NO158950B - Dna-sekvens som koder for et polypeptid med human fibroblast-interferonaktivitet, fremgangsmaate for dens fremstilling, samt fremgangsmaate for fremstilling av et plasmid. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en DNA-sekvens som koder for et polypeptid med human fibroblast-interferonaktivitet, fremgangsmåte for dens fremstilling samt fremgangsmåte for fremstilling av et plasmid.

Interferon er et glycoprotein (molekylvekt ca. 20.000)

med antiviral virkning, som er oppdaget av Isaacs og Linden-mann i 1957. Undersøkelser har vist at forbindelsen har antitumorvirkning utover antiviralvirkning, og at man derfor forventer bred klinisk anvendelse av forbindelsen. Det er f.eks. blitt rapportert at interferon effektivt kan administreres ved forskjellige virale sykdommer, osteo-sarkoma og brystkarsinom.

Imidlertid kan interferon på grunn av dets høye arts-spesifisitet kun anvendes til mennesker når det stammer fra humane celler. For øyeblikket har det interferon som benyttes til administrasjon, en relativ virkning på ca. 10 (internasjonale enheter) pr. 1 mg, hvilket tilsvarer en renhet på ca. 0,1 til 0,01%.

Anvendelsen av interferon er dessuten temmelig begrenset fordi det er vanskelig å masseprodusere. For tiden er leveringen av interferon bare ca. 1% av behovet til kliniske undersøkelser (10 13 enheter pr. år). Av disse grunner er det et teknologisk behov for å kunne produsere humant interferon av stor renhet på en lett måte og i store mengder.

Til. dette formål er det blitt utviklet en hittil ukjent metode for å fremstille interferon lett og i store mengder ved å innføre et humant interferongen i et plasmid DNA (f.eks. plasmid DNA som stammer fra E. coli ved hjelp av rekombinant DNA (deoksyribonukleinsyre)-teknologi.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles en DNA-

sekvens som koder for et polypeptid med interferonvirkning, idet man benytter den humane interferon mRNA som en mal og et hittil ukjent rekombinant plasmid, som inneholder DNA-

sekvensen, fremstilles. Videre; kan rekombinantplasmidet innføres i en vertsmikroorganisme.

DNA-sekvensen som koder for et polypeptid med interferonvirkning og det rekombinante plasmid som inneholder DNA-sekvensen, er nå for første gang blitt fremstilt.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en DNA-sekvens som koder for et polypeptid med human fibroblast-interferonaktivitet, kjennetegnet ved at den er komplementær til humant fibroblast-interferon mRNA som styrer syntese av biologisk aktivt humant fibroblast-interferon i et Xenopus Laevis oocytt translasjonssystem.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en frem-. gangsmåte for fremstilling av nevnte DNA-sekvens, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man isolerer en human fibroblast-interferon mRNA fra human cytoplasmatisk RNA og syntetiserer en dobbeltkjedet DNA under anvendelse av nevnte mRNA som en templat, og enzymene revers transkriptase og DNA polymerase I.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant plasmid og eventuelt mikroorganisme inneholdende dette, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at en DNA-sekvens som viser komplementaritet overfor humant fibroblast-interferon mRNA innføres i et plasmid for dannelse av det rekombinante plasmidet TpIF 319-13 og eventuelt transformerer E. coli x 1776 med dette ved i og for seg kjente metoder.

Ved fremstillingen av DNA-sekvensen ekstraheres først cytoplasmatisk RNA fra (1) human fibroblast, MG63- celler eller andre indusert av poly(I):poly(C), som er en dobbeltkjedet RNA som består av polyinosin og polycitidylsyre eller andre induksjonsmidler, (2)

human leukocytt, lymfoblastiske celler, NAMALWA-

celler eller andre indusert av Sendai-virus eller andre induksjonsmidler, eller (3) lymfocytter indusert av forskjellige mitogener eller andre induserende midler. Fra denne RNA isoleres den humane interferon mRNA inneholdende poly A (polyadenylsyre). En dobbeltkjedet DNA syntetiseres, f.eks. med revers transkriptase med mRNA som koder for et polypeptid med human-fibroblast-interf eronaktivitet, som templat. Et rekombinant plasmid oppnås ved å innføre den syntetiserte DNA sekvens i en vektor DNA som f.eks. E. coli plasmid DNA ved hjelp av teknikken bestående av in vitro DNA rekombina^sjon. Rekombinanten merkes med en radioisotop for å anvendes som en forsøksprøve. Rekombinante plasmider som har en innført del som er komplementær til human-fibroblast-interferon mRNA, velges. Den DNA som koder for et polypeptid med human-fibroblast-interferonvirkning, utvinnes fra det rekombinante plasmid, og basekonsekvensen av DNA-materialet bestemmes.

