CN103163194A - 一种在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置，包括三电极三电极电源、毛细管、第一缓冲液槽、第二缓冲液槽、检测器、金属针管；转移时，金属针管与零极相连套在毛细管的进样端上，放在凝胶上表面，毛细管的出口端、三电极电源正电极放在第一缓冲液槽中，三电极电源负电极连在所述凝胶的下面；分析时，将三电极电源零电极与毛细管进样端放入第二缓冲液槽中，毛细管的出口端与三电极电源正电极仍放在第一缓冲液槽中。本发明与其他蛋白质转移方法相比，简单、快速、高效、可在线转移检测，染色与否并不影响SDS-PAGE中蛋白质条带的转移，在凝胶蛋白质转移中具有重要的理论和实际价值，具有很广泛的实际应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离和检测蛋白质的技术，尤其涉及一种在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置和方法。
背景技术
蛋白质组学技术是药物靶点发掘的一个重要方法。通过比较健康状态/疾病状态，经药处理/未经处理条件下，细胞、组织或生物体蛋白质表达谱图的差异，并分离出表达异常的蛋白质加以鉴定，从而找出与疾病相关的蛋白质和药物治疗的可能靶点。二维凝胶电泳（2-DE）和质谱（MS）联合应用是蛋白质组学中分离鉴别蛋白质的最常用方法。2-DE可以实现数千种蛋白质的同时分离，并通过染色得到蛋白质的表达图谱。MS可以精确测定由蛋白酶（通常为胰蛋白酶）水解得到的多肽片断的质量，通过肽质量指纹图谱鉴定每一个蛋白质。
经二维凝胶分离后在进行染色方能跟踪蛋白质的分离情况。常用的染色方法有考马斯亮蓝染色、硝酸银染色（银染）、荧光标记染色、负染等，这些方法的灵敏度和特点各不相同，其中考马斯亮蓝染色（coomassie brilliant blue,CBB）和银染最为常用。考马斯亮蓝染色的原理是CBB分子上的芳香苯环与蛋白质的疏水区结合，以及其亚硫酸基团（-SO3 -）与蛋白质的正电荷结合，将蛋白质染成蓝色条带。CBB有G250和R250两种，G250为二甲花青亮蓝，与蛋白质结合反应迅速，两分钟左右即可达到平衡，染色后为蓝绿色，常用来测定蛋白质含量，也可用来对电泳条带染色，但是染色后背景较深不易脱色。R250为三苯基甲烷，结构上比G250少两个甲基，染色后为红蓝色，R250与蛋白质反应速度较慢，但染料可以穿透凝胶，而且可以被洗脱下去，因此可用来对电泳条带进行染色。考马斯亮蓝染色方法简单，无毒性，染色后背景及对比度良好，但是灵敏度较低，对于表达丰度低的蛋白质，难以显色。银染是一种灵敏度非常高的染色方法，是差异蛋白质组学研究中最常用的显色方式。原理是银离子与蛋白质分子上的羧基（-COO-）结合生成稳定的复合物，银离子经甲醛还原后成为金属银，银颗粒沉积在蛋白质上，使蛋白条带呈深棕至黑色。银染的优点在于灵敏度高,但是操作较为繁琐，染色时间长，接触有毒试剂甲醛，核酸、脂多糖、脂类等化合物易引起干扰，参见：Miller I,Crawford J,Gianazza E,Protein stains forproteomic applications:which,when,why？J Proteomics,2006,6:5385～5408。
以电喷雾电离（electrospray ionization,ESI）和基质辅助激光解吸电离（matrix-assistedlaser desoption/ionization,MALDI）两项软电离技术为基础的生物质谱，具有自动化程度高、灵敏度高、准确性好的特点，能够准确测定多肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸的序列及翻译后修饰。生物质谱技术的出现使得蛋白质快速、准确、高通量的检测成为可能，无可争议的成为蛋白质组学研究的核心技术，推动着蛋白质组学的快速发展。
2-DE（二维凝胶电泳）和MS（质谱）是目前最流行、最可靠的蛋白质分析平台，但是蛋白质从二维凝胶到质谱的样品处理过程却非常的繁琐，难以对胶中所分离的蛋白进行后续的氨基酸组成和序列分析、质谱测定等结构鉴定工作或在线定性定量分析。聚丙烯酰胺凝胶是由单体和交联剂发生聚合反应生成的网状结构，由于遭受到物理障碍，以及固定和染色的影响，生物高聚物（蛋白质，核酸等）从凝胶中转移较为困难，只有采用强烈的手段才能使包埋于凝胶内的蛋白质取出来。目前报道的可以转移凝胶中蛋白质方法包括直接洗脱、电洗脱、膜转印等，具有耗时长、操作繁琐、重复性差、容易造成样品损失和分析物稀释等缺点，难以满足蛋白质组学研究的自动化需要。
本发明第一发明人于1999年首次提出利用毛细管电泳技术转移凝胶中蛋白质的思想，并于2004年获得美国专利Liu Y D,Bao J J,Methods and apparatus for automatic on-linemulti-dimensional electrophoresis,U.S.Patent,6676819,2004-01-1。2002年，Lee等开发了两电极毛细管电泳转移法，以细胞色素C、卵清蛋白、β-半乳糖苷酶为模型蛋白质，成功的从聚丙烯酰胺凝胶中转移出SDS-蛋白质复合物，并发表文章Cooper J W,Gao J,Lee C S,Gel protein capillary extraction apparatus.Electronic protein transfer,Anal Chem,2002,374:1182～1186。
