CN111007160A

CN111007160A - 一种基于fesi-mcds-mekc检测中性物质含量的方法

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Publication number: CN111007160A
Application number: CN201911031010.0A
Authority: CN
Inventors: 楚楚; 刘彩婧; 连琳敏; 李璟; 颜继忠
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN111007160B

Abstract

本发明公开了一种基于FESI‑MCDS‑MEKC检测中性物质含量的方法，利用胶束电动色谱模式(MEKC)下的场放大进样(FESI)和胶束溶剂堆积技术(MCDS)的联用技术来分析测定复杂样品基质中中性分析物的方法，具体包括：先分别对毛细管和样品进行预处理，再基于FESI‑MCDS‑MEKC进行电泳分析，最后绘制酸中性物质的标准曲线，定量分析中性物质的含量，所述的中性物质为酸枣仁皂苷A或酸枣仁皂苷B。本发明进一步提高了CE检测中性分析物的灵敏度，拓展了CE在中性分析物方面的应用。该方法简便、重现性好、绿色环保，相比于已报道的方法，灵敏度得到了显著提高，富集倍数为140‑152倍。

Description

一种基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法

技术领域

本发明涉及毛细管电泳分析领域，具体涉及一种在胶束电动色谱模式 (MEKC)下的场放大进样(FESI)和胶束溶剂堆积技术(MCDS)的联用技术来分析测定复杂样品基质中中性分析物的方法。

背景技术

毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是近年来发展最快的高效分离分析技术之一，具有操作简单、分离效率高、分析速度快、样品消耗少、分离模式多等优点，在药物、食品、环境、生命科学等领域有广泛的应用。但是由于CE进样体积小，检测光程短，导致其检测灵敏度低，限制了它在痕量物质分析方面的应用。为了解决这一问题，无需对仪器进行改造而仅通过对样品、背景缓冲溶液的组成以及进样程序进行适当调控的在线富及技术越来越受到关注。

中性物质在电解液中不带电，不能在常规的区带毛细管电泳中分离，是毛细管电泳分离的难题。胶束电动毛细管色谱(MEKC)则通过在背景缓冲液中加入胶束从而完成了中性分析物的分离测定。由于中药成分复杂、含量低微，因此，香豆素类、皂苷类、萜类等中性物质的定量分析仍然受到极大限制。为了提高中性物质的检测灵敏度，基于MEKC的在线富集方法逐渐发展起来，如吹扫技术(Sweeping)、场放大进样-反向胶束迁移技术(FESI-RMM)和胶束环糊精堆积技术(MCDS)等。但是这些技术的富集倍数大多只有几倍-几十倍，其灵敏度仍有待提高。

为了进一步提高CE检测中性分析物的检测灵敏度，本实验以酸枣仁皂苷为研究模型，通过对分离和富集条件的优化，首次建立了在胶束电动色谱模式下的场放大进样和胶束环糊精堆积联用的在线富集技术，为检测复杂基质样品中的痕量中性分析物提供了新的选择和思路。

发明内容

本发明旨在提供一种快速、灵敏、绿色环保的测定复杂样品基质中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B含量的方法，该方法操作简便、重现性好、绿色环保，显著提高了检测灵敏度。

本发明的技术方案如下：

一种基于FESI-MCDS-MEKC的两步策略检测中性物质含量的方法，包括：先分别对毛细管和样品进行预处理，再基于FESI-MCDS-MEKC进行电泳分析，最后绘制中性物质的标准曲线，定量分析中性物质的含量，其特征在于，所述的中性物质为酸枣仁皂苷A或酸枣仁皂苷B；

所述电泳分析的条件为：以40～120mmol/L十二烷基硫酸钠 -10％～40％甲醇-40～60mmol/L磷酸-5～15mmol/L磷酸二氢钠为缓冲液，先40～60mbar压力进环糊精溶液，再40～60mbar压力进纯水，最后-5～-10 kV电压进含十二烷基硫酸钠的样品溶液，分离电压为-15～-25kV，温度为 20～30℃，检测波长为203nm。

