CN110806441B - 一种铁皮石斛中金属离子的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药材分析技术领域，公开了一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，步骤为：制备铁皮石斛供试品母液；在铁皮石斛供试品母液中加入阴离子表面活性剂和电解质，调节pH得到铁皮石斛供试品溶液；配制背景缓冲液；配制络合剂溶液；设置毛细管电泳参数，依次用碱溶液、超纯水和背景缓冲液活化毛细管柱后，将络合剂溶液、铁皮石斛供试品溶液依次注入毛细管柱中，施加电压，进行在线络合和金属离子的富集；通过与标准品的电泳图对照，确定铁皮石斛供试品溶液中的金属离子浓度。本发明将在线络合和胶束到溶剂堆积巧妙结合，用于检测、分析中药铁皮石斛中的金属离子，可以大大提高检测的灵敏度，并减少络合剂的浪费和对环境的污染。

Description

一种铁皮石斛中金属离子的检测方法

技术领域

本发明涉及中药材分析技术领域，尤其是涉及一种铁皮石斛中金属离子的检测方法。

背景技术

中药铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，浙江省传统道地药材，属于兰科植物铁皮石斛的新鲜或干燥茎，又称为“黑节草”或“铁吊兰”，具有养胃健脾、滋阴补肾、润肺生津的功效，被归类为新浙八味。由于采矿、废气排放、污水灌溉等因素，重金属污染问题在中药材中也广泛存在。高剂量金属离子由于其生物累积性和非生物降解性对生态系统和人类健康具有潜在危害。例如，镍是具有潜在毒性的人体必需微量元素。镍引起的最常见症状是呼吸系统疾病和皮炎。镍的某些化合物甚至是致癌物质。钴对皮肤的主要影响是过敏或刺激性皮炎，对呼吸系统也有一定影响。过量的铜会对肾脏，胃肠道，运动和感觉神经造成潜在风险。汞的剧毒性质现在已为公众所知。暴露于高汞可能导致脑损伤，炎症，自身免疫，并影响神经系统的发育。暴露于部分由工业排放或吸烟产生的镉可导致肾脏和肝脏毒性并影响胚胎的正常生长。因此，开发一种灵敏高效的测定中药材中金属离子的方法是很有必要的。

目前，各种分析技术如比色测定、荧光传感器阵列伏安法、火焰原子吸收光谱法和共振拉曼等被开发，用于金属离子的测定。然而，由于复杂仪器和繁琐预处理程序的要求，这些技术的更广泛应用受到限制。近年来，配备二极管阵列检测器的毛细管电泳法在金属离子的检测中越来越受欢迎，它具有高效、易控制和低溶剂消耗的特点。例如，在中国专利文献上公开的“一种液体中金属阳离子的毛细管电泳检测方法”，其公告号CN107389774A，包括如下步骤：分别配制各离子单标溶液，经毛细管电泳仪得出各离子的出峰时间；配制不同浓度的各离子的混标溶液，经毛细管电泳仪得出各离子浓度和出峰面积的线性特征关系；检测待测样品，得出出峰面积，计算得出待测样品中各离子的浓度。此方法出峰间隔大，线性范围宽，准确性高，检测速度快。

但使用毛细管电泳法检测金属离子时，由于一些金属在紫外可见光下没有发色团，需在毛细管柱前或柱上使用络合剂，已报道的络合剂有咪唑、1，10-菲咯啉、卟啉等。而现有技术中，络合剂都是溶解在背景缓冲液中的，众所周知，背景缓冲液使用量相对较大，但实际仅需要少量的络合剂即可与分析物反应，将络合剂溶于背景缓冲液中，会造成络合剂的浪费，且络合剂均为有机物，使用量大会对环境造成污染，并影响检测结果和灵敏度。此外，毛细管电泳法检测金属离子时，由于其有限的注入量和短光路，导致其测定灵敏度较低。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中使用毛细管电泳法检测金属离子时，络合剂都是溶解在背景缓冲液中的，而背景缓冲液使用量相对较大，造成络合剂的浪费、易对环境造成污染，并影响检测结果和灵敏度；此外，毛细管电泳法检测金属离子时，由于其有限的注入量和短光路，导致其测定灵敏度较低的问题，提供一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，将在线络合和胶束到溶剂堆积的富集方法应用于毛细管电泳法中，大大减少了检测过程中络合剂的浪费和对环境的污染，并提高了检测的灵敏度。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，包括如下步骤：

