CN108530514B - 一种电泳用分离胶及其分离多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种电泳用分离胶及其分离多肽的方法。制备凝胶配方中用乙二醇代替甘油，不使用尿素，小于5kd条带不会弯曲。该操作方便简单，避免了尿素加入时反应体积增大，能够很好分离条带较多的小肽样品。

Description

一种电泳用分离胶及其分离多肽的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种电泳用分离胶及其分离多肽的方法。
背景技术
多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用，不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。
采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。
电泳的经典方法(Schagger 1987)制胶步骤中使用的是甘油和尿素，导致小于5kd的蛋白电泳后弯曲。
发明内容
为了解决小于5kd的蛋白电泳后弯曲的问题，本发明提出了一种电泳用分离胶及电泳分离多肽的方法。
一种电泳用分离胶，其特征在于，包括如下组分：PAA，凝胶缓冲液，乙二醇，过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)。
优选的电泳用分离胶，由如下组分配置而成：40％PAA(19:1)2.7ml，凝胶缓冲液1.5ml，电泳级乙二醇1.8ml，10％过硫酸铵45μl，四甲基乙二胺9μl。
一种电泳分离多肽的方法，按照下述步骤进行：
(1)配制分离胶
将40％PAA、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合；加入10％过硫酸铵和四甲基乙二胺，混匀5-10秒，以使溶液充分混匀，制成分离胶溶液；在凝胶模具中迅速灌入分离胶溶液，然后在分离胶溶液上覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整；静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合；去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去；
(2)配制浓缩胶
将双蒸水、40％PAA和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合；加入10％过硫酸铵和四甲基乙二胺，混匀5-10秒，以使溶液充分混匀，制成凝胶；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡；静置30-60分钟，待凝胶聚合后配制成浓缩胶；
(3)电泳
取一管分装好的Marker样品，95℃处理5分钟，充分混匀后备用；电泳前，将10×阳极缓冲液和10×阴极缓冲液用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用；将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或经过2×Tricine蛋白样品上样缓冲液处理后的蛋白样品加入点样孔，80-120V电泳30-60分钟左右，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至150-200V，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳，整个电泳过程需要2-3小时；
(4)染色及脱色
卸下电泳胶板，撬开玻璃板，将凝胶整块刮到装有染色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下染色1h；从染色液中取出凝胶，用蒸馏水清洗3-5次，转移到装有脱色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下脱色；脱色后，将凝胶拍照保存或将凝胶浸于水中保存。
所述的分离胶、浓缩胶均为0.75mm厚度的凝胶。
所述分离胶由下述试剂制成：40％PAA(19:1)2.7ml,凝胶缓冲液1.5ml,电泳级乙二醇1.8ml,10％过硫酸铵45μl，四甲基乙二胺9μl；所述浓缩胶由下述试剂制成：40％PAA(29:1)0.5ml,凝胶缓冲液1ml,双蒸水2.5ml,10％过硫酸铵30μl，四甲基乙二胺6μl。
所述40％PAA(19:1)的制备方法为称取丙稀酰胺38g、甲叉双丙稀酰2g，用双蒸水溶解后定容至100ml，过滤后使用；所述40％PAA(29:1)的制备方法为称取丙稀酰胺38.67g、甲叉双丙稀酰1.33g，用双蒸水溶解后定容至100ml，过滤后使用；所述凝胶缓冲液制备方法为称取Tris碱182g、ddH2O 300ml、1.5g SDS或15ml 10％SDS，用HCl调pH值至8.45，用ddH2O定容至500ml。
