CN107058332B - 一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用 - Google Patents
一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107058332B CN107058332B CN201710004159.4A CN201710004159A CN107058332B CN 107058332 B CN107058332 B CN 107058332B CN 201710004159 A CN201710004159 A CN 201710004159A CN 107058332 B CN107058332 B CN 107058332B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhfgf
- nucleic acid
- expression
- expression vector
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title abstract description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 52
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 36
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 25
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 22
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 21
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 21
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 15
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N lactose group Chemical group OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)CO)[C@H](O1)CO GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 44
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 23
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 abstract description 22
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 22
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 abstract description 19
- 230000011164 ossification Effects 0.000 abstract description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 4
- 208000037891 myocardial injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 44
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 29
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 26
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 24
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 14
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 9
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 7
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 7
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 7
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 7
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 7
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 6
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 6
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 6
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical group CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101001060265 Homo sapiens Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000008065 myocardial cell damage Effects 0.000 description 4
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 102000057237 human FGF6 Human genes 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 101150098999 pax8 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 2
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 2
- 102000003968 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 description 2
- 108700000707 bcl-2-Associated X Proteins 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101001060267 Homo sapiens Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000911513 Homo sapiens Uncharacterized protein FAM215A Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100446521 Mus musculus Fgf6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001060266 Mus musculus Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 102100026728 Uncharacterized protein FAM215A Human genes 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009067 heart development Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N octadecylsilane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[SiH3] YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种编码rhFGF‑6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用,涉及生物医药领域。本发明提供的编码rhFGF‑6的核酸片段根据FGF‑6的天然序列优化而得,在天然序列的基础上去除了37个信号肽,消除了不利于表达的二级结构,但是不改变FGF‑6的氨基酸序列,将此核酸片段构建到合适的载体构成重组表达载体,再将重组表达载体转化进入宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,用诱导剂进行诱导表达,能够高表达rhFGF‑6,并且表达的rhFGF‑6具有促进组织再生、促进骨生成、修复心肌损伤、促进创伤愈合、促进血管再生的活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体而言,涉及一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用。
背景技术
成纤维细胞生长因子-6(Fibroblast Growth Factor-6,FGF-6)是FGF家族成员之一,属FGF4亚家族(FGF4、FGF5、FGF6)。人FGF-6基因定位于人类染色体12p13,共有约15kb的三个外显子,其编码的蛋白由208个氨基酸残基组成单链多肽,N端有约37个氨基酸残基的疏水信号肽序列,成熟蛋白有171个氨基酸(38-208氨基酸残基),其理论分子质量为19kDa,等电点约为9.73。人FGF-6与鼠的氨基酸序列具有93.3%的高度同源性。哺乳动物FGF-6位点上的比较基因组学显示出人类、大鼠和小鼠FGF-6启动子是高度保守的。在结构上,FGF-6与FGF基因家族的其它成员是非常相似的,尤其与FGF-4(70%)、FGF-5(49%)具有高度的序列同源性。体内外的研究表明,FGF-6在分化发育、骨生成、肿瘤形成和其他细胞发育过程中也发挥着重要的作用。
先天性心脏病是指在胚胎发育时期由于心脏发育障碍而导致心脏形态、功能异常的疾病。Pax-8基因在调节心脏发育和心肌细胞凋亡的中有着重要作用,而Pax-8基因敲除小鼠的心脏中发现FGF-6的表达显著上调,表明FGF-6是Pax-8的下游基因而受到其调控。Lin S等将携带FGF-6基因的重组真核表达载体转染至大鼠H9C2心肌细胞中,使其得到有效过表达,测得心肌细胞的增殖能力变强,能抵抗由血清饥饿引起的细胞凋亡。(Zhang J,etal.Chinese Journal of Pathophysiology,2009,25(7):1292-1297;Gao Z,PLA MedicalJournal,2009,34(9):1082-1084;HuangX,ZhejiangX,Zhejiang.medicine,2010(11):1591-1593;L in S,et al.Journal of Wenzhou Medical College,2013,43(1):9-14.)
Grass等研究发现FGF-6和TGFβ-2可以协同刺激软骨结节的形成,诱导hMSC的定向分化与增殖,以应用到软骨组织修复中。Bosetti M等研究发现FGF-6可能是一个重要的调节骨生成和骨重构的因子,其在成骨细胞和破骨细胞中的活性证明了这一点,并推测FGF-6是通过RANKL激活MAP激酶的信号传导途径,随后激活破骨细胞,完成骨生成。(Hunziker EB,et al.OARS,2002,10(6):432-463;Dozin B,et al.MATRIX BIOL,2002,21(5):449-459;Jiang Y,Nature,2002,418(6893):41-49;Grass S,Development,1996,122(1):141-150;Bosetti M,J CELL PHYSIOL,2010,225(2):466-471.)
