CN106801060B

CN106801060B - 重组人成纤维细胞生长因子-22的基因克隆、表达和应用

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Publication number: CN106801060B
Application number: CN201710199557.6A
Authority: CN
Inventors: 田海山; 姜潮; 杨欢欢; 王申; 许诺; 林海鹏
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN106801060A

Abstract

本发明提供了一种重组人成纤维细胞生长因子‑22的基因克隆、表达和应用，涉及分子生物学技术领域。本发明通过对人成纤维细胞生长因子‑22核苷酸序列进行优化及与适宜的表达载体和宿主细胞的组合，构建了重组人成纤维细胞生长因子‑22的高效表达菌株，建立规模化的高密度发酵培养技术及优化包涵体变复性方法，并通过合理串联色谱柱纯化，最终获得纯度超过95％并具有高生物学活性的重组人成纤维细胞生长因子‑22蛋白，为进一步开展疾病相关作用机制研究和新药开发奠定了基础。

Description

重组人成纤维细胞生长因子-22的基因克隆、表达和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种重组人成纤维细胞生长因子-22的基因克隆、表达和应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子-22(Fibroblast Growth Factor22，FGF22)是FGF家族成员之一，属FGF7亚家族(FGF7、FGF10、FGF22)约有45％～54％的氨基酸同源序列。FGF22是通过旁分泌途径产生的，主要在大脑和皮肤组织中表达。人FGF22基因定位于人类染色体19p13.3，共有3个外显子，两个转录变异体，其编码的蛋白是170个氨基酸残基组成的单链多肽，N端有22个氨基酸残基的疏水信号肽序列，成熟蛋白有149个氨基酸(23～170氨基酸残基)，其理论分子质量为17.3kDa。体内外的研究表明，FGF22与脊髓损伤修复，神经系统及皮肤癌等疾病有着重要的联系，特别是在神经突触的形成过程中起着调节因子的作用。

FGF22作为突触形成的中介和突触形成、成熟的调节因子，在脊髓损伤神经环路的形成过程中起着关键作用。Anne Jacobi等研究发现，FGF22是由脊髓中部神经所表达并且释放于靠近脊髓灰质的部位，这使得FGF22有利于进入正在生长中的轴突脉络发挥作用。作为FGF22在脊髓中的主要受体FGFR1和FGFR2，在脊髓损伤中也起着重要的作用。实验证明，同时敲除FGFR1和FGFR2将会影响突触环路的形成和突触功能的恢复，同样破坏FGF22信号基因会减少新突触的产生并且会改变突触分子化合物的形成。研究结果说明，FGF22是神经突触可塑性和神经突触环路连接的内在调节因子，显示了FGF22在脊髓损伤修复领域广阔的应用前景。(Umemori H,et al.Cell,2004,118(2):257-270；Stevens H E,et al.TheJournal of Neuroscience,2010,30(16):5590-5602；Terauchi A,et al.Nature,2010,465(7299):783-787；Jacobi A,et al.EMBO Journal,2015,34(9):1231-1243.)

研究显示在海马体的发育过程中，FGF22能够促进突触前末梢兴奋的形成，与癫痫的发生有很大的联系。Lee C H等的研究发现在野生型戊四唑(PTZ)诱导的癫痫模型小鼠中，齿状回颗粒细胞(DGCs)发生增强，门区异位颗粒细胞(H'EGC)出现，门细胞死亡增加，苔藓纤维发芽形成；而在FGF22基因敲除小鼠用戊四唑诱导至中等癫痫发作时，齿状回颗粒细胞没有增强，门区异位颗粒细胞没有出现，门细胞死亡也没有改变。实验结果说明，通过PTZ诱导癫痫模型中，FGF22基因敲除小鼠比野生型小鼠更能抑制癫痫的发作。由此进一步说明FGF22在控制神经发生，颗粒细胞的异常迁移和门细胞死亡的过程中起着很重要的作用。这可能是因为源于CA3的FGF22会发送信号到DGCs并以一种独立的方式调节神经产生和门细胞存活。这些研究结果的发现，为我们提供了一种潜在的治疗癫痫疾病的新思路即开发FGF22的小分子抑制剂可能会治疗或者缓解癫痫的发生。(Lee C H,Umemori H.Frontiersin Cellular Neuroscience,2013,7:43Akiko T,et al.Natrue,2010,465(7299):783-787.)

