CN113049695A - 基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法及其应用 - Google Patents

基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相‑质谱联用方法及其应用。本发明运用质谱蛋白质组学定向分析技术，建立了麝香中特征性多肽类成分的定量方法，并找到了养殖麝香与野生麝香在多肽成分和含量上的差异，可以填补麝香成分研究中的空白，为实现麝香的全面质量分析和质量控制提供关键指标，确保含麝香的中成药制剂的质量及其临床疗效。

Description

基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法及其 应用
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及麝香的分析。
背景技术
麝香为麝科动物林麝(MoschusberzovskiiFlerov.)、马麝(M.sifanicusPrzewalssi.)和原麝(M.moschiferusLinaeus.)成熟雄体脐下香腺囊分泌物的干燥品。麝香是常用中药材，具有开窍、醒神、活血通络、消肿止痛之功效。目前天然麝香主要有野生和养殖两种来源，养殖麝香规模最大最成熟的为林麝麝香，野生麝香则为多种属麝香的混合物。天然麝香化学成分非常复杂，主要包含大环酮类、含氮杂环类、甾体类等非极性化合物，及多肽类、氨基酸类、有机酸类等。现代研究表明，麝香中蛋白质及多肽类成分是抗炎的主要成分。目前对麝香小极性化学成分(如大环酮类、吡啶、甾体类、脂肪酸类等)或大极性氨基酸类成分的分析研究较多，而对于大分子多肽类的成分分析研究较少，且多为凝胶电泳或蛋白质总量测定等，研究技术不够先进，评价较为片面，难以准确鉴定出天然麝香来源，也不利于对麝香的成分分析和质量控制等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法，所述特征多肽的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示。
本发明的方法通过对所述若干特征多肽的检测，可以实现对麝香的成分分析、鉴定或质量控制。
进一步地，所述天然麝香包括养殖麝香或野生麝香中的至少一种。具体地，所述养殖麝香包括从养殖林麝采取的麝香；所述野生麝香包括从野生麝类(如野生林麝、野生马麝、野生原麝等)采取的麝香，或者从野生的多种属麝类(如野生林麝、野生马麝、野生原麝等)采取的麝香的混合物。
进一步地，所述方法包括：
1)内标溶液制备：取内标物比伐卢定配制8～12μg/mL的内标溶液；
2)标准溶液制备：取如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽配制混合标准溶液，并稀释得到系列浓度梯度的标准溶液，其中各多肽的浓度范围为0.4～1250.00ng/mL，所述系列浓度梯度的标准溶液分别加入等体积的内标溶液，得系列浓度梯度的含内标的标准曲线溶液；
3)供试品溶液制备：提取麝香中的蛋白并酶解，得到麝香酶解样品；以麝香酶解样品与内标混合，作为麝香供试品溶液；
4)利用所述标准曲线溶液和所述麝香供试品溶液，按以下色谱条件与质谱条件进行液相-质谱检测，对麝香中的如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽进行定量分析；
色谱条件：选用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速为0.1～0.5mL/min；以0.05％～0.2％甲酸-水溶液为流动相A，以0.05％～0.2％甲酸-乙腈溶液为流动相B，以流动相A与流动相B混合得到的AB混合液进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～5min，12％～15％B(即B在AB混合液中的体积分数为12％～15％，下同)；5～10min，15％～30％B；10～15min，30％～35％B；15.1～28min，11.8～12.2％B；图谱采集时间为14～16min；
质谱条件：质谱检测采用ESI(电喷雾)正离子化模式，采用SRM(选择反应监测技术)-IDA(条件触发)-EPI(增强子离子扫描)扫描模式，根据在线优化的质谱参数进行样品测定。
进一步地，其色谱条件优选为：选用HSS T3色谱柱；流速0.2mL/min，以0.1％甲酸-水溶液为流动相A，以0.1％甲酸-乙腈溶液为流动相B，图谱采集时间为15min；
其质谱检测ESI正离子化模式源参数优选为：GS1(雾化气)为55psi，GS2(辅助气)为55psi；气帘气(CUR)为30psi；碰撞气(CAD)high；喷雾电压(IS)4500V；离子化温度(TEM)550℃；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)13V；脱簇电压(DP)为70V；
