CN1724671B - 一种重组人内皮抑素表达菌株及可溶性表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种重组人内皮抑素表达菌株及其可溶性表达方法。本发明提供了一种重组人内皮抑素的表达菌株和可溶性表达的方法。该菌株含有表达载体pET-Endo,该表达载体由人内皮抑素基因插入载体pET43.1a获得。培养该表达菌株,用终浓度0.1~1.0mmol/L的IPTG诱导,诱导温度25~30℃,诱导时间6~10h,外源蛋白可溶性表达量可达到总表达量的80%以上,总表达量为菌体总蛋白的50%左右。因而本发明克服了人内皮抑素以包涵体形式表达的缺陷。本发明可用于重组人内皮抑素的制备及其它重组蛋白的可溶性表达。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种重组人内皮抑素表达菌株及其可溶性表达的方法。
技术背景
内皮抑素(Endostatin)是1997年O′Reilly等在体外培养的鼠血管内皮细胞瘤(EOMA)的细胞培养液中发现的(O’Reilly,M.S.,Boehm,T.,and Folkman,J.1997.Endostatin:An endogenous inhibitor of angiogenesisand tumor growth.Cell88,277-285)。它能够抑制体外牛毛细血管内皮细胞增殖,分子量为20kDa,序列分析显示其为胶原蛋白18(collagenXVIII)C末端片段。人的内皮抑素分子量为18kDa。由于内皮抑素能抑制血管内皮细胞生长,进而抑制新生血管生长,阻止肿瘤生长和转移,而且反复使用无耐药性产生(Boehm,T.,Folkman,J.,Browder,T.,andO’Reilly,M.S.1997.Antiangiogenic therapy of experimental cancer doesnot induce acquired drug resistance.Nature390,404-407),因此,引起人们的广泛关注。国内外的众多科研人员都在进行基于内皮抑素的基础和应用研究,希望尽快将其开发成为治疗肿瘤的临床药物。1999年美国FDA批准了内皮抑素治疗肿瘤的I期临床试验,2001年此项研究进入II期临床试验。目前,国内也已进入II期临床试验阶段。内皮抑素的适应症主要有肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、纤维瘤和黑色素瘤等,临床试验表明,内皮抑素的治疗效果具有剂量效应。除了单独注射内皮抑素进行治疗外,内皮抑素与其它药物(血管抑素)结合使用显示出更好的疗效(王朱逸,王瑶,李永渝,同济大学学报(医学版),24(3):260-262,2003)。
目前,重组人内皮抑素的表达系统主要有毕赤酵母和大肠杆菌。其中,毕赤酵母中主要为分泌表达(Dhanabal,M.,Volk,R.,Ramchandran,R.,Simons,M.,and Sukhatme,V.P.1999.Cloning,expression,and in vitroactivity of human endostatin.Biochem.Biophy.Res.Comm.258,345-352),容易得到具有生物学活性的重组人内皮抑素,但其生产周期较长,工艺复杂,成本较高,产量也不高,而且所表达的外源蛋白容易发生部分降解,如Boehm等在酵母表达系统中成功表达可溶性小鼠内皮抑素,但所获产物的N端不均一,分析原因可能是酵母中蛋白酶降解所致(Boehm,T.,Pirle-Shephere,S.,Trinh,L.,Shiloach,J.,and Folkman,J.1999.Disruption of the KEX1 gene in Pichia pastoris allows expression offull-length murine and human endostatin.Yeast15,563-572)。大肠杆菌则具有生长速度快、发酵条件容易控制、外源蛋白表达量较高等优点,但在大肠杆菌中所表达的外源蛋白容易形成包涵体,纯化过程中需要进行复性,而复性率往往较低。