(1)制备铁皮石斛供试品母液；

(2)在铁皮石斛供试品母液中加入阴离子表面活性剂和电解质，使得阴离子表面活性剂的浓度为4.2～16.2mmol/L，电解质浓度为140～220mmol/L，调节pH至5～6，得到铁皮石斛供试品溶液；

(3)配制背景缓冲液，所述背景缓冲液为含有甲醇的电解质溶液，背景缓冲液中的电解质浓度与铁皮石斛供试品溶液中的电解质浓度相同；

(4)配制络合剂溶液，所述络合剂溶液中络合剂的浓度为10～50mmol/L；

(5)设置毛细管电泳参数，依次用碱溶液、超纯水和背景缓冲液活化毛细管柱后，将络合剂溶液、铁皮石斛供试品溶液依次注入毛细管柱中，施加电压，进行在线络合和金属离子的富集；

(6)通过与标准品的电泳图对照，确定铁皮石斛供试品溶液中的金属离子浓度。

本发明没有将络合剂溶解在背景缓冲液中，而是直接将络合剂和铁皮石斛供试品溶液注入，使络合剂和铁皮石斛供试品溶液中的金属离子进行在线络合，大大减少了络合剂的用量，减少了浪费和污染的同时提高了检测灵敏度。

同时，本发明还利用胶束到溶剂堆积法对金属离子进行富集。胶束到溶剂堆积的重点是基于胶束和溶剂边界上带电分析物的有效电泳迁移率的逆转，胶束到溶剂堆积的基本条件是含胶束的样品溶液和含有机溶剂的背景缓冲液，并且要求样品溶液中的胶束与带电分析物具有相反的电荷，以结合分析物并将分析物运输到胶束和溶剂边界上，并且背景缓冲液中有机溶剂的量必须足以在通过边界时减小胶束与分析物的相互作用，从而释放出分析物。

本发明中的待测金属离子为阳离子，因此在铁皮石斛供试品母液加入阴离子表面活性剂和电解质制得铁皮石斛供试品溶液，金属离子与阴离子表面活性剂所带电荷相反，施加正向电压条件下，由于静电力相互作用，阴离子胶束携带待测阳离子向正极(进口端)移动，当接触到背景缓冲液时，有机溶剂甲醇会降低胶束和待测离子的相互作用，使得待测阳离子从胶束中释放出来，其电泳迁移方向发生改变，从正极变为负极，向出口端移动，背景缓冲液中的胶束携带待测离子继续向正极移动，样品开始产生堆积，区带变窄。胶束携带金属阳离子不断向负极移动并不断堆积，当所有阳离子全部从胶束中释放出来，堆积完成。最后待测离子可在合适毛细管电泳模式下进行分离、检测。为了保证金属离子的聚集是由胶束到溶剂堆积的效应引起的，而不是其他场放大效应，铁皮石斛供试品溶液中的电解质浓度与背景缓冲液中保持一致。

因此，本发明以“在线络合”作为增敏手段和“胶束到溶剂堆积”作为富集手段，将两者巧妙结合，用于检测、分析中药铁皮石斛中的金属离子，可以大大提高检测的灵敏度，并减少络合剂的浪费和对环境的污染。

作为优选，步骤(1)中铁皮石斛供试品母液的制备方法为：将铁皮石斛药材粉碎并过筛后，加入68％浓硝酸混匀并静置10～30min，得到液体混合物；将液体混合物在100℃下进行消解，至液体混合物呈澄清状态后得到消解液；将消解液冷却至室温，离心分离后将上清液稀释得到所述铁皮石斛供试品母液。采用该方法制备铁皮石斛供试品母液，可以有效破坏有机物、溶解颗粒物，并将各种价态的待测元素氧化成单一高价态，有利于后续检测。

