CN112014512A - 一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药材分析技术领域，公开了一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，包括以下步骤：制备含SDS和磷酸的石斛样品溶液；制备含SDS、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸的背景缓冲液；活化毛细管柱；将环糊精溶液通过压力进样注入毛细管柱中，再将石斛样品溶液通过电动进样注入毛细管柱中；将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，施加反向电压，进行毛细管电泳，获得电泳色谱图；测量电泳色谱图中各类三嗪类除草剂的峰面积，根据浓度‑峰面积标准曲线，获得铁皮石斛中各类三嗪类除草剂的含量。本发明将微乳液电动色谱与环糊精相结合，具有较高的分离效率和在线富集灵敏度，能实现三嗪类除草剂的快速分离检测。

Description

一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法
技术领域
本发明涉及中药材分析技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法。
背景技术
三嗪类除草剂是最早于1950年代引入的传统除草剂之一，其作用是抑制植物的光合作用。作为防止农田中的杂草和昆虫生长的高效除草剂和杀虫剂，三嗪类除草剂已在全球范围内广泛使用。但是，由于其用量大、性能稳定、残留时间长和水溶性高，可能对土壤、农作物、地表水和其他饮用水源造成污染。根据最近的研究，这些化合物及其降解产物在水中的残留会损害免疫系统，危害人类、动植物和水生生物的健康；另外，这类化合物可能引起人类癌症和先天性缺陷，并且还干扰激素的正常功能，因此世界上许多国家已经将它们列入内分泌干扰物化合物列表中。因此，为了确保生态环境和食品安全，建立快速、高效、准确的三嗪类除草剂检测方法对环境分析人员而言是紧迫的任务。
近年来，人们非常关注三嗪类除草剂，并开发了许多检测和分析方法，例如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱分析(HPLC-MS/MS)和毛细管电泳(CE)。但是，这些方法或多或少地具有一些缺点，例如灵敏度低、分析时间长、检测成本高等。因此，开发新的低成本、快速、高灵敏度的检测方法具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法。本发明将微乳液电动色谱与环糊精相结合，具有较高的分离效率和在线富集灵敏度，能实现三嗪类除草剂的快速分离检测。
本发明的具体技术方案为：
一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备石斛样品溶液：对铁皮石斛进行粗提后，经过滤器过滤后，加入十二烷基硫酸钠和磷酸，获得石斛样品溶液；
(2)制备背景缓冲液：所述背景缓冲液为含有十二烷基硫酸钠、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯的磷酸溶液；
(3)制备环糊精溶液：所述环糊精溶液为含有环糊精的磷酸溶液；
(4)活化毛细管柱；
(5)进样：将环糊精溶液通过压力进样注入毛细管柱中，再将石斛样品溶液通过电动进样注入毛细管柱中；
(6)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，施加反向电压，进行毛细管电泳，获得电泳色谱图；
(7)数据分析：测量电泳色谱图中各类三嗪类除草剂的峰面积，根据各类三嗪类除草剂的浓度-峰面积标准曲线，获得石斛样品溶液中各类三嗪类除草剂的浓度，从而获得铁皮石斛中各类三嗪类除草剂的含量。
本发明将微乳液电动色谱与环糊精(CD)相结合，机制如下：以十二烷基硫酸钠(SDS)为阴离子表面活性剂，以甲醇和正丁醇为辅表面活性剂，以乙酸乙酯为油相，形成微乳液；带正电的三嗪类除草剂(分析物)通过SDS结合在微乳滴中，在电场作用下向阳极(出口端)移动，接触到环糊精后，环糊精与SDS形成稳定的复合物，游离微乳滴浓度的下降将使微乳滴崩解而释放分析物；被释放的分析物向阴极(进口端)移动，微乳滴继续携带分析物向阳极移动，使分析物开始堆积，区带变窄；微乳滴携带分析物不断向阳极移动并不断堆积，当所有分析物均释放出来后，堆积完成，在合适的毛细管电泳模式下可实现分析物的分离和检测。由于不同的三嗪类除草剂分子量不同，在毛细管柱中的迁移率不同，故通过本发明可实现不同三嗪类除草剂之间的分离及含量检测。