为了克服上述技术问题,人们试图从以下两方面对用大肠杆菌表达系统制备重组人内皮抑素的方法进行改进:一是开发和改进重组内皮抑素的纯化和复性方法,以便从包涵体中获得更多的活性蛋白(You,W.K.,So,S.H.,Lee,H.,Park,S.Y.,Yoon,M.R.,Chang,S.I.,Kim,H.K.,Joe,Y.A.,Hong,Y.K.,and Chung,S.I.1999.Purificationand characterization of recombinant murine endostatin in E.coli.Exp.Mol.Med.31,197-202;Violand,B.N.,and Harding,E.I.2003.Method ofproducing mouse and human endostatin.United States Patent 6,653,098),但是由于包涵体复性的复杂性,内皮抑素的活性回收率往往很低;二是通过改变克隆策略和对表达菌株培养条件的优化,从而增加重组人内皮抑素在大肠杆菌中的可溶性表达量(Xu,R.,Du,P.,Fan,J.J.,Zhang,Q.,Li,T.P.,and Gan R.B.2002.High-level expression and secretion ofrecombinant mouse endostatin by Escherichia coli.Protein Expression Purif24,453-459;朱敏生,智刚,朱年春,智强,陈晓明,重组人内抑素的高效表达方法,CN03155724.4,公开日:2004年4月21日)。中国专利申请CN03155724公开了一种使人内皮抑素基因在大肠杆菌中高效表达的方法,该方法在不改变内皮抑素氨基酸序列的前提下,突变了N端4个氨基酸残基的编码序列,选用大肠杆菌喜用密码子,将该突变后的重组人内皮抑素基因克隆入表达载体,并采用乳糖诱导重组人内皮抑素的表达,表达量可达菌体总蛋白的40%,但是表达产物以包涵体形式存在,仍然要经过复杂的变复性过程才能获得有活性的人内皮抑素。外源蛋白不能在工程菌中可溶性高效表达与其本身结构特征、表达载体及宿主菌有关,同时与诱导表达的工艺条件也有关系。
因此,本领域迫切需要提供一种能够可溶性高效表达重组人内皮抑素的表达菌株和培养该菌株以使重组人内皮抑素可溶性高效表达的方法。
发明内容
基于上述本领域技术上的需要,本发明人对多个表达载体和宿主菌进行了广泛的研究。作为结果,本发明人最终提供了一种可溶性高效表达重组人内皮抑素的表达菌株。另一方面,本发明人对该表达菌株的培养及表达条件也进行了广泛的研究,提供了培养该菌株使重组人内皮抑素可溶性高效表达的方法。
因此,本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种重组人内皮抑素的表达菌株,它高效表达可溶性重组人内皮抑素,以克服现有技术中存在的重组人内皮抑素以包涵体形式表达的缺陷。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种可溶性高效表达重组人内皮抑素的方法,以克服现有技术中存在的重组人内皮抑素以包涵体形式表达、纯化须经变复性的缺陷。
为此,本发明的构思如下:对表达载体和宿主菌进行选择,构建一种重组人内皮抑素的大肠杆菌表达菌株,继而对诱导表达方法进行选择,使重组人内皮抑素在大肠杆菌中可溶性表达量和总表达量同时增加。
本发明提供了一种重组人内皮抑素的表达载体pET-Endo,该载体含有人内皮抑素基因(Endo),它插入载体pET43.1a。
所述的表达载体pET-Endo的构建:
根据人内皮抑素基因序列(SEQ ID NO:1)合成两段引物(引物一:5′-GCATAGCCATCGTGATTTC-3′(SEQ ID NO:2),引物二:5′-CGGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCAT-3′(SEQ ID NO:3)),以质粒pMD-Endo为模板,通过PCR方法扩增人内皮抑素基因。将PCR产物和载体pET43.1a(购自Novagen公司)分别用PshAI和BamHI酶切后,使用TaKaRa DNA连接试剂盒(TaKaRa DNA Ligation Kit)(TaKaRa公司,cat.No:D6022)进行连接,将Endo基因插入载体pET43.1a的PshAI和BamHI之间。
利用本领域公知的技术,例如可以通过人工合成人内皮抑素的基因序列或者用RT—PCR方法克隆人内皮抑素基因,如用中国专利申请CN03155724公开的方法克隆人内皮抑素基因,将其插入质粒载体pMD(pMD18-T载体。TaKaRa公司,cat.No:D504A),即可得到载体pMD-Endo,人内皮抑素基因插入质粒载体pMD的步骤按照厂家提供的说明书进行。
上述PCR和酶切的方法在本领域是已知的,连接反应按照厂家说明书进行。
另一方面,本发明提供了一种重组人内皮抑素的表达菌株,它含有表达载体pET-Endo。优选地,该表达菌株的宿主菌为大肠杆菌。更优选地,为大肠杆菌Origami(DE3)(Novagen公司,cat.No:70617-3)。