发明内容
差异蛋白质组学是发现药物作用靶点的重要方法，二维凝胶电泳和质谱是分离和鉴定蛋白质的核心技术。经二维凝胶电泳分离的蛋白质，在进入质谱之前需要长时间、繁琐的样品处理过程，难以满足自动化的需要。针对该问题，本发明提供一种在线转移和分析凝胶中蛋白质的方法，其在线转移凝胶中蛋白质采用三电极的转移模式，将蛋白质高效、快速的从凝胶中转移到毛细管中，通过毛细管电泳，实现了转移出来蛋白质的再一次分离和检测。该技术的开发大大提高了蛋白质转移和进一步分离的效率，为二维凝胶电泳和质谱分析蛋白质提供了一个有效的方法。
本发明针对目前聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质点处理繁琐、时间长、样品易被稀释和损失的问题，在本发明第一发明人在美国申报的发明基础上，进一步发展和优化了基于毛细管电泳的凝胶中蛋白质转移方法。该方法根据蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移特性，以及毛细管电泳的电进样原理，将凝胶中的蛋白质直接转移到毛细管中。转移装置的核心技术是毛细管进样端口和凝胶表面的有效接触，以及三电极的使用。在毛细管外面套着的金属针管上连接零极，在毛细管的出口端和凝胶的下端分别连接正极和负极，接通三电极电源后，三个电极的使用产生一个贯穿凝胶和毛细管的高压电场，凝胶中蛋白质在该电场和毛细管电渗流泵的驱动下，很快进入毛细管中。转移结束后转换装置，使得蛋白质在毛细管内继续电泳，实现分离和检测。
为了解决上述技术问题，本发明用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置予以实现的技术方案是：包括三电极电源、毛细管、第一缓冲液槽、第二缓冲液槽、正电极、负电极、零极，所述毛细管的柱上设有检测器；还包括有一金属针管。
当用于在线转移凝胶中的蛋白质时，所述金属针管套在所述毛细管的进样端上，所述毛细管的出口端设置在第一缓冲液槽中，并通过第一缓冲液槽中的正电极与三电极电源的正极相连，所述金属针管的上端与三电极电源零极相连，所述毛细管的进样端与凝胶的上面接触，所述负电极设置在所述凝胶的下面，所述负电极与三电极电源的负极相连；
当用于在线分析凝胶中的蛋白质时，撤下负电极、凝胶和金属针管，直接将零极和毛细管进样端放入第二缓冲液槽中，所述毛细管的出口端通过第一缓冲液槽中的正电极与三电极电源的正极相连，所述毛细管的进样端通过第二缓冲液槽中的零电极与三电极电源的零极相连。
本发明一种在线转移和分析凝胶中蛋白质的方法，采用上述用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置，并包括以下步骤：
步骤一、利用平板凝胶电泳装置进行聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质处理，并将上述处理好的聚丙烯酰胺凝胶用保鲜膜包好，4℃保存；
步骤二、取一段熔融石英毛细管，对该毛细管进行预处理后备用；
步骤三、聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的毛细管电转移：
向经过预处理后的毛细管中充满pH4-9、10-50mM的运行缓冲液，其中，包括添加浓度为0.1到1.2mM的CTAB；从上述步骤一处理好的聚丙烯酰胺凝胶上切下需要转移的聚丙烯酰胺凝胶，用二甲基亚砜褪色后，根据胶块的大小用缓冲液和蒸馏水或用蒸馏水浸泡15～25min后，放在负电极上，并排除所述负电极周围的气泡；调整毛细管的位置，使得毛细管进样端与聚丙烯酰胺凝胶的表面接触；转移时，毛细管的出口端位于第一缓冲液槽中，对所述正电极、零极及负电极同时施加电压，并使零极和第一负电极之间的电压为-3.0～-6.0V，毛细管的两端施加1～12kV高电压，并根据转移目的和凝胶中蛋白质含量的不同确定转移时间的长短，记录转移时间和电流变化；
步骤四、检测被转移出来的蛋白质：
转移后，将聚丙烯酰胺凝胶和负电极、金属针管撤下，然后将零电极放入到第二缓冲液槽中，将毛细管的进样端从金属针管中拿出后插入第二缓冲液槽中，零电极与三电极电源的零极相连，进行毛细管电泳，紫外在线检测被转移出来的蛋白质；
上述步骤一至步骤四均在室温下进行。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明开发了新型三电极的转移方法和垂直方向上电提取和电排出转移技术，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品迁移原理，以及毛细管电泳的电进样原理，建立了一种新型三电极毛细管电泳方式，通过将小尺寸的毛细管端口与蛋白质凝胶条带的物理接触，使得高电压施加后在接触面上产生一个强的电场强度，迫使凝胶中带负电荷的SDS-蛋白质复合物电泳迁移至毛细管内，利用毛细管电泳场放大进样原理，在电场作用下，使凝胶中的蛋白质以高浓度的样品区带形式转移到毛细管中。该技术与传统的电洗脱和膜转印方法相比，具有简单、快速、高效、可在线转移检测的的巨大优势，经过SDS-PAGE分离过的蛋白质条带无论是否经过染色处理，均可以进行转移，在凝胶蛋白质转移中具有重要的理论和实际价值，具有很广泛的实际应用前景。
