CN1266064A - 血管生成抑制因子—内皮抑素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

抑制肿瘤中的血管生成,可以抑制肿瘤的生长与转移。本发明提供一种新发现的血管生成抑制因子——内皮抑素,是由肿瘤细胞自身所产生的,其抑制肿瘤的效果大大强于以前发现的其它抗血管生成药物。我们从中国人的基因组中克隆了人源的内皮抑素基因,并将其在大肠杆菌及酵母中得到稳定及高效的表达。表达产物经反相柱层析一步即可得到纯化,透析后即可得到可溶性、并具生物活性的蛋白,具有明显抗肿瘤作用,可作为一种新型的抗癌药物。

Description

血管生成抑制因子——内皮抑素及其制备方法

本发明涉及基因工程中抑制肿瘤的血管生成的一种因子，具体地说是通过来源于中国人的内皮抑素基因获得血管生成抑制因子——重组人内皮抑素。

发明背景：血管生成是指产生伸入到组织或器官中的新生血管。

内皮是指衬在浆液腔、淋巴管及血管内壁上的扁平内皮细胞的薄层。

Northern杂交是指将样品RNA片段从胶中转移至膜支持物上，使RNA片段固定，再与合适的探针进行杂交以分析样品中靶mRNA的产生情况。

cDNA是指将单链mRNA在体外经反转录得到的双链互补的DNA片段。

RT-PCR是指反转录聚合酶链式反应。

Da(或kDa)是指道尔顿(或千道尔顿)。

His(或6×His)是指组氨酸(或六聚组氨酸)。

bp是指碱基对。

BamH，Hind III，SnaB I，EcoR I，Kpn I，Xba I均为文中所出现的限制性内切酶名称。

恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。据统计，全世界每年死于恶性肿瘤的约有七百万人，其中中国就占了六分之一。恶性肿瘤已是我国第二位的死亡原因，占总死亡人数的近四分之一。我国现有12亿人口，今后将有至少3亿人患恶性肿瘤。因而，对恶性肿瘤的防治是摆在我们面前很严峻的课题。

抑制肿瘤中的血管生成，从而抑制肿瘤的生长与转移，这是目前研究治疗肿瘤的一个新方向，也是一个新热点。近年来的研究表明，血管发生在实体瘤(占恶性肿瘤的绝大部分)的生长维持及其转移中起重要作用。实体瘤的生长需要血管来运输氧气和营养，同时血管又是肿瘤发生转移的主要途径。

血管发生是正常组织生长与发育所必需的过程，而在成年人中，除了女性的生殖系统及机体的修复过程(如伤口愈合)有血管发生外，其它组织则少见，且其过程一般较短暂并受机体严格调控。与之相反，在某些病理性疾病中，如肿瘤(一般为实体瘤)、类风湿性关节炎、增生性视网膜病、牛皮癣等，常发生无控制的血管发生，根据其中存在不受控制的血管生成的各种病理学疾病状态分类为血管生成依赖性的或血管生成相关性的疾病。

受控制的及不受控制的血管生成是以相似的方式进行的。毛细血管是由基底膜包裹内皮细胞和外膜细胞形成的。当血管生成开始时，由内皮细胞和血细胞释放的金属蛋白水解酶逐步侵蚀基底膜，然后位于血管腔内的内皮细胞伸出基底膜。在血管生长因子的刺激下，内皮细胞通过受侵蚀的基底膜迁移。迁移的内皮细胞从母血管分岔形成“新芽”，内皮细胞在这里开始有丝分裂和增殖。内皮细胞新芽彼此合并形成毛细环，从而产生新的血管。

在正常的生理过程中，血管发生中血管内皮细胞的生长受血管生长因子和抑制因子的严格调控；而肿瘤细胞则打破了对血管内皮细胞生长的严格调控，它可过度表达一种或几种血管生成因子，如成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板来源的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)等，相互协同作用刺激血管生成。但同时，许多恶性肿瘤还能产生血管生成抑制因子，如thrombospondin、angiostatin、干扰素α(IFN-α)等。肿瘤细胞诱发的血管发生正是这些正调控因子与负调控因子之间的净平衡——血管生成因子占优势造成的结果。

一般说来，人体的许多肿瘤常保持原位状态(in situ tumor)相当长的一段时间(体积小于1mm³)，可从数月至数年处于静止状态。而当肿瘤内的一细胞亚群通过血管生成因子与抑制因子的相互协调作用而使其转化为血管生成表型(angiogenic phenotype)后，肿瘤就可快速生长并达到临床可检测到大小，随后可通过血管转移至全身各处。

