CN1535283A - 从融合多肽制备感兴趣的多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离感兴趣的蛋白质的方法，包括与融合的伴体一起表达感兴趣的蛋白质、在基质上选择性地吸附、及对吸附在基质上或从基质分离的融合蛋白质进行高效的切割和回收感兴趣的蛋白质。此外，本发明提供了包括感兴趣的蛋白质和融合的伴体的融合蛋白质，其中融合伴体包含可以被泛素蛋白酶在其C－端进行切割的氨基酸序列，并具有一个或多个不同于感兴趣的蛋白质的等电点。按照本发明，可以高回收率和高纯度地纯化感兴趣的蛋白质。另外，可以不使用生产重组蛋白质所需的复杂的分离过程从而降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及从包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质分离感兴趣的蛋白质的方法，及可用于该方法的融合蛋白质。
背景技术
随着基因重组技术的发展，难于天然获得的蛋白质可以通过利用基因工程化有机体大规模地生产，因而有助于人类的健康。用于重组技术的宿主包括E.coli、酵母、动物细胞等等。特别是在蛋白质生产中E.coli具有基因易于操作、高产出率和允许使用便宜的培养基的优点。
当感兴趣的蛋白质使用重组E.coli生产时，蛋白质可以根据其特性表达为可溶解的形式或不溶的包含体。以可溶解的形式表达的蛋白质由于精确的蛋白质折叠而具有天然性质，在形成三级结构之前可以凝结在一起而不溶的蛋白质不显示其天然特性。因此，不溶蛋白质的包含体必须按照各种方法溶解，然后重新折叠。在后一种情况中，重折叠过程的回收率和产率较低。另外，在不溶解的蛋白质中的许多二硫键给精确的重折叠造成了困难，因此，有利的是产生可溶解形式的感兴趣的蛋白质。
当感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达时，大量地减少显著降低蛋白质的回收率和产率的早期分离步骤如离心和使用膨胀床吸附(EBA)的过滤是可能的。为了以可溶解的形式表达感兴趣的蛋白质，可以将能够以可溶解的形式很好地表达的融合伴体与感兴趣的蛋白质融合在一起。融合伴体的例子包括GST、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、泛素等。泛素是由76个氨基酸组成的小多肽。当感兴趣的蛋白质在与泛素的融合肽中表达时，泛素使得该蛋白质以可溶解的形式很好地表达，还提高了其表达率，因而使该蛋白质处于活性形式。
另一方面，当感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达时难于回收纯的蛋白质，而当感兴趣的蛋白质以不溶解的包含体的形式表达时，容易在纯化的早期阶段将包含体与从E.coli获得的可溶解物质如宿主细胞蛋白质、DNA、多糖分离开。但是，分离可溶解的感兴趣的蛋白质是非常困难的，因为它与可溶解的污染物如宿主细胞的蛋白质、DNA、多糖混合在一起。包含体可以在破坏细胞以用EBA纯化包含体之前通过加入去垢剂如尿素得到溶解，这丧失了如上所述的将不溶解的包含体与从E.coli获得的可溶解的物质分离的有利条件。总之，当感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达时，或者要应用到EBA过程时，与DNA、多糖混合的感兴趣的蛋白质进入随后的纯化步骤。因此，仍然需要高效的纯化过程。
在典型的纯化过程中，可以利用电荷、溶解性、大小、疏水性等的不同从细胞内蛋白质中回收感兴趣的蛋白质。这些纯化过程采用了便宜的材料，但具有较低的选择性。因此，为达到理想的纯度，需要包括各种方法的许多步骤，而且通过这些纯化步骤纯化回收率大幅降低。另外，这些方法还存在着纯化步骤必须进行优化以满足各特定的感兴趣的蛋白质的特性的问题。为增加对感兴趣的蛋白质的选择性，通常可以使用亲合色谱法，其中识别该蛋白质的独特的结构的抗体被固定在树脂上，或者对特异的载体具有亲合力的尾可以被用作融合伴体。用于增加选择性的例子包括GST、多聚组氨酸等(美国专利5108919号和韩国专利177304号)。在亲合色谱的情况下，对融合伴体或感兴趣的蛋白质具有亲合力的昂贵的树脂限制了其工业应用。
另外，当感兴趣的蛋白质以融合蛋白质的形式表达时，融合伴体必须在随后的步骤中通过切割除去，特别是，当感兴趣的蛋白质要应用于医药时，融合多肽必须被设计在感兴趣的蛋白质和融合伴体之间具有适宜的切割位点以在切割后产生精确的N-端或C-端，而且在感兴趣的蛋白质内部没有切割位点。切割反应可以用化学试剂如酸和CNBr，及蛋白酶如凝血酶原激酶和肠激酶进行。尽管酶具有相对高的选择性，它仍可能切割预期的切割位点之外的其它位点，此外，它还具有低效率和高成本。
在本发明之前，已经发展了包含与感兴趣的蛋白质具有不同的等电点的融合伴体的融合多肽，并用离子交换色谱进行了制备和分离。美国专利4532207号提出，精氨酸尾与带负电的EGF融合，然后通过阳离子交换色谱纯化以生产EGF。但是，该方法具有一个缺点，就是直接连接在感兴趣的蛋白质C-端的一些离子型氨基酸的电荷被大的感兴趣的蛋白质的相反电荷掩盖，因此融合蛋白质不能有效地吸附在基质上。所以该方法的纯化回收率较低。
在美国专利5179196和5322930号中，融合多肽分别包含与感兴趣的蛋白质具有不同的电性质的融合伴体、感兴趣的蛋白质及SNBR切割位点和Staph V8切割位点。但是，这些专利还存在问题，许多具有相似的等电点的蛋白质以及融合蛋白质也可能被吸附到离子交换色谱上，而且切割方法选择性较差。因此，其它的被吸附到色谱上的蛋白质被切割并与感兴趣的蛋白质一起溶解。
发明内容
本发明提供了一种方便地以高回收率分离感兴趣的蛋白质的DNA构造。
