CN109575103A - 一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，具体方法包括如下步骤：A，进行选取胎盘，将胎盘进行充分的粉碎成条状，然后送入浓度67％的酒精溶液中进行充分的浸泡，浸泡时间控制2.5min，然后将其进行清洗，风干；B，配制电涌缓冲液；C、准备24g丙烯酰胺、0.75g甲叉双丙烯酰胺，加超纯水至50ml，4℃棕色瓶避光保存，10％过硫酸铵溶液：取0.1g过硫酸铵，加超纯水至1ml，现配现用，然后进行配制凝胶；D、将步骤A中的胎盘进行电泳上样及跑胶；E、对胎盘进行电泳染色和脱色，然后进行测定水溶性蛋白分子，再将脱色后的溶液整体送入离心机中进行旋转分离，持续35min。本发明可以充分高效的提取胎盘中的水溶性蛋白分子，方法简单，值得推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，具体为一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法。
背景技术
胎盘(placenta)是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，以维持正常妊娠。胎盘还是一味中药，称之为紫河车，又叫人胎衣、胞衣、衣胞、胎衣、胎膜。
人类胎盘制备的胎盘血清蛋白、胎盘球蛋白是抢救病人的重要生物制品。干制的胎盘，在中药称为紫河车，为有名的滋补药物，可用于辅助治疗支气管哮喘、肺结核病。人类胎盘含有干扰素(interferon)、β抑制因子(β-inhibitor)能抑制包括流感病毒在内的多种病毒。胎盘中含有与血液凝固有关的成分，有类似凝血因子Ⅻ的纤维蛋白稳定因子；尿激酶抑制物和纤维蛋白溶酶原活化物。人胎盘中还含有水溶性蛋白，目前医院较多将人体的胎盘进行遗弃，这造成了较多的资源浪费，即便留存少量胎盘进行提取，提取的水溶性蛋白，纯度低，并且提取率较低，造成了大量的资源浪费，那么如何发明出一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，这成为我们需要解决的问题。
发明内容
本发明为解决上述现象，采用以下改性的技术方案，一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，具体方法包括如下步骤：
A，进行选取胎盘，将胎盘进行充分的粉碎成条状，然后送入浓度67％的酒精溶液中进行充分的浸泡，浸泡时间控制2.5min，然后将其进行清洗，风干；
B，配制电涌缓冲液；
C、准备24g丙烯酰胺、0.75g甲叉双丙烯酰胺，加超纯水至50ml，4℃棕色瓶避光保存，10％过硫酸铵溶液：取0.1g过硫酸铵，加超纯水至1ml，现配现用，然后进行配制凝胶；
D、将步骤A中的胎盘进行电泳上样及跑胶；
E、对胎盘进行电泳染色和脱色，然后进行测定水溶性蛋白分子，再将脱色后的溶液整体送入离心机中进行旋转分离，使用离心纳米级过滤的物理方法分离提取，持续35min，即完成提取分离。
优选的，步骤B中，所述凝胶缓冲液(3MTris-HCl,0.3％SDS,pH8.45)：取18.16gTris、0.15gSDS，加适量超纯水溶解，调pH至8.45，加超纯水至50ml；
阴极缓冲液(100mMTris,100mMTricine,0.1％SDS,pH8.25)：取12.11gTris、17.92gTricine、1gSDS加超纯水至1000ml；
正极缓冲液(100mMTris-HCl,pH8.9)：取12.11gTris，加适量超纯水溶解，调pH至8.9，加超纯水至1000ml。
优选的，步骤C中，所述凝胶的制胶方法包括：将垂直板电泳槽洗净并按操作手册装配固定，检查凝胶玻璃板密封性，配制分离胶和浓缩胶溶液，将新配制的分离胶液体立即均匀注入玻璃与胶框之间的槽中，加入乙醇覆盖胶面。室温放置30-60min待凝胶聚合后，吸去乙醇再注入新配制的浓缩于分离胶之上，并插入样品梳，室温放置30-60min待凝胶聚合后，取出样品梳，将凝胶玻璃板转移至电泳槽内，在内部注入阴极缓冲液，并浸没凝胶顶部，在电泳槽底部注入阳极缓冲液，待加样。
优选的，所述分离胶的浓度设为16％，所述浓缩胶溶液的浓度设为4％，所述浓缩胶溶液包括，凝胶缓冲液0.6ml，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储备液0.2ml，超纯水1.68ml，10％过硫酸铵0.02ml，TEMED0.002ml；所述分离胶包括，凝胶缓冲液1.65ml，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储备液1.65ml，超纯水1.18ml，丙三醇0.5ml，10％过硫酸铵0.015ml，TEMED0.002ml。
