CN108324928A - 重组人成纤维细胞生长因子-5在促骨折愈合中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组人成纤维细胞生长因子‑5(rhbFGF5)在制备促骨折愈合药物中的应用。本发明将含有rhbFGF5的胶原海绵固定于开放性小鼠股骨骨折断端。结果显示rhbFGF5显著促进骨折断端的成骨细胞、骨小梁以及骨痂生成，缩短骨折愈合的进程，减少骨折并发症的发生。在离体水平实验结果显示，rhbFGF5能够显著升高碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、骨形态发生蛋白‑2(BMP2)等骨折愈合标志性分子的mRNA表达水平，并促进骨髓间充质干细胞增殖、迁移、分化，同时能促进成熟成骨细胞增殖。本发明的提出为rhbFGF5能够成为治疗骨折的药物提供了有力的理论依据，为临床上促进骨折愈合提供了更有效的治疗手段，并且具有安全、有效、操作简便易行的特点，对于临床骨折愈合的治疗具有重要的实际意义。

Description

重组人成纤维细胞生长因子-5在促骨折愈合中的应用

技术领域

本发明涉及重组人成纤维细胞生长因子-5的新用途，特别涉及重组人成纤维细胞生长因子-5在促骨折愈合中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

骨折是临床上常见的外源性创伤，随着我国人口老龄化加剧及肿瘤发病率逐年增加，创伤性骨折、老年性骨质疏松或肿瘤转移等疾病继发的病理性骨折发生率日渐剧增。骨折愈合过程是使受伤的组织和器官恢复生物学功能，但其过程复杂、愈合时间长、且具有并发症多等特点，不但严重影响病人的生活质量，更给社会和家庭造成严重的经济负担。据临床统计显示，骨折不愈合的发生率为5％-10％，其中高能开放性骨折以及骨质疏松骨折更是临床上的难点问题。目前，临床上对于骨折愈合的治疗主要以手术疗法结合中药或钙剂为主的药物治疗以及饮食疗法等，其主要目的为补充机体钙含量，促进骨折断端骨钙沉积。然而，单纯的促进骨钙沉积并不能缩短骨折愈合进程，也不能预防骨折愈合延迟或骨折不愈合等并发症的发生。而目前尚没有一种治疗策略能够从细胞及分子水平上促进骨折愈合。近年来随着科研技术的快速发展，对骨折愈合的研究逐步深入到了分子生物学水平，重组蛋白技术的成熟应用，使重组成纤维细胞生长因子治疗骨折受到了重视。

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)是广泛存在于多种组织中的一类多肽生长因子，由血管内皮细胞合成，储存在细胞的基底膜和细胞外基质中，参与机体多种系统和器官的病理生理过程。本发明通过在体动物模型及离体细胞水平研究，发现重组人成纤维细胞生长因子-5(recombinant human basic fibroblast growthfactor，rhbFGF5)能够有效地加快骨折愈合进程。通过形态学及分子生物学等技术证实，rhbFGF5能够显著促进骨折断端的成骨细胞、骨小梁以及骨痂生成，缩短骨折愈合的进程。显著地促进骨髓间充质干细胞增殖和迁移，促其加速分化为成骨细胞，使骨折断端的新生骨组织中ALP、COL1、BMP2等基因的表达水平升高，加快形成骨痂，初步完成骨重建。

本发明的提出为rhbFGF5能够成为治疗骨折的药物提供了有力的理论依据，使开发针对rhbFGF5为靶点的药物治疗骨折愈合成为可能，为临床上促进骨折愈合提供新的药物治疗靶点及更有效的生物治疗手段，具有安全、有效、操作简便易行的特点，对于临床骨折愈合的治疗具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供重组人成纤维细胞生长因子-5(rhbFGF5)在促骨折愈合中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明将含有重组人成纤维细胞生长因子-5的胶原海绵固定于开放性小鼠股骨骨折断，结果发现重组人成纤维细胞生长因子-5能够显著促进骨折断端的成骨细胞、骨小梁以及骨痂生成，缩短骨折愈合的进程，减少骨折并发症的发生。在离体水平实验结果显示，重组人成纤维细胞生长因子-5显著升高ALP、COL1、BMP2等骨折愈合标志性分子的mRNA表达水平，并促进骨髓间充质干细胞增殖、迁移、分化，同时能促进成熟成骨细胞增殖。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了重组人成纤维细胞生长因子-5在制备促骨折愈合药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物能够促进骨折断端的成骨细胞、骨小梁以及骨痂生成，缩短骨折愈合的进程，减少骨折并发症的发生。

