KR20220058619A - 인간 콜라겐 17형 폴리펩티드, 이의 생산 방법 및 용도 - Google Patents

인간 콜라겐 17형 폴리펩티드, 이의 생산 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

폴리펩티드, 이의 생산 방법 및 용도가 제공된다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 63개 내지 1496개의 연속적 아미노산 잔기들을 포함하고, (A)m으로 나타낸 서열을 포함하거나 (A)m으로 나타낸 서열로 구성되며, 각각의 A는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 및 서열 번호 : 3 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열이거나, 1개 이상, 예를 들면 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기들이 치환, 부가, 또는 결실된 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3 중 어느 하나의 아미노산 서열이거나, 또는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열과 83% 내지 97%의 서열 동일성을 갖는 서열이고; m은 1 내지 10의 정수이고; 각각의 A는 동일하거나 상이하고 2개의 인접한 A들은 펩티드 결합으로 직접 연결되거나 적어도 하나의 아미노산 잔기로 연결된다. 상기 폴리펩티드는 세포 부착 활성을 갖는다.

Description

인간 콜라겐 17형 폴리펩티드, 이의 생산 방법 및 용도
본 출원은 2019년 10월 31일 출원된 중국 특허 출원 번호 제201911051106.3호의 우선권을 주장하며, 이의 개시된 내용은 그 전문이 본 명세서에서 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 유전 공학 기술 분야에 속하며, 폴리펩티드, 이의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다.
콜라겐
콜라겐은 일반적으로 흰색의 투명하고 분지되지 않은 피브릴(fibril)이며, 피부 및 뼈의 기본 지지체이다. 이는 단백질 총량의 25% 내지 35%를 차지할 수 있다. 콜라겐은 인체의 다른 부위들 중 피부, 혈관, 뼈, 힘줄(tendon), 치아 및 연골에 주로 분포하는데, 이들 조직의 주요 기질 및 스캐폴드(scaffold)로서 역할을 하고, 다양한 조직들을 보호하고 연결하며, 신체 내 중요한 생리학적 기능을 한다. 그러므로, 콜라겐은 의약 및 화장품 산업과 같은 산업에서 널리 사용될 수 있다.
현재 시중에 있는 콜라겐 제품은 모두 돼지, 소, 어류와 같은 동물들의 조직으로부터 취한 것이다. 특정 동물들의 콜라겐은 인간의 콜라겐과 매우 유사하지만, 여전히 바이러스 감염 및 감작(sensitization)의 위험을 피하는 것은 어렵다. 현재, 소량의 동물-유래 콜라겐이 화장품에 사용되지만, 의료 장치 또는 정교한 조직 엔지니어링 제품에 널리 사용되어 콜라겐 본래의 생물학적 기능을 수행하는 것은 어렵다. 또한, 기존의 방법에 의해 생산된 콜라겐은 일반적으로 강력한 응고 기능을 가지고 있어, 특정 조직 엔지니어링 제품에 사용되는 경우 혈전증을 일으킬 위험이 높아, 이의 광범위하고 심도 있는 응용에 큰 제한이 있다.
콜라겐을 생산하는 통상적인 방법은 산, 알칼리, 및 효소 가수분해를 활용함으로써 동물-유래 조직을 가공하여 콜라겐 유도체를 추출하는 것이다. 이 방법으로 추출된 콜라겐은 이의 본래의 생물학적 활성을 상실하여 생물의약 분야에서 이의 실제 기능을 수행하는데 사용될 수 없다. 중국 및 해외의 일부 연구기관은 기존의 재조합 발현 방법들을 통해 시험관 내(in vitro) 인간-유래 콜라겐을 발현시키고 있지만, 대량 생산에 투입하기에 생산 비용이 일반적으로 너무 높고 생산 주기가 너무 길다. 그러므로, 우수한 생체물질 특성을 갖고, 인체와 높은 정도의 아미노산 상동성을 가지며, 산업화된 시스템에서 대량으로 제조될 수 있는 콜라겐 물질이 시장에서 절실히 요구된다.
17형 인간 콜라겐
구조적 관점에서, 인체 내 천연 콜라겐의 구조는 매우 복잡하고, 기존의 수단으로 인간-유래 콜라겐을 다량으로 발현 및 제조하는 것은 매우 어렵다. 콜라겐의 가장 일반적인 구조적 특징은 3개의 펩티드 사슬에 의해 형성된 삼중 나선 구조이며, 즉, 3개의 A 펩티드 사슬들이 오른손 방향의 초나선 방식(supercoiled manner)으로 단백질을 형성하는 것이며, 이러한 삼중 나선 부위는 콜라겐 부위라고 한다. 분자 구조의 각각의 A 펩티드 사슬은 반복되는 Gly-X-Y (X 및 Y는 Gly이외의 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X는 흔히 Pro이고, Y는 흔히 Hyp임) 펩티드 단편으로 구성되어 왼손 방향의 나선을 형성하고, 아미노산 잔기들의 상호작용 하에서, 3개의 A 펩티드 사슬들은 동일한 축을 중심으로 하여 오른손 방향의 초나선 방식으로 안정한 삼중 나선 구조를 형성한다. 그러므로, 콜라겐 서열들이 자발적으로 결합하여 안정적인 삼중 나선 구조를 형성하고 생물학적 기능을 수행하는 것은 일반적으로 어렵다. 이러한 어려움은 인간 콜라겐의 개발 및 생산을 심각하게 방해한다.
인체는 28개의 상이한 유형의 콜라겐들을 함유하고, 이들은 일반적인 섬유성 콜라겐 및 일반적이지 않은 비섬유성 콜라겐으로 나뉘어진다. 인간 피부에서 I형, II형, III형은 섬유성 콜라겐에 속한다. 비섬유성 콜라겐 중에서 매우 중요한 콜라겐의 아형(subtype)은 콜라겐 XVII인 17형 콜라겐(인체 내 COL17A1 유전자에 의해 인코딩됨)이다. 17형 콜라겐은 180kDa의 단일 사슬 분자량을 갖는 3개의 COL17A1 사슬의 조합으로 형성된 동종삼량체이다. 이는 70kDa의 구형 세포 내 도메인, 120kDa의 막투과 도메인 및 세포 외 콜라겐 도메인을 포함하며, 견고한 열 안정성을 가진다. 최근 연구는 17형 콜라겐이 인체의 표피 줄기세포에서 헤미데스모좀(hemidesmosome)의 중요한 구성성분이고 세포 노화 및 피부 분화 둘 모두에서 중요한 역할을 하는 것을 확인했다. 하지만, 현재 인간은 비섬유성 콜라겐, 특히 17형 콜라겐의 구조 및 기능에 대한 이해가 매우 제한적이다.
본 발명자는 다년간 콜라겐의 구조 및 기능을 심도 있게 연구하였다. 특히, 세계 최초로, 본 발명자는 인간 콜라겐의 다중 분절들(multiple segments)의 새로운 원자 구조를 분석했고, 대중에게 공개를 위해 국제 단백질 구조 데이터베이스에 게시하고, 풍부한 연구 경험을 축적했다. 반복된 탐구를 통해, 본 발명자는 17형 콜라겐의 여러 세포 외 기능 부위의 재조합 발현을 성공적으로 달성했으며, 이는 우수한 생체물질 특성을 갖고, 이의 제조 방법은 간단하고 생산 확장하기에 쉽고, 의약 및 화장품 산업과 같은 분야에서 널리 사용될 수 있음을 발견했다.
본 발명은 부분적으로 하기 발견들에 기초한다:
본 발명의 폴리펩티드 C17A3, C17B3 및 C17C1은 기존 인간 콜라겐과 비교하여 필적하거나 더 높은 세포 부착 효과를 가지고, 폴리펩티드 C17A3, C17B3 및 C17C1은 숙주 세포에서 발현된 후 수용성 형태로 존재하고, 제조 방법이 간단하고, 생산 확장하기에 쉽다.
배경 기술에서 나타낸 선행 기술의 단점에 대해, 본 발명은 하기를 제공한다:
항목 1. 서열 번호 9의 63개 내지 1496개의 연속적인 아미노산 잔기들을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 세포 부착 활성을 갖는, 폴리펩티드.