本发明采用微乳液电动色谱，相较于传统的胶束毛细管电泳而言，微乳液比胶束更不牢固且更易溶，故可以提供更高的分离效率，缩短分析时间，而且其分离窗口更容易调整和控制。在微乳液电动色谱的基础上，本发明采用环糊精使微乳滴释放分析物，实现了微乳液电动色谱与在线富集技术的结合，环糊精作用快速，且经济、无污染。
作为优选，步骤(3)中，所述环糊精为α-环糊精。
环糊精的碳链长度会影响其夹杂程度，相较于其他类型的环糊精(如γ-环糊精、甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精)而言，α-环糊精的碳链最短，夹杂程度最小，因而检测灵敏度最高。
作为优选，步骤(3)中，所述环糊精溶液中，α-环糊精的浓度为50～70mM。
进一步地，步骤(3)中，所述环糊精溶液中，α-环糊精的浓度为50mM。
当将三嗪类除草剂通过载体微乳滴运输到边界时，需要一定的CD阈值才能维持边界，故在一定范围内，随着CD浓度的增大，三嗪类除草剂的检测信号增强。但当CD浓度增大到一定程度后，由于毛细管的长度限制了完全堆叠和分离所需的CD量，故继续增加CD浓度，检测信号不会进一步增强；此外，发明人经实验发现，当CD浓度由50mM增加到75mM时，扑灭津的峰面积增大，但发生峰分裂，而阿特津和西玛津的峰面积均减小。因此，从检测灵敏度考虑，本发明将α-环糊精的浓度设置为50～70mM，优选为50mM。
作为优选，步骤(2)中，所述背景缓冲液中的甲醇体积分数为15％～25％。
进一步地，步骤(2)中，所述背景缓冲液中的甲醇体积分数为20％。
当背景缓冲液中的甲醇含量过低时，低浓度的甲醇会导致微乳滴塌陷并产生堆积效应，会导致微乳滴塌陷并产生堆积效应，致使检测灵敏度和不同三嗪类除草剂的分离度降低；当甲醇含量过高时，迁移时间过长。因此，综合考虑灵敏度、分离度和迁移时间，本发明将背景缓冲液中的甲醇体积分数设置为15％～25％，优选为20％。
作为优选，步骤(2)中，所述背景缓冲液中的磷酸浓度为80～90mM。
进一步地，步骤(2)中，所述背景缓冲液中的磷酸浓度为80mM。
发明人经实验发现，在一定范围内增加背景缓冲液中的磷酸浓度，能使检测信号增强；但当磷酸浓度增大到一定值后，继续增大磷酸浓度无法再显著增强检测信号，且磷酸的导电性会使毛细管柱内的电流增大，产生更多的焦耳热，致使基线噪声增强，对三嗪类除草剂的检测造成影响。因此，综合考虑灵敏度和噪声，本发明将背景缓冲液中的磷酸含量设置为80～90mM，优选为80mM。
作为优选，步骤(2)中，所述背景缓冲液中的十二烷基硫酸钠浓度为90～110mM。
作为优选，步骤(2)中，所述背景缓冲液中的正丁醇体积分数为1.2％～1.5％。
作为优选，步骤(2)中，所述背景缓冲液中的乙酸乙酯质量浓度为0.5％～0.8％
作为优选，步骤(5)中，在将石斛样品溶液通过电动进样注入毛细管柱中之前，先向石斛样品溶液中加入十二烷基硫酸钠和磷酸。
背景缓冲液中含有SDS和磷酸，分别用于除草剂的在线富集和提高背景缓冲液的导电性。在此基础上，若在石斛样品溶液中也加入SDS和磷酸，前者也将参与除草剂的在线富集，后者则将提高样品溶液的导电性，故能提高检测灵敏度，缩短电泳时间。
进一步地，加入十二烷基硫酸钠后，石斛样品溶液中的十二烷基硫酸钠浓度为20～40mM。
进一步地，加入十二烷基硫酸钠后，石斛样品溶液中的十二烷基硫酸钠浓度为20mM。
SDS用于结合分析物并使微乳滴带负电，故当石斛样品中的SDS浓度过低时，会导致微乳滴无法向阳极运动，导致分析物的堆积难以发生，因而无法实现分析物的分离和检测。由于微乳滴坍塌释放分析物是基于游离微乳滴浓度的降低，故当石斛样品溶液中的SDS浓度过高时，不利于微乳滴崩解，会导致检测灵敏度和不同三嗪类除草剂的分离度过低。
作为优选，加入磷酸后，石斛样品溶液中的磷酸浓度为0.1M。
作为优选，步骤(5)中，所述电动进样的电压为-8～-12kV。
作为优选，步骤(5)中，所述电动进样的进样时间为60～80s。
进一步地，步骤(5)中，注入石斛样品溶液的时间为80s。
在一定范围内，随着石斛样品溶液进样时间的增加，毛细管柱中富集的石斛量增加，故检测信号增强，且微乳滴-环糊精边界更接近检测器，能减小迁移时间；但由于最大样品进样时间受限于用于叠加和分离的毛细管长度，故当石斛样品溶液进样时间进一步增加时，色谱峰会出现峰分裂的问题，影响检测。因此，综合考虑检测灵敏度和峰形，本发明将石斛样品溶液的进样时间设置为60～80s，优选为80s。
作为优选，步骤(5)中，所述压力进样的压力为0.4～0.6psi。
作为优选，步骤(5)中，所述压力进样的进样时间为50～60s。