本发明还提供一种包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质以方便地和高效地以高回收率分离感兴趣的蛋白质。
本发明还提供一种方便地和高效地以高回收率分离感兴趣的蛋白质的方法。
本发明提供了一种通过利用等电点的变化分离感兴趣的蛋白质的方法。
附图说明
图1为泛素的三级结构示意图。
图2为当按照实施例3用阳离子交换色谱法分离融合蛋白质时，以各种盐浓度洗脱的融合蛋白质的SDS-PAGE分析片断的照片。
图3为按照实施例5用泛素切割酶处理后，加载到阳离子交换色谱并以400mM的盐浓度洗脱所获得的SDS-PAGE分析片断的照片。
图4为按照实施例6用泛素切割酶处理后，加载到阴离子交换色谱并以400mM的盐浓度洗脱所获得的SDS-PAGE分析片断的照片。
图5为按照实施例7用反相HPLC分析图3中的3道片断的色谱图。
图6为说明通过加载包括融合蛋白质的细胞溶解产物到阳离子交换树脂上，用低盐浓度的盐溶液洗涤及与吸附在阳离子交换树脂上的泛素切割酶反应可以制备高纯度的感兴趣的蛋白质的SDS-PAGE照片。
图7为通过EBA在阳离子交换树脂上吸附细胞抽提物、沉淀及与阳离子交换树脂柱中的泛素切割酶反应所获得的SDS-PAGE分析片断的照片。
图8为按照实施例11加载在薄膜上的样品、用NaCl溶液洗脱的溶液、脱盐后的UBP切割反应溶液和使UBP反应溶液通过薄膜获得的片断的SDS-PAGE分析的照片。
图9为按照实施例13加载在薄膜上的样品、用NaCl溶液洗脱的溶液、脱盐后的UBP切割反应溶液和使UBP反应溶液通过薄膜获得的片断的SDS-PAGE分析的照片。
具体实施方式
本发明涉及从包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质分离感兴趣的蛋白质的方法、融合伴体及可用于该方法的融合蛋白质。
更具体地说，本发明提供了一种包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质，其中融合伴体包含可以被泛素切割酶在其C-端进行切割的氨基酸序列，而且其中感兴趣的蛋白质和融合伴体之间的等电点的差异至少为1。
除了特别指出的外，名词“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。
名词“泛素切割酶”是指切割在蛋白质如真核细胞中的泛素的C-端与RGG相邻的肽键的酶。例如，该酶包括从酿酒酵母中获得的UBP1和UBP2、肌肉细胞中的UBP41等。由于泛素切割酶精确地切割相邻于泛素第76位氨基酸甘氨酸的肽键，在感兴趣的蛋白质中产生精确的N-端是可能的(美国专利5847097号)。
在本发明中，泛素可以被修饰以包括含6-10个选自His、Lys和Arg的组的氨基酸的尾。例如，修饰后的泛素可以是多聚组氨酸、多聚赖氨酸或多聚精氨酸等。
名词“感兴趣的蛋白质”是指要制备的蛋白质，包括生理活性蛋白质如生长激素、干扰素、白介素、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素和胰岛素。
这里，名词“融合伴体”是指包含可被泛素切割酶在其C-端进行切割的氨基酸序列，例如RGG，且与感兴趣的蛋白质的等电点相比具有1个或更多，优选为1.5个或更多，更优选为2个或更多的差异的肽。优选的融合伴体为使感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达的肽，也就是说，融合伴体可包括i)泛素切割位点，氨基酸序列可被泛素切割酶在其C-端切割，如泛素、泛素的部分和由它们获得的肽，及ii)在泛素切割位点的N-端的使融合蛋白质以可溶解的形式表达的肽或其变体，如谷光甘肽S转移酶、麦芽糖结合蛋白或硫氧还蛋白。
在本发明的一种实施方式中，融合伴体中的至少一个氨基酸可被替换、缺失或插入以使等电点的差异至少为1。
融合伴体可包括电荷可以发生变化的肽，电荷的变化可通过包含在融合伴体的N-端或内部位点具有与感兴趣的蛋白质不同的电荷的氨基酸序列实现。与感兴趣的蛋白质具有不同的电荷的氨基酸序列可以是包含至少一种选自His，Lys和Arg的氨基酸的氨基酸序列。优选，该氨基酸序列可以是由2-30个氨基酸组成的肽，如多聚组氨酸、多聚赖氨酸和多聚精氨酸。
或者，与感兴趣的蛋白质具有不同的电荷的氨基酸序列可以是包含至少一种选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸的氨基酸序列。
优选，该氨基酸序列可以是由2-30个氨基酸组成的肽，如多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸等。例如，融合伴体可以包括泛素、泛素的部分或其变体、及包含泛素或泛素切割位点的合成肽，其包括在N-端或内部位点具有与感兴趣的蛋白质不同的电荷的氨基酸序列。
这里，名词“具有与感兴趣的蛋白质的电荷不同的电荷的氨基酸序列”意思是在融合蛋白质或感兴趣的蛋白质的纯化过程所使用的pH条件下具有与感兴趣的蛋白质的电荷不同的电荷的氨基酸序列，因而在感兴趣的蛋白质和融合伴体之间产生对基质的吸附差异。如果感兴趣的蛋白质的pH是已知的，就有可能设计出产生电荷差异的氨基酸序列。
例如，当感兴趣的蛋白质具有7或更低的等电点时，可以使用连续连接至少两个带正电荷的氨基酸，如Lys和Arg的氨基酸序列。当感兴趣的蛋白质具有7或更高的等电点时，可以使用连续连接至少两个带负电荷的氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸序列。
具有与感兴趣的蛋白质的电荷不同的电荷的氨基酸序列可以位于融合伴体的N-端或内部位点。通过改变融合伴体的电荷容易地改变融合伴体和感兴趣的蛋白质对基质，如离子交换树脂的吸附程度是可能的。