本发明方法中FESI-MCDS-MEKC两步在线富集技术的原理为:毛细管电泳中首先充满了含阴离子胶束的低pH背景缓冲液，在负电压下，胶束的迁移速度大于电渗流的速度，形成了反向胶束迁移的胶束电动毛细管色谱模式。环糊精溶液和水柱依次通过压力进样注入毛细管中，然后将含阴离子胶束的样品溶液在场放大进样模式(FESI)下注入毛细管中。由于水柱提供的高场强，使得分析物在水柱边缘堆积，完成第一步富集。水柱在电渗流的影响下从进口端流出，被胶束包裹的分析物则继续朝出口端移动，遇到环糊精溶液后，环糊精与胶束发生反应，结合生成更稳定的络合物，导致没有足够的表面活性剂分子去形成胶束，分析物被释放出来。中性分析物不带电，迁移速度接近于0，堆积在样品区带和环糊精区带边界，当环糊精溶液消耗完全时，第二步富集完成。随后，中性分析物在MEKC模式下完成分离。

优选地，所述缓冲液中十二烷基硫酸钠(SDS)浓度为90～110mmol/L。 SDS浓度过高时，分析物与溶剂峰的分离度变小。

优选地，所述缓冲液中甲醇含量为25％～35％。这是由于若甲醇含量太低，分析物难以分离完全，甲醇含量太高，迁移时间延长。

所述环糊精为异丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、α-环糊精或β-环糊精中的任意一种，优选为异丙基-β-环糊精。这是由于异丙基-β-环糊精能提供更好的峰形。

所述环糊精溶液的进样时间为45～225s，优选为170～190s。随着环糊精进样时间的增加，分析物的峰面积变大，但是进样时间过长则会导致分析物的分离度变差。

所述样品溶液中十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度为10～25mmol/L，优选为18～22mmol/L。样品中SDS浓度过高，分析物与胶束的相互作用太强，难以被释放。所述样品溶液的进样时间为180s。

所述毛细管的预处理包括：利用1mmol/L NaOH、0.1mmol/L NaOH、水和缓冲液依次冲洗5～20min。每两次运行之间，0.1mmol/L NaOH、水和缓冲液依次冲洗3～5min。

所述酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准曲线建立方法包括：将浓度为1.0～12.5μg/mL的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准溶液基于 FESI-MCDS-MEKC进行电泳分析，再以毛细管电泳谱图中的峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标分别绘制酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准曲线。

所述酸枣仁皂苷A的标准曲线为y＝6.8906x+0.0201，所述酸枣仁皂苷 B的标准曲线为y＝8.2343x+0.0415。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明方法首次在反向胶束迁移-胶束电动毛细管色谱模式下将场放大进样技术和胶束环糊精堆积技术结合，从而进一步提高CE检测中性分析物的灵敏度，拓展了CE在中性分析物方面的应用。且该方法操作简便、分析时间短、分离效率高而且准确可靠，重现性好，富集倍数可达 140～152倍，相比于已有的富集方法也更高，为复杂样品基质中中性物质的测定提供了新选择。

(2)本发明方法样品前处理过程简单，富集过程中用到的有机溶剂量少，符合绿色化学的要求，应用也更为广泛。

附图说明

图1为背景缓冲液中SDS浓度对中性物质富集效果的影响效果图，图中，横坐标为SDS浓度，纵坐标为峰面积。

图2为背景缓冲液中甲醇含量对中性物质富集效果的影响效果图，图中a、b、c代表不同的甲醇含量，分别为a:10％、b:30％、c:40％；1和2 分别代表两种不同的中性物质，分别为1：酸枣仁皂苷B、2：酸枣仁皂苷 A。

图3为环糊精种类对中性物质富集效果的影响效果图，图中，a、b、 c、d代表不同种类环糊精的电泳图，分别为a:异丙基-β-环糊精、b:甲基-β- 环糊精、c:α-环糊精、d:β-环糊精；1和2分别代表两种不同的中性物质，分别为1：酸枣仁皂苷B、2：酸枣仁皂苷A。

图4为环糊精进样时间对中性物质富集效果的影响效果图，图中，横坐标为环糊精进样时间，纵坐标分别为峰面积。

图5为样品基质中不同浓度十二烷基硫酸钠对中性物质富集效果的影响效果图，图中，横坐标为十二烷基硫酸钠浓度，纵坐标为峰面积。

图6为FESI-MCDS-MEKC模式下酸枣仁配方颗粒(A)和加标大鼠尿样(B)中的生物碱分析物电泳图；图中，1和2分别代表两种不同的中性物质，分别为1：酸枣仁皂苷B；2：酸枣仁皂苷A。

图7为常规MEKC(a)和FESI-MCDS-MEKC(b)模式下中性分析物电泳图；图中，1和2分别代表两种不同的中性物质，分别为1：酸枣仁皂苷B；2：酸枣仁皂苷A。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明基于FESI-MCDS-MEKC两步策略在线检测酸枣仁皂苷A或酸枣仁皂苷B含量的方法，包括如下步骤：

