JP2023052664A - 抗配列類似性19を持つファミリー、メンバーa5抗体及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願に関する相互参照事項
本PCT出願は、2019年1月2日付に出願された米国仮出願第62/787,711号及び2019年4月24日付に出願された第62/838,190号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全文が本明細書に参照によって組み込まれる。
電子提出された配列目録に関する参照事項
本出願と共に提出されたASCIIテキストファイル(名:3763_016PC02_SeqListing_ST25.txt;サイズ:90,231バイト;及び、生成日:2019年12月30日)の電子提出された配列目録の内容は、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
政府支援の陳述
本研究は、大韓民国産業通商資源部(MOTIE)の産業技術革新事業(10081300、虚血性脳卒中に対する神経膠傷痕形成の阻害機序を用いた治療用単クローン性抗体新薬開発)の研究費支援を受けて行われた。
FAM19A5は、5個の相同性が高い小さなタンパク質で構成されているタンパク質のTAFAサブファミリーに属する一種である。Tang T.Y.et al.,Genomics 83(4):727-34(2004)を参照されたい。これらのタンパク質は、所定位置に保存されたシステイン残基を含有し、CC-ケモカインファミリーに属する一種である大食細胞炎症タンパク質1-アルファ(MIP-1-アルファ)とかすかに関連がある。前記TAFAタンパク質は脳と脊髄の特定領域で主に発現する。これらのタンパク質神経発生過程で成体神経幹細胞によって生成及び分泌されるものとされている。
[発明が解決しようとする課題]
FAM19A5阻害は、中枢神経系を治療するのに重要な役割を担うことができるが、FAM19A5に特異的に結合し、FAM19A5活性を調節できる抗体、特に、副作用無しでヒト対象に使用できる抗体を開発する必要が依然としてある。
本明細書は、配列類似性19を持つヒトファミリー、メンバーA5(FAM19A5)タンパク質に特異的に結合し、重鎖CDR1、CDR2及びCDR3並びに軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む分離された抗体(“抗FAM19A5抗体”)又はその抗原結合部分であって、前記重鎖CDR1、CDR2及びCDR3はそれぞれ、配列番号5、6及び7に示したアミノ酸配列を含み、前記配列のそれぞれは、場合によって1、2、3、4又は5個の突然変異を含み、前記軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3はそれぞれ、配列番号8、9及び10に示したアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3の少なくとも一つは、1、2、3、4又は5個の突然変異を含み、前記抗体は、配列番号11に示したVH及び配列番号12に示したVLを含む基準抗体に比べて、ヒトにおいて減少した免疫原性を有する分離された抗体又はその抗原結合部分を提供する。
図1A~図1Cは、FAM19A5タンパク質に対する個別scFvクローンの結合を分析して提供している。405nmで吸光度を測定した。X軸にはクローン番号が提供されている。図1A~図1Cはそれぞれ、4次、5次又は6次バイオパンニングによって第1ニワトリ、第2ニワトリ及び第3ニワトリから由来した96個クローンの分析を示している。図1A~図1Cに示すそれぞれのクローンに対して、垂直棒は、FAM19A5タンパク質、陰性対照群タンパク質、血球凝集素タンパク質及びBSA(左から右の順に)に該当する。図1A、図1B及び図1Cのそれぞれにおいて、ボックス中のクローンは、追加分析のために選別された8個のクローンである(実施例4参照)。
する。図16Bで、左パネルは還元SDS-PAGEを示し、右パネルは非還元SDS-PAGEを示している。
本明細書は、配列類似性19を持つヒトファミリー、メンバーA5(FAM19A5)タンパク質に特異的に結合して本明細書に開示の特性のいずれか一つ以上を示す分離された単クローン性抗体(“抗FAM19A5抗体”)又はその抗原結合部分を開示する。具体的に、前記抗FAM19A5抗体は、ヒト対象において免疫原性を減少させるために脱免疫化された。
本開示内容全般にわたって、用語“一つの”又は“ある”実体は、その実体の1つ以上をいうもので、例えば、“一つの抗体”は1つ以上の抗体を表すものと理解される。このように、用語“一つ”(又は“ある”)、“1つ以上の”及び“少なくとも1つの”は、本明細書で同じ意味で使われる。
Molecular Biology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press;Dictionary of Cell and Molecular Biology,3rd ed,1999,Academic Press;及びOxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology,Revised,2000,Oxford
University Pressは、当業者に、本開示内容で使われている用語の多数を提供している。
(II)アイソ型2(UniProt:Q7Z5A7-2、可溶性タンパク質):
MQLLKALWAL AGAALCCFLV LVIHAQFLKE GQLAAGTCEI VTLDRDSSQP RRTIARQTAR CACRKGQIAG TTRARPACVD ARIIKTKQWC DMLPCLEGEG CDLLINRSGW TCTQPGGRIK TTTVS(配列番号2)
(III)アイソ型3(UniProt:Q7Z5A7-3):
MYHHREWPAR IIKTKQWCDM LPCLEGEGCD LLINRSGWTC TQPGGRIKTT TVS(配列番号3)
用語“FAM19A5”は、細胞によって自然的に発現するFAM19A5の任意の変異体又はアイソ型を含む。したがって、本明細書に記載された抗体は、同一種内の異なるアイソ型(例えば、ヒトFAM19A5の異なるアイソ型)と交差反応したり、或いはヒト以外の種のFAM19A5(例えば、マウスFAM19A5)と交差反応し得る。これと違い、前記抗体は、ヒトFAM19A5に特異的であり得、異なる種とはいかなる交差反応も示さないことがある。FAM19A5又はその任意の変異体及びアイソ型は、これらを自然的に発現させる細胞又は組織から分離されたり、或いは組換えによって生産され得る。ヒトFAM19A5をコードするポリヌクレオチドは、GenBank受託番号BC039396、及び次のような配列を有する:
TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391 and
Kabat EA et al,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242参照)。Kabat番号表記体系を用いると、抗体重鎖分子内CDRは、典型的に、アミノ酸位置31~35番(CDR1)(場合によって35番以降に1個又は2個の追加アミノ酸を含んでもよい(Kabat番号表記方式では35A及び35Bと称する。)、アミノ酸位置50~65番(CDR2)及びアミノ酸位置95~102番(CDR3)に存在する。Kabat番号表記体系用いると、抗体軽鎖分子内CDRは、典型的に、アミノ酸位置24~34番(CDR1)、アミノ酸位置50~56番(CDR2)及びアミノ酸位置89~97番(CDR3)に存在する。特定の具現例において、本明細書に記載の抗体のCDRは、Kabat番号表記方式によって決定している。
Microbiol Biotechnol.77(1):13-22(2007))。
少したり又は存在しない定常領域を含む。
of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242;Vidarsson G.et al.,Front Immunol.5:520(2014年10月20日オンライン公開)を参照する。
Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt4):339-350;McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23;Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274;McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303参照)。抗体:抗原結晶は、周知のX線回折技術を用いて研究でき、X-PLOR(Yale University,1992,Molecular Simulations,Inc.によって配布;例えば、Meth Enzymol(1985)volumes 114 & 115,eds Wyckoff H.W.et al.,;U.S.2004/0014194参考)及びBUSTER(Bricogne G.(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt1):37-60;Bricogne G.(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,ed Carter CW;Roversi P.et al.,(2000)Acta Crystallogr D Biol
Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)のようなコンピュータソフトウェアを用いて精製(refine)され得る。突然変異誘発マッピング研究は、当業者に公知された任意の方法を用いて行うことができる。アラニンスキャニング突然変異誘発技術を含む突然変異誘発技術の記載については、例えば、Champe M.et al.,(1995)J Biol Chem 270:1388-1394及びCunningham B.C. & Wells J.A.(1989)Science 244:1081-1085を参考する。
Biotech.23(9):1117-1125参照)、前記可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するように再配列される様々な遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含有する。再配列の他にも、前記可変領域は、外来抗原に対する抗体の親和性を増加させるために多数の単一アミノ酸変化(体細胞突然変異又は超突然変異という)によってさらに変形され得る。前記定常領域は、抗原に対する追加反応にしたがって変わるだろう(すなわち、アイソ型変化)。したがって、抗原に反応して軽鎖及び重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする、再配列され体細胞突然変異した核酸分子は、本来の核酸分子と配列同一性を有することはできないが、その代わりに、実質的に同一又は類似するであろう(すなわち、少なくとも80%同一性を有する)。
Neurosci(1999)2:1114-1119.前記ERK遺伝子、タンパク質、リン酸化及び活性化は公知されており、特性が分析されており、ERK及びpERKの発現は当業界に公知の方法(例えば、ノーザンブロット、定量的PCR又は免疫組織化学的方法)によって決定され得る。Gao Y.J.and Ji R.R.,Open
Pain J.(2009)2:11-17を参照する。用語“pERK発現増加”は、ERK mRNA、ERKタンパク質又はpERK活性レベルの増加を含む。
本明細書は、特定機能的特徴又は特性を特徴とする抗体、例えば、単クローン性抗体を開示する。例えば、ヒトFAM19A5に特異的に結合する前記抗体は、ヒトにおいて高度に免疫原性である領域又は残基を除去及び/又は変形することによって突然変異(例えば、置換又は欠失)されている(すなわち、脱免疫化されている)。したがって、本明細書に開示の抗体、すなわち、抗FAM19A5抗体は、基準抗体(例えば、脱免疫化されていない対応抗体、例えば、3-2又は2-13抗体)に比べて、ヒトを対象に投与時に免疫原性が減少する。
(a)KDが10nM以下である可溶性ヒトFAM19A5に結合する特性;
(b)KDが10nM以下である膜結合ヒトFAM19A5に結合する特性;
(c)反応性神経膠症の発病を減少、反転、遅延及び/又は予防する特性;
(d)反応性星状細胞の過剰増殖を抑制する特性;
(e)ニューロカン及び神経膠抗原2(NG2)を含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現を減少させる特性;
(f)神経細胞の核内c-fos及びpERKの発現を増加させる特性;
(g)神経細胞の生存を促進する特性;
(h)神経細胞内GAP43の発現を増加させる特性;及び
(i)軸索の再成長を促進する特性。
(a)配列番号6のアミノ酸6においてグリシンの酸性アミノ酸への置換;
(b)配列番号6のアミノ酸7においてセリンの酸性アミノ酸への置換;
(c)配列番号6のアミノ酸8においてセリンの酸性アミノ酸への置換;
(d)配列番号6のアミノ酸9においてトレオニンの酸性アミノ酸への置換;及び
(e)配列番号6のアミノ酸16においてアルギニンの塩基性アミノ酸への置換。
(a)配列番号10のアミノ酸6においてセリンの酸性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸への置換;
(b)配列番号10のアミノ酸7においてアスパラギンの酸性アミノ酸又はヒドロキシル又は硫黄/セレニウム含有アミノ酸への置換;
(c)配列番号10のアミノ酸8においてグリシンの酸性アミノ酸又はヒドロキシル又は硫黄/セレニウム含有アミノ酸への置換;
(d)配列番号10のアミノ酸9においてグリシンの酸性アミノ酸又はヒドロキシル又は硫黄/セレニウム含有アミノ酸への置換;及び
(e)配列番号10のアミノ酸10においてイソロイシンの塩基性アミノ酸への置換。
(a)配列番号8のアミノ酸6においてチロシンの酸性アミノ酸への置換;
(b)配列番号8のアミノ酸7においてアルギニンの酸性アミノ酸への置換;
(c)配列番号8のアミノ酸8においてグリシンの酸性アミノ酸への置換;及び
(d)配列番号8のアミノ酸9においてセリンの酸性アミノ酸への置換。
(a)配列番号9のアミノ酸1においてグルタミン酸の酸性アミノ酸への置換;
(b)配列番号9のアミノ酸2においてセリンの酸性アミノ酸への置換;
(c)配列番号9のアミノ酸3においてアスパラギンの酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸への置換;及び
(d)配列番号9のアミノ酸4においてリシンの酸性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸への置換。
(a)前記VHは、配列番号33に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号38に示したアミノ酸配列を含むか;
(b)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号39に示したアミノ酸配列を含むか;
(c)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号41に示したアミノ酸配列を含むか;
(d)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号40に示したアミノ酸配列を含むか;
(e)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号42に示したアミノ酸配列を含むか;
(f)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号43に示したアミノ酸配列を含むか;又は
(g)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号44に示したアミノ酸配列を含む。
