CN101993494A

CN101993494A - 人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)的N-末端化学修饰及其应用

Info

Publication number: CN101993494A
Application number: CN2009101046529A
Authority: CN
Inventors: 范开; 陈勇; 曹宇; 梅翔; 谭克海
Original assignee: Fujin Bio-Medicine Co Ltd Chongqing
Current assignee: Fujin Bio-Medicine Co Ltd Chongqing
Priority date: 2009-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2011-03-30

Abstract

本发明公开了一种人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)的化学修饰及其应用。其特征为：它是以分子量为10KD-40KD的聚乙二醇N末端化学修饰人成纤维细胞生长因子-21而形成的hFGF-21偶联物。本发明的hFGF-21偶联物修饰率高，产物均一；该偶联物保持了hFGF-21在体内的活性，改善了hFGF-21在体内的药物代谢动力学性质；同时，该偶联物可用于制备治疗2型糖尿病、肥胖症或代谢综合症的药物。

Description

人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)的N-末端化学修饰及其应用

技术领域

本发明涉及一种使用聚乙二醇(PEG)N末端化学修饰人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)的偶联物，还涉及该偶联物的应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子(FGF)是一种多功能非特异性的活性物质。现发现该成纤维细胞生长因子家族(FGFs)共有23个成员，即FGF-1到FGF-23(Olsen SH et al.，J Biol Chem278：34226-34236，2003)。它们功能各异，主要由成纤维细胞，内皮细胞，骨细胞，多形细胞等分泌，相对分子量一般在17-34kD，其中心区域的氨基酸含有30％-70％的同源性。

FGF-21是FGF家族的一个新成员，属于FGF-19亚家族；最先从老鼠胚胎中分离得到，是一种分泌蛋白；主要在肝脏中表达，少量表达于胸腺。人FGF-21(hFGF-21)cDNA编码209个氨基酸，N端前28个氨基酸为信号肽序列，其后181个氨基酸为人FGF-21成熟氨基酸序列。hFGF-21与hFGF-19、hFGF-23以及鼠的FGF-21的氨基酸序列相比分别有35％、24％和75％的同源性(Nishimura et al.，Biochim Biophys Acta 1492：203-206，2000)。

临床前研究显示，hFGF-21的主要生物学功能表现在糖脂代谢调控方面。hFGF-21的代谢调节功能所表现出的作用与胰岛素类似，它可以增强胰岛素的敏感性，改善β细胞功能及其存活率，降低血糖，改善胰岛素抵抗，却不出现低血糖的不良反应；同时它能有效降低血脂，对脂代谢和动脉粥样硬化也有重要的作用(A Kharitonenkov et al.，J Clin Invest 115：1627-1635，2005；Wente et al.，Diabetes 55：2470-2478，2006；A Kharitonenkov et al.Endocrinology 148：774-781，2007；A Kharitonenkov et al.，Biodrugs.22(1)：37-44，2008；AKharitonenkov et al.，Current Opinion in Investigational Drugs 10：359-364，2009)。因此hFGF-21的研究以及在临床上的应用前景日益受到人们的关注。

研究发现hFGF-21在体内半衰期短，这限制了其在临床治疗中的应用。在其他治疗用蛋白质药物的研究中，发现了解决蛋白类药物在机体内半衰期短和免疫原性等问题的方法。其中方法之一，是将蛋白质与水溶性聚合物共价结合成偶联物。其中所使用的水溶性聚合物包括聚乳糖、聚乙二醇、聚合氨基酸等，而聚乙二醇的使用较为普遍。

聚乙二醇-蛋白质偶联物具有良好的热稳定性、抗酶解、增加水溶性、延长半衰期、降低免疫原性和毒性等优势(Inada，et al.，J.Bioact.And Compatible Polymers，5：343(1990)；Delgalo，etal.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems，9：249(1992)；katre，Advanced DrugDelivery Systems，10：91(1993))。自1991年第一种用PEG修饰的药物PEG-ADA被FDA批准上市后，制药公司们积极推进PEG修饰药物蛋白质的技术。近几年上市的的产品有PEG-干扰素、PEG-粒细胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺酶、PEG-生长抑素以及PEG化单链抗体等；而且，还有数几十种PEG修饰的蛋白药物处于研究或临床实验阶段。