尽管大多数用于医疗用途的蛋白质具有7.0或更低的等电点，细胞提取物中的核酸和内毒素也显示出低的等电点分布。因此，通过感兴趣的蛋白质与高pI的融合伴体的结合将融合蛋白质与来自于细胞的污染物分离是可能的。
例如，由于泛素具有接近于中性pI值的6.56的pI值，因此根据等电点的差异使用离子交换树脂或薄膜将弱酸性的感兴趣的蛋白质与污染物质如核酸、内毒素和宿主细胞的蛋白质分离是困难的。在这种情况下，通过用在泛素的N-端或内部位点插入的阳离子肽尾修饰泛素以产生包含修饰的泛素和感兴趣的蛋白质的融合蛋白质从而增加融合蛋白质的pI是可能的。因此，可轻易地将融合蛋白质与来自于宿主细胞的污染物质分离。
另外，包括离子型氨基酸的尾可以被连接到泛素的N-端以产生感兴趣的蛋白质和要被泛素切割酶切割的融合伴体之间的等电点差异。此外，泛素可以通过替换至少一个泛素的氨基酸，或通过向其中插入一个离子型氨基酸进行修饰。
本发明的融合伴体可以是至少一个位于泛素的三级结构的表面上的氨基酸可被替换而具有不同的电荷的修饰后的泛素。例如，至少一个位于泛素的三级结构的表面上的氨基酸可以用至少一个选自His、Lys和Arg的氨基酸，或至少一个选自Glu和Asp的氨基酸替换。
参照如图1中所示的泛素的三级结构(Vijay-Kumar et al.，J Mol Biol，194：pp.531(1987))，可以选择适宜被替换的氨基酸。在融合伴体中可被替换的氨基酸满足氨基酸的替换改变泛素的表面电荷的要求，而为了使泛素切割酶在替换后识别融合蛋白质不改变泛素的三级结构。被替换的氨基酸在二级结构中可以从位于环上但不在α-螺旋和β-片的二级结构中，且位于三级结构的表面上的氨基酸选择。
融合伴体可以选自至少一个选自包含Glu16、Glu18和Glu64的组中的位点上的氨基酸可被替换的修饰后的泛素。优选在Glu16、Glu18和Glu64上的氨基酸可分别被His、Lys和Arg替换。
在本发明中，名词“细胞提取物”包括含有包含感兴趣的蛋白质的融合蛋白质的细胞溶解物和培养物溶液。
本发明提供了一种使用融合蛋白质分离感兴趣的蛋白质的方法。
另外，本发明提供了一种从融合蛋白质中分离感兴趣的蛋白质的方法。包括：
a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质；
b)将融合蛋白质加载在融合伴体可以吸附的基质上；
c)用泛素切割酶处理吸附的蛋白质；及
d)从基质上洗脱被切割的感兴趣的蛋白质。
本发明还提供一种从融合蛋白质中分离感兴趣的蛋白质的方法，包括：
a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质；
b)将融合蛋白质加载在融合伴体可以吸附的基质上；
c)从基质上回收融合蛋白质；
d)用泛素切割酶处理回收的融合蛋白质；
e)通过利用感兴趣的蛋白质和融合伴体之间对基质的吸附性差异分离感兴趣的蛋白质和融合伴体。
在上述分离感兴趣的蛋白质的步骤中，步骤b)中在基质上加载融合伴体的步骤可以i)通过在融合伴体可以吸附的基质上加载包含融合蛋白质的细胞抽提物进行，或ii)通过在感兴趣的蛋白质可以吸附的基质上加载包含融合蛋白质的细胞抽提物，从基质上回收融合蛋白质，再将回收的融合蛋白质加载到融合伴体可以吸附的基质上进行。
基质可以是离子交换树脂或带电的薄膜。可在本发明中应用的感兴趣的蛋白质和融合伴体可以是具有1个或更多，优选为1.5个或更多，更优选为2个或更多的等电点差异的肽或蛋白质。例如，感兴趣的蛋白质可以是具有7.0或更高，或者7.0或更低的等电点的蛋白质。
在一个方面，本发明提供了一种分离或纯化感兴趣的蛋白质的高效的方法，包括：
a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质，其中融合伴体包含在N-端或内部位点具有不同于感兴趣的蛋白质的电荷的氨基酸序列，和可以被泛素蛋白酶在其C-端进行切割的氨基酸序列；
b)在融合蛋白质可以吸附的基质上加载含有融合蛋白质的细胞抽提物；
c)用泛素蛋白酶处理吸附的基质；及
d)从基质上洗脱切割的感兴趣的蛋白质。
在另一个方面，本发明提供了一种分离或纯化感兴趣的蛋白质的高效的方法，包括：
a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质，其中融合伴体包含在N-端或内部位点具有不同于感兴趣的蛋白质的电荷的氨基酸序列，和可以被泛素蛋白酶在其C-端进行切割的氨基酸序列；
b)在融合伴体可以吸附的基质上加载含有融合蛋白质的细胞抽提物；
c)从基质上回收融合蛋白质；
d)用泛素切割酶处理回收的融合蛋白质；及
e)通过利用感兴趣的蛋白质和融合伴体之间对基质的吸附性差异分离感兴趣的蛋白质和融合伴体。
在本发明的实施方式中，本发明提供了制备具有7.0或更低的pI值的感兴趣的蛋白质的方法。更具体地说，包含感兴趣的蛋白质的融合蛋白质被吸附到基质上，然后被吸附到离子交换树脂或薄膜上的融合蛋白质在不洗脱融合蛋白质的情况下直接用泛素切割酶处理，从而产生高纯度的蛋白质。该方法包括表达包含具有7.0或更低的pI值的感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质的步骤，其中融合伴体包含被泛素切割酶在其C-端切割的氨基酸序列，和在N-端或内部位点至少有两个带正电荷的氨基酸的氨基酸序列，还包括在融合伴体可以吸附的离子交换树脂或薄膜上加载含有融合蛋白质的细胞抽提物的步骤，用泛素切割酶处理离子交换树脂的步骤，及从离子交换树脂或薄膜上洗脱感兴趣的蛋白质的步骤。
在用泛素切割酶处理之前，弱吸附于基质的来自于宿主细胞的污染物蛋白质、内毒素和核酸可以通过以低浓度的不能使融合蛋白质脱离的盐溶液洗涤树脂塔而被洗脱，因此增加了最终产物的纯度。在融合蛋白质的酶切割之后，感兴趣的蛋白质可以通过应用低浓度的只能洗脱感兴趣的蛋白质的盐溶液选择性地以高浓度地洗脱。