(a)前記VHは、配列番号33に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号38に示したアミノ酸配列を含むか;
(b)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号39に示したアミノ酸配列を含むか;
(c)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号41に示したアミノ酸配列を含むか;
(d)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号40に示したアミノ酸配列を含むか;
(e)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号42に示したアミノ酸配列を含むか;
(f)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号43に示したアミノ酸配列を含むか;又は
(g)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号44に示したアミノ酸配列を含む。
(a)前記VHは、配列番号33に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号38に示したアミノ酸配列を含むか;
(b)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号39に示したアミノ酸配列を含むか;
(c)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号41に示したアミノ酸配列を含むか;
(d)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号40に示したアミノ酸配列を含むか;
(e)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号42に示したアミノ酸配列を含むか;
(f)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号43に示したアミノ酸配列を含むか;
(g)前記VHは、配列番号34に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号44に示したアミノ酸配列を含むか;
(h)前記VHは、配列番号36に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含むか;
(i)前記VHは、配列番号37に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含むか;
(j)前記VHは、配列番号130に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含むか;又は
(k)前記VHは、配列番号131に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のさらに他の態様は、本明細書に記載の抗体のいずれか一つをコードする一つ以上の核酸分子に関する。前記核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製されたり或いは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸(例えば、他の染色体DNA、例えば、自然で分離されたDNAに連結された染色体DNA)又はタンパク質からアルカリ/SDS処理、CsClバンディング(banding)、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動及び当業界によく知られたその他の技術を含む標準技術によって精製される時、“分離”されたり或いは“実質的に純粋になる”。F.Ausubel,et al.,ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New Yorkを参照する。本明細書に記載の核酸は、例えば、DNA又はRNAであり、イントロン配列を含有しても含有しなくてもよい。特定の具現例において、前記核酸は、cDNA分子である。
Interest,Fifth Edition,US Department of
Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242参考)、これらの領域を含むDNA断片は、標準PCR増幅によって得ることができる。前記重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域、例えばIgG2及び/又はIgG4定常領域であり得る。Fab断片重鎖遺伝子の場合、前記VH-コーディングDNAは、重鎖CH1定常領域だけをコードするさらに他のDNA分子に作動的に連結され得る。
No.91-3242)、これらの領域を含むDNA断片は、標準PCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得る。
stomatitis)ウイルス(VSV)タンパク質G(VSV G)のような他のenv遺伝子、肝炎ウイルス及びインフルエンザーの遺伝子も用いられ得る。
FAM19A5(例えば、ヒトFAM19A5)に免疫特異的に結合する抗体又はその断片は、抗体の合成のために当業界に公知の任意の方法、例えば化学的合成又は組換え発現技術によって生成され得る。本明細書に開示された方法は、特に言及がない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子分析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成及び変形、核酸混成化、及び当業界の関連技術分野における従来の技術を利用する。これらの技術は、例えば、本明細書で援用された参考文献に完全に説明されている。例えば、Maniatis T et al.,(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Sambrook J et al.,(1989)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor
Laboratory Press;Sambrook J et al.,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,NY;Ausubel FM et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987 and annual updates);Current Protocols in Immunology,John Wiley
& Sons(1987 and annual updates)Gait(ed.)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein(ed.)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press;Birren B et al.,(eds.)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参考されたい。
G & Milstein C(1975)Nature 256:495に記載されたとおり、ハイブリドーマ方法によって作ってもよく、例えば、本明細書に記載の技術を用いてファージライブラリーから分離されてもよい。クローン細胞株及びこれによって発現する単クローン性抗体を製造するための他の方法は、当業界によく知られている(例えば、上のChapter 11 in:Short Protocols in Molecular Biology,(2002)5th Ed.,Ausubel FM et al.を参照)。
JW(Ed)、Monoclonal Antibodies:Principles
and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。さらに、RIMMS(反復免疫多重部位)技術を用いて動物を免疫化できる(Kilpatrick KE et al.,(1997)Hybridoma 16:381-9、その全体が参照として含まれる)。