所述步骤(3)电泳中所述的10×阳极缓冲液的制备方法为称取Tris碱121.1g、ddH2O 400ml，用HCl调pH值至8.9，用ddH2O定容至500ml；所述的10×阴极缓冲液制备方法为称取Tris碱121.14g、Tricine 179.2g、SDS10g，用ddH2O溶解，定容至1000m；所述2×Tricine蛋白样品上样缓冲液的制备方法为量取1M Tris-Cl pH6.8试剂1ml、甘油2.4ml称取SDS0.8g、DTT或400μlβ-巯基乙醇0.31g、考马斯亮蓝G-250 2mg，用灭菌ddH2O定容至10ml，混匀分装-20℃贮存备用。
所述的染色液的制备方法为量取冰醋酸100ml，称取考马斯亮蓝G-250 0.25g，溶解在900ml水中；所述的脱色液的制备方法为量取冰醋酸100ml，溶解在900ml水中。
本发明的有益效果：本发明制胶步骤中用乙二醇代替甘油，不使用尿素，使小于5kd的蛋白电泳后条带不会弯曲，操作方便简单，避免了尿素加入时反应体积增大。
附图说明
图1为乙二醇配方脱色后凝胶的照片；
图2为甘油配方脱色后的凝胶的照片；
其中泳道1为彩虹预染超低分子量蛋白Marker上样量5μl，泳道2为抑肽酶Aprotinin浓度0.2μg/μl上样量5μl，泳道3为超低分子量蛋白Marker I上样量10μl，泳道4为小肽提取样品上样量5μl，泳道5为超低分子量蛋白Marker IV，泳道6为超低分子量蛋白Marker III。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
制胶
I配制分离胶
1.按照表一将不同体积的双蒸水、40％PAA(19:1)、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。
2.加入10％APS和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3.在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整。
4.静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
II配制浓缩胶
去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。
1.按照表一将不同体积的双蒸水、40％PAA(29:1)和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
2.加入10％过硫酸铵和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
4.静置30-60分钟装待凝胶聚合
表一 乙二醇的分离胶、甘油的分离胶、浓缩胶的配方
Figure BDA0001711202670000061
实施例2
分别使用乙二醇配方分离胶、甘油配方分离胶的凝胶进行电泳
1.取一管分装好的Marker样品，95℃处理5分钟，充分混匀后备用。
2.电泳前，将10×阳极缓冲液(Cat No：AB080)和10×阴极缓冲液(Cat No：CB010)用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将分别将已经过2×Tricine上样缓冲液处理后的彩虹预染超低分子量蛋白Marker 5μl、浓度0.2μg/μl的抑肽酶Aprotinin 5μl、超低分子量蛋白Marker I 10μl、小肽提取样品5μl、超低分子量蛋白Marker IV、超低分子量蛋白Marker III加入到1-6点样孔，80-120V电泳30-60分钟左右，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至150-200V，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要2-3个小时。如果电泳时间过短，染色时，指示前沿容易遮挡小于5kd的小肽。
实施例3
分别对使用乙二醇配方分离胶、甘油配方分离胶的凝胶电泳后染色
(1)卸下电泳胶板，小心撬开玻璃板，将凝胶小心的整块刮到装有染色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下染色1h；所述的染色液可以为考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液(Cat No：RTD6201)或者使用常规染色液。
(2)从染色液中取出凝胶，用蒸馏水清洗3-5次，转移到装有脱色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下脱色；
(3)脱色后，将使用乙二醇配方分离胶、甘油配方分离胶的凝胶拍照保存，如图1和图2所示；
实施例1-3所需的试剂配制方法见表二
表二 小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制
Figure BDA0001711202670000071
Figure BDA0001711202670000081
通过实验对结果进行比较：
1.乙二醇配方配制分离胶更加容易操作，甘油配方配制分离胶由于甘油粘度较大，不易吸取，体积不易称量称取，操作繁琐。