研究显示，FGF22与脂溢性角化病(Seborrheic Keratosis,SK)，基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)，鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma,SCC)等皮肤肿瘤发生发展有很大的联系。Monika Jarosz等人使用二羟甲基丁酸和对苯二甲酸(DMBA/TPA)两步法来诱导皮肤癌的产生，通过比较野生型小鼠和FGF22基因敲除小鼠在经过DMBA/TPA诱导之后，经过50多周的观察，野生型小鼠的乳突淋瘤个数是FGF22基因敲除小鼠乳突淋瘤的两倍。进一步研究发现，FGF22可能是通过与FGF7和FGF10相互竞争FGFR2b受体来实现对肿瘤发生的调节。虽然具体的研究机制还不清楚，但是这为治疗皮肤癌提供了一种新的方法即开发小分子的FGF22拮抗剂可能是未来治疗皮肤癌的新途径。(Jarosz M,et al.PLOSONE,2012,7(6):e39436；Beyer T A,et al.Experimental Cell Research,2003,287(2):228-236；Zhang X,et al.Journal of Biological Chemistry,2006,281(23):15694-15700.)

FGF22其他生物学功能。Rishabh singh等通过微阵列分析，在小鼠外侧膝状核(LGN)内FGF22能够诱导肌肉，海马和小脑神经末梢的兴奋；而在FGF22基因敲除小鼠中LGN的视网膜神经是损伤的，证明FGF22有助于视网膜膝状弯曲神经突触的形成。FGF-22与大多数FGFs成员相同，能与受体FGFR特异性结合，促上皮和间质细胞有丝分裂，在组织修复方面有良好的应用前景。(Rishabh Singhet al.Front Mol Neurosci,2012,4:61；Beenken A,et al.Nature reviews Drug discovery,2009,8(3):235-253.)

综上所述，FGF22具有多种生物学功能，尤其对于大脑发育有着不可替代的作用，并且在视网膜、脊髓损伤等神经突触的形成过程中发挥调节因子的作用。此外，FGF22在癫痫与皮肤肿瘤发生方面具有重要的基础研究价值和临床应用前景。到目前为止，国内外对于FGF22的研究较少，其在各个器官的精确表达和功能分析及具体信号通路还有待进一步研究。如何高效获得高生物学活性的rhFGF22蛋白，是一切疾病相关作用机制研究和新药开发的基础，是亟需解决的问题。

因此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种编码人成纤维细胞生长因子-22的核苷酸序列，本发明的第二个目的在于提供包含所述核苷酸序列的重组表达载体，本发明的第三个目的在于提供包含所述重组表达载体的重组表达菌株，本发明的第四个目的在于提供重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白的生产方法，本发明的第五个目的在于提供按照所述生产方法生产得到重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白，本发明的第六个目的在于提供所述重组人成纤维细胞生长因子-22的临床应用，以缓解现有技术中关于人成纤维细胞生长因子-22相关研究不足，以及现有技术生产的重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白纯度低、活性差的问题。

本发明提供了一种优化的编码人成纤维细胞生长因子-22的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

另外，本发明还提供了包含所述核苷酸序列的重组表达载体。

进一步的，所述重组表达载为pET3a、pET3c、pET22b或pET28a，优选的，源始于pET3a。

另外，本发明还提供了包含所述重组表达载体的重组表达菌株。

进一步的，所述重组表达菌株源始于大肠杆菌，优选的，源始于BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3)或者Rosetta(DE3)pLysS，更优选的，源始于BL21(DE3)plysS。

另外，本发明还提供了重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白的生产方法，所述生产方法包括培养所述重组表达菌株，诱导所述重组表达菌株表达所述重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白，经过包涵体变性、复性和分离纯化步骤，得到所述重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白。

进一步的，所述生产方法包括以下步骤：

培养所述重组表达菌株，包括对所述重组表达菌株进行活化培养和扩增培养，接种至发酵罐中进行高密度培养；

所述包涵体变性采用两步变性方法；

所述包涵体复性采用稀释复性、透析复性或者柱上复性方法；

所述分离纯化采用柱层析法，优选阳离子交换柱层析和/或肝素亲和柱层析。

进一步的，

所述活化培养中的活化培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为10g/L；酵母粉，终浓度为5g/L；氯化钠，终浓度为10g/L；