该表达菌株的制备方法,包括将上述表达载体pET-Endo转化宿主菌的步骤。
将表达载体转化宿主菌的方法在本领域是已知的,例如高压电穿孔转化法或者热激转化感受态细胞法。宿主菌感受态细胞的制备按照《分子克隆试验指南》(第二版)的方法制备。
由于培养和诱导表达条件对重组人内皮抑素的表达有显著影响,因此本发明还提供了重组人内皮抑素可溶性高效表达的方法,该方法通过培养上述表达菌株实现。
在本发明的中,提供了一种重组人内皮抑素可溶性高效表达的方法,该方法包括培养上述表达菌株的步骤,诱导温度为25—30℃。优选地,诱导温度为25℃。
本发明提供了一种重组人内皮抑素可溶性高效表达的方法,该方法通过培养上述表达菌株实现,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的终浓度为0.1-1.0mmol/L。优选地,IPTG的终浓度为0.1-0.5mmol/L。
在本发明的另一实施例中,提供了一种重组人内皮抑素可溶性高效表达的方法,该方法通过培养上述表达菌株,用IPTG诱导人内皮抑素表达,诱导时间为6—19hr。优选地,诱导时间为6—10hr。
优选地,本发明重组人内皮抑素可溶性高效表达的方法为:培养上述表达菌株,诱导温度25—30℃、IPTG的终浓度为0.1-0.5mmol/L,诱导时间6—10hr。
在本发明中“可溶性表达”的意思是人内皮抑素或融合人内皮抑素以溶解的形式存在于细胞质中或者分泌于细胞周质。上述人内皮抑素的表达方法中,人内皮抑素以融合蛋白的形式存在于细胞质中。
检测表达蛋白的方法在本领域是公知的,例如用SDS—PAGE检测目标蛋白的表达:收获菌体,破碎菌体,然后全菌破碎液、离心后上清(可溶性表达)和沉淀(即包涵体)分别进行SDS—PAGE,用凝胶自动扫描密度定量分析表达量和可溶性表达产物的比例。也可以用免疫印迹法(Western Blotting)检测人内皮抑素的表达。
利用本发明的表达菌株,人内皮抑素融合蛋白占菌体总蛋白的50%左右(图2),可溶性表达量占总表达量的40%左右(图3),而现有技术中人内皮抑素是以包涵体形式表达的,没有可溶性表达或者可溶性表达非常低。在发明人一个实施例中,将人内皮抑素基因(Endo)克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建了表达质粒pGEX-Endo,然后将其转入大肠杆菌表达宿主Origami(DE3)中,得到重组菌株Origami(pGEX-Endo)。与本发明的表达菌株平行试验显示,人内皮抑素在大肠杆菌中Origami(pGEX-Endo)以包涵体形式表达(附图4)。显而易见,本发明提供的表达菌株有显著技术效果。这是因为本发明采用的表达载体pET43.1a的多克隆位点上游存在一个可溶性很强的Nus蛋白,将人内皮抑素基因插入到多克隆位点,构建的表达载体pET-Endo表达Nus—人内皮抑素融合蛋白,有效地增加人内皮抑素在细胞质中的可溶性。另外,载体pET-Endo中还含有一个His-Tag,这有利于人内皮抑素的纯化。
优选地,本发明选择了大肠杆菌Origami(DE3)作为表达载体pET-Endo的宿主菌,该菌株带有谷胱甘肽还原酶(gor)和硫氧还蛋白还原酶(trxB)双突变,有利于外源蛋白在细胞质中二硫健的形成,增加外源蛋白的可溶性。
根据本发明提供的重组人内皮抑素的表达方法,在总表达量提高的同时,可溶性重组人内皮抑素的表达均可达到总表达量的40%—80%。特别优选地,总表达量达菌体蛋白的47%,同时可溶性表达达89%。
因而,本发明提供的重组人内皮抑素表达菌株及其表达方法,有效解决了现有技术中存在的人内皮抑素以包涵体形式表达的技术缺陷,有利于重组人内皮抑素的纯化。
另外,本发明构建表达载体的方法也可以用于其他种属内皮抑素,例如鼠内皮抑素或其他外源蛋白的可溶性表达。
附图说明
附图1:PCR产物琼脂糖电泳检测图。泳道M为DL2000DNA分子量标准,单位bp;泳道1为PCR产物。
附图2:大肠杆菌E.coli(pET-Endo)全蛋白SDS-PAGE电泳图。1.E.coli(pET-43.1a)(未诱导);2.E.coli(pET43.1a)(IPTG诱导);3.E.coli(pET-Endo)(未诱导)4.E.coli(pET-Endo)(IPTG诱导);M.蛋白分子量标准。
附图3:大肠杆菌E.coli(pET-Endo)破菌蛋白SDS-PAGE电泳图。1.E.coli(pET43.1a)(上清);2.E.coli(pET-Endo)(上清);3.E.coli(pET-Endo)(包涵体);4.E.coli(pET-Endo)(包涵体);M.蛋白分子量标准。
