CN103076382A - 天然麝香的多肽电泳图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药检测方法，具体涉及一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。本发明采用电泳上样缓冲液直接提取分析，每个样品的用量仅需几毫克，该方法为天然麝香的鉴别建立了一种简便可行的辅助手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药检测方法，具体涉及一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。
背景技术
麝香具有一定的抗炎镇痛药理活性，现有研究显示麝香的抗炎活性与麝香中特有的糖肽有关，不同文献报道其抗炎糖肽分子量各不相同，不同来源的麝香其多肽成分有显著性差异。常规的电泳分析体系Tris-甘氨酸-SDS-PAGE电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在10~200kDa，对于相对分子质量小于10kDa的多肽分辨率低。利用含有SDS的凝胶中加入高浓度脲时可利用SDS-PAGE对小分子多肽进行分析的分离效果不甚理想，且重现性较差，且小分子多肽在固定染色的过程中容易丢失。并且由于麝香样品蛋白含量较低，且麝香为贵重药材，在进行鉴别研究中不能采用先提取出其蛋白质成分，然后进行电泳检测的方法；另一方面，麝香样品提取物中含有大量的色素类成分，难以在微量样品检测中有效去除。研究中发现优化的人工麝香凝胶电泳方法不适用于天然麝香样品，故采用Tricine-SDS-PAGE电泳，建立麝香多肽电泳方法。
发明内容
本发明提供了一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.003~0.008重量份，加入1体积份乙醚，超声提取15~25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取15~25min，在4500rpm，10℃条件下离心15~25min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴3~8min，即得电泳样品；
2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解100~150重量份Tris，用HCl调PH值至7-9，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解50~70重量份Tris，80~100重量份Tricine，3~8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解150~200重量份Tris，1~2重量份SDS，用HCl调PH值至7~9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)40~60%丙烯酰胺，1~2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)40~60%丙烯酰胺，1~5%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10%SDS，0.6~1体积份β–巯基乙醇，0.5~1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10%SDS，0.6~1体积份β–巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.2~0.6重量份甘油，0.5~1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份，临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；
夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)0.5~1.5体积份，0.5~0.8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份,临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；
浓缩胶2体积份：0.4~0.6体积份凝胶缓冲液(3×)，0.1~0.2体积份3C储液，去离子水稀释至1~3体积份，临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇30-60体积份，冰醋酸5-20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
染色液：称取0.5~1.0重量份AgNO3溶于3~5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 15~30体积份，再加入氨水1~2体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；
显色液：0.3~0.8体积份1﹪柠檬酸，0.03~0.08体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；
终止液：量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
3、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定0.5~1.5h，每10~30min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次5~15min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色10~20min；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2~4min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5~1.5h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存;
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.
本发明天然麝香的多肽电泳图谱检测方法优选如下步骤：
1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.003重量份，加入1体积份乙醚，超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取20min，在4500rpm，10℃条件下离心20min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴5min，即得电泳样品；
2、Tricine-SDS-PA重量份E凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解100重量份Tris，用HCl调PH值至7.5，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS,定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解160重量份Tris，1.5重量份SDS,用HCl调PH值至7.8,定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.8体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2体积份甘油，3体积份10%SDS，0.7体积份β–巯基乙醇，1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.4体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2体积份甘油，2.5体积份10%SDS，1体积份β–巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.6重量份甘油，1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED；
夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.5体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2.5体积份,临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份的TEMED；
浓缩胶2体积份：取上述制得的0.6体积份凝胶缓冲液(3×)，0.2体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处；
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇50体积份，冰醋酸5体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
染色液：称取0.5重量份AgNO3溶于3体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 18体积份，再加入氨水1.5体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；
显色液：0.8体积份1﹪柠檬酸，0.06体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；
终止液：量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
3、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定1h，每10min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次10min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20min；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶1h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.
本发明天然麝香的多肽电泳图谱检测方法还可以优选如下步骤：
1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.008重量份，加入1体积份乙醚，超声提取18min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取22min，在4500rpm，10℃条件下离心22min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴4min，即得电泳样品；
2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解150重量份Tris，用HCl调PH值至9，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解180重量份Tris，1重量份SDS，用HCl调PH值至8.5，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.4体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，3.5体积份甘油，1.5体积份10%SDS，0.8体积份β-巯基乙醇，0.7体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.8体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2.5体积份甘油，1.8体积份10%SDS，0.8体积份β-巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.3重量份甘油，1.2体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份，临用时加入0.009体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0015体积份TEMED；
夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1.2体积份，0.55体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份,临用时加入0.008体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED；
浓缩胶2体积份：0.45体积份凝胶缓冲液(3×)，0.18体积份3C储液，去离子水稀释至1.5体积份，临用时加入0.008体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0008体积份TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处；
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇30体积份，冰醋酸20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
染色液：称取0.6重量份AgNO3溶于3.5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 25体积份，再加入氨水1.8体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；
显色液：0.7体积份1﹪柠檬酸，0.04体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；
终止液：量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
3、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定1.2h，每15min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次15min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.