其质谱检测SRM-IDA-EPI扫描模式优选为：IDA阈值为300cps，CE(碰撞电压)为40eV，CES(碰撞电压差)为35eV。
进一步地，所述步骤4)中，还包括对质谱参数的在线优化及测定：以所述多肽的双电荷准分子离子为母离子，单电荷子离子碎片构建三对离子对，进而衍生产生三组伪离子对，每组伪离子对分别对应在5～50eV范围内梯级变化的CE；不同碰撞能的伪离子对产生不同的相对响应值，利用高斯曲线拟合构建候选离子对的相对响应值-碰撞能曲线(RRCEC)，以该曲线的最高点对应CE值作为最优CE值；根据优化的质谱参数进行检测。
进一步地，提取麝香中的蛋白的方法包括：依次采用二氯甲烷、乙醇超声提取，去除溶液，残渣用水继续提取，取上清液干燥，配制成5～20mg/mL麝香提取液；对麝香提取液依次进行二硫键还原处理、烷基化处理、加入尿素并超滤处理、加入碳酸氢铵并超滤处理。
进一步地，所述二硫键还原处理采用的试剂包括TCEP(三(2-羧乙基)膦)；所述烷基化处理采用的试剂包括碘代乙酰胺；所述酶解采用的试剂包括胰酶。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法在麝香分析、麝香鉴定或麝香质量控制中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
麝香中的特征多肽，所述特征多肽包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽中的至少一种。
例如，野生麝香与养殖麝香中，所述特征多肽的含量有差异，可据此对野生麝香和养殖麝香进行鉴定和区分。同时，野生麝香和养殖麝香在多肽成分和含量上的差异，可以填补麝香成分研究中的空白，为实现麝香的全面质量分析和质量控制提供关键指标。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
麝香中的特征多肽在麝香分析、麝香鉴定或麝香质量控制中的应用，所述特征多肽包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽中的至少一种。
例如，可以制备含有所述特征多肽的试剂盒。
在本发明的一个具体的实施例中，一种基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法，包括：
首先，对特征多肽即目标分析物的确定过程进行说明：
1、目标分析物确定
称取麝香样品约200～1000mg，混合均匀后，置于10～25mL容量瓶中，加入5～25mL二氯甲烷，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤1次；所得残渣继续加入6～30mL乙醇，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤1次；用5～25mL水对所剩残渣继续进行提取，超声30min，抽滤，取上清溶液，重复上述步骤1次。将所得的上清溶液混合，于旋转蒸发仪(水浴温度为30℃)上旋干，加入纯水复溶，12000rpm离心10min，取上清液作为麝香样品溶液。
取一定体积的麝香(蛋白量为400～800μg)分别加入一定体积TCEP(终浓度为10mM)，并置于67℃的恒温箱10min，恢复室温后，加入一定体积的碘代乙酰胺(终浓度为15mM)，避光孵育30min，进行烷基化。将烷基化样品转移至10K超滤管中，加入200μL的8M尿素，10000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；再加入200μL的50mM碳酸氢铵，10000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；在超滤管中加入胰酶(胰酶：蛋白＝1:50)，于37℃，200r/min转的摇床中16h，更换超滤管，12000rpm离心30min，收集超滤液，即得麝香酶解样品。
将麝香酶解样品注入LC–LTQ-Orbitrap-MS系统，采集样品的高分辨质谱数据。以水(含0.1％甲酸)为流动相A，以乙腈(含0.1％甲酸)为流动相B，以流动相A与流动相B混合得到的AB混合液进行梯度洗脱，洗脱程序如下：0～65min，5～30％B；65～75min，30～50％B；75～85min，50～100％B；85～90min，100％B；图谱采集时间为90min。质谱检测采用ESI正离子化模式，喷雾电压为4.5kV，鞘气(Sheath Gas)流速为30arb，标准化碰撞能量47％，活化时间10ms；MS1谱图通过FTMS(傅里叶变换)模式获取，扫描范围设定为350～2000Da，分辨率(resolution)为60000FWHM(半峰全宽：full width at half maxima)；MS2谱图通过ITMS(离子阱)模式采集，分辨率为7500FWHM。