항목 2. 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 (A)m으로 나타낸 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지며, 각각의 A는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로부터 선택되거나, 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3 중 어느 하나에서 1개 이상, 예컨대, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기들이 치환, 부가, 또는 결실된 아미노산 서열이거나, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열과 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 서열 동일성을 갖는 서열이되; m은 1 내지 10의 정수이고, 각각의 A는 동일하거나 상이하고, 인접한 2개의 A들은 펩티드 결합으로 연결되거나 1개 이상의 아미노산 잔기로 연결되고; 상기 폴리펩티드는 세포 부착 활성을 갖는, 폴리펩티드. 본 명세서에 기재된 간격은 종점을 포함하는데, 예를 들면, 1 내지 10은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10을 포함하며, 즉, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.
항목 3. 제1 항목 또는 제2 항목에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
항목 4. 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항목에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5, 서열 번호 7, 또는 서열 번호 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오티드로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
항목 5. 제4 항목에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
항목 6. 제5 항목에 기재된 발현 벡터를 포함하거나 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항목에 기재된 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 대장균(E. coli) 세포인, 숙주 세포.
항목 7. 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항목에 기재된 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
(1) 생산 배지에서 제6 항목에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계;
(2) 상기 숙주 세포로부터 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항목에 기재된 폴리펩티드를 분리(isolating)하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 8. 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항목에 기재된 폴리펩티드 또는 제7 항목의 방법에 따라 제조된 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
항목 9. 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항목에 기재된 폴리펩티드 또는 제7 항목의 방법에 따라 제조된 폴리펩티드 또는 제8 항목에 기재된 조성물을 포함하는 물품으로서, 상기 물품은 약제학적 조성물, 의료 기기, 조직 엔지니어링 제품, 화장품, 또는 건강 제품(health product)이고, 바람직하게는 상기 약제학적 조성물은 국소 제제(topical preparation), 바람직하게는 국소 도말 제제(topical smear preparation), 예컨대, 국소 겔 또는 국소 침윤 제제(topical infiltration preparation)이고; 바람직하게는 상기 국소 겔은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하고, 상기 국소 침윤 제제는 멸균 의료용 코튼 볼(sterile medical cotton balls)을 더 포함하는 것인, 물품.
항목 10. 물품, 바람직하게는 의료 기기, 조직 엔지니어링 제품, 화장품, 및 건강 제품의 제조에 있어 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항목에 기재된 폴리펩티드, 제4 항목의 폴리뉴클레오티드, 제5 항목의 발현 벡터, 제6 항목의 숙주 세포, 또는 제8 항목의 조성물의 용도.
선행 기술과 비교하여, 본 발명은 하기 특징들을 가진다:
(1) 본 발명에서 최초로 선택된 17형 인간 콜라겐 서열은 장기간 스크리닝에 최적화된 서열이고;
(2) 대규모 증폭에 적합한 E. coli 발현 시스템이 사용되고, 1회 발효가 20시간 내에 완료될 수 있다. 생산 비용이 매우 낮다. 유전자 서열에 대한 E. coli의 코돈 최적화 및 2xYT 배지의 선택으로 인해, 생산량이 매우 높고;
(3) 생산된 재조합 인간-유래 콜라겐은 매우 우수한 친수성 및 안정성을 갖고, 이의 아미노산 조성은 천연 콜라겐 아미노산 서열의 대응하는 부분과 100% 동일하다. 이는 인체에 적용시 면역 거부 및 알레르기 반응을 일으키지 않을 것이고, 생물의약 및 화장품 산업에 널리 사용될 수 있다.
(4) 본 발명의 제품은 활성 검출을 거치고 인체 내 천연 단백질의 생물학적 활성에 도달하거나 이를 능가할 수 있는 생물학적 활성을 가지며, 인체 내에서 천연 단백질의 기능을 발휘하여 실제 제품 사용 목적을 달성할 수 있고;
(5) 본 발명의 기술적 설계는 인체 내에서 사용될 때 콜라겐의 응고 위험을 효과적으로 감소시키면서, 콜라겐의 높은 세포 부착 활성을 유지할 수 있고, 광범위한 조직 엔지니어링응용 전망을 갖는다.
도 1은 본 발명의 벡터 pET32a-C17A3, pET32a-C17B3, 및 PET32a-C17C1에 의해 제작된 플라스미드 프로파일이다.
도 2는 본 발명의 Trx-C17A3 단백질의 발현 및 정제 후 얻어진 단백질 전기영동 다이어그램이며; 전기영동에 의해 검출된 Trx-C17A3 단백질의 분자량은 약 42kDa이다.
도 3은 본 발명의 Trx-C17B3 단백질의 발현 및 정제 후 얻어진 단백질 전기영동 다이어그램이며, 전기영동에 의해 검출된 Trx-C17B3 단백질의 분자량은 약 40kDa이다.
도 4는 본 발명의 Trx-C17C1 단백질의 발현 및 정제 후 얻어진 단백질 전기영동 다이어그램이며; 전기영동에 의해 검출된 Trx-C17C1 단백질의 분자량은 약 32kDa이다.
도 5는 Trx-C17A3 단백질의 발현 후 효소 분해(restriction digestion)로 Trx 태그를 제거하고 이온 교환 정제를 통해 얻어진 표적 단백질 C17A3 단백질의 전기영동 다이어그램이며; 전기영동에 의해 검출된 C17A3 단백질의 분자량은 약 25kDa이고, 이는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대응한다.
도 6은 Trx-C17B3 단백질의 발현 후 효소 분해로 Trx 태그를 제거하고 이온 교환 정제를 통해 얻어진 표적 단백질 C17B3 단백질의 전기영동 다이어그램이며; 전기영동에 의해 검출된 C17B3 단백질의 분자량은 약 23kDa이고, 이는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대응한다.
도 7은 Trx-C17C1 단백질의 발현 후 효소 분해로 Trx 태그를 제거하고 이온 교환 정제를 통해 얻어진 표적 단백질 C17C1의 전기영동 다이어그램이며; 전기영동에 의해 검출된 C17C1 단백질의 분자량은 약 16kDa이고, 이는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대응한다.
도 8은 C17A1 단백질(서열 번호 1) 및 인간 콜라겐과 비교한, 본 발명의 C17A3 단백질의 생물학적 활성 검출 결과를 보여준다.
도 9는 C17B1 단백질(서열 번호 2) 및 인간 콜라겐과 비교한, 본 발명의 C17B3 단백질의 생물학적 활성 검출 결과를 보여준다.
도 10은 인간 콜라겐과 비교한, 본 발명의 C17C1 단백질의 생물학적 활성 검출 결과를 보여준다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 추가 설명이 하기에 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 "의료 기기(medical devices)"는 인체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 사용되는 기구, 장치, 기기, 시험관 내 진단 시약 및 교정기(calibrator), 물질, 및 기타 유사하거나 관련된 품목을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "조직 엔지니어링 제품(tissue engineering products)"는 조직 엔지니어링에 사용되는 제품을 지칭한다. 조직 엔지니어링은 세포 생물학 및 재료 과학을 결합하여 시험관 내 또는 생체 내(in vivo)에서 조직 또는 기관을 제작하는 새로운 학문이다.
본 명세서에서 사용되는 "분리(isolation)"는 배양된 숙주 세포로부터 표적 폴리펩티드를 분리하는 것, 예를 들면, 숙주 세포를 파괴(disrupt)하고 표적 폴리펩티드를 정제하는 것을 지칭한다. 정제된 표적 폴리펩티드가 정제 태그, 예컨대 Trx 또는 His 태그를 갖는 경우, "분리"는 또한 효소 분해에 의해 Trx 또는 His 태그를 제거하는 것을 포함한다.
"약제학적으로 허용 가능한 담체(Pharmaceutically acceptable carriers)"는 당업계에 익히 공지되어 있고, 당업자는 본 발명의 조성물 또는 물품에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 선택할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예컨대, 인산, 시트르산 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실 디메틸 벤질 염화 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄; 염화 벤제토늄; 페놀, 부탄올 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 파라벤 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르신; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기들) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 고분자, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
본 발명에서, 인간 17형 콜라겐 COL17A1의 서열은 스크리닝 및 최적화를 위해 선택된다. 인간 콜라겐 17형의 서열은 NCBI 참조 서열: Q9UMD9.3 (서열 번호 9)이며, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q9UMD9.3를 참조한다.