通常采用微生物发酵的方式生产rhFGF-6(recombinant human FGF-6,重组人FGF-6),但是现有技术中微生物发酵表达rhFGF-6的表达量以及所表达的rhFGF-6的活性都很低,难以满足规模化应用的需求。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种编码rhFGF-6的核酸片段,其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。该核酸片段消除了不利于表达的二级结构,并且不改变FGF-6的氨基酸序列。
本发明的目的之二在于提供一种包含上述编码rhFGF-6的核酸片段的表达载体,将该表达载体转化进入宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,用诱导剂进行诱导表达,能高表达rhFGF-6。
本发明的目的之三在于提供一种包含上述表达载体的宿主细胞,培养该宿主细胞,用诱导剂进行诱导表达,能高表达rhFGF-6。
本发明的目的之四在于提供一种运用包含上述核酸片段的宿主细胞生产rhFGF-6的方法,应用该方法生产的rhFGF-6表达量高,活性高。
本发明的目的之五在于提供rhFGF-6在制备促进肌肉组织再生、促进骨生成、修复心肌损伤、促进创伤愈合或促进血管再生的药物中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种编码rhFGF-6的核酸片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种表达载体,其包含上述的编码rhFGF-6的核酸片段。
含有上述的表达载体的宿主细胞。
一种生产rhFGF-6的方法,其包括将上述的编码rhFGF-6的核酸片段转化至宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,用诱导剂进行诱导表达,得到蛋白样品,蛋白样品经纯化处理后,得到纯净的rhFGF-6。
本发明实施例的一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用的有益效果是:本发明提供的编码rhFGF-6的核酸片段根据FGF-6的天然序列(如SEQID NO.2所示)优化而得,在天然序列的基础上去除了37个信号肽,消除了不利于表达的二级结构,但是不改变FGF-6的氨基酸序列,将此核酸片段构建到载体构成重组表达载体,再将重组表达载体转化进入宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,用诱导剂进行诱导表达,能够高表达rhFGF-6,并且表达的rhFGF-6具有促进肌肉组织再生、促进骨生成、修复心肌损伤、促进创伤愈合或促进血管再生的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中提供的pET3a-rhFGF-6的重组表达载体图;
图2为实施例2中提供的pET3a-rhFGF-6重组载体酶切鉴定图;
图3为实施例2中提供的rhFGF-6诱导表达的western blot鉴定以及SDS-PAGE分析图;
图4为实施例3中阳离子交换柱层析及肝素亲和柱层析的SDS-PAGE图;
图5为实施例3中纯化后的rhFGF-6的HPLC分析图;
图6为实施例6中MTT法测定rhFGF-6促进细胞增殖活性的验证图;
图7为实施例7中不同浓度rhFGF-6对氧化损伤模型的保护作用的验证图;
图8为实施例7中各组促增殖相关蛋白的western blot及灰度值分析图;
图9为实施例7中各组凋亡相关蛋白的western blot及灰度值分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用进行具体说明。
发明人优化了天然的FGF-6序列(如SEQ ID NO.2所示),去掉了37个信号肽,得到了优化后的核酸片段序列(如SEQ ID NO.1所示),该序列消除了不利于表达的二级结构,并且不改变FGF-6的氨基酸序列。
本发明提供了含有上述编码rhFGF-6的核酸片段的表达载体,将该表达载体转化进入宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,用诱导剂进行诱导表达,能高表达rhFGF-6。
优选的,该表达载体为原核表达载体。
优选的,该原核表达载体为pET3a、pET3c、pET14b或pET28a中的任意一种。
更优选的,该原核表达载体为pET3a。
本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞,培养该宿主细胞,用诱导剂进行诱导表达,能高表达rhFGF-6。
优选的,该宿主细胞选自大肠杆菌BL21、C41或Rosetta中的任意一种。
更优选的,该宿主细胞为BL21(DE3)plysS。
本发明提供了一种生产rhFGF-6的方法,其将上述的核酸片段转化至宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,用诱导剂进行诱导表达,得到蛋白样品,蛋白样品经纯化处理后,得到纯净的rhFGF-6。具体包括如下步骤:
(1)将上述核酸片段构建到上述表达载体,得到重组表达载体。
(2)将上述重组表达载体转化进入上述宿主细胞,得到重组菌。
(3)培养上述重组菌,用诱导剂进行诱导表达,得到蛋白样品,蛋白样品经纯化处理后,得到纯净的rhFGF-6。
具体地,培养重组菌包括:将重组菌以1:50-100(v:v)的比例接种至LB培养基中进行活化培养,培养至A600达到0.8-1.0,得到活化培养液;然后按1:10-20(v:v)的比例将活化培养液接种至含有磷酸盐缓冲对的LB培养基中进行扩大培养,培养至A600达到3-5,得到扩大培养液;再按1:10-20(v:v)的比例将扩大培养液接种至含有罐内培养基的发酵罐中,并加入无机盐及生长因子,以温度37℃、pH值6.8-7.0、调节搅拌转数和通气量以及流加碳源保持DO>25%,至A600达到20-25(对数生长中期);加入诱导剂进行诱导表达。
诱导剂可选用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或乳糖。
优选的,所用诱导剂为乳糖,并且乳糖的终浓度为28-32mM。
IPTG是外源蛋白高效表达的诱导剂,但其价格昂贵且对人体有潜在毒性,而乳糖廉价易得且无毒,这对于重组外源蛋白的工程化生产具有重要意义。本发明中,乳糖诱导外源蛋白表达量与IPTG诱导效果相当,但其产物量则大大超过IPTG诱导,外源蛋白的可溶性表达量也有所增加。
优选的,诱导表达的条件为:pH7.0-7.2,33-35℃下,诱导表达4h-6h。
具体地,变性处理以及纯化包括如下步骤:
(1)菌体的收集以及破碎