利用Proteome Discoverer v.1.4软件分析质谱数据，并导入Swiss-Prot数据库进行检索，SEQUEST算法用于多肽的鉴定，参数设定如下：酶解方式为胰蛋白酶，胰酶漏切为2，母离子偏差≤10ppm，子离子偏差≤0.8Da。
在定性分析的基础上，选取匹配度、响应值强度高的多肽作为目标分析物。具体包括：
如SEQ ID No.1所示的多肽DVDAAYMNK
如SEQ ID No.2所示的多肽TLLEGEESR
如SEQ ID No.3所示的多肽QSLEASLAETEGR
如SEQ ID No.4所示的多肽TLLDIDNTR
如SEQ ID No.5所示的多肽VLDELTLTK
如SEQ ID No.6所示的多肽EVATNSELVQSGK
如SEQ ID No.7所示的多肽SLDLDSIIAEVK
如SEQ ID No.8所示的多肽YLGYLEQLLR
随后，在确定目标分析物后，本发明的基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法包括：
2样品溶液制备
2.1内标溶液的制备
取内标物比伐卢定(IS)适量，用纯水配制成浓度为4mg/mL的内标储备液，再用30％乙腈逐步为10μg/mL的内标溶液，-20℃保存，备用。
2.2标准溶液的制备
取SLDLDSIIAEVK(如SEQ ID No.7所示)适量，用纯水配制至浓度为6.93mg/mL的储备液，-20℃保存，备用。分别取DVDAAYMNK(如SEQ ID No.1所示)、TLLEGEESR(如SEQ IDNo.2所示)、QSLEASLAETEGR(如SEQ ID No.3所示)、TLLDIDNTR(如SEQ ID No.4所示)、VLDELTLTK(如SEQ ID No.5所示)、EVATNSELVQSGK(如SEQ ID No.6所示)、YLGYLEQLLR(如SEQ ID No.8所示)适量，用纯水分别配制至浓度为10mg/mL的储备液，-20℃保存，备用。
精密吸取各标准品储备液，配成SLDLDSIIAEVK(如SEQ ID No.7所示)配制浓度为866.25ng/mL，DVDAAYMNK(如SEQ ID No.1所示)、TLLEGEESR(如SEQ ID No.2所示)、QSLEASLAETEGR(如SEQ ID No.3所示)、TLLDIDNTR(如SEQ ID No.4所示)、VLDELTLTK(如SEQID No.5所示)、EVATNSELVQSGK(如SEQ ID No.6所示)、YLGYLEQLLR(如SEQ ID No.8所示)配制浓度为1250.00ng/mL的8个多肽的混合标准溶液，用30％乙腈逐步对半稀释该混合标准溶液，得到系列浓度的标准溶液。分别吸取各浓度标准溶液50μL，加入等体积的内标溶液，即得系列浓度梯度的含内标的标准曲线溶液。
2.3供试品溶液制备
分别精密称取麝香样品约200～1000mg，置于10～25mL容量瓶中，加入5～25mL二氯甲烷，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤3次；所得残渣继续加入6～30mL乙醇，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤3次；用5～25mL水对所剩残渣继续进行提取，超声30min，抽滤，取上清溶液，重复上述步骤2次。将2次提取所得的水提物上清溶液混合，于旋转蒸发仪(水浴温度为30℃)上，旋干，称取提取物重量，加纯水配成10～50mg/mL的养殖麝香提取物溶液，并用BCA蛋白试剂盒测得其蛋白浓度。
取一定体积的麝香提取物溶液(含蛋白400μg～800μg)加入一定体积TCEP(终浓度为10mM)，并置于67℃的恒温箱10min，恢复室温后，加入一定体积的碘代乙酰胺(终浓度为15mM)，避光孵育30min，进行烷基化。将烷基化样品转移至10K超滤管中，加入200μL的8M尿素，12000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；再加入200μL的50mM碳酸氢铵，12000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；在超滤管中加入胰酶(胰酶：蛋白＝1:50)，于37℃，200r/min转的摇床中16h，更换超滤管，12000rpm离心30min，收集超滤液，即得麝香酶解溶液，取50μL酶解样品，加入50μL内标，作为麝香供试品溶液。
3、定量分析
3.1色谱条件
色谱柱为HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm,Waters,Milford,MA,USA)，柱温为40℃，流速分别为0.2mL/min，进样量为5.0μL。以水(含0.1％甲酸)为流动相A，乙腈(含0.1％甲酸)为流动相B进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～5min，12％～15％B；5～10min,15％～30％B；10～15min，30％～35％B；15.1～28min，12％B。图谱采集时间为15min。