Fig. 1 viser restriksjon-endonuklease-sammensetningen av:

(a) et gen, som viser komplementaritet til human fibroblast-interferon mRNA i rekombinanten nr. 319, som benyttes til fremstilling av det omhandlede rekombinante plasmid nr. 319-13; (b) et gen, som viser komplementaritet til human fibroblast-interferon mRNA i det omhandlede rekombinant plasmid nr. 319-13.

Fig. 2 illustrerer primærstrukturen (basesekvensen) til

mRNA-sekvensen innført i plasmidet nr. 319-13.

Det fremstilte rekombinante plasmid er et rekombinant plasmid hvori den ovennevnte DNA er innført i en vektor-DNA som f.eks. pBR322, pCRl, pMB9 eller pSCl.

Rekombinantplasmidene betegnet nr. 319 og nr. 319-13

er foretrukne eksempler på et fremstilt rekombinant plasmid.

Som vertsmikroorganisme anvendes vanligvis E. coliX1776.

Som eksempel på fremgangsmåten til fremstilling av DNA-sekvensen, det omhandlede plasmid og den omtalte trans-formant, angis følgende: Først tilveiebringes f.eks. humane fibroblaster fra for-hud stammende fra fostre eller lignende. En liten mengde interferon tilsettes deretter til en dyrkningsvæske bestående av humane fibroblastere for å påvirke inter-feronsyntesen ved hjelp av humane fibroblaster, hvortil poly(I):poly(C) tilsettes for å starte syntesen av interferon mRNA. Cykloheksamid tilsettes samtidig for

å øke nivået av interferon mRNA. På et passende tids-punkt (ca. 4 timer) etter at de humane fibroblastene er superindusert på den ovenfor beskrevne måte, inn-samles celler ogødelegges, og kjernene fjernes.

Cytoplasmisk total RNA ekstraheres med fenol eller lignende. RNA-materialet kan også ekstraheres ved å ødelegge hele celler, ekstrahere både DNA og RNA med f.eks. fenol og nedbryte og fjerne DNA-materialet med DNAse.

Videre kan interferon mRNA også ekstraheres fra MG63-celler indusert av poly(I):poly(C) eller andre induksjonsmidler, humane leukocytter eller lymfoblastiske celler indusert med Sendai-virus eller andre induksjonsmidler og lymfocytter indusert av forskjellige mitogener eller andre induksjonsmidler.

Den således ekstraherte RNA oppløses i en saltoppløsning av NaCl eller KC1 i en så høy konsentrasjon som 0,5M og på-føres på en søyle av oligo (dT) cellulose for på søylen å absorbere mRNA som inneholder poly(A). Elueringen utføres med vann, en saltoppløsning i lav konsentrasjon som f.eks. 10 mM tris-HCl-buffer eller lignende for å isolere mRNA som inneholder poly(A).

Den isolerte mRNA fraksjoneres ved hjelp av sukrose-tetthetsgradient-sentrifugering. Interferon mRNA-aktivitet undersøkes ved å bestemme interferonaktivitet (antiviral-aktivitet) av det protein som syntetiseres i aocytter av Xenopus laevis etter mikroinjeksjon av en del av mRNA-materialet i hver fraksjon. Bestemmelsen av interferon-aktiviteten utføres således som beskrevet i Japan J. Micro-biol. 18, 449-456, (1974).

Deretter syntetiseres en DNA-sekvens som viser komplementaritet med mRNA, in vitro ved hjelp av en revers transkriptase som oppnås fra fjærkremyeloblastosis-virus, idet man som mal anvender en mRNA som har den høyeste interferon mRNA-aktivitet.

Syntesen utføres på følgende måter: En mRNA omsettes ved en passende temperatur (f.eks. 3 7°C) i et passende tidsrom (f.eks. 60 min.) med oligo (dT),MgCl2(f.eks. 5 mM) NaCl

(f.eks. 30 mM), merkaptoetanol (f.eks. 5 mM) og tris-HCl-buffer (f.eks. pH 8,0, 40 mM), idet man benytter en revers transkriptase sammen med deoksyadenosintrifosfat (dATP), deoksytymidintrifosfat (dTTP), deoksyguanoin-trifosfat (dGTP) og deoksycytidintrifosfat (dCTP) (f.eks.