显然，通过外加血管生成抑制因子可以抑制血管发生，从而阻止肿瘤的生长及扩散。在七十年代初期，Judah Folkman已提出用抗血管生成药物治疗肿瘤的想法，这在当时还被许多人认为是无稽之谈。经过十几年来血管生成这一领域工作的不断开展，不断有新的证据来支持这一理论，人们的观念已发生改变，逐渐接受了这一新的提法。

近十几年来，抗血管生成药物层出不穷，其分类非常复杂，作用方式也多样。抗血管生成药物包括维生素类(如维生素A类、维生素D3类等)、脂类(如花生四烯酸等)、抗生素类(如烟曲霉素衍生物一TNP-40、偏端霉素A的衍生物等)、类固醇类(如地塞米松等)、多糖类(如葡聚糖衍生物等)、蛋白及肽类(如IFN-α、angiostatin、thrombospondin-1、platelet factor-4等)、组织提取物及其它。其作用方式也多种多样，可针对血管生成中不同阶段的不同靶子，如抑制侵蚀基底膜的金属蛋白水解酶的活性，抑制内皮细胞膜上血管表皮生长因子(VEGF)的受体与VEGF的结合，直接抑制内皮细胞的增殖等等。

新发现的一种来源于小鼠的血管生成抑制因子——内皮抑素能特异地抑制新生内皮细胞的生长，从而阻止肿瘤发生中新生血管的产生，可抑制绝大多数的来源于小鼠的实体瘤，具有相当好的治疗效果；且不同于其它化疗药物，它不会引起机体产生获得性的药物耐受性。但由于其为鼠源性的，不能应用于人体肿瘤的治疗。

发明的目的：为了使血管生成抑制因子能应用于抑制人体肿瘤的生长和转移。本发明是从人特别是中国人的基因中构建人源的内皮抑素基因，并将其在大肠杆菌及酵母菌中得到稳定及高效的表达，表达产物经层析、透析后即得到可溶性的、并具生物活性的蛋白：血管生成抑制因子——内皮抑素，用以抑制人体肿瘤的生长和转移。

发明的主要技术内容：抑制肿瘤中的血管生成，可以抑制肿瘤的生长与转移。现已有多种抗血管生成药物应用于治疗肿瘤的临床或临床前研究，并取得了较好的治疗效果。我们设计并构建的血管生成抑制因子——内皮抑素，是由人肿瘤细胞自身所产生的，其抑制肿瘤的效果大大强于以前发现的其它抗血管生成药物。

血管生成抑制因子——内皮抑素的主要特点是：该血管生成抑制因子是来源于人特别是中国人的内皮抑素基因，位于18型胶原蛋白的C-末端，该蛋白大小约20千道尔顿(kDa)，包含至少183个氨基酸；人18型胶原的氨基酸序列选自SEQ No.1；人内皮抑素的氨基酸序号在人18型胶原蛋白的第1154位氨基酸至第1336位氨基酸之间，其编码蛋白质的核苷酸序列及相应的氨基酸序列选自SEQ No.2。该内皮抑素能抑制血管生成。本发明中，中国人的内皮抑素基因来自中国人的肝、肺、肾等组织。

血管生成抑制因子——内皮抑素的制备方法是：抽提来源于人的肝脏、肺、肾脏等组织的总RNA，经反转录聚合酶链式反应合成人内皮抑素cDNA片段后，构建入过渡质粒pUC19中，经测序验证序列，再构建入原核表达载体pQE30、酵母表达载体pPIC9K(其菌种保藏编号分别为CGMCC No.0388.1和No.0338.2)和哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1，分别表达后，进行分离纯化得到目的蛋白——重组人内皮抑素，将此目的蛋白在体外、体内作生物活性检测。

在上述制备过程中，除了采用金属螯合柱亲和层析一步纯化目的蛋白外，为降低生产成本，采用反相柱一步也可获得高纯度的目的蛋白。

重组人内皮抑素的构建过程解释：

内皮抑素位于18型胶原蛋白的C-末端，是由体内蛋白水解酶对前体蛋白在特定位点的裂解而得到，大小为20kDa左右(包括183个氨基酸)。18型胶原蛋白是细胞外基质的一组成部分，Northern杂交分析表明，在肝脏、肺及肾中其表达最丰富。图1显示了人XVIII型胶原蛋白的氨基酸全序列(SEQ No.1)，图2显示了编码人内皮抑素的核苷酸序列及相应的蛋白的氨基酸序列(SEQ No.2)。