诱导表达结束后,低温高速离心收集菌体,-20℃冻存备用。将菌体室温融化后,以1:20-40(g:mL)比例充分悬浮于细胞裂解缓冲液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,1mM PMSF,5mM DTT,pH7.5),进行高压均质。镜检下可见视野范围内无完整大肠杆菌后,低温高速离心,弃上清,收集沉淀。
(2)包涵体清洗
取上述沉淀,加入10-20倍(g:mL)量清洗缓冲液1(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1MNaCl,1%Triton X-100,0.5%去氧胆酸钠,pH7.3)室温充分搅拌洗涤后低温高速离心,弃上清,收集沉淀。再加入10-20倍(g:mL)量清洗缓冲液2(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1MNaCl,1%Triton X-100,pH7.3)室温充分搅拌洗涤后,低温高速离心,弃上清,收集沉淀。再加入10-20倍(g:mL)量清洗缓冲液3(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,2M脲,pH7.3),室温充分搅拌洗涤后,低温高速离心,弃上清,收集沉淀即为包涵体。
(3)包涵体变性
称取适量包涵体,加入10-20倍(g:mL)量变性缓冲液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,8M脲,pH7.3),充分悬浮,并在磁力搅拌条件下低温溶解过夜后,低温高速离心去除未溶物,即得包涵体的变性溶液。
(4)包涵体的纯化
包涵体的纯化包括复性后纯化、纯化后复性以及柱上复性三种方法。
其中,包涵体的复性包括稀释复性和透析复性两种方法,具体地:
(A)稀释复性:取包涵体变性溶液,在4℃磁力搅拌条件下,缓慢滴入10-40倍(v:v)体积复性缓冲液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,pH7.3),复性过程18h-24h。复性完毕,低温高速离心去除沉淀或采用中空纤维超滤装置进行初步分离,所采用的截留分子量为10KD。
(B)透析复性:取包涵体变性溶液,装入截留分子量为7KD的透析袋中,在低温磁力搅拌条件下,放入20-50倍(v:v)复性缓冲液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,5mMDTT,pH7.3),复性液中还可添加氧化/还原型谷胱甘肽、精氨酸或甘油。8h-12h小时更换复性液,共3-4次。复性完毕,低温高速离心去除沉淀或采用中空纤维超滤装置进行初步分离,所采用的截留分子量为10KD。
复性后纯化,即将变性后的包涵体溶液经上述复性方法复性后,先后经过阳离子交换层析以及肝素亲和层析纯化,得到纯净的rhFGF-6。
纯化后复性,即将变性后的包涵体溶液经阳离子交换层析,经上述复性方法复性后,最后再进行肝素亲和层析,得到纯净的rhFGF-6。
柱上复性,即将变性后的包涵体溶液先经阳离子交换层析柱上复性及纯化,再经肝素亲和层析纯化,得到纯净的rhFGF-6。
上述三种方法中,阳离子交换层析所用的填料为CM或SP阳离子交换填料,肝素亲和层析所用的填料为Heparin Sepharose亲和层析填料。
本发明还提供了采用上述方法制备的rhFGF-6的生物学活性检测方法。
首先,用MTT比色法检测了rhFGF-6对小鼠胚胎成纤维细(NIH3T3)、小鼠成肌细胞(C2C12)以及大鼠心肌细胞(H9C2)的增殖的影响。结果显示,rhFGF-6具有良好的促进成纤维细胞及成肌细胞增殖的活性,但对正常心肌细胞增殖活性不明显。然后,用MTT比色法以及免疫印迹分析(western blot)检测了rhFGF-6对双氧水导致的心肌细胞损伤的修复作用。结果显示,rhFGF-6具有良好的修复心肌细胞损伤的作用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例中提供一种编码rhFGF-6的核酸片段。
该核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该序列由人FGF-6的天然序列(如SEQ ID NO.2所示)根据大肠杆菌偏好性进行密码子优化,去除了37个信号肽,消除了不利于表达的二级结构,但不改变FGF-6的氨基酸序列。
将本实施例提供的核酸片段构建到表达载体,并将此重组表达载体转化到宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,用诱导剂进行诱导表达,能获得高表达rhFGF-6。
实施例2
本实施例提供一种生产rhFGF-6的方法,包括如下步骤:
2.1构建重组表达载体
合成rhFGF-6基因,在编码rhFGF-6的核酸片段(SEQ ID NO.1)的5’端与3’端分引入起始密码子和终止密码子,并引入特异性酶切位点NdeⅠ和BamHⅠ。
37℃下用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切分别处理表达载体pET3a和rhFGF-6基因,酶切4h。
回收相应的酶切片段,用T4DNA连接酶16℃连接过夜,构建重组表达载体。pET3a-rhFGF-6重组表达载体图如图1所示。
2.2重组表达载体的转化及鉴定
将重组表达载体pET3a-FGF-6转化进入宿主细胞:大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,在含有载体抗性的LB平板上挑选阳性克隆,并进行质粒双酶切(酶切位点是NdeⅠ和BamHⅠ)鉴定。
鉴定结果如图2所示(图中,M1为DNA Marker DL 15000;1为FGF6cDNA;2为pET-3a空载体;3、4分别为pET-3a-FGF6重组表达载体;M2为DNA Marker DL 2000)。重组表达载体经酶切后,在500bp附近出现条带,表明编码rhFGF-6的核酸片段正确插入载体中。
对克隆序列进行正向、逆向序列分析测定,测定结果证实克隆序列与设计序列完全一致。即本步骤中成功构建了pET3a-rhFGF-6重组表达载体,并将其转化进入宿主细胞BL21(DE3)plysS中,得到重组菌pET3a-rhFGF-6/BL21(DE3)plysS。
2.3培养重组菌(pET3a-rhFGF-6/BL21(DE3)plysS),诱导表达rhFGF-6
2.3.1活化培养
将pET3a-rhFGF-6/BL21(DE3)plysS重组菌以1:100(v:v)的比例接种至LB培养基(包括:10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母粉,10g/L氯化钠)中进行活化培养,培养至A600达到1.0,得到活化培养液。
2.3.2扩大培养
