CN1197877C

CN1197877C - AsLc－IFN融合蛋白及其制备

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Publication number: CN1197877C
Application number: CN 03116232
Authority: CN
Inventors: 韩焕兴
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-04-08
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2023-04-08
Also published as: CN1442430A

Abstract

本发明涉及人源抗HBs轻链与IFN融合蛋白(AsLc-IFN)及其制备方法和应用。本发明AsLc-IFN融合蛋白是由人源抗HBsλ轻链与IFN-α融合，分子量约为47Kd的蛋白。该AsLc-IFN融合蛋白采用人抗HBs轻链基因与IFNα的基因在体外连接，构建pBAD/gIII载体，转化Top10细菌后经抗原结合活性和干扰素活性的双重筛选，阳性克隆在阿拉伯糖诱导条件下原核表达，经发酵培养和Ni-NTAAgarose亲和层析纯化，得到约80mg/L菌液的周质腔蛋白，并可大量生产该融合蛋白。该融合蛋白保持了原抗原结合能力，并具有IFN-α的生物活性，可用于HBV感染的预防和某些患者的治疗，还可用于包括HBsAg阳性的部分肝癌患者。

Description

AsLc-IFN融合蛋白及其制备

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人源抗HBs轻链与IFN融合蛋白(AsLc-IFN)及其制备方法和应用。

背景技术：

人源性或人源化单克隆抗体是抗体在临床应用中的必要形式，近年已经FDA批准上市的抗体制剂有数十种之多。人源抗HBs片段抗体在HBV感染的防治中有肯定的价值。

IFN-α是一组能够诱导一系列细胞内蛋白表达，继而发挥抗病毒作用的细胞因子，除能直接诱导抗病毒状态外，还能通过活化巨噬细胞，NK细胞和增强其它免疫功能，产生广泛抗病毒效应。IFN-α用于慢性乙型肝炎的抗病毒治疗已有20多年，是目前治疗病毒性肝炎最有效的药物。

干扰素克隆与表达的报道很多，有原核、酵母菌、细胞等多种形式，是一项成熟的技术。人源抗HBs的克隆与表达有数家报道，均为原核系统的周质腔分泌性表达。抗体片段与IFN的融合表达国外未见报道，国内见于两家，一是北京海军总医院报导的抗HBsFd与IFN的融合；另一是解放军医学杂志2000，25(3)：204-206报导的Fab与IFN的融合表达。在人源自然抗体的抗原结合能力中，轻链占据重要地位，因而选择研究抗体轻链与IFN的融合显得更为重要。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是在现有技术的基础上公开一种具有较好抗原结合性和生物活性的人源抗HBs轻链与IFN-α的融合蛋白(AsLc-IFN)。

本发明AsLc-IFN融合蛋白是由人源抗HBsλ轻链与IFN-α融合的分子量约为47Kd的蛋白，其轻链序列见序列1(Lc-DNA)。

本发明所要解决的另一技术问题是公开上述AsLc-IFN融合蛋白的制备方法。

本发明公开的AsLc-IFN融合蛋白是采用人抗HBs轻链基因与IFNα的基因在体外连接，其具体步骤包括：

1、选择商品高表达载体pBAD/gIII作为本产品的克隆载体，应用轻链框架区和稳定区两端的序列特异引物从抗HBFab阳性克隆中扩增出轻链序列，经酶切与连接后构建成轻链表达载体；用基因扩增法将IFN-α基因插入到已载有轻链的载体中；改建后的质粒图谱为见图1。

2、载体转化Top10细菌后经抗原结合活性和干扰素活性的双重筛选确定阳性克隆，增菌、发酵培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达融合蛋白。

3、经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化，得到约80mg/L菌液的目的蛋白，并大量生产该融合蛋白。