专利PCT2005/113606报道用IgG4-Fc或BSA同FGF-21融合，形成一种hFGF-21融合蛋白。该蛋白能有效改善hFGF-21在体内的药代动力学，可用于治疗2型糖尿病、肥胖症或代谢综合症。专利PCT2005/091944报道用聚乙二醇修饰hFGF-21的Lys的ε-氨基和其Cys的巯基，该修饰后的hFGF-21也能有效改善FGF-21在体内的药代动力学。本发明采用N末端修饰方法修饰人成纤维细胞生长因子-21及其突变体或变异体，形成单一位点PEG修饰的均一产物。通过实施能有效改善hFGF-21在体内的药代动力学，可适用于治疗2型糖尿病、肥胖症或代谢综合症的一种药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用聚乙二醇(PEG)N末端化学修饰人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)的偶联物；同时，该偶联物可用于制备治疗2型糖尿病、肥胖症或代谢综合症的药物。

对于聚乙二醇分子来说，可通过多种方法将其加到蛋白质上。总的来说，聚乙二醇分子是通过一个分子上的反应基团而联到蛋白质分子上的。PEG偶联的主要基团是氨基、巯基和羧基(Veroneee FM，Biomaterials，2001，22：405)，绝大部分修饰剂主要与Lys的ε-氨基和N-末端的氨基进行共价偶联的。目前的方法显示，任何活化的PEG(包括SPA、OTS、NH₂、NPC、SS、SC等)与Lys的ε-氨基反应时，易造成产物的不均一性。如果这些治疗蛋白质在组合物中各批量间有区别，人们将无法对其生物活性进行预测。不同位点的的聚乙二醇分子稳定性不同。如果这些分子是随机附着而因此随机解离，那么治疗用PEG化蛋白质的药物动力学就不可能准确预测。

本发明采用一种醛基化的PEG对人成纤维细胞生长因子-21进行修饰，选择性激活hFGF-21的N-末端残基的氨基基团，使PEG专一性共价结合hFGF-21的N-末端，从而形成稳定和单一的PEG修饰偶联物。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种修饰的人成纤维细胞生长因子-21，其中每一分子人成纤维细胞生长因子-21的N-末端与一分子的聚乙二醇类聚合物通过化学键相偶联(PEG-rhFGF-21)。所述聚乙二醇为醛基活化的mPEG，包括甲醛基、乙醛基、丙醛基、丁醛基、戊醛基等，优选丙醛基和丁醛基活化的mPEG。优选的丙醛基和丁醛基活化的mPEG分子量为10KD-40KD，进一步优选丁醛基活化的mPEG的分子量为20KD。修饰后的人成纤维细胞生长因子-21经常规的柱层析色谱分离纯化后，纯度大于95％。

所述的人成纤维细胞生长因子-21为天然的人成纤维细胞生长因子-21或天然人成纤维细胞生长因子-21的突变体或天然人成纤维细胞生长因子-21的变异体。天然人FGF-21(hFGF-21)cDNA编码209个氨基酸，其N端含有28个信号肽序列，其后181个氨基酸为人成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

所述的天然人成纤维细胞生长因子-21的突变体或天然人成纤维细胞生长因子-21的变异体指的是天然人成纤维细胞生长因子-21的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代或天然人成纤维细胞生长因子-21的氨基酸序列被延长或被截断，或天然人成纤维细胞生长因子-21的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代的同时人成纤维细胞生长因子-21的氨基酸序列被延长或被截断。

人成纤维细胞生长因子-21的结构和功能在近年得到广泛的研究(Reuss et al.，Cell TissueRes.313：139-157(2003)；Olsen SH et al.，J Biol Chem 278：34226-34236，2003；AKharitonenkovet al.，J Clin Invest 115：1627-1635，2005；Wente et al.，Diabetes 55：2470-2478，2006；AKharitonenkov et al.Endocrinology 148：774-781，2007；A Kharitonenkov et al.，Biodrugs.22(1)：37-44，2008；AKharitonenkov et al.，Current Opinion in Investigational Drugs 10：359-364，2009)；Rydén M.Cell Mol Life Sci.2009Mar 11；Micanovic R et al.，J Cell Physiol.2009May；219(2)：227-34.；Yie J et al.，FEBS Lett.2009Jan 5；583(1)：19-24.)，为了提高其稳定性和临床应用，对其结构进行了一定的突变和变异。如：专利CN101010338A，通过氨基酸的取代，改变FGF-21的糖基化数量和类型；专利PCT 2006/065582，用带电的和/或极性但不带电荷的氨基酸取代hFGF-21的glutamine 54，arginine 77，leucine 139，alanine 145，leucine 146，isoleucine 152，glutamine 156，glycine 161，serine 163氨基酸等。