作为优选，步骤(1)的具体过程如下：将铁皮石斛与乙腈按1g:40～50mL的质量体积比混合，静置2～3min；加入无水硫酸镁和氯化钠，所述铁皮石斛、无水硫酸钠、氯化钠的质量比为1:0.8～1.2:2～2.5，充分混合后，离心，取上清液；加入N-丙基乙二胺，充分混合后，离心，取上清液；加水，所述铁皮石斛与水的质量体积比为1g:0.1～0.13mL，涡旋后，经过滤器过滤，获得石斛样品溶液。
作为优选，步骤(7)中，所述各类三嗪类除草剂的浓度-峰面积标准曲线通过以下方法获得：
(a)制备标准溶液：将各类三嗪类除草剂和水配制成标准溶液；所述标准溶液中，各类三嗪类除草剂的浓度相同；
(b)获得电泳色谱图：将步骤(2)～(6)中的石斛样品溶液换成标准溶液，按照步骤(2)～(6)获得标准溶液的电泳色谱图，测量各类三嗪类除草剂的峰面积；
(c)获得标准曲线：将标准溶液设置成不同浓度梯度，重复步骤(b)，获得不同浓度标准溶液的电泳色谱图；以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别绘制各类三嗪类除草剂的浓度-峰面积标准曲线。
进一步地，步骤(a)中，所述各类三嗪类除草剂包括扑灭津、阿特津和西玛津。
作为优选，步骤(6)中，毛细管电泳时的检测波长为205nm。
作为优选，步骤(6)中，毛细管电泳时的电压为-8～-12kV。
作为优选，步骤(4)中，所述毛细管柱的总长度和有效长度分别为48.5cm和40cm。
作为优选，步骤(1)中，所述过滤器的孔径为0.22μm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明将微乳液电动色谱与环糊精相结合，具有较高的分离效率和在线富集灵敏度，能实现三嗪类除草剂的快速分离检测；
(2)本发明整套工艺参数均围绕三嗪类除草剂的特性设计，兼顾检测灵敏度和分离度等因素，有利于实现不同三嗪类除草剂之间的分离和检测，受分析物的特性所限，不能套用其他分析物的工艺。
附图说明
图1为不同种类环糊精对三嗪类除草剂检测效果的影响。图A为不同种类环糊精对峰面积的影响；图B为不同种类环糊精对电泳色谱图的影响，其中，曲线a为α-CD，曲线b为γ-CD，曲线c为甲基-β-CD，曲线d为羟丙基-β-CD，曲线e为羟丙基-γ-CD，“1”代表扑灭津，“2”代表阿特津，“3”代表西玛津。
图2为不同α-环糊精浓度对三嗪类除草剂检测效果的影响。图A为不同环糊精浓度对峰面积的影响；图B为不同环糊精浓度对电泳色谱图的影响，其中，曲线a为25mM，曲线b为50mM，曲线c为75mM，曲线d为100mM，“1”代表扑灭津，“2”代表阿特津，“3”代表西玛津。
图3为背景缓冲液中不同甲醇体积分数对电泳色谱图的影响。其中，曲线a为25％，曲线b为20％，曲线c为15％，曲线d为10％，“1”代表扑灭津，“2”代表阿特津，“3”代表西玛津。
图4为样品溶液中不同SDS浓度对电泳色谱图的影响。其中，曲线a为60mM，曲线b为40mM，曲线c为20mM，曲线d为0mM，“1”代表扑灭津，“2”代表阿特津，“3”代表西玛津。
图5为背景缓冲液中不同磷酸浓度对峰面积的影响。
图6为样品溶液不同进样时间对电泳色谱图的影响。其中，曲线a为120s，曲线b为100s，曲线c为80s，曲线d为60s，“1”代表扑灭津，“2”代表阿特津，“3”代表西玛津。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：材料的准备
1制备磷酸溶液
将49g磷酸(PA)溶解到1L水中，制备成浓度为0.5M的磷酸溶液。
2制备背景缓冲液
将0.5M磷酸溶液按一定稀释比稀释后，加入一定量的SDS、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯，制备成背景缓冲液。
3制备环糊精溶液
将0.5M磷酸溶液稀释成0.1M，加入一定量的环糊精，制备成环糊精溶液。
4制备石斛样品溶液
称取5g铁皮石斛溶解在40mL乙腈中，静置2min。随后，将4g无水硫酸镁和10g氯化钠添加到样品溶液中，然后以4000rpm离心5min，取上清液。然后，将50mg N-丙基乙二胺(PSA)添加到0.5mL上清液中，并以4000rpm离心5min，取上清液。最后，在上清液中加入0.5mL的纯净水，涡旋并通过0.22μm过滤器过滤，再加入SDS和磷酸，使制得的石斛样品溶液中SDS和磷酸的浓度分别为20mM和0.1M。
5制备标准溶液
将0.5M磷酸溶液稀释成0.1M，加入SDS，制备成SDS和磷酸的混合溶液；将1μg扑灭津、1μg阿特津和1μg西玛津溶解在1mL SDS和磷酸的混合溶液中，制备成浓度为1μg/mL(三种三嗪类除草剂浓度均为1μg/mL)的标准溶液。
