CN110160856A - 一种基于fass-mcds在线富集测定生物碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于毛细管电泳分析领域，公开了一种场放大样品堆积技术(FASS)‑胶束溶剂堆积技术(MCDS)在线富集测定生物碱含量的方法，所述生物碱为苦参碱和氧化苦参碱。该方法通过配制不同电导率的背景缓冲液和样品溶液以及使用环糊精逆转分析物的有效迁移率来完成富集，成功应用于复杂样品基质中目标成分的检测。本发明方法不仅操作简便、分析时间短、无需用到有机溶剂，而且灵敏度得到了显著提高，富集倍数可达169～218倍，为复杂样品基质中生物碱的测定提供了新选择。

Description

一种基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法

技术领域

本发明涉及毛细管电泳分析领域，具体涉及一种场放大样品堆积技术(FASS)-胶束溶剂堆积技术(MCDS)在线富集测定复杂样品基质中生物碱含量的方法。

背景技术

毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。由于其具有分析速度快，分离效率高，操作简单，低溶剂消耗等优点，毛细管电泳技术已成为现代分离科学的重要组成部分，广泛应用于食品、药物、环境、生命科学等各个领域。然而，检测灵敏度低仍是制约其发展的一个瓶颈。

近年来，毛细管电泳在线富集技术发展迅速，而场放大样品堆积技术(FASS)是所有在线富集技术中经典和操作最为简单的富集技术，它是利用背景缓冲液和样品基质之间电导率的差异来实现聚焦作用的。胶束环糊精堆积技术(MCDS)则是由Quirino在2017年提出的一种新型在线富集技术，其原理是利用环糊精与胶束溶液的结合作用来逆转待测分析物的有效迁移率，使分析物在样品区带与环糊精区带边界堆积，完成富集。与其他在线富集技术不同的是，它可以在含盐或者表面活性剂的样品中进行而且富集过程中不需要有机溶剂，是一种具有广泛应用前景的绿色环保的富集技术。

多步富集不仅可以增加进样量，而且还可以有效地改善峰型，从而进一步提高检测灵敏度。目前，多种在线富集技术的联用已成为提高毛细管电泳灵敏度的新的研究趋势。

生物碱是中药中重要的有效成分之一，具有抗癌、降压、抗心律不齐、镇痛、抗菌等多种生物活性，但是大量的生物碱却会给人体带来毒副作用，因此，建立简单灵敏的检测生物碱的方法是十分必要的。

发明内容

本发明旨在提供一种灵敏、绿色环保、有效测定复杂样品基质中生物碱含量的方法，该方法操作简便、分析时间短、无需使用有机溶剂，富集效果好，显著提高了检测灵敏度。

本发明的技术方案如下：

一种基于FASS-MCDS两步在线富集测定生物碱含量的方法，所述生物碱为苦参碱和氧化苦参碱，包括如下步骤：将待测样品预处理后利用FASS-MCDS两步在线富集后进行检测，再结合苦参碱和氧化苦参碱的标准曲线得到样品中苦参碱和氧化苦参碱的含量；

所述FASS-MCDS两步在线富集条件为：缓冲液为乙酸铵-磷酸，将毛细管进行预处理，先压力进样，样品为含十二烷基苯磺酸钠的样品溶液，进样完成后再压力进样，样品为环糊精。

本发明方法中FASS-MCDS两步在线富集技术的原理为：将毛细管中先充满低pH但电导率较高的背景缓冲液，起到抑制电渗流的作用。压力进一段电导率较低的含阳离子分析物和阴离子胶束的样品溶液，然后再压力进一段环糊精溶液，由于样品溶液和环糊精溶液存在电导率差异，FASS边界形成。

进样完成后，施加正电压，由于阳离子分析物与阴离子胶束相互作用，胶束携带待测离子向正极方向(进口端)移动，在场增强效应下，样品区带变窄产生第一步富集。此外，当待测离子与胶束的络合物遇到环糊精溶液时，胶束溶液发生崩塌，阳离子待测物被释放出来，在正压条件下有效迁移方向发生反转，向负极方向移动(出口端)。待测离子在移动过程中又被来自样品区带的胶束溶液捕获，从而不断重复迁移、释放、捕获的过程，直到样品区带中的胶束溶液被耗尽，待测离子在胶束溶剂堆积界面处堆积，完成第二步富集。最后待测阳离子在区带电泳模式下被分离检测。

所述缓冲液中乙酸铵的浓度为40～80mmol/L，优选为55～65mmol/L，这是由于增加浓度可以使得样品与背景缓冲液的电导率差异变大，场放大效果明显，更利于富集，但是浓度太高会产生大量的焦耳热从而降低目标成分的富集和分离效率。

所述缓冲液中磷酸的浓度为45～90mmol/L，优选70～80mmol/L，缓冲液的pH值会影响电渗流和分析物的电离，磷酸浓度在此范围内，两种生物碱的富集效果最好。