0,5 mM av hver) som substituater.

Det således fremstilte reaksjonsprodukt underkastes deproteinisering f.eks. ved hjelp av fenol, og RNA-malen fjernes ved hjelp av alkali eller ribonukleasebehandling.

En dobbeltkjedet DNA-sekvens syntetiseres ved hjelp av en omvendt transkriptase på samme måte som syntesen av DNA-materialet, som utviser komplementaritet med mRNA-

materialet beskrevet ovenfor, bortsett fra at mRNA er er-stattet av DNA, og oligo (dT) er utelatt.

Ved å benytte E. coli DNA polymerase I, som kan oppnås fra

E. coli MRE 600 eller lignende istedenfor revers transkriptase, kan den samme dobbeltkjedede DNA syntetiseres.

Etter at den dobbeltkjedede DNA som er syntetisert ved

hjelp av den ovenfor beskrevne metode, er behandlet med nuklease som kan oppnås fra Aspergillus oryzae i nær-

vær av ZnCl2(f.eks. 1 mM), natriumacetatbuffer (f.eks.

0,1 M, pH 4,5), NaCl (f.eks. 0,2 M) osv., dannes poly A-kjeder ved begge 3'-endene av den syntetiserte DNA ved å inkubere med en terminal-transferase som er utvunnet av kalve-tymus, i nærvær av kaliumkakodylat-buffer (f.eks. pH 7,6, 0,14 M) tris (base) (f.eks. 0,03 M), ditiotreitol (f.eks.

0,1 mM) , CoCl2(f.eks. 1 mM) og dATP (f.eks. 1 mM) ved en passende temperatur (f.eks. 37°C) i løpet av et passende tidsrom (f.eks. 20 minutter).

På den annen side spaltes en plasmid DNA som er benyttet

som en vektor DNA, f.eks. E. coli plasmid pBR322 DNA [Gene vol. 2, p. 95-113 (1977)], på et sted ved å behandle med en restriksjon-endonuklease EcoRI, som f.eks. kan oppnås fra E. coli RY 13 i nærvær av tris-HCl-buffer (f.eks. pH 7,5, 10 mM), MgCl2(f.eks. 6 mM), NaCl (f.eks. 0,1 M) merkaptoetanol (f.eks. 6 mM), eller lignende, og deretter behandlet med fag X-avledet eksonuklease, som f.eks. kan oppnås fra E. coli W3102 (Xcl851) x 13), i nærvær av Na-glycin-buffer (f.eks. pH 9,5, 0,1 M), MgCl2(f.eks. 5 mM) eller lignende. Deretter dannes poly F-kjeder ved begge 3'-endene på samme måte som for den ovenfor beskrevne syntetiserte dobbeltkjedede DNA-sekvens under anvendelse av dTTP istedenfor dATP.

Syntetisk dobbeltkjedet DNA og plasmid DNA som er kjede-forlenget ved begge 3'-endene slik som beskrevet ovenfor, inkuberes ved en passende temperatur og i en passende tid med tris-HCl buffer (f.eks. pH 7,5, 50 mM), NaCl (f.eks. 0,1 M), EDTA (f.eks. 5 mM) eller lignende<p>g hybridiseres idet hydrogenbindinger dannes av adenin og tymin. Deretter transformeres en trahsformerbar E. coli stamme, f.eks.

E. coliX1776 (Molecular Cloning of Recombinant DNA,

Scott, W.A.&Werner, R., Academic Press, p. 99-114 1977) med den hybridiserte DNA ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet av Enea et al., (J. Mol. Biol. vol. 96, p. 495-509, 1975) eller lignende.

I den således fremstilte rekombinante plasmid-DNA finnes det et vektor DNA-gen, f.eks. 3-laktamase (et enzym som ødelegger ampicillin) gen, av E. coli plasmid pBR322. Derfor utviser den transformerte E. coli resistens overfor ampicillin. Følgende teknikk anvendes for å utta en stamme med en ny rekombinant, som har et gen som viser komplementaritet overfor den humane fibroblast-interferon mRNA blant disse ampicillin-resistente stammer.