al.,(1995)J Immunol Methods 182:41-50;Ames RS et al.,(1995)J Immunol Methods 184:177-186;Kettleborough CA et al.,(1994)Eur J Immunol 24:952-958;Persic L et al.,(1997)Gene 187:9-18;Burton DR & Barbas CF(1994)Advan Immunol 57:191-280;PCT出願番号PCT/GB91/001134;国際公開番号WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401及びWO97/13844;米国特許番号第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号及び第5,969,108号に開示されているものを含む。
91:969-973)、チェーンシャッフリング(米国特許番号5,565,332)及び例えば米国特許番号6,407,213、米国特許番号5,766,886、国際公開番号WO93/17105;Tan P et al.,(2002)J Immunol 169:1119-25;Caldas C et al.,(2000)Protein Eng.13(5):353-60;Morea V et al.,(2000)Methods 20(3):267-79;Baca M et al.,(1997)J Biol Chem 272(16):10678-84;Roguska MA et al.,(1996)Protein Eng 9(10):895-904;Couto JR et al.,(1995)Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s;Couto JR et al.,(1995)Cancer Res 55(8):1717-22;Sandhu JS(1994)Gene 150(2):409-10及びPedersen JT et al.,(1994)J Mol Biol 235(3):959-73に開示された技術。また、米国出願公開番号US2005/0042664A1(2005年2月24日)を参照する。
Y et al.,(2005)Human Antibodies 14:27-31参照)。
上で議論したとおり、本明細書に開示のVH及びVL配列を持つ抗FAM19A5抗体は、VH及び/又はVL配列又はこれに付着した定常領域を変形させることによって新しい抗FAM19A5抗体を生成するために使用することができる。これによって、本明細書に記載のさらに他の態様では、本明細書に記載の抗FAM19A5抗体の構造的特徴は、ヒトFAM19A5に対する結合のように本明細書に記載の抗体の少なくとも一つの機能的特性を保有する構造的に関連した抗FAM19A5抗体を生成するために用いられる。例えば、前記操作方法のための出発物質は、本明細書に提供されたVH及び/又はVL配列又はその一つ以上のCDR領域である。前記操作された抗体を生成するために、本明細書に提供された一つ以上のVH及び/又はVL配列又はその一つ以上のCDR領域を持つ抗体を実際に製造(すなわち、タンパク質として発現)する必要がない。その代わりに、前記配列に含まれた情報を出発物質として使用し、本来の配列から派生した“2世代”配列を生成した後、“2世代”配列を製造し、タンパク質として発現させる。
(a)(i)表3に示したCDR1、CDR2及び/又はCDR3配列又は表5に示した重鎖可変領域のCDR1、CDR2及び/又はCDR3を含む重鎖可変領域配列;及び(ii)表4に示したCDR1、CDR2及び/又はCDR3配列又は表6に示した重鎖可変領域のCDR1、CDR2及び/又はCDR3を含む軽鎖可変領域配列を提供し;
(b)前記重鎖可変領域配列及び/又は軽鎖可変領域配列内の少なくとも一つのアミノ酸残基を変形して少なくとも一つの変形された抗体配列を生成し;
(c)前記変形された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む、抗FAM19A5抗体を製造するための方法が提供される。
(1)ヒト対象で減少した免疫原性;
(2)例えば、Biacoreによって測定したとき、KDが10nM以下(例えば、0.01nM~10nM)である可溶性ヒトFAM19A5に結合;
(3)例えば、ELISAによって測定したとき、KDが10nM以下(例えば、0.01nM~1nM)である膜結合ヒトFAM19A5に結合;
(4)例えば、ELISAによって測定したとき、EC50が1nM以下(例えば、0.01nM~1nM)である膜結合ヒトFAM19A5に結合;
(5)反応性神経膠症の発病を減少、反転、遅延及び/又は予防;
(6)反応性星状細胞の過剰増殖抑制;
(7)ニューロカン及び神経細胞膠抗原2(NG2)を含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現減少;
(8)神経細胞の核においてc-fos及びpERKの発現増加;
(9)神経細胞の生存促進;
(10)神経細胞においてGAP43の発現増加;
(11)軸索の再成長促進;及び
(12)ヒトFAM19A5に結合に対していずれか一方向又は両方向に本明細書に開示の抗FAM19A5抗体と競合。
特定の態様において、本明細書は、FAM19A5(例えば、ヒトFAM19A5)及び関連ポリヌクレオチド及び発現ベクターに特異的に結合する本明細書に記載の抗体(又はその抗原結合断片)を発現させる(例えば、組換えによって)細胞(例えば、宿主細胞)を提供する。本明細書は、宿主細胞、例えば、哺乳類細胞において組換え発現のための抗FAM19A5抗体又は断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター(例えば、発現ベクター)を提供する。また、本明細書は、抗FAM19A5抗体(例えば、ヒト又はヒト化抗体)を組換えによって発現させるための当該ベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の態様において、本明細書は、宿主細胞から当該抗体を発現させることを含む、本明細書に記載の抗体を生産するための方法を提供する。
Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794);pINベクター(Inouye S & Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13:3101-3109;Van Heeke G & Schuster SM(1989)J Biol Chem 24:5503-5509);などが含まれるが、これに制限されるものではない。例えば、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)によって融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるためにpGEXベクターを使用してもよい。一般に、当該融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着及び結合した後、遊離グルタチオンが存在する状態で溶出することによって、溶解された細胞から容易に精製され得る。前記pGEXベクターは、トロンビン又は因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように構成され、クローニングされた標的遺伝子産物がGSTモイエティから放出され得る。
77(6):3567-70;O’Hare K et al.,(1981)PNAS 78:1527-31);ミコフェノール酸耐性を付与するgpt(Mulligan RC & Berg P(1981)PNAS 78(4):2072-6);アミノグリコシドG-418耐性を付与するneo(Wu GY & Wu CH(1991)Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev P(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573-596;Mulligan RC(1993)Science 260:926-932;及びMorgan