3.2质谱条件
质谱检测采用ESI正离子化模式，源参数：GS1为55psi，GS2为55psi；气帘气(CUR)为30psi；碰撞气(CAD)high；喷雾电压(IS)4500V；离子化温度(TEM)550℃；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)13V；脱簇电压(DP)为70V，采用SRM-IDA-EPI扫描模式。对于EPI扫描，IDA阈值为300cps，CE为40eV，CES为35eV。
3.3质谱参数在线优化及测定
以其双电荷准分子离子为母离子，单电荷子离子碎片构建三对离子对，进而衍生产生三组伪离子对，每组伪离子对分别对应在5～50eV范围内梯级变化的CE。不同碰撞能的伪离子对产生不同的相对响应值，将每组伪离子对的相对响应值均导入GraphPad Prism5.0软件中(Graphpad,San Diego,CA)，利用高斯曲线拟合构建候选离子对的相对响应-碰撞能曲线(RRCEC)，以曲线的最高点对应CE值作为最优CE值。
根据优化的质谱参数进行样品测定。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±20％范围内。
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
质谱蛋白质组学定向分析技术能够非常灵敏的检测到蛋白质信号，且实验重复性高。它是运用三重四级杆质谱仪通过选择反应监测技术(SRM)探测可以代表每一个蛋白质的单一特征肽段产生的碎片离子信号，实现对预筛选蛋白质样品的分析。本发明运用质谱蛋白质组学定向分析技术，建立了麝香中多肽类成分的定量方法，并找到了养殖麝香(林麝麝香)与野生麝香在多肽成分和含量上的差异，可以填补麝香成分研究中的空白，为实现麝香的全面质量分析和质量控制提供关键指标，确保含麝香的中成药制剂的质量及其临床疗效。
附图说明
图1为本发明实施例中针对麝香中8个多肽的LC–MS选择离子检测色谱图(A：混标B：养殖麝香C：野生麝香)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
一目标多肽的分析选取
1麝香样品制备
称取麝香样品约200mg，混合均匀后，置于10mL容量瓶中，加入5mL二氯甲烷，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤1次；所得残渣继续加入6mL乙醇，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤1次；用5mL水对所剩残渣继续进行提取，超声30min，抽滤，取上清溶液，重复上述步骤1次。将所得的上清溶液混合，于旋转蒸发仪(水浴温度为30℃)上旋干，加入纯水复溶，12000rpm离心10min，取上清液作为麝香样品溶液。
2酶解样品制备
取一定体积的麝香(蛋白量为400～800μg)分别加入一定体积TCEP(终浓度为10mM)，并置于67℃的恒温箱10min，恢复室温后，加入一定体积的碘代乙酰胺(终浓度为15mM)，避光孵育30min，进行烷基化。将烷基化样品转移至10K超滤管中，加入200μL的8M尿素，10000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；再加入200μL的50mM碳酸氢铵，10000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；在超滤管中加入胰酶(胰酶：蛋白＝1:50)，于37℃，200r/min转的摇床中16h，更换超滤管，12000rpm离心30min，收集超滤液，即得麝香酶解样品。
3定性分析
将麝香酶解样品注入LC–LTQ-Orbitrap-MS系统，采集样品的高分辨质谱数据。以水(含0.1％甲酸)为流动相A，以乙腈(含0.1％甲酸)为流动相B，以流动相A与流动相B混合得到的AB混合液进行梯度洗脱，洗脱程序如下：0～65min，5～30％B；65～75min，30～50％B；75～85min，50～100％B；85～90min，100％B；图谱采集时间为90min。质谱检测采用ESI正离子化模式，喷雾电压为4.5kV，鞘气(Sheath Gas)流速为30arb，标准化碰撞能量47％，活化时间10ms；MS1谱图通过FTMS模式获取，扫描范围设定为350～2000Da，分辨率(resolution)为60000FWHM；MS2谱图通过ITMS模式采集，分辨率为7500FWHM。
利用Proteome Discoverer v.1.4软件分析质谱数据，并导入Swiss-Prot数据库进行检索，SEQUEST算法用于多肽的鉴定，参数设定如下：酶解方式为胰蛋白酶，胰酶漏切为2，母离子偏差≤10ppm，子离子偏差≤0.8Da。
4蛋白选择