32

Først syntetiseres [ P]-merket DNA med RNA-sekvensen som har den ovenfor beskrevne interferon mRNA-aktivitet, som en mal, og DNA-sekvensen hybridiseres med mRNA som er ekstrahert uten induksjon av poly(I):poly(C) (derfor indu-seres ikke interferon mRNA-syntese) fra humane fibroblastere ved inkubering ved en høy temperatur (f.eks. 65°C) i en reaksjonsblanding inneholdende f.eks. NaCl (f.eks. 0,5 M). Deretter adskilles den hybridiserte DNA (prøve A) og ikke-hybridiserte DNA (prøve B) ved hydroksyapatittsøyle-kromatografi. Deretter hybridiseres filterfikserende DNA-materialer av transformanter for seg med prøve B eller prøve A som beskrevet av Grunstein-Hogness (Proe. Nat.

Acad. Sei. USA, vol. 72, p. 3961-3965, 1975), og stammer som har en DNA-sekvens som kan hybridiseres med prøve V, men slett ikke eller knapt nok med prøve A, avsløres ved autoradiografi.

Deretter isoleres plasmid DNA fra hver av de utvalgte stammer og hybridiseres med mRNA som har interferon mRNA-aktivitet, ved inkubering ved høy temperatur (f.eks.

53°C). i nærvær av 80 vekt/vol-% formamid, 0,4 NaCl, osv. Siden mRNA-sekvensen hybridisert med cDNA-delen av plasmid DNA-sekvensen fra den ovenfor beskrevne stamme tilbakeholdes på et nitrocellulosefilter, mens uhybridisert mRNA ikke kan under visse omstendigheter (se eksemplene nedenfor og Nygaard, A.P. & Hall, B.D. Biochem. Biophys. Res. Collum. Vol. 12, p. 98-104, 1963), kan denne mRNA utvinnes selek-tivt fra filteret ved høy temperatur (f.eks. 60°C) i en oppløsning som f.eks. 90 volum-% formamid og deretter inn-sprøytes i oocytter av Xenopus laevis.

Når interferon syntetiseres i oocyttene, må den til hybridi-seringen benyttede DNA-sekvens inneholde en DNA-sekvens som er komplementær med interferon mRNA; og på denne måte kan en rekombinant plasmid-DNA som har et gen som utviser komplementaritet med den humane fibroblast-interferon mRNA, isoleres.

Den ovenfor fremstilte rekombinate plasmid-DNA eller brudd-stykker spaltet med en restriksjon-endonuklease, merkes med

32

en isotop som f.eks. [ P] ved hjelp av Nick-oversettelses-metoden (Ridby, et al., J. Mol. Biol. vol. 113, p. 237-251, 1977) eller lignende, og anvendes som en prøve for å fremstille E. coli-stammer som inneholder et rekombinant plasmid

som har interferon mRNA-sekvensen fra de ovenfor beskrevne ampicillinresistente stammer på samme måte som beskrevet ovenfor. Flere således fremstilte stammer dyrkes, og plasmid DNA isoleres herfra. Plasmid DNA spaltes med en restriksjon-endonuklease for å oppnå den innskutte DNA. Lengden av den innskutte DNA-sekvens undersøkes for å få

et plasmid som har en innskutt DNA-sekvens som koder for hele området av interferonproteinet. Den primære oppbygging av den innskutte DNA-sekvens av den innskutte DNA-sekvens av en av de rekombinante plasmider isolert ved den ovenfor nevnte metode bestemmes slik som beskrevet i Maxam-Gilbert-metoden (Proe. Nat. Acad. Sei. USA. Vol. 74, p. 560-564, 1977), og som er illustrert i følgende eksempel. Det er således blitt vist at det omhandlede rekombinante plasmid inneholder hele koderegionen av den humane fibroblast-interferon mRNA.

Som angitt ovenfor fremstilles en DNA-sekvens som koder for humant fibroblast-interferon polypeptid, spesielt en DNA-sekvens som omfatter hele koderegionen av den humane fibroblast-interferon mRNA, et rekombinant plasmid inneholdende DNA-sekvensen og en mikroorganisme, inneholdende plasmidet.

Basesekvensen av den ovenfor fremstilte DNA og den tilsvarende peptidrekkefølge er angitt i fig. 2 .nedenfor.

Basesekvensen i fig. 2 er et foretrukket eksempel for uttrykkingen av den DNA som koder for humant interferonpolypeptid. Da aminosyrene i peptidsekvensen i fig. 2 kan være kodet ved hjelp av an basetriplet som er forskjellig fra de i fig. 2, er basesekvenser av DNA som koder for humant interferonpolypeptid forskjellig fra det i fig. 2 anførte også omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Bestemmelsen av basesekvensen av den DNA-sekvensen som koder for human-interferonpolypeptid har muliggjort kjemisk syntese av slik DNA.