MDVTKKNKRDGTEVTERIVTETVTTRLTSLPPKGGTSNGYAKTASLGGGSRLEKQSLTHGSSGYINSTGSTRGHASTSSYRRAHSPASTLPNSPGSTFERKTHVTRHAYEGSSSGNSSPEYPRKEFASSSTRGRSQTRESEIRVRLQSASPSTRWTELDDVKRLLKGSRSASVSPTRNSSNTLPIPKKGTVETKIVTASSQSVSGTYDATILDANLPSHVWSSTLPAGSSMGTYHNNMTTQSSSLLNTNAYSAGSVFGVPNNMASCSPTLHPGLSTSSSVFGMQNNLAPSLTTLSHGTTTTSTAYGVKKNMPQSPAAVNTGVSTSAACTTSVQSDDLLHKDCKFLILEKDNTPAKKEMELLIMTKDSGKVFTASPASIAATSFSEDTLKKEKQAAYNADSGLKAEANGDLKTVSTKGKTTTADIHSYGSSGGGGSGGGGGVGGAGGGPWGPAPAWCPCGSCCSWWKWLLGLLLTWLLLLGLLFGLIALAEEVRKLKARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQEELWMFVRKKLMMEQENGNLR GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA GPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPV GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA GPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRGPPGEGLPGPPGPPGSFLSNSETFLSGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSTSGSSSFGLNLQGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPSGPSEGGSSSTMYVSGPPGPPGPPGPPGSISSSGQEIQQYISEYMQSDSIRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTITGETFDYSELASHVVSYLRTSGYGVSLFSSSISSEDILAVLQRDDVRQYLRQYLMGPRGPPGPPGASGDGSLLSLDYAELSSRILSYMSSSGISIGLPGPPGPPGLPGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDLSSYLHTAGLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRSFIVGPPGPPGPQGPPGDSRLLSTDASHSRGSSSSSHSSSVRRGSSYSSSMSTGGGGAGSLGAGGAFGEAAGDRGPYGTDIGPGGGYGAAAEGGMYAGNGGLL GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ VYAGRRRRRSIAVKP(서열 번호 9)
상기 기재된 서열에서 굵은 밑줄친 부분은 본 발명에서 선택된 아미노산 서열이다. 본 출원인은 많은 연구를 통해 상기 선택된 서열은 강한 수용성, 높은 재조합 발현율, 간단한 정제 과정을 가지고, 상용 인간 콜라겐 또는 서열 번호 9에서의 다른 서열보다 우수한 세포 부착을 달성하고, 다양한 뛰어난 생물학적 물질 특성을 가지는 것을 발견했다. 본 발명에서 폴리펩티드는 서열 번호 9의 전장 서열이 아니다.
본 발명은 부분적으로 하기 발견에 기초한다: 서열 번호 9의 적어도 63개의 연속적 아미노산 잔기들을 포함하는 폴리펩티드는 실시예에서 나타낸 것과 같이, 상용 콜라겐보다 우수한 생체물질 특성들을 가질 수 있다. 당업자는 재조합 콜라겐을 구성하는 연속적인 아미노산 잔기들을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 연속적인 아미노산 잔기들의 길이는 특히 48-100, 50-72, 54-57 및 48-72일 수 있다.
본 발명에서, 여러 특정 아미노산 부위의 서열들이 검출된다:
(1)C17A:GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA (서열 번호 1)；
(2)C17B:GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA (서열 번호 2)；
(3)C17C:GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ (서열 번호 3)；
본 명세서의 폴리펩티드는 삼중 반복 서열인 재조합 인간-유래 콜라겐 C17A3일 수 있고, 207개의 아미노산들을 포함하고, 기본 반복 단위는: GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA (서열 번호 1)이며, 이는 인간 콜라겐 17형 펩티드 단편이다.
C17A3의 아미노산 서열은 하기와 같다:
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA (서열 번호 4).
C17A3의 DNA 서열은 하기와 같다:
GGTAGCCCAGGTCCAAAAGGTGATATGGGAAGCCCAGGTCCGAAAGGTGATCGTGGTTTTCCGGGTACACCAGGTATTCCGGGTCCACTGGGTCATCCAGGTCCGCAAGGTCCGAAAGGCCAGAAAGGTAGCGTGGGTGATCCGGGTATGGAAGGGCCTATGGGGCAGCGTGGGCGTGAAGGGCCGATGGGTCCGCGTGGTGAAGCAGGTAGCCCGGGGCCTAAAGGGGATATGGGGAGTCCGGGTCCGAAAGGGGATCGTGGATTTCCGGGTACGCCGGGTATCCCGGGTCCGCTGGGTCATCCGGGTCCGCAAGGGCCTAAAGGTCAGAAAGGTAGTGTGGGTGATCCTGGTATGGAAGGTCCGATGGGTCAGCGTGGTCGTGAGGGTCCGATGGGACCGCGTGGTGAGGCTGGTAGCCCTGGTCCGAAAGGAGATATGGGTAGCCCGGGTCCGAAAGGTGACCGTGGTTTTCCTGGTACACCGGGTATTCCAGGGCCTCTGGGTCATCCTGGTCCTCAGGGTCCGAAAGGTCAGAAAGGGAGTGTGGGAGATCCGGGTATGGAGGGTCCGATGGGGCAGCGCGGTCGTGAAGGTCCGATGGGCCCGCGTGGTGAAGCC (서열 번호 5).
본 명세서의 폴리펩티드는 C17B의 삼중 반복 서열인 인간-유래 콜라겐일 수 있고, 189개의 아미노산 서열들을 포함하고, 기본 반복 단위는:
GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA (서열 번호 2)이며, 이는 인간 콜라겐 17형 펩티드 단편이다.
C17B3의 아미노산 서열은 하기와 같다:
GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA (서열 번호 6).
C17B3의 DNA 서열은 하기와 같다:
GGTCTGCAGGGTCTGCGTGGTGAAGTAGGACTGCCGGGTGTGAAAGGAGATAAAGGACCAATGGGTCCACCAGGACCAAAAGGAGATCAAGGAGAAAAAGGACCACGTGGTCTGACAGGTGAACCGGGTATGCGTGGGCTGCCGGGAGCAGTTGGAGAACCGGGAGCAAAAGGAGCAATGGGTCCAGCAGGACTGCAGGGTCTGCGCGGTGAAGTGGGACTGCCTGGTGTTAAAGGGGATAAAGGGCCGATGGGTCCGCCGGGTCCGAAAGGAGATCAGGGAGAAAAAGGGCCGCGTGGTCTGACCGGTGAACCGGGAATGCGTGGTCTGCCGGGGGCTGTGGGTGAGCCAGGTGCAAAAGGTGCAATGGGTCCTGCAGGTCTGCAAGGACTGCGTGGAGAAGTGGGTCTGCCTGGTGTGAAAGGTGATAAAGGTCCGATGGGTCCTCCGGGTCCGAAAGGTGATCAGGGTGAAAAAGGTCCGCGTGGTCTGACGGGTGAACCGGGCATGCGTGGTCTGCCTGGGGCAGTTGGTGAACCGGGGGCAAAAGGTGCTATGGGGCCGGCA (서열 번호 7).
본 명세서의 폴리펩티드는 C17C의 반복 서열인 재조합 인간-유래 콜라겐 C17C1일 수 있고, 119개의 아미노산들을 포함하고, 기본 반복 단위는: GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ (서열 번호 3)이며, 이는 인간 콜라겐 17형 펩티드이다.
C17C1의 아미노산 서열은 하기와 같다:
GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ (서열 번호 3).
C17C1의 DNA 서열은 하기와 같다:
GGTGCAGATTTTGCAGGTGATCTGGATTATAATGAACTGGCAGTTCGTGTTAGCGAAAGCATGCAGCGTCAGGGACTGCTGCAGGGAATGGCATATACCGTTCAGGGTCCGCCGGGTCAGCCGGGTCCTCAAGGTCCTCCTGGTATTAGCAAAGTTTTTAGTGCATATTCAAACGTGACGGCAGATCTGATGGATTTTTTTCAGACGTATGGTGCAATTCAGGGTCCTCCTGGGCAAAAAGGTGAAATGGGTACACCTGGTCCGAAAGGCGATCGTGGTCCGGCCGGTCCGCCGGGCCACCCTGGTCCTCCTGGCCCTCGTGGTCATAAAGGTGAGAAAGGTGATAAAGGTGATCAA (서열 번호 8).