RA & Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62:191-217;Nabel GJ & Feigner PL(1993)Trends Biotechnol 11(5):211-5);及びハイグロマイシン耐性を付与するhygro(Santerre RF et al.,(1984)Gene
30(1-3):147-56)。組換えDNA技術分野で知られた通常の方法は、所望の組換えクローンを選別するために一般に適用されてよく、当該方法は、例えばその全体が本明細書に参照によって含まれるAusubel FM et al.,(eds.)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993);Kriegler M,Gene Transfer and Expression,A Laboratory
Manual,Stockton Press,NY(1990);及びChapters 12 and 13,Dracopoli NC et al.,(eds.)、Current Protocols in Human Genetics,John
Wiley & Sons,NY(1994);Colbere-Garapin F
et al.,(1981)J Mol Biol 150:1-14に記載されている。
expression of cloned genes in mammalian
cells in DNA cloning,Vol 3(Academic Press,New York,1987を参照))。抗体を発現させるベクターシステム内マーカーが増幅可能なとき、宿主細胞培養物に存在する阻害剤のレベル増加は、マーカー遺伝子の複製数を増加させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の生産も増加するであろう(Crouse GF et al.,(1983)Mol Cell Biol 3:257-66)。
本明細書に記載の抗体は、FAM19A5に対する結合を、例えば標準ELISAによって試験できる。簡単にいえば、微細力価プレートを、PBS中1~2μg/mlの精製されたFAM19A5でコートした後、PBS中5%ウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体希釈液(例えば、FAM19A5-免疫化マウスの血漿希釈液)をそれぞれのウェルに添加し、37℃で1~2時間培養する。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、37℃で1時間セイヨウワサビ過酸化酵素(HRP)に接合された2次試薬(例えば、ヒト抗体の場合、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的多クローン試薬)と共に培養する。洗浄後、プレートをABTS基質(Moss Inc,product:ABTS-1000)で発色させ、OD 415~495で分光光度計によって分析する。次に、ヒトFAM19A5を発現させる細胞株には結合するが、FAM19A5を発現しない対照群細胞株には結合しないものに対して免疫化されたマウスの血清を流細胞分析法によってさらにスクリーニングする。簡単にいえば、抗FAM19A5抗体の結合を1:20希釈比で抗FAM19A5抗体と共にFAM19A5発現CHO細胞を培養することによって評価する。細胞を洗浄し、結合をPE-標識抗ヒトIgG Abによって検出する。流細胞分析は、FACS can流細胞分析法(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いて行う。好ましくは、最も高い力価を示すマウスを融合用に使用するであろう。
本明細書に記載の抗体を、二重特異的分子を形成するために使用することができる。抗FAM19A5抗体又はその抗原結合部分は誘導体化されたり、或いは別の機能性分子、例えば他のペプチド又はタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体又はリガンド)に連結されて少なくとも2個の異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異的分子を生成できる。IL-6、CNTF、LIF、EGF及びTGFαのようなサイトカインは、以降、CNS損傷後反応性星状膠細胞症の多い様相を調節する転写のタンパク質信号伝達因子及び活性化因子3(STAT3)を活性化することによって神経膠症及び/又は反応性星状膠細胞症の発病促進因子として関与した(Balasingam et al.,J.Neurosci.14(2):846-56(1994);Winter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.20;92(13):5865-9(1995))。Herrmann J.E.et al.,J.Neurosci.28(28):7231-7243(2008)を参照する。例えば、STAT3が存在しないか減少すると、神経膠繊維質酸性タンパク質(GFAP)の上向き調節弱化、星状細胞肥大の失敗及び炎症の拡散増加、病変体積の増加、CNS損傷後運動機能回復の部分的な弱化として現れる。Herrmann J.E.et al.,J.Neurosci.28(28):7231-7243(2008)を参照する。これによって、例えば、抗FAM19A5抗体は、例えば、IL-6、CNTF、LIF、EGF又はTGFαに対する抗体のように、組合せ治療のための神経膠症の発病及び/又は反応性星状膠細胞症の過剰増殖の阻害に関与する任意のタンパク質に特異的に結合する抗体又はscFvに連結され得る。
al.,(1985)Science 229:81-83)及びGlennie et al.,(1987)J.Immunol.139:2367-2375)に記載されている方法を含む。好ましい接合剤はSATA及びsulfo-SMCCであり、いずれもPierce Chemical Co.(Rockford,IL)から入手できる。
一具現例において、抗FAM19A5抗体に付着したモイエティは、結合モイエティ、標識モイエティ及び生物学的活性モイエティからなる群から選ばれる。
本明細書は、生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)において所望の程度の純度を持つ、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合部分を含む組成物を提供する。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、使用された投与量及び濃度において、受容者に非毒性であり、ホスフェート、シトレート及びその他の有機酸のような緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールのような);低分子量(約10個未満の残基)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン(lysine)のようなアミノ酸;単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAのようなキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールのような糖;ナトリウムのような塩形成対イオン;金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM(登録商標)、PLURONICS(登録商標)又はポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書は、本明細書に記載の一つ以上の抗体又はその抗原結合部分を含むキットを提供する。特定の具現例において、本明細書は、本明細書に提供された一つ以上の抗体又はその抗原結合部分のような、本明細書に記載の薬剤学的組成物の成分の一つ以上が満たされた一つ以上の容器、及び場合によって使用説明書を含む、薬剤学的パック又はキットを提供する。一部の具現例において、前記キットは、本明細書に記載の薬剤学的組成物及び本明細書に記載されたような任意の予防剤又は治療剤を含有する。
