CN105176908A - 一种重组人成纤维细胞生长因子（fgf）-18的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达和生产rhFGF-18的方法。通过生物信息学手段优化设计合成FGF-18核苷酸序列全长，筛选pET系列载体与大肠杆菌宿主细胞，获得可溶性表达且稳定遗传的工程菌株，并建立了高密度发酵方法和二步柱层析纯化方法及建立相应活性检测方法，使大规模生产rhFGF-18成为可能。在此基础上，进一步探讨rhFGF-18在皮肤烧烫伤、难愈性溃疡治疗或黏膜损伤的组织修复、生物美容及在雄激素性脱发、脂溢性脱发、斑秃及放化疗后的脱发修复治疗领域的应用。

Description

一种重组人成纤维细胞生长因子（FGF）-18的生产方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种优化的生产人成纤维细胞生长因子-18(FGF-18)的方法，以及用于该方法的表达载体、宿主细胞、活性测定方法及可能的临床应用。

背景技术

FGF18是FGF家族的一个新成员，是一种可分泌蛋白。1998年，日本科学家Ohbayashi首次从老鼠胚胎中分离得到了FGF-18。人FGF-18基因编码一个207氨基酸组成的蛋白序列，分子质量约为23kDa；基因定位于染色体5q34，共有5个外显子，与已发现的FGFs其他成员有30％～70％的同源性。在结构上，FGF-18和FG-8、FGF-17相似，具有70％～80％的氨基酸序列同源性，为同一亚家族成员，但它们的生物学功能却有很大的差别。FGF-18在骨骼生长发育过程中扮演着重要的角色，也参与皮质神经元活动，腺垂体的生存、分化和增殖及调节头发的生长和皮肤修复。体内外的多项研究表明，FGF18在形态发生、血管形成、肿瘤生长和其他细胞发育过程中也发挥着重要的作用

大量体内外的研究都表明，FGF-18在骨骼发育中的具有不可替代的作用，它是骨骼发育过程中的一个重要的中介物。据报道，FGF-18在长骨发育过程中的软骨膜内和颅骨发育过程中成骨间充质细胞中显著性表达。此外，FGF-18基因敲除的小鼠肋骨畸形导致胸腔体积的减少，可能会引发呼吸衰竭，同时还发现了关节发育的缺陷。对FGF18鼠的胚胎研究显示，FGF-18是一种骨骼的周期调节剂。并且，有研究进一步证实，在FGF-18基因缺陷小鼠成骨过程中，颅骨骨缝闭合和长骨骨化延迟。据报道，FGF-18基因缺陷小鼠会出现延迟骨化和减少骨性标记、骨桥蛋白及骨钙素的表达。Ohbayashi等研究发现，FGF-18基因敲除小鼠胚胎显示，成骨间充质细胞增殖减少，而观察到软骨细胞增殖和分化增加。因此，在胚胎发育过程中，FGF-18最有可能对成骨生成起正向促进作用和对软骨形成起负向抑制作用。Kapadia等的研究进一步证实了，FGF18在胚胎发育期可抑制骨软骨细胞增殖和分化。与此相反，在成年个体FGF-18对其他软骨组织(除了生长面)的软骨细胞具有正向作用。据报道，在胚胎发育期的骨膜中，FGF-18可以通过增强预软骨细胞的分化来促进软骨修复。同时，Ellsworth等研究显示腺病毒介导转移FGF18到小鼠外耳刺激细胞的增殖，导致软骨细胞数量的增加、蛋白聚糖表达以及II型胶原蛋白的上升。最近的研究报告显示，在软骨细胞增殖过程中，FGF-18合成作用增强可能是由特定组织的损伤或受损后通过另外的生长因子和细胞因子的表达所致。在另一项研究中发现，FGF18能提高骨形态发生蛋白(BMP)的功能及通过抑制头蛋白的表达来刺激软骨形成。