选择中国人的肝脏和肺组织作为mRNA的来源，设计并合成相应的引物，利用反转录聚合酶链式反应合成人内皮抑素的cDNA片段，得到片段的大小与预计的相同(570bp)，见图3，包括人18型胶原蛋白的第1154位氨基酸到第1336位氨基酸。同收PCR产物片段后，用BamH I和Hind III双酶切，插入经同样两个酶双酶切的克隆载体pUC19(购自GIBCO/BRL公司)中，通过Perkin-Elmer公司的DNA测序仪对其测序，结果表明PCR产物的序列与人18型胶原基因的3’端的核苷酸序列一致，证明得到了来源于中国人的内皮抑素基因。

使用pQE30(购自QIAGEN公司)作为表达载体，见图4，它是以T7启动子外加两个lac操纵子序列引发受IPTG调节的基因的转录。表达产物是N-端与六聚组氨酸(6×His)相融合的重组人内皮抑素，可利用金属螯合柱亲和层析一步纯化。为了在目的蛋白纯化后将6×His去除，在6×His后又加上了肠激酶的酶切位点(Arg-Arg-Arg-Arg-Lys↓)。

将重组表达质粒分别在四种不同的大肠杆菌菌株：M15、SG13009、BL21和TB-1中进行表达，电泳结果表明得到的目的蛋白大小与预计的相似，并经免疫印迹法鉴定，见图7。重组人内皮抑素在大肠杆菌菌株BL21中的表达量最高，目的蛋白的含量可达总蛋白量的30％以上，主要以包涵体形式存在，在变性条件下可经金属螯合柱亲和层析一步得到纯化，纯度达95％以上，产量达400-600mg/L。目的蛋白可通过透析得到复性，其复性效率可达50％以上。

为了降低生产成本，用反相柱代替金属螯合柱可同样经一步层析得到高纯度的目的蛋白，纯度可达95％以上。

同时，将编码人内皮抑素的基因片段克隆到酵母的表达载体——pPIC9度(购自Invitrogen公司)的双酶(SnaB I/EcoR I)位点中，见图5，以利用甲醇酵母中的α因子信号肽分泌表达该蛋白。

利用pPIC9K质粒介导人内皮抑素基因整合到甲醇酵母染色体上后，用甲醇诱导目的蛋白的表达。表达的目的蛋白是以可溶的形式存在于甲醇酵母的培养基中，利用反相柱层析可一步纯化，纯度达95％以上，产量达500-700mg/L。

此外，还将编码人内皮抑素的基因片段克隆到真核表达载体——pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)的双酶(Kpn I/Xba I)位点中，见图6，以利用载体pcDNA3.1上的CMV启动子在真核哺乳动物细胞中表达该蛋白。通过磷酸钙-DNA共沉淀法将重组后质粒导入体外培养的哺乳动物细胞——COS1中，暂时表达结果表明重组人内皮抑素基因在细胞内得到了表达。

重组人内皮抑素体外活性的检测方法：使用四种不同来源的细胞系——人血管内皮细胞(ECV304)、人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(HepG2)及人宫颈癌上皮细胞(HeLa)等，检测重组人内皮抑素特异地抑制人血管内皮细胞增殖的活性。

用不同浓度的重组人内皮抑素处理这四种细胞系，三天后用流式细胞仪计数，其结果(见图8)发现，重组人内皮抑素只能抑制血管内皮细胞的生长，而不能抑制另外三种来源的细胞的生长。这说明在大肠杆菌及酵母中表达的重组人内皮抑素的确可以特异地抑制血管内皮细胞的生长。

重组人内皮抑素体内活性的检测——直接处理体内的原发瘤：六至八周龄的雌性BALB/c小鼠在其背部皮下接种5×10⁶个Meth-A细胞(来源于BALB/c小鼠的纤维肉瘤的细胞株)，5天后当肿瘤大小为100-200mm³时，开始用重组人内皮抑素蛋白治疗。通过腹腔内或皮下途径给小鼠一次注射20mg/kg的重组人内皮抑素蛋白(悬浮于100μl的PBS中)，对照组则注射100μl的PBS。每隔4天，用游标卡尺量小鼠肿瘤的大小。第20天，处死所有的小鼠。