作为优选，液体混合物中铁皮石斛药材与浓硝酸的比例为1g：(40-50)mL。采用该比例范围，可保证铁皮石斛药材消解充分。

作为优选，步骤(2)中的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，电解质为乙酸钠。SDS为阴离子表面活性剂，所带电荷与金属离子相反，加入含有乙酸钠的铁皮石斛供试品溶液中，可以使金属离子有效实现胶束到溶剂堆积。

作为优选，步骤(3)中配制的背景缓冲液中甲醇的质量含量为30～70％。在此含量范围内，可以减小胶束与金属离子的相互作用，从而使金属离子可以有效释放。

作为优选，步骤(4)中配制的络合剂溶液中的络合剂为1,10-菲咯啉、18-冠醚-6、L-半胱氨酸、咪唑中的一种。这些络合剂与金属离子的结合力强，并能增强多种金属离子的紫外吸收。

作为优选，步骤(4)中配制的络合剂溶液中络合剂为1,10-菲咯啉时，溶剂为甲醇；络合剂为18-冠醚-6、L-半胱氨酸、咪唑时，溶剂为水。采用合适的溶剂可以保证络合剂充分溶解并有效发挥自身作用。

作为优选，步骤(5)中注入络合试剂前依次用1.0mol/L氢氧化钠溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液、超纯水和背景缓冲溶液活化毛细管柱，活化时间分别为10min、10min、5min、5min。用氢氧化钠溶液活化毛细管柱，可以平滑毛细管柱的内表面，并活化硅羟基，然后用水洗去氢氧化钠溶液，再用背景缓冲液平衡毛细管柱，保证检测精度。

作为优选，步骤(5)中络合剂溶液的进样时间为2～10s，铁皮石斛供试品溶液的进样时间为40～100s。在此进样时间范围内，金属离子的峰面积和峰高均达到最优。

作为优选，步骤(5)中络合剂溶液和铁皮石斛供试品溶液的注入压力为50mbar，施加的电压为16kV。在此注入压力和电压下，可以实现有效络合和富集。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)将在线络合与胶束到溶剂堆积富集方法相结合，并应用于中药材中金属离子的检测，使仪器对金属离子的检测灵敏度大大提高，且减少了络合剂的浪费和对环境的污染，属于环境友好型的绿色检测方法；

(2)前期只需要对铁皮石斛供试品进行预处理，后续络合以及富集只需设置毛细管电泳的参数，利用仪器的自动进样方法，即可机动完成金属离子的检测，操作环境安全，操作步骤简单易控；

(3)应用范围广泛，无论是铁皮石斛还是其他中药材，均能用本发明方法进行金属离子的检测。

附图说明

图1是本发明在线络合与胶束到溶剂堆积联合的模型图；

图2是毛细管电泳中在线络合与胶束到溶剂堆积效果的实验验证图；

图3是考察不同络合剂种类的电泳图；

图4是考察不同络合剂浓度的富集效果折线图；

图5是考察络合剂不同注入时间的富集效果折线图；

图6是考察样品溶液中不同SDS浓度的富集效果折线图；

图7是考察样品溶液中不同乙酸钠含量的富集效果折线图；

图8是考察样品溶液中不同乙酸钠含量的电泳图；

图9是考察背景缓冲液中不同甲醇含量的富集效果折线图；

图10是考察背景缓冲液中不同甲醇含量的电泳图；

图11是考察待测样品溶液不同进样时间的富集效果折线图；

图12是考察待测样品溶液不同进样时间的电泳图；

图13是实施例中铁皮石斛供试品溶液的电泳图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。

本发明实施例中涉及的金属离子对照品溶液，其制备方法为：分别精密称定适当量的六水合硝酸镍(Ni²⁺)，六水合硝酸钴(Co²⁺)，三水合硝酸铜(Cu²⁺)，一水硝酸汞(Hg²⁺)，四水合硝酸镉(Cd²⁺)标准品于1.5mL离心管中，加适量水超声溶解，制成1000mg/mL的样品母液(由于一水硝酸汞水溶性差，配制成100mg/mL)，使用前稀释制得所需浓度的对照品溶液。