6毛细管柱的活化与平衡
取总长度和有效长度分别为48.5cm和40cm的毛细管柱，新的毛细管柱以1bar的压力依次用1.0M氢氧化钠溶液、0.1M氢氧化钠溶液、超纯水、背景缓冲液分别淋洗毛细管柱10min、10min、5min、5min，对毛细管柱进行活化；在两次连续的运行之间，以1mbar的压力依次用1.0M氢氧化钠溶液、0.1M氢氧化钠溶液、超纯水、背景缓冲液分别淋洗毛细管柱3min、5min、3min、3min，对毛细管柱进行平衡。
实施例2：环糊精种类的选择
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精的浓度为50mM，环糊精分别选用α-环糊精(α-CD)、γ-环糊精(γ-CD)、甲基-β-环糊精(甲基-β-CD)、羟丙基-β-环糊精(羟丙基-β-CD)、羟丙基-γ-环糊精(羟丙基-γ-CD)；
(3)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将实施例1中制得的标准溶液(SDS的浓度为20mM)在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间为60s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图。
上述毛细管电泳是在安捷伦CE/MS系统(美国，加州，帕洛阿尔托，7100)上进行的，该系统配备了二极管阵列探测器。采用HPChemStation(Agilent)软件进行控制和分析。以下实施例中，均采用该毛细管电泳系统和检测软件。
图1显示了不同种类的环糊精对三嗪类除草剂检测效果的影响。从图1A中可以看到，当CD的类型为α-CD时，与其他CD相比，观察到目标分析物的峰面积最大，这可能是由于碳链长度影响了CD的夹杂程度，而α-CD的碳链最短。此外，γ-CD和甲基-β-CD表现出相似的峰面积，其原因是γ-CD和甲基-β-CD之间的分子量差异很小(前者分子量为1297g/mol，后者为1310g/mol)。另外，羟丙基-β-CD和羟丙基-γ-CD在这些测试的CD中显示出较差的富集性能，这可以归因于由羟丙基取代引起的CD结构的变化，这可能会影响分子内氢键合力。图1B中的结果表明，当选用甲基-β-CD时，所有峰均较宽。因此，选择了α-CD并用于进一步的实验。
实施例3：α-环糊精浓度的优化
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度分别设置为25mM、50mM、75mM、100mM；
(3)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将实施例1中制得的标准溶液(SDS的浓度为20mM)在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间为60s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图。
图2显示了不同α-环糊精浓度对三嗪类除草剂检测效果的影响。从图2A可以看到，当α-CD的浓度从25mM增加到50mM时，所有目标化合物的峰面积都会增大。结果表明，注入的α-CD量影响分析物的富集效率。其原因是，当将分析物通过载体微乳滴运输到边界时，需要一定的CD阈值才能维持边界。但是，当α-CD量进一步增加(75～100mM)时，未观察到峰面积的进一步增大，这可能是由于毛细管的长度限制了完全堆叠和分离所需的α-CD数量。对于75mMα-CD，扑灭津的峰面积最大，但发生峰分裂(图2B)，而其他两种分析物的峰面积减小。因此，选择50mM作为最佳的α-CD浓度。
实施例4：背景缓冲液中甲醇含量的优化
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，正丁醇的体积分数(v/v)为1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％，甲醇的体积分数分别设置为10％、15％、20％、25％；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(3)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将实施例1中制得的标准溶液(SDS的浓度为20mM)在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间为60s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图。