将治疗组及对照组中小鼠的肿瘤体积对时间作曲线，其结果见图9。治疗组小鼠与对照组小鼠的背部肿瘤大小的比较见图10。

可以看出，经重组人内皮抑素治疗的小鼠，其背部的肿瘤的生长得到了明显的抑制。从整体的结果来看，重组人内皮抑素对治疗的小鼠(n＝20)达到了100％的抑制作用。

同时，还对另外三种原发瘤模型——Lewis肺癌、B16F1黑色素瘤及H22肝癌进行了类似的实验，也得到了同样的结果。

本发明的优点：①.可抑制多种肿瘤(尤其是实体瘤)的生长和转移；②.该内皮抑素基因来源于中国人，表达得到的蛋白可应用于人体肿瘤的治疗；③.在对表达后蛋白进行分离纯化时，应用成本低的反相柱层析替代高成本的金属螯合柱，也可一步得到高纯度的目的蛋白。

附图及图面说明：图1显示人18型胶原的全部氨基酸序列，即SEQ No.1。图2显示编码人内皮抑素的核苷酸序列及相应蛋白的氨基酸序列，即SEQ No.2。图3RT-PCR产物经1％琼脂糖电泳后的照片，显示获得中国人内皮抑素基因的RT-PCR产物经1％琼脂糖电泳分析的结果。图中序号说明：M)DNA的分子量标准——φX174 DNA用

             Hae III酶切；

             C)阴性对照(无模板mRNA)；

             1)模板mRNA来自人的肝脏组织；

             2)模板mRNA来自人的肺组织。

             箭头显示合成的人内皮抑素基因的位置。图4显示原核表达载体pQE-30的示意图。图5显示甲醇酵母表达载体pPIC9K的示意图。图6显示真核哺乳动物表达载体pcDNA3.1的示意图。图7显示表达产物与抗人18型胶原的C-端的单克隆抗体杂交的免疫印迹。

—抗为抗人18型胶原蛋白的C-端的单克隆抗体(1∶500)；

二抗为与辣根过氧化物酶偶联的蛋白A(1∶1,000)。

图中序号说明：1)pQE30/en在大肠杆菌菌株BL21中表达后的

                水溶性抽提液；

              2)pQE30/en在大肠杆菌菌株BL21中表达后的

                8M尿素抽提液；

              3)水溶性抽提液经金属螯合柱纯化后；

              4)8M尿素抽提液经金属螯合柱纯化后。

              箭头显示重组人内皮抑素蛋白的位置。图8显示重组人内皮抑素对人内皮细胞(ECV304)增殖的体外抑制效果，并与其它三种细胞(人肝癌细胞(HepG2)、人肺癌细胞(A549)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa))进行比较。横坐标表示重组人内皮抑素的浓度(ng/ml)，纵坐标表示细胞总数(细胞/孔×10⁴)。图9显示一次体内注射20mg/kg的重组人内皮抑素后，治疗组与对照组的肿瘤体积与时间的关系。

横坐标表示治疗时间(天数)，纵坐标表示肿瘤的体积(mm³)。图10治疗组与对照组小鼠的照片，显示治疗组与对照组小鼠的背部

肿瘤大小的比较。箭头显示背部肿瘤的位置。图11内皮抑素的构建过程图3是琼脂糖电泳后的实物照片，不是显微或细胞结构照图10是治疗组与对照组小鼠的实照，显示治疗前后肿瘤大小的比较

实施例1来源于中国人的内皮抑素基因的获得

内皮抑素位于18型胶原蛋白的C-末端，是由体内蛋白水解酶对前体蛋白在特定位点的裂解而得到，大小为20kDa左右(包括183个氨基酸)。18型胶原是细胞外基质的一组成部分，Northern杂交分析表明，在肝脏、肺及肾中其表达最丰富。图1中显示了人18型胶原蛋白的氨基酸全序列(SEQ No.1)，图2中显示了编码人内皮抑素的核苷酸序列及相应的蛋白的氨基酸序列(SEQ No.2)。

选择中国人的肝脏和肺组织作为mRNA的来源，设计并合成相应的引物(上游引物为：5’CGGGATCCACAGCCAGCGCGAC 3’，为便于克隆，设计入BamH I酶切位点；下游引物为：5’GGGAAGCTTGGCGGTGGCTACTFGGAGG 3’，为便于克隆，设计入Hind III酶切位点)，利用反转录聚合酶链式反应合成人内皮抑素的cDNA片段，得到片段的大小与预计的相同(570bp)(见图3)，包括人18型胶原蛋白的第1154位氨基酸到第1336位氨基酸。回收PCR产物片段后，用BamHI和Hind III双酶切，插入经同样两个酶双酶切的克隆载体pUC19(购自GIBCO/BRL公司)中，通过Perkin-Elmer公司的DNA测序仪对其测序，结果表明PCR产物的序列与人18型胶原基因的3’端的核苷酸序列一致，证明得到了来源于中国人的内皮抑素基因。实施例2重组人内皮抑素在大肠杆菌中的表达