按1:20(v/v)的比例将活化培养液接种至含有磷酸盐缓冲对的LB培养基(包括:23g/L胰蛋白胨,17g/L酵母粉,3.5g/L磷酸氢二钾,1.2g/L磷酸二氢钾,4g/L氯化钠,2g/L葡萄糖)中进行扩大培养,培养至A600达到5,得到扩大培养液。
2.3.3罐内培养
按1:20(v/v)的比例将扩大培养液接种至含有罐内培养基(包括:23g/L胰蛋白胨,17g/L酵母粉,3.5g/L磷酸氢二钾,1.2g/L磷酸二氢钾,4g/L氯化铵,1g/L硫酸镁,0.02g/L氯化钙,0.01g/L维生素B1,5g/L葡萄糖以及适量微量元素)的发酵罐中,并加入无机盐及生长因子,温度37℃、pH值7.0、调节搅拌转数和通气量以及加碳源保持DO>25%,至A600达到25(对数生长中期)。
2.3.4诱导培养
加入乳糖作为诱导剂,保持终浓度为28mM进行诱导,加入后温度控制在33℃、pH值7.1、并通过调节搅拌转数和通气量以及加碳源、氮源及磷酸盐缓冲溶液保持DO>25%,诱导培养3h-6h。
培养重组菌全过程中,每小时取样测A600值,并在诱导前进行镜检。诱导后每小时留样进行SDS-PAGE检测以及western blot鉴定。
SDS-PAGE检测以及western blot鉴定结果如图3所示。其中,图3-A为westernblot鉴定图(1、2、3、4、5的样品分别取自诱导前、诱导3h、4h、5h、6h的培养液),图3-B为SDS-PAGE检测分析图(1、2、3、4、5的样品分别取自诱导前、诱导3h、4h、5h、6h的培养液,M为蛋白质分子量标准品)。
由图3-A和图3-B可知,加入乳糖诱导前,重组菌不表达rhFGF-6,诱导后rhFGF-6表达量持续增长,且诱导后6h的rhFGF-6产量及表达量最多。
2.4菌体的收集及破碎
2.4.1菌体的收集
于4℃,9000r/min离心10min收集菌体,收集的菌体-20℃冻存备用。
2.4.2菌体的破碎
将室温冻融的菌体以1:40(g:mL)比例充分悬浮于细胞裂解缓冲液(20mM PB,2mMEDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,1mM PMSF,5mM DTT,pH7.5),进行高压均质。以300bar循环1次,再以800bar均质2次,镜检在可见视野范围内无完整大肠杆菌后,4℃,9000r/min离心40min,弃上清,收集沉淀。
2.5包涵体的清洗及变性
2.5.1包涵体的清洗
取上述沉淀,加入20倍(g:mL)量清洗缓冲液1(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1MNaCl,1%Triton X-100,0.5%去氧胆酸钠,pH7.3),室温充分搅拌洗涤2h后,4℃,9000r/min离心30min,弃上清,收集沉淀。再加入20倍(g:mL)量清洗缓冲液2(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,pH7.3),室温充分搅拌洗涤2h后,4℃,9000r/min离心30min,弃上清,收集沉淀。再加入20倍(g:mL)量清洗缓冲液3(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1MNaCl,1%Triton X-100,2M脲,pH7.3),室温充分搅拌洗涤2h后,4℃,9000r/min离心30min,弃上清,收集沉淀即为包涵体。
2.5.2包涵体的变性
称取适量包涵体,加入20倍量(g:mL)变性缓冲液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1MNaCl,1%Triton X-100,8M脲,pH7.3),充分悬浮,并在磁力搅拌条件下4℃溶解过夜。4℃,9000r/min离心30min,去除未溶物,即得包涵体的变性溶液。
2.6包涵体的复性
取上述包涵体的变性溶液,先经过阳离子交柱换层析柱上复性及纯化,再经过肝素亲和柱层析纯化,得到rhFGF-6。
2.6.1阳离子交换柱层析
阳离子交换柱层析的层析介质选用CM或SP阳离子交换层析填料。具体地:
用5个柱体积的平衡液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,8M脲,0.1M NaCl,pH7.3)平衡层析柱至基线稳定。
将包涵体的变性溶液上样。
用5个柱体积的平衡液平衡层析柱至基线稳定。
用100%-0%(v/v)的平衡液以及0%-100%(v/v)的复性液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,pH7.3)进行梯度复性。此过程中,开始阶段,平衡液输出100%,复性液输出0%;随后进行梯度洗脱,平衡液输出逐渐减少最终为0%,复性液输出逐渐增加最终为100%,此过程需要12h以上。
复性完成后,用5个柱体积洗脱液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3)清洗层析柱,收取蛋白峰,测定蛋白含量,并进行SDS-PAGE检测其纯度。
2.6.2肝素亲和柱层析
肝素亲和柱层析的层析介质选用Heparin Sepharose亲和层析填料。具体地:
用5个柱体积的平衡液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3)平衡层析柱至基线稳定。
将经阳离子交换柱层析收集的蛋白洗脱液上样。
用5个柱体积的平衡液平衡层析柱至基线稳定。
用5个柱体积洗脱液1(20mM PB,2mM EDTA-2Na,1.2M NaCl,pH7.3)清洗层析柱,去除杂蛋白。
用5个柱体积洗脱液2(20mM PB,2mM EDTA-2Na,2.0M NaCl,pH7.3)清洗层析柱收取蛋白峰,测定蛋白含量,并进行SDS-PAGE检测其纯度。
实施例3
本实施例提供一种生产rhFGF-6的方法,包括如下步骤:
构建表达载体、重组表达载体的转化及鉴定、培养重组菌,诱导表达rhFGF-6、菌体的收集及破碎、包涵体的清洗及变性与实施例2中提供的步骤与方法基本相同,其区别在于,本实施例中诱导培养的条件为:乳糖浓度保持30mM,温度为34℃,pH 7.0。除此之外,本实施例提供的生产rhFGF-6的方法还包括:
3.1包涵体的复性
取包涵体变性溶液,装入截留分子量为7KD的透析袋中,在4℃磁力搅拌条件下,放入50倍(v:v)复性缓冲液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,5mMDTT,pH7.3),复性液中还可添加氧化/还原型谷胱甘肽、精氨酸、甘油等。12h更换复性液,共4次,得到包涵体复性溶液。复性完毕,离心去除沉淀或采用中空纤维超滤装置进行初步分离,所采用的截留分子量为10KD。
3.2阳离子交换柱层析
阳离子交换柱层析的层析介质选用CM或SP阳离子交换层析填料。具体地:
用5个柱体积的平衡液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,pH7.3)平衡层析柱至基线稳定。