图3显示了背景缓冲液中不同甲醇含量对电泳色谱图的影响。从图3中可以看出，当甲醇的体积分数从10％增加到25％时，峰面积和分离度得到改善，其原因归因于以下事实：低浓度的甲醇会导致微乳滴塌陷并产生堆积效应，从而导致微乳滴塌陷并产生堆积效应。除此之外，随着浓度的增加，明显观察到更长的迁移时间。结果，考虑到较短的迁移时间和较好的富集效果，将20％的甲醇浓度用于随后的实验。
实施例5：样品溶液中SDS含量的优化
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(3)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将实施例1中制得的标准溶液(SDS的浓度分别为0mM、20mM、40mM、60mM)在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间为60s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图。
图4显示了样品溶液中不同SDS浓度对电泳色谱图的影响。从图4可以看出，在样品溶液中没有SDS时没有观察到堆积效果；随着SDS浓度增加到20mM，所有目标分析物的峰面积和峰轮廓均得到显着改善；但是，进一步增加SDS浓度并不会导致峰面积显着增加或堆积效率增加，目标分析物之间的分离度却降低了。归因于以下事实：SDS浓度应处于较低水平，以确保微乳滴崩解，因为微乳滴坍塌是基于游离的微乳滴浓度的降低。在这种情况下，选择20mM作为最佳SDS浓度以获得最佳堆积效果。
实施例6：背景缓冲液中磷酸含量的优化
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，SDS的浓度为100mM，甲醇和正丁醇的体积分数(v/v)分别为1.2％和20％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％，磷酸的浓度分别设置为50mM、60mM、70mM、80mM、90mM；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(3)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将实施例1中制得的标准溶液(SDS的浓度为20mM)在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间为60s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图。
图5显示了背景缓冲液中不同磷酸浓度对峰面积的影响。图5的结果表明，随着背景缓冲液中磷酸浓度的增加，三种三嗪类除草剂的峰面积均增加；但是，将磷酸浓度从80mM进一步增加到90mM并不会显着增加分析物的峰面积，而且，当磷酸浓度提高时，电流从45μA增加到56μA，电流的增加会产生更多的焦耳热，从而导致基线噪声增加。根据上述实验结果，将背景缓冲液中的磷酸浓度选择为80mM。
实施例7：样品溶液进样时间的优化
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(3)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将实施例1中制得的标准溶液(SDS的浓度分别为20mM)在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间分别设置为60、80、100、120s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图。
图6显示了样品溶液不同进样时间对电泳色谱图的影响。图6结果表明，当注入时间从60s增加到80s时，峰面积增加而迁移时间减少。峰面积的增加归因于可以富集的样品量的增加。进样时间的增加也使微乳滴-环糊精边界更接近检测器，从而减少了迁移时间。但是，当进样时间进一步增加到100s时，扑灭津和阿特拉津就会出现峰分裂。此外，当进样时间增加到120s时，所有化合物的峰形都会恶化。出现这种情况的原因是最大样品进样时间受到用于叠加和分离的毛细管长度的限制。基于以上实验结果，本研究选择了80s的注入时间。
实施例8：铁皮石斛中三嗪类除草剂含量的检测
1绘制标准曲线