本发明实施例中涉及的络合剂溶液的配制方法为：精密称定适当量的络合试剂，包括1,10-菲咯啉，18-冠醚-6，L-半胱氨酸和咪唑，分别用合适溶剂(1,10-菲咯啉用甲醇，其余用水)超声溶解制备成100mmol/L的母液，使用前用合适溶剂(1,10-菲咯啉用甲醇，其余用水)稀释得所需浓度的络合剂溶液。

本发明实施例中涉及的阴离子表面活性剂和电解质溶液的配制方法分别为：精密称定适当量的SDS，用水超声溶解制得50mmol/L SDS母液；精密称定适当量的乙酸钠，用水超声溶解制得500mmol/L乙酸钠母液。使用时用母液配制成所需浓度。

本发明中的毛细管电泳的条件为：未涂层熔融石英毛细管长41.5cm×内径50μmi.d.，有效柱长33cm。柱温25℃，分离电压16kV，DAD检测波长214nm，宽带4nm，无参比波长。

如图1所示，在线络合与胶束到溶剂堆积联合的模型图，图中：A)起始情况：将络合剂和样品溶液依次注入毛细管中；(B)施加电压：电渗流的方向朝向负电极，样品溶液中分析物的方向朝向阳电极，与此同时，分析物与络合剂相互结合；(C-D)继续施加电压：所有胶束结合着的分析物被运输到胶束与溶剂的边界。在胶束与溶剂的边界，背景缓冲液中包含的有机溶剂降低了阴离子胶束对阳离子分析物的亲和力，并导致边界处分析物的有效电泳迁移率向阴极的反转。然后阳离子分析物被释放并分离。

如图2所示，毛细管电泳中在线络合与胶束到溶剂堆积效果的实验验证图，图中：(a)典型进样，样品溶液在50毫巴下注射5s；(b)大体积进样，样品溶液在50毫巴下注射60s；(c)胶束到溶剂堆积，样品溶液在50毫巴下注射60s；(d)简单的在线络合，首先在50毫巴下注入络合剂3s，然后进行典型的进样；(e)在线络合和大体积进样；(f)在线络合和胶束到溶剂堆积。典型进样和大体积进样的样品溶液含180mM乙酸钠。胶束到溶剂堆积的样品溶液含7.2mM SDS和180mM乙酸钠。所有用到的背景缓冲液是含有50％甲醇的180mM乙酸钠溶液。分离电压均设置在16kV，检测波长均为214nm。

一、络合剂种类的考察：

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂的种类分别为30mmol/L的1,10-菲咯啉、18-冠醚-6、L-半胱氨酸、咪唑；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠的浓度为180mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液2s、金属离子对照品溶液60s，在入口端施加正压16kV。运行开始。

结果如图3所示，从图3中可以看出，五种金属离子Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺均可以通过与1,10-菲咯啉和18-冠醚-6的络合来测定。然而，当分别注射L-半胱氨酸和咪唑作为络合剂时，仅出现Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺的峰。此外，与其他三种络合剂相比，由1,10-菲咯啉络合的五种金属离子的响应最高。该现象应该与络合剂与金属离子之间的结合力不同，以及络合剂本身的紫外吸收不同造成的。因此，采用1,10-菲咯啉作为络合剂对五种金属离子的检测灵敏度的提升最为显著。

二、络合剂浓度的考察：

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为1,10-菲咯啉，浓度分别为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠的浓度为180mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液2s、金属离子对照品溶液60s，在入口端施加正压16kV。运行开始。

结果如图4所示，从图4可以看出，随着浓度从10mmol/L增加到30mmol/L，Ni²⁺，Co²⁺和Cu²⁺的峰面积增加，随后当络合剂浓度从30mmol/L增加到50mmol/L，Ni²⁺，Co²⁺和Cu²⁺的峰面积逐渐降低。然而，对于Hg²⁺和Cd²⁺，随着1,10-菲咯啉的量达到40mmol/L，峰面积一直增加，超过40mmol/L后，峰面积基本保持恒定。该现象归因于Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺和Hg²⁺，Cd²⁺的不同紫外吸收强度。为了同时对五种金属离子实现高响应的检测，选择30mmol/L作为最佳的络合剂浓度。

三、络合剂进样时间的考察：

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为30mmol/L的1,10-菲咯啉；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠的浓度为180mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液和金属离子对照品溶液，络合剂溶液的进样时间分别为2、4、6、8、10s，金属离子对照品溶液的进样时间为60s，络合试剂在入口端施加正压16kV。运行开始。