其中，优选的，所述的药物能够促进骨髓间充质干细胞增殖、迁移、分化，同时能促进成熟成骨细胞增殖。

其中，优选的，将重组人成纤维细胞生长因子-5与适当载体连接，通过内固定局部给药的方式，用于骨折断端的修复，加快骨折愈合进程。

其中，优选的，所述的载体为胶原海绵、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体等。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明为rhbFGF5能够成为治疗骨折的药物提供了有力的理论依据，使开发针对rhbFGF5为靶点的药物治疗骨折愈合成为可能，为临床上促进骨折愈合提供新的药物治疗靶点及更有效的生物治疗手段，并将其作为一种新型药物以及生物标志物，应用于开创性骨折、粉碎性骨折及骨质疏松性骨折等骨组织修复过程中，具有安全、有效、操作简便易行的特点，对于临床骨折愈合的治疗具有重要的实际意义。

附图说明

图1为X线扫描检测骨折愈合程度及Real-Time PCR技术检测FGF5mRNA水平的变化；

A.X线扫描技术观察小鼠骨折断端的形态变化；B-E.小鼠骨折断端不同组织内FGF5mRNA表达变化；

图2为Micro-CT扫描检测小鼠股骨骨折断端愈合；

图3为H&E染色观察小鼠骨折断端骨小梁和骨髓腔；

图4为RT-PCR技术检测小鼠骨折断端成骨细胞相关基因mRNA表达变化；

图5为rhbFGF5对小鼠骨髓间充质干细胞增殖迁移能力的影响；

A.CCK-8法检测小鼠骨髓间充质干细胞BMSC活力；B.划痕实验检测小鼠骨髓间充质干细胞BMSC迁移能力；C.划痕实验检测小鼠骨髓间充质干细胞BMSC 迁移能力统计图；

图6为rhbFGF5对小鼠骨髓间充质干细胞BMSC成骨分化能力的影响；

A-F.RT-PCR检测小鼠骨髓间充质干细胞BMSC成骨分化相关基因的mRNA的表达变化；G.茜素红染色检测BMSC分化的成骨细胞成熟及矿化程度；

图7为rhbFGF5对人成骨细胞(hFOB1.19)增殖能力的影响。

A.CCK-8法检测人成骨(hFOB1.19)活力；B.细胞计数法检测细胞数量；C. EDU染色法检测新生成骨细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明对于骨折愈合作用的优点和特点将随着描述更为清楚。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所涉及的动物、药品及仪器来源：

1、实验动物：雄性昆明小鼠，体重25±5g由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

2、主要药品：0.9％生理盐水；rhbFGF5(Sigma)；胶原海绵。

3、主要仪器：细胞培养相关仪器、分子生物学检测设备(Real-Time PCR system)、Micro-CT扫描仪器(上海越波生物公司)

实施例一、FGF5在骨折愈合过程中呈趋势性的变化

1.建立小鼠开放性股骨骨折模型：本实验选取雄性昆明小鼠20-30g，经1.2％三溴乙醇腹腔注射麻醉，俯卧位固定于鼠板上，剥离右后肢股骨肌肉组织后，于中间整齐剪断股骨，用1ml无菌注射器针头连接两个断端起到固定作用，成功建立开放性骨折模型。实验动物分为空白对照组(Control组)，剥离肌肉和组织不剪断股骨；骨折模型组(Model组)，剥离肌肉和组织并剪断股骨。

2.观察结果：分别在造模后24小时，1周和2周，采用X线扫描检测骨折断端愈合程度，结果显示骨折愈合2周可观察到明显膨大的肉芽组织包裹断端，基本完成断端的骨结合(见图1A)，说明小鼠骨折自行愈合的在2周内基本完成。RT-PCR 技术检测骨折断端不同组织内的FGF5mRNA的表达水平，结果显示(图1B-1E)：在股神经、骨骼肌、血液中FGF5的mRNA含量在急性期(24小时)较空白组相比明显增加(P<0.05)，骨折1周及2周后，FGF5含量逐渐降低，与24小时相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；骨组织中的FGF5mRNA水平的变化则在骨折 24小时内较正常组显著降低，骨折1周及2周后，FGF5含量逐渐升高至正常水平。结果表明在骨折初始损伤阶段，骨折断端周围组织内储存形式的FGF5大量释放，并分别到骨折局部，从而参与骨折愈合过程。

实施例二、rhbFGF5对小鼠骨折愈合的促进作用

1.建立开放性小鼠股骨骨折模型：方法同实施例一所述。分为模型组(Model) 剥离肌肉和组织并剪断股骨；rhbFGF5组，剥离肌肉和组织并剪断股骨，在针头连接骨折断端时，将含有rhbFGF5(2μg/mm²)的胶原海绵固定在断端处。分别于术后 1周、2周和3周，取骨折断端进行Micro-CT扫描和H&E染色，观察骨折断端形态学变化。采用RT-PCR实验技术检测骨折断端的BMP2、ALP及COL1等骨折愈合标志物mRNA水平的变化。