FGF-18存在于多种细胞类型中，其功能并不仅仅局限于骨骼发育，它是一个多效性生长因子，可刺激众多间质细胞和上皮细胞及组织的增殖，包括肺、肾脏、心脏、睾丸、脾脏、骨骼肌和大脑。同时另外一项研究显示，FGF-18是对多种细胞有效的分裂素，在肝脏和小肠发育过程中扮演着重要的角色。Dichmann等发现，FGF-18在胚胎胰腺中显著性表达，但其在胰腺的具体作用尚不十分清楚。此外，Shimokawa等的研究进一步强调，FGF-18与消化系统保持平衡的相关性，并提出了提高FGF-18表达可能导致结直肠肿瘤的发生。在结肠癌和滑膜肉瘤组织中也可以观察到FGF-18的异常增多，同时抑制结肠癌细胞的FGF-18表达可以抑制其增长，这说明它参与了肿瘤的形成。在胚胎和产后肺，FGF-18也显著性表达。研究认为，FGF-18在胚胎肺的发育阶段后期肺部肺泡发育中发挥着重要的作用，而不是在形态肺分支形态发生期。在肺发育早期FGF-18的功能明确，它的信号主要通过FGFR2b，同时FGF-18可能通过激活FGFR2c来介导。在中脑和小脑区域发育中，FGF-18具有刺激神经胶质细胞的功能。对FGF-18突变型小鼠研究发现，它是通过与其他生长因子协同来参与中脑活动。据Ellsworth报道，FGF-18在发育期和成人期的大脑组织内都表达。研究认为，在短期性脑缺血大鼠模型中，FGF-18是一种有效的脑组织保护剂。同时在前神经折叠、鳃弓、原肠胚形成相关区域也发现了FGF-18的表达。在大脑内，FGF-18也参与特定的左右不对称胚胎器官的发育。(HuMCetal.MolCellBiol,1998,18(10):6063-6074；OhbayashiNetal.JBiolChem,1998,273(29):18161-18164；IwataTetal.HumMolGenet,2000,9(11):1603-1613；OhuchiHetal.MechDev,2000,95(1-2):55-66；EllsworthJLetal.OsteoarthritisCartilage,2002,10(4):308-320；OhbayashiNetal.GenesDev,2002,16(7):870-879；ShimoakaTetal.JBiolChem,2002,277(9):7493-7500；DichmannDSetal.DevDyn,2003,226(4):663-674；UsuiHetal.BiochemBiophysResCommun,2004,322(3):887-892；KatohMetal.IntJMolMed,2005,16(3):493-496；KawanoMetal.JInvestDermatol,2005,124(5):877-885；MooreEEetal.OsteoarthritisCartilage,2005,13(7):623-631；SmithSMetal.ArchBiochemBiophys,2007,468(2):244-251；GrecoVetal.CellStemCell,2009,4(2):155-169；BehrBetal.TissueEngPartA,2011,17(15-16):2061-2069；PlikusMVetal.JInvestDermatol,2012,132(5):1321-1324；LongFetal.ColdSpringHarbPerspectBiol,2013,5(1):1-20.)

由于FGF-18的发现对于骨骼性疾病以及脱发症的治疗有着重要意义，对其研究以及临床应用的前景日益受到人们的关注。然而，目前FGF-18蛋白表达水平低，同时很难制备具有高活性的蛋白，这些构成了开展FGF-18基础研究和临床应用的瓶颈问题。Huetal.利用哺乳动物细胞表达FLAG标签的FGF-18，然而，哺乳动物表达细胞更加复杂和昂贵的，很难利用大规模发酵过程。而且，FLAG会影响FGF18的生物活性。2012年，Jeonetal.利用大肠杆菌TOP10细胞表达6×His-FGF-18，虽然添加了His标签有利于蛋白的纯化，但增加了免疫原性和降低了生物活性，使其很难成为一种有效的治疗药物。

目前国际上的FGF-18大肠杆菌表达系统生产工艺，为方便纯化都融合标签(His,GST,Trx等)来表达目的蛋白，但这些方法来表达的蛋白具有较高的免疫原性，同时去除融合标签既昂贵又会影响蛋白的生物活性。申请单位通过基因优化，表达载体和宿主菌的筛选，获得大肠杆菌的高表达菌株，同时利用离子交换和肝素亲和二步柱层析技术纯化目的蛋白，最终获得蛋白纯度超过95％的具有较高生物学活性的重组蛋白，为今后开展产业化生产奠定了良好基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便并且高效的生产FGF-18的方法。

本发明的目的是提供一种检测FGF-18生物学活性的方法。

本发明的另一目的是提供用于该方法的表达载体和宿主细胞。

为实现上述目的，本发明首先将FGF-18的天然序列按照大肠杆菌偏好性进行优化，在不改变其氨基酸序列的前提下，设计合成rhFGF-18的全长序列。同时，本发明提供了筛选优化的表达载体和宿主细胞的组合，如pET3a、pET14b、pETM-11表达载体及对应的Origima(DE3)、C41(DE3)或C41(DE3)pLysS、BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主细胞。最终选择将FGF-18正确编码序列应用BamHI和NdeI酶切后插入到表达载体pET3a，并最终构建了高效稳定表达的pET3a-rhFGF-18/Origima(DE3)工程菌株。