在定性分析的基础上，选取匹配度、响应值强度高的DVDAAYMNK(如SEQ ID No.1所示)、TLLEGEESR(如SEQ ID No.2所示)、QSLEASLAETEGR(如SEQ ID No.3所示)、TLLDIDNTR(如SEQ ID No.4所示)、VLDELTLTK(如SEQ ID No.5所示)、EVATNSELVQSGK(如SEQ ID No.6所示)、SLDLDSIIAEVK(如SEQ ID No.7所示)与YLGYLEQLLR(如SEQ ID No.8所示)作为目标分析物。各目标多肽的分子离子均为双电荷离子，分子量在1026.45～1390.67Da之间。
表1 8个目标多肽的信息表
Figure BDA0002966259300000101
二麝香中多肽类成分定量分析
1样品溶液制备
1.1内标溶液的制备
取内标物比伐卢定(IS)适量，用纯水配制成浓度为4mg/mL的内标储备液，再用30％乙腈逐步为10μg/mL的内标溶液，-20℃保存，备用。
1.2标准溶液的制备
取SLDLDSIIAEVK适量(如SEQ ID No.7所示)，用纯水配制至浓度为6.93mg/mL的储备液，-20℃保存，备用。分别取DVDAAYMNK(如SEQ ID No.1所示)、TLLEGEESR(如SEQ IDNo.2所示)、QSLEASLAETEGR(如SEQ ID No.3所示)、TLLDIDNTR(如SEQ ID No.4所示)、VLDELTLTK(如SEQ ID No.5所示)、EVATNSELVQSGK(如SEQ ID No.6所示)、YLGYLEQLLR(如SEQ ID No.8所示)适量，用纯水分别配制至浓度为10mg/mL的储备液，-20℃保存，备用。
精密吸取各标准品储备液，配成SLDLDSIIAEVK(如SEQ ID No.7所示)配制浓度为866.25ng/mL；DVDAAYMNK(如SEQ ID No.1所示)、TLLEGEESR(如SEQ ID No.2所示)、QSLEASLAETEGR(如SEQ ID No.3所示)、TLLDIDNTR(如SEQ ID No.4所示)、VLDELTLTK(如SEQID No.5所示)、EVATNSELVQSGK(如SEQ ID No.6所示)、YLGYLEQLLR(如SEQ ID No.8所示)配制浓度为1250.00ng/mL的8个多肽的混合标准溶液，用30％乙腈逐步对半稀释该混合标准溶液，得到系列浓度的标准溶液。分别吸取各浓度标准溶液50μL，加入等体积的内标溶液，即得系列浓度梯度的含内标的标准曲线溶液。
1.3供试品溶液制备
分别精密称取麝香样品约1000mg，置于25mL容量瓶中，加入25mL二氯甲烷，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤3次；所得残渣继续加入30mL乙醇，超声提取30min，抽滤，去除溶液，重复上述步骤3次；用25mL水对所剩残渣继续进行提取，超声30min，抽滤，取上清溶液，重复上述步骤2次。将2次提取所得的水提物上清溶液混合，于旋转蒸发仪(水浴温度为30℃)上，旋干，称取提取物重量，加纯水配成50mg/mL的养殖麝香提取物溶液，并用BCA蛋白试剂盒测得其蛋白浓度。
取一定体积的麝香提取物溶液(含蛋白400μg～800μg)加入一定体积TCEP(终浓度为10mM)，并置于67℃的恒温箱10min，恢复室温后，加入一定体积的碘代乙酰胺(终浓度为15mM)，避光孵育30min，进行烷基化。将烷基化样品转移至10K超滤管中，加入200μL的8M尿素，12000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；再加入200μL的50mM碳酸氢铵，12000rpm离心30min，重复两次，弃去超滤液；在超滤管中加入胰酶(胰酶：蛋白＝1:50)，于37℃，200r/min转的摇床中16h，更换超滤管，12000rpm离心30min，收集超滤液，即得麝香酶解溶液，取50μL酶解样品，加入50μL内标，作为麝香供试品溶液。
部分在预实验中多肽类成分含量低于定量下限的样品，则将样品称样量增加至1g，提高目标多肽类成分在受试样品中的浓度，使其达到定量限水平。
2色谱条件
色谱柱为HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm,Waters,Milford,MA,USA)，柱温为40℃，流速分别为0.2mL/min，进样量为5.0μL。以水(含0.1％甲酸)为流动相A，乙腈(0.1％甲酸)为流动相B进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～5min，12％～15％B；5～10min,15％～30％B；10～15min，30％～35％B；15.1～28min，12％B。图谱采集时间为15min。
3质谱条件