在另一个方面，本发明提供了一种制备具有7.0或更低的pI值的感兴趣的蛋白质的方法。更具体地说，该方法包括表达包含具有7.0或更低的pI值的感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质的步骤，其中融合伴体包含被泛素切割酶在其C-端切割的氨基酸序列和在N-端或内部位点至少有两个带正电荷的氨基酸的氨基酸序列，还包括在融合伴体可以吸附的阳离子交换树脂上加载含有融合蛋白质的细胞抽提物的步骤，从阳离子交换树脂或薄膜上回收融合蛋白质的步骤，用泛素切割酶处理回收的融合蛋白质的步骤，及通过利用融合伴体和感兴趣的蛋白质之间对离子交换树脂的吸附差异分离感兴趣的蛋白质的步骤。例如，通过利用吸附差异分离感兴趣的蛋白质和融合伴体的步骤可以通过在阴离子交换树脂上加载以泛素切割酶处理的融合蛋白质以洗脱融合伴体、然后在吸附融合蛋白质后洗脱吸附的感兴趣的蛋白质，或者通过在阳离子交换树脂上加载以泛素切割酶处理的融合蛋白质以吸附融合伴体、然后洗脱感兴趣的蛋白质而进行。
在本发明的实施方式中，本发明提供了一种制备具有7.0或更高的pI值的感兴趣的蛋白质的方法，更具体地说，该方法包括表达包含具有7.0或更高的pI值的感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质的步骤，其中融合伴体包含被泛素切割酶在其C-端切割的氨基酸序列和在N-端或内部位点至少有两个带负电荷的氨基酸的氨基酸序列，还包括在感兴趣的蛋白质可以吸附的阳离子交换树脂上加载含有融合蛋白质的细胞抽提物的步骤，从阳离子交换树脂上回收融合蛋白质的步骤，在融合伴体可以吸附的阴离子交换树脂上加载融合蛋白质的步骤，从阴离子交换树脂上回收融合蛋白质的步骤，用泛素切割酶处理回收的融合蛋白质的步骤，及通过利用对阴离子交换树脂的吸附差异分离感兴趣的蛋白质的步骤。
特别是，因为大多数细胞内蛋白质具有接近于弱酸性pH的等电点，细胞抽提物中的蛋白质、核酸和内毒素在pH7.0时带负电荷。按照本发明，融合伴体可以被修饰以包括带正电荷的氨基酸序列。因此，大多数细胞内蛋白质、核酸和/或内毒素可轻易地通过使含有融合蛋白质的细胞抽提物经过阳离子交换树脂而被消除。
可应用于本发明的阳离子交换树脂包括CM Sepharose、SPSepharose等。阴离子交换树脂包括Q Sepharose、DEAE Sepharose等。
在本发明中，在产生融合蛋白质之后获得的宿主的细胞抽提物可以使其直接进入膨胀床吸附步骤，从而减少早期分离步骤，如离心和过滤的数目。膨胀床吸附色谱可以从细胞抽提物中除去固体污染物，并在一个步骤中提供需要的蛋白质，从而该色谱可以取代初始分离过程如现有生产方法的离心和过滤。
感兴趣的蛋白质的纯度可以用反相HPLC检测。按照本发明的方法，可以降低混合在感兴趣的蛋白质中的DNA和内毒素的量。
在本发明，各种蛋白质可以与融合伴体融合并使用适宜的表达系统在适宜的原核细胞和真核细胞中表达。
本发明进一步通过下述的实施例阐明。下述的实施例只是阐述本发明，而不是用于限制如权利要求所述的本发明的范围。
实施例1：产生K6Ub-hGH的表达载体
编码人生长激素的基因(Genbank Accession No.K02383，人生长激素合成基因，完全CDS)被克隆入pGNX2载体(韩国专利公布号0319520)以产生pGNX2hGH。使用pGNX2hGH作为模板及使用hGHN和hGHCB作为引物扩增400bp的产物，然后用BamH1切割。
通过PCR使用Genbank Accession No.M17524的基因(合成人泛素基因，完全cds)作为模板及使用正向引物(5’-GCAGCATATGCAGATTTTCGTC-3’(UBF))和反向引物(5’-CGACGGCGCCACCTCTTAGCC-3‘(UBR))扩增编码泛素的基因，然后用Nde1切割203bp的扩增产物。所获得的产物与用HindIII切割的pUC18连接以产生pUC18Ubq。为融合hGH基因，pUC18Ubq用sfo1和BamH1切割，然后与400bp的PCR产物融合以产生pUC18ubhGH。为将pUC18ubhGH转移到表达载体，pGNX4(韩国专利公布号0319520)和pUC18ubhGH用Nde1和BamH1切割，然后连接以产生pGNX4ubhGH。E.coli XL1-Blue MR用pGNX4ubhGH进行转化，在含有卡那霉素的培养基中进行筛选，然后在LB液体培养基中培养。在OD600＝0.6的细胞密度下，通过加入0.5mM的IPTG诱导在细胞中的人生长激素的表达，且该表达用SDS-PAGE分析进行确认。
为融合6赖氨酸尾到融合蛋白质的N-端，赖氨酸尾的串、KTT(表1)被合成并通过PCR使用5’-引物(KTN)和3’-引物(KTC)进行扩增以获得45bp的PCR产物。该PCR产物用Nde1(NEB，England)和Ase1(NEB，England)切割，并与用NdeI切割的pGNX4ubhGH融合以产生pGNX46UbhGH。
E.coli XL1-Blue MR用pGNX46UbhGH转化，在含有卡那霉素的培养基中进行筛选，然后在LB液体培养基中摇瓶培养。通过加入1mM的IPTG诱导在细胞中的人生长激素的表达，且该表达用SDS-PAGE分析进行确认。表达的质粒DNA的序列分析证实N-端的6赖氨酸尾通过AAG AAAAAAAAG AAAAAG的密码子进行编码。
实施例2：K10-UBP表达载体的产生
为克隆UBP1基因，S.cerevisiae ATCC 208275的基因组被用作模板并通过PCR使用UBPN和UBPC的引物(表1)进行扩增以产生2400bp的UBP1基因。UBP1在pRSETc载体的NdeI和BamH1位点之间克隆。克隆的载体和pGNX4载体用NdeI和BamH1切割并融合以获得pGNX4UBP1。E.coli XL1-Blue MR用pGNX4UBP1转化，在含有卡那霉素的培养基中进行筛选，然后在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养。在OD600＝0.6的细胞密度下，通过加入0.5mM的IPTG诱导在细胞中的UBP1的表达。通过用UBP1切割实施例1的融合蛋白质确定UBP1的活性。