为了实现本发明的目的，人成纤维细胞生长因子-21是通过基因重组技术，经宿主表达和纯化而得的重组人成纤维细胞生长因子-21(rhFGF-21)。所述宿主体系主要指大肠杆菌或酵母。

本发明还提供了通过N末端PEG修饰后的人成纤维细胞生长因子-21或其突变体和变异体能有效改善hFGF-21在体内的药代动力学，作为用于制备治疗2型糖尿病、肥胖症或代谢综合症的药物。

为实现本发明的目的，采用CD-1鼠研究N末端PEG修饰后的重组人成纤维细胞生长因子-21(PEG-rhFGF-21)在体内的药代动力学；采用3T3-LI脂肪细胞和Ob/ob小鼠模型研究PEG-rhFGF-21的体内外生物活性。

该药物的有效剂量指的是能够有效实现治疗2型糖尿病、肥胖症或代谢综合症的所需医学效果的量。

本文涉及的所有专利和出版物引为参考。

附图说明

图1为pET-3c-FGF-21的构建示意图。

图2为rh-CNTF在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE图谱，其中1为诱导前；2为诱导3hr；3为诱导4hr；M为蛋白质marker。

图3为mPEG-ButylALD-20KD修饰rhFGF-21的SDS-PAGE图，其中M为蛋白质marker；1为rhFGF-21；2为mPEG-ButylALD-20KD对rhFGF-21的修饰。

图4为mPEG-PropionALD-40KD修饰rhFGF-21的SDS-PAGE图，其中M为蛋白质marker；1为rhFGF-21；2为mPEG-PropionALD-40KD对rhFGF-21的修饰。

具体实施方式

以下实施实例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实例1、rhFGF-21的上游构建与表达

根据Gene Bank获得人FGF-21cDNA序列后进行大肠杆菌偏爱密码子改变，设计FGF-21的表达cDNA序列(SEQ ID NO：2)，序列5’端和3’分别设计限制性内切酶Nde I和BamHI位点。委托宝生物工程(大连)有限公司全基因人工合成，并嵌入pMD-19-T载体且命名为pMD-FGF-21。质粒pMD-FGF-21/DH5α和表达载体质粒pET-3c用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切，根据1％琼脂糖电泳结果，回收pET-3c酶切后约4638bp的片段，回收pMD-FGF-21酶切后的FGF-21cDNA约550bp的片段，将两个片段用T4连接酶进行连接。用LA(胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，琼脂3g，加水定溶至200mL，121℃，高压灭菌30min，当温度降到50℃左右时加入Amp至终浓度为100ug/mL，取适量倒培养皿，凝固后即成LA琼脂平板)平板筛选重组子，Nde I和BamH I双酶切鉴定阳性克隆。正确质粒命名为pET-3c-FGF-21(图1)。再将质粒pET-3c-FGF-21转化BL21(DE3)plysS宿主菌中，筛选目的蛋白表达的工程菌命名pET-3c-FGF-21/BL21(DE3)plysS。用于表达的载体和宿主菌菌购于Novagen公司，Nde I和BamH I酶购于宝生物工程(大连)有限公司。

将上述表达最佳工程菌株划线接种于LA琼脂平板，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基试管中，37℃培养12小时。然后按1％的比例转接到含200mL LB培养液的1000mL三角瓶中，37℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含20L M9YT培养液的30L发酵罐中，37℃培养。整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30％以上，用28％的氨水调节pH并保持在7.0。至菌液OD600＝10～14时，加入终浓度为0.5mM IPTG，继续培养4小时获得高效hFGF-21(图2)，8000rpm离心10分钟，收集菌液，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。

实例2、rhFGF-21的纯化

从-20℃冰箱中取出菌体，按加入细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH10.0，10mM EDTA，0.2mg/mL溶菌酶)中，37℃下搅拌1小时。冷却后超声(400W，工作时间5s，间歇5s，超声40个循环)，12000rpm离心10分钟弃上清，沉淀用溶液A(20mM Tris-HCl pH 10，10mMEDTA，2M urea，1％TritonX-100)洗涤，37℃搅拌30min，12000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀再用溶液B(20mM Tris-HCl pH 10，4M urea，1.0M NaCl)洗涤，37℃搅拌30min，再12000rpm离心10分钟，收集包涵体(沉淀)。