将包涵体复性溶液上样。
用5个柱体积的平衡液平衡层析柱至基线稳定。
用5个柱体积洗脱液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.6M NaCl,pH7.3)清洗层析柱,收取蛋白峰,测定蛋白含量,并进行SDS-PAGE检测其纯度。
3.3肝素亲和柱层析
所用材料以及方法均同实施例2中肝素亲和层析部分。
经阳离子柱层析的rhFGF-6以及肝素亲和柱层析后的rhFGF-6的SDS-PAGE检测图如图4所示。图4-A(1、2、3的样品分别取自变性上清、上样穿出液、目的蛋白洗脱峰,M为Marker)为经阳离子柱层析的rhFGF-6的SDS-PAGE检测图。变性上清中,含有杂蛋白较多,上样穿出液中没有目的蛋白条带,表明目的蛋白与层析介质结合,目的蛋白洗脱峰的目的条带明显,说明目的蛋白rhFGF-6被洗脱下来。图4-B(1、2、3、4的样品分别取自复性后上清、上样穿出液、杂质峰、目的蛋白洗脱峰,M为Marker)为经肝素亲和柱层析的rhFGF-6的SDS-PAGE检测图,只有1和4有目的条带,并且4没有杂蛋白条带,说明rhFGF-6被高度纯化。
对纯化后的rhFGF-6进行高效液相检测,具体操作如下:
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,理论板数应不低于2000;柱温25±1℃、恒温器4±1℃;以A相(0.1%TFA-水溶液:量取1.0mL三氟乙酸加水至1000mL,充分混匀)、B相(0.1%TFA-乙腈溶液:量取1.0mL三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000mL,充分混匀)为流动相,在室温条件下,进行梯度洗脱(10-100%B相),流速1mL/min。样品浓度为1mg/mL,上样量应不低于10μg,在波长280nm处检测。
检测结果如图5所示。样品经过此两步纯化,即离子交换柱层析、肝素亲和柱层析,纯度提高至95%以上。
实施例4
本实施例提供一种生产rhFGF-6的方法,包括如下步骤:
构建表达载体、重组表达载体的转化及鉴定、培养重组菌,诱导表达rhFGF-6、菌体的收集及破碎、包涵体的清洗及变性与实施例2中提供的步骤与方法基本相同,其区别在于,本实施例中诱导培养的条件为:乳糖浓度保持32mM,温度为35℃,pH 7.2。除此之外,本实施例提供的生产rhFGF-6的方法还包括:
4.1阳离子交换柱层析
阳离子交换柱层析的层析介质选用CM或SP阳离子交换层析填料。具体地:
用5个柱体积的平衡液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,8M脲,0.1M NaCl,pH7.3)平衡层析柱至基线稳定。
将包涵体变性溶液上样。
用5个柱体积的平衡液平衡层析柱至基线稳定。
用5个柱体积洗脱液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,8M脲,0.3M NaCl,pH7.3)清洗层析柱,收取蛋白峰,测定蛋白含量,并进行SDS-PAGE检测其纯度。
4.2复性
取经阳离子交换柱层析的蛋白溶液,在4℃磁力搅拌条件下,缓慢滴入40倍体积(v:v)复性缓冲液(20mM PB,2mM EDTA-2Na,0.1M NaCl,1%Triton X-100,pH7.3),复性24h,得到复性溶液。复性完毕,离心去除沉淀或采用中空纤维超滤装置进行初步分离,所采用的截留分子量为10KD。
4.3肝素亲和柱层析
对复性溶液进行肝素亲和柱层析。所用材料以及方法均同实施例2中肝素亲和层析部分。
实施例5
本实施例提供一种优化的表达载体与宿主细胞的组合。
按照实施例2中2.1的方法,将实施例1提供的核酸片段,分别构建到载体pET3a、pET3c、pET14b、pET28a中,得到重组载体pET3a-rhFGF-6、pET3c-rhFGF-6、pET14b-rhFGF-6、pET28a-rhFGF-6。并将这些重组载体分别转化进入宿主细胞:大肠杆菌C41(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS,得到一系列重组菌。
按照实施例2中的方法培养这些重组菌,在相同条件诱导表达rhFGF-6,并进行SDS-PAGE检测以及Western blot鉴定。
结果表明,将核酸片段构建到载体pET3a,并且将重组表达载体pET3a-rhFGF-6转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS时,得到重组菌pET3a-rhFGF-6/BL21(DE3)plysS,rhFGF-6的表达量最高,占菌体总蛋白量20.1%。相同条件下,pET3a-rhFGF-6/BL21(DE3)、pET3a-rhFGF-6/C41(DE3)pLysS、pET3a-rhFGF-6/Rosetta(DE3、pET3a-rhFGF-6/Rosetta(DE3)pLysS中rhFGF-6的表达量占菌体总蛋白量的比例分别为18.2%、15.4%、10.1%及11.8%。
由此可见,将本发明提供的编码rhFGF-6的核酸片段构建到表达载体pET3a得到重组表达载体pET3a-rhFGF-6,将此重组表达载体转入进入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)pLysS得到重组菌pET3a-rhFGF-6/BL21(DE3)plysS,培养该重组菌,用浓度为28-32mM的乳糖诱导表达rhFGF-6,可使表达的rhFGF-6的含量占菌体总蛋白含量的20.1%。
实施例6
本实施例提供了rhFGF-6在促进细胞增殖中的应用。分别考察了rhFGF-6对NIH3T3、C2C12、H9C2的增殖的影响。其包括如下步骤:
6.1细胞传代培养
维持培养液:含10%(v/v)胎牛血清(FBS)、1%(v/v)双抗(青霉素-链霉素)的DMEM。
用维持培养液分别培养上述三种细胞。取对数生长期的细胞,用胰酶消化计数后,按8×103/孔的细胞铺板到96孔板,每孔加入100μL维持培养液,于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h。
6.2饥饿培养
用含0.5%FBS(其余成分同维持培养液)的饥饿培养基继续培养24h。
6.3MTT试验
加入不同浓度(2、4、8、16、32、64、128、256ng/mL)的rhFGF-6蛋白到96孔板中,并且分别设置阴性对照孔和阳性对照孔,其中阴性对照孔分别加入相同梯度浓度的PBS,阳性对照孔分别加入相同梯度浓度的aFGF(酸性成纤维细胞生长因子)或bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)。加入后继续培养48h后每孔加入25μL的MTT(5mg/mL),再培养4h,吸掉孔中的液体,每孔加入150μL DMSO,震荡15min,使结晶物充分溶解,用酶联免疫检测仪在490nm下测定各孔吸光度。