为在保持UBP1活性的情况下方便地纯化，10赖氨酸被连接到融合肽的N-端。具有10AAG密码子的寡聚核苷酸的10K(表1)被合成，且10K中的Nde1和Ase1位点用限制性内切酶切割，然后与用Nde1和CIP切割的pGNX4UBP1融合以产生pGNX410KUBP1。用与pGNX4UBP1相同的检测UBP1的活性。
在实施例1和2中的引物序列如下述的表1所示。
[表1]
| 引物 | 核酸序列(5’→3’) | SEQ ID号 |
| UBF | 5’-GCAGCATATGCAGATTTTCGTC-3’ | 1 |
| UBR | 5’-CGACGGCGCCACCTCTTAGCC-3’ | 2 |
| hGHN | 5’-TTTCCAACCATTCCACTG-3’ | 3 |
| hGHCB | 5’-GACTGGATCCTTAAAAACCACAAGAACC-3’ | 4 |
| KTN | 5’-GGGGAATTCCATATG-3’ | 5 |
| KTT | 5’-GGGGAATTCCATATGAARAARAARAARAARAATAATGGATCCCCC-3’ | 6 |
| KTC | 5’-GGGGGATCCATTAAT-3’ | 7 |
| UBPN | 5’-CTACCGCGGTTCATATGGCTITTGTTTATTGAAAGAAG-3’ | 8 |
| UBPC | 5’-ATTGGATCCTTAGTTTACATCTTTACC-3’ | 9 |
| 10K | 5’-GGCCATATG(AAG)10ATTAATGGCC-3’ | 10 |
注：R为腺嘌呤或鸟嘌呤
实施例3：蛋白质的产生和分离
用在实施例1中获得的pGNX4K6UbhGH表达载体转化E.coli TG1以产生转化体群体，该转化体群体接种在含有50mg/L的卡那霉素的5mL的LB培养基，并在37℃培养。1mL的培养的转化体被接种在100mL的含有5g/L的葡萄糖的R培养基中(R培养基的组成如表2所示)并在30℃培养。所获得的培养物被接种在1.4L的含有15g/L葡萄糖的R培养基中并按照fed-batch培养法进行培养，其中在葡萄糖量为0g/L时加入500g/L的葡萄糖溶液。当培养物溶液的吸光率达到大约70时，通过加入1mM的IPTG诱导蛋白质的表达。细胞用离心法收获，在20mM的磷酸缓冲液(pH7.5)中悬浮，然后用微流化剂裂解。细胞抽提物以15000rpm离心60分钟以产生溶解的细胞抽提物的上清液，然后溶解的细胞抽提物用离子交换树脂进行分离。
[表2]
| 成分 | 加入量 |
| KH2PO4 | 3g/L |
| K2HPO4 | 3g/L |
| (NH4)2SO4 | 4g/L |
| 柠檬酸三钠 | 2.3g/L |
| 酪蛋白氨基酸 | 2g/L |
| 葡萄糖 | 5g/L |
| MgSO47H2O | 0.22ml/L |
| 痕量金属溶液 | 1ml/L |
| 卡那霉素 | 100mg/L |
| 硫胺 | 5mg/L |
Econo-Park柱(Bio-Rad，USA)被用2mL的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂(Pharmacia，瑞典)填充，并在1mL/min下操作。磷酸缓冲液(pH7.5)被用作流动相，且在加载样品之前柱用15柱床体积的磷酸缓冲液平衡。柱用上清溶液加载，用3柱床体积的缓冲液溶液冲洗，并用含有同样的流动相的缓冲物质和各种浓度的NaCl的各种溶液洗脱。也就是，分别使用6ml具有200、400、600、800和1000mM的NaCl浓度的缓冲液溶液。在洗脱后用6柱床体积的1M的NaCl缓冲液溶液冲洗柱。通过使用具有各种盐浓度的洗脱溶液获得的部分以SDS-PAGE进行分析，其结果如图2所示(SM：分子量标志，1：流过部分，2：用缓冲液溶液洗脱的溶液，3：用具有200mM的NaCl的缓冲液溶液洗脱的溶液，4：用具有400mM的NaCl的缓冲液溶液洗脱的溶液，5：用具有600mM的NaCl的缓冲液溶液洗脱的溶液，6：用具有800mM的NaCl的缓冲液溶液洗脱的溶液，7：用具有1M的NaCl的缓冲液溶液洗脱的溶液)。
如图2中所示，融合蛋白，K6Ub-hGH在400mM的盐浓度下被洗脱，因而除去了大部分来自于E.coli的污染蛋白质。但是，融合蛋白质被与各种阳离子蛋白质吸附在一起。
实施例4：产生泛素切割酶
用在实施例2中产生的表达载体pGNX410KUBP1转化E.coliTG1，且重组体E.coli按照实施例3的方法培养以产生与10赖氨酸尾(K10-UBP)融合的泛素切割酶。按照与实施例3基本相同的方法，获得重组体E.coli的细胞抽提物，且使用阳离子交换色谱法分离酶。在实施例1中，K6Ub-hGH用具有400mM盐浓度的缓冲液溶液洗脱(K6Ub-hGH 400mM部分)，而在该实施例中，K10-UBP也出现于在400mM盐浓度下获得的部分(K10-UBP 400mM部分)中。因此，含有两个融合蛋白质的溶液可以被调节到具有相同的离子强度。
实施例5：使用泛素切割反应和阳离子交换树脂的分离过程
在实施例3中部分地分离的K6Ub-hGH 400mM部分和在实施例4中部分地分离的K10-hGH 400mM部分以50∶1的比例混合，在30℃进行1小时的切割，并用SDS-PAGE(图3，2道)进行分析。