包涵体用溶解液(8M尿素，10mM乙醇胺，PH11.5，1/1000ββ-ME，2mM EDTA)溶解，除去不溶物后，溶解液用Q-Sepharose FF柱分离。用Q-Sepharose FF平衡液(8M尿素，10mM乙醇胺，PH11.5，1/1000 β-ME，2mM/L EDTA)平衡Q-sepharose FF柱，上样溶解液样品，再平衡。用0-500mM/L的NaCl线性洗脱，收集目的洗脱峰。

包涵体的复性：经Q-sepharose纯化的目的蛋白置于4℃复性液(20mMTris-HCl pH9.0)中进行透析复性H或稀释复性12小时。

复性液经RP-HPLC(Waters公司C18柱纯化：流动相A液(0.1％三氟乙酸、5％乙腈)，流动相B液(0.1％三氟乙酸、95％乙腈)，0-100％B线性洗脱，进一步纯化复性后的rhFGF-21蛋白。经RP-HPLC纯化的目的蛋白再经Superdex-75(Amersham Biosciences)(缓冲为10mm的磷酸盐缓冲，pH7.4)凝胶柱层析获得rhFGF-21的纯度可达95％以上。

实例3、mPEG-ButylALD-20KD对rhFGF-21的修饰

rhFGF-21溶液由实例2制备，mPEG-ButylALD-20KD(相对分子质量为20×10³)，氰基硼氢化钠(CH3BNNa)溶液作为α-NH₂的活化剂。

rhFGF-21溶液经对100mM PB pH5.0透析后，加入CH3BNNa终浓度为20mM。取rhFGF-21与mPEG-ButylALD-20KD质量比1∶2，4℃条件下，100r/min搅拌，反应24hr，取样进行SDS-PAGE电泳(图3)，确定PEG-20-FGF-21的修饰比例，其修饰率达到75％。

实例4、mPEG-PropionALD-40KD对rhFGF-21的修饰

rhFGF-21溶液经对100mM/L PB pH5.0透析后，加入CH3BNNa终浓度为20mM。取rhFGF-21与mPEG-ButylALD-40KD质量比1∶3，4℃条件下，100r/min搅拌，反应24hr，取样进行SDS-PAGE电泳(图4)，确定PEG-40-FGF-21的修饰比例，其修饰率达到70％。

实例5、PEG-FGF-21的纯化

修饰后样品PEG-FGF-21(包括20KD和40KD PEG修饰)，用DDW稀释5-10倍后，调pH至8.0。采用Source 15-Q进一步分离纯化。用平衡液(50mM Tris-HCl pH8.0)平衡后，上样再平衡。用0-500mM的NaCl线性洗脱，收集不含未修饰的rhFGF-21的PEG-20-FGF-21或PEG-40-FGF-21洗脱峰。

实例6、PEG-20-FGF-21和PEG-40-FGF-21体外生物活性测定

3T3-L1前体脂肪细胞培养于含10％FBS的高糖DMEM中培养中，在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下培养，以2.5×10⁴密度将细胞接种于12孔板中。待细胞生长至接触抑制时，用脂肪分化液I(含10％FBS、0.25μmol/L dexamethasone、0.5mmol/L IBMX、5mg/L重组人胰岛素)的DMEM培养基分化48h后。再用脂肪分化液II(含10％FBS、5mg/L重组人胰岛素的DMEM培养基)继续分化48h，此后用含10％FBS的DMEM培养基继续培养，每2d换1次液直到90％以上(10d左右)的细胞表现出脂肪细胞特征。

已分化的成熟3T32L1脂肪细胞饥饿12h，分别将rhFGF-21、PEG-20-FGF-21和PEG-40-FGF-21用细胞培养液(含0.2％FBS的高糖DMEM培养基)稀释成以下不同的浓度(100nm、20nm、4nm、0.8nm、0.16nm、0.032nm)，分别处理细胞24h-48h后，分别取上清培养基测定葡萄糖的含量，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)测定，运用统计学分析实验结果。

结果显示(图5)，不同浓度的rhFGF-21、PEG-20-FGF-21和PEG-40-FGF-21处理小鼠3T32L1脂肪细胞后，对葡萄糖的摄取利用显著增加，呈剂量依赖关系。其中PEG-20-FGF-21和PEG-40-FGF-21提高葡萄糖摄取利用率潜能比FGF-21有所降低。在相同浓度条件下，PEG-20-FGF-21保留65％左右，PEG-40-FGF-21保留50％左右。