본 명세서에서, 상기 폴리펩티드는 1개 이상, 바람직하게는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기들이 치환, 부가, 결실 또는 삽입된, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열과 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열의 동일성 퍼센트(percentage identity of amino acid sequence)"는 후보 서열이 참조 폴리펩티드 서열과 정렬될 때 서열 동일성의 최대 퍼센트를 얻기 위해 필요한 경우 갭(gap)을 도입한 후, 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기들의 퍼센트로 정의되며, 이때 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려되지 않는다. 아미노산 서열들의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 사용되는 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계에 공지된 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수들을 결정할 수 있다.
아미노산 부가는 폴리펩티드가 콜라겐 특징 및 세포 부착 활성을 갖는 조건하에, 아미노산 서열, 예컨대, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 9 중 어느 하나의 서열의 C- 또는 N-말단에 아미노산을 부가하는 것을 의미한다.
아미노산 치환은 폴리펩티드가 콜라겐 특징 및 세포 부착 활성을 갖는 조건하에, 아미노산 서열, 예컨대, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 9 중 어느 하나의 서열에서 특정 위치의 특정 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미한다.
아미노산 삽입은 폴리펩티드가 콜라겐 특징 및 세포 부착 활성을 갖는 조건하에, 아미노산 서열, 예컨대, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 9의 어느 하나의 서열의 적절한 위치에 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 의미한다. 삽입된 아미노산 잔기들은 전체적으로 또는 부분적으로 서로 인접하거나, 삽입된 아미노산들 중 어느 것도 서로 인접하지 않을 수 있다.
아미노산 결실은 폴리펩티드가 콜라겐 특징 및 세포 부착 활성을 갖는 조건하에, 아미노산 서열, 예컨대, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 9 중 어느 하나의 서열로부터 1개, 2개 또는 3개 이상의 아미노산들을 결실시키는 것을 의미한다.
본 발명에서, 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있으며, 이는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 9 중 어느 하나와 비교하여, 3개, 더욱 바람직하게는 2개 또는 1개의 아미노산이 유사하거나 필적하는 특성들을 갖는 아미노산으로 대체되어 펩티드를 형성하는 것을 의미한다. 이 보존적 변이체 펩티드는 표 1에 따라 아미노산 치환을 수행함으로써 생성될 수 있다.
[표 1] 아미노산의 보존적 치환
Figure pct00001
본 명세서의 폴리펩티드 서열에서 모든 아미노산들은 L형 아미노산일 수 있고, 폴리펩티드의 생체이용률, 안정성, 및/또는 항바이러스 활성을 개선하기 위해 1개 이상(예컨대, 2개 내지 5개, 2개 내지 4개 또는 2개 내지 3개)의 아미노산은 또한 D형 형태를 갖는 아미노산, 인공적으로 변형된 아미노산, 및 자연에 존재하는 희귀 아미노산으로 대체될 수 있다. 그 중에서, D형 아미노산은 단백질을 구성하는 L형 아미노산에 대응하는 아미노산을 지칭하고; 인공적으로 변형된 아미노산은 메틸화, 인산화 등에 의해 변형된, 단백질을 구성하는 일반적인 L형 아미노산이고; 자연에 존재하는 희귀 아미노산은 단백질을 구성하는 일반적이지 않은 아미노산, 및 단백질을 구성하지 않는 아미노산을 포함하며, 예컨대, 5-하이드록실라이신, 메틸히스티딘, γ 아미노부티르산, 호모세린 등이 있다.
본 발명에서, 인간-유래 콜라겐을 재조합하는 것은 당업계의 기존 방법들에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 이는 하기 단계들로 생산될 수 있다: (1) E. coli 유전자 조작 박테리아를 제작하는 단계; (2) E. coli 유전자 조작 박테리아를 발효 배양하는 단계; (3) 재조합 인간-유래 콜라겐을 유도 및 발현하는 단계; 및 (4) 재조합 인간-유래 콜라겐을 정제하고 임의적으로 효소 분해하는 단계.
단계 (1)에서, E. coli 유전자 조작 박테리아 제작은 하기와 같이 수행될 수 있다: (1) PCR 방법에 의해 인간-유래 17형 콜라겐의 유전자 나선 부위에서 코돈 최적화하고 DNA 단편을 스플라이싱 재조합하여 최종적으로 표적 유전자 단편을 얻는 단계; (2) 얻어진 표적 유전자 단편을 PET-32a 발현 벡터 내에 삽입하여 재조합 발현 플라스미드를 얻는 단계; (3) 재조합 발현 플라스미드를 E. coli 컴피턴트 세포 BL21 (DE3) 내에 형질전환시키고, 스크리닝하여 E. coli의 양성 유전자 조작 박테리아를 얻는 단계.
단계 (2) 및 (3)에서, E. coli 유전자 조작 박테리아를 발효 배양하는 단계 및 재조합 인간-유래 콜라겐을 유도 및 발현하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다: (1) LAB 플레이트에서 E. coli 유전자 조작 박테리아의 최적화된 단일 콜로니를 선택하고, 이를 10ml의 LB 배지에 배치하고 12 내지 16시간 동안 37℃, 220 rpm에서 배양한다; (2) 1:100의 비로 접종된 2xYT 배지 내에서 상기 박테리아 용액을 증폭 배양하고 약 3시간 동안 37℃에서 배양한다. OD600이 0.4 내지 0.6일 때, 유도를 위해 최종 농도 0.5mM의 IPTG를 첨가하고, 추가 20시간 동안 16℃에서 배양하고, 원심분리에 의해 박테리아를 수집한다.
단계 (4)에서, 재조합 인간-유래 콜라겐 폴리펩티드를 정제하고 효소 분해하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다: (1) 인산 완충액(40mM NaH2PO3, 500mM NaCl, pH 7.8) 중 박테리아를 재현탁하고, 초음파로 파쇄(disrupting)하고, 원심분리에 의해 상층액을 수집한다; (2) Ni-NTA 친화성 컬럼을 사용하여 재조합 인간-유래 콜라겐을 결합시키고, 10mM 이미다졸로 불순물 단백질(impure protein)을 세척한 다음, Tev 프로테아제 (Tobacco Etch Virus 효소)를 첨가하고, 16시간 동안 4℃에서 컬럼에서 분해하고, 최종적으로 표적 콜라겐 폴리펩티드를 얻는다.
숙주 세포는 진균 및 효모와 같은 진핵생물 세포, 또는 장내세균, 예컨대, 대장균과 같은 원핵생물 세포일 수 있다. 당업자는 숙주 세포로서 상기 언급된 E. coli 균주를 다른 발현 균주로 대체할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 당업자는 본 실시예는 단지 예시적이고 제한적이지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.
실시예 1: 재조합 인간-유래 콜라겐 폴리펩티드의 제작, 발현 및 정제
C17A3 유전자 발현 벡터의 제작 및 발현
1. 실시예 1에서 사용되는 인간-유래 콜라겐 C17A3의 전장 유전자 서열은 서열 번호 5에 나타난다. 이 서열은 E. coli의 코돈에 대해 코돈 최적화되었다.
2. C17A3 유전자의 전체 길이는 621bp이다. 최적화된 C17A3 코돈 유전자 서열인 서열 번호 5에 따라, 유전자 단편을 합성하기 위해 Beijing Shengyuan Kemeng Gene Biotechnology Co., Ltd.에 위탁했고, 합성된 C17A3 유전자 단편을 Tev 프로테아제 제한 자리에 연결한 후, Kpn I 및 Xho I 제한 자리를 통해 유전자 단편을 PET32a 발현 벡터(Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences 제공)에 삽입했다. 성공적으로 제작된 발현 플라스미드를 E. coli 컴피턴트 세포 BL21 (DE3) (Merck Company) 내에 형질전환시켰다. 구체적인 과정은 하기와 같다: 1: 1μl의 플라스미드를 100μl의 E. coli 컴피턴트 세포 BL21 (DE3)에 가하고, 30분 동안 얼음 상에서 방치했다. 2: 혼합물에 90s 동안 42℃ 워터 배쓰(water bath)에서 열 충격을 가한 다음, 빠르게 얼음 상에 배치하고 2분 동안 방치했다. 3: 600μl의 비내성 LB를 혼합물에 첨가하고 37℃, 220 rpm에서 1시간 동안 배양했다. 4: 200μl의 박테리아 용액을 취해 앰피실린 내성-함유 LB 플레이트 (10g/L 펩톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L 염화나트륨, 15g/L 아가(agar), 100μg/ml 앰피실린 항생제) 상에 균일하게 도포했다. 5: 명확하게 보이는 콜로니가 자랄 때까지 약 20h 동안 37℃ 인큐베이터에서 플레이트를 뒤집어서 배양했다.