本明細書はまた、必要とする対象(例えば、ヒト)にCNSに対する傷害又は損傷を軽減させるための方法として、前記対象に本明細書に記載の抗FAM19A5抗体、二重特異的分子又は免疫接合体又はその組成物を投与することを含む方法を提供する。
〔実施例1 ヒトFAM19A5タンパク質の発現及び精製〕
下に記載の通りに組換えヒトFAM19A5タンパク質を生産及び精製し、精製されたタンパク質を結合親和度分析に基づいて抗体スクリーニング分析に使用した。まず、FAM19A5遺伝子を発現させるLPS-hTプラスミドをバクテリアに形質転換させ、タンパク質過発現を誘導した。生産後、FAM19A5タンパク質を、Ni-NTA親和性クロマトグラフィー(Qiagen,Valencia,CA,USA)を用いて精製した。次第により高い濃度のイミダゾールを用いてHis-標識FAM19A5タンパク質をNi-カラムから除去した。前記溶液においてタンパク質発現は、Coomassie
Brilliant Blue R-250染料を用いて測定する。FAM19A5イミダゾール含有溶液だけを取り、PBSを用いてFAM19A5タンパク質を濃縮させた。濃縮が完了すれば、ウェスタンブロット分析法を用いてFAM19A5タンパク質の純度及び濃度を測定した。次いで、濃縮したタンパク質を用いてFAM19A5特異的抗体をスクリーニングした。
1.免疫化
FAM19A5タンパク質をホワイトレグホンニワトリの免疫化のための抗原として使用し、50μgの合成ペプチドKLH接合体を750μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で混合し、37℃で30分間培養した。その後、油中水乳化補助剤(RIBI+MPL+TDM+CWSアジュバント、Sigma,St.Louis,Mo,USA)を含有するTDW及びCWSの細胞壁成分の2%スクアレン耐毒素MPL(モノホスホリルリピドA種)及びミコバクテリア(mycobacteria)から毒素を除去し、乳化させた後、ニワトリに皮下注射した。免疫化中にニワトリを略2~3週間隔で総4回免疫化させた。免疫化した動物から得た抗体の力価を、FAM19A5タンパク質を過発現させたHEK293T細胞の溶解物を使用する免疫ブロッティングで測定した。
TRI試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA USA)を用いて、上述の免疫化されたニワトリの脾臓、骨髄及びファブリキウス嚢からRNAを抽出した。オリゴ-dTプライマーとSUPERSCRIPTTM III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いて第1鎖cDNAを合成した。前記動物の免疫系から得たcDNAの場合、Expand High Fidelity PCRシステム(Roche Molecular Systems,IN,USA)を用いて単鎖可変領域ライブラリーを製造した。各反応において、1μLのcDNA、60pmolの各プライマー、10μLの10×反応緩衝液、8μLの2.5mM dNTP(Promega,Madison,WI,USA)及び0.5μLのTaq DNA重合酵素を水と混合した。最終体積は100μLであった。次のような条件を用いてPCR反応を行った:(i)94℃で15秒、(ii)56℃で30秒、(iii)72℃で90秒の30サイクル後、最後に72℃で10分間延長した。約350bp長さの断片を含むPCR産物を1.5%アガロースゲルにローディングし、電気泳動後にQIAGEN Gel II抽出キット(QIAGEN,Valencia,CA,USA)を用いてヌクレオチド断片を精製した。精製されたPCR産物をOD260nmで判読して定量化した(1単位OD=50μg/ml)。
前記PCR産物のscFv断片とベクターpComb3X-SS(The Scripps Research Institute,CA,USA)をSfi I制限酵素で分解した。10μgの精製された重複PCT産物を、360ユニットのSif I(16単位当たりのDNA(μg)、Roche Molecular Systems,Pleasanton,CA,USA)、20μLの10×反応緩衝液及び水と最終体積200μLまで混合した。20μgのpComb3X-SSベクターを120ユニットのSfi I(6ユニット当たりのDNA(μg))、20μLの10×反応緩衝液及び水と最終体積200μLまで混合した。この混合物を50℃で8時間分解した。その後、scFv断片(約700bp)とベクター(約3400bp)を含む分解産物を1%アガロースゲルにローディングし、Gel Extraction II QIAGEN(QIAGEN,Valencia,CA,USA)を用いて精製した。1400ngのSfi I-制限pComb3Xベクター及び700ngの分解されたscFv断片を5×リガーゼ緩衝液、10μLのT4DNAリガーゼ(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)及び水と最終体積200μLまで混合した。この混合物を16℃で16時間培養して結紮を行った。
磁気ビーズ(Dynabeads M-270 Epoxy,Invitrogen)を用いてバイオパンニングを行った。約1×107個のビーズを5μgの組換えFAM19A5タンパク質と共に20時間常温で回転させながら前記タンパク質でビーズを撹拌によってコートした。コーティングが完了すれば、ビーズをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4回洗浄し、常温で3% BSA含有PBSで1時間ブロッキングした。次に、コートしたビーズを、上記のファージ-ディスプレイされたscFvと共に常温で2時間培養した。抗原コーティングされたビーズに結合していないファージを除去するために、ビーズを0.05% Tween20/PBSで洗浄した。次に、結合したファージを50μLの0.1Mグリシン/塩化水素(0.1M Glycine-HCl、pH 2.2)で溶出させ、塩化水素と共に3μLの2Mトリス(tris-HCl、pH 9.1)で中和させた。このファージ含有上澄液を用いてE.coli ER2738細胞を感染させ、VCSM13ヘルパーファージを用いて一晩増幅及び救出(rescue)した。また、50μg/mlのカナマイシンを含有したLB寒天プレートでファージ-感染培養物をブロッティングし、ファージ-感染培養物からファージ力価による投入(input)及び生産(output)を決定した。翌日、PEG-8000とNaClを用いてファージを沈殿させ、続いて、バイオパンニングのために使用した。上の過程を反復して総5回までバイオパンニングを行った。それぞれの増幅によってFAM19A5タンパク質に対する高い親和性に対してファージをスクリーニング及び選別した。
バイオパンニングから選別したクローンを分析するために、ファージ-ディスプレイscFvから個別クローンを無作為に選別し、前記クローンがFAM19A5組換えタンパク質に結合するか否かをELISAで確認した。前記FAM19A5組換えタンパク質を0.1M NaHCO3緩衝液に希釈し、100ng/wellのタンパク質を用いて4℃で16時間96ウェル微細力価プレートをコートした。翌日、前記プレートを37℃で3% BSA/PBSで1時間ブロッキングした。その後、ファージ上澄液を6% BSA/PBSと混合し、37℃で2時間培養した。次に、前記上澄液を含有したプレートを0.05% Tween-20/PBSで洗浄した。HRP接合M13抗体(a-M13-HRP,Pierce Chemical Co,Rockford,IL,USA)を1/5000に希釈した。50μlの希釈された抗体をプレートに入れ、37℃で1時間培養した。培養及び洗浄後に、発色のためにプレートに0.05Mクエン酸塩緩衝液、1μg/mlの2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS,Amresco,Solon,OH,USA)及び0.1% H2O2を添加した。各ウェルに対する吸光度を405nmで測定した。