进一步，本发明提供了一种生产重组人成纤维细胞生长因子-18的方法，通过优化培养基、控制参数及补料流加策略，建立了高密度培养方法，最后通过色谱分离技术得到高纯度的rhFGF-18。具体包括如下步骤：

(1)降低罐内培养基中底物浓度，特别是降低底物中碳源含量，并通过流加碳源、氮源、无机盐、微量元素及促生长因素等营养成分，延长对数生长期并保护质粒的稳定遗传，促进工程菌生长及产物的合成。通过优化诱导前后关键控制参数，获得了高密度、高效表达可溶性rhFGF-18的发酵生产工艺。

(2)根据rhFGF-18蛋白特性，筛选并添加适宜的蛋白稳定剂及缓冲体系，并通过串联合理的纯化方法，获得了较高纯度及收率的纯化生产工艺。具体包括：通过二步超滤方法进行初步纯化，即选择10KD超滤膜分离去除小分子量杂质，再通过选择30KD～50KD超滤膜分离去除大分子量杂质，达到初步浓缩的目的；通过二步柱层析技术进行精细纯化，即选用阳离子交换柱层析(SPSepharoseFastFlow或CMSepharoseFastFlow)捕获量大，易处理特性进行中度纯化，去除大部分杂质；选用肝素亲和柱层析(heparinSepharose6FF或HiTrapHeparinHP)通过肝素与目标蛋白特异性结合的特性进行高度纯化。

(3)建立用小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH/3T3)及小鼠成骨细胞(MC/3T3-E1)结合MTT比色法，检测重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白体外生物学活性方法。

本发明具有以下优点：

(1)通过对FGF-18核苷酸序列进行优化及筛选适宜的表达载体和宿主细胞的组合，获得高效稳定表达的工程菌株，表达水平达到菌体总蛋白的30％以上，并以可溶性形式表达；

(2)通过建立高密度培养方法，rhFGF-18的表达水平达到菌体总蛋白的20％以上，菌体产量达75g/L发酵液以上；

(3)通过超滤及二步柱层析方法，提高了蛋白纯度及收率。蛋白收率达≥120mg/L发酵液，蛋白纯度≥95％。

(4)建立了用小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH/3T3)结合MTT法，通过促进成纤维细胞增殖测定其体外生物学活性测定方法及用小鼠成骨细胞(MC/3T3-E1)结合MTT比色法，通过促进成骨细胞增殖测定其体外生物学活性测定方法。两种方法的实验结果均呈典型的S型曲线，并在一定范围内具有剂量依赖性，显示出良好的重复性和可靠性。

附图说明

图1pET3a-FGF-18重组载体图

图2质粒双酶切鉴定图

图3rhFGF-18发酵表达SDS-PAGE电泳分析

图4rhFGF-18柱层析SDS-PAGE电泳分析

图5MTT法测定rhFGF-18蛋白对NIH/3T3细胞的促增殖生物学活性

图6MTT法测定rhFGF-18蛋白对MC/3T3-E1细胞的促增殖生物学活性

具体实施方式

实施例1rhFGF-18蛋白高效表达工程菌的构建

根据GenBank中公布的人FGF-18天然序列(登录号：NM-003862.2)和氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变氨基酸序列的条件下，设计rhFGF-18的编码序列引物。通过PCR扩增的方法获得rhFGF-18的全长目的序列。人工合成重组人成纤维细胞生长因子-18(rhFGF-18)基因的全序列时，在该基因的5’端引入NdeI酶切位点及在3’端引入BamHI酶切位点。其中，人工合成重组人成纤维细胞生长因子-18(rhFGF-18)基因的全序列如SEQIDNO.1所示，rhFGF-18的编码序列引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。

用NdeI和BamHI双酶切分别处理基因rhFGF-18和表达载体如pET3a、pET3c、pET14b、pETM-11，37℃酶切3h回收相应的片段,用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定。抽提的质粒DNA用限制性内切酶及NdeI+BamHI在37℃反应3h，得到在pET载体中插入了rhFGF-18基因的重组质粒pET3a-rhFGF-18、pET-3c-rhFGF-18、pET-14b-rhFGF-18、pETM-11-rhFGF-18。利用菌落PCR进行阳性鉴定，应用NdeI+BamHI双酶切时，能切出大小约543bp的片段，表明序列已正确插入载体中。用常规方法进行正、逆向序列分析，委托Invitrogen公司进行序列的测定，证实克隆序列与设计序列完全一致。将重组质粒转化Origima(DE3)、C41(DE3)或C41(DE3)pLysS、BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS表达宿主菌种，用抗性筛选出高效表达单菌落，进行摇瓶培养，该诱导后测定目的蛋白表达量，并进行免疫印迹(WesternBlot)检测呈现阳性反应，证实所表达的重组外源蛋白为rhFGF-18。实验结果表明，pET3a-rhFGF-18/Origima(DE3)工程菌株表达的目的蛋白表达量占总蛋白30％以上，优于其他表达载体和宿主菌的组合。