3. 형질전환된 LB 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고 이를 12h-16h 동안 10ml LB (100μg/ml 앰피실린 항생제 함유) 배지에서 배양한 다음, 이를 증폭 배양을 위해 1:100의 비로 2xYT 배지(16g/L 펩톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L 염화나트륨)에 옮기고, 박테리아 용액의 OD600이 0.4 내지 0.6일 때까지 37℃, 220 rpm에서 배양하고, 발현을 유도하기 위해 최종 농도 0.5mM의 IPTG(Sigma Company, Cat. No.: I5502-1G)를 첨가했다. 유도 조건은 20h 동안 18℃, 180rpm에서의 배양이다. 최종적으로, 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 -20℃에서 저장하거나 즉시 다음 단계인 정제로 진행했다.
4. 약 50ml의 인산 완충액 (pH 7.8) (40mM 인산이수소나트륨), 500mM 염화나트륨)을 사용하여 박테리아 침전물을 재현탁시키고 (1L), 고압 박테리아 파쇄 기기(SCIENTZ BIO)를 사용하여 박테리아를 파쇄하고 30분 동안 13000rpm에서 원심분리하여 봉입체(inclusion bodies)로부터 가용성 단백질을 완전히 분리했다.
5. Ni-NTA (Qiagen company, Cat. No.: 30210) 친화성 컬럼을 5 컬럼 부피의 결합 완충액 (40mM NaH2PO3, 500mM NaCl, pH 7.8)으로 평형화했다. 이어서, 단백질 상층액을 첨가하고 0.5 내지 1h 동안 4℃에서 인큐베이팅하여 표적 재조합 단백질이 컬럼 물질에 완전히 결합하도록 하였다. 이어서, 불순물 단백질을 10 mM 이미다졸을 함유하는 200 ml의 세척 완충액(10 mM 이미다졸, 40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8) (Sigma Company)으로 세척했다. Trx-태그된 표적 단백질이 필요한 경우, 용출 완충액 (250mM 이미다졸, 40mM NaH2PO3, 500mM NaCl, pH 7.8)을 사용하여 표적 단백질 Trx-C17A3을 직접 용출할 수 있다. Trx-태그된 표적 단백질이 제거될 필요가 있는 경우, 적절한 양의 His 태그를 갖는 TEV 프로테아제를 첨가할 수 있다. 16h 동안 4℃에서 인큐베이팅한 후, 담체 단백질 Trx가 제거된 표적 콜라겐 C17A3인 통과액(flow-through fluid)을 수집했다.
6. 표적 단백질의 신속한 정제를 위해 음이온 교환 컬럼을 사용할 수 있다. 표적 단백질을 완충액 A (20mM Tris, 15mM NaCl, pH 8.0)에 투석하고, 이를 음이온 교환 컬럼 Hitrap Q (GE Healthcare)에 통과시키고, 완충액 B (20mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0)로 구배 용출(gradient eluting)하고, 상이한 용출 분획들을 수집하여 단백질을 검출했다. 얻어진 표적 단백질 생성물을 밤새 투석하고, 추후 사용을 위해 건조 분말로 동결건조하였다.
7. 얻어진 C17A3 단백질의 분자량 및 순도를 SDS-PAGE에 의해 검출하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다: 40μl의 정제된 단백질 용액을 취하고, 10μl의 5Х단백질 로딩 완충액 (250mM Tris-HCl (pH: 6.8), 10% SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤, 5% β-머캅토에탄올)을 첨가하고, 10분 동안 100℃ 끓는물에서 가열한 다음, SDS-PAGE 단백질 겔에 웰당 10μl를 첨가하고, 2h 동안 80V에서 구동하고, 20분 동안 Coomassie Brilliant Blue 염색 용액 (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 25% 이소프로판올, 10% 빙초산(acetic acid glacial))으로 단백질을 염색한 다음, 탈색을 위해 단백질 탈색 용액 (10% 아세트산, 5% 에탄올)을 사용했다. 최종적으로, 인간 천연 콜라겐과 비교하여 단백질 활성을 측정했다.
C17B3 유전자 발현 벡터의 제작 및 발현
1. 실시예 2에서 사용되는 인간-유래 콜라겐 C17B3의 전장 유전자 서열은 서열 번호 7에 나타난다. 이 서열은 E. coli의 코돈에 대해 코돈 최적화되었다.
2. C17A3 유전자의 전체 길이는 567bp이다. 최적화된 C17B3 코돈 유전자 서열인 서열 번호 7에 따라, 유전자 단편을 합성하기 위해 Beijing Shengyuan Kemeng Gene Biotechnology Co., Ltd.에 위탁했고, 합성된 C17B3 유전자 단편을 Tev 프로테아제 제한 자리에 연결한 후, Kpn I 및 Xho I 제한 자리를 통해 유전자 단편을 PET32a 발현 벡터(Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences 제공)에 삽입했다. 성공적으로 제작된 발현 플라스미드를 E. coli 컴피턴트 세포 BL21 (DE3) (Merck Company) 내에 형질전환시켰다. 구체적인 과정은 하기와 같다: 1: 1μl의 플라스미드를 100μl의 E. coli 컴피턴트 세포 BL21 (DE3)에 가하고, 30분 동안 얼음 상에서 방치했다. 2: 혼합물에 90s 동안 42℃ 워터 배쓰에서 열 충격을 가한 다음, 빠르게 얼음 상에 배치하고 2분 동안 방치했다. 3: 600μl의 비내성 LB를 혼합물에 첨가하고 37℃, 220 rpm에서 1시간 동안 배양했다. 4: 200μl의 박테리아 용액을 취해 앰피실린 내성-함유 LB 플레이트 (10g/L 펩톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L 염화나트륨, 15g/L 아가, 100μg/ml 앰피실린 항생제) 상에 균일하게 도포했다. 5: 명확하게 보이는 콜로니가 자랄 때까지 약 20h 동안 37℃ 인큐베이터에서 플레이트를 뒤집어서 배양했다.
3. 형질전환된 LB 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고 이를 12h-16h 동안 10ml LB (100μg/ml 앰피실린 항생제 함유) 배지에서 배양한 다음, 이를 증폭 배양을 위해 1:100의 비로 2xYT 배지(16g/L 펩톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L 염화나트륨)에 옮기고, 박테리아 용액의 OD600이 0.4 내지 0.6일 때까지 37℃, 220 rpm에서 배양하고, 발현을 유도하기 위해 최종 농도 0.5mM의 IPTG(Sigma Company, Cat. No.: I5502-1G)를 첨가했다. 유도 조건은 20h 동안 18℃, 180rpm에서의 배양이다. 최종적으로, 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 -20℃에서 저장하거나 즉시 다음 단계인 정제로 진행했다.
4. 약 50ml의 인산 완충액 (pH 7.8) (40mM 인산이수소나트륨), 500mM 염화나트륨)을 사용하여 박테리아 침전물을 재현탁시키고 (1L), 고압 박테리아 파쇄 기기(SCIENTZ BIO)를 사용하여 박테리아를 파쇄하고 30분 동안 13000rpm에서 원심분리하여 봉입체로부터 가용성 단백질을 완전히 분리했다.