所述扩增培养中的扩增培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为10g/L；酵母粉，终浓度为10g/L；磷酸氢二钾，终浓度为3.0g/L；磷酸二氢钾，终浓度为1.0g/L；氯化钠，终浓度为4g/L；葡萄糖，终浓度为1g/L。

另外，本发明还提供了按照所述生产方法生产得到的重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白。

另外，本发明还提供了所述重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白在下述I～VII任意一种中的应用：

I、保护受损肝细胞；

II、修复脊髓神经及视网膜损伤；

III、促进创伤愈合；

IV、生物美容；

V、治疗烧烫伤及难愈性溃疡；

VI、制备生物美容药物；

VII、制备治疗烧烫伤及难愈性溃疡药物。

本发明通过优化成纤维细胞生长因子-22基因，得到了优化的编码人成纤维细胞生长因子-22的基因，构建了重组人成纤维细胞生长因子-22的高效表达菌株，建立规模化的高密度发酵培养技术，优化包涵体变复性方法，并通过合理串联色谱柱纯化，最终获得纯度超过95％并具有高生物学活性的重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白，为进一步开展疾病相关作用机制研究和新药开发奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图做简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为优化前后人FGF22核苷酸序列的对比图；

图2为pET3a-hFGF22重组表达载体示意图；

图3为pET3a-hFGF22重组表达载体的酶切鉴定电泳图；

图4a为rhFGF22蛋白诱导表达的western blot鉴定图；

图4b为rhFGF22蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳分析图；

图5为阳离子柱层析SDS-PAGE电泳分析图；

图6为亲和柱层析SDS-PAGE电泳分析图；

图7为rhFGF22蛋白HPLC分析图；

图8为MTT法测定rhFGF22蛋白促NIH 3T3细胞增殖生物学活性图；

图9a为不同浓度rhFGF22蛋白对H₂O₂诱导LO2细胞肝损伤模型的保护作用的数据图；

图9b为不同浓度rhFGF22蛋白对H₂O₂诱导LO2细胞肝损伤模型的保护作用的细胞显微图；

图10为各组相关凋亡基因的RNA分析结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中涉及的rhFGF22为重组人成纤维细胞生长因子-22(recombinant humanFibroblast Growth Factor 22，rhFGF22)，涉及的hFGF22为人成纤维细胞生长因子-22(human Fibroblast Growth Factor 22，hFGF22)，涉及的FGF22为成纤维细胞生长因子-22(Fibroblast Growth Factor 22，FGF22)。

本发明提供了编码hFGF22的核苷酸序列，编码hFGF22的核苷酸序列包含SEQ IDNO.1所示的序列。本发明提供的编码hFGF22的核苷酸序列可包括：仅SEQ ID NO.1所示的序列，或者在SEQ ID NO.1所示的序列的5’端或者3’端添加起始密码子、终止密码子、蛋白纯化标签或者酶切位点等序列得到的核苷酸序列。即，编码hFGF22的核苷酸序列可能不仅包含SEQ ID NO.1所示的序列，还可能包含其他的功能性核苷酸序列。

另外，本发明还提供了包含编码hFGF22的核苷酸序列的重组表达载体。重组表达载体的制备方法包括，通过在SEQ ID NO.1所示的序列的5’端与3’端分别添加起始密码子和终止密码子，并引入特异性酶切位点等操作，然后将编码hFGF22的核苷酸序列连接到表达载体上，得到重组表达载体。此处涉及的表达载体，表示尚不包含SEQ ID NO.1所示序列的载体。其中，表达载体可以是pET3a、pET3c、pET22b或者pET28a。相对得到的重组表达载体可以表示为pET3a-hFGF22、pET3c-hFGF22、pET22b-hFGF22或者pET28a-hFGF22。

另外，本发明还提供了包含上述重组表达载体的重组表达菌株。重组表达菌株通过将上述重组表达载体导入到表达宿主中制备而成。表达宿主可以是大肠杆菌，发明人对多种大肠杆菌的菌株进行了筛选实验，最终发现当将上述重组表达载体转入表达宿主BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3)或者Rosetta(DE3)pLysS时，得到的重组表达菌株有较好的rhFGF22蛋白表达量。其中，尤以将重组表达载体pET3a-hFGF22转入到表达宿主BL21(DE3)plysS中，获得的重组表达菌株pET3a-hFGF22/BL21(DE3)plysS的rhFGF22蛋白表达量最高。