优选的，步骤D中，方法包括，取胎盘水溶性蛋白样品1mg溶于1mL去离子水中，取20μL样品与20μL2X上样缓冲液混合均匀，煮沸5min，1200rpm离心2min，取10μL上清液上样，另取10μL蛋白标准品上样；接通电源，内槽接负极，外槽接正极，恒压30V约30min，待样品进入分离胶后，电压升至90V，当溴酚蓝指示剂跑到距离凝胶底部约1cm处时，停止电泳。
优选的，步骤E中，卸开电泳槽，取出电泳后的PAGE胶放入容器中，加入50mL去离子水，加热至沸腾后停止，继续在脱色摇床上摇动5min，弃去水溶液；加入20mL至25mL快速染色液，浸没胶面，加热至沸腾后保持沸腾状态20-60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10min，弃去染色液；加入约50mL去离子水，加热至沸腾后保持沸腾状态20-60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10min，换水后完成脱色。
本发明可以对胎盘的水性蛋白进行准确的测定含量，并且可以进行提取，提取的纯度高，并且原料利用率高，充分节约资源，整体方法简单，且提取耗时较短，在业内具有技术性突破。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案，一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，具体方法包括如下步骤：
A，进行选取胎盘，将胎盘进行充分的粉碎成条状，然后送入浓度67％的酒精溶液中进行充分的浸泡，浸泡时间控制2.5min，然后将其进行清洗，风干；
B，配制电涌缓冲液；
C、准备24g丙烯酰胺、0.75g甲叉双丙烯酰胺，加超纯水至50ml，4℃棕色瓶避光保存，10％过硫酸铵溶液：取0.1g过硫酸铵，加超纯水至1ml，现配现用，然后进行配制凝胶；
D、将步骤A中的胎盘进行电泳上样及跑胶；
E、对胎盘进行电泳染色和脱色，然后进行测定水溶性蛋白分子，再将脱色后的溶液整体送入离心机中进行旋转分离，使用离心纳米级过滤的物理方法分离提取，持续35min，即完成提取分离。
优选的，步骤B中，所述凝胶缓冲液(3MTris-HCl,0.3％SDS,pH8.45)：取18.16gTris、0.15gSDS，加适量超纯水溶解，调pH至8.45，加超纯水至50ml；
阴极缓冲液(100mMTris,100mMTricine,0.1％SDS,pH8.25)：取12.11gTris、17.92gTricine、1gSDS加超纯水至1000ml；
正极缓冲液(100mMTris-HCl,pH8.9)：取12.11gTris，加适量超纯水溶解，调pH至8.9，加超纯水至1000ml。
步骤C中，所述凝胶的制胶方法包括：将垂直板电泳槽洗净并按操作手册装配固定，检查凝胶玻璃板密封性，配制分离胶和浓缩胶溶液，将新配制的分离胶液体立即均匀注入玻璃与胶框之间的槽中，加入乙醇覆盖胶面。室温放置30-60min待凝胶聚合后，吸去乙醇再注入新配制的浓缩于分离胶之上，并插入样品梳，室温放置30-60min待凝胶聚合后，取出样品梳，将凝胶玻璃板转移至电泳槽内，在内部注入阴极缓冲液，并浸没凝胶顶部，在电泳槽底部注入阳极缓冲液，待加样。
所述分离胶的浓度设为16％，所述浓缩胶溶液的浓度设为4％，所述浓缩胶溶液包括，凝胶缓冲液0.6ml，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储备液0.2ml，超纯水1.68ml，10％过硫酸铵0.02ml，TEMED0.002ml；所述分离胶包括，凝胶缓冲液1.65ml，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储备液1.65ml，超纯水1.18ml，丙三醇0.5ml，10％过硫酸铵0.015ml，TEMED0.002ml。
步骤D中，方法包括，取胎盘水溶性蛋白样品1mg溶于1mL去离子水中，取20μL样品与20μL2X上样缓冲液混合均匀，煮沸5min，1200rpm离心2min，取10μL上清液上样，另取10μL蛋白标准品上样；接通电源，内槽接负极，外槽接正极，恒压30V约30min，待样品进入分离胶后，电压升至90V，当溴酚蓝指示剂跑到距离凝胶底部约1cm处时，停止电泳。
步骤E中，卸开电泳槽，取出电泳后的PAGE胶放入容器中，加入50mL去离子水，加热至沸腾后停止，继续在脱色摇床上摇动5min，弃去水溶液；加入20mL至25mL快速染色液，浸没胶面，加热至沸腾后保持沸腾状态20-60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10min，弃去染色液；加入约50mL去离子水，加热至沸腾后保持沸腾状态20-60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10min，换水后完成脱色：
本发明的提取方法参数表格如下：表1
| 提取胎盘 | 提取率 | 提取时间 | 耗电量 | 原料成本 |
| 100个 | 86％ | 1.5-3h | 低 | 低 |
传统的提取方法参数表格如下：表2