抗FAM19A5 scFvを哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。FAM19A5 scFv遺伝子配列において、ヒトCκ遺伝子を軽鎖可変ドメインに連結し、CH1、CH2及びCH3遺伝子のヒト免疫グロブリンアイソ型IgG2/4を重鎖可変領域に連結した。制限部位(Genscript,USA)を追加して各軽鎖及び各重鎖を持つ抗体を合成した。変形された制限部位を持つ哺乳類細胞発現ベクターに合成された遺伝子を挿入してクローニングを容易にさせた。まず、Hind III及びXba I(New England Biolabs,UK)制限酵素を用いてベクターに軽鎖遺伝子を挿入した後、NheI及びBamHI(New England Biolabs,UK)制限酵素を用いてベクターに重鎖遺伝子を追加した。
Bis-Tris勾配ゲル電気泳動で行った。タンパク質のサイズ及び収率は、クーマシーブリリアントブル染色によって確認した。抗体の結合能は、ELISA分析法を用いて測定した。
抗体の機能的特性をさらに評価するために、次のような方法を用いた。
FAM19A5発現ベクターを作製するためにヒトFAM19A5をコードする遺伝子を化学的に合成した(Genscript,Picataway,NJ,USA)。前記遺伝子を、従来に報告されたとおり、3’領域でヒトIgG1のヒンジ領域及びウサギIgGのCH2-CH3ドメインをコードする変形された哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。Han,J.,et al.,Exp Mol Med.48(11):e271(2016)を参照する。
選別されたクローンの遺伝子を、従来に報告されたとおり、5’領域でCκドメイン(ヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常ドメイン)をコードする変形されたpCEP4ベクターにサブクローニングした。Lee,Y.,et al.,Exp Mol Med.46:e114(2014)を参照する。抗FAM19A5 scFvヒトCκ融合タンパク質をコードする発現ベクターを、上述のとおりにHEK293F細胞(Invitrogen)に形質注入した。scFv-hCκ融合タンパク質は、メーカー指針に従ってタンパク質Aセファロースカラム(Repligen,Waltham,MA,USA)を用いて、一時的に形質注入されたHEK293F細胞の培養上澄液から精製した。
抗体の中和効能を評価するために、前述した通りに流細胞分析法によって確認した。Kim,M.,et al.,PLoS One.7(4):e35100(2012)を参照する。マウス及びヒト膠細胞を、ウェル当たりに最終密度が3×105細胞であるv型底96ウェルプレート(Corning Inc.,Corning,Ny,USA)に接種した。細胞を流細胞分析緩衝液[0.05%(w/v)アジ化ナトリウムを含有したPBS中1%(w/v)BSA]で1μMの組換えFAM19A5ウサギFc及び5μMの抗FAM19A5 scFvヒトCκ融合タンパク質で37℃で1時間処理した。流細胞分析緩衝液で洗浄した後、細胞をAlexa Fluor 488-接合抗ウサギIgG(Fc特異的)抗体(Jackson Immuno Research Inc.,PA,USA)と共に37℃で1時間、暗い所で培養した。同一緩衝液でさらに洗浄した後、細胞を300μL PBSに再懸濁し、488-nmレーザー付きFACSCANTOTM II機器(BD Bioscience,San Jose,CA,USA)を使用する流細胞分析法によって分析した。データは、FlowJoソフトウェア(TreeStar,Ashland,OR,USA)で分析した。
マウス及びヒト膠細胞の両方でFAM19A5発現を中和させる能力から、3-2抗体をエピトープマッピング分析のために選択した。ヒトFAM19A5タンパク質の重複ペプチド断片(F1~F6、図4参照)を合成してBSAに接合させた。BSA-接合ペプチド断片F1~F6に対する異なる抗FAM19A5抗体の結合は、ELISA分析法によって決定した。簡単にいえば、FAM19A5断片F1~F6(50mM炭酸緩衝液(Biosesang)で1μg/mLに希釈又は高農度分析のために20μg/mLに希釈)を用いて4℃で一晩96ウェル免疫プレート(Thermo Scientific)のウェルをコートし(100μL/ウェル)、その後、1XPBSで2回洗浄した。次に、プレートを常温で1時間、ブロッキング緩衝液(100μL/ウェル)でブロッキングした。1時間培養中に、関連抗FAM19A5抗体を希釈緩衝液で1μg/mL(又は、高農度分析の場合に20μg/mL)まで希釈した。プレートが洗浄されると(1×PBSを用いて2×)、希釈した抗FAM19A5抗体を適切なウェルに添加し、プレートを常温で1時間培養した。次いで、プレートを洗浄緩衝液を用いて総5回洗浄した。次に、ODP基質(ODP精製(O-フェニレンジアミンジヒドロクロリド、Thermo)1個を9mLの滅菌された脱イオン数と1mLの10X安定した過酸化水素安定(Peroxide Stable)緩衝液(Thermo)に溶解させて準備)を各ウェルに添加し、10分間変色反応がおきるようにした。この反応は、ウェルに100mLの2N H2SO4(Daejung)を添加して中断させた。各ウェルの吸収値を96ウェルマイクロプレートリーダ(Molecular Device)を用いて492nmで検出した。
1.免疫原性インシリコ(in silico)評価
ヒトを対象に投与時に免疫原性の危険を下げるために、インシリコ分析を行って3-2及び2-13抗FAM19A5抗体内高い免疫原性の特定領域を同定した。
免疫原性と関連しているCD4+ T細胞エピトープを回避するために、複合抗体ライブラリーを設計した。ライブラリー作製のために、最も相同的なヒト生殖系を選択するためにクローン2-13及びクローン3-2のフレームワークをIgBLASTデータベース(NCBI)に対して分析した。クローン3-2に対してヒト生殖系IGLV1-2751*02、IGLJ2*01、IGHV3-64*04及びIGHJ1*01遺伝子を選択した(図9A及び図9B)。クローン2-13に対してヒト生殖系IGLV3-27*01、IGLJ2*01、IGHV3-64*04及びIGHJ1*01遺伝子を選択した(図10)。
陽性クローンを分離するために、前述の通りにバイオパンニング及びファージ酵素免疫分析を行った(Barbas CF.,Phage display:a laboratory manual.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press;2001)。FAM19A5に対する反応性を有するファージクローンを選択し、これらのヌクレオチド配列をサンガーシーケンシングによって決定した。FAM19A5に対する親和性を有する最も少ない数の無差別MHCクラスII結合エピトープを持つscFvクローンを最終的に選択した。
抗体と抗原の結合において静電気的相互作用は重要である。Lee J.Y.,et al.,Nat Commun.7:13354(2016)。脱免疫化されたクローン2-13のCDRH3を除く5個のCDR内の各アミノ酸をグルタミン酸とアスパラギン酸に置換し、人為的に負に荷電されたRグループを導入した。点突然変異したscFvをコードする総70個の遺伝子を化学的に合成し(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA,USA)、前述した通りにファージミドベクターにサブクローニングしてファージをディスプレイする突然変異scFvを作製した。Yoon,A.,et al.,PLoS One.11(1):e0146907(2016)。