另外，本发明还提供了rhFGF22蛋白的生产方法，包括培养并诱导重组表达菌株表达rhFGF22蛋白，经过包涵体变性、复性和分离纯化步骤，得到所述rhFGF22蛋白。

其中，培养上述重组表达菌株，包括对重组表达菌株进行活化培养和扩增培养，接种至发酵罐中进行高密度培养。

用于活化培养的活化培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为10g/L；酵母粉，终浓度为5g/L；氯化钠，终浓度为10g/L。用于扩增培养的扩增培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为10g/L；酵母粉，终浓度为10g/L；磷酸氢二钾，终浓度为3.0g/L；磷酸二氢钾，终浓度为1.0g/L；氯化钠，终浓度为4g/L；葡萄糖，终浓度为1g/L。

接种至发酵罐中进行高密度培养时，发酵罐的罐内培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为23g/L；酵母粉，终浓度为17g/L；磷酸氢二钾，终浓度为3.0g/L；磷酸二氢钾，终浓度为1.0g/L；氯化铵，终浓度为4g/L；硫酸镁，终浓度为1g/L；氯化钙，终浓度为0.02g/L；维生素B1，终浓度为0.01g/L；葡萄糖，终浓度为5g/L；微量元素，适量。发酵过程中补加的补料培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为23g/L；酵母粉，终浓度为17g/L；磷酸氢二钾，终浓度为3.0g/L；磷酸二氢钾，终浓度为1.0g/L；硫酸镁，终浓度为1g/L。

其中，诱导重组表达菌株表达rhFGF22蛋白包括用IPTG诱导，IPTG诱导的终浓度为0.5mM～1.0mM，诱导条件为37℃、pH值7.0～7.2，诱导时间为4h～6h。

培养重组表达菌株和诱导重组表达菌株表达rhFGF22蛋白的全过程概括如下：将重组表达菌株以1:50～100(V:V)的比例接种至活化培养基中，培养至A₆₀₀达到0.8～1.0，再按1:10～20(V:V)的比例接种至扩增培养基中，培养至A₆₀₀达到3～5，然后按1:10～20(V:V)的比例接种至包含罐内培养基的发酵罐中，以温度37℃、pH值6.8～7.0并调节搅拌转数和通气量以及通过流加补料培养基保持DO>25％，至A₆₀₀达到18～22。流加诱导剂IPTG至终浓度0.5mM～1.0mM进行诱导，诱导后控制温度37℃、pH值7.0～7.2并通过调节搅拌转数和通气量以及流加补料培养基保持DO>25％，诱导4h～6h。

经过上述培养和诱导的过程，即得到包涵体形式表达的rhFGF22蛋白。对包涵体进行变性、复性和分离纯化的步骤，最终得到高纯度的rhFGF22蛋白。

其中，包涵体变性采用两步变性的方法。第一步变性：用包涵体10～20倍量(g/V)变性缓冲液(20mM PB，5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl，5mM DTT，7M盐酸胍，pH 7.3)充分溶解包涵体，得到包涵体变性溶液I；将包涵体变性溶液I用10～15倍量(V:V)稀释液(20mM PB，5mMEDTA-2Na,0.1M NaCl，5mM DTT，pH7.3)快速稀释，离心得到沉淀。第二步变性：向第一步变性得到的沉淀中，加入10～20倍量(g/V)变性缓冲液(20mM PB，5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl，5mM DTT，8M～9M脲，pH7.3)充分溶解包涵体，得到包涵体变性溶液II。

其中，包涵体复性采用稀释复性、透析复性或者柱上复性方法；分离纯化采用柱层析法，优选阳离子交换柱层析和/或肝素亲和柱层析。需要注意的是，复性和纯化的过程并不是严格的分开操作的，其先后顺序也没有严格的要求，例如可以先复性、再纯化，也可以先纯化、再复性，也可以先纯化、再复性、再纯化。即可以根据具体情况的不同，依据上述纯化和复性的方法，最终确定不同的纯化和复性的方案。

另外，本发明还发现了rhFGF22蛋白能够促进成纤维细胞增殖活性。此外还发现了rhFGF22蛋白能够对肝损伤起到保护的作用，并通过体外实验验证，表明rhFGF22蛋白能够用于肝损伤的保护，该应用包括应用rhFGF22蛋白制备治疗肝损伤的相关药物。