反应溶液用20mM的磷酸缓冲液(pH7.5)以1∶1的比例稀释以降低离子强度，并被加载到SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂柱上。人生长激素在不被吸附到树脂上的情况下被直接洗脱。其它的蛋白质被吸附到阳离子交换色谱上，从而以高回收率和高纯度分离人生长激素(图3，道1：K6Ub-hGH 400mM洗脱部分，2：用UBP处理K6Ub-hGH400mM洗脱部分后，3：用UBP处理后通过洗脱K6Ub-hGH 400mM溶液获得的流过溶液，4：用缓冲液冲洗的溶液，5：用具有200mM的NaCl的缓冲液冲洗的溶液，6：用具有1M的NaCl的缓冲液冲洗的溶液)。
实施例6：通过使用泛素切割反应和阴离子交换树脂的分离过程
在实施例3中部分地分离的K6Ub-hGH 400mM部分和在实施例4中部分地分离的K10-hGH 400mM部分以50∶1的比例混合，在30℃进行1小时的切割，并用PD-10柱(Pharmacia)脱盐以很好地在阴离子交换色谱上吸附人生长激素。脱盐的反应溶液被加载到Q-Sepharose FastFlow阴离子交换树脂柱上，并用20mM的磷酸缓冲液冲洗以除去不吸附的蛋白质。人生长激素用200mM的盐溶液洗脱(图4，道1：用UBP处理K6Ub-hGH 400mM洗脱部分所获得的溶液，2：用UBP处理后通过加载K6Ub-hGH 400mM获得的洗脱溶液，4：用具有50mM的NaCl的缓冲液冲洗的溶液，5：用具有200mM的NaCl的缓冲液冲洗的溶液，6：用具有1M的NaCl的缓冲液冲洗的溶液)。
实施例7：反相HPLC分析
为确定通过实施例5获得的人生长激素的纯度，进行反相HPLC。从图3的3道部分获得的部分被用作样品。柱为VydacC4(300A，5um，4.6mm id×250mm，USA)。分析条件按照欧洲药典(欧洲药典1999：0951)上描述的人生长激素的分析条件设定。柱温保持在45℃，且29％的异丙醇和71％的50Mm Tris缓冲液(pH7.5)被用作流动相，流速为250μl/min。如图5中所示，通过使用两个离子交换树脂的纯化步骤获得了具有99％或更高纯度的人生长激素。
实施例8：树脂柱中的切割反应
按照实施例3安装SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用磷酸缓冲液(pH7.5)平衡，然后3mL的K6UbhGH 400mM部分用相同体积的缓冲液稀释以降低离子强度，并注射到柱中。通过6mL的缓冲液冲洗除去不吸附的蛋白质，1mL含有K10-UBP 400mM部分的部分用相同体积的缓冲液稀释，并注射到树脂塔中，然后在室温下反应1小时。在反应后，切割的人生长激素通过注入6mL的具有200mM的NaCl的缓冲液洗脱，然后残留的吸附蛋白质通过注入6mL的具有1M的NaCl的缓冲液洗脱。从各步骤中获得的部分用SDS-PAGE进行分析以在图6中显示其结果(SM：分子量标志，1：K6UbhGH 400mM部分，2：用缓冲液冲洗的溶液，3：加载K10-UBP 400mM部分后洗脱的溶液，4：用具有200mM的NaCl的缓冲液冲洗的溶液，5：用具有1M的NaCl的缓冲液冲洗的溶液)。
包含在K6UbhGH 400mM部分中的蛋白质很好地吸附在阳离子交换树脂上，因此使用缓冲液的预洗脱步骤(2道)中不洗脱。与此相似，包含在K10-UBP 400mM部分中的蛋白质吸附良好(3道)。在泛素切割酶的切割反应后，人生长激素被从融合蛋白质中释放出来。在切割反应后，塔用具有200mM的NaCl的缓冲液灌注，然后切割的人生长激素以高纯度出现在洗脱部分中(4道)。
实施例9：分离过程中应用EBA
用100ml STREAMLINE树脂填充的STREAMLINE25以磷酸缓冲液(pH7.5)平衡，然后用按照实施例3获得的含有K6Ub-hGH融合蛋白质的细胞抽提物(400ml)从底部向上注入，以使柱床的膨胀率为2。在样品注入之后，柱用2倍树脂体积的磷酸缓冲液冲洗以除去固体物质如细胞残片、DNA和细胞蛋白质。为从吸附在树脂上的融合蛋白质切割人生长激素，树脂被沉淀，且50ml在实施例4中获得的K10-UBP溶液用缓冲液稀释，然后被注入柱中。通过用蠕动泵使柱中的溶液循环进行反应，且通过用分光光度计测定吸光率来确定切割反应的进行程度。随着反应的进行，从吸附的融合蛋白质切割的人生长激素释放增加，且在3小时后，吸光率不再增加，表明反应的中止。在反应后，释放的人生长激素通过注入具有100mM的NaCl的缓冲液洗脱，并分别用含有600mM和1M的NaCl的溶液冲洗(图7，道1：分子量标志，2：细胞溶解物，3：注入细胞溶解物后冲洗的溶液，4：UBP处理后洗脱的溶液，5：用具有100mM的NaCl的缓冲液冲洗的溶液，6：用具有600mM的NaCl的缓冲液冲洗的溶液，7：用具有1M的NaCl的缓冲液冲洗的溶液)。
实施例10：产生pGNX4K6UblFNalpha-2b表达载体
为融合泛素蛋白和干扰素蛋白，进行了两步的PCR。
在第一步中，泛素基因通过使用包含泛素编码基因(GenbankAccession No.M17524，合成人泛素基因，完全cds)的载体作为模板及F6KUb(如表3中所示包含NdeI位点、6赖氨酸、泛素的5’-端)和ORIFN(包含泛素的3’-端和人干扰素的5’-端)作为引物以分别产生250bp和500bp的PCR产物。
在第二步中，为融合两个PCR产物，作为模板的PCR产物用引物F6KUb(包含NdeI位点、6赖氨酸、泛素的5’-端)和引物RIFN(包含人干扰素的3’-端和BamH1位点)以产生750bp的PCR产物。所获得的产物和pGHNX4用NdeI和BamH1切割，并连接以产生pGNX4K6UblFNalpha-2。载体的核酸序列分析证实，6赖氨酸尾、泛素和人干扰素表达在蛋白质中。
用pGNX4K6UblFNalpha-2b转化E.coli TG1，且通过加入0.5mM的IPTG诱导融合肽的表达，并用SDS-PAGE进行分析。在实施例中使用的引物序列如表3中所示。
[表3]