所述胶束十二烷基苯磺酸钠(SDBS)的浓度为5～20mmol/L，优选为10～20mmol/L，SDBS的浓度过高，分析物和胶束之间的相互作用太强，分析物有效迁移方向逆转难度增加，导致富集效果减弱。

所述样品溶液进样时间为60～270s，优选200～250s，随着进样时间的增加，峰面积增加，但进样时间过长，会导致样品过载，使两种分析物的分离度降低并且峰宽变宽。

所述环糊精为α-环糊精、γ-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或异丙基-β-环糊精中的任意一种，优选为异丙基-β-环糊精，这是由于异丙基-β-环糊精能提供令人满意的峰形，富集效果最好，更易于过滤。

所述环糊精的浓度为10～70mmol/L，优选为45～55mmol/L，增加环糊精的浓度可以在环糊精-胶束边界处更有效地降低分析物在胶束中的保留因子，从而更好地逆转分析物的有效迁移方向，但当环糊精浓度增加到一定程度时，靶向分析物的迁移时间延长而且富集效果没有明显增加。

所述环糊精的进样时间为60s。

上述方法中压力进样的压力为50mbar。分离电压为20～30kV，温度为20～30℃，检测波长为205nm。

对毛细表进行预处理具体为：将毛细管依次用用NaOH溶液、水和缓冲液分别冲洗3～10min。

所述标准曲线建立方法为：将浓度为0.1～10.0μg/mL的苦参碱和氧化苦参碱的标准溶液利用FASS-MCDS两步进样富集后进行检测，再根据得到的毛细管电泳谱图分别绘制苦参碱和氧化苦参碱的标准曲线。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明方法首次将场放大样品堆积技术和胶束环糊精堆积技术结合，通过配制不同电导率的背景缓冲液和样品溶液以及使用环糊精逆转分析物的有效迁移率来完成富集，并成功应用于测定复杂样品基质中生物碱的含量，该方法操作简便、分析时间短、分离效率高而且准确可靠，重现性好，富集倍数可达169～218倍，为复杂样品基质中生物碱的测定提供了新选择；

(2)本发明方法在富集过程中无需用到有机溶剂，减少了对环境的污染和人体健康的损害，更加符合绿色化学的要求。此外，该方法可以减弱样品制备过程对富集的影响，应用范围也更加广泛。

附图说明

图1为背景缓冲液中乙酸铵浓度对生物碱富集效果的影响，图中，横坐标为乙酸铵浓度，纵坐标为峰面积。

图2为背景缓冲液中磷酸浓度对生物碱富集效果的影响，图中，横坐标为磷酸浓度，纵坐标为峰面积。

图3为环糊精种类对生物碱富集效果的影响，图中，a、b、c、d、e代表不同种类环糊精的电泳图，分别为a:α-环糊精、b:γ-环糊精、c:β-环糊精、d:甲基-β-环糊精、e:异丙基-β-环糊精，1为苦参碱，2为氧化苦参碱。

图4为环糊精浓度对生物碱富集效果的影响，图中，a、b、c、d代表不同浓度环糊精的电泳图，分别为a:10mmol/L、b:30mmol/L、c:50mmol/L、d:70mmol/L，1为苦参碱，2为氧化苦参碱。

图5为样品基质中不同浓度十二烷基苯磺酸钠对生物碱富集效果的影响，图中，横坐标为十二烷基苯磺酸钠浓度，纵坐标为峰面积。

图6为样品进样时间对生物碱富集效果的影响，图中，横坐标为进样时间，纵坐标分别为峰面积和分离度。

图7为FASS-MCDS模式下复方苦参水杨酸(A)和加标大鼠尿样(B)中的生物碱分析物电泳图，图中，1为苦参碱，2为氧化苦参碱。

图8为常规CZE(a)和FASS-MCDS(b)模式下生物碱分析物电泳图，图中，1为苦参碱，2为氧化苦参碱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

FASS-MCDS两步富集后检测的最优条件如下：先配制含有60mmol/L乙酸铵和75mmol/L磷酸的缓冲液，再取新毛细管依次用1.0mol/L NaOH溶液冲洗20min、0.1mol/LNaOH溶液冲洗10min、纯净水冲洗10min，进样之前再将毛细管依次用0.1mol/L NaOH溶液、纯净水、缓冲液分别冲洗5min。

压力进样(240s,50mbar)，进含15mmol/L十二烷基苯磺酸钠的样品溶液，继续压力进样(60s,50mbar)，进50mmol/L的异丙基-β-环糊精，检测波长为205nm，分离电压为25kV，温度为25℃。