为了有助于更清楚的理解本发明，现通过具体的实施例对本发明的内容进行详细的介绍。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。

实施例1构建rhFGF22蛋白高效表达工程菌株

根据GenBank中公布的人FGF22天然序列(登录号：NM020637.1)，(人FGF22天然序列如SEQ ID NO.2所示)N端去掉22个信号肽，在不改变氨基酸序列的条件下，按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，得到优化后的编码hFGF22蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)。(如图1所示为优化前的天然序列和优化后序列的比较图，其中Optimized表示优化后，Original表示优化前的原始序列，标有下划线的碱基表示进行了优化的碱基位点)

在hFGF22优化序列(SEQ ID NO.1)的5’端与3’端分别加起始密码子和终止密码子，并引入特异性酶切位点Nde I和BamH I，再用Nde I和BamH I双酶切分别处理表达载体和合成于克隆载体上的hFGF22基因，37℃酶切3h～4h后回收相应的片段，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建重组表达载体(见图2)。

连接产物转化进入大肠杆菌，在包含载体抗性的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒双酶切鉴定，证实表达序列已正确插入载体中(见图3，其中M1表示DNA Marker DL 15,000；M2表示DNA Marker DL 2,000；1-3表示不同的重组表达载体双酶切后产物(酶切位点是BamH I和Nde I)；4表示pET3a质粒双酶切胶回收片段；5表示hFGF22-pUC57质粒双酶切胶回收片段)。

委托基因测序公司进行正向、反向序列分析测定，证实克隆序列与设计序列完全一致。将重组表达载体转化Rosetta(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS、BL21(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS表达宿主菌，用抗性筛选出高效表达单菌落，并进行免疫印迹(Western Blot)检测。

试验结果表明，与pET3a载体构建的重组子(即重组表达载体)有较好的表达，进一步筛选表达宿主，对BL21(DE3)plysS及BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS及Rosetta(DE3)重组表达菌株中目的蛋白占菌体总蛋白量进行测定，结果分别为15.0％、14.2％、9.4％、9.8％。表明，pET3a-hFGF22/BL21(DE3)plysS重组表达菌株中目的蛋白表达量优于其他表达载体和表达宿主的组。

实施例2建立rhFGF22蛋白高密度发酵方法

将rhFGF22工程菌株(即构建而成的重组表达菌株)以1:50～100(V:V)接种至LB培养基中进行活化制备一代种子，培养至A₆₀₀达到0.8～1.0左右，按1:10～20(V:V)的比例接种至包含磷酸盐缓冲液的LB培养基中进行扩增至A₆₀₀达到3～5左右，按1:10～20(V:V)的比例接种至包含罐内培养基的发酵罐中，并加入无机盐及生长因子，以温度37℃、pH值6.8～7.0并调节搅拌转数和通气量以及流加碳源保持DO>25％，至A₆₀₀达到18～22。流加诱导剂(IPTG)至终浓度0.5mM～1.0mM进行诱导，诱导后温度控制在37℃、pH值7.0～7.2并通过调节搅拌转数和通气量以及流加碳源、氮源及磷酸盐缓冲溶液保持DO>25％，诱导4h～6h，低温高速离心，菌体-20℃以下冻存。发酵全过程中每1h取样测A₆₀₀值，并在诱导前进行镜检；诱导后留样进行SDS-PAGE检测。(见图4a和图4b，其中M表示蛋白质分子量标准品；1表示诱导前；2-4表示不同菌株诱导后)

表1各阶段培养基组成

续表

实施例3建立rhFGF22蛋白纯化方法

1、菌体破碎

将菌体室温融化后，以1：20～40(g：mL)比例充分悬浮于细胞裂解缓冲液(20mMPB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1％Triton X-100，pH7.5)中，进行高压均质破碎细胞。以250bar～300bar循环1次，再以800bar～850bar均质1～2次，镜检在可见视野范围内无完整大肠杆菌后，低温高速离心，弃上清，收集沉淀。