实例7、PEG-FGF-21在CD-1小鼠体内的药代动力学

取CD-1小鼠48只，随机分成三组(PEG-20-FGF-21组，PEG-40-FGF-21组，rhFGF-21组)。每组按0.4mg/kg皮下注射，于注射后0到144hr间，间隔多次取血。采用FGF-21ELISAKit(康肽生物公司)测定血中FGF-21的血药浓度，计算半衰期。

名称	t_1/2(h)
		PEG-20-FGF21组	32.1
PEG-40-FGF21组	51.4
		rhFGF-21组	3.2

实验结果表明，rhFGF-21的半衰期仅为3.2hr；而PEG-20-FGF21的半衰期达到32.1hr；PEG-40-FGF21的半衰期达到51.4hr。结果证明PEG化rhFGF-21的体内半衰期显著延长。

实例9、PEG-FGF-21在Ob/ob小鼠模型中降糖和降脂评价

取9周龄Ob/ob小鼠随机分成五组，对照组、rhFGF-21I组、rhFGF-21II组、PEG-20-FGF21组和PEG-40-FGF21组。对照组皮下注射生理盐水，连续注射7天；rhFGF-21I组按10ug/kg注射rhFGF-21，连续皮下注射7天；rhFGF-21II组、PEG-20-FGF21组和PEG-40-FGF21组按50ug/kg只第一天皮下注射一次。给药后每两天通过小鼠尾部取血，测其血糖浓度；给药后的第3天和7天测甘油三脂。

结果显示：重组rhFGF-21单次给药和对照组间血糖浓度和甘油三酯浓度无差异，连续给药7天后rhFGF-21和单次给药PEG-20-FGF-21及PEG-40-FGF-21组从2天开始至给药后7天0b/ob动物体内的血糖和甘油三酯浓度均显著下降(统计学处理P＜0.05)。证明，N末端PEG修饰的重组rhFGF-21的皮下给药后药效学作用可较长时间。

序列表

<110>重庆富进生物医药有限公司

<120>人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)的N-末端化学修饰及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>181

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210>2

<211>543

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>Other Information

<222>(1)..(543)

<223>Sythetic cDNA for FGF-21

<400>2

cacccaatcc cagattctag tccactgtta caattcggag gtcaggttcg tcaacgttat 60

ctgtataccg atgacgcaca gcagaccgaa gcccatttgg aaattcgtga agatggaacc 120

gttggtggtg ctgccgatca atctcctgaa tcactgttac agctgaaagc attgaaacca 180

ggagttattc agattctggg tgtcaaaacc tctcgttttt tatgtcaacg tcctgacggt 240

gccctgtatg gaagtttgca ttttgatcca gaagcctgtt cttttcgtga actgttactg 300

gaagatggtt ataatgttta tcagtcagaa gcccacggtt tgcctctgca tttaccagga 360

aataaatctc ctcatcgtga cccagcacct cgtggtccag cccgttttct gccattgcca 420

ggtctgcctc cagctctgcc tgaaccacct ggtattctgg ccccacagcc tccagatgtt 480

ggtagttctg atcctctgtc aatggtcggt ccatctcaag gtcgtagtcc ttcttatgca 540

tca 543

Claims

1.一种化学修饰的人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)偶联物，其特征在于，具有如下结构通式：

式中：

mPEG-(CH2)n-C-为醛基聚乙二醇链，其中n为1至7的整数；NH-为N末端氨基；

FGF-21为人成纤维细胞生长因子-21。

2.根据权利要求1所述的人成纤维细胞生长因子-21偶联物，其特征在于，所述人成纤维细胞生长因子-21为天然人成纤维细胞生长因子-21或天然人成纤维细胞生长因子-21的突变体或天然人成纤维细胞生长因子-21的变异体。

3.根据权利要求1所述的FGF-21偶联物，其特征在于，所述偶联部分是直链或分支链聚乙二醇。

4.根据权利要求1所述的化学修饰，其特征在于，聚乙二醇以N末端化学修饰人成纤维细胞生长因子-21。

5.根据权利要求3、4任一项所述的聚乙二醇，其特征在于，所述聚乙二醇为醛基活化的mPEG，其分子量为10KD-40KD。

6.一种人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21)的化学修饰偶联物的应用，其特征在于，该偶联物可用于制备治疗2型糖尿病、肥胖症或代谢综合症的药物。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物为治疗有效剂量的权利要求1、2、4任一项所述的用聚乙二醇N末端化学修饰天然人成纤维细胞生长因子-21及其突变体和变异体的蛋白。