4所得蛋白经与抗原结合试验和干扰素活性测定表明具有双重活性。

本发明实施例1详细描述了AsLc-IFN融合蛋白的制备。

本发明选择抗HBs轻链与IFN的融合表达，将原pComb3表达系统转换为pBAD系统。其中pBAD/gIII Top10原核表达系统，系周质腔分泌性表达，有助于活性蛋白的正确折叠，有助于抗体与干扰素的立体结构形成与活性保持。

表达纯化后的融合蛋白保持了原抗原结合能力，实验证明其抗原结合性与Fab片段相近，并具有IFN-α的生物活性，经dot-blot，westernblot鉴定其抗原结合能力与原Fab的生物活性在同一级别。初步鉴定表明融合蛋白中的干扰素具良好生物活性。

本发明所要解决的再一技术问题是公开上述AsLc-IFN融合蛋白在制备治疗HBV感染药物中的应用。

本发明公开的AsLc-IFN融合蛋白，可用于HBV感染的预防和某些患者的治疗，还可用于包括HBsAg阳性的部分肝癌患者。

本发明克隆表达的融合蛋白中的抗体片段为人源抗体基因的表达产物，其氨基酸的序列见序列2(Lc-pro)，各框架区和CDR区的序列见序列5，IFN-α为人源干扰素基因，其基因序列和对应的氨基酸分别见序列3(INF-DNA)，序列4(INF-pro)。

序列表

序列1 人源抗HBsλ轻链序列(Lc-DNA)

cgcctggccg agctccagcc tgcctccgtc tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gcttatgact ttgtctcctg gtaccaacaa 120

cacccaggca aaccccccaa actcatcatt tttgatgtca agaagcggcc cccaggggtt 180

tccaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caaactgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaacaccgt cacccccgtt 300

ttcggcggag agaccaaggt gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttcata gttctagaac 660

序列2 人源抗HBsλ轻链氨基酸序列(Lc-pro)

Arg Leu Ala Glu Leu Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Ile Phe Asp Val Lys Lys Arg Pro Pro Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asn Thr

85 90 95

Val Thr Pro Val Phe Gly Gly Glu Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Phe Asn Lys Asn

210 215 220

序列3 IFN-α基因序列(INF-DNA)

atgtgcgacc ttcctcaaac tcacagcctt ggcaaccgcc gcgccttgat actcctggca 60

cagatgagga aaatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

atcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaacg tctagaac 508

序列4 IFN-α氨基酸序列(INF-pro)

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

1 5 10 15

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

20 25 30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65 70 75 80

Ile Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145 150 155 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu Arg Leu Glu

165

序列5 轻链各框架区和CDR区的序列

RL″AELQPASVSGSPGQSITISC″ TGTSSDVGAYDFVS″WYQQHPGKPPKLIIF″ DVKKRPP″GVSNRFS

FR 1 CDR 1 FR 2 CDR 2

GSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYC″ SSYTNTVTPVF″GGETKVTVLG″QPKAAPSVTLFPPSSEELQAN

FR 3 CDR 3 FR 4

KATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHE

GSTVEKTVAPTECS

附图说明

图1 改建后的pBAD/gIII质粒图谱

具体实施方式：

实施例1：

(1)IFN-α的扩增

以IFN-α质粒为模板设计一对引物：正向5’-ATGC TCTAGAAGGA GGC GGT GGC TCG ATG TGC GAC CTT CCT CAA ACT-3’，反向5’-ACGC TCTAGA CG TTC CTT ACT TCT TAA ACT TTCTTG-3’扩增出5’端带有一个5个氨基酸柔性连接肽的目的基因。

(2)克隆及筛选

将重组了人源抗HBsAg抗体Lc基因的pBAD/gIIIA载体用xbaI单酶切，胶回收后作去磷酸化处理，与经同样由xbaI单酶切的IFN-α目的基因以1∶1摩尔比混合，T4连接酶连接。将连接产物转化大肠杆菌TOP10，选取单克隆，抽提质粒载体为模板，用扩增IFN-α基因的引物行PCR鉴定插入了IFN-α的阳性克隆，再以载体上游的18个碱基序列合成一段正向筛选引物，序列为5’-TTC GCG ATT CCG CTGGTG-3’。用此引物与扩增IFN-α的反向引物组合，以插入了IFN-α的阳性载体为模板，进行PCR反应，如IFN-α插入方向正确则可扩增出一包含抗体片段基因与IFN-α基因在内的长约2KB的基因片段，如IFN-α为反向插入，则扩增不出此片段。