rhFGF-6促进细胞增殖的结果如图6所示。图6-A为rhFGF-6对NIH3T3增殖活性的影响图(a、b、c、d分别为不同浓度的rhFGF-6、aFGF、bFGF、PBS对NIH3T3增殖活性的影响曲线),图6-B为rhFGF-6对H9C2增殖活性的影响图(a、b、c、d分别为不同浓度的rhFGF-6、aFGF、bFGF、PBS对H9C2增殖活性的影响曲线),图6-C(a、b、c分别为不同浓度的rhFGF-6、aFGF(对照品)、PBS对C2C12增殖活性的影响曲线)为rhFGF-6对C2C12增殖活性的影响图。
MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸光度值,可间接反映活细胞数量,吸光度值越高,活细胞数越多。
rhFGF-6对正常H9C2细胞无明显促增殖活性,对NIH3T3以及C2C12细胞的促进作用呈剂量依赖性。rhFGF-6浓度在1.5ng/ml-25ng/ml时,对C2C12细胞具有显著的促增殖作用,并呈线性相关。
实施例7
本实施例提供rhFGF-6在双氧水导致的心肌细胞损伤的修复中的应用。其包括如下步骤:
7.1细胞传代培养
维持培养液:含10%(v/v)胎牛血清(FBS)、1%(v/v)双抗(青霉素-链霉素)的DMEM。
用维持培养液培养H9C2。取对数生长期的H9C2,用胰酶消化计数后,按8×103/孔的细胞铺板到96孔板,每孔加入100μL维持培养液,于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h。
7.2制备H9C2氧化损伤模型
取对数生长期的H9C2细胞,按1×104/孔的细胞铺板到96孔板,每孔加入100μL维持培养液,于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h后,用含0.5%FBS的饥饿培养基继续培养24h。将双氧水按终浓度为0μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、400μM加入到96孔板中,继续培养12h后,利用MTT法测定各孔吸光度。根据如下公式计算存活率:
存活率(%)=(双氧水处理组吸光度-空白对照组吸光度)/(正常对照组吸光度-空白对照组吸光度)×100%
7.3不同浓度的rhFGF-6蛋白对氧化损伤模型的保护作用
将rhFGF-6、aFGF和bFGF按终浓度为25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL加入到96孔板中,培养2h后加入终浓度为200μM的双氧水继续培养12h,利用MTT法测定各孔吸光度。根据上述公式计算存活率。
7.4氧化损伤模型中LDH活性和MDA含量的检测
取对数生长期的H9C2细胞,按2×105/孔的细胞铺板到6孔板上,每孔加入2mL维持培养液,于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h后,用含0.5%FBS的饥饿培养基继续培养24h。将rhFGF-6、aFGF和bFGF按终浓度为25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL加入到6孔板中,培养2h后加入200μM的双氧水继续培养12h。将每组细胞按照LDH试剂盒(购自南京建成生物技术有限公司,货号:A020-2)和MDA试剂盒(购自南京建成生物技术有限公司,货号:A003-4)说明书进行活性和含量的测定。
7.5蛋白提取及western blot分析
H9C2细胞先用rhFGF-6按终浓度为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL培养2h后,加入200μM的双氧水继续培养12h。取出H9C2细胞,吸出原有细胞培养液,用PBS冲洗三次。6孔板每孔加入200μL细胞裂解液,吹打数下。将细胞裂解液铺匀,冰上放置30min。然后12000g,4℃,离心30min,取上清液。取一部分上清液用BCA法测定总蛋白浓度,剩余分装后置于-80℃备用。利用western blot方法研究不同浓度的rhFGF-6对氧化损伤的H9C2细胞的保护作用。所用抗体为兔抗人ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、Caspase-3、Bcl-2、Bax、和β-actin(内参)一抗(1:800)及抗兔二抗(1:8000)。对各组蛋白灰度扫描后,按如下公式进行灰度值分析:
相对灰度值=(样品灰度值-背景灰度值)/(内参灰度值-背景灰度值)
rhFGF-6对氧化损伤模型的修复如图7-9所示。图中,##表示:与control(对照组)组比较,P﹤0.01;*表示:与氧化损伤模型组比较,P﹤0.05,**表示:与氧化损伤模型组比较,P﹤0.01。
图7-A为MTT比色法检测rhFGF-6对氧化损伤模型的增殖促进结果图,rhFGF-6对氧化损伤模型组的细胞增殖能力有明显的促进作用,0-200ng/mL范围内,浓度越高,rhFGF-6促进氧化损伤模型增殖作用越强。图7-B为rhFGF-6对氧化损伤模型的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)活性影响图。氧化损伤模型中LDH活性明显较正常细胞偏高,rhFGF-6可降低氧化损伤模型的LDH的活性,0-200ng/mL内,rhFGF-6浓度越高,降低LDH活性的作用越强。图7-C为rhFGF-6对氧化损伤模型中总丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影响图。氧化损伤模型中MDA的含量明显高于正常细胞,rhFGF-6可降低氧化损伤模型的MDA的含量,0-200ng/mL内,rhFGF-6浓度越大,降低MDA含量的作用越强。
ERK1/2以及p38MAPK蛋白的磷酸化水平是rhFGF-6介导的促增殖作用的相关指标;Caspase 3、Bax、Bcl-2是细胞凋亡的关键指标。图8-A为rhFGF-6对氧化损伤模型中磷酸化的ERK1/2的表达水平的影响图。氧化损伤模型中磷酸化的ERK1/2的表达水平明显低于正常细胞,rhFGF-6可提高磷酸化的ERK1/2的表达水平,0-200ng/mL内,浓度越高,提高磷酸化的ERK1/2的表达水平的能力越强;图8-B为rhFGF-6对氧化损伤模型中磷酸化的p38MAPK的表达水平的影响图。氧化损伤模型中磷酸化的p38MAPK的表达水平明显低于正常细胞,rhFGF-6可提高磷酸化的p38MAPK的表达水平,0-200ng/mL内,浓度越高,提高磷酸化的p38MAPK的表达水平的能力越强。即rhFGF-6对心肌细胞损伤具有保护作用并且这种保护作用呈剂量依赖性。