附图说明
图1是凝胶中蛋白质迁移示意图，其中（a）为水平方向迁移，（b）为垂直方向迁移；
图2是本发明用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置的连接示意图；其中，1-毛细管；21-第一缓冲液槽，22-第二缓冲液槽；31-正电极，32-负电极，33为零极；4-金属针管；5-聚丙烯酰胺凝胶；
图3（a）是含BSA样品的PAGE胶转移结果示意图；
图3（b）是空白PAGE胶转移结果示意图；
图3（a）和图3（b）对应的转移条件是：毛细管总长37cm，有效长度30cm，30mM硼砂缓冲液（pH9.2，含0.3mM CTAB），凝胶浓度为10%，含BSA浓度为0.5mg/mL，负模式进样，毛细管两端电势差为11kV，转移时间为60s；
图4是凝胶两端电压对蛋白质转移效率的影响示意图，其对应的转移条件是：毛细管总长32cm，有效长度25cm，20mM硼砂缓冲液（pH9.0，含0.3mM CTAB），凝胶浓度为10%，含BSA浓度为0.05mg/mL，负模式进样，毛细管两端电势差为8kV，转移时间为120s；
图5是凝胶浓度对蛋白质转移效率的影响示意图，其对应的转移条件是：毛细管总长37cm，有效长度30cm，20mM磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.3mM CTAB），含BSA浓度为0.5mg/mL，胶间电压4.5V，负模式进样，毛细管两端电势差为11kV，转移时间为60s；
图6是毛细管两端转移电压对转移效率的影响示意图；其对应的转移条件是：毛细管总长37cm，有效长度30cm，20mM磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.3mM CTAB），凝胶浓度为10%，含BSA浓度为1.25mg/mL，胶间电压4.5V，转移时间为60s；
图7是转移时间对蛋白质转移效率的影响示意图，其对应的转移条件是：毛细管总长37cm，有效长度30cm，20mM磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.3mM CTAB），凝胶浓度为10%，含BSA浓度为1.25mg/mL，胶间电压4.5V，负模式进样，毛细管两端电势差为11kV；
图8是缓冲液pH值对蛋白质转移效率的影响示意图，其对应的转移条件是：毛细管总长37cm，有效长度30cm，凝胶浓度为10%，含BSA浓度为1.25mg/mL，胶间电压4.5V，负模式进样，毛细管两端电势差为11kV，转移时间为60s；
图9是缓冲液pH值对电渗流的影响示意图，转移条件与图8相同；
图10是缓冲液浓度对蛋白质转移效率的影响示意图，转移条件与图8相同；
图11是缓冲液中CTAB浓度对电渗流的影响示意图，转移条件与图8相同；
图12是缓冲液中CTAB浓度对蛋白质转移效率的影响示意图，，转移条件与图8相同；
图13是DMSO褪色对蛋白质转移的影响示意图，其中，曲线1未经过DMSO退色，曲线2经过DMSO退色；
图14是SDS-PAGE染色结果的照片；
图15是SDS-PAGE中BSA条带的转移电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
本发明（1）提出三电极的转移方法和垂直方向上电提取和电排出蛋白质转移技术；（2）转移凝胶中蛋白质的毛细管电泳装置；（3）考察影响三电极转移SDS-PAGE中蛋白质的各种因素。
本发明旨在建立凝胶中蛋白质转移的毛细管电泳装置和方法。本发明所涉及到的凝胶中蛋白质转移原理是：
聚丙烯酰胺凝胶是由单体和交联剂，在引发剂和增速剂的存在下聚合而形成的交叉网状结构。蛋白质在凝胶中的迁移方向由自身所带电情况，以及电场方向决定。在SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）中，蛋白质被SDS（十二烷基硫酸钠）包裹，带有大量的负电荷，因此会向着正极方向迁移。当电压加在凝胶两端时，如图1（a）中所示，蛋白质在水平方向迁移，这是聚丙烯酰胺凝胶电泳的常规方法；当电压加在凝胶上下两面时，如图1（b）所示，蛋白质在垂直方向迁移，由于迁移距离很短，一般为0-1.5mm，蛋白质在电场作用下将很快从凝胶中迁移出来，这是本发明设计方法转移凝胶中蛋白质的基础。
毛细管电泳也是一种以电场为驱动力的技术手段，样品分子根据分子量和所带电荷的不同在毛细管中实现分离。毛细管电泳的迁移通道为一根小内径、大比表面积的中空毛细管。由于没有凝胶网状结构阻碍，因而迁移速度快。电进样是毛细管电泳的一种常用的进样方式，在外加电场下，样品分子依靠电渗流和电泳流的作用，由进样端进入到毛细管内部。
本发明利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品迁移原理，以及毛细管电泳的电进样原理，建立一种毛细管电转移方式，在电场作用下凝胶中的蛋白质被直接转移到毛细管中。转移的实现主要取决于毛细管和聚丙烯酰胺凝胶的有效连接，将毛细管进样端横截面内的微小面积与聚丙烯酰胺凝胶中已分离得到的蛋白条带近距离接触，由凝胶表面的水溶液将二者有效的连接起来。