2、包涵体清洗

取上述沉淀，加入10～20倍量(V:V)清洗缓冲液1(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1MNaCl,1％Triton X-100,0.5％去氧胆酸钠,pH7.3)，室温充分搅拌洗涤2h后，高速离心，4℃，30min，弃上清，收集沉淀。再加入10～20倍量(V:V)清洗缓冲液2(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1％Triton X-100,pH7.3)，室温充分搅拌洗涤2h后，高速离心，4℃，30min，弃上清，收集沉淀。再加入10～20倍量(V:V)清洗缓冲液3(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1MNaCl,1％Triton X-100,4M脲，pH7.3)，室温充分搅拌洗涤2h后，高速离心，4℃，30min，弃上清，收集沉淀即为包涵体。

3、包涵体变性

由于rhFGF22包涵体在含脲变性溶液中溶解效果不理想，故采用两步变性的方法。

第一步变性：称取适量包涵体，加入10～20倍量(g/V)变性缓冲液(20mM PB，5mMEDTA-2Na,0.1M NaCl，5mM DTT，7M盐酸胍，pH7.3)溶解包涵体。充分搅拌均匀后，在磁力搅拌条件下4℃溶解15h以上，离心，20000rpm，4℃，30min，去除未溶物，得到包涵体变性溶液I。

快速稀释：将得到的包涵体变性溶液I用10～15倍量(V:V)稀释液(20mM PB，5mMEDTA-2Na,0.1M NaCl，5mM DTT，pH7.3)快速稀释。离心，20000rpm，4℃，30min，去除上清液，得rhFGF22蛋白沉淀。

第二步变性：将得到的rhFGF22蛋白沉淀用10～20倍量(g/V)变性缓冲液(20mMPB，5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl，5mM DTT，8～9M脲，pH7.3)溶解包涵体。充分搅拌均匀后，在磁力搅拌条件下4℃溶解15h以上，离心，20000rpm，4℃，30min，去除未溶物，得包涵体变性溶液II。

4、包涵体纯化

方法1：复性后纯化

复性：

(1)稀释复性

取包涵体变性溶液II，在4℃磁力搅拌条件下，缓慢滴入10～40倍量(V:V)复性缓冲液(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1％Triton X-100,pH7.3)，复性过程控制16h以上。复性完毕，离心去除沉淀或采用中空纤维超滤装置进行初步分离，所采用的截留分子量为10KD。

(2)透析复性

取包涵体变性溶液II，装入截留分子量为7KD的透析袋中，在4℃磁力搅拌条件下，依次放入30～50倍量(V:V)复性缓冲液1(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1％TritonX-100,5mMDTT,4M脲pH7.3)、复性缓冲液2(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1％TritonX-100,5mM DTT,2M脲pH7.3)、复性缓冲液3(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1％TritonX-100,5mMDTT,1M脲pH7.3)、复性缓冲液4(20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,pH7.3)中，复性液中还可添加氧化/还原型谷胱甘肽、精氨酸、甘油等，8h～12h小时更换复性液。复性完毕，离心去除沉淀或采用中空纤维超滤装置进行初步分离，所采用的截留分子量为10KD。

纯化—阳离子交换：

层析介质：CM或SP或其他型号阳离子交换填料

缓冲溶液：平衡液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,pH7.3

洗脱液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3

再生液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,2.0M NaCl,pH7.3

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将复性后的蛋白溶液上样。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

洗脱：用3～5个柱体积洗脱液清洗层析柱，收取蛋白峰，测定蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测其纯度。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液冲洗层析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，待用。

纯化—肝素亲和层析：

层析介质：Heparin Sepharose亲和层析填料

缓冲溶液：平衡液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3

洗脱液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,1.2M NaCl,pH7.3

再生液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,2.0M NaCl,pH7.3

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将离子交换柱层析收集的rhFGF22蛋白溶液上样。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

洗脱：用3～5个柱体积洗脱液清洗层析柱收取蛋白峰，测定蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测其纯度。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液冲洗层析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，待用。

方法2：纯化后复性

纯化—阳离子交换：

层析介质：CM或SP或其他型号阳离子交换填料

缓冲溶液：

平衡液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,8M脲,0.1M NaCl,pH7.3

洗脱液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,8M脲,0.3M NaCl,pH7.3

再生液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,8M脲,2.0M NaCl,pH7.3

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将变性后的蛋白溶液上样。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液冲洗层析柱。

平衡：用不含脲的平衡液平衡3～5个柱体积，待用。

复性：

将阳离子交换收集的rhFGF22蛋白溶液进行复性，具体方法同上(稀释复性或透析复性)