2.观察结果：

2.1 rhbFGF5对小鼠股骨骨折模型中骨痂形成的促进作用

Micro-CT技术检测各组动物骨折手术后1周、2周和3周的骨折断端的愈合(图 2)。模型组小鼠在1周时，横断面经二维及三维扫描未发现股骨断裂后髓腔周围的新生骨，整体扫描显示骨折断端尚未闭合；rhbFGF5组骨折横断面经二维及三维扫描均可看见髓腔周围散乱分布着大量的新生骨，骨折断端轻度闭合，说明给予 rhbFGF5后加快肉芽组织以及新生骨形成。骨折愈合2周时，模型组动物骨折断端开始出现新生骨，骨折断端轻度闭合，开始生成肉芽组织；rhbFGF5组可见大量的矿化骨痂产生，散乱分布在骨折断端周围，说明rhbFGF5给药后加快了新生骨的成熟。骨折愈合3周时，模型组骨折断端可见大量的矿化骨痂，但未形成明显的髓腔轮廓，整体扫描结果显示骨折断端仍有部分尚未愈合；rhbFGF5组可见骨折断端被成熟的矿化骨痂完全覆盖，且显示规则的髓腔轮廓，骨折断端紧密连接，结果表明给予rhbFGF5能增加骨折断端的骨痂矿化程度，从而减少骨折不愈合并发症的发生。

如表1所示，骨折1周后，rhbFGF5组骨折断端BV/TV、BS/BV及Tb.Th与模型组相比有显著的统计学差异。骨折后第3周，rhbFGF5组骨折断端Tb.N和Tb.Sp 与模型组相比有显著的统计学差异。结果表明rhbFGF5在骨折愈合的初期阶段作用最为明显，有助于加快新生骨形成和矿化的进程。

表1.小鼠股骨骨折断端CT扫描结果统计表(n＝3，)

注：BV/TV：骨体积分数，BS/BV：骨表面积除以骨体积，Tb.N：骨小梁平均数量，Tb.Th：骨小梁平均厚度，Tb.Sp：骨小梁分离度。rhbFGF5组与模型组相比 *P<0.05，**P<0.01。

2.2 rhbFGF5对小鼠骨折后新生骨小梁的作用

H&E染色法观察骨折断端骨髓腔的结构和骨小梁、成骨细胞的增殖。结果显示，骨折后1周，模型组小鼠骨折断端可见大量炎性细胞，rhbFGF5组骨折断端周围可见大量的肉芽组织及新生骨细胞附着，形成骨包。骨折后2周，模型组形成骨包，产生肉芽组织和新生骨，rhbFGF5组可见大量成骨细胞形成骨小梁，及破骨细胞出现在髓腔周围。骨折后3周，模型组断端吻合，生成大量成骨细胞， rhbFGF5组骨折断端已基本修复，出现大量破骨细胞，开始重构骨髓腔，四周分布着排列整齐的骨小梁(如图3所示)。实验结果表明，rhbFGF5在骨折愈合的初始阶段发挥了重要作用，能促进骨小梁生成，快速生成新生骨，缩短骨折愈合进程。

2.3 rhbFGF5对于成骨细胞相关基因mRNA表达的影响

RT-PCR技术检测小鼠骨折后1周、2周及3周的骨折断端处成骨细胞相关的基因ALP、COL1和BMP2的mRNA表达水平。结果显示，骨折愈合1周，rhbFGF5 组与模型组相比，ALP、COL1和BMP2的mRNA表达水平显著升高。骨折愈合第2周，rhbFGF5组与模型组相比，ALP、COL1和BMP2的mRNA表达水平显著降低。骨折愈合第3周，rhbFGF5组与模型组相比，ALP和COL1的mRNA表达水平显著升高(如图4所示)。说明rhbFGF5促进成骨细胞的增殖，从而有助于加快骨折的愈合进程，最终缩短骨折愈合时间。

实施例三、rhbFGF5对于小鼠骨髓间充质干细胞的影响

1.rhbFGF5对小鼠骨髓间充质干细胞增殖迁移能力的影响

1.1细胞培养及实验分组：

1.1.1 CCK-8法检测细胞活力

培养小鼠骨髓间充质干细胞系(BMSC)于96孔板中，分别加入不同浓度rhbFGF5(1、5、10、12.5、25、50、100、200ng/ml)，于37℃，5％CO₂孵箱培养 24小时后收集细胞，采用CCK-8法检测细胞活力。