结果如图5所示，从图5中可以看出，随着络合剂注入时间的增加，五种金属离子的峰面积均增加，但当注入时间达到6s时，峰面积增长较缓慢。这可能是由于络合剂中含有的有机溶剂对胶束到溶剂堆积效应的影响。因此，络合试剂进样8s为最优条件。

四、SDS浓度的考察：

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为30mmol/L的1,10-菲咯啉；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度分别为4.2mmol/L、7.2mmol/L、10.2mmol/L、13.2mmol/L、16.2mmol/L，乙酸钠的浓度为180mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液和金属离子对照品溶液，络合剂溶液的进样时间为8s，金属离子对照品溶液的进样时间为60s，络合试剂在入口端施加正压16kV。运行开始。

结果如图6所示，从图6中可以看出，当SDS浓度从4.2mmol/L增加到7.2mmol/L时，五种金属离子的峰面积都增加，其中，Ni²⁺，Co²⁺和Cu²⁺的峰面积增加不明显。然而，当SDS的浓度从7.2mmol/L增加至16.2mmol/L，峰面积均逐渐减小。此外，随着样品溶液中SDS含量的增加，Hg²⁺和Cd²⁺的拖尾峰也得到改善。以上现象可能是由于Hg²⁺和Cd²⁺的检测灵敏度较低，使胶束到溶剂堆积对Hg²⁺和Cd²⁺的富集效应更明显。但是一旦SDS的量足够大，就很难被背景缓冲液中的有机溶剂稀释，从而阻碍了金属离子从胶束中的释放。因此，选择7.2mmol/LSDS用于后续实验。

五、乙酸钠浓度的考察：

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为30mmol/L的1,10-菲咯啉；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠的浓度分别为140mmol/L、160mmol/L、180mmol/L、200mmol/L、220mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液和金属离子对照品溶液，络合剂溶液的进样时间为8s，金属离子对照品溶液的进样时间为60s，络合试剂在入口端施加正压16kV。运行开始。

结果如图7和图8所示，从图7中可以看出，在140-180mmol/L范围内乙酸钠浓度的增加有助于金属离子的检测。然而，随着样品溶液中乙酸钠的浓度增加至等于或大于缓冲液中乙酸钠的浓度，金属离子的检测灵敏度降低。此外，Ni²⁺和Hg²⁺的峰形随着乙酸钠浓度的增加而变差，特别是在220mmol/L时。该现象是由于随着样品溶液中乙酸钠浓度的增加，样品溶液和背景缓冲液区域之间电导率的差异增大。这导致样品溶液区域中金属离子的解堆积和意外的扭曲峰。因此，180mmol/L乙酸钠为最佳条件。

六、甲醇含量的考察：

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液分别为含30％、40％、50％、60％、70％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为30mmol/L的1,10-菲咯啉；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu^{2 +}，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠的浓度分别为180mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液和金属离子对照品溶液，络合剂溶液的进样时间为8s，金属离子对照品溶液的进样时间为60s，络合试剂在入口端施加正压16kV。运行开始。

结果如图9和图10所示，从图9中可以看出，随着甲醇含量的增加，五种金属离子的峰面积先增加后逐渐减小；从图10中可以看出，当甲醇含量为30％时，Ni²⁺，Co²⁺和Cu²⁺显示出较低的峰，Hg²⁺，Cd²⁺甚至不能被检测到。当甲醇含量超过50％时，金属离子与1,10-菲咯啉之间的分离变差，从而影响Hg²⁺和Cd²⁺的检测。以上现象可以通过以下事实来解释：低甲醇含量不足以降低胶束和金属离子之间的亲和力，不能释放金属离子。然而，当背景缓冲液中有机溶剂含量增加时，背景缓冲液的电解质浓度被稀释，影响局部电场强度并导致带点金属离子的信号强度降低。因此，50％甲醇为最佳条件。

七、待测样品注入时间的考察：

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为30mmol/L的1,10-菲咯啉；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠的浓度分别为180mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液和金属离子对照品溶液，络合剂溶液的进样时间为8s，金属离子对照品溶液的进样时间分别为40s、50s、60s、80s、100s，络合试剂在入口端施加正压16kV。运行开始。