使用pQE30(购自QIAGEN公司)作为表达载体(见图4)，它是以T7启动子引发受IPTG调节的基因的转录。表达产物是N-端与6×His相融合的重组人内皮抑素，可利用金属螯合柱亲和层析一步纯化。为了在目的蛋白纯化后将6×His去除，在6×His后又加上了肠激酶的酶切位点(Arg-Arg-Arg-Arg-Lys↓)。

将重组表达质粒分别在四种不同的大肠杆菌菌株：M15、SG13009、BL21和TB-1中进行表达，电泳结果表明得到的目的蛋白大小与预计的相似，并经免疫印迹法鉴定。其中，重组人内皮抑素在大肠杆菌菌株BL21中的表达量最高，目的蛋白的含量可达总蛋白量的30％以上，该克隆命名为pQE30/en，在菌种保藏中心的编号为CGMCC No.0388.1。

当接种后细菌的密度达到600nm的光密度值为0.6-0.8时，用IPTG诱导3小时，然后收集细胞，将其重悬于PBS中，经超声波破碎后离心收集沉淀，上清即为水溶性抽提液。沉淀经1％的脱氧胆酸钠溶液洗涤两次后，以含6M尿素的PBS溶解沉淀，离心后上清即为6M尿素抽提液。在变性条件下，6M尿素抽提液可经金属螯合柱亲和层析一步得到纯化，纯度达95％以上，产量可达200-400mg/L。目的蛋白可通过透析得到复性，其复性效率可达50％以上。

为了降低生产成本，用反相柱代替金属螯合柱可同样一步层析得到高纯度的目的蛋白，纯度可达95％以上。实施例3重组人内皮抑素在酵母中的表达

将编码人内皮抑素的基因片段克隆到酵母的表达载体——pPIC9K(购自Invitrogen公司)(见图5)的双酶(SnaB I/EcoR I)位点中，以利用甲醇酵母中的α因子分泌信号分泌表达该蛋白。

利用pPIC9K质粒介导人内皮抑素基因整合到甲醇酵母染色体上后，经筛选后得到可高水平表达重组人内皮抑素的克隆，命名为pPIC9K/en，其菌种保藏编号为CGMCC和No.0338.2。用甲醇可诱导目的蛋白的表达，表达的目的蛋白是以可溶的形式存在于甲醇酵母的培养基中，利用反相柱层析可一步纯化，纯度可达95％以上，产量可达500-700mg/L。实施例4重组人内皮抑素在哺乳动物细胞中的表达

将编码人内皮抑素的基因片段克隆到真核表达载体——pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)(见图6)的双酶位点(Kpn I/Xba I)中，以利用载体pcDNA3.1上的CMV启动子在真核哺乳动物细胞中表达该蛋白。

通过磷酸钙-DNA共沉淀法将重组后质粒导入真核哺乳动物细胞——COS1中，其具体步骤如下：

1.将COS1细胞以2×10⁵/cm²的密度接种于60mm组织培养皿中，以含10％热灭活的胎牛血清(10％FCS)的DMEM培养基于37℃，含5％CO₂浓度的孵箱中培育24小时。

2.在无菌试管中配制下列溶液：将220μl的DNA溶液(DNA浓度为40μl/ml)和250μl的2×HBS混匀，缓慢加入31μl的2MCaCl₂溶液，混合后在室温下放置20-30分钟，直至出现细小的白色沉淀。

3.将混合物混匀，加至细胞单层表面上，轻轻晃动培养皿使磷酸钙-DNA共沉淀物在细胞表面分布均匀，置于37℃，含5％CO₂浓度的孵箱中培育24小时。

4.移去培养基，重新加入含10％FCS的DMEM培养基，再放入37℃，含5％CO₂浓度的孵箱中培育48-60小时，检测细胞裂解物中目的蛋白的产生情况。

经免疫印迹法检测，证明重组人内皮抑素基因在COSl细胞内得到了表达。实施例5重组人内皮抑素的体外活性的检测——人血管内皮细胞检测法

使用人血管内皮细胞株(ECV304)，其它三种人的不同来源的细胞株(人肝癌细胞(HepG2)、人肺癌细胞(A549)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa))作为对照，检测人内皮抑素抑制人血管内皮细胞增殖的活性。