本发明所述重量份与体积份的关系为g/ml的关系。
本发明方法采用电泳上样缓冲液直接提取分析，每个样品的用量仅需几毫克，该方法为天然麝香的鉴别建立了一种简便可行的辅助手段。
附图说明：
附图1：天然麝香多肽电泳图谱;A:Marker+胰岛素；B~J:天然麝香，批号依次为1~5，7~10
下面实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例一：天然麝香多肽电泳指纹图谱分析
取天然麝香，批号依次为1-5，7-10，按照实施例一的方法，检测天然麝香的多肽电泳图谱，电泳结果显示，在研究的批次天然麝香中，除1个批次未能显示74kDa蛋白条带外（F泳道），其余批次均含有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。结果见附图1（其中A:Marker+胰岛素；B~J:天然麝香，批号依次为1~5，7~10）
结论：从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1：
1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.003g，加入1ml乙醚，超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05ml电泳上样缓冲液（1X），超声提取20min，在4500rpm，10℃条件下离心20min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴5min，即得电泳样品；
2、Tricine-SDS-PAgE凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解100g Tris，用HCl调PH值至7.5，定容至500ml，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解55g Tris，90g Tricine，8g SDS,定容至500ml，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解160g Tris，1.5g SDS,用HCl调PH值至7.8,定容至500ml，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.8ml 1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2ml甘油，3ml 10%SDS，0.7mlβ-巯基乙醇，1.5ml 1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10ml，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.4ml 1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2ml甘油，2.5ml 10%SDS，1mlβ-巯基乙醇，加蒸馏水补足60ml，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3ml：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1ml，0.6g甘油，1.5ml 6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4ml，临用时加入0.005ml的10%过硫酸铵溶液和0.001ml TEMED；
夹层胶3ml：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1ml，0.5ml 3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2.5ml,临用时加入0.005ml的10%过硫酸铵溶液和0.001ml的TEMED；
浓缩胶2ml：取上述制得的0.6ml凝胶缓冲液(3×)，0.2ml 3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2ml，临用时加入0.005ml的10%过硫酸铵溶液和0.001ml TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处；
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇50ml，冰醋酸5ml，加双蒸水稀释至100ml；
染色液：称取0.5g AgNO3溶于3ml双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 18ml，再加入氨水1.5ml混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100ml；
显色液：0.8ml 1﹪柠檬酸，0.06ml甲醛，加双蒸水至100ml；
终止液：量取冰醋酸1ml，加双蒸水稀释至100ml；
3、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定1h，每10min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次10min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20分钟；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶1h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存。
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.
实施例2：
1、养殖麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取养殖麝香样品0.008g，加入1ml乙醚，超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05ml电泳上样缓冲液（1X），超声提取22min，在4500rpm，10℃条件下离心22min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴4min，即得电泳样品；
2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解150g Tris，用HCl调PH值至9，定容至500ml，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解70g Tris，95gTricine，3g SDS，定容至500ml，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解180g Tris，1g SDS，用HCl调PH值至8.5，定容至500ml，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.4ml 1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，3.5ml甘油，1.5ml 10%SDS，0.8mlβ–巯基乙醇，0.7ml 1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10ml，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.8ml 1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2.5ml甘油，2.5ml 10%SDS，0.8mlβ-巯基乙醇，加蒸馏水补足60ml，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3ml：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1ml，0.3g甘油，1.2ml6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5ml，临用时加入0.009ml的10%过硫酸铵溶液和0.0015mlTEMED；
夹层胶3ml：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1.2ml，0.55ml3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5ml,临用时加入0.008ml的10%过硫酸铵溶液和0.001ml TEMED；
浓缩胶2ml：0.45ml凝胶缓冲液(3×)，0.18ml 3C储液，去离子水稀释至1.5ml，临用时加入0.008ml的10%过硫酸铵溶液和0.0008ml TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处；
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇30ml，冰醋酸20ml，加双蒸水稀释至100ml；
染色液：称取0.6gAgNO3溶于3.5ml双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 25ml，再加入氨水1.8ml混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100ml；
显色液：0.7ml 1﹪柠檬酸，0.04ml甲醛，加双蒸水至100ml；
终止液：量取冰醋酸1ml，加双蒸水稀释至100ml；
3、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定1.2h，每15min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次15min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存。
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
Claims (3)
1.一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.003~0.008重量份，加入1体积份乙醚，超声提取15~25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取15~25min，在4500rpm，10℃条件下离心15~25min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴3~8min，即得电泳样品；
B、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解100~150重量份Tris，用HCl调PH值至7-9，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解50~70重量份Tris，80~100重量份Tricine，3~8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解150~200重量份Tris，1~2重量份SDS，用HCl调PH值至7~9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)40~60%丙烯酰胺，1~2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)40~60%丙烯酰胺，1~5%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10%SDS，0.6~1体积份β巯基乙醇，0.5~1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10%SDS，0.6~1体积份β-巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.2~0.6重量份甘油，0.5~1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份，临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；
夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)0.5~1.5体积份，0.5~0.8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份,临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；