图9-A为rhFGF-6对氧化损伤模型中Caspase-3的表达水平的影响图。氧化损伤模型中Caspase-3的表达水平明显高于正常细胞,rhFGF-6可降低Caspase-3的表达水平,0-200ng/mL内,浓度越高,降低Caspase-3的表达水平的能力越强。图9-B为rhFGF-6对氧化损伤模型中Bax的表达水平的影响图。氧化损伤模型中Bax的表达水平明显高于正常细胞,rhFGF-6可降低Bax的表达水平,0-200ng/mL内,浓度越高,降低Bax的表达水平的能力越强。图9-C为rhFGF-6对氧化损伤模型中Bcl-2是的表达水平的影响图。氧化损伤模型中Bcl-2的表达水平明显低于正常细胞,rhFGF-6可提高Bcl-2的表达水平,0-200ng/mL内,浓度越高,提高Bcl-2的表达水平的能力越强。进一步表明rhFGF-6具有保护和修复受损心肌细胞的功能。
综上所述,本发明提供的编码rhFGF-6的核酸片段根据FGF-6的天然序列优化而得,在天然序列的基础上去除了37个信号肽,消除了不利于表达的二级结构,但是不改变FGF-6的氨基酸序列,将此核酸片段构建到载体构成重组表达载体,再将重组表达载体转化进入宿主细胞,得到重组菌,培养该重组菌,能够高表达rhFGF-6,并且表达的rhFGF-6具有促进肌肉组织再生、促进骨生成、修复心肌损伤、促进创伤愈合、促进血管再生的活性。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 温州医科大学
<120> 一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagtccgg ccggtacccg cgcaaataat accctgctgg atagccgtgg ctggggtacc 60
ctgttaagcc gtagccgtgc aggtctggcc ggtgaaattg ccggcgtgaa ttgggaaagc 120
ggttacctgg ttggcatcaa acgtcagcgc cgtctgtact gcaatgtggg cattggcttc 180
catctgcagg tgctgccgga tggtcgcatt agcggcaccc atgaagagaa cccgtatagc 240
ctgctggaaa tcagcaccgt ggaacgcggc gttgtgagcc tgtttggtgt gcgcagcgcc 300
ctgtttgtgg ccatgaacag caaaggccgc ctgtatgcca ccccgagctt tcaagaagaa 360
tgcaaattcc gcgagacact gctgccgaac aattacaacg cctacgagag cgacctgtat 420
cagggtacct atatcgccct gagcaagtat ggtcgcgtga aacgtggcag caaagtgagc 480
ccgattatga ccgtgaccca ctttctgccg cgcatttaat aa 522
<210> 2
<211> 522
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
atgtcgcctg caggcacccg tgccaacaac acgctgctgg actcgagggg ctggggcacc 60
ctgctgtcca ggtctcgcgc ggggctagct ggagagattg ccggggtgaa ctgggaaagt 120
ggctatttgg tggggatcaa gcggcagcgg aggctctact gcaacgtggg catcggcttt 180
cacctccagg tgctccccga cggccggatc agcgggaccc acgaggagaa cccctacagc 240
ctgctggaaa tttccactgt ggagcgaggc gtggtgagtc tctttggagt gagaagtgcc 300
ctcttcgttg ccatgaacag taaaggaaga ttgtacgcaa cgcccagctt ccaagaagaa 360
tgcaagttca gagaaaccct cctgcccaac aattacaatg cctacgagtc agacttgtac 420
caagggacct acattgccct gagcaaatac ggacgggtaa agcggggcag caaggtgtcc 480
ccgatcatga ctgtcactca tttccttccc aggatctaat ga 522
Claims (4)
1.一种生产rhFGF-6的方法,其特征在于,其包括:将编码rhFGF-6的如SEQ ID NO.1所示的核酸片段构建到pET3a表达载体上,然后转化至宿主细胞,得到重组菌,培养所述重组菌,用诱导剂进行诱导表达,得到蛋白样品,所述蛋白样品经纯化处理后,得到纯净的所述rhFGF-6,所述宿主细胞为BL21(DE3)plysS。
2.根据权利要求1所述的生产rhFGF-6的方法,其特征在于,所述诱导剂为乳糖。
3.根据权利要求2所述的生产rhFGF-6的方法,其特征在于,所述诱导表达的条件为:在所述重组菌的对数生长中期,加入所述乳糖至终浓度为28-32mM,在pH7.0-7.2,33-35℃条件下,培养4h-6h。
4.根据权利要求1所述的生产rhFGF-6的方法,其特征在于,所述纯化处理是:将变性后的所述蛋白样品进行复性后经过CM或SP离子交换、再经肝素柱层析获得纯净的所述rhFGF-6;或将变性后的所述蛋白样品经过CM或SP离子交换,进行复性后再经肝素柱层析获得纯净的所述rhFGF-6;或将变性后的所述蛋白样品经CM或SP离子交换进行柱上复性、纯化,再经肝素柱层析获得纯净的所述rhFGF-6;所述变性处理是:用变性缓冲液对所述蛋白样品进行处理,使所述蛋白样品变性、溶解。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710004159.4A CN107058332B (zh) | 2017-01-04 | 2017-01-04 | 一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710004159.4A CN107058332B (zh) | 2017-01-04 | 2017-01-04 | 一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107058332A CN107058332A (zh) | 2017-08-18 |
CN107058332B true CN107058332B (zh) | 2021-03-23 |
Family
ID=59624491