具体实验方法：第0天，以每孔2.5×10⁴的密度将四种不同的细胞系分别接种于24孔板内，以0.5ml培养基培养(ECV304、HepG2及HeLa细胞的培养基为含10％热灭活的胎牛血清(10％FCS)的DMEM培养基；A549的培养基为含10％热灭活的胎牛血清的RPMI1640培养基)，37℃，含5％CO₂浓度的孵箱中培育24小时。

第1天，去掉培养基，换成含不同浓度的重组人内皮抑素的0.5mlDMEM/10％FCS(或RPMI1640/10％FCS)，样品的浓度分别为0，10，20，50，100，200，400，600，800，1000ng/ml。再将24孔板重新放回37℃，含5％CO₂浓度的孵箱中培养72小时。

第4天，除去培养基，用0.5ml的胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶，0.53mM EDTA)将各孔处理2-3分钟，再将悬浮的细胞转移到含9.5ml的PBS的流式管中用Coulter流式细胞仪计数。

将不同重组人内皮抑素浓度处理后的细胞数对不同浓度的重组人内皮抑素作图，见图8，可见重组人内皮抑素对非内皮细胞来源的A549、HepG2和HeLa均无抑制作用，而对内皮细胞来源的ECV304可产生剂量依赖的抑制作用。当重组人内皮抑素浓度达到400ng/ml时，即可产生最大程度的抑制作用。说明从大肠杆菌及酵母表达而得到的重组人内皮抑素的确能特异地抑制血管内皮细胞的生长，而对其它来源的细胞无抑制作用。实施例6重组人内皮抑素的体内活性的检测——直接处理体内的原发瘤

六至八周龄的雌性BALB/c小鼠在其背部皮下接种5×10⁶个Meth-A细胞(来源于BALB/c小鼠的纤维肉瘤的细胞株)，5天后当肿瘤大小为100-200mm³时，开始用重组人内皮抑素蛋白治疗。通过腹腔内或皮下途径给小鼠一次注射20mg/kg的重组人内皮抑素蛋白(悬浮于100μl的PBS中)，对照组则注射100μl的PBS。每隔4天，用游标卡尺量小鼠肿瘤的大小。第20天，处死所有的小鼠。

将治疗组及对照组中小鼠的肿瘤体积对时间作曲线，其结果见图9。治疗组小鼠与对照组小鼠的照片比较见图10。

可以看出，经重组人内皮抑素治疗的小鼠，其背部的肿瘤的生长得到了明显的抑制。从整体的结果来看，重组人内皮抑素对治疗的小鼠(n＝20)达到了100％的抑制作用。

同时，还对另外三种原发瘤模型——Lewis肺癌、B16F1黑色素瘤及H22肝癌进行了类似的实验，也得到了同样的结果。

这说明重组人内皮抑素是原发瘤体内生长的极强的抑制剂。

Claims (5)

1.一种血管生成抑制因子其特征是：该血管生成抑制因子是来源于中国人的内皮抑素基因，位于18型胶原蛋白的C-末端，该蛋白大小约为20千道尔顿，包括至少183个氨基酸。人18型胶原蛋白的氨基酸选自SEQ No.1；人内皮抑素的氨基酸序列位于人18型胶原蛋白的第1154位氨基酸至第1336位氨基酸之间，其编码蛋白质的核苷酸序列及相应的氨基酸序列选自SEQ No.2。

2.按权利要求1所说的血管生成抑制因子其特征是：人内皮抑素能特异地抑制血管内皮细胞的生长，从而抑制新生血管的生成。

3.按权利要求1，2所说的血管生成抑制因子其特征是：选自中国人的肝脏、肺、肾脏等的内皮抑素基因。

4.一种血管生成抑制因子的制备方法，其特征是：提取来源于人组织的总RNA，经反转录聚合酶链式反应合成人内皮抑素cDNA片段后，构建入过渡质粒pUC19中，经测序验证序列，再构建入原核表达载体和真核表达载体，分别表达后，进行分离纯化得到目的蛋白——重组人内皮抑素，将该蛋白在体外、体内作生物活性检测。

5.按权利要求4所说的血管生成抑制因子其特征是：该表达蛋白可经反相柱层析一步纯化。

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