5. Ni-NTA (Qiagen company, Cat. No.: 30210) 친화성 컬럼을 5 컬럼 부피의 결합 완충액 (40mM NaH2PO3, 500mM NaCl, pH 7.8)으로 평형화했다. 이어서, 단백질 상층액을 첨가하고 0.5 내지 1h 동안 4℃에서 인큐베이팅하여 표적 재조합 단백질이 컬럼 물질에 완전히 결합하도록 하였다. 이어서, 불순물 단백질을 10 mM 이미다졸을 함유하는 200 ml의 세척 완충액(10 mM 이미다졸, 40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8) (Sigma Company)으로 세척했다. Trx-태그된 표적 단백질이 필요한 경우, 용출 완충액 (250mM 이미다졸, 40mM NaH2PO3, 500mM NaCl, pH 7.8)을 사용하여 표적 단백질 Trx-C17B3을 직접 용출할 수 있다. Trx-태그된 표적 단백질이 제거될 필요가 있는 경우, 적절한 양의 His 태그를 갖는 TEV 프로테아제를 첨가할 수 있다. 16h 동안 4℃에서 인큐베이팅한 후, 담체 단백질 Trx가 제거된 표적 콜라겐 C17B3인 통과액을 수집했다.
6. 표적 단백질의 신속한 정제를 위해 위해 음이온 교환 컬럼을 사용할 수 있다. 표적 단백질을 완충액 A (20mM Tris, 15mM NaCl, pH 8.0)에 투석하고, 이를 음이온 교환 컬럼 Hitrap Q (GE Healthcare)에 통과시키고, 완충액 B (20mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0)로 구배 용출하고, 상이한 용출 분획들을 수집하여 단백질을 검출했다. 얻어진 표적 단백질 생성물을 밤새 투석하고, 추후 사용을 위해 건조 분말로 동결건조하였다.
7. 얻어진 C17B3 단백질의 분자량 및 순도를 SDS-PAGE에 의해 검출하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다: 40μl의 정제된 단백질 용액을 취하고, 10μl의 5Х단백질 로딩 완충액 (250mM Tris-HCl (pH: 6.8), 10% SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤, 5% β-머캅토에탄올)을 첨가하고, 10분 동안 100℃ 끓는물에서 가열한 다음, SDS-PAGE 단백질 겔에 웰당 10μl를 첨가하고, 2h 동안 80V에서 구동하고, 20분 동안 Coomassie Brilliant Blue 염색 용액 (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 25% 이소프로판올, 10% 빙초산)으로 단백질을 염색한 다음, 탈색을 위해 단백질 탈색 용액 (10% 아세트산, 5% 에탄올)을 사용했다. 최종적으로, 인간 천연 콜라겐과 비교하여 단백질 활성을 측정했다.
C17C1 유전자 발현 벡터의 제작 및 발현
1. 실시예 2에서 사용되는 인간-유래 콜라겐 C17C1의 전장 유전자 서열은 서열 번호 8에 나타난다. 이 서열은 E. coli의 코돈에 대해 코돈 최적화되었다.
2. C17C1 유전자의 전체 길이는 357bp이다. 최적화된 C17C1 코돈 유전자 서열인 서열 번호 8에 따라, 유전자 단편을 합성하기 위해 Beijing Shengyuan Kemeng Gene Biotechnology Co., Ltd.에 위탁했고, 합성된 C17C1 유전자 단편을 Tev 프로테아제 제한 자리에 연결한 후, Kpn I 및 Xho I 제한 자리를 통해 유전자 단편을 PET32a 발현 벡터(Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences 제공)에 삽입했다. 성공적으로 제작된 발현 플라스미드를 E. coli 컴피턴트 세포 BL21 (DE3) (Merck Company) 내에 형질전환시켰다. 구체적인 과정은 하기와 같다: 1: 1μl의 플라스미드를 100μl의 E. coli 컴피턴트 세포 BL21 (DE3)에 가하고, 30분 동안 얼음 상에서 방치했다. 2: 혼합물에 90s 동안 42℃ 워터 배쓰에서 열 충격을 가한 다음, 빠르게 얼음 상에 배치하고 2분 동안 방치했다. 3: 600μl의 비내성 LB를 혼합물에 첨가하고 37℃, 220 rpm에서 1시간 동안 배양했다. 4: 200μl의 박테리아 용액을 취해 앰피실린 내성-함유 LB 플레이트 (10g/L 펩톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L 염화나트륨, 15g/L 아가, 100μg/ml 앰피실린 항생제) 상에 균일하게 도포했다. 5: 명확하게 보이는 콜로니가 자랄 때까지 약 20h 동안 37℃ 인큐베이터에서 플레이트를 뒤집어서 배양했다.
3. 형질전환된 LB 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고 이를 12h-16h 동안 10ml LB (100μg/ml 앰피실린 항생제 함유) 배지에서 배양한 다음, 이를 증폭 배양을 위해 1:100의 비로 2xYT 배지(16g/L 펩톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L 염화나트륨)에 옮기고, 박테리아 용액의 OD600이 0.4 내지 0.6일 때까지 37℃, 220 rpm에서 배양하고, 발현을 유도하기 위해 최종 농도 0.5mM의 IPTG(Sigma Company, Cat. No.: I5502-1G)를 첨가했다. 유도 조건은 20h 동안 18℃, 180rpm에서의 배양이다. 최종적으로, 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 -20℃에서 저장하거나 즉시 다음 단계인 정제로 진행했다.
4. 약 50ml의 인산 완충액 (pH 7.8) (40mM 인산이수소나트륨), 500mM 염화나트륨)을 사용하여 박테리아 침전물을 재현탁시키고 (1L), 고압 박테리아 파쇄 기기(SCIENTZ BIO)를 사용하여 박테리아를 파쇄하고 30분 동안 13000rpm에서 원심분리하여 봉입체로부터 가용성 단백질을 완전히 분리했다.
5. Ni-NTA (Qiagen company, Cat. No.: 30210) 친화성 컬럼을 5 컬럼 부피의 결합 완충액 (40mM NaH2PO3, 500mM NaCl, pH 7.8)으로 평형화했다. 이어서, 단백질 상층액을 첨가하고 0.5 내지 1h 동안 4℃에서 인큐베이팅하여 표적 재조합 단백질이 컬럼 물질에 완전히 결합하도록 하였다. 이어서, 불순물 단백질을 10 mM 이미다졸을 함유하는 200 ml의 세척 완충액(10 mM 이미다졸, 40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8) (Sigma Company)으로 세척했다. Trx-태그된 표적 단백질이 필요한 경우, 용출 완충액 (250mM 이미다졸, 40mM NaH2PO3, 500mM NaCl, pH 7.8)을 사용하여 표적 단백질 Trx-C17C1을 직접 용출할 수 있다. Trx-태그된 표적 단백질이 제거될 필요가 있는 경우, 적절한 양의 His 태그를 갖는 TEV 프로테아제를 첨가할 수 있다. 16h 동안 4℃에서 인큐베이팅한 후, 담체 단백질 Trx가 제거된 표적 콜라겐 C17C1인 통과액을 수집했다.
6. 표적 단백질의 신속한 정제를 위해 음이온 교환 컬럼을 사용할 수 있다. 표적 단백질을 완충액 A (20mM Tris, 15mM NaCl, pH 8.0)에 투석하고, 이를 음이온 교환 컬럼 Hitrap Q (GE Healthcare)에 통과시키고, 완충액 B (20mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0)로 구배 용출하고, 상이한 용출 분획들을 수집하여 단백질을 검출했다. 얻어진 표적 단백질 생성물을 밤새 투석하고, 추후 사용을 위해 건조 분말로 동결건조하였다.
7. 얻어진 C17C1 단백질의 분자량 및 순도를 SDS-PAGE에 의해 검출하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다: 40μl의 정제된 단백질 용액을 취하고, 10μl의 5Х단백질 로딩 완충액 (250mM Tris-HCl (pH: 6.8), 10% SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤, 5% β-머캅토에탄올)을 첨가하고, 10분 동안 100℃ 끓는물에서 가열한 다음, SDS-PAGE 단백질 겔에 웰당 10μl를 첨가하고, 2h 동안 80V에서 구동하고, 20분 동안 Coomassie Brilliant Blue 염색 용액 (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 25% 이소프로판올, 10% 빙초산)으로 단백질을 염색한 다음, 탈색을 위해 단백질 탈색 용액 (10% 아세트산, 5% 에탄올)을 사용했다. 최종적으로, 인간 천연 콜라겐과 비교하여 단백질 활성을 측정했다.
결과
도 2 내지 4의 전기영동 다이어그램은 각각 42kDa, 40kDa 및 32kDa의 겉보기 분자량을 갖는 Trx-C17A3, Trx-C17B3 및 Trx-C17C1 융합 단백질이 얻어진 것을 보여준다.