为了获得良好的分离检测重现性，缓冲液每运行3次后更换，所有溶液使用前用0.22μm滤膜过滤，所有实验均在室温下进行。

实施例2

对实施例1中的FASS-MCDS两步在线富集检测过程中的具体条件进行替换，具体替换方案如下：

(1)背景缓冲液中乙酸铵浓度的选择

背景缓冲液中电解质的浓度在FASS富集过程中起着重要作用，本实验研究了不同浓度(40mmol/L,50mmol/L,60mmol/L,70mmol/L,80mmol/L)的乙酸铵缓冲液对目标分析物富集效果的影响。

如图1所示，当乙酸铵浓度从40mmol/L增加到60mmol/L时，两种生物碱的峰面积增加，富集效果变好。当浓度从60mmol/L增加到80mmol/L时，两种生物碱的峰面积降低，富集效果减弱。产生这种现象的原因可能是缓冲液中浓度增加使得样品与背景缓冲液的电导率差异变大，场放大效果明显，更利于富集。但是浓度太高会产生大量的焦耳热从而降低目标成分的富集和分离效率。综上所述，背景缓冲液中乙酸铵浓度为60mmol/L是最佳条件。

(2)背景缓冲液中磷酸含量的选择

在毛细管区带电泳中，缓冲液的pH值对于分析物的检测非常重要，因为它可以影响电渗流和分析物的电离。为了抑制电渗流，本实验采用低pH的磷酸并且通过改变磷酸浓度(45mmol/L,60mmol/L,75mmol/L,90mmol/L)来探究缓冲液pH对两种分析物富集效果的影响。

如图2所示，当磷酸浓度为75mmol/L时，两种生物碱的富集效果最好，因此，为确保最佳富集效果，在以下研究中选择了75mmol/L的磷酸为最佳条件。

(3)环糊精种类的选择

由于环糊精结构中存在疏水内腔，它们能够与表面活性剂形成络合物。在MCDS过程中，环糊精被用来逆转分析物的有效迁移方向。实验考察了不同种类环糊精(α-环糊精，γ-环糊精，β-环糊精，甲基-β-环糊精和异丙基-β-环糊精)对生物碱分离和富集效果的影响。

结果如图3所示，β-环糊精不能提供令人满意的峰形，甲基-β-环糊精的富集效果不如其它种类环糊精。产生这一现象的原因可能是十二烷基苯磺酸钠胶束溶液无法很好地匹配这些环糊精。虽然在α-环糊精，γ-环糊精和羟丙基-β-环糊精中，富集效果和峰形相似，但是在实验过程中，α-环糊精和γ-环糊精比羟丙基-β-环糊精更难过滤。因此，最终选择羟丙基-β-CD来逆转分析物的有效迁移率。

(4)环糊精浓度的选择

胶束环糊精堆积的发生需要足够的环糊精来逆转分析物的有效迁移方向，否则不能发生富集。实验考察了不同浓度的环糊精(10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L,70mmol/L)对生物碱分离和富集效果的影响。

结果如图4所示，当环糊精浓度从10mmol/L增加到50mmol/L时，分析物的富集效果变好。这归因于较高浓度的环糊精可以在环糊精-胶束边界处更有效地降低分析物在胶束中的保留因子，从而更好地逆转分析物的有效迁移方向。但当环糊精浓度增加到70mmol/L时，靶向分析物的迁移时间延长而且富集效果没有明显增加。基于上述结果，选择使用50mmol/L羟丙基-β-CD进行进一步优化。

(5)样品基质中胶束浓度的选择

本方法中的分析物通过十二烷基苯磺酸钠(SDBS)胶束包裹并输送到堆积边界。实验考察了样品溶液中十二烷基苯磺酸钠浓度(5mmol/L,10mmol/L,15mmol/L,20mmol/L)对聚焦效应的影响。

结果如图5所示，随着SDBS浓度的增加，分析物的峰面积先增加后减小，当浓度为15mmol/L时，获得了最佳的富集效果。这种现象可以解释为当SDBS的浓度太高时，分析物和胶束之间的相互作用太强，分析物有效迁移方向逆转难度增加，导致富集效果减弱。为了确保最佳的堆积效果，最终选择了15mmol/L浓度的十二烷基苯磺酸钠。

(6)进样时间的选择

增加进样量是提高毛细管电泳灵敏度的有效方法之一，本实验考察了不同进样时间(60s,120s,180s,240s,270s)对生物碱分离和富集效果的影响。

结果如图6所示，当进样时间从60秒增加到270秒时，峰面积增加。然而，随着样品注射时间的延长，两种分析物的分离度降低并且峰宽变宽。这可能是由样品过载引起的。考虑到分析物的灵敏度和分辨离度，最终选择进样时间为240s。

实施例3

建立苦参碱和氧化苦参碱的标准曲线：取苦参碱和氧化苦参碱的标准品，以纯水为溶剂配制得到1mg/mL的混合标准溶液母液，分别取适量1mg/mL的混标储备液，准确配制苦参碱和氧化苦参碱的浓度分别为0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、7.5、10.0μg/mL的混标溶液，在实施例1所述的最优进样条件下平行检测三次，得到标准溶液毛细管电泳谱图，以所得谱图中各标准品的峰面积为纵坐标、混合标准溶液中标准品的浓度为横坐标分别绘制苦参碱和氧化苦参碱的标准曲线。结果表明，在0.1～10.0μg/mL之间，苦参碱和氧化苦参碱的线性关系良好，具体的标准曲线见下表1。

将5μg/mL的混标溶液一天之内连续进样6次评价日内精密度，连续3天每天进样3次评价日间精密度，结果得到的峰面积RSD均小于2.88％，证明该方法重现性好，实验结果见表1。

本方法对苦参碱和氧化苦参碱的富集倍数分别为169和218倍，较常规毛细管区带电泳模式检测灵敏度高。

表1方法的线性范围、检出限、重现性和富集倍率

富集倍数＝(本方法待测物的峰面积/常规待测物的峰面积)×稀释倍数。

实施例4：利用FASS-MCDS毛细管电泳法检测样品

将复方苦参水杨酸散和生物样品大鼠尿液分别采用FASS-MCDS两步富集模式进行毛细管电泳检测，样品检测前经过如下预处理：

复方苦参水杨酸散的预处理方法为：准确称取复方苦参水杨酸0.5g，加入10mL甲醇，超声提取30min，离心取上清液，挥干甲醇并用15mmol/L的十二烷基苯磺酸钠复溶。

生物样品大鼠尿液的预处理方法为：取正常大鼠尿样于13000rpm离心30min取上清液得大鼠原尿样品。将大鼠原尿样品与甲醇等体积混合，震荡摇匀后13000rpm高速离心30min，取上清液即得处理后的大鼠尿样。分别取适量含苦参碱和氧化苦参碱的混合标准品加入到含有500μL上述大鼠尿样的15mmol/L十二烷基苯磺酸钠溶液中(总体积为1mL)得到加标大鼠尿样。

在实施例1所述的最优条件下，对预处理后的试样溶液进行检测，得到的复方苦参水杨酸散和生物样品大鼠尿液的毛细管电泳谱图分别如图7A和图7B所示，将所得谱图中苦参碱和氧化苦参碱的峰面积分别代入实施例3构建的标准曲线中，分别计算得出试样中苦参碱和氧化苦参碱的含量，其中复方苦参水杨酸散中苦参碱和氧化苦参碱的含量分别为7.97μg/mL和8.32μg/mL，尿液中苦参碱和氧化苦参碱的含量分别为4.95μg/mL和4.94μg/mL。

实验证明，本发明方法适用于复杂样品基质中生物碱的检测，且富集效果显著，具有较强的应用前景。

对比例

分别利用常规进样模式和FASS-MCDS两步进样模式对样品中的苦参碱和氧化苦参碱含量进行检测，其分离及富集效果如图8所示，由图可知，FASS-MCDS两步富集模式相比于常规进样模式，富集效果更显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述生物碱为苦参碱和氧化苦参碱，包括如下步骤：将待测样品预处理后利用FASS-MCDS两步在线富集后进行检测，再结合建立的苦参碱和氧化苦参碱的标准曲线得到样品中苦参碱和氧化苦参碱的含量；

所述FASS-MCDS两步在线富集条件为：缓冲液为乙酸铵-磷酸，将毛细管进行预处理，先压力进样，样品为含十二烷基苯磺酸钠的样品溶液，进样完成后再压力进样，样品为环糊精。

2.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述缓冲液中乙酸铵的浓度为40～80mmol/L，磷酸的浓度为45～90mmol/L。

3.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述样品溶液中十二烷基苯磺酸钠的浓度为5～20mmol/L。

4.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述含十二烷基苯磺酸钠的样品溶液的进样时间为60～270s。

5.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述环糊精为α-环糊精、γ-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或异丙基-β-环糊精中的任意一种，所述环糊精(乙酸铵-磷酸溶液)浓度为10～70mmol/L。

6.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述环糊精的进样时间为50～70s。

7.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述压力进样的压力为40～60mbar。

8.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述方法的分离电压为20～30kV，温度为20～30℃，检测波长为205nm。

9.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述预处理为：将毛细管依次用用NaOH溶液、水和缓冲液分别冲洗3～10min。

10.根据权利要求1所述的基于FASS-MCDS在线富集测定生物碱含量的方法，其特征在于，所述标准曲线建立方法为：将浓度为0.1～10.0μg/mL的苦参碱和氧化苦参碱的标准溶液利用FASS-MCDS两步进样富集后进行检测，再根据得到的毛细管电泳谱图分别绘制苦参碱和氧化苦参碱的标准曲线。