(1)对毛细管进行预处理：利用1mmol/L NaOH、0.1mmol/L NaOH、水和缓冲液依次冲洗5～20min。

(2)基于FESI-MCDS-MEKC两步富集后进行电泳分析，具体条件如下：以40～120mmol/L十二烷基硫酸钠-10％～40％甲醇-50mmol/L磷酸-10 mmol/L磷酸二氢钠为缓冲液，将毛细管依次经过1mmol/L NaOH、0.1 mmol/L NaOH、水和缓冲液依次冲洗20min、10min、10min、10min，再依次50mbar压力条件下进环糊精溶液45～225s，50mbar压力进纯水2 s，-8kv电压进含0～25mmol/L SDS的样品溶液，分离电压为-20kV，温度为25℃，检测波长为203nm。

(3)分别绘制酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准曲线，定量分析中性物质的含量。

实施例1：FESI-MCDS-MEKC两步富集条件优化

(1)背景缓冲液中SDS浓度的优化

SDS是MEKC模式中常用的添加剂，对中性物质的分离至关重要。本实验研究了缓冲液中不同浓度(40mmol/L,60mmol/L,80mmol/L, 100mmol/L,120mmol/L)的SDS对目标分析物富集效果的影响，结果如图 1所示。由图1可知，SDS浓度从40mmol/L增加到100mmol/L时，两种分析物的峰高增加；而当SDS浓度增加到120mmol/L时，分析物与溶剂峰未完全分开。因此，实验选择SDS浓度为100mmol/L。

(2)背景缓冲液中甲醇含量的优化

背景缓冲液中的有机添加剂可以改善分析物的分离情况。本实验考察了甲醇含量分别为10％、30％和40％时分析物的出峰情况结果如图2所示。由图2可知，随着甲醇含量的增加，两种分析物的分离度增加，出峰时间延长；而当甲醇含量为40％时，峰宽变宽。为了在分析物的峰完全分离的情况下，减少保留时间，实验选择甲醇含量为30％。

(3)环糊精种类的优化

在MCDS中，环糊精被用来与胶束发生反应，逆转分析物的有效迁移率，而不同的环糊精疏水内腔结构不同，与表面活性剂形成络合物的能力不同。实验考察了不同种类环糊精(羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、 α-环糊精、β-环糊精)对中性物质分离和富集效果的影响，结果如图3所示。由图3可知，甲基-β-环糊精不能使分析物出峰，α-环糊精和β-环糊精条件下的峰展宽，富集效果也没有羟丙基-β-环糊精效果好，这一现象的原因可能是十二烷基硫酸钠胶束溶液无法很好地匹配这些环糊精。因此，最终选择羟丙基-β-环糊精来逆转分析物的有效迁移率。

(4)环糊精进样时间的优化

胶束环糊精堆积的发生需要足够的环糊精来逆转分析物的有效迁移方向，否则不能发生富集。在样品进样时间固定为180s的情况下，考察了环糊精进样时间为45s,90s,135s,180s,225s时分析物的峰面积和分离情况，结果如图4所示。由图4可知，进样时间从45s增加到180s时，两种分析物的峰面积增加；而当进样时间继续增加至225s时，分析物与溶剂不能完全分离。综上，选择环糊精进样时间为180s。

(5)样品基质中胶束浓度的优化

本发明中的分析物可以通过SDS胶束包裹并输送到堆积边界。实验考察了样品溶液中十二烷基硫酸钠浓度(0mmol/L,10mmol/L,15mmol/L, 20mmol/L,25mmol/L)对聚焦效应的影响结果如图5所示。由图5可知，样品基质中SDS浓度为0mmol/L，样品未出峰；而当浓度从10mmol/L 增加至25mmol/L时，峰面积先增加后减少，在浓度为20mmol/L时，两种分析物峰面积最大。因此，选择20mmol/L SDS为样品基质。

综上所述，上述优化实验得到的最优条件为：以100mmol/L十二烷基硫酸钠-30％甲醇-50mmol/L磷酸-10mmol/L磷酸二氢钠为缓冲液，压力进羟丙基-β-环糊精溶液180s，电压进含20mmol/L SDS的样品溶液。

实施例2：建立标准曲线、方法的线性范围、检出限、重现性和富集倍数

分别取适量1mg/mL混标储备液，准确配制酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的浓度分别为1.0、3.0、5.0、7.5、10.0、12.5μg/mL的混标溶液，在实施例得到的最优条件下平行测定三次。以两种皂苷的峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标作标准曲线，结果表明，在1.0-12.5μg/mL之间，酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的线性关系良好。将5μg/mL的混标溶液一天之内连续进样6次评价日内精密度，连续3天每天进样3次评价日间精密度，结果得到的峰面积RSD均小于4.3％，证明该方法重现性好。本方法对酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的富集倍数分别为140和152倍，较常规毛细管区带电泳模式检测灵敏度高。具体实验结果见下表1。