纯化—肝素亲和层析：

层析介质：Heparin Sepharose亲和层析填料

缓冲溶液：平衡液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3

洗脱液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,1.2M NaCl,pH7.3

再生液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,2.0M NaCl,pH7.3

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将复性的离子交换柱层析收集的rhFGF22蛋白溶液上样。

平衡：用平衡液液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液冲洗层析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，待用。

样品经过此两步纯化，即阳离子交换、亲和层析，纯度提高至95％以上(见图5、图6。其中图5中，M表示Marker；1表示变性上清；2表示目的蛋白洗脱峰。其中图6中，M表示Marker；1表示复性后上清；3表示目标蛋白洗脱峰)。

方法3：柱上复性

缓冲溶液：

平衡液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,8M脲，pH7.3

复性液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,pH7.3

洗脱液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3

再生液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,2.0M NaCl,pH7.3

平衡：CM或SP或其他型号阳离子层析柱用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将变性后的蛋白溶液上样。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

柱上复性：平衡液从100％至0％，复性液从0％至100％，缓冲液梯度交换16h以上。

洗脱：复性完成后，用3～5个柱体积洗脱液清洗层析柱，收取蛋白峰，测定蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测其纯度。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液冲洗层析柱。

平衡：用不含脲的平衡液平衡3～5个柱体积，待用。

肝素亲和层析：

层析介质：Heparin Sepharose亲和层析填料

缓冲溶液：平衡液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3

洗脱液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,1.2M NaCl,pH7.3

再生液-20mM PB,5mM EDTA-2Na,2.0M NaCl,pH7.3

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

上样：将离子交换柱层析收集的rhFGF22蛋白溶液上样。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，至基线稳定。

再生：清洗后用3～5个柱体积的再生液冲洗层析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5个柱体积，待用。

实施例4rhFGF22蛋白高效液相检测方法建立

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论板数应不低于2000；柱温25±1℃、恒温器4±1℃；以A相(0.1％TFA-水溶液：量取1.0mL三氟乙酸加水至1000mL，充分混匀)、B相(0.1％TFA-乙腈溶液：量取1.0mL三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000mL，充分混匀)为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱(10％～100％B相)，流速1mL/min。样品浓度为1mg/mL，上样量应不低于10μg，在波长280nm处检测。(见图7)

实施例5rhFGF22蛋白细胞活性检测方法建立

本发明根据rhFGF22蛋白具有特异性促进成纤维细胞有丝分裂的功能，采用细胞增殖法，选择小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3细胞)为靶细胞，结合MTT比色法检测蛋白体外生物学活性。用含10％(v/v)FBS、1％(v/v)双抗的DMEM培养。取对数生长期的NIH 3T3细胞，用胰酶消化计数后，按7～9×10³/孔的细胞铺板到96孔板，100μL维持培养液/孔，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h后，用含0.5％FBS的饥饿培养基继续培养24h。加入不同浓度的rhFGF22蛋白到96孔板中，继续培养48h后每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)再培养4h，吸掉孔中的液体，每孔加入100μL DMSO，振荡混匀3min～5min。用酶联免疫检测仪以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，记录测定结果。实验表明，纯化的rhFGF22蛋白在2.0ng/mL～32ng/mL浓度时，对NIH 3T3细胞具有显著的促增殖作用，并呈线性相关。(见图8)

实施例6rhFGF22蛋白对LO2细胞肝损伤模型的保护作用

加入终浓度为6mmol/L的H₂O₂溶液作用LO2细胞2h后再给予不同浓度(50ng/mL，100ng/mL，150ng/mL，200ng/mL)的rhFGF22蛋白继续培养24h，用MTT法检测细胞活性，并计算细胞存活率。结果如图9a和图9b所示(图9a中，*p<0.05,**P<0.01,***P<0.001与H₂O₂造模组比较，#P<0.05与空白对照组比较)，rhFGF22重组蛋白在100ng/mL～200ng/mL浓度范围内对肝损伤细胞模型有保护作用，且浓度为150ng/mL的保护效果最好。