结果如图11和图12所示，从图11中可以看出，随着注入时间从40s增加到80s，五种金属离子的峰面积均增加。然而，当注射时间长于80s时，峰面积几乎恒定或减小。此外，图12表明，随着注入时间的增加，五种金属离子的峰高增加，但当样品注入100s时，分离效率较差。上述现象的解释是，延长样品溶液注入时间，可以获得更高的富集效果，而过载的样品量不能被络合剂完全络合，导致分离效果变差。根据富集效果和分离度，选择80s作为样品溶液的最佳注入时间。

实施例：

(1)制备铁皮石斛供试品母液：将生产于浙江诸暨的铁皮石斛药材粉碎，过三号筛，精密称定粉末0.2g，置干净的烧杯中，加入8mL 68％浓硝酸，搅拌使二者完全混合后静置约20分钟，得到液体混合物；将液体混合物置于加热板上，在100℃下进行消解至液体混合物呈澄清状态后得到消解液；将消解液冷却至室温，移至离心管中，4000转离心10分钟。取1mL上清液加入10mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，得到铁皮石斛供试品母液；

(2)在铁皮石斛供试品母液中加入SDS母液和乙酸钠母液，使得SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠浓度为180mmol/L，调节pH至5.5，得到铁皮石斛供试品溶液；

(3)配制背景缓冲液，背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液；

(4)配制络合剂溶液，络合剂溶液中的络合剂为1,10-菲咯啉，溶剂为甲醇，络合剂的浓度为30mmol/L；

(5)取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶剂、铁皮石斛供试品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。运行开始前，依次用1mol/L氢氧化钠溶液(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠溶液(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液8s、铁皮石斛供试品溶液80s，在入口端施加正压16kV，运行开始。

(6)通过与标准品的电泳图对照，确定铁皮石斛供试品溶液中的金属离子浓度。

所得电泳图见图12，从图中可以看出，本批次来自浙江诸暨的铁皮石斛药材中含Co²⁺。以Ni²⁺的标准品配制不同浓度的对照品溶液，按照上述相同电泳条件进行毛细管电泳检测，获得Ni²⁺对照品的电泳色谱图。以Ni²⁺对照品的浓度为横坐标，以色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标制作Ni²⁺的标准曲线。按同样方法制作Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺的标准曲线，线性方程见表1。根据标准曲线和铁皮石斛药材提取液的色谱峰的峰面积，计算的铁皮石斛药材中含Co²⁺约0.04mg/g。

为了进一步验证本方法的可行性，进行了方法学的考察，包括重复性、线性、检测限、定量限以及加样回收率。

重复性考察：

参照下列实验步骤，平行做3组，作为考察。

1、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、金属离子对照品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为30mmol/L的1,10-菲咯啉；8号瓶加入的金属离子对照品溶液含Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺和Cd²⁺分别为4μg/mL，4μg/mL，4μg/mL，8μg/mL和8μg/mL，SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠的浓度为180mmol/L。

2、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

3、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液和金属离子对照品溶液，络合剂溶液的进样时间为8s，金属离子对照品溶液的进样时间为60s，络合试剂在入口端施加正压16kV。运行开始。

重复性实验结果如表1所示。

表1：重复性实验结果。

加样回收率的考察：

参照下列实验步骤，每个浓度平行做3组。

1、将生产于浙江诸暨的铁皮石斛药材粉碎，过三号筛，精密称定粉末0.2g，置干净的烧杯中，加入8mL 68％浓硝酸，搅拌使二者完全混合后静置约20分钟，得到液体混合物；将液体混合物置于加热板上，在100℃下进行消解至液体混合物呈澄清状态后得到消解液；将消解液冷却至室温，移至离心管中，4000转离心10分钟。取1mL上清液加入10mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，得到铁皮石斛供试品母液；在铁皮石斛供试品母液中加入SDS母液和乙酸钠母液，使得SDS的浓度为7.2mmol/L，乙酸钠浓度为180mmol/L，调节pH至5.5，得到铁皮石斛供试品溶液；