(3)融合蛋白的表达及纯化

选取筛选的阳性克隆，转化TOP10大肠杆菌，挑选单个克隆，接种于10ml LB中(含50mg/ml氨苄)37℃，225rpm震摇过夜，按1％比例转接入100ml LB中(含50mg/ml氨苄)37℃，225rpm震摇4-5h，按4％比例接入2.5L KLF2000发酵系统中发酵培养14h，于第4h开始分批补料，于第9h开始加入阿拉糖诱导表达，14h后离心收菌，取一定量菌体按1∶10(W/V)加入10倍体积预冷1xPBS液，超声裂解，功率300-400W，10次，每次10秒，间隔10秒，裂解后5000rpm，4℃离心30min，收集上清，用Ni-NTA Agarose柱进行亲和层析纯化，经过上柱结合，洗涤，洗脱几个步骤，收集洗脱液，用Beckman Du640核酸及蛋白分析仪，测量蛋白含量。

(4)纯化产品的检测

取一定浓度纯化蛋白，以HRP标记的抗人IgG Fab抗体为显色抗体作Western-blot检测融合蛋白中抗体成份。在抗IFN-αELISA Kit板条加样孔中分别加入100μl纯化蛋白液，及各种浓度的IFN-α标准品，并以PBS及标准品稀释液为阴性对照，37℃温育90分钟，洗板5次，加入酶联工作液37℃温育60分钟，洗板5次，显色，终止后测450mm吸光度值。

(5)抗体融合蛋白的生物学活性鉴定

在硝纤膜上预点HBSAg抗原，以所获纯化蛋白为一抗，以HRP标记羊抗人IgG Fab抗体为二抗，作DOT-blot分析。以人源抗HBsAgFab片段蛋白为对照检测融合蛋白抗体亲合性。应用WISS细胞法检测表达产物中IFN-α的生物活性。用人IFN-αELISA检测试剂盒检测融合蛋白中IFN-α的抗原性，与IFN-α标准品对照示纯化蛋白液呈阳性结果。应用Dot-blot检测融合蛋白中抗体亲合性，结果提示融合蛋白有较好的抗原结合性，与Fab蛋白差别不大。WISS细胞法检测显示表达产物IFN-α生物活性较好。

(6)利用PCR技术扩增出了人IFN-α基因，并插入到重组了人抗HBsAg Lc基因的pBAD/gIIIA载体(图1)，又进一步筛选出了插入方向正确的阳性克隆。

发酵培养后离心收取菌落，获得湿菌重为96g/L，经Ni-NTAAgrase柱纯化后，获得了λ轻链与IFN-α的融合蛋白，分子量约为47kd。

Claims

1、一种人源抗HBs轻链与IFN融合蛋白AsLc-IFN融合蛋白，其特征在于该蛋白是由人源抗HBsλ轻链与IFN-α融合的蛋白，其轻链具序列2的氨基酸序列。

2、根据权利要求1所述的AsLc-IFN融合蛋白的制备方法，其特征在于所述融合蛋白的制备包括下列步骤：

1)选择载体pBAD/gIII作为本产品的克隆载体，应用轻链框架区和稳定区两端的序列特异引物从抗HBFab阳性克隆中扩增出轻链序列，经酶切与连接后构建成轻链表达载体，用基因扩增法将IFN-α基因插入到已载有轻链的载体中；

2)载体转化Top10细菌后经抗原结合活性和干扰素活性的双重筛选确定阳性克隆，增菌、发酵培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达融合蛋白；

3)经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化，得到目的蛋白，并大量生产该融合蛋白。