附图4:大肠杆菌Origami(pGEX-Endo)表达系统全蛋白SDS-PAGE电泳图。1:Origami(pGEX-4T-1)(IPTG诱导);2:Origami(pGEX-4T-1)(未诱导);3.Origami(pGEX-Endo)(IPTG诱导);3.Origami(pGEX-Endo)(IPTG诱导);4:Origami(pGEX-Endo)(诱导前);5:Origami(pGEX-Endo)(包涵体);6:Origami(pGEX-Endo)(上清);7:Origami(pGEX-4T-1)(上清);8:Origami(pGEX-4T-1)(包涵体t);M:蛋白质分子量标准。
附图5:重组人内皮抑素在大肠杆菌中的可溶性高效表达结果SDS-PAGE电泳图。M.蛋白分子量标准;1.E.coli(pET-Endo)(上清);2.E.coli(pET-Endo)(包涵体)。
以下结合具体实施方式进一步阐明本发明,但应理解,这些实施例都仅仅是说明性的,不以任何形式限制本发明的范围。在下述各实施例中,未指明具体条件的试验方法,按照本领域公知的常规试验方法进行,或者按照厂商所建议的操作说明进行。
具体实施方式
实施例1重组人内皮抑素表达质粒pET-Endo的构建
根据人内皮抑素的基因序列,合成N端和C端引物序列,其引物序列如下:
引物1:5′-GCATAGCCATCGTGATTTC-3′(SEQ ID NO:2)和
引物2:5′-CGGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCAT-3′(SEQ ID NO:3)
以质粒pMD-Endo为模板,用以上两条引物,通过PCR方法扩增人内皮抑素基因,经琼脂糖电泳分析,扩增片段约550bp(图1),与预计的相吻合。将PCR片段和载体pET43.1a分别用PshAI和BamHI酶切后,使用TaKaRa DNA连接试剂盒(TaKaRa DNA Ligation Kit)进行连接,获得重组人内皮抑素表达载体pET-Endo。
将上述载体用热激法转化至大肠杆菌Top10(商业菌株)感受态细胞中。操作如下:取一管大肠杆菌Top10感受态细胞(含100μl菌液),在冰上融化,将上述连接液全部加入融化的大肠杆菌Top10感受态细胞中,冰上放置30min,42℃水浴热激90s,冰上放置2~3min,加入900μl LB培养基(LB培养基的组成是1%(w/v)胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物和1%(w/v)NaCl),转移至37℃摇床中250r/min振荡培养1hr,然后涂布于含100mg/L氨苄青霉素LB平板上,37℃过夜培养;第二天挑选单克隆,转接在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养液中,37℃过夜振荡培养后,提取质粒,酶切鉴定后,对核苷酸序列进行测序,结果证实核苷酸序列和氨基酸序列的阅读框架完全正确。证明上述表达载体是正确的。
实施例2重组人内皮抑素表达菌株的构建与表达
将重组质粒pET-Endo用热激法转化至大肠杆菌Origami(DE3)感受态中(操作同实施例1)。第二天挑选单克隆,转接在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养液中,37℃过夜振荡培养后,提取质粒,酶切鉴定后进行诱导表达。将含表达质粒的单克隆菌E.coli Origami-Endo在LB培养基中(含100mg/L氨苄青霉素),37℃培养至OD600为0.5左右,加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达6h,离心收集菌体,经超声破菌后,分别对全菌、上清及沉淀(包涵体)蛋白进行SDS-PAGE分析,SDS-PAGE分离胶浓度为12%(w/v)。结果显示在分子量80kDa左右有一条明显的表达带,与预期的分子量相一致,经凝胶自动扫描密度定量分析,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的50%左右(图2),可溶性表达量占总表达量的40%左右(图3)。这表明构建的表达菌株能够可溶性高效表达重组人内皮抑素。
将人内皮抑素基因(Endo)克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建了表达质粒pGEX-Endo,然后将其转入大肠杆菌表达宿主Origami(DE3)中,得到重组菌株Origami(pGEX-Endo)。与上述同样条件诱导表达及检测,结果表明该重组菌株中所表达的人内皮抑素为包涵体(图4)。