如图2所示，本发明一种用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置，包括三电极电源、毛细管1、第一缓冲液槽21、第二缓冲液槽22、正电极31、负电极32和零极33，所述毛细管的柱上设有检测器6，其中，还包括有一金属针管4，本发明中所述三电极电源为12kv的三电极三电极电源，所述检测器为紫外检测器，采用哪种具体的检测器在本发明中不受限制，只要是能够检测蛋白质的检测器均可采用。上述各部件的连接关系是：当用于在线转移凝胶中的蛋白质时，如图2中的实线部分所示，所述金属针管4套在所述毛细管1的进样端上，所述毛细管1的出口端设置在第一缓冲液槽21中，并通过第一缓冲液槽21中的正电极31与三电极电源的正极相连，所述金属针管4的上端与三电极电源零极33相连，所述毛细管1的进样端与凝胶的上面接触，所述负电极32设置在所述凝胶的下面，所述负电极32与三电极电源的负极相连；当用于在线分析凝胶中的蛋白质时，撤出凝胶、负电极和金属针管，将零电极和毛细管进样端放入第二缓冲液槽22中，如图2中的虚线部分所示，所述毛细管的出口端通过第一缓冲液槽21中的正电极31与三电极电源的正极相连，所述毛细管的进样端通过第二缓冲液槽22中的零电极33与三电极电源的零极相连。
利用如图2中所示的本发明用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置进行在线转移和分析凝胶中蛋白质的方法，包括以下步骤：
步骤一、利用平板凝胶电泳装置进行聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质处理，并将上述处理好的聚丙烯酰胺凝胶用保鲜膜包好，4℃保存；
具体操作过程是：在凝胶浓度为5-17.5%的聚丙烯酰胺凝胶板材上设置15个上样孔，每个孔中用微量移液器进行上样，即向上样孔中上样牛血清白蛋白BSA10μL，将平板凝胶电泳装置的上槽与电源零极相连，将平板凝胶电泳装置的下槽与电源正极相连，然后通电，施加60V电压，电泳45min后；施加80V电压，电泳2h，此时牛血清白蛋白BSA中的溴酚蓝指示剂沿聚丙烯酰胺凝胶板材的垂直方向迁移，当溴酚蓝指示剂迁移到聚丙烯酰胺凝胶板材的1/2厚度处，切断电源，停止电泳；
目前，主要可以采用三种方式进行转移，一是未染色进行转移，这样无法确定凝胶电泳中蛋白质转移到什么位置；二是部分染色脱色后进行转移，部分染色是指凝胶板一半染色，一半不染色，部分染色脱色后进行转移对凝胶中蛋白质位置的确定存在偏差；三是染色脱色后用DMSO褪色后进行转移，若染色脱色后未经褪色的蛋白质是无法转移出来的。
本发明中对凝胶板的染色步骤是：将上述已经电泳好的聚丙烯酰胺凝胶从平板凝胶电泳装置的玻璃板中剥离下来，放入考马斯亮蓝染色液中，染色15min；染色完毕，倾出考马斯亮蓝染色液，加入脱色液，每隔半小时更换一次脱色液，直到聚丙烯酰胺凝胶的蓝色背景完全褪去，蛋白质的电泳条带清晰为止；将上述处理好的聚丙烯酰胺凝胶用保鲜膜包好，4℃保存；
步骤二、取一段熔融石英毛细管，对该毛细管进行预处理后备用；
具体操作过程是：将一段熔融石英毛细管装入用于安装固定毛细管的检测卡盒中，对于新的毛细管，分别依次用1M NaOH溶液、去离子水、缓冲液各冲洗1h；每日开机毛细管电泳后，依次用0.1M NaOH溶液、去离子水、缓冲液各冲洗5min，施加电压，电泳平衡20min；两次进样之间，依次用0.1M NaOH溶液和缓冲液各冲洗毛细管5min。
步骤三、聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的毛细管电转移：
按照图2的实线部分搭建转移装置，向经过预处理后的毛细管中充满pH4-9、10-50mM的运行缓冲液，其中，包括添加浓度为0.1-1.2mM的CTAB，所述缓冲液可以是醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、硼酸-硼砂和三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl中的任何一种；从上述步骤一处理好的聚丙烯酰胺凝胶上切下需要转移的聚丙烯酰胺凝胶，用二甲基亚砜褪色后，根据胶块的大小用缓冲液和蒸馏水或用蒸馏水浸泡15～25min后，将胶块放在负电极上，并排除所述负电极周围的气泡（尽量不留气泡在电极周围）；调整毛细管的位置，使得毛细管进样端与聚丙烯酰胺凝胶的表面有效接触；转移时，毛细管的出口端位于第一缓冲液槽中，对于毛细管出口端的正电极、凝胶上端的零极及凝胶下端的负电极同时施加电压，给予凝胶上下两端的零极和负电极3.0-6.0V的电压，在毛细管的两端施加1～12kV的高电压，并根据转移目的和凝胶中蛋白质含量的不同确定转移时间的长短，记录转移时间和电流变化；本发明凝胶中蛋白质的转移过程是，在毛细管和凝胶的交界面处，通过毛细管外面套着的金属针管连接零极，以及在接通三电极的三电极电源后，产生一个贯穿凝胶和毛细管的高强度电场，该电场作用协同电渗流的拉动作用，迫使聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质由凝胶内部迁移到毛细管柱内，完成凝胶中蛋白质的转移。