En spesiell utførelsesform av foreliggende fremgangsmåte er angitt i følgende representative eksempel.

Eksempel

Etter induksjon av humane fibroblaster natten over ved inkubasjon med MEM-dyrkningssubstrat (produkt fra Nissui Seikyaku Co., Ltd., Japan) inneholdende humant interferon, som er fremstilt slik som beskrevet i Proe. Nati Acad. Sei. USA, 73, 520-523 (1976), (25 U/ml), superinduseres fibroblastene ved å tilsette 10 ym/ml poly (I) :poly(C)

(et produkt fra Galbiochem Co., USA) og 5 yg/ml cykloheksamid til substratet. Induksjonen og superinduksjonen utføres som beskrevet i henholdsvis Brit. J. Exp. Path.,

39, 452-458 (1958) og antimicrob. Agents Chemother.,

2, 476-484 (1972).

Etter 4 timers forløp ødelegges 1,5 x 10 9 superinduserte humane fibroblastere ved hjelp av Teflon-homogenizer ved en temperatur på 0-4°C i nærvær av 0,3% "NP-40" og 50 yg/ml heparin i RSB-buffer (10 mM tris-HCl, pH 7,4; 10 mM NaCl; 1.5 mM MgCl2). Kjernene ble fjernet ved sentrifugering ved 3000 omdr./min., og 4°C i 10 minutter, og man fikk 9.6 mg cytoplasmisk RNA ved 3 gangers ekstraksjon med fenol.

Den cytoplasmiske RNA ble utfe.lt med 76% etanol i nærvær

av 0,1 mM NaCl, oppløst i 10 ml 1 mM EDTA-oppløsning og inkubert i 2 minutter ved 6 5°C. Deretter ble 2,5 ml av saltoppløsning med høy konsentrasjon (0,5 M tris-HCl,

pH 7,5; IM CaCl; 50 mM EDTA) tilsatt til den ovenfor nevnte oppløsning, og blandingen påført en søyle pakket med 0,15 g av en oligo (dT) cellulose for å absorbere mRNA inneholdende poly(A). Elueringen ble deretter utført med saltoppløsning med lav konsentrasjon (10 mM tris-HCl,

pH 7,5) og vann for å isolere 250 yg mRNA inneholdende poly(A).

mRNA ble utfelt med 67% etanol i nærvær av 0,1 M NaCl og oppløst i 0,5 ml 1 mM EDTA-oppløsning. Oppløsningen ble inkubert i 2 minutter ved 65°C, sentrifugert gjennom en 5-25% sukrose-tetthetsgradient inneholdende 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 0,2 M NaCl og 1 mM EDTA (dreiet ved 35.000 omdr./min. under anvendelse av en "SW40"-rotor) ved 4°C

i 16 timer og fraksjonert i 20 fraksjoner.

Interferon mRNA-aktiviteten av hver av disse fraksjoner ble bestemt som beskrevet ovenfor, og resultatene er vist i tabell 1 nedenfor.

mRNA-innholdet i fraksjon nr. 11 var omtrent 5 yg. Denne mRNA og en revers transkriptase ble inkubert ved 37°C i 1 time i 20 yl av en reaksjonsblanding.bestående av 5 yg mRNA; 0,5 mM dATP; 0,5 mM dTTP; 0,5 mM dGTP; 0,5 mM dCTP;

1 yg oligo (dT); 8 enheter revers transkriptase (avledet fra f.eks. fjærkre-myoblastitis virus); 5 mM MgCl2; 30 mM NaCl; 5 mM merkaptoetanol og 40 mM tris-HCl (pH 8,0), og ble deretter deproteinisert med fenol. Etter at RNA var

fjernet ved behandling med 0,3 N NaOH ved 37°C i 15 timer, ble den syntetiserte enkeltkjedede DNA-sekvensen inkubert ved 37°C i 20 yl av en reaksjonsblanding (den samme blanding som beskrevet ovenfor, bortsett fra at mRNA og oligo (dT) var utelatt) i 1 time for å syntetisere 1,5 yg av en

dobbeltkjedet DNA. Den dobbeltkjedede DNA ble behandlet med nukleasé i 50 yl av en reaksjonsblanding (1,5 yg dobbeltkjédet DNA; 1 mM ZnCl2; 0,1 M natriumacetat, pH

4,5; 0,2 M NaCl; 0,05 enheter ved 37°C i 30 minutter og enzymet ble fjernet ved hjelp av fenolekstraksjon. DNA-sekvensen ble utfelt med etanol og deretter behandlet med en terminal transferase i 2 0 yl reaksjonsblanding bestående av 1,5 yg DNA, 0,14M kaliumkakodylat, pH 7,6; 0,03 M Tris (base); 0,1 mM ditiotreitol; 1 mM CoCl2; 1 mM dATP og en enhet terminal transferase ved 37 C i 20 minutter, hvorved man fikk ca. 1,5 yg av et produkt hvor poly A-kjeder var dannet ved begge 3'-endene av den dobbeltkjedede DNA.