实验结果表明，150ng/mL的rhFGF22蛋白可使细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)的活性含量降低，使受损的肝细胞得到有效保护，并呈现剂量依赖性。Western blot检测了rhFGF22蛋白介导的细胞凋亡的关键指标Caspase 3、Caspase 12、Bax、Bcl-1、Bcl-2。实验结果表明，Caspase-3、Caspase 12和Bax促凋亡基因的表达量下降，而Bcl-1、Bcl-2抑制凋亡基因的表达量上升，并且呈剂量依赖性。(见图10，其中*p<0.05,**P<0.01,***P<0.001与H₂O₂造模组比较，#P<0.05与空白对照组比较)

通过实施例4提供的检测方法发现，按照实施例1-3得到的rhFGF22蛋白，其纯度能够达到95％以上，又通过实施例6和7的方法发现，rhFGF22蛋白具有较高的生物学活性。因此，本发明通过基因优化、菌种构建、蛋白纯化等一些列过程，最终得到了纯度高、生物学活性好的rhFGF22蛋白。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 温州医科大学

<120> 重组人成纤维细胞生长因子-22的基因克隆、表达和应用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 447

<212> DNA

<213> Homo sapiens (human)

<400> 1

accccgagcg caagccgtgg tccgcgtagc tatccgcatc tggaaggcga tgtgcgttgg 60

cgccgcctgt ttagcagcac ccactttttt ctgcgcgttg acccgggtgg tcgcgttcag 120

ggtacccgtt ggcgccatgg tcaggatagc attctggaga ttcgcagcgt gcatgtgggt 180

gttgtggtga tcaaagccgt gagcagcggt ttttacgtgg ccatgaatcg ccgtggtcgt 240

ctgtatggca gccgcctgta taccgttgat tgccgctttc gcgagcgcat cgaagaaaac 300

ggccataaca cctacgccag ccaacgttgg cgtcgtcgcg gtcagccgat gtttctggcc 360

ctggatcgtc gtggtggtcc tcgtccgggt ggtcgtacac gtcgctatca tctgagcgcc 420

cattttctgc cggtgctggt gagctaa 447

<210> 2

<211> 447

<212> DNA

<213> Homo sapiens (human)

<400> 2

accccgagcg cgtcgcgggg accgcgcagc tacccgcacc tggagggcga cgtgcgctgg 60

cggcgcctct tctcctccac tcacttcttc ctgcgcgtgg atcccggcgg ccgcgtgcag 120

ggcacccgct ggcgccacgg ccaggacagc atcctggaga tccgctctgt acacgtgggc 180

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ctggacagga ggggggggcc ccggccaggc ggccggacgc ggcggtacca cctgtccgcc 420

cacttcctgc ccgtcctggt ctcctga 447

Claims

1.一种编码人成纤维细胞生长因子-22的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列。

2.包含权利要求1所述的核苷酸序列的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体源始于pET3a、pET3c、pET22b或pET28a。

4.根据权利要求 3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体源始于pET3a。

5.包含权利要求3或4所述的重组表达载体的重组表达菌株。

6.根据权利要求5所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株源始于大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株源始于BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3)或者Rosetta(DE3)pLysS。

8.根据权利要求7所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株源始于BL21(DE3)plysS。

9.重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括培养权利要求6-8任一项所述的重组表达菌株，诱导所述重组表达菌株表达所述重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白，经过包涵体变性、复性和分离纯化步骤，得到所述重组人成纤维细胞生长因子-22蛋白。

10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，

所述培养重组表达菌株，包括对所述重组表达菌株进行活化培养和扩增培养，接种至发酵罐中进行高密度培养；

所述包涵体变性采用两步变性方法；

所述分离纯化采用柱层析法。

11.根据权利要求10所述的生产方法，其特征在于，所述分离纯化采用阳离子交换柱层析和/或肝素亲和柱层析。

12.根据权利要求10所述的生产方法，其特征在于，

用于所述活化培养的活化培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为10 g/L；酵母粉，终浓度为5g/L；氯化钠，终浓度为10 g/L；

用于所述扩增培养的扩增培养基包括：胰蛋白胨，终浓度为10 g/L；酵母粉，终浓度为10 g/L；磷酸氢二钾，终浓度为3.0 g/L；磷酸二氢钾，终浓度为1.0 g/L；氯化钠，终浓度为4g/L；葡萄糖，终浓度为1 g/L。

13.权利要求1所述的核苷酸序列编码的人成纤维细胞生长因子-22蛋白在制备减轻由活性氧自由基诱导的肝细胞受损的药物中的应用。