质谱检测采用ESI正离子化模式，源参数：GS1为55psi，GS2为55psi；气帘气(CUR)为30psi；碰撞气(CAD)high；喷雾电压(IS)4500V；离子化温度(TEM)550℃；射入电压(EP)10V；碰撞室射出电压(CXP)13V；脱簇电压(DP)为70V，采用SRM-IDA-EPI扫描模式。对于EPI扫描，IDA阈值为300cps，CE为40eV，CES为35eV。
4质谱参数在线优化
以TLLDIDNTR(如SEQ ID No.4所示)为例，简述方法建立的过程。以其双电荷准分子离子([M+2H]2+)m/z 530.79为母离子，单电荷子离子碎片m/z 846.43(y7 +)，733.35(y6 +)和618.32(y5 +)构建三对离子对，分别为m/z 530.79>846.43，530.79>733.35和530.79>618.32。进而衍生产生三组伪离子对，如530.790>846.430，530.790>846.431，530.790>846.432等；m/z530.790>733.350，530.790>733.351，530.790>733.352等；530.790>618.320，530.790>618.321，530.790>618.322等。每组伪离子对分别对应在5～50eV范围内梯级变化的CE。不同碰撞能的伪离子对产生不同的相对响应值，将每组伪离子对的相对响应值均导入GraphPad Prism 5.0软件中(Graphpad,San Diego,CA)，利用高斯曲线拟合构建候选离子对的相对响应-碰撞能曲线(RRCEC)，以曲线的最高点对应CE值作为最优CE值。各多肽的定量离子对、保留时间(tR)及质谱参数碰撞能CE见表2。
表2 8个目标多肽的序列、保留时间、定量离子对、碰撞能CE
Figure BDA0002966259300000131
5方法学验证
典型色谱图如图1所示，从色谱图可以看出，8个多肽类成分具有较好分离度及峰形。从线性结果表明，8个多肽的相关系数均大于0.99，说明多肽类成分具有较好的线性关系，见表3。在方法学考察中，日内精密度实验RSD≤8.49％，日间精密度实验RSD≤10.63％，说明仪器的精密度良好；重复性实验RSD≤11.65％，结果表明该方法的重复性良好；稳定性实验RSD≤8.21％，表明各待测化合物在4℃条件下24h之内能够稳定存在。具体结果见表4。
6测定结果
对18批养殖麝香和10批野生麝香进行8个多肽的同步定量分析，定量结果如表5～表6。结果表明各批次麝香样品中多肽类成分含量变异较大，野生麝香中YLGYLEQLLR(如SEQID No.8所示)的含量远高于养殖麝香，而养殖麝香中多肽QSLEASLAETEGR(如SEQ ID No.3所示)、TLLDIDNTR(如SEQ ID No.4所示)、EVATNSELVQSGK(如SEQ ID No.6所示)的含量显著高于野生麝香。提示对相应多肽进行检测，可以实现对麝香的成分分析、鉴定和质量控制。
表3 8个多肽的线性方程、线性范围、相关系数、最低定量限与最低检测限
Figure BDA0002966259300000141
表4 8个目标多肽的日内精密度、日间精密度、重复性、稳定性
Figure BDA0002966259300000142
N.D.,not detected，未检出
表5养殖麝香中8个目标多肽的含量(ng/mg)
Figure BDA0002966259300000151
N.D.,not detected，未检出
表6野生麝香中8个目标多肽的含量(ng/mg)
Figure BDA0002966259300000161
N.D.,not detected，未检出
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 漳州片仔癀药业股份有限公司
<120> 基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 1
Asp Val Asp Ala Ala Tyr Met Asn Lys
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 2
Thr Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg
1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 3
Gln Ser Leu Glu Ala Ser Leu Ala Glu Thr Glu Gly Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 4
Thr Leu Leu Asp Ile Asp Asn Thr Arg
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 5
Val Leu Asp Glu Leu Thr Leu Thr Lys
1 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 6