实施例2rhFGF-18蛋白高密度培养方法的建立

挑取实施例1中制备的转入pET3a-rhFGF-18的大肠杆菌Origima(DE3)单克隆菌株，接种到LB液体培养基中，培养至A₆₀₀达到0.8～1.2，按1:10的比例接种于含有磷酸盐及葡萄糖的LB液体培养基中，扩大培养至A₆₀₀达到3～5，按1:10接种罐内培养基中。通过流加流加碳源(葡萄糖或甘油)、氨水调节pH6.8～7.0、培养温度,37℃，通过调节转数、通气量等，维持DO₂≥25％；待A₆₀₀达到18～20，流加IPTG至终浓度0.5mmol/L开始诱导。通过流加适当补加碳源(葡萄糖或甘油)、氨水调节pH7.1～7.2，并流加氮源、磷酸盐缓冲液，诱导温度33℃，通过调节转数、通气量等，维持DO₂≥25％，诱导4h～5h带菌密度基本稳定后确定为发酵终点。放罐、4℃、8000rpm离心10min，称重放-20℃冻存，取一定量样品进行SDS-PAGE检测，测定目的蛋白的表达量。在已发表文章技术基础上，对高密度培养方法进行改进和优化，使rhFGF-18蛋白表达量及菌体密度得到大幅提高。

表1各阶段培养基组成

表2高密度发酵培养结果与已发表数据对照表

实施例3rhFGF-18蛋白纯化方法的建立

1、菌体破碎

在原有超声破碎基础上，对其破菌生产工艺进行优化与放大即采用高压均质破碎方法。将菌体室温融化后，以1：20(g：mL)比例充分悬浮于细胞裂解缓冲液(50mMTris,2mMEDTA-2Na,0.1MNaCl,1％TritonX-100,5mMDTT，蛋白酶抑制剂,pH7.5)，进行高压均质。破碎方式为200bar循环1次，再以800bar均质1～2次，镜检在可见视野范围内无完整大肠杆菌后，20000rpm离心，4℃，30min，弃沉淀，收集上清。

2、超滤

取上述离心后的上清，泵入装有10KD膜的超滤装置，弃去离出液，分离去除小分子量杂质；再将剩余液体泵入装有30KD膜的超滤装置，收取离出液，分离去除大分子量杂质，达到初步浓缩的目的，并减少了杂质的干扰。

3、柱层析纯化

(1)阳离子交换

层析介质：SP-SepharoseFF或CM-SepharoseFF

平衡液(溶液A)：50mMTris+2mMEDTA-2Na-0.1MNaCl(pH7.5)

洗脱液(溶液B)：50mMTris+2mMEDTA-2Na-0.6MNaCl(pH7.5)

洗脱液(溶液C)：50mMTris+2mMEDTA-2Na-1.2MNaCl(pH7.5)

再生液(溶液D)：50mMTris+2mMEDTA-2Na-2.0MNaCl(pH7.5)

平衡：用溶液A平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将超滤后的蛋白溶液上样。

平衡：用溶液A平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

洗脱：上样后用3～5个柱体积的溶液B清洗，至基线平衡。再用洗脱溶液C清洗，收取蛋白峰，测定蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测其纯度。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液D冲洗层析柱。

平衡：用溶液A平衡3～5个柱体积，待用。

(2)肝素亲和层析

层析介质：heparinSepharose6FF

平衡液(溶液B)：50mMTris+2mMEDTA-2Na-0.6MNaCl(pH7.5)

洗脱液(溶液C)：50mMTris+2mMEDTA-2Na-1.2MNaCl(pH7.5)

再生液(溶液D)：50mMTris+2mMEDTA-2Na-2.0MNaCl(pH7.5)

平衡：用溶液B平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将离子交换柱层析收集的rhFGF-18蛋白溶液用溶液A稀释至NaCl浓度为0.6M后上样。