步骤四、检测被转移出来的蛋白质：转移后，将聚丙烯酰胺凝胶、负电极和金属针管撤下，然后将零电极放入到第二缓冲液槽中，将毛细管的进样端从金属针管中拿出后插入第二缓冲液槽中，零电极与三电极电源的零极相连，进行毛细管电泳检测，从而在最佳波长下，由毛细管柱上的检测器检测被转移出来的蛋白质，并完成定性和定量分析。
本发明在线转移和分析凝胶中蛋白质的所有步骤均在室温下进行。
实施例1：对三电极毛细管电泳法转移凝胶中蛋白质的可行性验证
采用本发明的在线转移和分析凝胶中蛋白质的方法从含有0.5mg/mL BSA的样品模拟胶和相应的空白模拟胶中进行转移实验。其中，空白模拟胶的作用是与样品模拟胶作对照，通过比较二者的转移电泳图谱，排除样品模拟胶转移图谱中的背景干扰，确定蛋白质的峰位，结果见图3。从图3中可以明显看出，出峰时间小于5min的峰来自于凝胶本身的干扰，确认9min处的峰为BSA峰。该实验结果验证了三电极毛细管电泳转移凝胶中蛋白质的方法是可行性的。
蛋白质转移过程中，发现电流值是连续下降的。这由两方面原因造成：一是转移过程中施加高电压，毛细管进样端附近有限的电解质溶液遭受损耗；二是凝胶经蒸馏水浸泡后，表面存在的水在电渗流作用下不断进入毛细管中，造成电渗流减小。当转移完毕开始电泳分离时，电流值会缓慢回升到初始值。
实施例2：两电极转移法和三电极转移法自凝胶中转移蛋白质的效果对比
Lee于2002年提出了毛细管两电极转移凝胶中蛋白质方法，即在毛细管的出口端连接正极，在凝胶的下端连接负极。为了验证本发明提出的三电极转移法的优势，对二者进行了对比研究，采用相同的模型样品PAGE胶、转移电压、转移时间以及毛细管和缓冲液条件，对比了这两种方法的转移结果，三电极转移时凝胶两端的电压为4.5V。由于重现性问题，对峰面积进行时间校正，用峰面积和出峰时间的比值作为判断蛋白质转移量的依据。四次平行实验所得平均峰面积/出峰时间结果为（1）两电极法：21288.2；（2）三电极法：412737.0，这一结果表明三电极法的转移效率远高于两电极法，相同条件下转移出来的BSA量是两电极法的近20倍。这是因为三电极法转移时，在毛细管和样品凝胶交界面处提供了一个穿过样品凝胶的强电场，有助于凝胶中包埋的蛋白质大分子克服其所受到的物理障碍获得自由。而两电极法转移时，这个电场受到毛细管和凝胶空间距离的影响，电场强度较弱且不稳定，因此转移效率较低。通过对比得出结论：本发明研发的毛细管电泳三电极转移法是一种更有效的转移凝胶中蛋白质的方法。
实施例3：凝胶中蛋白质转移条件的优化
蛋白质从凝胶中转移到毛细管中包括两个过程，一个是蛋白质从凝胶内部迁移到凝胶表面，一个是蛋白质从凝胶表面进入到毛细管中。在第一个过程中，影响蛋白质迁移快慢的因素有在凝胶上下所加电压的大小和凝胶孔径的大小。一个提供蛋白质转移的动力，一个决定了蛋白质穿过凝胶网状结构时的阻力大小。第二个过程实际是一个借助外加电场的电动进样过程。样品分子在EOF和电泳的共同作用下进入毛细管。由电动进样方法中的进样量计算公式
（其中μa为物质的电泳淌度，μEOF为电渗流淌度，r为毛细管的内半径，L为毛细管总长，Uinj为进样电压，tinj为进样时间，ca为物质的摩尔浓度）可知，进样量的多少与毛细管内径、进样电压、进样时间以及样品溶液浓度成正比，与电渗流淌度和蛋白质的电泳淌度成函数关系。电渗淌度与毛细管内缓冲液的pH值、浓度以及用于抑制电渗流的CTAB浓度有关；电泳淌度与样品溶液的pH值、毛细管内缓冲液的性质有关。另外，如果样品溶液用稀释后的电泳缓冲液或者蒸馏水配制，则样品溶液的电阻率大于毛细管缓冲液，施加高电压时造成进样端的电场强度远高于毛细管内部，样品离子在高电场强度作用下迁移速度加快，进入毛细管之后在低电场强度作用下又放慢迁移速度，如此进样的结果导致样品离子在毛细管中的堆积和浓缩。
为了尽可能多的将凝胶中的蛋白质转移出来，通过考察影响蛋白质转移两个过程（蛋白质从凝胶内部迁移到凝胶表面和蛋白质从凝胶表面进入到毛细管中）的各个因素，从而总结出凝胶中蛋白质转移的最佳条件，用于指导实际SDS-PAGE中蛋白质条带的转移。
包括以下因素：
（1）凝胶两端转移电压的影响
由于SDS-蛋白质复合物带负电，当凝胶的上端接零极，下端接负极时，复合物向上迁移，从凝胶内部迁移到表面。凝胶上下两端所加的电压提供了一个蛋白质迁移的动力，考察了该电压的大小对凝胶中蛋白质转移量的影响。实验发现随着电压的升高，转移动力增大，蛋白质迁移速度变快，120s内转移出来的蛋白质量增多。但是随着电压的进一步增大（大于4.5V），高电压下产热增多，引起凝胶变黄、变黑，蛋白质变性等问题，导致蛋白质迁移量的大幅下降（图4）。因此，选择4.5V电压为转移时凝胶两端的最佳电压。
（2）凝胶孔径的影响
聚丙烯酰胺凝胶是由单体和交联剂发生聚合反应形成的多孔网状结构，凝胶孔径的大小与凝胶浓度，即单体和交联剂的总质量浓度有关，凝胶浓度越大，孔径越大，可分离的蛋白质分子量范围越宽。这是因为凝胶孔径决定了蛋白质迁移时所受物理屏障的大小，孔径越大，阻力越小，越有利于大分子量蛋白质的穿过。但是，过大的孔径容易造成蛋白质分子扩散，样品丢失等问题。为此，本发明配制了含有相同BSA浓度的，5、7.5、10、12.5、15和17.5%六种常用凝胶浓度的样品模拟胶，考察凝胶孔径对转移蛋白质的影响，结果表明：凝胶浓度对蛋白质的转移量有很大的影响，如图5所示。当凝胶浓度小于12.5%时，相同条件下转移量接近，而当大于12.5%时，转移量直线下降，这是因为凝胶孔径的减小，阻碍了蛋白质的转移。考虑到采用SDS-PAGE方法分离BSA（牛血清白蛋白）时，10%的凝胶浓度最为常用，因为该条件下凝胶孔径大小合适，BSA电泳时间较短，因此选择10%作为聚丙烯酰胺凝胶的浓度。
（3）凝胶浸泡步骤的影响
制备的聚丙烯酰胺凝胶中含有大量小分子化合物，包括有机物（未反应的单体、交联剂、引发剂、加速剂）和无机盐。在蛋白质转移过程中，带负电的有机物也会转移到毛细管中，对蛋白质的转移造成影响。有机化合物分子体积小，较蛋白质易于转移。当大量有机化合物被快速地转移到凝胶表面和毛细管内时，毛细管和凝胶接触面的局部电场减小，不利于后续蛋白质的转移。因而，在转移蛋白质前，需要充分浸泡凝胶，洗去凝胶中的小分子有机物。
除了有机物，凝胶内部无机盐以及浸泡液的离子强度也会影响蛋白质的转移效率。凝胶中离子强度越低，与毛细管内缓冲液离子强度差值越大，局部电场强度越大，越有利于蛋白质的转移。根据蛋白质的峰面积和出峰时间比值，对比了缓冲液和蒸馏水作为浸泡液时，被转移出来的蛋白质的四次平均峰面积/出峰时间为21788.0；采用蒸馏水浸泡凝胶明显提高了凝胶中蛋白质的转移效率，四次平均值为：76791.4，经过60s转移后BSA的转移量是缓冲液浸泡时的3.5倍。因此，选择蒸馏水作为凝胶的浸泡液，充分洗去有机物和无机盐。
（4）毛细管两端转移电压的影响
毛细管两端转移电压的大小直接与电进样时的进样量有关，即与蛋白质从凝胶进入到毛细管的转移量有关。考察了2-11kV转移电压对转移量的影响，图6。可以看出当电压低于6kV时，转移出来的BSA峰面积和出峰时间比值很小，当电压高于6kV时，该比值急剧增大。本实验所用仪器的最大电压为12kV，但是该电压输出不太稳定，电流值也较大，产生的大量焦耳热不利于蛋白质的测定，因此选择11kV为转移时毛细管两端的最佳电压。
（5）转移时间的影响
转移过程施加电压的时间，即转移时间，也与电动进样时的进样量直接相关。本发明考察了转移时间从30s到180s时蛋白质的转移情况。从图7可以看出，随着转移时间的延长，BSA的转移量逐渐增多。在实际应用时，可根据转移目的和凝胶中蛋白质含量的不同决定转移时间的长短。例如进行定性分析时，只需较短的转移时间；如进行定量比较，需要延长转移时间直至所有的蛋白质全部转移出来。对于蛋白质含量较低的凝胶，为满足检测的需要，需采用较长的转移时间，尽量多的转移出蛋白质。
（6）毛细管中缓冲液pH值的影响
配制浓度为20mM，pH值分别为4、5、6、7、8、9的缓冲液，内含0.3mM CTAB，测定缓冲液pH值对蛋白质转移效率的影响。从图8可以看出，随着缓冲液pH值升高，蛋白质的转移量逐渐增大。当pH值大于等于8时，能较大程度地从凝胶中转移出蛋白质；当pH值小于7时，转移量较少；当pH值为4时，已经无法转移出蛋白质。
为了解释缓冲液pH值对转移量的影响，测定了这些缓冲液条件下电渗流的大小。如图10，上面的曲线为pH4-9缓冲液中不加CTAB时电渗流的大小，下面的曲线为pH4-9缓冲液中含有0.3mM CTAB时电渗流的大小。可以看出，1.当不含CTAB时，电渗流随缓冲液pH值的增大逐渐增大。2.当含有0.3mM CTAB时，pH4-9缓冲液的电渗流全部反向。3.反向电渗流的大小与pH值没有明确的关系。其中，pH5和9的缓冲液（含有CTAB），反向电渗流特别大，与文献结果相近，这可能与CTAB的性质有关。
由于缓冲液反向电渗流的大小与蛋白质转移量没有明确关系，则从离子强度的差异入手，研究二者相互之间的关系。缓冲液配制时，pH4和5为醋酸-醋酸钠缓冲液，pH6、7和8为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH9为硼砂缓冲液。这些缓冲液虽然浓度相同，但是离子强度随着pH的增大而增大。由于转移时凝胶的表面为水，因此缓冲液的离子强度越大，水和缓冲液的离子强度差异越大，导致毛细管进样端电场强度越大，越有利于进样（场放大进样效应）。可根据转移的目的来选择最佳的pH值，例如若转移后要用胰蛋白酶对转移蛋白进行在线酶解，则应结合胰蛋白酶的最佳反应条件，选择转移缓冲液的最佳pH值为8。
（7）毛细管中缓冲液种类的影响
这里我们以pH8的缓冲液来进行讨论，毛细管电泳中有三种常用的pH8的缓冲液，包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、硼砂-硼酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液。将它们配制成浓度为20mM，pH值为8的缓冲液，分别测定在这些缓冲液条件下凝胶中蛋白质的转移情况。转移出来BSA的峰面积和出峰时间的比值依次为10133.9，3047.5和1328。峰面积的大小与缓冲液的离子强度有密切关系，三种缓冲液中，磷酸盐的离子强度最大，转移出来的BSA最多，Tirs-HCl的离子强度最小，转移出来的BSA最少，硼砂-硼酸缓冲液介于中间。这仍与场放大进样效应有关。因此，在pH8的缓冲液中磷酸氢二钠-磷酸二氢钠为最佳缓冲液。
（8）毛细管中缓冲液浓度的影响
缓冲液的浓度越大，与凝胶的浸泡液水相比，离子强度差异越大，在进样口端形成一个远高于毛细管内部的电场强度，促进样品快速的进入毛细管内。但实验发现缓冲液浓度不是越高越好。