Dessuten ble 10 yg E. coli plasmid pBR322 DNA behandlet ved 37°C i 2 timer med en restriksjon-endonuklease EcoRI i 100 yl åv en reaksjonsblanding av 10 mM tris-HCl, pH 7,5; 6 mM MgCl2; 0,1 NaCl; 6 mM merkaptoetanol; og 10 enheter EcoRI, hvilket første til spalting ved det eneste spaltnings-setet i pBR322 DNA. Det avskårne plasmid DNA ble behandlet med en eksonuklease avledet fra fag X i 200 yl av en reaksjonsblanding bestående av 10 yg DNA; 0,1 M Na-glycin, pH 9,5; 5 mM MgCl2; 50 yg/ml albumin; og 17 enheter Xekso-nuklease ved 0 C i 90 min, og enzymet ble fjernet ved fenol-ekstraks jon. DNA materialet ble behandlet med en terminal transferase i 50 yl av en reaksjonsblanding [10 yg DNA;

0,14 M kaliumkakodylat, pH 7,6; 0,03 M tris (base); 0,1 mM ditiotreitol; 1 mM CoCl2; 1 mM dTTP; 2 enheter terminal transferase] ved 37 C i 20 minutter hvorved man fikk ca.

0,5 yg av et produkt hvori poly T-kjeder var dannet ved begge 3'-endene av den ovenfor beskrevne plasmid pBR322 DNA.

Deretter ble 0,0 2 yg av den ovenfor fremstilte syntetiserte dobbeltkjedede DNA og 0,1 yg av plasmid pBR322 DNA-materialet inkubert for å hybridiseres i en oppløsning inneholdende 0,1 M NaCl, 50 mM tris-HCl (pH 7,5) og 5 mM EDTA ved 65°C i 2 minutter, ved 4 5°C i 1 time, ved 37°C i 1 time og ved rom-temperatur i 1 time. Deretter ble E. coli x!766 transfor-mert med den hybridiserte rekombinant slik som bekrevet av

Enea et al.

Ca. 4000 ampicillin-resistente stammer isoleres ved denne metode. 3600 resistente stammer ble utvalgt, og DNA-materialet av hver stamme fiksert på nitrocellulose-filtere som dobbeltprøver (Grunstein-Hogness-metoden).

32

Dessuten ble [ P] merket enkeltkjedet DNA (ca..0,44 g, spesifikk radioaktivitet ca. 6 x 10 g cpm/ g) syntetisert ved hjelp av en revers transkriptase på samme måte som beskrevet for den ovenfor nevnte enkeltkjedet DNA (dCTP

32

merket med P), idet man benyttet interferon mRNA-fraksjonen (ca. 10 yg), som som var ekstrahert og delvis renset slik som beskrevet ovenfor, som en mal. DNA-materialet ble hybridisert i 50 yl av en reaksjonsblanding (25 yg mRNA, 0,45 yg enkeltkjedet DNA merket<32>P, 0,5 mM NaCl,

25 mM Pipes-buffer, pH 5,6) ved 65°C i 40 timer med 25 yg mRNA som var ekstrahert fra humane fibroblaster som ikke var indusert med poly(I):poly(C). Den sistnevnte mRNA

ble fremstilt på samme måte som ble benyttet til ekstraksjon av poly(I):poly(C)-indusert mRNA. Reaksjonsblandingen ble påført på en søyle pakket med 0,2 g hydroksyapatitt,

og elueringen utført med 5 ml 0,14 M fosfatbuffer (pH

6,5) for å eluere den enkeltkjedede DNA, og deretter med 5 ml 0,4 M fosfatbuffer for å eluere DNA-materialet hybridisert med RNA. Som et resultat dikk man isolert DNA-sekvensen (ca. 90% av det hele) (prøve A), som

var hybridisert med det ovenfornevnte mRNA og DNA-materialet ca. 10% av det hele (prøve B) som ikke hybridiserte.