도 5 내지 7의 전기영동 다이어그램은 25kDa, 23kDa, 및 16kDa의 겉보기 분자량을 갖는 C17A3, C17B3 및 C17C1 융합 단백질이 얻어진 것을 보여준다.
실시예 2: C17A3, C17B3, 및 C17C1 단백질의 세포 부착 활성의 검출
콜라겐 활성의 검출 방법에 대해서는, 문헌 Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens, J Biochem. 136, 643-649 (2004)을 참조한다. 구체적인 구현 방법은 하기와 같다：
1. 인간 콜라겐 대조군(Sigma, C7774), C17A3, C17A1 (서열 번호 1, C17A3과 동일한 방법으로 제조), C17B3, C17B1 (서열 번호 2，C17B3과 동일한 방법으로 제조), 및 C17C1 단백질 샘플을 포함하는 검출될 단백질의 농도를 자외선(UV) 흡수 방법을 사용하여 검출한다. 구체적으로, 215nm 및 225nm에서 UV 흡수를 측정하고, 실험식 C(μg/mL)=144X(A215-A225)으로 단백질 농도를 계산한다. A215<1.5일 때 검출해야 함을 유의해야 한다. 이 방법의 원리는 원자외선(far UV light) 하에서 펩티드 결합의 특징적 흡수를 측정하는 것이며, 이는 크로모포어(chromophore)의 영향을 받지 않고, 간섭 물질이 적고, 조작이 간단하다. 이는 Coomassie Brilliant Blue에 의해 발색되지 않는 인간 콜라겐 및 이의 유사체를 검출하는 것이 적합하다. (참고 문헌: Walker JM. The Protein Protocols Handbook, second edition. Humana Press. 43-45). 단백질 농도를 검출한 후, 모든 검출된 단백질을 PBS로 0.5mg/ml로 조정한다.
2. 100μl의 다양한 단백질 용액 및 PBS 용액 블랭크 대조군을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 이를 60분 동안 실온에서 방치한다.
3. 105개의 잘 배양된 3T3 세포 (Tsinghua University 의 Teacher Tong Pei로부터 입수,)를 각 웰에 첨가하고, 60분 동안 37℃에서 배양한다.
4. 각 웰을 PBS로 4회 세척한다
5. LDH 검출 키트 (Roche, 04744926001)로 OD492nm에서의 흡광도를 검출한다. OD492nm에서의 흡광도는 콜라겐 또는 이의 단편의 세포 부착 활성을 반영할 수 있다. 단백질의 세포 부착 활성이 더 높을 수록, 단기간에 세포에 고품질의 외부 환경을 제공하여, 세포가 벽에 부착할 수 있도록 한다.
결과는 도 8 내지 10을 참조한다. 도 8 내지 10은 3개의 병렬 실험에서 OD492nm의 평균 및 표준 오차를 기반으로 플롯팅되었다.
도 8 내지 10의 결과는 3개의 인간 재조합 콜라겐(즉, C17A3, C17B3, 및 C17C1) 모두 상용 인간 콜라겐과 비교하여 우수한 세포 부착 활성을 가지고 있음을 보여준다.
서열
서열 번호 1 (C17A)
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA
서열 번호 2 (C17B)
GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA
서열 번호 3 (C17C1)
GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ
서열 번호 4 (C17A3)
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA
서열 번호 5 (C17A3-DNA)
GGTAGCCCAGGTCCAAAAGGTGATATGGGAAGCCCAGGTCCGAAAGGTGATCGTGGTTTTCCGGGTACACCAGGTATTCCGGGTCCACTGGGTCATCCAGGTCCGCAAGGTCCGAAAGGCCAGAAAGGTAGCGTGGGTGATCCGGGTATGGAAGGGCCTATGGGGCAGCGTGGGCGTGAAGGGCCGATGGGTCCGCGTGGTGAAGCAGGTAGCCCGGGGCCTAAAGGGGATATGGGGAGTCCGGGTCCGAAAGGGGATCGTGGATTTCCGGGTACGCCGGGTATCCCGGGTCCGCTGGGTCATCCGGGTCCGCAAGGGCCTAAAGGTCAGAAAGGTAGTGTGGGTGATCCTGGTATGGAAGGTCCGATGGGTCAGCGTGGTCGTGAGGGTCCGATGGGACCGCGTGGTGAGGCTGGTAGCCCTGGTCCGAAAGGAGATATGGGTAGCCCGGGTCCGAAAGGTGACCGTGGTTTTCCTGGTACACCGGGTATTCCAGGGCCTCTGGGTCATCCTGGTCCTCAGGGTCCGAAAGGTCAGAAAGGGAGTGTGGGAGATCCGGGTATGGAGGGTCCGATGGGGCAGCGCGGTCGTGAAGGTCCGATGGGCCCGCGTGGTGAAGCC
서열 번호 6 (C17B3)
GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA
서열 번호 7 (C17B3-DNA)
GGTCTGCAGGGTCTGCGTGGTGAAGTAGGACTGCCGGGTGTGAAAGGAGATAAAGGACCAATGGGTCCACCAGGACCAAAAGGAGATCAAGGAGAAAAAGGACCACGTGGTCTGACAGGTGAACCGGGTATGCGTGGGCTGCCGGGAGCAGTTGGAGAACCGGGAGCAAAAGGAGCAATGGGTCCAGCAGGACTGCAGGGTCTGCGCGGTGAAGTGGGACTGCCTGGTGTTAAAGGGGATAAAGGGCCGATGGGTCCGCCGGGTCCGAAAGGAGATCAGGGAGAAAAAGGGCCGCGTGGTCTGACCGGTGAACCGGGAATGCGTGGTCTGCCGGGGGCTGTGGGTGAGCCAGGTGCAAAAGGTGCAATGGGTCCTGCAGGTCTGCAAGGACTGCGTGGAGAAGTGGGTCTGCCTGGTGTGAAAGGTGATAAAGGTCCGATGGGTCCTCCGGGTCCGAAAGGTGATCAGGGTGAAAAAGGTCCGCGTGGTCTGACGGGTGAACCGGGCATGCGTGGTCTGCCTGGGGCAGTTGGTGAACCGGGGGCAAAAGGTGCTATGGGGCCGGCA
서열 번호 8 (C17C1-DNA)
GGTGCAGATTTTGCAGGTGATCTGGATTATAATGAACTGGCAGTTCGTGTTAGCGAAAGCATGCAGCGTCAGGGACTGCTGCAGGGAATGGCATATACCGTTCAGGGTCCGCCGGGTCAGCCGGGTCCTCAAGGTCCTCCTGGTATTAGCAAAGTTTTTAGTGCATATTCAAACGTGACGGCAGATCTGATGGATTTTTTTCAGACGTATGGTGCAATTCAGGGTCCTCCTGGGCAAAAAGGTGAAATGGGTACACCTGGTCCGAAAGGCGATCGTGGTCCGGCCGGTCCGCCGGGCCACCCTGGTCCTCCTGGCCCTCGTGGTCATAAAGGTGAGAAAGGTGATAAAGGTGATCAA
서열 번호 9 (COL17A1)
MDVTKKNKRDGTEVTERIVTETVTTRLTSLPPKGGTSNGYAKTASLGGGSRLEKQSLTHGSSGYINSTGSTRGHASTSSYRRAHSPASTLPNSPGSTFERKTHVTRHAYEGSSSGNSSPEYPRKEFASSSTRGRSQTRESEIRVRLQSASPSTRWTELDDVKRLLKGSRSASVSPTRNSSNTLPIPKKGTVETKIVTASSQSVSGTYDATILDANLPSHVWSSTLPAGSSMGTYHNNMTTQSSSLLNTNAYSAGSVFGVPNNMASCSPTLHPGLSTSSSVFGMQNNLAPSLTTLSHGTTTTSTAYGVKKNMPQSPAAVNTGVSTSAACTTSVQSDDLLHKDCKFLILEKDNTPAKKEMELLIMTKDSGKVFTASPASIAATSFSEDTLKKEKQAAYNADSGLKAEANGDLKTVSTKGKTTTADIHSYGSSGGGGSGGGGGVGGAGGGPWGPAPAWCPCGSCCSWWKWLLGLLLTWLLLLGLLFGLIALAEEVRKLKARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQEELWMFVRKKLMMEQENGNLRGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRGPPGEGLPGPPGPPGSFLSNSETFLSGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSTSGSSSFGLNLQGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPSGPSEGGSSSTMYVSGPPGPPGPPGPPGSISSSGQEIQQYISEYMQSDSIRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTITGETFDYSELASHVVSYLRTSGYGVSLFSSSISSEDILAVLQRDDVRQYLRQYLMGPRGPPGPPGASGDGSLLSLDYAELSSRILSYMSSSGISIGLPGPPGPPGLPGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDLSSYLHTAGLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRSFIVGPPGPPGPQGPPGDSRLLSTDASHSRGSSSSSHSSSVRRGSSYSSSMSTGGGGAGSLGAGGAFGEAAGDRGPYGTDIGPGGGYGAAAEGGMYAGNGGLLGADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQVYAGRRRRRSIAVKP
Sequence Listing <110> SHANXI JINBO BIO-PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> HUMAN COLLAGEN 17-TYPE POLYPEPTIDE, PRODUCTION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF <130> C20W7642 <150> CN201911051106.3 <151> 2019-10-31 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C17A <400> 1 Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Met Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly 1 5 10 15 Asp Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly His 20 25 30 Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Ser Val Gly Asp Pro 35 40 45 Gly Met Glu Gly Pro Met Gly Gln Arg Gly Arg Glu Gly Pro Met Gly 50 55 60 Pro Arg Gly Glu Ala 65 <210> 2 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C17B <400> 2 Gly Leu Gln Gly Leu Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly 1 5 10 15 Asp Lys Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu 20 25 30 Lys Gly Pro Arg Gly Leu Thr Gly Glu Pro Gly Met Arg Gly Leu Pro 35 40 45 Gly Ala Val Gly Glu Pro Gly Ala Lys Gly Ala Met Gly Pro Ala 50 55 60 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tgaagcaggt agcccggggc ctaaagggga tatggggagt 240 ccgggtccga aaggggatcg tggatttccg ggtacgccgg gtatcccggg tccgctgggt 300 catccgggtc cgcaagggcc taaaggtcag aaaggtagtg tgggtgatcc tggtatggaa 360 ggtccgatgg gtcagcgtgg tcgtgagggt ccgatgggac cgcgtggtga ggctggtagc 420 cctggtccga aaggagatat gggtagcccg ggtccgaaag gtgaccgtgg ttttcctggt 480 acaccgggta ttccagggcc tctgggtcat cctggtcctc agggtccgaa aggtcagaaa 540 gggagtgtgg gagatccggg tatggagggt ccgatggggc agcgcggtcg tgaaggtccg 600 atgggcccgc gtggtgaagc c 621 <210> 6 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C17B3 <400> 6 Gly Leu Gln Gly Leu Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly 1 5 10 15 Asp Lys Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu 20 25 30 Lys Gly Pro Arg Gly Leu Thr Gly Glu Pro Gly Met Arg Gly Leu Pro 35 40 45 Gly Ala Val Gly Glu Pro Gly Ala Lys Gly Ala Met Gly Pro Ala Gly 50 55 60 Leu Gln Gly Leu Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp 65 70 75 80 Lys Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly 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255 Phe Gly Val Pro Asn Asn Met Ala Ser Cys Ser Pro Thr Leu His Pro 260 265 270 Gly Leu Ser Thr Ser Ser Ser Val Phe Gly Met Gln Asn Asn Leu Ala 275 280 285 Pro Ser Leu Thr Thr Leu Ser His Gly Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ala 290 295 300 Tyr Gly Val Lys Lys Asn Met Pro Gln Ser Pro Ala Ala Val Asn Thr 305 310 315 320 Gly Val Ser Thr Ser Ala Ala Cys Thr Thr Ser Val Gln Ser Asp Asp 325 330 335 Leu Leu His Lys Asp Cys Lys Phe Leu Ile Leu Glu Lys Asp Asn Thr 340 345 350 Pro Ala Lys Lys Glu Met Glu Leu Leu Ile Met Thr Lys Asp Ser Gly 355 360 365 Lys Val Phe Thr Ala Ser Pro Ala Ser Ile Ala Ala Thr Ser Phe Ser 370 375 380 Glu Asp Thr Leu Lys Lys Glu Lys Gln Ala Ala Tyr Asn Ala Asp Ser 385 390 395 400 Gly Leu Lys Ala Glu Ala Asn Gly Asp Leu Lys Thr Val Ser Thr Lys 405 410 415 Gly Lys Thr Thr Thr Ala Asp Ile His Ser Tyr Gly Ser Ser Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro 435 440 445 Trp Gly Pro Ala Pro Ala Trp Cys Pro Cys Gly Ser Cys Cys Ser Trp 450 455 460 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His Ser Arg Gly Ser Ser 1280 1285 1290 Ser Ser Ser His Ser Ser Ser Val Arg Arg Gly Ser Ser Tyr Ser 1295 1300 1305 Ser Ser Met Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ala 1310 1315 1320 Gly Gly Ala Phe Gly Glu Ala Ala Gly Asp Arg Gly Pro Tyr Gly 1325 1330 1335 Thr Asp Ile Gly Pro Gly Gly Gly Tyr Gly Ala Ala Ala Glu Gly 1340 1345 1350 Gly Met Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Leu Leu Gly Ala Asp Phe Ala 1355 1360 1365 Gly Asp Leu Asp Tyr Asn Glu Leu Ala Val Arg Val Ser Glu Ser 1370 1375 1380 Met Gln Arg Gln Gly Leu Leu Gln Gly Met Ala Tyr Thr Val Gln 1385 1390 1395 Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ile Ser 1400 1405 1410 Lys Val Phe Ser Ala Tyr Ser Asn Val Thr Ala Asp Leu Met Asp 1415 1420 1425 Phe Phe Gln Thr Tyr Gly Ala Ile Gln Gly Pro Pro Gly Gln Lys 1430 1435 1440 Gly Glu Met Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro Ala 1445 1450 1455 Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Lys 1460 1465 1470 Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Gln Val Tyr Ala Gly Arg Arg 1475 1480 1485 Arg Arg Arg Ser Ile Ala Val Lys Pro 1490 1495

Claims (10)

  1. 서열 번호 9의 63개 내지 1496개의 연속적 아미노산 잔기들을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 세포 부착 활성을 갖는, 폴리펩티드.
  2. 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 (A)m으로 나타낸 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지며, 각각의 A는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로부터 선택되거나, 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3 중 어느 하나에서 1개 이상, 예컨대, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기들이 치환, 부가, 또는 결실된 아미노산 서열이거나, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열과 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 서열 동일성을 갖는 서열이되; m은 1 내지 10의 정수이고, 각각의 A는 동일하거나 상이하고 인접한 2개의 A들은 펩티드 결합으로 연결되거나 하나 이상의 아미노산 잔기로 연결되고; 상기 폴리펩티드는 세포 부착 활성을 갖는, 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5, 서열 번호 7, 또는 서열 번호 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오티드로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
  6. 제5항에 기재된 발현 벡터를 포함하거나 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 대장균(E. coli) 세포인, 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (1) 생산 배지에서 제6항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (2) 상기 숙주 세포로부터 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 분리(isolating)하는 단계;를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 제7항의 방법에 따라 제조된 폴리펩티드를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 제7항의 방법에 따라 제조된 폴리펩티드 또는 제8항에 기재된 조성물을 포함하는 물품으로서, 상기 물품은 약제학적 조성물, 의료 기기, 조직 엔지니어링 제품, 화장품, 또는 건강 제품(health product)이고, 바람직하게는 상기 약제학적 조성물은 국소 제제(topical preparation), 바람직하게는 국소 도말 제제(topical smear preparation), 예컨대, 국소 겔 또는 국소 침윤 제제(topical infiltration preparation)이고; 바람직하게는 상기 국소 겔은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하고, 상기 국소 침윤 제제는 멸균 의료용 코튼 볼(sterile medical cotton balls)을 더 포함하는 것인, 물품.
  10. 물품, 바람직하게는 의료 기기, 조직 엔지니어링 제품, 화장품, 및 건강 제품의 제조에 있어, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 제7항의 방법에 의해 제조된 폴리펩티드, 제4항의 폴리뉴클레오티드, 제5항의 발현 벡터, 제6항의 숙주 세포, 또는 제8항의 조성물의 용도.
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