图10显示了几种不同浓度的缓冲液对蛋白质转移量的影响。当缓冲液浓度较小时，蛋白质转移量随着缓冲液浓度增大而增加，但是当缓冲液浓度较大时，由于电流过大，焦耳热大，导致蛋白质转移量下降。毛细管两端电势差11kV，10、20、30、40和50mM五种浓度缓冲液的电流分别为27、68、109、160和﹥200μA。当缓冲液浓度为50mM时，已经超过电泳仪器电流的最大限度，因此未能进行测定。20mM磷酸盐缓冲液作为转移时毛细管中的运行缓冲液较为理想。
（9）CTAB浓度对毛细管中电渗流和蛋白质转移效率的影响
SDS-BSA（十二烷基硫酸钠-牛血清白蛋白）复合物带负电，其电泳淌度向着正极方向。如采用普通毛细管时，蛋白质电泳淌度和电渗流方向相反，虽然一般电渗淌度大于样品的电泳淌度，负电样品能进入到毛细管中，但是存在电动进样歧视效应，进样量非常少。因此，需要抑制电渗流或使电渗流反向，来增大蛋白质的进样量。常采用的方法有制备涂层毛细管柱，或者在缓冲液中加入电渗流改性剂。前者操作复杂，涂层易脱落，寿命短；后者简单方便，重现性好。因此，采用后者方法，在缓冲液中加入一种阳离子表面活性剂CTAB作为电渗流的改性剂。CTAB能够动态涂敷在毛细管内壁上，起到抑制电渗流甚至使电渗流反向的作用。
参考CTAB的临界胶束浓度（0.9mM），配制了分别含有0.1、0.3、0.6、0.9和1.2mMCTAB的磷酸盐缓冲液。采用Williams和Vigh（Williams,B.A.,Vigh,G.,Fast,AccurateMobility Determination Method for Capillary Electrophoresis,Anal.Chem.1996,68,1174–1180）的方法测定了这些缓冲液的电渗流大小，实验结果如图12。可以看出，当缓冲液中含有CTAB浓度≥0.1mM时，电渗流全部反向，且随着CTAB浓度的增大，反向电渗流逐渐增大。
将这5种含不同浓度CTAB的缓冲液作为转移时的毛细管电泳缓冲液，测定CTAB浓度对蛋白质转移量的影响。结果表明：BSA的转移量随着缓冲液中CTAB浓度的增加而增大，且变化趋势与电渗流的变化趋势相似，推断BSA的增加是由反向电渗流逐渐增大造成的。含有0.9mM浓度CTAB的缓冲液为最佳转移毛细管电泳缓冲液。
（10）考马斯亮蓝染色对转移的影响
考马斯亮蓝通过与蛋白质的相互结合，从而使凝胶中的蛋白质显色，以达到检测的目的。作为蛋白质转移影响因素的一部分，本发明考察了考马斯亮蓝染色与否对蛋白质转移的影响。制备两块含有相同浓度BSA的样品模拟胶，一块不经过处理，一块经过考马斯亮蓝染色和脱色处理，采用相同的方法进行毛细管电泳的蛋白质转移实验。结果表明：未处理胶中的BSA可以在1min内被成功转移，而经过染色和脱色后的凝胶，即使转移时间延长到5min，BSA仍无法被转移出来，这可能的原因如下：考马斯亮蓝（CBB）本身含有两个磺酸基，一个季铵，一个叔胺和一个仲胺，当进行染色时，CBB和蛋白质通过静电作用（带负电的磺酸基会与蛋白质分子中的碱性氨基酸结合）和疏水作用与蛋白质分子结合，而且1个蛋白质分子可以与多个CBB结合。一方面，BSA-CBB结合物中引入了较多胺基，增加了蛋白质正电性。由于凝胶下端为负电极，上端为正电极，因此不利于蛋白质向上转移；另一方面，结合物的疏水性和体积远大于蛋白质本身以及与SDS形成的复合物，使其更难穿过凝胶孔径。
为了避免CBB对蛋白质转移的影响，有两种解决办法，一种是电泳后对凝胶进行部分染色和脱色，根据染色蛋白质的位置确定未染色胶中蛋白的位置，将其切割下来进行转移实验。这种方法的缺点是确定未染色胶中蛋白位置时可能存在偏差。另一种是采用DMSO（二甲基亚砜）将与蛋白质结合的CBB全部洗下来。这种方法不存在位置偏差问题，较为准确、方便。
制备含有相同浓度BSA的模拟胶，一块进行考染和脱色，一块进行考染和脱色后，用DMSO褪色。实验中发现DMSO可以使与蛋白质结合的考马斯亮蓝完全解离下来，凝胶条带变成无色透明。经过蒸馏水浸泡后，采用毛细管电泳转移方法对上述两种胶进行蛋白质转移，观察转移情况，结果见图13。
从图13中可以看到经过DMSO褪色后，BSA可以被大量转移出来，而没有褪色步骤的凝胶无法转移出BSA。因此可以得出结论，DMSO可以对考染后的凝胶进行完全地褪色，且无蛋白质损失，不影响蛋白质的转移。这种方法优点是能够准确确定蛋白条带位置，但是与第一种方法相比，样品处理时间较长。
实施例4：最优条件下SDS-PAGE分离的BSA的转移
为了进一步说明本发明开发的三电极转移SDS-PAGE中蛋白质的CE法的优势，本发明实际转移了经SDS-PAGE分离的BSA，具体情况如下：
按照2010年药典方法，经过制胶、上样、电泳、剥胶、染色、脱色几个步骤，得到BSA的SDS-PAGE结果，如图14。在凝胶板上可以清晰看到经过考马斯亮蓝染色后的BSA条带。每个上样孔出现三个条带，这是因为除了BSA单体，还存在BSA的二聚体，多聚体。由于它们的分子大小不同，在电泳过程中实现分离，考马斯亮蓝染色后确定并记录BSA条带，切下目标条带，DMSO褪色，三电极转移法转移BSA单体，凝胶两端转移电压为4.5V，凝胶浓度为10%，凝胶转移前用蒸馏水充分浸泡，毛细管电泳上转移电压为11kV，转移缓冲液为20mM磷酸盐缓冲液（pH8.0），内含有0.9mM CTAB，检测波长214nm，结果表明BSA色谱峰在CE中清晰可见，如图15所示。