| 引物 | 核酸(5’→3’) | 注释 | SEQID号 |
| F6Kub | 5’-GGGTTAACATATGGAGGATGAGGATGAAGACAAGATTTTCGTCAAGAC-3’ | Nde I位点、ATG和6赖氨酸尾 | 11 |
| ORIFN | 5’-AGGGAGATCACAGCCACCTCTTAGCCTTAGCACA-3’ | - | 12 |
| OFIFN | 5’-TAAGAGGTGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCACA-3’ | - | 13 |
| RIFN | 5’-GCGCGGATCCTTATTCCTTCCTCCTTAATCTT-3’ | TAG和BamH1位点 | 14 |
实施例11：用阳离子薄膜分离干扰素
用pGNX4K6UblFNalpha-2b转化E.coli TG1，并选择表达融合蛋白质的克隆。克隆在5ml的LB培养基培养并接种到100ml的LB培养基中。在吸光率为1.5-2时，通过加入IPTG诱导干扰素的表达，并在加入IPTG 4小时后收获细胞。细胞通过在1300rpm离心3分钟进行回收，在4ml的20mM磷酸缓冲液中悬浮，然后用超声发生器破碎细胞。通过在1300rpm离心30分钟取得上清液以在下面的分离步骤中使用。
Vivapure S mini H(Vivascience，德国)阳离子交换薄膜在用20mM的磷酸缓冲液平衡后用于纯化干扰素。含有干扰素的上清液被加载到薄膜上，并通过1200g的离心吸附。该薄膜用0.4ml的磷酸缓冲液清洗两次，并用具有1M的NaCl的磷酸缓冲液洗脱。0.1ml的洗脱部分用具有3500的分子分离点的透析设备(Slide-A-Lyzer mini，Pierce，USA)脱盐1小时，并用UBP1处理。在2小时的切割反应之后，反应溶液被加载到用20mM的磷酸缓冲液平衡的薄膜上，并在1200g离心5分钟。不吸附的干扰素以高纯度出现在通过薄膜的部分中(图8，道1：加载以1/10的比例稀释的样品，2：用具有1M的NaCl的缓冲液洗脱的溶液，3：脱盐后的UBP切割反应溶液，4：在切割反应后通过薄膜的部分)。
实施例12：修饰泛素
为在保持三级结构以使泛素切割酶能够识别泛素-融合蛋白的情况下改变泛素的表面电荷，考虑到泛素的三级结构，在16位、18位和64位上的带负电的谷氨酸被精氨酸或赖氨酸替换以改变等电点。为修饰泛素，进行两步骤PCR。
在第一步的PCR中，使用在目标位点具有不同的DNA序列的引物。也就是，引物FMUB1被用于修饰在泛素的16位和18位上的谷氨酸，引物RMUB1被用于修饰泛素的64位上的谷氨酸。通过使用FMUB2的正向引物(包含ATG和NdeI位点)和RMUB2的反向引物(包含SfoI位点)扩增PCR产物以产生修饰的泛素基因。修饰的泛素基因被克隆入pGEM-T简易载体中以产生pGEM-Mub载体。载体的序列分析表明，获得了想要的修饰泛素。
进行第二步PCR以融合修饰的泛素基因和人生长激素基因。通过使用pGEM-Mub作为模板及引物FMUB2(包含NdeI位点、ATG和修饰的泛素的5’-端)和引物OrhGH(包含修饰的泛素的3’-端和人生长激素的5’-端)进行扩增以产生250bp的PCR产物。
人生长激素基因通过使用包括编码人生长激素的基因(GenbankAccession No.K02382，人生长激素合成基因，完全cds)作为模板，及引物OFhGH(包含修饰的泛素的3’-端和人生长激素的5’-端)和引物RhGH(包含人生长激素的3’-端和Bam HI位点)以产生600bp的PCR产物。为融合该PCR产物，作为模板的PCR产物用引物FMUB2(包含Nde I位点和修饰的泛素的5’-端)和RhGH(包含人生长激素的3’-端和Bam HI位点)以产生900bp的PCR产物。融合的PCR产物和表达载体pGNX4用NdeI和BamHI切割，并连接以产生pGNX4MubhGH载体。载体的核酸序列分析证实，修饰的泛素与人生长激素融合。
实施例13：用修饰的泛素分离人生长激素
用pGNX4MubhGH载体转化E.coli，并选择表达融合蛋白质的克隆。克隆在5ml的LB培养基中预培养，且3％的培养物溶液被接种到100ml的LB培养基中。当吸光率为1.5-2时，通过加入IPTG诱导融合蛋白质的表达，且在加入IPTG 4小时后收获细胞。细胞通过在13000rpm离心3分钟进行回收，悬浮在20mM的MES缓冲液中以使吸光率为50，并用超声发生器破碎细胞。通过在13000rpm离心30分钟取得上清液，然后在下面的分离步骤中使用。
Vivapure S mini H(Vivascience，德国)阳离子交换薄膜在用20mM的MES缓冲液平衡后用于纯化融合蛋白质。含有融合蛋白质的上清液被加载到薄膜上，并通过900g的离心吸附。该薄膜用0.4ml的MES缓冲液清洗两次，并用具有1M的NaCl的MES缓冲液洗脱。0.1ml的洗脱部分用具有3500的分子分离点的透析设备(Slide-A-Lyzer mini，Pierce，USA)脱盐1小时，并用UBP1处理。在2小时的切割反应之后，反应溶液被加载到用20mM的磷酸缓冲液平衡的薄膜上，并在900g离心5分钟以产生纯化的人生长激素。
与融合到泛素的N-端的离子型尾相似，通过在泛素的内部位点上替换氨基酸增加等电点，从而使修饰的泛素吸附到阳离子交换树脂上并被泛素切割酶所识别(图9，道1：加载以1/10的比例稀释的样品，2：用具有1M的NaCl的缓冲液洗脱的溶液，3：脱盐后通过洗脱UBP切割反应所获得的部分，4：在切割反应后通过薄膜所获得的部分)。引物如表4中所示，其中划线部分的核酸序列表示修饰的部分。
[表4]
| 引物 | 核酸(5’→3’) | 注释 | SEQID号 |