Glu Val Ala Thr Asn Ser Glu Leu Val Gln Ser Gly Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 7
Ser Leu Asp Leu Asp Ser Ile Ile Ala Glu Val Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 麝香(Moschus)
<400> 8
Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg
1 5 10

Claims (10)

1.一种基于特征多肽鉴别天然麝香来源的液相-质谱联用方法，其特征在于：所述特征多肽的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述天然麝香包括养殖麝香或野生麝香中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括：
1)内标溶液制备：取内标物比伐卢定配制8～12μg/mL的内标溶液；
2)标准溶液制备：取如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽配制混合标准溶液，并稀释得到系列浓度梯度的标准溶液，其中各多肽的浓度范围为0.4～1250.00ng/mL，所述系列浓度梯度的标准溶液分别加入等体积的内标溶液，得系列浓度梯度的含内标的标准曲线溶液；
3)供试品溶液制备：提取麝香中的蛋白并酶解，得到麝香酶解样品；以麝香酶解样品与内标混合，作为麝香供试品溶液；
4)利用所述标准曲线溶液和所述麝香供试品溶液，按以下色谱条件与质谱条件进行液相-质谱检测，对麝香中的如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽进行定量分析；
色谱条件：选用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速0.1～0.5mL/min，以0.05％～0.2％甲酸-水溶液为流动相A，0.05％～0.2％甲酸-乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～5min，12％～15％B；5～10min，15％～30％B；10～15min，30％～35％B；15.1～28min，11.8～12.2％B；图谱采集时间为14～16min；
质谱条件：采用ESI正离子化模式，SRM-IDA-EPI扫描模式，根据在线优化的质谱参数进行样品测定。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：其色谱条件为：选用HSS T3色谱柱；流速0.2mL/min，以0.1％甲酸-水溶液为流动相A，以0.1％甲酸-乙腈溶液为流动相B，图谱采集时间为15min；
其质谱检测ESI正离子化模式源参数为：GS1为55psi，GS2为55psi；气帘气为30psi；碰撞气为high；喷雾电压4500V；离子化温度550℃；射入电压10V；碰撞室射出电压13V；脱簇电压为70V；
其质谱检测SRM-IDA-EPI扫描模式为：IDA阈值为300cps，CE为40eV，CES为35eV。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，还包括对质谱参数的在线优化：以所述多肽的双电荷准分子离子为母离子，单电荷子离子碎片构建三对离子对，进而衍生产生三组伪离子对，每组伪离子对分别对应在5～50eV范围内梯级变化的CE；不同碰撞能的伪离子对产生不同的相对响应值，利用高斯曲线拟合构建候选离子对的相对响应值-碰撞能曲线，以该曲线的最高点对应CE值作为最优CE值。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，提取麝香中的蛋白的方法包括：依次采用二氯甲烷、乙醇超声提取，去除溶液，残渣用水继续提取；取上清液干燥，配制成5～20mg/mL麝香提取液；对麝香提取液依次进行二硫键还原处理、烷基化处理、加入尿素并超滤处理、加入碳酸氢铵并超滤处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述二硫键还原处理采用的试剂包括TCEP；所述烷基化处理采用的试剂包括碘代乙酰胺；所述酶解采用的试剂包括胰酶。
8.一种权利要求1至7中任一项所述的方法在麝香分析、麝香鉴定或麝香质量控制中的应用。
9.麝香中的特征多肽，所述特征多肽包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的多肽中的至少一种。
10.一种权利要求9所述的麝香中的特征多肽在麝香分析、麝香鉴定或麝香质量控制中的应用。
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