Hver prøve ble deretter hybridisert for seg med det ovenfornevnte DNA bundet på nitrocellulosefiltrene som beskrevet i Grunstein-Hogness-metoden. Man identifiserte 4 stammer som hver reagerte hovedsakelig overfor prøve B, men ikke overfor prøve A ved autoradiografi.

Tabell 2 viser reaksjonsgraden av DNA-sekvensene fra de fire stammer overfor hver prøve, anskueliggjort ved auto- radiogrammer.

Plasmid DNA ble isolert fra celler av fire stammer som beskrevet av Currier og Nester (Analut. Biochem. Vol. 75, p. 431-441, 1976) . Deretter ble disse DNA-forbindelser hybridisert med interferon mRNA på følgende måte: Først ble 5 yg plasmid DNA linearisert ved inkubering med restriksjon-endonuklease Hind III, som kan oppnås fraHaemophilus influenzae Rd i 50 yl av en reaksjonsblanding bestående av 10 mM tris-HCl, pH 7,5; 6 mM MgCl2; 50 mM NaCl;

6 mM merkaptoetanol; og 5 enheter Hind III ved 37 C i

2 timer. Etter deproteinisering ved fenolekstraksjon ble DNA-materialet utfelt med etanol og oppløst i 20 yl 80 vekt/ vol-% formamid.

Oppløsningen ble denaturert ved 85°c i 10 minutter og deretter inkubert i en oppløsning bestående av 2,5 yg mRNA, 20 yl 80 vekt/vol.-% formamid, 20 mM Pipes-buffer (pH 6,5), 0,4 M NaCl og 5 mM EDTA ved 5 3°C. Fire timer senere ble blandingen blandet med 0,4 ml 3 x SSC (.1 x SSC tilsvarer 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat) ved 90°C, og ble filtrert gjennom et nitrogencellulosefilter (diameter 1 cm, porestørrelse 0,45 ym) med en hastighet på ca. 0,5 ml.pr. minutt. Etter av-vasking av filteret med ca. 1,5 ml 2 x SSC ble filteret neddyppet i en oppløsning bestående av 0,6 ml 90 vol-% formamid, 20 mM Pipes-buffer, 0,1% SDS (natriumdodecyl-sulfat) og 5 mM EDTA. Inkuberingen av filteret i 2 minutter ved 60°C og fjerning av oppløsningen ble gjentatt 3 ganger, og RNA-materialet eluert fra nitrocellulosefilteret over i oppløsningen (1,8 ml) ble utfelt med etanol i nærvær av 0,1 M NaCl. mRNA-sekvensen inneholdende poly(A) ble isolert fra RNA-materialet under anvendelse av oligo (dT) cellulosesøylekromatografi, oppløst i en blanding av 3 yl 10 mM tris-HCl (pH 7,5) og 88 mM NaCl, og ble innsprøytet i oocytter av Xenopus laevis. Etter 15 timers forløp ble det syntetiserte interferon i oocyttene (antiviral virkning) bestemt.

Tabell 3 viser interferon mRNA-aktiviteten av den mRNA som er blitt hybridisert med DNA-materialet avledet fra 4 av de ovenfor nevnte bakteriestammer.

5 yg plasmid fremstilt fra stamme nr. 319 ved Currier ogNester-metoden ble spaltet med restriksjon-endonuklease

Hind III på samme måte som beskrevet ovenfor. DNA-materialet og rekombinant-plasmidet 3GpBr322 DNA (vektoren var pBR322)

(levert av Institute for Molecular Biology I of University of Zurich eller fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i Nature 281, 40-46, 1979) inneholdende kanin 3-glpbulin-

gen, for seg eller som blanding, ble hybridisert med en

blanding av kaninglobulin mRNA (oppnådd fra røde blod-legemer fra kaniner) (1 yg) og interferon mRNA (2,5 yg) oppnådd fra humane fibroblaster under de tidligere nevnte betingelser. mRNA-materialet som dannet et hybrid, ble injisert inn i oocytter av Xenopus laevis. Oocyttene ble deretter inkubert 15 timer i Barth's dyrkningsmedium (J. Embryol. Exp. Morph. 7, 210, 1959) inneholdende [<3>H] merket histodin og [ 3H] merket globin og isolert med akrylamidgelelektroforese og bestemt kvantitativt ved hjelp av fluorografi som beskrevet i Eur. J. Biochem. 46, 83-88, 1974). Interferonen ble bestemt ved antiviral aktivitet som beskrevet ovenfor. Syntesen av kanin globin og det humane interferon ble bestemt på samme måte. Resultatet er vist i tabell 4 nedenfor.