2、取9个干净毛细管电泳进样瓶，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，1-8号瓶中分别加入1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L氢氧化钠、超纯水、背景缓冲液(4、5、6)、络合剂溶液、铁皮石斛供试品溶液(装样前均需用0.22μm微孔滤膜过滤)，9号瓶作为废液瓶。

1号瓶加入的1mol/L氢氧化钠来自安捷伦标准溶液；2号瓶加入的0.1mol/L氢氧化钠由1mol/L氢氧化钠加超纯水稀释而来；3号瓶加入的超纯水以及实验过程中用于配制溶液的水均为HPLC级别；4、5、6号瓶加入的背景缓冲液为含50％甲醇的180mmol/L的乙酸钠溶液，且5、6号瓶的液面高度要保持一致；7号瓶加入的络合剂溶液中络合剂为30mmol/L的1,10-菲咯啉。

3、运行开始前，依次用1.0mol/L氢氧化钠(10分钟)，0.1mol/L氢氧化钠(10分钟)，超纯水(5分钟)，背景缓冲溶液(5分钟)活化毛细管柱。

4、选择压力注入方式，50mbar条件下先后注入络合剂溶液和金属离子对照品溶液，络合剂溶液的进样时间为8s，金属离子对照品溶液的进样时间为60s，络合试剂在入口端施加正压16kV。运行开始。

加样回收率的实验结果如表2所示。

表2：加样回收率实验结果。

回收率电泳色谱图如图13所示。结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性高。

Claims (9)

1.一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，包括如下步骤：

（1）制备铁皮石斛供试品母液；

（2）在铁皮石斛供试品母液中加入阴离子表面活性剂和电解质，使得阴离子表面活性剂的浓度为4.2~16.2 mmol/L，电解质浓度为140~220 mmol/L，所述电解质为乙酸钠，调节pH至5~6，得到铁皮石斛供试品溶液；

（3）配制背景缓冲液，所述背景缓冲液为含有甲醇的电解质溶液，背景缓冲液中的电解质浓度与铁皮石斛供试品溶液中的电解质浓度相同；

（4）配制络合剂溶液，所述络合剂溶液中络合剂的浓度为10~50 mmol/L，络合剂为1,10-菲咯啉、18-冠醚-6、L-半胱氨酸、咪唑中的一种；

（5）设置毛细管电泳参数，依次用碱溶液、超纯水和背景缓冲液活化毛细管柱后，将络合剂溶液、铁皮石斛供试品溶液依次注入毛细管柱中，施加电压，进行在线络合和金属离子的富集；

（6）通过与标准品的电泳图对照，确定铁皮石斛供试品溶液中的金属离子浓度。

2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，步骤（1）中铁皮石斛供试品母液的制备方法为：将铁皮石斛药材粉碎并过筛后，加入68%浓硝酸混匀并静置10~30min，得到液体混合物；将液体混合物在100℃下进行消解，至液体混合物呈澄清状态后得到消解液；将消解液冷却至室温，离心分离后将上清液稀释得到所述铁皮石斛供试品母液。

3.根据权利要求2所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，液体混合物中铁皮石斛药材与浓硝酸的比例为1g：(40~50)mL。

4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，步骤（2）中的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠。

5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，步骤（3）中配制的背景缓冲液中甲醇的质量含量为30~70%。

6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，步骤（4）中配制的络合剂溶液中络合剂为1,10-菲咯啉时，溶剂为甲醇；络合剂为18-冠醚-6、L-半胱氨酸、咪唑时，溶剂为水。

7.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，步骤（5）中注入络合试剂前依次用1.0 mol/L氢氧化钠溶液、0.1 mol/L氢氧化钠溶液、超纯水和背景缓冲溶液活化毛细管柱，活化时间分别为10min、10min、5min、5min。

8.根据权利要求1或7所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，步骤（5）中络合剂溶液的进样时间为2~10s，铁皮石斛供试品溶液的进样时间为40~100s。

9.根据权利要求1或7所述的一种铁皮石斛中金属离子的检测方法，其特征是，步骤（5）中络合剂溶液和铁皮石斛供试品溶液的注入压力为50 mbar，施加的电压为16kV。

Images