1.1.2细胞划痕实验

培养小鼠BMSC于六孔板中，分为对照组和rhbFGF5组，对照组加入空白培养基，rhbFGF5组加入含有5ng/ml rhbFGF5的培养基。于37℃，5％CO₂孵箱培养24 小时后，进行划痕实验。

1.2观察结果：

CCK-8法检测小鼠骨髓间充质干细胞活力显示rhbFGF5(1，5，10及12.5ng/ml) 显著增加小鼠骨髓间充质干细胞的活力，促进其增殖(图5A)。划痕后显微镜下实时观察结果显示，0时空白组和rhbFGF5组无显著差异；划痕6小时后空白组和 rhbFGF5组划痕宽度均有缩窄，划痕12小时后rhbFGF5组与空白组相比，划痕宽度显著缩窄(P<0.05)，划痕24小时后，rhbFGF5组划痕几乎完全消失，空白组仍存在显著划痕间隙，rhbFGF5组划痕愈合百分率和空白组相比呈显著的统计学差异 (P<0.01)(图5B、5C)。结果表明rhbFGF5具有促进BMSC增殖及迁移作用。

2.rhbFGF5对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

2.1细胞培养及实验分组：

将小鼠骨髓间充质干细胞系(BMSC)培养于6孔板中，分为空白组(Control)，给予正常培养基培养；rhbFGF5组(rhbFGF5)每72小时给予rhbFGF5(5ng/ml)；成骨诱导剂Revulsant组(Revulsant)每三天更换一次成骨诱导剂(地塞米松100 nmol/l，β-甘油磷酸钠0.01mol/l，维生素C 0.05g/l)；诱导剂+rhbFGF5组 (Revulsant+rhbFGF5)每三天更换一次成骨诱导剂和rhbFGF5(5ng/ml)。连续诱导 1周后，采用RT-PCR技术检测成骨细胞相关基因ATP、COL1和BMP2的mRNA 表达水平，以及软骨细胞分化相关转录因子Sox9，成骨细胞分化相关转录因子 RUNX2及骨形成重要转录因子OSTERIX的mRNA表达。连续诱导21天后茜素红染色检测诱导成功成骨细胞的矿化程度。

2.2观察结果：

RT-PCR技术检测结果显示，rhbFGF5组与空白组相比ALP、COL1、BMP2、 SOX9、RUNX2和OSTERIX的mRNA表达水平显著升高(P<0.05，P<0.01)，诱导剂+rhbFGF5组SOX9和OSTERIX的表达水平均显著高于诱导剂组(图6A-F)。结果表明，rhbFGF5具有促进BMSC向成骨细胞分化的作用。

茜素红染色结果显示，BMSC培养21天后，空白组中未出现红色标记物，显微镜下可清晰观察到BMSC形态，表明正常情况下BMSC未分化；Revulsant组出现较多的红色标记物，显微镜下观察到在BMSC细胞层上附着红色成骨细胞，说明诱导分化成功；诱导剂+rhbFGF5组出现大量红色成骨细胞，显微镜下观察到着色的成骨细胞几乎完全覆盖BMSC细胞层(图6G)。结果表明，在诱导剂的作用下 rhbFGF5促进BMSC分化的成骨细胞成熟矿化。

实施例四、rhbFGF5对成骨细胞增殖的影响

1.细胞培养及实验分组：

培养人SV40转染成骨细胞系(hFOB1.19)于96孔板中，加入rhbFGF5(1、 10、100ng/ml)，于37℃，5％CO₂孵箱培养24小时后收集细胞，进行CCK-8检测。于12孔板中培养hFOB1.19细胞系，分为对照组(Control)和rhbFGF5组(rhbFGF5)，对照组给予正常培养基，rhbFGF5组给予rhbFGF5 10ng/ml，预处理24小时后进行细胞计数和EDU染色。

2.观察结果：

CCK-8检测结果显示，rhbFGF5(1、10、100ng/ml)均能明显增加人成骨细胞的活力，浓度为10ng/ml时效果最为显著(见图7A)。细胞计数法结果显示，rhbFGF5 组细胞数量明显要高于对照组(图7B)。EDU染色结果显示，rhbFGF5组中EDU 荧光着色的细胞数量和强度明显高于对照组(图7C)。结果表明rhbFGF5显著促进成骨细胞的增殖。

Claims (5)

1.重组人成纤维细胞生长因子-5在制备促骨折愈合药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物能够促进骨折断端的成骨细胞、骨小梁以及骨痂生成，缩短骨折愈合的进程，减少骨折并发症的发生。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物能够促进骨髓间充质干细胞增殖、迁移、分化，同时能促进成熟成骨细胞增殖。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将重组人成纤维细胞生长因子-5与适当载体连接，通过内固定局部给药的方式，用于骨折断端的修复，加快骨折愈合进程。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的载体为胶原海绵、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体。