与现有技术中的其他转移方法相比，本发明设计的毛细管电泳的凝胶转移方法具有非常显著的优点。首先，转移效率高。借助高电场和电渗泵的双重作用，促进蛋白质分子克服其包埋在凝胶中所受到的物理障碍，加快进入到毛细管柱内的速度。其次，可实现在线检测。转移后的蛋白质在毛细管柱内继续电泳，不同的样品根据荷质比的差异实现分离。分离后的样品依次通过检测窗口，由出峰时间和峰面积进行定性和定量分析。然后，可控性强。毛细管电泳的凝胶转移方法中有多种参数可调，例如转移电压、缓冲液pH值、缓冲液浓度等。当固定凝胶和毛细管的位置后，可通过改变影响转移的各种参数，完成最高效的转移。最后，操作简便。无需多种溶剂长时间的反复操作，不存在样品损失、分析物稀释等问题，易实现自动化操作。
本发明开发的毛细管电泳三电极转移方法实际可行、有效，与当前常用的凝胶中蛋白质转移方法相比，具有简单、快速、高效的巨大优势。随着蛋白质组学的蓬勃发展和凝胶电泳的普遍应用，本发明开发的凝胶中蛋白质转移方法亦具有广泛的应用前景。
尽管上面结合图对本发明进行了描述，上述的具体实施方式是本发明的部分实施例和研究实验例而已，是示意性的，并非对本发明做任何形式上的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以作出很多变形，凡是依据本发明的技术实质内容对上述实施例作的任何简单的修改，等同变化与修饰，均属于本发明的保护之内。
Claims (4)
1.一种用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置，包括三电极电源、毛细管（1）、第一缓冲液槽（21）、第二缓冲液槽（22）、正电极（31）、负电极（32）和零极（33），所述毛细管的柱上设有检测器（6）；其特征在于，还包括有一金属针管（4）；当用于在线转移凝胶中的蛋白质时，所述金属针管（4）套在所述毛细管（1）的进样端上，所述毛细管（1）的出口端设置在第一缓冲液槽（21）中，并通过第一缓冲液槽（21）中的正电极（31）与三电极电源的正极相连，所述金属针管（4）的上端与零极（33）相连，所述毛细管（1）的进样端与凝胶的上面接触，所述负电极（32）设置在所述凝胶的下面，所述负电极（32）与三电极电源的负极相连；
当用于在线分析凝胶中的蛋白质时，将零极（33）放入第二缓冲液槽（22）中，同时将所述毛细管（1）的进样端从金属针管内拿出后放入第二缓冲液槽（22）中，所述毛细管的出口端通过第一缓冲液槽（21）中的正电极（31）与三电极电源的正极相连，所述毛细管的进样端通过第二缓冲液槽（22）中的零电极（33）与零极相连。
2.根据权利要求1所述用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，但是采用哪种具体的检测器在本发明中不受限制，只要是能够检测蛋白质的检测器均可采用。
3.一种在线转移和分析凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述用于在线转移和分析凝胶中蛋白质的装置，并包括以下步骤：
步骤一、利用平板凝胶电泳装置进行聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质处理，并将上述处理好的聚丙烯酰胺凝胶用保鲜膜包好，4℃保存；
步骤二、取一段熔融石英毛细管，对该毛细管进行预处理后备用；
步骤三、聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的毛细管电转移：
向经过预处理后的毛细管中充满pH4-9、10-50mM的运行缓冲液，其中，包括添加浓度为0.1到1.2mM的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；从上述步骤一处理好的聚丙烯酰胺凝胶上切下需要转移的聚丙烯酰胺凝胶，用二甲基亚砜褪色后，根据胶块的大小用缓冲液和蒸馏水或用蒸馏水浸泡15～25min后，放在负电极上，并排除所述负电极周围的气泡；调整毛细管的位置，使得毛细管进样端与聚丙烯酰胺凝胶的表面接触；转移时，毛细管的出口端位于第一缓冲液槽中，对所述正电极、零极及负电极同时施加电压，并使零极和负电极之间的电压为-3.0～-6.0V，毛细管的两端施加1～12kV高电压，并根据转移目的和凝胶中蛋白质含量的不同确定转移时间的长短，记录转移时间和电流变化；
步骤四、检测被转移出来的蛋白质：
转移后，将聚丙烯酰胺凝胶和负电极、金属针管撤下，然后将零电极放入到第二缓冲液槽中，将毛细管的进样端从金属针管中拿出后插入第二缓冲液槽中，零电极与三电极电源的零极相连，进行毛细管电泳，紫外在线检测被转移出来的蛋白质；
上述步骤一至步骤四均在室温下进行。
4.根据权利要求3所述在线转移和分析凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，所述缓冲液种类包括醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、硼酸-硼砂、三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl。
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