实施例3温度对重组人内皮抑素可溶性表达的影响
将表达菌株E.coli Origami-Endo接种于5ml、含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB培养液中。在细菌培养箱中,37℃,250r/min震荡培养15h,然后将菌液以1:100比例转接于含100mg/LAmp的LB培养液中,37℃,250r/min震荡培养3~4h,使菌液OD600在0.5左右,向菌液中加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行诱导表达,诱导温度分别为25℃、30℃和37℃,诱导表达6h后,收集菌体,经超声破菌后,分别对上清和沉淀(包涵体)蛋白进行SDS-PAGE分析,检测重组人内皮抑素可溶性表达效果。经凝胶自动扫描密度定量分析,在25℃、30℃和37℃下诱导,表达的融合蛋白分别占菌体总蛋白的26%、32%和2%,可溶性表达量占总表达量的80%、41%和6%。这表明诱导温度25℃—30℃,表达菌株重组人内皮抑素的可溶性表达量达总表达量的40%以上。
实施例4诱导剂浓度对重组人内皮抑素可溶性表达的影响
将表达菌株E.coli Origami-Endo接种于5ml、含100mg/L Amp的LB培养液中。在细菌培养箱中,37℃,250r/min震荡培养15h,然后将菌液以1:100比例转接于含100mg/L Amp的LB培养液中,37℃,250r/min震荡培养3~4h,使菌液OD600在0.5左右,向菌液中加入终浓度分别为0.1mmol/L、0.5mmol/L和1.0mmol/L的IPTG进行诱导表达,诱导温度分别为30℃,诱导表达6h后,收集菌体,经超声破菌后,分别对上清和沉淀(包涵体)蛋白进行SDS-PAGE分析,检测重组人内皮抑素可溶性表达效果。经凝胶自动扫描密度定量分析,在0.1mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L IPTG浓度下,表达的融合蛋白分别占菌体总蛋白的40%、43%和45%,可溶性表达量分别占总表达量的88%、85%和74%。
实施例5诱导时间对重组人内皮抑素可溶性表达的影响
将表达菌株E.coli Origami-Endo接种于5ml、含100mg/L Amp的LB培养液中。在细菌培养箱中,37℃,250r/min震荡培养15h,然后将菌液以1:100比例转接于含100mg/L Amp的LB培养液中,37℃,250r/min震荡培养3~4h,使菌液OD600在0.5左右,向菌液中加入终浓度分别为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达,诱导温度分别为25℃,诱导表达时间分别为6h、8h、10h和19h后,收集菌体,经超声破菌后,分别对上清和沉淀(包涵体)蛋白进行SDS-PAGE分析,检测重组人内皮抑素可溶性表达效果。经凝胶自动扫描密度定量分析,在6h、8h、10h和19h的诱导表达时间下,表达的融合蛋白分别占菌体总蛋白的54%、46%、43%和31%,可溶性表达量分别占总表达量的84%、87%、88%和55%。
实施例6重组人内皮抑素的可溶性高效表达
将表达菌株E.coli Origami-Endo接种于5ml、含100mg/L Amp的LB培养液中。在细菌培养箱中,37℃,250r/min震荡培养15h,然后将菌液以1:100比例转接于含100mg/LAmp的LB培养液中,37℃,250r/min震荡培养3~4h,使菌液OD600在0.5左右,向菌液中加入终浓度分别为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达,诱导温度为25℃,诱导表达时间为10h后,收集菌体,经超声破菌后,分别对上清和沉淀(包涵体)蛋白进行SDS-PAGE分析,检测重组人内皮抑素可溶性表达效果,经凝胶自动扫描密度定量分析,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的47%,可溶性表达量占总表达量的89%左右(图5)。
序列表
<110>山东东阿阿胶股份有限公司,华东理工大学
<120>一种重组人内皮抑素表达菌株及可溶性表达方法
<160>3
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>552
<212>DNA
<213>人种(human sp.)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(552)
<400>1