(1)制备标准溶液：按照实施例1中的步骤，制备浓度分别为0.5、1、2.5、5、20μg/mL的标准溶液，其中，SDS的浓度为20mM；
(2)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(3)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(4)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(5)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将标准溶液在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间分别设置为80s；
(6)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得不同浓度标准溶液的电泳色谱图；
(7)获得标准曲线：根据不同浓度标准溶液的电泳色谱图，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性拟合，分别获得扑灭津、阿特津和西玛津的浓度-峰面积标准曲线。结果见表1。
表1线性回归数据、检出限和定量限
Figure BDA0002646959190000111
2铁皮石斛中三嗪类除草剂含量的检测
(1)制备石斛样品溶液：按照实施例1中的步骤制备石斛样品溶液，其中，SDS的浓度为20mM；
(2)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(3)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(4)活化或平衡毛细管柱：按实施例1中的步骤活化或平衡毛细管柱；
(5)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将石斛样品溶液在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间分别设置为80s；
(6)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图；
(7)数据分析：测量电泳色谱图中扑灭津、阿特津和西玛津的峰面积，根据相应的浓度-峰面积标准曲线，获得石斛样品溶液中这三种三嗪类除草剂的浓度，从而获得铁皮石斛中三种三嗪类除草剂的含量。
实施例9：可行性考察
1重复性考察
参照以下步骤，平行做3组(用3根相同的毛细管柱)，作为重复性考察：
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(3)活化毛细管柱：按实施例1中的步骤活化毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将实施例1中制得的标准溶液(SDS的浓度为20mM)在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间为80s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图；
(6)数据分析：测量电泳色谱图中扑灭津、阿特津和西玛津的峰面积，根据实施例8中获得的浓度-峰面积标准曲线，获得石斛样品溶液中这三种三嗪类除草剂的浓度；根据3组重复实验结果，计算重现性，结果见表2。
表2重复性数据
Figure BDA0002646959190000121
2回收率考察
(1)制备加标样品溶液：按照实施例1中的步骤制备石斛样品溶液，加入扑灭津、阿特津和西玛津各2μg/mL(即加标量为2μg/mL)，获得加标样品溶液；
(1)制备背景缓冲液：按照实施例1中的步骤制备背景缓冲液，其中，磷酸的浓度为80mM，SDS的浓度为100mM，甲醇、正丁醇的体积分数(v/v)分别为20％、1.2％，乙酸乙酯的质量浓度(w/v)为0.5％；
(2)制备环糊精溶液：按照实施例1中的步骤制备环糊精溶液，其中，环糊精为α-环糊精，浓度为50mM；
(3)活化毛细管柱：按实施例1中的步骤活化毛细管柱；
(4)进样：将环糊精溶液以0.5psi的压力注入毛细管柱中，进样时间为50s；再将加标样品溶液在-10kV电压下注入毛细管柱中，进样时间为80s；
(5)毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，柱温维持在25℃，在-10kV电压下进行毛细管电泳，检测波长为205nm，参考波长为360nm，获得电泳色谱图；