平衡：用溶液B平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

洗脱：用洗脱溶液C清洗，收取蛋白峰，测定蛋白含量，并进行HPLC、SDS-PAGE检测其纯度。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液D冲洗层析柱。

平衡：用溶液B平衡3～5个柱体积，待用。

与已发表的相关数据相比较，通过对纯化方法进行改进和优化，使rhFGF-18蛋白收率大幅提高。

表3优化纯化结果与已发表数据对照表

实施例4rhFGF-18蛋白细胞活性检测方法建立

基因工程重组蛋白的生物学活性是反映药物质量及功效的重要指标，因此建立稳定、灵敏的活性测定方法对于产品的生产及质量检测具有重要意义，同时也是指导临床用药剂量的重要指标。

1、促进小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)增殖

根据rhFGF-18具有特异性促进上皮和间质细胞有丝分裂的功能，采用细胞增殖法，选择小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞)为靶细胞，结合MTT比色法检测蛋白体外生物学活性。采用全自动酶标仪以630nm为参比波长，于570nm处测定吸光度。结果显示，rhFGF-18蛋白在10ng/ml～100ng/ml浓度时，对NIH3T3细胞具有显著的促增殖作用，并呈线性相关。

2、促进小鼠成骨细胞(MC/3T3-E1)增殖

根据rhFGF-18具有特异性促进成骨有丝分裂的功能，采用细胞增殖法，选择小鼠成骨细胞(MC/3T3-E1)为靶细胞，结合MTT比色法检测蛋白体外生物学活性。采用全自动酶标仪以630nm为参比波长，于570nm处测定吸光度。结果显示，rhFGF-18蛋白在10ng/ml～100ng/ml浓度时，对MC/3T3-E1细胞具有显著的促增殖作用，并呈线性相关。

Claims (6)

1.一种用于构建可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子-18工程菌株的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

①一种源至pET系列的原核表达载体，其含有编码人成纤维细胞生长因子-18的重组DNA；

②将重组质粒转化宿主细胞，筛选高效可溶性表达的工程菌株。

2.一种用于制备有体内生物学活性的重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

①在适当营养条件下高密度可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子-18的发酵方法；

②在适当缓冲体系组成下分离纯化重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的纯化方法。

3.根据权利要求1的方法，其中所述pET载体优选为pET3a-c、pET14b、pETM-11；其中所述大肠杆菌宿主细胞优选是Origima(DE3)、C41(DE3)或C41(DE3)pLysS、BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

①罐内培养基底物中碳源浓度为1g/L～10g/L，优选为5g/L；培养温度为30℃～37℃，优选为37℃；诱导温度为30℃～37℃，优选为33℃；培养pH值为6.5～7.2，优选为6.8～7.0；诱导pH值为6.8～7.4，优选为7.1～7.2；诱导剂IPTG浓度为0.1mmol/L～1mmol/L，优选为0.3mmol/L～0.5mmol/L；诱导时机为诱导前A₆₀₀在5～25，优选为18～20；培养和表达溶解氧≥25％；诱导时间为4h～5h，在发酵过程中通过流加补充碳源、氮源、无机盐等调节溶解氧与pH值的变化，延长对数生长时间及保障质粒稳定性，实现高密度培养。

②根据蛋白在纯化过程中不稳定的特性，在细胞破碎裂解液组成中添加了表面活性剂并优选TritonX-100、蛋白酶抑制剂并优选proteininhibitorcocktails、还原剂并优选DTT、金属螯合剂并优选EDTA-2Na等进行优化；缓冲体系优选为20-50mMTri-HCl，pH值优选为7.4～7.6；通过超滤对破菌上清液进行初步纯化，采用阳离子交换并优选SPSepharoseFastFlow或CMSepharoseFastFlow，肝素亲和并优选heparinSepharose6FF或HiTrapHeparinHP色谱填料进行二步柱层析，提高了蛋白及活性收率。

5.一种用于检测重组人成纤维细胞生长因子-18的生物学活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

①建立用小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH/3T3)结合MTT比色法，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，检测重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白体外促成纤维细胞增殖的生物学活性测定方法；

②建立用小鼠成骨细胞(MC/3T3-E1)结合MTT比色法，于波长490nm处测定吸光度，检测重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白体外促成骨细胞增殖的生物学活性测定方法。

6.根据权利要求1～5所述制备的重组人成纤维细胞生长因子-18，其特征是，可应用于皮肤烧烫伤、难愈性溃疡治疗或黏膜损伤的组织修复、生物美容等，还可应用于针对雄激素性脱发、脂溢性脱发、斑秃及放化疗后的脱发疾病的修复治疗。