| 提取胎盘 | 提取率 | 提取时间 | 耗电量 | 原料成本 |
| 100个 | 58％ | 2.5-6h | 高 | 高 |
。
综上述，通过表1和表2明显看出本发明方法更优，本发明可以对胎盘的水性蛋白进行准确的测定含量，并且可以进行提取，提取的纯度高，并且原料利用率高，充分节约资源，整体方法简单，且提取耗时较短，在业内具有技术性突破。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，其特征在于：具体方法包括如下步骤：
A，进行选取胎盘，将胎盘进行充分的粉碎成条状，然后送入浓度67％的酒精溶液中进行充分的浸泡，浸泡时间控制2.5min，然后将其进行清洗，风干；
B，配制电涌缓冲液；
C、准备24g丙烯酰胺、0.75g甲叉双丙烯酰胺，加超纯水至50ml，4℃棕色瓶避光保存，10％过硫酸铵溶液：取0.1g过硫酸铵，加超纯水至1ml，现配现用，然后进行配制凝胶；
D、将步骤A中的胎盘进行电泳上样及跑胶；
E、对胎盘进行电泳染色和脱色，然后进行测定水溶性蛋白分子，再将脱色后的溶液整体送入离心机中进行旋转分离，使用离心纳米级过滤的物理方法分离提取，持续35min，即完成提取分离。
2.根据权利要求1所述的一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，其特征在于：步骤B中，所述凝胶缓冲液(3M Tris-HCl,0.3％SDS,pH 8.45)：取18.16g Tris、0.15g SDS，加适量超纯水溶解，调pH至8.45，加超纯水至50ml；
阴极缓冲液(100mM Tris,100mM Tricine,0.1％SDS,pH 8.25)：取12.11g Tris、17.92g Tricine、1g SDS加超纯水至1000ml；
正极缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 8.9)：取12.11g Tris，加适量超纯水溶解，调pH至8.9，加超纯水至1000ml。
3.根据权利要求1所述的一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，其特征在于：步骤C中，所述凝胶的制胶方法包括：将垂直板电泳槽洗净并按操作手册装配固定，检查凝胶玻璃板密封性，配制分离胶和浓缩胶溶液，将新配制的分离胶液体立即均匀注入玻璃与胶框之间的槽中，加入乙醇覆盖胶面。室温放置30-60min待凝胶聚合后，吸去乙醇再注入新配制的浓缩于分离胶之上，并插入样品梳，室温放置30-60min待凝胶聚合后，取出样品梳，将凝胶玻璃板转移至电泳槽内，在内部注入阴极缓冲液，并浸没凝胶顶部，在电泳槽底部注入阳极缓冲液，待加样。
4.根据权利要求3所述的一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，其特征在于：所述分离胶的浓度设为16％，所述浓缩胶溶液的浓度设为4％，所述浓缩胶溶液包括，凝胶缓冲液0.6ml，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储备液0.2ml，超纯水1.68ml，10％过硫酸铵0.02ml，TEMED0.002ml；所述分离胶包括，凝胶缓冲液1.65ml，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储备液1.65ml，超纯水1.18ml，丙三醇0.5ml，10％过硫酸铵0.015ml，TEMED0.002ml。
5.根据权利要求1所述的一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，其特征在于：步骤D中，方法包括，取胎盘水溶性蛋白样品1mg溶于1mL去离子水中，取20μL样品与20μL 2X上样缓冲液混合均匀，煮沸5min，1200rpm离心2min，取10μL上清液上样，另取10μL蛋白标准品上样；接通电源，内槽接负极，外槽接正极，恒压30V约30min，待样品进入分离胶后，电压升至90V，当溴酚蓝指示剂跑到距离凝胶底部约1cm处时，停止电泳。
6.根据权利要求1所述的一种分离提取胎盘或脐带组织中水溶性蛋白分子的方法，其特征在于：步骤E中，卸开电泳槽，取出电泳后的PAGE胶放入容器中，加入50mL去离子水，加热至沸腾后停止，继续在脱色摇床上摇动5min，弃去水溶液；加入20mL至25mL快速染色液，浸没胶面，加热至沸腾后保持沸腾状态20-60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10min，弃去染色液；加入约50mL去离子水，加热至沸腾后保持沸腾状态20-60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10min，换水后完成脱色。
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