(6)数据分析：测量电泳色谱图中扑灭津、阿特津和西玛津的峰面积，根据实施例8中获得的浓度-峰面积标准曲线，获得石斛样品溶液中这三种三嗪类除草剂的浓度；
(7)重复三次实验，计算重现性，并取三次的平均值，根据以下公式计算回收率：回收率(％)＝(加标样品中目标分析物的含量-样品中目标分析物的含量)×100/加标量。结果见表3。
表3分析物的含量、回收率和重现性
Figure BDA0002646959190000131
可行性考察结果表明，本发明的方法重复性良好，回收率高，检测准确性高。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备石斛样品溶液：对铁皮石斛进行粗提后，获得石斛样品溶液；
（2）制备背景缓冲液：所述背景缓冲液为含有十二烷基硫酸钠、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯的磷酸溶液；
（3）制备环糊精溶液：所述环糊精溶液为含有环糊精的磷酸溶液；
（4）活化毛细管柱；
（5）进样：将环糊精溶液通过压力进样注入毛细管柱中，再将石斛样品溶液通过电动进样注入毛细管柱中；
（6）毛细管电泳：将毛细管柱的两端插入背景缓冲液中，施加反向电压，进行毛细管电泳，获得电泳色谱图；
（7）数据分析：测量电泳色谱图中各类三嗪类除草剂的峰面积，根据各类三嗪类除草剂的浓度-峰面积标准曲线，获得石斛样品溶液中各类三嗪类除草剂的浓度，从而获得铁皮石斛中各类三嗪类除草剂的含量。
2.如权利要求1所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述环糊精为α-环糊精。
3.如权利要求2所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述环糊精溶液中，α-环糊精的浓度为50~70mM。
4.如权利要求1所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述背景缓冲液中的甲醇体积分数为15%~25%。
5.如权利要求1所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述背景缓冲液中的磷酸浓度为80~90mM。
6.如权利要求1所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，步骤（5）中，在将石斛样品溶液通过电动进样注入毛细管柱中之前，先向石斛样品溶液中加入十二烷基硫酸钠和磷酸。
7.如权利要求5所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，加入十二烷基硫酸钠后，石斛样品溶液中的十二烷基硫酸钠浓度为20~40mM。
8.如权利要求1所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于：
步骤（5）中，所述电动进样的电压为-8~-12kV；和/或
步骤（5）中，所述电动进样的进样时间为60~80s；和/或
步骤（5）中，所述压力进样的压力为0.4~0.6psi；和/或
步骤（5）中，所述压力进样的进样时间为50~60s。
9.如权利要求1所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程如下：将铁皮石斛与乙腈按1g:40~50mL的质量体积比混合，静置2~3min；加入无水硫酸镁和氯化钠，所述铁皮石斛、无水硫酸钠、氯化钠的质量比为1:0.8~1.2:2~2.5，充分混合后，离心，取上清液；加入N-丙基乙二胺，充分混合后，离心，取上清液；加水，所述铁皮石斛与水的质量体积比为1g:0.1~0.13mL，涡旋后，经过滤器过滤，获得石斛样品溶液。
10.如权利要求1所述的一种铁皮石斛中三嗪类除草剂的检测方法，其特征在于，步骤（7）中，所述各类三嗪类除草剂的浓度-峰面积标准曲线通过以下方法获得：
（a）制备标准溶液：将各类三嗪类除草剂和水配制成标准溶液；所述标准溶液中，各类三嗪类除草剂的浓度相同；
（b）获得电泳色谱图：将步骤（2）~（6）中的石斛样品溶液换成标准溶液，按照步骤（2）~（6）获得标准溶液的电泳色谱图，测量各类三嗪类除草剂的峰面积；
（c）获得标准曲线：将标准溶液设置成不同浓度梯度，重复步骤（b），获得不同浓度标准溶液的电泳色谱图；以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别绘制各类三嗪类除草剂的浓度-峰面积标准曲线。
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