浓缩胶2体积份：0.4~0.6体积份凝胶缓冲液(3×)，0.1~0.2体积份3C储液，去离子水稀释至1~3体积份，临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇30-60体积份，冰醋酸5-20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
染色液：称取0.5~1.0重量份AgNO3溶于3~5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 15~30体积份，再加入氨水1~2体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；
显色液：0.3~0.8体积份1﹪柠檬酸，0.03~0.08体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；
终止液：量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
C、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定0.5~1.5h，每10~30min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次5~15min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色10~20min；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2~4min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5~1.5h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存;
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
2.如权利要求1所述的天然麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.003重量份，加入1体积份乙醚，超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取20min，在4500rpm，10℃条件下离心20min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴5min，即得电泳样品；
B、Tricine-SDS-PA重量份E凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解100重量份Tris，用HCl调PH值至7.5，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS,定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解160重量份Tris，1.5重量份SDS,用HCl调PH值至7.8,定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.8体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2体积份甘油，3体积份10%SDS，0.7体积份β-巯基乙醇，1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.4体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2体积份甘油，2.5体积份10%SDS，1体积份β-巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.6重量份甘油，1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED；
夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.5体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2.5体积份,临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份的TEMED；
浓缩胶2体积份：取上述制得的0.6体积份凝胶缓冲液(3×)，0.2体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处；
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇50体积份，冰醋酸5体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
染色液：称取0.5重量份AgNO3溶于3体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 18体积份，再加入氨水1.5体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；
显色液：0.8体积份1﹪柠檬酸，0.06体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；
终止液：量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
C、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定1h，每10min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次10min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20min；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶1h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
3.如权利要求1所述的天然麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.008重量份，加入1体积份乙醚，超声提取18min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取22min，在4500rpm，10℃条件下离心22min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴4min，即得电泳样品；
B、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法
（1）电泳溶液准备：
(a)去离子水溶解150重量份Tris，用HCl调PH值至9，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；
(b)去离子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；
(c)去离子水溶解180重量份Tris，1重量份SDS，用HCl调PH值至8.5，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；
(d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；
(e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.4体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，3.5体积份甘油，1.5体积份10%SDS，0.8体积份β-巯基乙醇，0.7体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；
(g)0.8体积份1mol/L，PH为6.8的Tris-HCl，2.5体积份甘油，1.8体积份10%SDS，0.8体积份β-巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；
（2）凝胶制备：
分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.3重量份甘油，1.2体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份，临用时加入0.009体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0015体积份TEMED；
夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1.2体积份，0.55体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份,临用时加入0.008体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED；
浓缩胶2体积份：0.45体积份凝胶缓冲液(3×)，0.18体积份3C储液，去离子水稀释至1.5体积份，临用时加入0.008体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0008体积份TEMED；
（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处；
（4）染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：
固定液：量取甲醇30体积份，冰醋酸20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
染色液：称取0.6重量份AgNO3溶于3.5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%NaOH 25体积份，再加入氨水1.8体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；
显色液：0.7体积份1﹪柠檬酸，0.04体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；
终止液：量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
C、具体染色步骤：
(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定1.2h，每15min换一次液；
(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次15min；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min；
(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；
(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5h；
(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；
从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
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| CN113049695A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-06-29 | 漳州片仔癀药业股份有限公司 | 基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法及其应用 |
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| US20070155002A1 (en) * | 2004-01-05 | 2007-07-05 | Wenyan Wu | Amino acid sequence from active principles in musk and their acetic salts, preparation and use thereof |
| CN102240302A (zh) * | 2011-05-19 | 2011-11-16 | 刘金生 | 超基因活肽中药组合物 |
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| CN113049695A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-06-29 | 漳州片仔癀药业股份有限公司 | 基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法及其应用 |
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