CDR-H3部位指向突然変異誘発ライブラリーを作製するために、脱免疫化されたクローン2-13D-37scFvをコードする遺伝子をPCR用鋳型として使用した。CDR-H3内3個の連続している残基を、前述した通り、NNK縮退コドン(N=A、T、G又はC、K=G又はT)をコードするオリゴヌクレオチドで無作為化した(Lee Y,Kim H,Chung J.Exp Mol Med.2014;46:e114)。無作為化されたコドンをPCRによってCDR-H3に導入した。重複延長PCRによって増幅されたscFv断片をファージミドベクターにサブクローニングし、上述の通り、ファージ製造のためにER2738(New England BioLabs)に形質転換した。総8個のCDR-H3無作為化されたライブラリーが生成された。
脱免疫化された抗FAM19A5抗体の物理化学的特性を改善するために、3-2抗体の軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3及び重鎖CDR1及びCDR2の無作為化された配列を用いてファージディスプレイライブラリーを作製した。CDR部位指向突然変異誘発ライブラリーを作製するために、脱免疫化されたクローン3-2scFvをコードする遺伝子をPCR用鋳型として使用した。CDR内4個又は5個の連続している残基を、前述した通り、NNK縮退コドン(N=A、T、G又はC、K=G又はT)をコードするオリゴヌクレオチドで無作為化した。Lee,Y.,et al.,J.Exp Mol Med.46:e114(2014)。無作為コドンをPCRによってCDRH3以外の5個のCDRに導入した。重複延長PCRによって増幅されたscFv断片をファージミドベクターにサブクローニングし、上述の通りにファージ製造のためにER2738(New England BioLabs)に形質転換した。図12を参照する。
クローン2-13抗FAM19A5抗体に対するヒトFAM19A5の結合エピトープをプローブするために、後述するように水素/重水素交換質量分光分析法(HDX-MS)を用いた。図18を参照する。
エピトープマッピング実験前に、FAM19A5タンパク質に対する一般のペプチドの目録を作るために非重水素化実験を行った。オフライン及びオンラインペプシン分解を用いてFAM19A5タンパク質を分解した。Houde,D.,et al.,Methods Mol Biol 988:269-89(2013)。オンライン分解を利用時に、ペプシン固定カラムを使用し(~20℃)、流速を調整して反応効率を調節した。オフライン方法を利用時に、FAM19A5タンパク質を4℃で5分間ペプシンによって手動で分解した後、分析のために混合物を液体クロマトグラフィーカラムにローディングした。最大タンパク質カバレッジのための条件を確認するために、次のようなパラメータのいずれか一つ以上を調整した:リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、クエンチング維持時間、還元試薬(TCEP)、尿素濃度及びペプシン濃度。Waters PLGSソフトウェアを用いて生成された質量分光分析(MS)未加工(raw)データを分析し、最大タンパク質カバレッジを得たか否か確認した。実験の再現性を確認するために、それぞれの実験条件を少なくとも2回反復し、生成されたペプチドを確認した。図19は、使用した異なる実験条件及び得られたカバレッジ率を示している。
抗体-タンパク質複合体を標識化緩衝液で15倍希釈する時にも、最大(100%)結合(KD=1nM)を得るために、水素/重水素標識前に抗原-抗体複合体試料を少なくとも3時間培養した。標識後、平衡緩衝液を用いて試料を同一体積となるようにした。
Claims (15)
- 配列類似性19を持つヒトファミリー、メンバーA5(FAM19A5)タンパク質に特異的に結合し、重鎖CDR1、CDR2及びCDR3並びに軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む分離された抗体(“抗FAM19A5抗体”)又はその抗原結合部分であって、
前記重鎖CDR1、CDR2及びCDR3はそれぞれ、配列番号16、17及び18に示したアミノ酸配列を含み、前記配列のそれぞれは、場合によって1、2又は3個の突然変異を含み、
前記軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3はそれぞれ、配列番号30、31及び32に示したアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3の少なくとも一つは、1、2又は3個の突然変異を含み、
前記抗体は、配列番号35に示したVH及び配列番号45に示したVLを含む基準抗体に比べて、ヒトにおいて減少した免疫原性及びヒトFAM19A5タンパク質に対してより高い結合親和度を有する、分離された抗体又はその抗原結合部分。 - 前記重鎖CDR3が配列番号18、128又は129に示したアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記重鎖CDR1が配列番号16に示したアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載の抗体。
- 前記重鎖CDR1が配列番号19に示したアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載の抗体。
- 前記重鎖CDR2が配列番号17に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれかに記載の抗体。
- 前記軽鎖CDR3が配列番号32に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~5のいずれかに記載の抗体。
- 前記軽鎖CDR2が配列番号31に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~6のいずれかに記載の抗体。
- 前記軽鎖CDR1が一つの突然変異を持つ、配列番号30に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれかに記載の抗体。
- 前記突然変異が配列番号30のアミノ酸4においてセリンの脂肪族アミノ酸への置換を含む、請求項8に記載の抗体。
- 前記脂肪族アミノ酸がバリンを含む、請求項9に記載の抗体。
- 重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、前記VHは、配列番号35に示したアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%同じアミノ酸配列を含み、及び/又は前記VLは、配列番号45に示したアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%同じアミノ酸配列を含む、請求項1~10のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体が重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む基準抗体と交差競合し、前記VHは、配列番号36に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体が重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む基準抗体と交差競合し、前記VHは、配列番号37に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体が重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む基準抗体と交差競合し、前記VHは、配列番号130に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体が重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む基準抗体と交差競合し、前記VHは、配列番号131に示したアミノ酸配列を含み、前記VLは、配列番号46に示したアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれかに記載の抗体。
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