2.由图1及图2看出，泳道1 1.2kd条带乙二醇配方很好分离，甘油配方不能有效分离1.2kd；泳道4对比可见，乙二醇配方能够很好分离条带较多的小肽样品，甘油配方不能有效分离。

Claims (7)

1.一种电泳用分离胶，其特征在于，由如下组分配置而成：40% PAA 2.7ml， 凝胶缓冲液1.5ml，电泳级乙二醇1.8ml，10%过硫酸铵 45 μl ，四甲基乙二胺9μl；所述40% PAA中丙稀酰胺与甲叉双丙稀酰胺的用量质量比为19：1。
2.一种电泳分离多肽的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：（1）配制分离胶
将40% PAA、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合；加入10%过硫酸铵和四甲基乙二胺，混匀5-10秒，以使溶液充分混匀，制成分离胶溶液；在凝胶模具中迅速灌入分离胶溶液，然后在分离胶溶液上覆盖一层1-3 cm的水层，使凝胶表面保持平整；静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合；去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去；
（2）配制浓缩胶
将双蒸水、40% PAA和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合；加入10% 过硫酸铵和四甲基乙二胺，混匀5-10秒，以使溶液充分混匀，制成凝胶；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡；静置30-60分钟，待凝胶聚合后配制成浓缩胶；
（3） 电泳
取一管分装好的Marker样品，95℃处理5分钟，充分混匀后备用；电泳前，将10×阳极缓冲液和10×阴极缓冲液用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用；将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或经过2×Tricine蛋白样品上样缓冲液处理后的蛋白样品加入点样孔，80-120V电泳30-60分钟，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至150-200V，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳，整个电泳过程需要2-3小时；
（4）染色及脱色
卸下电泳胶板，撬开玻璃板，将凝胶整块刮到装有染色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下染色1h；从染色液中取出凝胶，用蒸馏水清洗3-5次，转移到装有脱色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下脱色；脱色后，将凝胶拍照保存或将凝胶浸于水中保存。
3.根据权利要求2所述的电泳分离多肽的方法，其特征在于，所述的分离胶、浓缩胶均为0.75mm厚度的凝胶。
4.根据权利要求3所述的电泳分离多肽的方法，其特征在于，所述分离胶由下述试剂制成：40% PAA 2.7ml, 凝胶缓冲液1.5ml,电泳级乙二醇1.8ml, 10％过硫酸铵45 μl ，四甲基乙二胺9 μl；所述40% PAA中丙稀酰胺与甲叉双丙稀酰胺的用量质量比为19：1；
所述浓缩胶由下述试剂制成：40% PAA 0.5ml, 凝胶缓冲液1ml, 双蒸水2.5ml, 10％过硫酸铵30 μl ，四甲基乙二胺6 μl，所述40% PAA中丙稀酰胺与甲叉双丙稀酰胺的用量质量比为29：1。
5.根据权利要求2所述的电泳分离多肽的方法，其特征在于，所述凝胶缓冲液制备方法为称取Tris碱182g、ddH2O 300ml、1.5 g SDS或15ml 10% SDS，用HCl调pH值至8.45，用ddH2O定容至500ml。
6.根据权利要求2所述的一种电泳分离多肽的方法，其特征在于，所述步骤（3）电泳中所述的10×阳极缓冲液的制备方法为称取Tris碱 121.1g、ddH2O 400ml，用HCl调pH值至8.9，用ddH2O定容至500ml；所述的10×阴极缓冲液制备方法为称取Tris碱 121.14g、Tricine 179.2 g、SDS10g，用ddH2O溶解，定容至1000m；所述2×Tricine蛋白样品上样缓冲液的制备方法为量取1M Tris-Cl pH6.8试剂1ml、甘油2.4ml称取SDS0.8g、DTT或400μl β-巯基乙醇0.31g、考马斯亮蓝G-250 2mg，用灭菌ddH2O定容至10ml，混匀分装-20℃贮存备用。
7.根据权利要求2所述的电泳分离多肽的方法，其特征在于，所述的染色液的制备方法为量取冰醋酸100ml，称取考马斯亮蓝G-250 0.25g，溶解在900ml水中；所述的脱色液的制备方法为量取冰醋酸100ml，溶解在900ml水中。
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