表1方法的线性范围、检出限、重现性和富集倍率

富集倍数＝(本方法待测物的峰面积/常规待测物的峰面积)×稀释倍数

实施例3：FASS-MCDS在实际样品中的应用

为了考察方法的实用性，在最优条件下，将上述优化实验创建的 FESI-MCDS-MEKC富集技术用于酸枣仁配方颗粒和生物样品大鼠尿液中酸枣仁皂苷的检测。样品检测前经过如下预处理：

酸枣仁配方颗粒的预处理方法为：取酸枣仁配方颗粒粉末0.15g置于锥形瓶中，加入10mL 70％(v/v)甲醇，超声提取30min后，取上清液，得到酸枣仁配方颗粒提取液，用20mmol/L SDS稀释至2.5mg/mL。

生物样品大鼠尿液的预处理方法为：取正常大鼠尿样于13000rpm离心30min取上清液得大鼠原尿样品。将大鼠原尿样品与甲醇等体积混合，震荡摇匀后13000rpm高速离心30min，取上清液即得处理后的大鼠尿样。分别取适量含酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的混合标准品加入到含有 500μL上述大鼠尿样的20mmol/L十二烷基硫酸钠溶液中(总体积为1mL) 得到加标大鼠尿样。

在实施例1得到的最优条件下，对上述预处理后的试样溶液进行检测，得到的酸枣仁配方颗粒和生物样品大鼠尿液的毛细管电泳谱图分别如图 6A和图6B所示，将所得谱图中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的峰面积分别代入实施例2构建的标准曲线中，分别计算得出试样中酸枣仁A和B 的含量。其中酸枣仁配方颗粒中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量分别为4.7μg/mL和2.3μg/mL，尿液中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量分别为4.91μg/mL和4.97μg/mL。

实验证明，本发明方法适用于复杂样品基质中中性物质的检测，且富集效果显著，具有较强的应用前景。

对比例

分别利用常规进样模式和FESI-MCDS-MEKC两步进样模式对样品中的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B含量进行检测，其分离及富集效果如图7 所示，由图可知，FESI-MCDS-MEKC两步富集模式相比于常规进样模式，富集效果更显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，包括：先分别对毛细管和样品进行预处理，再基于FESI-MCDS-MEKC进行电泳分析，最后绘制中性物质的标准曲线，定量分析中性物质的含量，其特征在于，所述的中性物质为酸枣仁皂苷A或酸枣仁皂苷B；

所述电泳分析的条件为：以40～120mmol/L十二烷基硫酸钠-10％～40％甲醇-40～60mmol/L磷酸-5～15mmol/L磷酸二氢钠为缓冲液，先40～60mbar压力进环糊精溶液，再40～60mbar压力进纯水，最后-5～-10kV电压进含十二烷基硫酸钠的样品溶液，分离电压为-15～-25kV，温度为20～30℃，检测波长为203nm。

2.根据权利要求1所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述缓冲液中十二烷基硫酸钠浓度为90～110mmol/L。

3.根据权利要求1所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述缓冲液中甲醇含量为25％～35％。

4.根据权利要求1所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述环糊精为异丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、α-环糊精或β-环糊精中的任意一种，所述环糊精溶液的进样时间为45～225s。

5.根据权利要求4所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述环糊精为异丙基-β-环糊精，所述环糊精溶液的进样时间为170～190s。

6.根据权利要求1所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述样品溶液中十二烷基硫酸钠的浓度为0～25mmol/L，所述样品溶液的进样时间为160～200s。

7.根据权利要求6所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述样品溶液中十二烷基硫酸钠的浓度为18～22mmol/L，所述样品溶液的进样时间为180s。

8.根据权利要求1所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述毛细管的预处理包括：利用1mmol/L NaOH、0.1mmol/L NaOH、水和缓冲液依次冲洗5～20min。

9.根据权利要求1所述的基于FESI-MCDS-MEKC检测中性物质含量的方法，其特征在于，所述标准曲线建立方法包括：将浓度为1.0～12.5μg/mL的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准溶液分别进行所述电泳分析，再以电泳谱图中的峰面积为纵坐标、以浓度为横坐标分别绘制酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准曲线。