| FMUB1 | 5’-CTT TGA CCG GTA AAACCA TAA CAT TGC GCG TTAAAT CTT CCC ATA CC-3’ | 在Glu16、Arg16、Glu18和Lys18修饰的氨基酸 | 15 |
| FMUB2 | 5’-GGC CGC ATA TGC AGATTT TCG TCA AGA CTT TGACCG GTA AAA CC-3’ | Nde I位点、ATG | 16 |
| RMUB1 | 5’-CTC TTA GCC TTA GCACAA GAT GTA AGG TGG AGCGCT TCT GAA TGT TG-3’ | 在Glu64和Arg64修饰的氨基酸 | 17 |
| RMUB2 | 5’-CGC GGA TCC AGT GGAATG GTT GGG GCG CCA CCTCTT AGC CTT AGC AC-3’ | Sfo I位点 | 18 |
| OrhGH | 5’-CAG TGG AAT GGT TGGAAA GCC ACC TCT TAG CCTTAG-3’ | 19 | |
| OfhGH | 5’-CTA AGG CTA AGA GGTGGC TTT CCA ACC ATT CCACTG-3’ | 20 | |
| RhGH | 5’-GCC GGA TCC TTA AAAACC ACA AGA ACC-3’ | Bam H1位点 | 21 |
按照本发明，感兴趣的蛋白质可以轻易和经济地得到分离。
Claims (22)
1、一种融合蛋白质，包括感兴趣的蛋白质和融合伴体，其中该融合伴体包含可以被泛素蛋白酶在其C-端进行切割的氨基酸序列，并具有一个或多个不同于感兴趣的蛋白质的等电点。
2、如权利要求1所述的融合蛋白质，其中所说的融合伴体是泛素或由泛素衍生的肽。
3、如权利要求1所述的融合蛋白质，其中所说的融合伴体包含在其C-端的可以被泛素蛋白酶切割的泛素切割位点，和在泛素切割位点的N-端的选自包含谷光甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白质和硫氧还蛋白的组的肽或其变体。
4、如权利要求3所述的融合蛋白质，其中所说的泛素切割位点是泛素或由泛素衍生的肽。
5、如权利要求1所述的融合蛋白质，其中所说的融合伴体是通过在融合伴体中替换、插入或缺失至少一个氨基酸使电荷发生改变的肽。
6、如权利要求5所述的融合蛋白质，其中所说的融合伴体是由于包含在融合伴体的N-端或内部位点上具有与感兴趣的蛋白质不同电荷的氨基酸序列而使电荷发生改变的肽。
7、如权利要求6所述的融合蛋白质，其中所说的具有与感兴趣的蛋白质不同的电荷的氨基酸序列是一个2-30氨基酸的氨基酸序列，包含至少一种选自组氨酸、赖氨酸和精氨酸的组的氨基酸。
8、如权利要求6所述的融合蛋白质，其中所说的具有与感兴趣的蛋白质不同的电荷的氨基酸序列是一个2-30氨基酸的氨基酸序列，包含至少一种选自谷氨酸和天冬氨酸的组的氨基酸。
9、如权利要求5所述的融合蛋白质，其中所说的融合伴体是通过在泛素的三级结构的表面上替换至少一个氨基酸使电荷发生改变的肽。
10、如权利要求9所述的融合蛋白质，其中所说的在泛素三级结构的表面上的至少一个氨基酸是被至少一个选自组氨酸、赖氨酸和精氨酸的组的氨基酸替换。
11、如权利要求9所述的融合蛋白质，其中所说的融合伴体包含至少一个在一个或多个选自泛素的Glu16、Glu18和Glu64的组的氨基酸位被替换的氨基酸。
12、如权利要求11所述的融合蛋白质，其中所说的融合伴体是泛素的Glu16被Arg替换、Glu18被Lys替换及Glu64被Arg替换的肽。
13、如权利要求9所述的融合蛋白质，其中所说的在泛素三级结构的表面上的至少一个氨基酸是被至少一个选自谷氨酸和天冬氨酸的组的氨基酸替换。
14、如权利要求1所述的融合蛋白质，其中所说的感兴趣的蛋白质是选自包含人生长激素、干扰素、白介素、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素和胰岛素的组。
15、一种从融合蛋白质中分离感兴趣的蛋白质的方法，包括：
a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和如权利要求1所述的融合伴体的融合蛋白质；
b)在融合伴体可以吸附的基质上加载融合蛋白质；
c)用泛素蛋白酶处理吸附的基质；及
d)从基质上洗脱感兴趣的蛋白质。
16、如权利要求15所述的方法，其中所说的融合蛋白质是在权利要求2-14中任一项权利要求所确定的融合蛋白质。
17、一种从融合蛋白质中分离感兴趣的蛋白质的方法，包括：
a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和如权利要求1所述的融合伴体的融合蛋白质；
b)在融合伴体可以吸附的基质上加载融合蛋白质；
c)从基质上回收融合蛋白质；
d)用泛素蛋白酶处理回收的融合蛋白质；及
e)利用对基质的吸附性差异将感兴趣的蛋白质与融合伴体分离。
18、如权利要求17所述的方法，其中所说的融合蛋白质是在权利要求2-14中任一项权利要求所确定的融合蛋白质。
19、如权利要求15或17所述的方法，其中所说的步骤b)中在基质上加载融合蛋白质的步骤是i)通过在融合伴体可以吸附的基质上直接加载包含融合蛋白质的细胞抽提物进行，或ii)通过在感兴趣的蛋白质可以吸附的基质上加载包含融合蛋白质的细胞抽提物，从基质上回收融合蛋白质，再将回收的融合蛋白质加载到融合伴体可以吸附的基质上进行。
20、如权利要求15或17所述的方法，其中所说的基质是离子交换树脂或带电的薄膜。
21、如权利要求15或17所述的方法，其中所说的感兴趣的蛋白质具有7.0或更低的pI值。
22、如权利要求15或17所述的方法，其中所说的感兴趣的蛋白质具有7.0或更高的pI值。
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