Fra resultatet av dette forsøk kan det sees at DNA fra nr. 319 har DNA (interferongenet) som danner et hybrid spesielt med interferon mRNA-materialet.

DNA-materialet av nr. 319 ble spaltet med flere restriksjon-endonukleaser, og en restriksjon-endonukleaseoversikt, fig. 1 (a), ble laget ved hjelp av agaroseelektroforese.

Restriksjon-endonukleasene Pst I, Bgl II og Hind III spalter nr. 319 DNA ved de angitte seter i fig. 1 (a).

Fragmentene oppnådd ved å spalte nr. 319 DNA med restriksjon- endonuklease Pst I og Bgl II, ble isolert og renset ved hjelp av gelelektroforese som beskrevet i Tabak&Flavell (Nucleic Acids Research, vol. 5, p. 2321-2332, 1978) .

32

Fragmentene ble merket ved P slik som beskrevet av

Rigby et al. (J. Mol. Biol. vol. 113, p. 237-251, 1977),

og de merkede fragmenter anvendt som prøve. Flere stammer inneholdende et plasmid som viser komplementaritet overfor prøven ble isolert fra de ovennevnte ampicillin-resistente stammer som beskrevet av Grunstein&Hogness (proe. Nat. Acad. Sei. USA, Vol. 72, p. 3961-3965, 1975), nemlig kolonihybridiseringsmetoden. Plasmid DNA-materialet fremstilt fra hver av stammene som beskrevet av Currier-Nester, og de innskutte deler herav ble spaltet med en restriksjon-endonuklease som f.eks. Hind III. Lengden av de avskårne plasmid DNA fragmenter ble sammenlignet, og de lengste plasmid DNA-fragmenter utvalgt. Plasmiden ble benevnt nr. 319-13.

Restriksjon-endonukleasekartet av plasmidet er illustrert

i fig. 1 (b) som anskueliggjør at det omhandlede plasmid har en mRNA-sekvens inneholdende mRNA-sekvensen fra nr. 319. Den primære struktur (basesekvensen) av mRNA-sekvensen innskutt i plasmidet av nr. 319-13 ble bestemt som beskrevet av Maxam-Gilbert (Proe. Nat. Acad. Sei. USA. vol. 74 p, 560-564, 1977). Den primære struktur er angitt i fig. 2..

DNA-sekvensen muliggjør forutsigelse av hele aminosyresekvensen av human-fibroblast-interferon (aminosyrene.1-166) og dets formodede signalpeptid (aminosyrene -21-1) som vist i linjen ovenfor DNA-sekvensene.

Det er viktig at det i sekvensen helt sikkert eksisterer basesekvensen (3 basepar) tilsvarende aminosyresekvensen fra den amino-terminale til 13. aminosyre av det humane fibroblast-interferon slik som angitt av Knight et al., (Science vol. 207, p. 525-526, 1980). Denne kjennsgjerning viser at det omhandlede nr. 319-13 plasmid har den humane

fibroblast-interferon mRNA-sekvens.

Ytterligere fremgår det av data av den primære sekvens

at plasmidet omfatter hele koderegionen av det ovenfornevnte mRNA-protein, og sannynligvis koderegionen av signalpeptidet.

319-13 plasmidet som er benevnt TpIF 319-13, er trans-formert E. coli x!776,°g anbragt i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, under aksesjons-nummeret ATCC 31712, hvorfra det er offentlig tilgjengelig.

Claims (3)

1. DNA-sekvens som koder for et polypeptid med humanfibroblast-interferonaktivitet,karakterisert vedat den er komplementær til humant fibroblastinterferon mRNA som styrer syntese av biologisk aktivt humant fibroblastinterferon i etXenopus laevis oocytt translasjonssystem.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en DNA-sekvens som koder for et polypeptid med humanfibroblast-interferonaktivitet,karakterisert vedat man isolerer en humanfibroblast-interferon mRNA fra human cytoplasmatisk RNA og syntetiserer en dobbeltkjedet DNA under anvendelse av nevnte mRNA som en templat, og enzymene revers transkriptase og DNA polymerase I.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant plasmid og eventuelt en mikroorganisme inneholdende dette,karakterisert vedat en DNA sekvens som viser komplementaritet overfor humant fibroblast interferon mRNA, innføres i et plasmid for dannelse av det rekombinante plasmidet TpIF 319-13 og eventuelt transformerer E. coli x 1776 med dette ved hjelp av i og for seg kjente metoder.