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
Claims (7)
1.一种重组人内皮抑素的表达菌株,其特征在于,宿主菌为大肠杆菌OrigamiDE3,表达载体是含有人内皮抑素基因的载体pET43.1a。
2.制备重组人内皮抑素的表达菌株的方法,其特征在于,包括如下步骤:将人内皮抑素基因插入载体pET43.1a构建表达载体和将该表达载体转化宿主菌Origami DE3。
3.如权利要求2所述的制备重组人内皮抑素的表达菌株的方法,其特征在于,将人内皮抑素基因插入载体pET43.1a构建表达载体的方法是根据人内皮抑素基因合成两端引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3,以将人内皮抑素基因插入载体pMD18-T获得的质粒pMD-Endo为模版,通过PCR方法扩增人内皮抑素基因,将PCR产物和载体pET43.1a分别用PshAI和BamHI酶切后,用DNA连接酶链接,将人内皮抑素基因插入载体pET43.1a的PshAI和BamHI之间从而获得表达载体。
4.一种重组人内皮抑素的可溶性表达方法,包括培养如权利要求1所述的表达菌株,其特征在于:用终浓度0.1-1.0mmol/L的IPTG在诱导温度25-30℃条件下诱导6-10小时。
5.如权利要求4所述的重组人内皮抑素的可溶性表达方法,其特征在于,用终浓度0.1-1.0mmol/L的IPTG在诱导温度30℃条件下诱导6小时。
6.如权利要求4所述的重组人内皮抑素的可溶性表达方法,其特征在于,用终浓度0.1mmol/L的IPTG在诱导温度25℃条件下诱导6-10小时。
7.如权利要求4所述的重组人内皮抑素的可溶性表达方法,其特征在于,用终浓度0.1mmol/L的IPTG在诱导温度25℃条件下诱导10小时。
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CN1266064A (zh) * | 1999-03-03 | 2000-09-13 | 华西医科大学 | 血管生成抑制因子—内皮抑素及其制备方法 |
WO2000058498A1 (en) * | 1999-03-30 | 2000-10-05 | Merck & Co., Inc. | Soluble recombinant endostatin |
-
2005
- 2005-07-04 CN CN 200510027530 patent/CN1724671B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN1266064A (zh) * | 1999-03-03 | 2000-09-13 | 华西医科大学 | 血管生成抑制因子—内皮抑素及其制备方法 |
WO2000058498A1 (en) * | 1999-03-30 | 2000-10-05 | Merck & Co., Inc. | Soluble recombinant endostatin |
Non-Patent Citations (4)
Title |
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冯怡等.人内皮抑素基因的克隆以及在大肠杆菌中的可溶性表达研究.中国生物工程杂志24 9.2004,24(9),39-43. |
冯怡等.人内皮抑素基因的克隆以及在大肠杆菌中的可溶性表达研究.中国生物工程杂志24 9.2004,24(9),39-43. * |
李彪等.人血管内皮抑素的基因克隆和表达载体构建及纯化.上海第二医科大学学报23 2.2003,23(2),104页左栏"人血管内皮抑素基因克隆及表达质粒的构建"部分、右栏第2-4行,106页左栏第8-20行,参考文献4272页左栏第1.2.4部分. |
李彪等.人血管内皮抑素的基因克隆和表达载体构建及纯化.上海第二医科大学学报23 2.2003,23(2),104页左栏"人血管内皮抑素基因克隆及表达质粒的构建"部分、右栏第2-4行,106页左栏第8-20行,参考文献4272页左栏第1.2.4部分. * |
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Publication number | Publication date |
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CN1724671A (zh) | 2006-01-25 |
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