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710004159.4A Active CN107058332B (zh) | 2017-01-04 | 2017-01-04 | 一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107058332B (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104293821A (zh) * | 2014-08-13 | 2015-01-21 | 温州医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子-20的基因克隆、表达及应用 |
CN105176908A (zh) * | 2015-10-23 | 2015-12-23 | 温州医科大学 | 一种重组人成纤维细胞生长因子(fgf)-18的生产方法 |
CN105200085A (zh) * | 2015-10-23 | 2015-12-30 | 温州医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途 |
-
2017
- 2017-01-04 CN CN201710004159.4A patent/CN107058332B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104293821A (zh) * | 2014-08-13 | 2015-01-21 | 温州医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子-20的基因克隆、表达及应用 |
CN105176908A (zh) * | 2015-10-23 | 2015-12-23 | 温州医科大学 | 一种重组人成纤维细胞生长因子(fgf)-18的生产方法 |
CN105200085A (zh) * | 2015-10-23 | 2015-12-30 | 温州医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
林素等.FGF6基因高表达对鼠心肌细胞凋亡和增殖的影响.《温州医学院学报》.2013,第43卷(第1期), * |
谭亚清等.人酸性成纤维细胞生长因子的研究进展.《生物技术通报》.2013,(第5期), * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107058332A (zh) | 2017-08-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
CN109575126B (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
KR100205078B1 (ko) | 염기성 섬유 아세포 성장인자 및 이의 생산방법 | |
CN109593127B (zh) | 基因重组胶原样肽mjlgg-34及其制备方法与应用 | |
EP2753704A1 (en) | Collagen 7 and related methods | |
CN110950967B (zh) | 抗人血清白蛋白纳米抗体与il-2融合蛋白及制备方法 | |
CN109021086B (zh) | 一种抗菌肽天蚕素a突变体及其编码基因、制备方法和应用 | |
CN113683679A (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l6t及其制备方法和用途 | |
CN101914561B (zh) | 一种具有抗菌和修复功能的融合蛋白及其生产方法和应用 | |
CN116333097A (zh) | 一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用 | |
US20220315635A1 (en) | Amino acid sequence of recombinant human bone morphogenetic protein-2 | |
CN107446941A (zh) | 基于自聚集短肽诱导的天蚕素a抗菌肽及其制备方法 | |
RU2354702C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS11, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК-ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS11, ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS11 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | |
CN111423516B (zh) | 一种蛋白及其在创口修复及抑菌中的应用 | |
CN116836263B (zh) | 一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统 | |
CN107058332B (zh) | 一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用 | |
CN113735959A (zh) | 一种新型治疗nash的fgf类似物 | |
CZ98297A3 (cs) | Způsob purifikace keratinocytových růstových faktorů | |
CN116874590A (zh) | 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法 | |
CN108484749B (zh) | 一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法 | |
CN101235084A (zh) | 一种制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法 | |
CN113024675A (zh) | 一种hb-nc4重组蛋白及其制备方法与应用 | |
CN101775404A (zh) | 一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法 | |
CN117466992B (zh) | 一种纤连蛋白突变体及其制备和应用 | |
CN117886922B (zh) | 一种重组人源纤连蛋白及其表达体系 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |