CN117964756A - 抗序列相似家族19成员a5的抗体及其使用方法 - Google Patents

抗序列相似家族19成员a5的抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了与人FAM19A5特异性结合的抗体以及包含这种抗体的组合物。在一些实施例中，对抗体进行脱免疫来降低人类个体的免疫原性。在某些实施例中，抗体已经具备亲和力成熟性。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体可以利用此类抗体调节FAM19A5活性，例如抑制、压制、减少或逆转反应性胶质增生和/或反应性星形胶质细胞过度增殖。本发明还公开了通过与人FAM19A5特异性结合抗体来治疗机能失调(例如中枢神经系统损伤、退行性脑疾病、神经病理性疼痛或癌症)的方法。

Description

抗序列相似家族19成员A5的抗体及其使用方法
本申请是申请号为201980072221.0、申请日为2019年12月31日、发明名称为“抗序列相似家族19成员A5的抗体及其使用方法”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本PCT申请主张2019年1月2日提交的第62/787,711号美国临时专利申请和2019年4月24日提交的第62/838,190号美国临时专利申请的优先权，其中，所述两个专利申请通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
电子版序列列表的引用
ASCII文本文件电子版序列表(名称：3763_016PC02_SeqListing_ST25.txt；大小：90,231个字节；创建日期：2019年12月30日)随本申请一起提交，其内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分
政府支持声明
本工作得到了韩国产业通商资源部(MOTIE)资助的工业技术创新计划(10081300，通过治疗缺血性卒中胶质瘢痕形成抑制机制，研发新型治疗性单克隆抗体药物)的支持。
技术领域
本公开提供了与序列相似家族19成员A5(FAM19A5)特异结合的抗体(例如脱免疫或亲和力成熟的抗体)，包含此类抗体的组合物，以及使用此类抗体预防或治疗由个体中枢神经系统损伤引起的疾病或病症的方法。
背景技术
FAM19A5是TAFA蛋白亚家族的成员，该亚家族由五个高度同源小蛋白组成。TangT.Y.等人，《基因组学(Genomics)》83(4)：727-34(2004).此类蛋白在固定位置含有保守的半胱氨酸残基，并且与巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1-α)——CC趋化因子家族的成员——远缘相关。TAFA蛋白主要在大脑和脊髓的特定区域表达。据信，此类蛋白是由成年神经干细胞在神经发生过程中产生和分泌的。
FAM19A5主要在脊椎动物的大脑中表达，并且认为FAM19A5在完整的中枢神经系统的发育、分化和形成中发挥着重要作用，并且可以用于预防或治疗中枢神经系统损伤和/或疾病。美国专利公开第2015/0118230号。
虽然抑制FAM19A5可以在治疗中枢神经系统损伤中发挥着重要作用，但是仍需要开发与FAM19A5特异性结合且能够调节FAM19A5活性的抗体，尤其是可用于人类个体且无不良影响的抗体。
发明内容
本公开提供了抗体或其抗原结合部分，其与人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)蛋白特异性结合(“抗FAM19A5抗体”)，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中重链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：5、6和7所示的氨基酸序列，氨基酸序列中的每一个任选地包含一个、两个、三个、四个或五个突变，其中轻链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：8、9和10所示的氨基酸序列，其中所述轻链CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个包含一个、两个、三个、四个或五个突变，并且其中与包含SEQ ID NO：11所示的VH和SEQID NO：12所示的VL的参照抗体相比，所述抗体在人中的免疫原性降低。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体的重链CDR3包含SEQ ID NO：7中所示的的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体的重链CDR1包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具有一个或两个突变。在一些实施例中，突变包含SEQ ID NO：5的氨基酸3位的苏氨酸被酸性氨基酸取代。在其他实施例中，突变包含SEQ ID NO：5的氨基酸5位的丝氨酸被酸性氨基酸取代。在某些实施例中，酸性氨基酸包含天冬氨酸或谷氨酸。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体的重链CDR2包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个或五个突变。在一些实施例中，突变包含SEQID NO：6的氨基酸16位的精氨酸被碱性氨基酸取代。在某些实施例中，碱性氨基酸包含赖氨酸。在其他实施例中，突变包含以下一种或多种情况：(a)SEQ ID NO：6的氨基酸6位的甘氨酸被酸性氨基酸取代；(b)SEQ ID NO：6的氨基酸7位的丝氨酸被酸性氨基酸取代；(c)SEQID NO：6的氨基酸8位的丝氨酸被酸性氨基酸取代；(d)SEQ ID NO：6的氨基酸9位的苏氨酸被酸性氨基酸取代；和(e)SEQ ID NO：6的氨基酸16位的精氨酸被碱性氨基酸取代。在某些实施例中，酸性氨基酸包含天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施例中，碱性氨基酸包含赖氨酸。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体的轻链CDR3包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个或五个突变。在一些实施例中，突变包含以下一种或多种情况：(a)SEQ ID NO：10的氨基酸6位的丝氨酸被酸性氨基酸或脂肪族氨基酸取代；(b)SEQ ID NO：10的氨基酸7位的天冬酰胺被酸性氨基酸或羟基或含硫/硒的氨基酸取代；(c)SEQ ID NO：10的氨基酸8位的甘氨酸被酸性氨基酸或羟基或含硫/硒的氨基酸取代；(d)SEQ ID NO：10的氨基酸9位的甘氨酸被酸性氨基酸或羟基或含硫/硒的氨基酸取代；和(e)SEQ ID NO：10的氨基酸10位的异亮氨酸被碱性氨基酸取代。在某些实施例中，酸性氨基酸包含天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施例中，含羟基或硫/硒的氨基酸包含丝氨酸。在进一步的实施例中，碱性氨基酸包含组氨酸。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体的轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个突变。在某些实施例中，突变包括以下一种或多种情况：(a)SEQ ID NO：8的氨基酸6位的酪氨酸被酸性氨基酸取代；(b)SEQ IDNO：8的氨基酸7位的精氨酸被酸性氨基酸取代；(c)SEQ ID NO：8的氨基酸8位的甘氨酸被酸性氨基酸取代；和(d)SEQ ID NO：8的氨基酸9位的丝氨酸被酸性氨基酸取代。在一些实施例中，酸性氨基酸包括谷氨酸或谷氨酰胺。
在一些实施例中，轻链CDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个突变。在一些实施例中，突变包含以下一种或多种情况：(a)SEQID NO：9的氨基酸1位的谷氨酸被酸性氨基酸取代；(b)SEQ ID NO：9的氨基酸2位的丝氨酸被酸性氨基酸取代；(c)SEQ ID NO：9的氨基酸3位的天冬酰胺被酸性氨基酸、碱性氨基酸或脂肪族氨基酸取代；和(d)SEQ ID NO：9的氨基酸4位的赖氨酸被酸性氨基酸或脂肪族氨基酸取代。在某些实施例中，酸性氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施例中，碱性氨基酸包含组氨酸。在进一步的实施例中，脂肪族氨基酸包括亮氨酸。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：9的氨基酸2位的丝氨酸被酸性氨基酸取代。在一些实施例中，酸性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或其组合物。在某些实施例中，酸性氨基酸是天冬酰胺。
本文也提供了分离的抗体或其与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗原结合部分，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
本文也提供了分离的抗体或其与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗原结合部分，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
本文也提供了分离抗体或其与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗原结合部分，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
本文也提供了分离的抗体或其与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗原结合部分，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
本文也提供了分离的抗体或其与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗原结合部分，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
本文也提供了分离的抗体或其与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗原结合部分，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
本文也提供了分离的抗体或其与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗原结合部分，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，和/或其中VL包含与SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，该参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中：(a)VH包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；(b)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；(c)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；(d)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；(e)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；(f)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；或者(g)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体与作为参照抗体的相同人FAM19A5抗原表位结合，该参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：(a)VH包含SEQ IDNO：33所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；(b)VH包含SEQ IDNO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列(c)VH包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列(d)VH包含SEQID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列(e)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列(f)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列或者(g)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，人FAM19A5抗原表位包含SEQ ID NO：90、91或92所示的氨基酸序列。
本文进一步公开了分离抗体或其抗原结合部分，该抗原结合部分与序列相似家族19成员A5(FAM19A5)蛋白特异性结合(“抗FAM19A5抗体”)，包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中重链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：16、17和18所示的氨基酸序列，氨基酸序列中的每一个视需要包含一个、两个或三个突变，其中轻链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：30、31和32所示的氨基酸序列，其中轻链CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个包含一个、两个或三个突变，并且其中所述抗体与包含SEQ ID NO：35所示的VH和SEQ ID NO：45所示的VL的参照抗体相比，所述抗体在人和/或结合亲和力更高的人FAM19A5蛋白中的免疫原性降低。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体的重链CDR3包含SEQ ID NO：18、128或129所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体的重链CDR1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。在其他实施例中，重链CDR1包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体的重链CDR2包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体的轻链CDR3包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体的轻链CDR2包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体的轻链CDR1包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，按氨基酸序列具有一个突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：30的氨基酸4位的丝氨酸被脂肪族氨基酸取代。在一些实施例中，脂肪族氨基酸包含缬氨酸。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，和/或其中VL包含与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，VL包含SEQ IDNO：46所示的氨基酸序列。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。在进一步的实施例中，抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO：130所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体选自选自由以下组成的群组：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、其变体及其任何组合。在某些实施例中，抗FAM19A5抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv(scFv)。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体是单链抗体。在某些实施例中，所述单链抗体包含VH和VL，其中：(a)VH包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQID NO：38所示的氨基酸序列；(b)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQID NO：39所示的氨基酸序列；(c)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQID NO：41所示的氨基酸序列；(d)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；(e)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；(f)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；(g)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；(h)VH包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；(i)VH包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，VL包含SEQID NO：46所示的氨基酸序列；(j)VH包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列，VL包含SEQ IDNO：46所示的氨基酸序列或者(i)VH包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列，VL包含SEQ IDNO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体展现出以下特性中的一种或多：(a)如通过酶联免疫吸附法(ELISA)所测定的，以10nM或更小的KD与可溶性人FAM19A5结合；(b)如通过酶联免疫吸附法(ELISA)所测定的，以10nM或更小的KD与膜结合的人FAM19A5结合；(c)减少、逆转、延缓和/或预防反应性神经胶质增生的发作；(d)抑制反应性星形胶质细胞过度增殖；(e)降低包括神经蛋白聚糖和神经元-神经胶质抗原2(ng2)在内的硫酸软骨素蛋白聚糖的表达；(f)增加c-fos和pERK在神经元核中的表达；(g)促进神经元存活；(h)增加GAP43在神经元中的表达；(i)促进轴突的再生；(j)诱导例如肿瘤中的血管正常化；(k)抑制肿瘤生长；(1)增强免疫细胞向肿瘤的渗透；(m)增强神经元细胞向肿瘤的渗透；(n)增强巨噬细胞或小胶质细胞的吞噬活性；(o)增加巨噬细胞或小胶质细胞的线粒体膜电位；(p)减少髓源抑制性细胞(MDSCs)向肿瘤的募集；(q)减少肿瘤中的坏死和水肿；(r)降低肿瘤的组织通透性；和(s)增加肿瘤中的血流速度。
本文还提供了核酸，所述核算对本文公开的抗FAM19A5抗体进行编码；载体，所述载体包含所述核酸；细胞，所述细胞包含所述载体；以及免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文公开的所述抗FAM9A5抗体。本文还公开了组合物，所述组合物包含本公开的所述抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物，和载体。本公开也提供了试剂盒，其包含本公开的所述抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物，和使用说明书。
本文还提供了一种产生与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗体的方法，其包含在合适的条件下培养本文公开的所述细胞并分离所述抗体。
本公开进一步提供了用于在有此需要的个体中治疗疾病或病状的方法，其包含施用本文所述的抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物。在一些实施例中，所述疾病或病症包含肿瘤、纤维化、青光眼、心境障碍、视网膜病变、年龄相关性黄斑变性或神经病理性疼痛。在某些实施例中，疾病或病症是肿瘤。
在一些实施例中，肿瘤包含黑素瘤、胰腺癌、神经胶质瘤、乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、肾癌、前列腺癌、纤维肉瘤、结肠腺癌、肝癌或卵巢癌。在某些实施例中，神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物诱导血管的正常化。在某些实施例中，血管的正常化伴随着血管特性的变化，所述血管特性的变化包含增加的连通性、增加的壁厚、减小的血管直径、更规则的血管方向和分布方式、增加的血管数量、渗漏和通透性的降低、周细胞在血管上增大的覆盖度和接近度、增加的氧合作用或其组合。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物抑制肿瘤的生长。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物增强了免疫细胞向肿瘤的浸润。在某些实施例中，免疫细胞包含巨噬细胞、树突细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)或其组合。在一些实施例中，免疫细胞进一步显示肥大。在一些实施例中，免疫细胞向肿瘤的浸润增强伴随着神经元细胞向肿瘤的浸润增加。在某些实施例中，神经元细胞包含星形胶质细胞、神经胶质细胞或其组合。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物增强巨噬细胞或小胶质细胞的吞噬活性。在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物增大巨噬细胞或小胶质细胞的线粒体膜电位。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物减少髓源抑制性细胞(MDSC)向肿瘤的募集。在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物减少肿瘤中的坏死和水肿。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物降低肿瘤的组织通透性。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体、核酸、载体、细胞或免疫缀合物增加肿瘤中的血流速率。
在一些实施例中，所述治疗疾病或病症的方法进一步包含施用附加的治疗剂。在某些实施例中，所述附加的治疗剂包含化疗、免疫疗法、放射疗法或其组合。
附图说明
图1A、1B和1C提供了单个scFv克隆与FAM19A5蛋白的结合分析。吸光度在405nm处测量。在X轴上提供的克隆号。图1A、1B和1C分别显示了来自第一只鸡、第二只鸡和第三只鸡的第4轮、第5轮或第5轮生物淘选的96个克隆的分析。对于图1A、1B和1C所示的克隆中的每一个，竖线对应于FAM19A5蛋白、阴性对照蛋白、血凝素蛋白和BSA(从左到右)。在图1A、1B和1C中的每一个图中，盒装克隆是选择用于进一步分析的8个克隆(参见实施例4)。
图2A和2B分别提供不同抗FAM19A5 scFv的近似大小和结合能力。抗体的大小用SDS-Page显示，结合能力用酶联免疫吸附试验(FLISA)测定。显示的抗体包括(从左到右)：1-28、1-85、2-13、2-14、2-20、2-29、3-2和3-26。在图2B中，对于显示的每种抗体，左边的线代表抗体与FAM19A5蛋白的结合。右边的线代表阴性对照(在单独存在封闭缓冲液的情况下测得的结合，即没有重组FAM19A5蛋白)。标记为“仅第2”的柱代表另一个阴性对照，以显示测定的背景水平(在没有初级抗FAM19A5抗体的情况下测得的结合)。
图3A和3B分别提供了不同的抗FAM19A5抗体在小鼠和人神经胶质细胞中和FAM19A5表达的能力的比较。中和显示为FAM19A5表达的降低百分比，其显示为平均荧光强度(MFI)。可以使用以下公式计算降低百分比：100％-[((FAM19A5+抗FAM19A5抗体的MFI)/(FAM19A5+对照抗体的MFI))×100]，括号中显示了每种抗体的降低百分比。
图4提供了表位F1-F6(与牛血清白蛋白结合)的氨基酸序列及其在人FAM19A5多肽上的位置。示出的顶部氨基酸序列是野生型FAM19A5亚型2(没有信号肽)。示出的第二个氨基酸序列是相同的序列，但是半胱氨酸残基突变为丝氨酸，以降低肽合成过程中的非特异性活性。
图5提供了3-2抗体与表位片段F1至F6结合的ELISA结果。最左边的一栏(“FAM19A5”)表示阳性对照，并显示3-2抗FAM19A5抗体与整个FAM19A5蛋白的结合。“无关蛋白”和“仅封闭”(即仅封闭缓冲液，即不含FAM19A5蛋白)组代表阴性对照。对于每一组，左边的线对应于同种型对照，右边的线对应于3-2抗体。
图6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I和6J提供了丙氨酸扫描分析的结果，显示表位F2片段中的特定氨基酸残基对于各种3-2抗体变体与FAM19A5蛋白的结合是重要的。图6A、6B、6C和6D显示了在HEK293F细胞中产生的下列抗体的结果：(A)野生型3-2抗体，(B)1-30抗体，(C)1-32抗体，及(D)6-10抗体。图6E、6F、6G、6H、6I和6J分别显示了在CHO细胞中产生的下列抗体的结果：(E)1-17抗体，(F)1-30抗体，(G)1-32抗体，(H)4-11抗体，(I)6-10抗体，及(J)PI值偏低抗体。如实施例7所述，产生突变肽，其中每个突变肽在表位片段F2内的单个氨基酸残基处具有丙氨酸取代。抗体与不同突变肽的结合用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。
图7鉴定了3-2抗体的轻链可变区(VL)(顶部三行)和重链可变区(VH)(底部三行)上的潜在免疫原性位点。VL对应于SEQ ID NO：12并且VH对应于SEQ ID NO：11。还显示了用于3-2抗体的框架区的人种系的序列：VL＝免疫球蛋白λ可变基因区1-51(IGV1-51*02)和免疫球蛋白λ结合基因区2(IGLJ2*01)；VH＝免疫球蛋白重链可变区基因3-64(IGHV3-64*04)和免疫球蛋白重链结合区基因1(IGHJ1*01)。所用的人种系是与3-2克隆最同源的人种系(NCBI IgBLAST)。指示了通过ITOPE分析确定所确定的具有高、中等免疫原性潜力的混杂MHC II类结合肽。具体而言，具有高免疫原性潜力的MHC II结合肽如下所示：(i)肽#3：SEQID NO：12的残基85-93(IYYCGSWDS)；(ii)肽#9：SEQ ID NO：11的残基64-72(VRGRATISR)；和(iii)肽#10：SEQ ID NO：11的残基79-87(VRLQLNNPG)。具有中等免疫原性潜力的MHCII结合肽如下所示：(i)肽SEQ ID NO：12的残基16-24(VKITCSGGG)；(ii)肽#2：SEQ ID NO：12的残基48-56(IYESNKRPS)；(iii)肽#4：SEQ ID NO：11的残基18-26(LSLVCKASG)；(iv)肽#5：SEQID NO：11的残基19-27(SLVCKASGF)；(v)肽#6：SEQ ID NO：11的残基32-40(FNMFWVRQA)；(vi)肽#7：SEQ ID NO：11的残基45-53(LEYVAQISS)；(vii)肽#8：SEQ ID NO：11的残基48-56(VAQISSSGS)；和(viii)肽#11：SEQ ID NO：11的残基81-89(LQLNNPGAE)。来自T细胞表位数据库中的同源肽如下所示：肽#5、肽#6和肽#9。总共鉴定出11种结合肽，记为肽#1至#11。结合肽中的每个“Pl”表示第一锚定位。
图8鉴定了2-13抗体的轻链可变区(VL)(顶部三行)和重链可变区(VH)(底部三行)上的潜在免疫原性位点。VL对应于SEQ ID NO：45，并且VH对应于SEQ ID NO：35。还显示了用于2-13抗体的框架区的人种系的序列：VL＝免疫球蛋白λ可变基因区3-27(IGLV3-27*01)和免疫球蛋白λ结合基因区2(IGLJ2*01)；VH＝免疫球蛋白重链可变区基因3-64(IGHV3-64*04)和免疫球蛋白重链结合区基因1(IGHJ1*01)。所用的人种系是与2-13克隆(IgBLAST,NCBI)最同源的人种系。指示了通过ITOPE分析确定所确定的具有高和中等免疫原性潜力的混杂MHC II类结合肽。具体而言，具有高免疫原性潜力的MHC II结合肽如下所示：(i)肽#1：SEQ ID NO：45的残基16-24(VKITCSGGS)；(ii)肽#2：SEQ ID NO：45的残基80-88(VYFCGTEDI)；和(iii)肽#8：SEQ ID N0：35的残基79-87(VRLQLNNLR)。具有中等免疫原性潜力的MHCII结合肽如下所示：(i)肽#3：SEQ ID NO：35的残基18-26(LSLVCKASG)；(ii)肽#4：SEQ ID NO：35的残基20-28(LVCKASGFT)；(iii)肽#5：SEQ ID NO：35的残基36-44(WVRQTPGKG)；(iv)肽#6：SEQ ID NO：35的残基47-55(YVAEITNDG)；(v)肽#7：SEQ ID NO：35的残基64-72(VKGRATISR)；(vi)肽#9：SEQ ID NO：35的残基81-89(LQLNNLRAE)；和(vii)肽#10：SEQ ID N0：35的残基86-94(LRAEDTGTY)。来自T细胞表位数据库中的同源肽如下所示：肽#4和肽#5。总共鉴定出10种结合肽，记为肽#l至#10。结合肽中的每个“Pl”表示第一锚定位。
图9A、9B和9C提供了脱免疫的3-2抗体的结合分析。图9A提供的示意图显示了可以在哪里进行氨基酸突变，以使3-2抗体脱免疫。图9B提供了以下轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的序列比较：(i)野生型3-2抗体(“克隆3-2”),(ii)完全脱免疫的3-2抗体(“充分脱免疫的克隆3-2”)，和(iii)脱免疫的(除了重链CDR2内的一个氨基酸)抗体(“脱免疫的克隆3-2”)。具有如通过ITOPETM分析测定的具有高和中等免疫原性潜力的氨基酸残基在框内分别用“1”和“2”表示。图9C显示了如通过ELISA所测定的针对FAM19A5蛋白的(i)野生型3-2抗体，(ii)完全脱免疫的3-2抗体，和(iii)除处在具有重链CDR2的一个氨基酸处脱免疫的(“脱免疫的克隆3-2”)抗体的结合的比较。将展示噬菌体的每个单链可变片段(scFv)加入到FAM19A5(■)或抗HA抗体(□)包被的微量滴定板的孔中。在BSA包被的对照孔中测量背景信号。用HRP结合的抗M13抗体对孔进行探测。测量405nm位的吸光度。结果显示为从实验中获得的平均标准差，一式四份。结果显示为四份实验结果的平均值±SD。
图10A和10B提供了两种不同脱免疫的2-13抗体的分析：(i)充分脱免疫，和(ii)脱免疫，除处在具有重链CDR2的一个氨基酸处脱免疫的抗体(“脱免疫克隆2-13”)。图10A提供了针对野生型2-13抗体(“克隆2-13”)的两种脱免疫2-13抗体的轻链可变区(VL)(顶部三行)和重链可变区(VH)(底部三行)的比较。具有如通过ITOPETM分析测定的具有高和中等免疫原性潜力的氨基酸残基在框内分别用“1”和“2”表示。图10B显示了如通过ELISA所测定的针对FAM19A5蛋白的(i)野生型2-13抗体，(ii)完全脱免疫的2-13抗体，和(iii)除处在具有重链CDR2的一个氨基酸处脱免疫的(“脱免疫的克隆2-13”)抗体的结合的比较。将展示噬菌体的每个单链可变片段(scFv)加入到FAM19A5(■)或抗HA抗体(□)包被的微量滴定板的孔中。在BSA包被的对照孔中测量背景信号。用HRP结合的抗M l 3抗体对孔进行探测。测量405nm位的吸光度。结果显示为四份实验结果的平均值±SD。
图11提供了不同脱免疫的克隆2-13变体的结合能力的比较。不同变体抗体的身份沿着x轴提供。CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2的每个氨基酸残基由谷氨酸和天冬氨酸取代。用噬菌体酶免疫分析法分析70种变体抗体的反应性。将展示噬菌体的每个单链可变片段(scFv)加入到FAM19A5(■)或抗HA抗体(□)包被的微量滴定板的孔中。在BSA包被的对照孔中测量背景信号。用HRP结合的抗M13抗体对孔进行探测。测量405nm位的吸光度。结果显示为三份实验结果的平均值±SD。
图12提供了用于产生具有改善的物理化学性质的脱免疫的抗FAM19A5抗体的方法的示意图。
图13A和13B提供了几种脱免疫3-2变体与野生型(即未脱免疫)3-2抗体(“原始”)的理化性质的比较。所示的变异抗体包括：(i)具有低等电点(LowPI)的抗体，(ii)1-17，(iii)1-30，(iv)1-32，(v)4-11和(vi)6-10。图13A显示了抗体与FAM19A5蛋白的结合分析。结果显示为平均值±SD。图13B显示了溶解度(CamSol评分)和疏水性(GRAVY评分)数据。
图14A和14B提供了不同脱免疫3-2抗体变体的重链可变区(图14A)和轻链可变区(图14B)的序列比对。所示的脱免疫变体抗体与3-2抗体相关，因为这些抗体等同于3-2抗体，除了所述抗体在给药人类个体时已脱免疫以降低免疫原性。具有如通过ITOPETM分析测定的具有高和中等免疫原性潜力的氨基酸残基在框内分别用“1”和“2”表示。也注意到其他感兴趣的氨基酸残基：“3”＝最近人种系序列的差异；“4”＝潜在精氨酸或赖氨酸甲基化；“5”＝潜在色氨酸或蛋氨酸氧化；“6”＝潜在天冬酰胺脱酰胺作用；“7”＝潜在天冬氨酸异构化；“8”＝稀有氨基酸插入；和“9”＝游离半胱氨酸或非标准半胱氨酸对。所述氨基酸残基在自然细胞加工和降解过程中会导致产物变体。
图15提供了针对不同脱免疫和/或亲和力成熟的2-13抗体变体的轻链可变区(顶部三行)和重链可变区(底部三行)的序列比对。所述变体抗体与2-13抗体相关，因为它们等同于2-13抗体，除了所述抗体已脱免疫和/或经历亲和力成熟过程外。具有如通过ITOPETM分析测定的具有高和中等免疫原性潜力的氨基酸残基在框内分别用“1”和“2”表示。也注意到其他感兴趣的氨基酸残基：“3”＝潜在精氨酸或赖氨酸甲基化；“4”＝潜在色氨酸或蛋氨酸氧化；“5”＝潜在天冬酰胺脱酰胺作用；“6”＝潜在天冬氨酸异构化；“7”＝稀有氨基酸插入；和“8”＝游离半胱氨酸或非标准半胱氨酸对。所述氨基酸残基在自然细胞加工和降解过程中会导致产物变体。
图16A、16B和16C提供了按照SDS-PAGE和蛋白质印迹法测定的脱免疫2-13D-37抗体的两种变体(2-13D-37-1.5W-41和2-13D-37-3W-16)的表达水平。图16A和16B显示了用SDS-PAGE检测来自培养液和纯化蛋白的抗体的结果。图16C显示了使用蛋白质印迹法的结果。在图16A、16B和16C中，泳道“1”和“2”分别对应于抗体2-13D-37-1.5W-41和2-13D-37-3W-16。在泳道“1”和“2”内，“A”和“B”分别对应于离心前和离心后。在图16B中，左图显示了还原的SDS-PAGE，而右图显示了非还原的SDS-PAGE。
图17A和17B提供了脱免疫2-13D-37抗体的两种变体(2-13D-37-1.5W-41和2-13D-37-3W-16)的分析，所述变体是通过亲和力成熟产生的。图17A显示了以下抗体的轻链可变区(顶部三个框)和重链可变区(底部三个框)的氨基酸序列比对：脱免疫克隆2-13D-37、脱免疫克隆2-13D-37-1.5W-41和脱免疫克隆2-13D-37-3W-16。具有如通过ITOPETM分析测定的具有高和中等免疫原性潜力的氨基酸残基在框内分别用“1”和“2”表示。也注意到其他感兴趣的氨基酸残基：“3”＝潜在的色氨酸或蛋氨酸氧化；“4”＝潜在的天冬酰胺脱酰胺作用；“5”＝潜在的天冬氨酸异构化；和“6”＝非典型半胱氨酸对。所述氨基酸残基在自然细胞加工和降解过程中会导致产物变体。图17B显示了脱免疫克隆2-13D-37、脱免疫克隆2-13D-37-1.5W-41和脱免疫克隆2-13D-37-3W-16与FAM19A5蛋白的结合分析。将展示噬菌体的每个单链可变片段(scFv)加入到FAM19A5(■)或抗HA抗体(□)包被的微量滴定板的孔中。在BSA包被的对照孔中测量背景信号。用HRP结合的抗M13抗体对孔进行探测。测量405nm位的吸光度。
图18提供了实施例11中使用的HDX-MS测定的总体工作流程示意图。
图19提供了一个表格，所述表格总结了在实施例11中描述的HDX-MS测定的不同实验条件下获得的覆盖率百分比。调整了以下一个或多个参数：(i)样品浓度，(ii)骤冷条件，(iii)胃蛋白酶浓度和/或消化持续时间，和(v)骤冷保持时间(分钟)。根据分析，Cl8或C8胃蛋白酶固定化柱用于在线(开)或离线(关)消化，如图19所示。
图20A和20B提供了FAM19A5蛋白在实施例11中所述优化条件下的酶消化的结果。图20A显示了相对于成熟FAM19A5蛋白(SEQ ID NO：101，即，SEQ ID NO：2减去对应于前25个氨基酸的信号肽)。每条水平线代表一个单独的肽。图20B提供了44个肽的氨基酸序列，包括它们相对于SEQ ID NO：101的起始和结束位点，单离子质量(MHP)和保留时间(RT)。
图21显示了如实施例11所述，在氘标记后用胃蛋白酶消化FAM19A5蛋白鉴定的22个肽的覆盖率和冗余度百分比。每条水平线代表一个单独的肽。
图22A、22B、22C、22D和22E提供了单个(单独抗原，“1”)和抗原-抗体(2-13)复合物(“2”)之间氘摄取作为时间函数的比较。y轴显示最大氘摄取量(如果肽含有脯氨酸，最大值为[(氨基酸数-1)-(脯氨酸数)]。x轴提供氘标记的持续时间。图22A提供了下列肽的数据：(i)FLKEGQL(SEQ ID NO：102)(左上图)，(ii)FLKEGQLAAGTCE(SEQ ID NO：103)(右上图)，(iii)LKEGQLAAG(SEQ ID NO：104)(左中图)，(iv)LKEGQLAAGTCEI(SEQ ID NO：105)(右中图)，(v)LKEGQLAAGTCEIVTL(SEQ ID NO：106)(左下图)，及(vi)AAGTCEI(SEQ ID NO：107)(右下图)。图22B提供了下列肽的数据：(i)RDSSQPPRTIARQTARCAC(SEQ ID NO：108)(左上图)，(ii)QPPRTIARQTA(SEQ ID NO：109)(右上图)，(iii)ACRKGQIAGTTRARPAC(SEQ ID NO：110)(左中图)，(iv)ACRKGQIAGTTRARPACLKEGQLAAGTCEI(SEQ ID NO：111)(右中图)，(v)ACRKGQIAGTTRARPACVDA(SEQ ID NO：112)(左下图)，及(vi)ARIIKTKQWC(SEQ ID NO：113)(右下图)。图22C提供了下列肽的数据：(i)ARIIKTKQWCDM(SEQ ID NO：114)(左上图)，(ii)ARIIKTKQWCDML(SEQ ID NO：115)(右上图)，(iii)ARIIKTKQWCDMLPCL(SEQ ID NO：116)(左中图)，(iv)RIIKTKQWCDM(SEQ ID NO：117)(右中图)，(v)RIIKTKQWCDML(SEQ ID NO：118)(左下图)，及(vi)WCDMLPCL(SEQ ID NO：119)(右下图)。图22D提供了以下肽的数据：(i)LPCLEGEG(SEQ ID NO：120)(左上图)，(ii)PCLEGEG(SEQ ID NO：121)(右上图)，(iii)PCLEGEGCD(SEQ ID NO：122)(左中图)，(iv)PCLEGEGCDL(SEQ ID NO：123)(右中图)，(v)EGEGCDL(SEQ ID NO：124)(左下图)，及(vi)EGEGCDLL(SEQ ID NO：125)(右下图)。图22E提供了下列肽的数据：(i)LLINRSGWTCTQPGGRIKTTT(SEQ ID NO：126)(左图)和(ii)LINRSGWTCTQPGGRIKTTT(SEQ ID NO：127)(右图)。在每个图中，图的顶角提供了关于肽的附加信息(即起始和终止位点(SEQ ID NO：101，即，SEQ ID NO：2减去对应于前25个氨基酸的信号肽)和大小)。
图23A、23B和23C显示了沿FAM19A5蛋白的关键氨基酸残基，在单个和复合样品之间氘摄取量(即，大于±0.5Da)有显著差异。图23A提供了单个(单独抗原，定部)和抗原-抗体(2-13)复合物(底部)氘摄取量的蝴蝶图分析。图23B提供了单个样品和复合样品间氘吸收差异的曲线图。图23C显示了表示氘摄取量小于1.5Da的差值之和的数据。在图23A、23B和23C中，每条线代表氘标记的不同持续时间：(i)“1”(0.33分钟或20秒)、(ii)“2”(10分钟)、(iii)“3”(60分钟)和(iv)“4”(240分钟)。此外，每个点对应于一个单独的肽。图23B和23C显示了肽(SEQ ID NO：101)的起始和终止位点在单个(单独抗原)和抗原-肽复合物间氘摄取量差异大于0.5Da。图23B和23C中的虚线框显示了氘摄取量的差异小于0.5Da。
图24提供了热图分析，显示了FAM19A5蛋白的区域在单个(单独抗原)和抗原-抗体(2-13)复合物样品间氘摄取量有显著差异。红色虚线框中的残基代表关键氨基酸残基：(i)CRKGQIAGTTRAR(SEQ ID NO：101的氨基酸残基38-50或SEQ ID NO：2的氨基酸残基63-75)及(ii)PACVDARJIKTKQW(SEQ ID NO：101的氨基酸残基51-64或SEQ ID NO：2的氨基酸残基76-85)。
图25提供了FAM19A5蛋白的三维结构和2-13抗体的关键结合表位的位置。
具体实施方式
本文公开了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)蛋白(“抗FAM19A5抗体”)，并展示出本文公开的一种或多种特性。具体而言，抗FAMI9A5抗体已被脱免疫以降低人类个体的免疫原性。
为了促进对本文公开的公开内容的理解，定义了多个术语和短语。在整个详细描述中阐述了附加定义。
I.定义
在本公开中，“一种”实体指一个或多个该实体；例如“一种抗体”可理解为代表一个或多个抗体。因此，在本文中，“一”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”可以互换使用。。
此外，“和/或”在本文中使用时，应视为两个指定特征或组件中的每一个(与或不与另一个)的具体公开。因此，本文中“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”预计包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”预计涵盖以下每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
应当理解，无论在何处用语言“包含”来描述方面，也提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”中描述的其他类似方面。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应具有与本公开内容相关本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。例如《简明生物医学与分子生物学辞典(Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)》，Juo,Pei-Show,第二版，2002年，CRC出版社；《细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell andMolecular Biology)》，第三版，1999年，美国学术出版社；《牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)》，修订版，2000年，牛津大学出版社，以上出版物为本领域技术人员提供了本公开所使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号及其国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义范围的数字。除另有说明外，氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述本公开的各个方面可以通过整体参考说明书来获得。因此，通过参考整个说明书，下文定义的术语整体予以更全面的定义。
本文使用的术语“约”是指近似、大致、大约或在……的范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过将边界扩展高于或低于所述数值来修改该范围。通常，术语“约”可以以高于或低于(提高或降低)例如10％的变量将数值修改为大于或小于所述值。
术语“序列相似家族19成员A5”或“FAM19A5”是指属于五个高度同源蛋白的TAFA家族(也称为FAM19家族)的蛋白，主要在大脑和脊髓中表达。FAM19A5也称为TAFA5或趋化因子样蛋白TAFA-5。
在人类中，编码FAM19A5的基因位于22号染色体上。存在多种被认为是通过可变剪接产生的人FAM19A5(UniProt：Q7Z5A7)同工型：同工型1(UniProt：Q7Z5A7-1)，由132个氨基酸组成，同工型2(UniProt：Q7Z5A7-2)，由125个氨基酸组成，和同工型3(UniProt：Q7Z5A7-3)，由53个氨基酸组成。人FAM19A5蛋白被认为以膜结合和可溶性(分泌)形式存在。同工型1被认为是具有一个跨膜区的膜蛋白。在Tang T.Y.等人，《基因组学(Genomics)》83(4)：727-34(2004)中作为分泌蛋白(可溶性)报道的同工型2在氨基酸1-25处含信号肽。同工型1被认为是一种膜蛋白，根据EST数据预测。以下是三种已知的人FAM19A5同工型的氨基酸序列。
(I)同工型1(UniProt：Q7Z5A7-1，跨膜蛋白)：该同工型已被选为规范序列。
MAPSPRTGSR QDATALPSMS STFWAFMILA SLLIAYCSQL AAGTCEIVTL DRDSSQPRRTIARQTARCAC RKGQIAGTTR ARPACVDARI IKTKQWCDML PCLEGEGCDL LINRSGWTCT QPGGRIKTTTVS(SEQ ID NO：1)
(ii)同工型2(UniProt：Q7Z5A7-2，可溶性蛋白)：
MQLLKALWAL AGAALCCFLV LVIHAQFLKE GQLAAGTCEI VTLDRDSSQP RRTIARQTARCACRKGQIAG TTRARPACVD ARIIKTKQWC DMLPCLEGEG CDLLINRSGW TCTQPGGRIK TTTVS(SEQID NO：2)
(iii)同工型3(UniProt：Q7Z5A7-3)：
MYHHREWPAR IIKTKQWCDM LPCLEGEGCD LLINRSGWTC TQPGGRIKTT TVS(SEQ ID NO：3)
术语“FAM19A5”包括细胞天然表达的FAM19A5的任何变体或同工型。因此，本文所述的抗体可以与相同物种中的不同的同工型(例如人FAM19A5的不同的同工型)交叉反应，或与来自人以外物种的FAM19A5(例如小鼠FAM19A5)交叉反应。抗体也可以对人FAM19A5具有特异性，而与其他物种无交叉反应性。FAM19A5或其任何变体和同工型，可以从天然表达它们的细胞或组织中分离或重组产生。编码人FAM19A5的多核苷酸具有GenBank登录号BC039396和以下序列：
表1A人FAM19A5的多核苷酸序列
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术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”是本领域的术语，在本文中可以互换使用，并且是指具有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本文使用的术语包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。在一个实施例中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合部分。在另一个实施例中，“抗体”是指包含单个可变结构域，例如VHH结构域的单链抗体。每个重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。在某些天然存在的抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗体中，每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。
VH和VL区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FRs组成，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其中包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“Kabat编号”和类似术语是本领域公认的术语，指对抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，可以根据Kabat编号系统确定抗体的CDR(参见Kabat EA，Wu TT(1971)《纽约科学院年鉴(Ann NY Acad Sci)》190：382-391和Kabat EA等人(1991)，《免疫相关蛋白质序列(Sequence of Proteins ofImmunological Interest)》第五版，美国卫生与公共服务部，NIH出版物第91-3242号)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于第31至35位的氨基酸处，可在35之后视需要包括一个或两个附加的氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B)(CDR1)；第50至65位氨基酸(CDR2)处；以及第95至102位氨基酸(CDR3)处。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于第24至34位氨基酸(CDR1)，第50至56位氨基酸(CDR2)和第89至97位氨基酸(CDR3)处。在具体实施例中，已经根据Kabat编号方案确定了本文描述的抗体的CDR。
短语“如Kabat中的氨基酸位置编号”，“Kabat位置”及其语法变体是指Kabat等人，《免疫相关蛋白质序列(Sequence of Proteins of Immunological Interest)》，第五版，公共卫生署，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991年)中抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含更少或更多的氨基酸，对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或插入。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或插入含较少或附加的氨基酸。例如重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入片段(根据Kabat的残基52a)和在重链FW残基82之后的插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。参见表IB。
表1B
可以通过在抗体的序列的同源性区与“标准”Kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。相反，Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》196：901-917(1987))。当使用卡巴特编号惯例进行编号时，乔西亚CDR-H1循环的末端根据循环的长度在H32和H34之间变化(这是因为卡巴特编号方案将插入放在H35A和H35B如果35A和35B都不存在，循环在32结束；如果只存在35A，循环在33结束；如果35A和35B都存在，循环在34结束)。ABM高变区代表了Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并由牛津分子公司用于ABM抗体建模软件。
IMGT(ImMunoGeneTics)也提供了用于包括CDR在内的免疫球蛋白可变区的编号系统。参见例如Lefranc，M.P.等人，《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27：55-77(2003)，其通过引用并入本文。IMGT编号系统基于5,000多个序列的比对、结构数据和高变环的表征，并允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号模式，VH-CDR1位于第26至35位，VH-CDR2位于第51至57位，VH-CDR3位于第93至102位，VL-CDR1位于第27至32位，VL-CDR2位于第50至52位，VL-CDR3位于第89至97位。
对于本公开中讨论的所有重链恒定区氨基酸位置，根据Edelman等人，1969，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》63(l)：78-85中首次描述的EU索引进行编号，其描述了骨髓瘤蛋白EU的氨基酸序列——第一个测序的人lgGl。Edelman等人的EU索引也在下列文献中进行了阐述，比如Kabat等人，1991，《免疫相关蛋白质序列(Sequence ofProteins of Immunological Interest)》，第五版，公共卫生署，美国国立卫生研究院，贝塞斯达。因此，短语“如Kabat阐述的EU索引”或“Kabat的EU索引”和“根据如Kabat阐述的EU索引的位置、、、、”及其语法变体是指如Kabat 1991所阐述的Edelman等人的基于人lgGl EU抗体的残基编号系统。
用于可变结构域(重链和轻链两者)和轻链恒定区氨基酸序列的编号系统在Kabat1991中进行了阐述。
抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgD、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2)或任何亚类(例如人IGg 1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白，例如IgGl，以几种同种异型存在，它们彼此之间最多只有几个氨基酸不同。本文公开的抗体可以来自任何通常已知的同种型、类别、亚类或同种异型。在某些实施例中，本文所述的抗体是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚类或其任何杂合体。在某些实施例中，抗体是IgG2、IgG4或IgG2/IgG4亚类。
“抗体”包括，例如天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；全合成抗体；单链抗体；单特异性抗体；多特异性抗体(包括双特异性抗体)；包含两个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体；抗体轻链单体；抗体重链单体；抗体轻链二聚体，抗体重链二聚体；抗体轻链-抗体重链对；胞内抗体；缀合抗体；单价抗体；单链抗体；骆驼化抗体；亲合体；抗独特型(抗-id)抗体(包括，例如抗抗-ID抗体)和单结构域抗体(sdAbs)，这些抗体包括由单个单体可变抗体结构域组成的结合分子，所述分子完全具有抗原结合能力(例如VH结构域或VL结构域)。Harmen M.M.和Haard H.J.，《应用微生物生物技术(ApplMicrobiol Biotechnol.)》77(1)：13-22(2007))。
本文中所用的抗体的术语“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个保留与抗原(例如人FAM19A5)特异性结合的能力的片段。所述“片段”的长度例如为约8至约1500个氨基酸之间，合适地在约8至约745个氨基酸之间，合适地约8至约300，例如约8至约200个氨基酸，或约10至约50或100个氨基酸。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗体，例如本文所述的抗FAM19A5抗体的术语“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一个由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一个包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域和二硫键连接的Fv(sdFv)组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)《自然》341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区或(vii)两个或多个可以视需要通过合成接头连接的分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过使它们能够成为一条蛋白链的合成接头连接起来，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，(1988)科学242：423-426；和Huston等人，(1988)《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整的免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。
本文中所用的术语“可变区”和“可变结构域”可互换使用，并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般是轻链或重链的一部分，通常为成熟重链的氨基末端约110至120个氨基酸，成熟轻链的约90至115个氨基酸(不同抗体之间的序列差异很大)，并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在那些称为互补决定区(CDR)的区中，而可变结构域中更加高度保守的区称为框架区(FR)。
不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施例中，可变区是人可变区。在某些实施例中，可变区包括啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定实施例中，可变区是灵长类(例如非人灵长类)可变区。在某些实施例中，可变区包括啮齿动物或鼠CDR和灵长类(例如非人灵长类)框架区(FR)。
本文中所用的术语“重链”(HC)在涉及抗体使用时可以指任何基于恒定结构域的氨基酸序列的不同类型，例如α(a)、δ(6)、ε(a)、γ(y)和μ(p)，其分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4.
本文中所用的术语“轻链”(LC)在关于抗体使用时可以指任何基于恒定结构域的氨基酸序列的不同类型，，例如kappa(k)或lambda(X)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的在特定实施例中，轻链是人轻链。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用，指抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用，指抗体的重链可变区。
如本文所使用的，术语“恒定区”和“恒定域”可互换使用，并且具有其在本领域的普通含义。恒定区是抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以展现出多种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更加保守的氨基酸序列。
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”指抗体重链的C-末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一成分(Clq)结合。因此，Fc区包括抗体的恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1或CL)。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白片段，分别来自抗体的两个重链的第二个(CH2)和第三个(CH3)恒定结构域；IgM和IgE Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH2-4结构域)。对于IgG，Fc区包括免疫球蛋白结构域Cy2和Cy3以及Cyl和Cy2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能会变化，但通常将人IgG重链Fc区定义为从C226或P230位氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)延伸到重链的羧基末端，其中编号按照如Kabat的EU索引。人IgG Fc区的CH2结构域从约氨基酸231延伸到约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区Cm结构域的C末端侧，，即，其从IgG的约氨基酸341延伸到约氨基酸447。本文中所用的Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体，或变体Fc(例如非天然存在的Fc)。Fc也可以单独地指这一区域，或在包含Fc的蛋白多肽，诸如“包含Fc区的结合蛋白”的上下文中，也称为“Fc融合蛋白”(例如抗体或免疫粘附素)。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgGl Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；以及天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fes的各种同种异型(参见例如Jefferis等人，(2009)《单克隆抗体(mAbs)》1：1；Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布))。
“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包含FcyR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcyR家族由三个活化(小鼠体内的FcyRI、fcyrii和FcyRIV；人类的FcyRIA、FcyRIA和FcyRIIA)和一种抑制性(fcyrib)受体组成。人IgGl与大多数人Fc受体结合，并引发最强的Fc效应子功能。相对于与其结合的活化Fc受体类型而言，它被认为等同于鼠IgG2a。相反，人IgG4引发最少的Fc效应子功能。Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布)。
恒定区可以例如通过重组技术来操纵，以消除一种或多种效应子功能。“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用，或由此产生的生化事件。示例性“效应功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcyR介导的效应子功能诸如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)。这种效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合。因此，术语“不具有Fc功能的恒定区”包括具有减少或没有由Fc区介导的一种或多种效应子功能的恒定区。
抗体的效应子功能可以通过不同的方法减少或避免。通过使用缺少Fc区的抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、单链Fv(scFv)或由单体VH或VL结构域组成的sdAb)，可以减少或避免抗体的效应子功能。所谓的非糖基化抗体也可以通过以下方式产生：去除与Fc区中特定残基连接的糖以减少抗体的效应子功能，同时保留Fc区的其他有价值的属性(例如延长的半衰期和异二聚化)。糖基化抗体可以通过例如缺失或改变糖附着的残基，酶促去除糖，在糖基化抑制剂存在下培养的细胞中产生抗体，或通过无法使蛋白糖基化的细胞(例如细菌宿主细胞)中表达抗体来产生。参见例如美国专利公开第20120100140号。另一种方法是使用来自IgG亚类的具有减少的效应子功能的的Fc区，例如IgG2和IgG4抗体的特征在于比IgG1和IgG3具有更低水平的Fc效应子功能。Fc部分CH2结构域中最靠近铰链区的残基负责抗体的效应子功能，因为其在先天免疫系统的效应子细胞上含Clq(补体)和IgG-Fc受体(FcyR)的高度重叠结合位点。Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布)。因此，可以通过产生例如包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域的嵌合Fc区，或包含来自IgG2的铰链区和来自IgG4的CH2区的嵌合Fc区(参见例如lauc.等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》191：4769-4777(2013))，或具有导致Fc效应子功能改变，例如减少或没有Fc功能的突变的Fc区，来制备具有减少或不具有Fc效应子功能的抗体。此类具有突变的Fc区是本领域已知的。参见例如美国专利公开第20120100140号和其中引用的美国和PCT申请以及an等人，《单克隆抗体(mAbs)》1：6，572-579(2009)；通过引用将其公开内容整体并入本文。
“铰链”、“铰链结构域”或“铰链区”或“抗体铰链区”是指重链恒定区的将CH1结构域连接到CH2结构域的结构域，并且包括铰链的上部、中部和下部(Roux等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》1998 161：4083)。铰链在抗体的结合区和效应子区之间提供了不同水平的柔性，并且还提供了两个重链恒定区之间的分子间二硫键结合的位点。本文中所用的对于所有的IgG同种型，铰链开始于Glu216，终止于Gly237(Roux等人，1998，免疫学161：4083)。野生型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4铰链的序列是本领域已知的参见例如Rabat EA等人，
(1991)《免疫相关蛋白质序列》(Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest)第5版，美国卫生与公共服务部，NIH出版物第91-3242号)；Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布)。
术语“CH1结构域”是指重链恒定结构域中将可变结构域连接到铰链的重链恒定区。本文中所用的CH1结构域开始于Al 18，并且终止于V215。术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域，以及其天然存在的变体(例如同种异型)。IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(包括野生型和同种异型)的CH1结构域序列是本领域已知的。参见例如Rabat EA等人，(1991)同上和Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布)。示例性CH1结构域包括具有突变的CH1结构域，该突变修饰抗体的生物学活性，例如半衰期，例如美国公开专利第20120100140号和其中引用的美国专利和出版物以及PCT出版物。
术语“CH2结构域”是指在重链恒定区中将铰链连接到CH3结构域的重链恒定区。本文中所用的CH2结构域开始于P238，并且终止于K340。术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域，以及其天然存在的变体(例如同种异型)。IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(包括野生型和同种异型)的CH2结构域序列是本领域已知的。参见例如Rabat EA等人，(1991)同上和VidarssonG.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布)。示例性CH2结构域包括具有突变的CH2结构域，所述突变修饰抗体的生物活性，例如半衰期和/或降低的Fc效应子功能，例如美国专利公开第20120100140号和其中引用的美国专利和出版物以及PCT出版物。
术语“CH3结构域”是指重链恒定结构域中是CH2结构域C末端的重链恒定区。本文中所用的CH3结构域开始于G341，并且终止于K447。术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域，以及其天然存在的变体(例如同种异型)。IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(包括野生型和同种异型)的CH3结构域序列是本领域已知的。参见例如Kabat EA等人，(1991)同上和VidarssonG.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布)。示例性CH3结构域包括具有突变的CH3结构域，该突变修饰抗体的生物学活性，例如半衰期，例如美国公开专利第20120100140号和其中引用的美国专利和出版物以及PCT出版物。
本文中所用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl IgA2、IgD和IgE抗体)。
“同种型”是指特定同种型组中天然存在的变体，所述变体在几个氨基酸上有所不同(例如参见Jefferis等人，(2009)《单克隆抗体(mAbs)》1：1。本文所述的抗体可以是任何同种异型。IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种异型在本领域是已知的，参见例如Kabat EA等人，(1991)同上和Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(2014年10月20日在线发布)；和Lefranc MP，《单克隆抗体(mAbs)》1：4，1-7(2009)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
本文中所用的“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如与FAM19A5特异性结合的分离抗体基本上不含与FAM19A5以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，特异性结合FAM19A5表位的分离抗体可以与来自不同物种的其他FAM19A5蛋白具有交叉反应性。
“结合亲和力”通常是指分子(如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外说明，否则本文中所用的“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1：1的相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。可以用本领域已知的多种方式测量和/或表达亲和力，包括但不限于平衡解离常数(Kd)、和平衡缔合常数(Ka)。KD由k关闭/k开启的商计算，并以摩尔浓度(M)表示，而ka由k开启/k关闭的商计算。k开启是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，而k关闭是指例如抗体与抗原的解离。k开启和k关闭可以通过本领域普通技术人员已知的技术来确定，诸如免疫测定法(例如酶联免疫吸附测定法(ELISA))、或平衡弃除免疫测量法(KinExA)。
本文中所用的术语“特异性结合”、“特异性识别”、“特异结合”、“选择结合”以及“选择性结合”是抗体上下文中的类似术语，并且是指如本领域技术人员所理解的那样与抗原(例如表位或免疫复合物)结合的分子(例如抗体)。例如与抗原特异性结合的分子可以通常以较低的亲和力与其他肽或多肽结合，该亲和力例如通过免疫测定法、KinExA3000仪器(Sapidyne仪器，Boise，ID)或本领域已知的其他测定所确定。在具体实施例中，与抗原特异性结合的分子以至少2log、2.5log、3log、4log或比分子与另一抗原结合时的ka更大的ka与抗原结合。
抗体通常以高亲和力与其同源抗原特异性结合，这由10-5至10-11m或更小的解离常数(KD)反映。通常认为任何大于约10-4M的KD指示非特异性结合。本文中所用的与抗原“特异性结合”的抗体是指以高亲和力与抗原和基本上相同的抗原的结合，但不与无关抗原高亲和力结合的抗体，该以高亲和力与抗原和基本上相同的抗原的结合意味着，当使用预定抗原以BIACORE 2000仪器通过免疫测定法(例如ELISA)或表面等离子共振(SPR)技术测定时具有10-7m或更小，优选10-8m或更小，甚至更优选10-9m，并且最优选在10-8m和10-10m之间或以下的KD。
本文中所用的术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，如蛋白、肽或半抗原。抗原可以是FAM19A5或其片段。
本文中所用的“表位”是本领域的术语，并且是指抗体可以与之特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可以例如来自一个或多个多肽的两个或多个非连续区域(构象、非线性、不连续或非连续表位)。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或同时来自一个或多个多肽的两个或多个非连续区域(构象、非线性、不连续或非连续的表位)。在暴露于变性溶剂时，由连续氨基酸形成的表位通常但不一定全部保留；而在用变性溶剂处理时，通常会导致由三级折叠形成的表位丢失。表位通常包括独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个氨基酸。确定给定抗体结合哪些表位的方法(即表位作图)是本领域众所周知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定法，其中使用给定抗体(例如抗FAM19A5抗体)测试来自(例如来自FAM19A5)的重叠或连续肽的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域和本文所述的技术，例如x射线晶体分析法、二维核磁共振和HDX-质谱(例如参见《分子生物学方法：表位作图法(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology)》，Vol.66，G.E.Morris编辑，(1996))。
在某些实施例中，可以通过例如NMR波谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定法、氢/氘交换结合质谱法(例如液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定法和/或诱变作图(例如定点诱变作图)来确定抗体所结合的表位。对于x射线晶体分析法，可以使用本领域中已知方法中的任一种完成结晶(例如Giege R等人，(1994)《晶体学报D卷：生物晶体学(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)》50(Pt4)：339-350；McPherson A(1990)《欧洲生物化学杂志(Eur JBiochem)》189：1-23；Chayen NE(1997)《结构(Structure)》5：1269-1274；McPherson A(1976)《生物化学杂志(J Biol Chem)》251：6300-6303)。抗体：抗原晶体可以使用众所周知的x射线衍射技术进行研究，并且可以使用诸如X-PLOR(耶鲁大学，1992年，由分子模拟公司发行；参见例如《甲基酶醇(Meth Enzymol)》(1985)第114和115期，Wyckoff HW等编，美国公开专利第2004/0014194号，和BUSTER(Bricogne G(1993)《晶体学报D卷：生物晶体学(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)》49(Pt1)：37-60；BricogneG(1997)《甲基酶醇(Meth Enzymol)》276A：361-423，ed Carter CWRoversi P等人，(2000)《晶体学报D卷：生物晶体学(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)》56(Pt 10)：1316-1323)的计算机软件优化。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来完成诱变作图研究。关于包括丙氨酸扫描诱变技术在内的诱变技术的描述，参见例如Champe M等人，(1995)《生物化学杂志(J Biol Chem)》270：1388-1394和Cunningham BC&Wells JA(1989)《科学(Science)》244：1081-1085。
术语“表位作图”是指鉴定用于抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
关于两种或多种抗体，术语“与相同表位结合”是指抗体与氨基酸残基的相同片段的结合，如通过给定方法所确定的。用于确定抗体是否与本文所述的抗体一样结合“FAM19A5上的相同表位”的技术包括例如表位作图方法，诸如提供表位的原子分辨率的对抗原：抗体复合物的晶体进行x射线分析，和氢/氘交换质谱法(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段的结合或抗原的突变变异，其中通常认为抗原序列中氨基酸残基的修饰所导致的结合损失是表位成分的指示。另外，也可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。具有相同的VH和VL或相同的CDR 1、2和3序列的抗体预期与相同的表位结合。
“与另一种抗体竞争结合靶标的抗体”是指抑制(部分或完全)另一抗体与靶标结合的抗体。可以使用已知的竞争实验来确定两种抗体是否彼此竞争结合靶标，即一种抗体是否抑制另一抗体与靶标的结合和抑制程度如何。在某些实施例中，抗体与另一抗体竞争并抑制另一抗体与靶标的结合达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。根据哪一抗体是“封闭抗体”(即首先与靶标一起孵育的冷抗体)，抑制或竞争的水平可以不同。根据例如Ed Harlow和David Lane，《冷泉港实验方案(Cold SpringHarbProtoc)》；2006；doi：10.1101/pdb.prot4277，或Ed Harlow和David Lane“使用抗体(Using Antibodies)”(位于美国纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社)(1999)第11章所述进行竞争测定。竞争性抗体与相同表位、重叠表位结合或与邻近表位结合(例如如通过位阻证明)。
其他竞争结合分析包括：固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹心式竞争测定法(参见Stahli等人，《酶学方法(Methods inEnzymology)》9：242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人，J.Immunol。137：3614(1986))；固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法(参见Harlow和Lane，抗体：《实验室手册(A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(1988年)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，《分子免疫学(Mol.Immunol.)》25(1)：7(1988))；固相直接生物素-亲和素免疫分析(Cheung等人，《病毒学(Virology)》176：546(1990))；以及直接标记的RIA.(Moldenhauer等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》32：77(1990))。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Sonisvilai&Lachmann，《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》79：315-321(1990)；Kostelny等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》148，1547-1553(1992)。
本文中所用的术语“单克隆抗体”是指对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体，或其中所有抗体对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体组合物。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性并且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和任选恒定区的抗体或抗体组合物。在一个实施例中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞，该B细胞具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文中所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)与用于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)与转化以表达抗体的宿主细胞(例如与转染瘤)分离的抗体，(c)与重组、组合人抗体库分离的抗体，以及(d)通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列上的方法制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体包含可变区和恒定区，所述可变区和恒定区利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括例如在抗体成熟期间出现的后续重排和突变。如本领域中已知的(参见例如Lonberg(2005)《自然生物技术(Nature Biotech.)》23(9)：1117-1125)，可变区含由各种基因编码的抗原结合结构域，该基因重排以形成对外源抗原具有特异性的抗体。除了重排之外，可变区还可以通过多个单个氨基酸变化(称为体细胞突变或超突变)进一步修饰，以增加抗体对外源抗原的亲和力。恒定区将进一步响应于抗原而变化(即同种型转换)。因此，在对抗原的应答中，对轻链和重链免疫球蛋白多肽进行编码的重排和体细胞突变的核酸分子无法具有与原始核酸分子具有序列同一性，而是基本上相同或相似(即，具有至少80％的同一性)。
“人”抗体(HuMAb)是指具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文所述的抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，本文中所用的术语“人抗体”并非要包括这样的抗体，即其中源自另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已嫁接到人框架序列上的抗体.术语“人”抗体和“完全人”抗体是同义词。
“人源化”抗体是指其中非人抗体的CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应氨基酸替换的抗体。在抗体的人源化形式的一个实施例中，CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸替换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸未改变。对氨基酸进行小的添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要它们不消除抗体与特定抗原结合的能力即可。“人源化”抗体保留了与原始抗体相似的抗原特异性。
本文中所用的术语“脱免疫的”或“脱免疫”是指其中例如在人个体中修饰抗体或其抗原结合部分以降低其免疫原性的过程。例如可以分析来自原始抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列，并且可以从每个v区生成人T细胞表位“图”，从而显示表位在序列中相对互补决定区(CDR)和其他关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的各个T细胞表位，以鉴定改变最终抗体活性风险较低的替代氨基酸取代。设计一系列包含氨基酸取代组合的替代VH和VL序列，然后将这些序列并入一系列FAM19A5特异性抗体或其抗原结合部分，以用于本文所公开的诊断和治疗方法，然后测试该诊断和治疗方法的功能。然后，将包含修饰的V和人C区的完整重链和轻链基因克隆到表达载体和随后引入细胞系中的质粒，以产生完整抗体。然后以适当的生化和生物学测定法比较抗体，并鉴定最佳变体。可以使用本文所述的方法或本领域已知的任何其他方法，对抗体进行脱免疫。参见例如WO 98/52976或WO 00/34317。
“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个物种而恒定区源自另一物种的抗体，诸如其中可变区源自小鼠抗体而恒定区源自人抗体的抗体。
本文中所用的术语“交叉反应”是指本文所述的抗体与来自另一不同物种的FAM19A5结合的能力。例如本文所述的结合人FAM19A5的抗体也可以结合另一物种FAM19A5(例如小鼠FAM19A5)。本文中所用的可以通过以结合测定法(例如SPR、ELISA)检测与纯化的抗原的特异性反应，或与生理表达FAM19A5的细胞结合或在功能上相互作用来测量交叉反应性。交叉反应性的测定方法包括如本文所述的标准结合测定法，例如利用2000SPR仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)，通过/>表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术技术。
应用于本文公开的物体的术语“天然存在的”是指在自然界中可以发现的物体。例如存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，所述生物体可与天然来源分离，并且在实验室中未经过人为有意修饰。
“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，所述链的长度没有上限。蛋白中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰，诸如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。“蛋白”可以包含一种或多种多肽。
本文中所用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以是cDNA。
本文使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，额外的DNA片段可以连接到其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离哺乳动物载体)在引入宿主细胞后可整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中可用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其他形式的表达载体，诸如发挥等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本文中所用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指包含非天然存在于细胞中的核酸的细胞，并且可能是已导入重组表达载体的细胞。应当理解，所述术语不仅是指特定的物体细胞，而且还指所述细胞的后代。因为突变或环境影响可能会造成在后代中发生某些修饰，所以所述后代实际上无法与亲本细胞相同，但仍然包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
本文中所用的术语“连接的”是指两个或多个分子的缔合。连接可以是共价或非共价的。连接也可以是遗传的(即重组融合的)。可以使用多种本领域公认的技术，诸如化学缀合和重组蛋白产生来实现所述连接。
本文中所用的“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将治疗剂或包含治疗剂的组合物以物理方式引入个体。本文所述抗体的优选施用途径包括例如通过注射或输注的静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径。本文中所用的短语“肠胃外施用”是指通常通过注射而不是肠内和局部施用的施用方式，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心脏内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。本文所述的抗体也可以经由非肠胃外途径，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行施用。
本文中所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指对个体进行的任何类型的干预或过程，或将活性剂施用于个体，以实现以下目标：逆转、减轻、改善、抑制或减慢或预防与疾病相关的症状、并发症、病状或生化征象的进展、发展、严重程度或复发。所治疗的可以是患有疾病的个体或未患疾病的个体(例如用于预防)。
本文中所用的术语“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本文中所用的术语“神经胶质增生的发作”或“反应性神经胶质增生的发作”包括神经胶质增生的开始或起始。神经胶质增生是响应于来自例如创伤、脑脊髓损害、脑瘤、感染、局部缺血、中风、自身免疫反应和/或神经退行性疾病的损伤和损害的中枢神经系统(CNS，例如大脑和/或脊髓)中神经胶质细胞的非特异性反应性变化，并且包括几种不同类型的神经胶质细胞(包括星形胶质细胞、小神经胶质细胞和少突胶质细胞)的增殖或肥大。神经胶质增生的发作可导致形成瘢痕，从而抑制已受创伤或损伤的CNS部分的轴突再生。神经胶质增生发作的有害影响包括对神经元的不可逆或永久性损害和/或妨碍周围神经元恢复。因此，术语“延缓神经胶质增生的发作”和“延缓反应性神经胶质增生的发作”包括阻止、减缓、抑制或预防神经胶质增生的开始或起始及其对CNS的相关有害作用。
本文中所用的术语“反应性星形胶质细胞过度增殖”包括例如CNS损害、创伤、损伤、脑脊髓损害、脑瘤、感染、局部缺血、中风、自身免疫反应和/或神经退行性疾病导致的附近神经元的破坏所引起的星形胶质细胞数量的异常增加。反应性星形胶质细胞的过度增殖可导致对CNS的有害作用，包括：形成瘢痕，从而抑制已受创伤或损伤的CNS部分的轴突再生；加剧炎症；在神经毒性水平上产生和释放活性氧物种；潜在地释放兴奋毒性谷氨酸盐；潜在地导致癫痫发生；损害血脑屏障功能；造成创伤和中风期间的细胞毒性水肿；星形胶质细胞的慢性细胞因子活化潜在地导致慢性疼痛；以及CNS损伤后造成继发性变性。Sofroniew，Michael V.(2009)《神经科学趋势(Trends in Neurosciences)》，32(12)：638-47；McGraw，J.等人(2001)《神经科学研究杂志(Journal of Neuroscience Research)》63(2)：109-15；和Sofroniew,M.V.(2005)《神经科学家(Neuroscientist)》11(5)：400-7。因此，术语“抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖”包括阻止、减缓、抑制、遏制或预防反应性星形胶质细胞的过度或异常增殖及其对CNS的相关有害作用。
本文中所用的术语“硫酸软骨素蛋白聚糖”包括由蛋白核心和硫酸软骨素构成的蛋白聚糖。硫酸软骨素蛋白聚糖，也称为CSPG，是在整个发育和成熟CNS中广泛表达的细胞外基质分子。CSGP在中枢神经系统发育和胶质瘢痕形成中起关键作用，并在CNS损伤后抑制轴突再生。已知的CSPG包括聚集蛋白聚糖(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(CSPG2)、神经蛋白聚糖(CSPG3)、CSPG4(或神经元-神经胶质抗原2(NG2))、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体3的结构维持)、短小蛋白聚糖(CSPG7)、CD44(CSPG8，分化簇44)以及磷酸酶蛋白聚糖神经蛋白聚糖(CSPG3)。Rhodes，K.E.和Fawcett，J.W.(2004)《解剖学杂志(Journal of Anatom.)》204(l)：33-48。因此，术语“降低硫酸软骨素蛋白聚糖的表达”包括降低、抑制、减小一种或多种CSPG的水平，或减小一种或多种CSPG的活性或使其失活。在某些实施例中，该术语包括降低、抑制、减小神经蛋白聚糖、NG2或两者的水平，或减小神经蛋白聚糖、NG2或两者的活性或使其失活。
本文中所用的术语“神经元”包括电可兴奋细胞，所述电可兴奋细胞通过电信号和化学信号处理和传输信息。神经元是CNS的大脑和脊髓以及周围神经系统(PNS)的神经节的主要组成部分，并且可以彼此连接形成神经网络。典型的神经元由细胞体(体细胞)、树突和轴突构成。神经元的体细胞(细胞体)含有细胞核。神经元的树突是具有许多分支的细胞伸展，其中神经元的大部分输入都发生在所述细胞伸展处。轴突是从体细胞延伸的更细的、电缆状的突起，并将神经信号从体细胞和某些类型的信息传送回体细胞。术语“促进神经元的再生”包括刺激、促进、增加或激活神经元的生长，优选在损伤或损害后。
本文中所用的术语“c-fos”包括原癌基因c-fos，其通过刺激神经递质迅速诱导，c-fos存在于包括小鼠和人在内的许多物种中。c-fos基因和蛋白是已知并且表征的。参见Curran，T，c-fos原癌基因，第307-327页(《癌基因手册(The Oncogene Handbook)》，ReddyEP等(编辑)Elsevier)(1988)。c-fos的表达可以通过本领域已知的方法来确定，例如诺瑟杂交(northernblot)、定量PCR或免疫组织化学法。术语“增加c-fos的表达”包括增加c-fosmrna、c-fos蛋白或c-fos蛋白活性的水平。
本文中所用的术语“pERK”包括磷酸化的细胞外信号调节激酶。细胞外信号调节激酶或ERK(包括ERK1和ERK2)是有丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的成员。ERK通过其上游激酶的磷酸化作用激活形成pERK，然后激活下游靶标。ERK参与神经和突触可塑性基础学习，以及记忆和疼痛超敏反应。Ji R.R.等人，《自然神经科学(Nat Neurosci)》(1999)2：1114-1119。ERK基因、蛋白、磷酸化和激活是已知并且表征的，并且可通过本领域已知的方法确定(例如诺瑟杂交、定量PCR或免疫组织化学法)ERK和pERK的表达。参见Gao Y.J.和JiR.R.，《开放疼痛杂志(Open Pain J.)》(2009)2：11-17.术语“增加pERK的表达”包括增加ERK mRNA、ERK蛋白或pERK活性的水平。
本文中所用的术语“GAP43”，也称为“生长相关蛋白43”，是神经组织特异性蛋白，其促进神经突形成、再生和可塑性。Benowitz L.I.和Routtenberg A.(1997)《神经科学趋势(Trends in Neurosciences)》20(2)：84-91；Aarts L.H.等人，(1998)《实验医学和生物学进展(Advances in Experimental Medicine and Biology)》446：85-106。人GAP43由GAP43基因编码。人GAP43多肽序列(UniProt：KB-P17677)和编码该多肽的cDNA序列是本领域已知的。Kosik K.S.等人，(1988)《神经元(Neuron)》1(2)：127—32；Ng S.C.等人，(1988)《神经元(Neuron)》1(2)：133-9。GAP43的表达可以通过本领域已知的方法(例如Northern印迹、定量聚合酶链反应或免疫组织化学)来确定。可以通过本领域已知的方法(例如诺瑟杂交、定量PCR或免疫组织化学法)确定GAP43的表达。术语“增加神经元中GAP43”包括增强或增加GAP43 mRNA、GAP43蛋白的水平，或增加GAP43蛋白的活性。
本文中所用的术语“治疗有效量”是指有效地“治疗”个体的疾病或病症(例如中枢神经系统损害)或降低其风险、潜力、可能性或发生率的药物(其单独或与另一种治疗剂组合)的量。“治疗有效量”包括为患有或处于患有疾病或病症(例如中枢神经系统损害，诸如脑外伤或本文公开的其他疾病)的个体提供某些改善或益位的药物或治疗剂的量。因此，“治疗有效”量是降低疾病或病症的风险、潜力、可能性或发生率，或提供一定程度的缓解、减轻和/或降低至少一种指标(例如反应性神经胶质增生的发作)，和/或减轻疾病或病症的至少一种临床症状的量。
II.抗FAM19A5抗体
本文公开了以特定功能特征或特性表征的抗体，例如单克隆抗体。例如已经通过去除和/或修饰在人类中高度免疫原性的区域或残基(即，脱免疫的)来突变(例如取代或缺失)特异性结合人FAM19A5的抗体。因此，与参照抗体(例如尚未脱免疫的相应抗体，例如3-2或2-13抗体)相比，本文公开的抗体，即抗FAM19A5抗体，当施用于人个体时具有降低的免疫原性。
另外，本文所述的抗体展现出以下功能特性中的一种或多种：
(a)以10nM或更小的KD与可溶性人FAM19A5结合；
(b)以10nM或更小的KD与膜结合的人FAM19A5结合；
(c)减少、逆转、延迟和/或预防反应性神经胶质增生的发作；
(d)抑制反应性星形胶质细胞过度增殖；
(e)降低包括神经蛋白聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)在内的硫酸软骨素蛋白聚糖的表达；
(f)增加c-fos和pERK在神经元核中的表达；
(g)促进神经元的存活。
(h)增加GAP43在神经元中的表达；以及
(i)促进轴突的再生。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体已脱免疫，使得与参照抗体(例如尚未脱免疫的相应抗体，例如抗体3-2或2-13)相比，当施用于人个体时该抗体的免疫原性较低。在一些实施例中，与参照抗体(例如尚未脱免疫的相应抗体，例如抗体3-2或2-13)相比，抗体的免疫原性已经降低了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少月20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些实施例中，脱免疫过程不改变抗体的结合亲和力。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体已经历亲和力成熟，使得与参照抗体(例如未经历亲和力成熟的相应抗体，例如抗体2-13)相比，抗体以更大的亲和力结合FAM19A5蛋白。在某些实施例中，与参照抗体(例如尚未经历亲和力成熟的相应抗体，例如抗体2-13)相比，抗体的结合亲和力已经降低了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些实施例中，亲和力成熟过程不改变抗体的免疫原性。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体已脱免疫并经历了亲和力成熟，使得当与参照抗体(例如未脱免疫或未经历亲和力成熟的相应抗体，例如抗体3-2或2-13)相比时，该抗体不仅在施用于人个体时免疫原性较低，而且以更大的亲和力结合FAMI9A5蛋白。在一些实施例中，与参照抗体相比，抗体的免疫原性已经降低了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些实施例中，与参照抗体相比，抗体的结合亲和力增加了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％或更多。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体以高亲和力(例如以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nMm)或更小、10-10M(0.1nM)或更小、10-11M或更小、或10-12M或更小，例如10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、或10-9M至10-7M，例如10-12M、5×10-12M、10-11M、5×10-11M、10-10M、5×10-10M、10-9M、5×10-9M、10-8M、5×10-8M、10-7M或5×10-7M的KD)与可溶性的人FAM19A5或膜结合的人特异性地结合。评估抗体对不同物种的人FAM19A5的结合能力的标准测定法在本领域中是已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹和RIA。在实施例中详细描述了合适的测定法。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，诸如通过ELISA、BIACORE分析或KinExA来评估。评估抗体对FAM19A5的功能特性(例如配体结合)的影响的测定法在下文和实施例中进一步详细描述。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体以例如通过ELISA所确定的10-7M或更小、10-8M(10nM)或更小、10-9m(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M的KD与可溶性的人FAM19A5结合。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体以如通过ELISA所确定的约1pM、2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、10pM、20pM、30pM、40pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM、900pM、或约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、或9nM、或约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM或90nM的KD与可溶性的人FAM19A5特异性地结合。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体以例如通过ELISA所确定的10-7M或更小、10-8M(10nM)或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M、或10-8M至10-7M的KD与膜结合的人FAM19A5结合。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体以如通过ELISA所确定的约1pM、2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、10pM、20pM、30pM、40pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM、或900pM、或约1nM、2nM、3nmM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、或9nM、或约10nM、20nM、30nmM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM或90nM的KD与膜结合的人FAM19A5结合。
本公开的抗FAM19A5抗体可以延缓或抑制神经胶质增生的发作，例如延缓、减慢或抑制响应于来自例如创伤、脑脊髓损害、脑瘤、感染、局部缺血、中风、自身免疫反应和/或神经退行性疾病的损伤和损害的中枢神经系统(CNS，例如大脑和/或脊髓)中神经胶质细胞的非特异性反应性变化。
本公开的抗FAM19A5抗体可以延缓、阻止、减慢、抑制、遏制或预防反应性星形神经胶质细胞的过度或异常增殖及其对CNS的相关有害作用。例如本公开的抗FAM19A5抗体可以抑制或预防来自例如CNS损害、创伤、损伤、脑脊髓损害、脑瘤、感染、局部缺血、中风、自身免疫反应和/或神经退行性疾病的神经元的破坏引起的星形神经胶质细胞数量异常增加，抑制或预防CNS中形成瘢痕，抑制或减少活性氧物种的神经毒性水平的释放或潜在的兴奋毒性谷氨酸盐的释放，减少或抑制癫痫发作、疼痛和/或CNS损伤后的继发性变性。本公开的抗FAM19A5抗体可以促进、刺激、增加或激活神经元和/或轴突的再生，优选在CNS受到损伤或损害之后。
本公开的抗FAM19A5抗体可抑制包括由蛋白核心和硫酸软骨素(CSGP)构成的蛋白聚糖在内的硫酸软骨素蛋白聚糖的表达，诸如聚集蛋白聚糖(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(CSPG2)、神经蛋白聚糖(CSPG3)、CSPG4(或神经元-神经胶质抗原2(NG2))、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体3的结构维持)、短小蛋白聚糖(CSPG7)、CD44(CSPG8，分化簇44)以及磷酸酶蛋白聚糖神经蛋白聚糖(CSPG3)。在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体抑制、降低或减小神经蛋白聚糖和/或NG2的水平，或神经蛋白聚糖和/或NG2的活性。
本公开的抗FAM19A5抗体可以增加神经元核中c-fos和pERK的表达，例如增加c-fos和pERK的mRNA、蛋白和/或蛋白质活性。本公开的抗FAMI9A5抗体还可增加或增强GAP43mRNA、GAP43蛋白的表达水平或增加或增强GAP43蛋白的活性。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中重链CDR1、CDR2和CDR3包含SEQ ID NO：5、6和7所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列中的每一个任选地包含一个、两个或三个突变，其中轻链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：8、9和10所示的氨基酸序列，其中轻链CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个包含一个、两个、三个、四个或五个突变，并且其中与包含SEQ ID NO：11所示的VH和SEQ IDNO：12所示的VL的参照抗体相比，抗体在人个体中的免疫原性降低。
在一些实施例中，包括在抗体中的突变是取代、缺失和/或插入。在一个实施例中，突变是取代，例如保守取代。本文中所用的“保守取代”(也称为保守替换)是指将给定氨基酸改变为具有相似生化特性(例如电荷、疏水性和大小)的另一氨基酸的氨基酸替换。尽管有许多方法对氨基酸进行分类，但通常根据其结构和其R基团的一般化学特征将其分为六个主要群组。
表2氨基酸类别
相反，自由基替换或自由基取代是将初始氨基酸交换为具有不同物理化学性质的最终氨基酸的氨基酸替换。在某些实施例中，FAM19A5抗体位的氨基酸突变是自由基取代。在其他实施例中，FAM19A5抗体位的氨基酸突变是保守取代和自由基取代的组合。
在一些实施例中，重链CDR3包含SEQ ID NO：7。在某些实施例中，重链CDR3包含SEQID NO：7所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个、两个或三个突变。
在一些实施例中，重链CDR1包含SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列，所述氨基酸序列任选地具有一个或两个突变。在一些实施例中，突变包含SEQ ID NO：5的氨基酸3位的苏氨酸被酸性氨基酸取代。在其他实施例中，突变包含SEQ ID NO：5的氨基酸5位的丝氨酸被酸性氨基酸取代。在一些实施例中，酸性氨基酸包括天冬氨酸或谷氨酸。
在一些实施例中，重链CDR2包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列任选地具有一个、两个、三个、四个或五个突变。在一些实施例中，突变包含SEQ ID NO：6的氨基酸16位的精氨酸被碱性氨基酸取代。在一些实施例中，碱性氨基酸包含赖氨酸。在一些实施例中，突变包含以下一种或多种情况：
(a)SEQ ID NO：6的氨基酸6位的甘氨酸被酸性氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO：6的氨基酸7位的丝氨酸被酸性氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO：6的氨基酸8位的丝氨酸被酸性氨基酸取代；
(d)SEQ ID NO：6的氨基酸9位的甘氨酸被酸性氨基酸；及
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸16位的丝氨酸被碱性氨基酸取代。
在某些实施例中，酸性氨基酸包括天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施例中，碱性氨基酸包含赖氨酸。
在一些实施例中，轻链CDR3包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列任选地具有一个、两个、三个、四个或五个突变。在某些实施例中，突变包括以下一种或多种情况：
(a)SEQ ID NO：10的氨基酸6位的丝氨酸被酸性氨基酸或脂肪族氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO：10的氨基酸7位的天冬酰胺被酸性氨基酸或羟基或含硫/硒的氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO：10的氨基酸8位的甘氨酸被酸性氨基酸或羟基或含硫/硒的氨基酸取代；
(d)SEQ ID NO：10的氨基酸9位的甘氨酸被酸性氨基酸或羟基或含硫/硒的氨基酸取代；及
(e)SEQ ID NO：10的氨基酸10位的异亮氨酸被碱性氨基酸取代。
在一些实施例中，酸性氨基酸包括天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施例中，含羟基或硫/硒的氨基酸包含丝氨酸。在进一步的实施例中，碱性氨基酸包含组氨酸。
在一些实施例中，轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个突变。在某些实施例中，突变包括以下一种或多种情况：
(a)SEQ ID NO：8的氨基酸6位的酪氨酸被酸性氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO：8的氨基酸7位的天冬酰胺被酸性氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO：8的氨基酸8位的甘氨酸被酸性氨基酸取代；及
(d)SEQ ID NO：8的氨基酸9位的丝氨酸被酸性氨基酸取代。
在一些实施例中，酸性氨基酸包括谷氨酸或谷氨酰胺。
在一些实施例中，轻链CDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个突变。在某些实施例中，突变包括以下一种或多种情况：
(a)SEQ ID NO：9的氨基酸1位的谷氨酸被酸性氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO：9的氨基酸2位的丝氨酸被酸性氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO：9的氨基酸3位的天冬酰胺被酸性氨基酸、碱性氨基酸或脂肪族氨基酸取代；及
(d)SEQ ID NO：9的氨基酸4位的丝赖酸被酸性氨基酸或脂肪族氨基酸取代。
在一些实施例中，酸性氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施例中，碱性氨基酸包含组氨酸。在进一步的实施例中，脂肪族氨基酸包括亮氨酸。
在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：9的氨基酸2位的丝氨酸被酸性氨基酸取代。在某些实施例中，酸性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或其组合物。在进一步的实施例中，酸性氨基酸是天冬酰胺。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQID NO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体是人源化的。在其他实施例中，人源化抗FAM19A5包含人抗体的框架区。在某些实施例中，抗FAM19A5抗体包含在抗体的框架区(即VH的FR1、FR2、FR3和FR4和/或VL的FR1、FR2、FR3和FR4)内的一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个)突变。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体在VH的FR1内包含突变。在某些实施例中，突变包含在SEQ ID NO：11的残基19位的氨基酸取代(例如丝氨酸被碱性氨基酸，例如精氨酸取代)和/或残基21位的氨基酸取代(例如缬氨酸被羟基或含硫/硒氨基酸，例如丝氨酸取代)。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含在VH的FR2内的突变。在某些实施例中，突变包含在SEQ ID NO：11的残基49位的氨基酸取代(例如丙氨酸被羟基或含硫/硒的氨基酸，例如丝氨酸取代)。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含在VH的FR3内的突变。在某些实施例中，突变包含在SEQ ID NO：11的残基79位的氨基酸取代(例如缬氨酸被脂肪族氨基酸，例如亮氨酸取代)、80位的氨基酸取代(例如精氨酸被芳香族氨基酸，例如酪氨酸取代)、83位的氨基酸取代(例如亮氨酸被羟基或含硫/硒氨基酸，例如蛋氨酸取代)、85位的氨基酸取代(例如天冬酰胺被羟基或含硫/硒氨基酸，例如丝氨酸取代)、86位的氨基酸取代(例如脯氨酸被脂肪族氨基酸，例如亮氨酸取代)和/或87位的氨基酸取代(例如甘氨酸被碱性氨基酸，例如精氨酸取代)。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体包含在VL的FR2内的突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：12的氨基酸残基39的缺失。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含在VL的FR3内的突变。在一些实施例中，突变包含SEQ ID NO：12的残基81位的氨基酸取代(例如天冬氨酸被脂肪族氨基酸，例如甘氨酸取代)和/或残基85位的氨基酸取代(例如异亮氨酸被酸性氨基酸，例如天冬氨酸取代)。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，并且/或其中VL包含与SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述抗体与包含如SEQ ID NO：11所示的VH和SEQ ID NO：12所示的VL的参照抗体相比降低了免疫原性。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，该参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中：
(a)VH包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；
(b)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；
(c)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；
(d)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；
(e)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；
(f)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；或
(g)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体与作为参照抗体的相同人FAM19A5抗原表位结合，该参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
(a)VH包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；
(b)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；
(c)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；
(d)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；。
(e)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；
(f)VH包含SEQ ID NO：34序列所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；或
(g)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中重链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：16、17和18所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列中的每一个任选地包含一个、两个或三个突变，其中轻链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：30、31和32所示的氨基酸序列，其中轻链CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个包含一个、两个或三个突变，并且其中所述抗体与包含SEQ ID NO：35所示的VH和SEQ ID NO：45所示的VL的参照抗体相比，所述抗体在人和/或结合亲和力更高的人FAM19A5蛋白中的免疫原性降低。
在一些实施例中，重链CDR3包含SEQ ID NO：18。在某些实施例中，重链CDR3包含SEQ ID NO：18所述的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个或两个突变。在一些实施例中，突变包含以下一种或多种情况：(a)SEQ ID NO：18的氨基酸2位的苏氨酸被被羟基或含硫/硒的氨基酸取代；和(b)SEQ ID NO：18的氨基酸4位的谷氨基酸被脂肪族氨基酸取代。在某些实施例中，含羟基或硫/硒的氨基酸包含丝氨酸。在一些实施例中，脂肪族氨基酸包含缬氨酸。在一些实施例中，突变包含以下一种或多种情况：(a)SEQ ID NO：18的氨基酸2位的苏氨酸被酸性氨基酸取代；和(b)SEQ ID NO：18的氨基酸4位的谷氨基酸被脂肪族氨基酸取代。在某些实施例中，酸性氨基酸是天冬酰胺。在某些实施例中，脂肪族氨基酸包含丙氨酸。
在一些实施例中，重链CDR1包含SEQ ID NO：16。在某些实施例中，重链CDR3包含SEQ ID NO：16所述的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个突变。在一些实施例中，突变包含SEQ ID NO：16的氨基酸3位的苏氨酸被酸性氨基酸取代。在某些实施例中，酸性氨基酸包含天冬氨酸。
在一些实施例中，重链CDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，轻链CDR3包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。在某些实施例中，重链CDR3包含SEQ ID NO：31。在一些实施例中，轻链CDR2包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，、所述氨基酸序列具有一个、两个或三个突变。
在进一步的实施例中，轻链CDR包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：30的氨基酸4位的丝氨酸被脂肪族氨基酸取代。在一些实施例中，脂肪族氨基酸包含缬氨酸。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列；(iv)轻链CDR1包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列；(128)轻链CDR1包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；(ii)重链CDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；(iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列；(129)轻链CDR1包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列；(v)轻链CDR2包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；及(vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体是人源化的。在其他实施例中，人源化抗FAM19A5包含人抗体的框架区。在某些实施例中，抗FAM19A5抗体包含在抗体的框架区(即VH的FR1、FR2、FR3和FR4和/或VL的FR1、FR2、FR3和FR4)内的一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个)突变。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含在VH的FR1内的突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：35的残基19处(例如丝氨酸至碱性氨基酸，例如精氨酸)、残基21处(例如缬氨酸至羟基或含硫/硒的氨基酸，例如丝氨酸)和/或残基23处(例如赖氨酸至羟基或含硫/硒的氨基酸，例如丝氨酸)的氨基酸取代。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体包含VH的FR2内的突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：35的残基40处(例如酪氨酸至脂肪族氨基酸，例如丙氨酸)和/或残基49处(例如丙氨酸至含羟基或硫/硒的氨基酸，例如丝氨酸)的氨基酸取代。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体包含VH的FR3内突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：35的残基79处(例如缬氨酸到脂肪族氨基酸，例如亮氨酸)、残基80处(例如精氨酸到芳香族氨基酸，例如酪氨酸)、残基83处(例如亮氨酸到羟基或含硫/硒的氨基酸，例如甲硫氨酸)和/或残基85处(例如天冬酰胺到羟基或含硫/硒的氨基酸，例如丝氨酸)的氨基酸取代。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体包含FR1内的突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：45的残基16位的氨基酸取代(例如缬氨酸被脂肪族氨基酸例如丙氨酸取代)。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体包含在VL的FR2内的突变。在某些实施例中，突变包含SEQ ID NO：45的氨基酸残基34位的缺失。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含在VL的FR3内的突变。在一些实施例中，突变包含SEQ ID NO：45的残基76处(例如天冬氨酸到酸性氨基酸，例如谷氨酸)、残基80处(例如缬氨酸到酸性氨基酸、例如天冬氨酸)和/或残基82处(例如苯丙氨酸到芳族氨基酸、例如酪氨酸)的氨基酸取代。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，和/或其中VL包含与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明的抗FAMI9A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中(i)VH包含SEQ ID NO：36，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；(ii)VH包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；(iii)VH包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列；VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；或(iv)VH包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体作为参照抗体与相同的人FAM19A5表位结合，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中(i)VH包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；(ii)VH包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；(iii)VH包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；或(ii)VH包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列等。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体与参照抗体(例如3-2或2-13抗体)交叉竞争结合(或抑制结合)人FAM19A5表位。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体抑制此类参照抗体(例如3-2或2-13抗体)与人FAM19A5的结合至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。竞争性抗体与相同表位、重叠表位结合或与邻近表位结合(例如如通过位阻证明)。可以使用本领域已知的竞争实验诸如RIA和EIA来确定两种抗体是否彼此竞争与靶标结合。
用于确定两种抗体是否与相同表位结合的技术包括例如表位作图法，诸如提供表位的原子分辨率的对抗原：抗体复合物的晶体进行的x射线分析，和氢/氘交换质谱法(HDX-MS)；监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异结合的方法，其中通常将抗原序列中氨基酸残基的修饰所导致的结合丧失当作表位成分的指示；用于表位作图的计算组合方法。
可用于本文公开的方法的抗FAM19A5抗体可以与成熟人FAM19A5的至少一个表位结合，如通过例如将抗体与人FAM19A5的片段结合所确定的。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体结合至少一个表位，该表位具有氨基酸序列TLDRDSSQPRRTIARQTARC(SEQ ID NO：90或SEQID NO：2的氨基酸残基42至61)，或者与位于SEQ ID NO：90的氨基酸序列内的片段结合，例如具有SEQ ID NO：90的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的表位。在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体与对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基44至52(即DRDSSQPRR)的一个或多个氨基酸结合，例如氨基酸残基45、46、50、51和52(RD-PRR)、例如氨基酸残基45、50、51和52(即R-PRR)、例如氨基酸残基43、50和51(即R-PR)。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体结合至少一个表位，该表位具有氨基酸序列TARCACRKGQIAGTTRARPA(SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：2的氨基酸残基58至77)，或者与位于SEQ ID NO：91的氨基酸序列内的片段结合，例如具有SEQ ID NO：91的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的表位。在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体与对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基63至75(即CRKGQIJATTRAR)的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体结合至少一个表位，该表位具有氨基酸序列ARPACVDARIIKTKQWCDML(SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：2的氨基酸残基74至93)，或者与位于SEQ ID NO：92的氨基酸序列内的片段结合，例如具有SEQ ID NO：92的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的表位。在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体与对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基76至89(即PACVDARIIKTKQW)的一个或多个氨基酸结合。
在一些实施例中，至少一个表位具有与SEQ ID NO：90、91或92至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体或其抗原结合部分仅结合人FAM19A5表位，所述表位为SEQ ID NO：89、90、91、92、93或94，或与位于SEQ ID NO：89、90、91、92、93或94的氨基酸序列内的片段结合，例如具有SEQ ID NO：89、90、91、92、93或94的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的表位。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体与SEQ ID NO：90或其天然构象的片段(即未变性)结合。在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体或其抗原结合部分与糖基化的和未糖基化的人FAM19A5结合。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体结合一个或多个额外的FAM19A5表位。在一些实施例中，一个或多个额外的FAM19A5表位选自QLAAGCEIVLTDR(SEQ ID NO：89，表位F1)，TLDRDSSQPRRTARQTARC(SEQ ID NO：90，表位F2)，TARCACRKGQIAGTTRARPA(SEQ ID NO：91，表位F3)，ARPACVDARIIKTKQW CDML(SEQ ID NO：92，表位F4)，CDMLPCLEGEGCDLLINRSG(SEQ IDNO：93，表位F5)，或NRSGWTCTQPGGRIKTTTVS(SEQ ID NO：94，表位F6)，或位于SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：94或其任意组合的氨基酸序列内的片段。位于SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：94的氨基酸序列中的一个片段，包括具有SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：94的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的表位。在一些实施例中，一个或多个额外的FAM19A5表位选自SEQ ID NO：89、90、91、92、93或94，或位于SEQ ID NO：89、90、91、92、93或94的氨基酸序列内的片段，例如具有SEQ ID NO：89、90、91、92、93或94的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的片段，或其任意组合。在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以其天然构象(即未变性)与一个或多个额外表位中的任何一个结合。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分与一个或多个额外的糖基化和非糖基化FAM19A5表位结合。
在一些实施例中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其以比FAM19A家族中另一蛋白高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的亲和力与FAM19A5(例如人FAM19A5)结合，如通过例如免疫测定法(例如ELISA)、表面等离子共振或平衡弃除免疫测量法所测量。在某些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合片段与FAM19A5(例如人FAM19A5)结合，而与FAM19A家族中的另一蛋白没有交叉反应性，如通过例如免疫测定法所测量。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体不是天然抗体或不是天然存在的抗体。例如在一些实施例中，抗FAM19A5抗体具有与天然存在的抗体不同的翻译后修饰，诸如通过具有更多、更少或不同类型的翻译后修饰。
本公开的示例性抗体的VH和VL CDR的氨基酸序列分别在表3和表4中提供。表3和表4分别提供了本公开的示例性抗体的VH和VL CDR的氨基酸序列。表5和6分别提供了VH和VL氨基酸序列。
表3可变重链CDR氨基酸序列(使用IMGT鉴定)
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表4可变轻链CDR氨基酸序列(使用IMGT鉴定)
表5：可变重链氨基酸序列
表6：可变轻链氨基酸序列
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在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：23的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：38的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：33，并且/或VL包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：39的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列，和/或VL包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：41的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列，和/或VL包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：40的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列，和/或VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：42的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列，和/或VL包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：43的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列，并且/或VL包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：44的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列，并且/或VL包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：36的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：46的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：36所示的氨基酸序列，并且/或VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列46.
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：37的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：46的轻链CDR1、CDR2和CDR3在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：37所示的氨基酸序列，并且/或VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：130的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：46的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQID NO：37所示的氨基酸序列，并且/或VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：131的重链CDR1、CDR2和CDR3，和/或轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO：46的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体包含VH和VL，其中VH包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，并且/或VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含VH和VL，其中VH包含与SEQ ID NO：33、34、36、37、130或131所示的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体包含VH和VL，其中VL包含与SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44或46所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体包含VH和VL，其中：
(a)VH包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；
(b)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；
(c)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；
(d)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；。
(e)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；
(f)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；
(g)VH包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
(h)VH包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；
(i)VH包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；
(j)VH包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；或
(k)VH包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列等
本文所述的VH结构域或其一个或多个CDR可以连接到用于形成重链的恒定结构域，例如全长重链。类似地，本文所述的VL结构域或其一个或多个CDR可以连接到用于形成轻链的恒定结构域，例如全长轻链。全长重链和全长轻链结合形成全长抗体。
因此，在特定实施例中，本文提供了包含抗体轻链和重链，例如分开的轻链和重链的抗体。关于轻链，在具体实施例中，本文所述抗体的轻链是κ轻链。在另一具体实施例中，本文所述抗体的轻链是λ轻链。在又另一具体实施例中，本文所述抗体的轻链是人κ轻链或人λ轻链。在特定实施例中，与FAM19A5多肽(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体包含轻链，该轻链包含本文所述的任何VL或VL CDR氨基酸序列，并且其中该轻链的恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。在特定实施例中，与FAM19A5多肽(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体包含轻链，该轻链包含本文所述的VL或VL CDR氨基酸序列，并且其中该轻链的恒定区包含人λ轻链恒定区的氨基酸序列。人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中进行了描述，例如参见美国专利第5,693,780号和Kabat EA等人，(1991)同上。
关于重链，在一些实施例中，本文所述抗体的重链可以是alpha(a)，delta(6)，epsilon(a)，gamma(y)或mu(p)重链。在另一具体实施例中，所述抗体的重链可以包含人alpha(a)，delta(6)，epsilon(a)，gamma(y)或mu(p)重链。在一个实施例中，与FAM19A5(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体包含重链，该重链包含本文所述的VH或VHCDR氨基酸序列，并且其中该重链的恒定区包含人gamma(γ)重链恒定区的氨基酸序列。在另一实施例中，与FAM19A5(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体包含重链，该重链包含本文公开的VH或VH CDR氨基酸序列，并且其中该重链的恒定区包含本文所述或本领域已知的人重链的氨基酸。人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中进行了描述，例如参见美国专利第5,693,780号和Kabat EA等人，(1991)同上。
在一些实施例中，与FAM19A5(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体包含有包含本文所述的VH或VH CDR和VL和VL CDR的VL结构域和VH结构域，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在另一具体实施例中，与FAM19A5(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体包含有包含本文所述的任何氨基酸序列的VL结构域和VH结构域，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的恒定区的氨基酸序列。在一些实施例中，恒定区包含天然存在的人IgG的恒定区的氨基酸序列，该人IgG包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)和同种异型(例如G1m、G2m、G3m和nG4m)及其变体。参见例如Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5：520(于2014年10月20日在线发布)以及Jefferis R.和Lefranc MP，《单克隆抗体(mAbs)》1：4,1-7(2009)。在一些实施例中，恒定区包含人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的恒定区的氨基酸序列。
在某些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体不具有Fc效应子功能，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。效应子功能由Fc区介导，并且在Fc区的CH2结构域中最接近铰链区的残基负责抗体的效应子功能，因为其在先天免疫系统的效应子细胞上含C1q(补体)和IgG-Fc受体(FcγR)的高度重叠结合位点。此外，IgG2和IgG4抗体的Fc效应子功能水平低于IGg 1和IgG3抗体。抗体的效应子功能可以通过本领域已知的不同方法减少或避免，包括(1)使用缺少Fc区的抗体片段(例如诸如Fab、F(ab')2、单链Fv(scFv)或由单体VH或VL结构域组成的sdAb)；(2)产生非糖基化抗体，其可以通过例如缺失或改变糖所附着的残基，酶促去除糖，在糖基化抑制剂存在下培养的细胞中产生抗体，或通过在无法使蛋白糖基化的细胞(例如细菌宿主细胞，参见例如美国公开第20120100140)中表达抗体来产生；(3)采用来自IgG亚类的具有减少效应子功能的Fc区(例如来自IgG2或IgG4抗体的Fc区或包含来自IgG2或IgG4抗体的CH2结构域的嵌合Fc区，参见例如美国公开第20120100140号和Lau C.等人，免疫学.191：4769-4777(2013))；以及(4)产生具有导致Fc功能减少或没有Fc功能的突变的Fc区。参见例如美国公开第20120100140号和其中引用的美国和PCT申请以及An等人，《单克隆抗体(mAbs)》1：6,572-579(2009)。
因此，在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体是由单体VH或VL结构域组成的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)或sdAb。这种抗体片段在本领域是众所周知的，并在上文中进行了描述。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体是单链Fv。下表7提供了示例性抗FAM19A5单链抗体的氨基酸序列。
表7：抗FAM19A5单链抗体的氨基酸序列
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在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体包含具有减少的或没有Fc效应子功能的Fc区。在一些实施例中，恒定区包含人IgG2或IgG4的Fc区的氨基酸序列。。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体是IgG2/IgG4同种型的。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包含有：包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域的嵌合Fc区；包含来自IgG2的铰链区和来自IgG4的CH2区的嵌合Fc区；或具有导致Fc功能减少或没有Fc功能的突变的Fc区。具有减少或没有Fc效应子功能的Fc区包括本领域已知的那些。参见例如Lau C.等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》191：4769-4777(2013)；An等人，《单克隆抗体(mAbs)》1：6，572-579(2009)；和美国专利第20120100140号以及其中引用的美国专利和出版物以及PCT出版物。本领域普通技术人员还可以容易地制备具有减少的或没有Fc效应子功能的Fc区。
III.核酸分子
本文所述的另一方面涉及编码本文所述的抗体中的任何一种的一个或多个核酸分子。核酸可以以完整细胞、以细胞裂解物或以部分纯化或基本纯的形式存在。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如本质上与分离的DNA连接的染色体DNA)或蛋白纯化后，核酸是“分离的”或“变得基本上纯的”，该标准技术包括碱/SDS处理、CsCl密度梯度离心法(CsCl banding)、柱色谱、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域众所周知的技术。参见F.Ausu bel等人，(1 987)《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》，Greene Publishing和WileyInterscience，New York。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以或可以不含有内含子序列。在某些实施例中，核酸是cDNA分子。
本文描述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码抗体的核酸。
本文描述的某些核酸分子是编码本公开的各种抗FAMI9A5抗体的VH和VL序列的那些核算分子。表8和9分别显示了编码这种抗体的VH和VL序列的示例性DNA序列。
表8：可变重链多核苷酸序列
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表9：可变轻链多核苷酸序列
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本文公开的制备抗FAMI9A5抗体的方法可以包含在包含具有信号肽的编码重链和轻链的核苷酸序列的细胞系中表达重链和轻链。本文包括包含这些核苷酸序列的宿主细胞。
一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或单链抗体基因。在这些操纵中，将编码VL或VH的DNA片段与编码另一蛋白(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。如上下文中所用，术语“可操作地连接”是指将两个DNA片段连接在一起，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见Kabat，E.A.等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第五版，美国卫生与公共服务部，NIH公开第91-3242号)并且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG2和/或IgG 4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子可操作地连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见Kabat，E.A.等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第五版，美国卫生与公共服务部，NIH公开第91-3242号)并且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接到另一编码柔性接头的片段，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人，(1988)《科学(Science)》242：423-426；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)《自然(Nature)》348：552-554)。表7提供了示例性抗FAM19A5 scFv的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开提供了包含分离的核酸分子的载体，该分离的核酸分子包含编码抗体的核苷酸序列。在其他实施例中，载体可用于基因治疗。
用于本公开的合适载体包括表达载体、病毒载体和质粒载体。在一个实施例中，载体是病毒载体。
本文中所用的表达载体是指任何核酸构建体，该核酸构建体含有插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件，或者在RNA病毒载体的情况下，当引入到合适的宿主细胞中时含有复制和翻译所必需的元件。表达载体可以包括质粒、噬菌粒、病毒及其源自物。
本公开的表达载体可以包括编码本文所述的抗体。在一个实施例中，抗体的编码序列与表达控制序列可操作地连接。本文中所用的当两个核酸序列以允许每个组分核酸序列保留其功能性的方式共价连接时，它们被可操作地连接。当将编码序列和基因表达控制序列以使编码序列的表达或转录和/或翻译置于基因表达控制序列的影响或控制下的方式共价连接时，它们被称为可操作地连接。如果在5'基因表达序列中诱导启动子导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接本质没有(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录本翻译成蛋白的能力，则两个DNA序列被称为可操作地连接。因此，如果基因表达序列能够实现编码核酸序列的转录，使得所得到的转录本翻译成所需抗体，则该基因表达序列将可操作地连接到该编码核酸序列。
病毒载体包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，诸如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；慢病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；以及RNA病毒，诸如逆转录病毒。人们可以容易地使用本领域众所周知的其他载体。某些病毒载体基于非细胞性真核病毒，其中非必需基因已被感兴趣的基因替换。非细胞病性病毒包括逆转录病毒，该逆转录病毒的生命周期包括将基因组病毒RNA逆转录成DNA，然后将原病毒整合到宿主细胞DNA中。已批准逆转录病毒用于人类基因治疗试验。最有用的是那些复制缺陷的逆转录病毒(即能够指导所需蛋白的合成，但不能制造感染性颗粒)。此类遗传改变的逆转录病毒表达载体的一般用途是体内基因的高效转导。在Kriegler,M.，《基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual)》，W.H.Freeman Co.,New York(1990)和《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》，第7期，Humana Press出版社，Cliffton,N.J.(1991)中提供了产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括将外源遗传物质并入到质粒中，用质粒转染包装细胞系，通过包装细胞系产生重组逆转录病毒，从组织培养基中收集病毒颗粒，以及用病毒颗粒感染靶细胞等步骤)。
在一个实施例中，病毒是腺相关病毒——一种双链DNA病毒。可以将腺相关病毒改造为复制缺陷型，并能够感染一系列细胞类型和物种。它还具有其他优点，诸如热和脂质溶剂稳定性；包括造血细胞在内的多种谱系细胞的高转导频率；以及没有重复感染抑制作用，因此可以进行多个系列的转导。据报道，腺相关病毒可以以位点特异性的方式整合到人细胞DNA中，从而使插入诱变的可能性和逆转录病毒感染的插入基因表达特征的可变性最小。此外，在没有选择性压力的情况下，野生型腺相关病毒感染已经在组织培养中被跟踪超过100代，这意味着腺相关病毒基因组整合是一个相对稳定的事件。另外，在没有选择压力的情况下，在组织培养中对野生型腺相关病毒感染进行多于100次的传代，这意味着腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒也可以以染色体外的方式发挥作用。
在其他实施例中，载体源自慢病毒。在某些实施例中，载体是一种能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的载体。
慢病毒基因组和前病毒DNA通常具有逆转录病毒中发现的三个基因：gag、pol和env，其两侧是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有附加的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV)。
与5'LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效衣壳化为颗粒(Psi位点)所必需的序列。如果病毒基因组中缺失衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒体)所需的序列，则顺式缺陷会阻止基因组RNA的衣壳化。
但是，所得到的突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白的合成。本公开提供了一种产生能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的方法，该方法包含用两种或多种携带包装功能的载体，即gag、pol和env以及rev和tat转染合适的宿主细胞。如下文将公开的，缺少功能性tat基因的载体对于某些应用是需要的。因此，例如第一载体可以提供编码病毒gag和病毒pol的核酸，而另一载体可以提供编码病毒env的核酸以产生包装细胞。将提供异源基因的载体(本文中称为转移载体)引入包装细胞，产生释放携带目的外源基因的感染性病毒颗粒的生产细胞。
根据上述载体和外源基因的配置，第二载体可以提供编码病毒包膜(env)基因的核酸。env基因几乎可以源自任何合适的病毒，包括逆转录病毒。在一些实施例中，包膜蛋白是两性包膜蛋白，其允许转导人和其他物种的细胞。
逆转录病毒源自的env基因的例子包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。也可以使用其他env基因，诸如水泡性口炎病毒(VSV)蛋白G(VSV G)、肝炎病毒基因和流感病毒基因。
提供病毒env核酸序列的载体与本文别处所述的调控序列可操作地相关。
在某些实施例中，载体包括慢病毒载体，其中HIV毒力基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，而不损害载体转导非分裂细胞的能力。
在一些实施例中，载体包括慢病毒载体，所述慢病毒载体包含3'LTR的U3区的缺失。U3区的缺失可以是完全缺失或部分缺失。
在一些实施例中，包含本文所述的FVIII核苷酸序列的本公开的慢病毒载体可以用(a)包含gag、pol或gag和pol基因的第一核苷酸序列和(b)包含异源env基因的第二核苷酸序列在细胞中转染；其中慢病毒载体缺少功能性tat基因。在其他实施例中，进一步用包含rev基因的第四核苷酸序列转染细胞。在某些实施例中，慢病毒载体缺少选自vif、vpr、vpu、vpx和nef或其组合的功能基因。
在某些实施例中，慢病毒载体包含一个或多个编码gag蛋白、Rev应答元件、中央聚嘌呤序列(cPPT)或其任何组合的核苷酸序列。
在WO9931251、W09712622、W09817815、W09817816和WO9818934中公开了慢病毒载体的实例，其通过引用整体并入本文。
其他载体包括质粒载体。质粒载体已在本领域中进行了广泛描述，并且是本领域技术人员众所周知的。参见Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，第二版，冷泉港实验室出版社，1989年。最近几年的研究发现，由于质粒载体无法在宿主基因组中复制并整合到宿主基因组中，因此质粒载体特别有利于基因向细胞体内递送。然而，这些质粒具有与宿主细胞相容的启动子，可以表达来自质粒内可操作编码的基因的肽。一些常用质粒可从商业供应商处获得，包括pBR322、pUC18、pUC19、各种pcDNA质粒、pRC/CMV、各种pCMV质粒、pSV40和pBlueScript。特异性质粒的附加的实例包括pcDNA3.1，目录号V79020；和pcDNA3.1/hygro，目录号V87020；pcDNA4/myc-His，目录号V86320；以及pBudCE4.1，目录号V53220，它们全都来自英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。本领域普通技术人员对其他质粒已经非常熟悉。另外，质粒可以使用标准分子生物学技术进行定制设计，以去除和/或添加DNA的特异性片段。
IV.抗体生产
通过本领域已知的抗体合成方法，可以生产与FAM19A5(例如人FAM19A5)免疫特异性结合的抗体或其片段，例如通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有说明，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内的相关领域中的常规技术。例如本文引用的参考文献对这些技术作出了描述，并且在文献中对其进行了充分说明。参见例如Maniatis T等人,(1982)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)》，第二版，冷泉港实验室出版社；Sambrook J等人,(1989)，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第二版，冷泉港实验室出版社；Sambrook J等人,(2001)分子克隆：实验室手册，第二版，位于美国纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社；Ausubel FM等人，《分子生物学最新方案(Current Protocols in MolecularBiology)》，约翰威立父子出版集团(John Wiley&Sons)(1987年以及年度更新版)；《分子生物学最新方案(Current Protocols in MolecularBiology)》，约翰威立父子出版集团(John Wiley&Sons)(1987年以及年度更新版)Gait(编辑)(1984)，《寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach)》，IRL出版社；Eckstein(编辑)(1991)，《寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach)》，IRL出版社；Birren B等人,(编辑.)(1999)《基因组分析：实验室手册(GenomeAnalysis：A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社。
在具体实施例中，本文所述的抗体是通过任何涉及例如经由合成、DNA序列的遗传工程产生的方法制备、表达、产生或分离的抗体(例如重组抗体)。在某些实施例中，此类抗体包含在体内非天然存在于动物或哺乳动物(例如人)的抗体种系库中的序列(例如DNA序列或氨基酸序列)。在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体已脱免疫。
如实例(例如实例2)中所述，最初通过用合成的FAM19A5肽对鸡进行免疫产生抗FAM19A5抗体。因此，为了最小化施用于人个体时的免疫原性风险，抗FAM19A5抗体(例如3-2和2-13)已经被修饰以更类似于人抗体的免疫原性序列。在一些实施例中，与其尚未脱免疫的相应的对应抗体相比，本文公开的脱免疫的抗FAM19A5抗体与人FAM19A5具有相似的结合亲和力。在一些实施例中，本文公开的抗FAMI9A5抗体也经历了亲和成熟过程。使抗体脱免疫的方法在本文中公开并且也是本领域已知的。
在某一方面，本文提供了制备与FAM19A5(例如人FAM19A5)免疫特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包含培养本文所述的细胞或宿主细胞。在某一方面，本文提供了制备与FAM19A5(例如人FAM19A5)免疫特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包含使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如重组表达)抗体或其抗原结合片段。在特定实施例中，细胞是分离的细胞。在特定实施例中，已将外源多核苷酸引入细胞中。在一个特定的实施例中，该方法进一步包含纯化从细胞或宿主细胞获得的抗体或其抗原结合片段的步骤。
产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如《分子生物学简短方案(ShortProtocols in Molecular Biology)》第11章，(2002)第五版，Ausubel FM等人，约翰威立父子出版集团(John Wiley&Sons)，纽约)。
可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如可以使用杂交瘤技术来产生单克隆抗体，该杂交瘤技术是本领域已知的，如下文文献所述：参见Harlow和Lane，《抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(1988)；Hammerling等人，《单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)》563 681(位于纽约的爱思唯尔出版社，1981年)。本文中所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如单克隆抗体可以由外源表达本文所述抗体或其片段，例如此类抗体的轻链和/或重链的宿主细胞重组产生。
在特定实施例中，本文中所用的“单克隆抗体”是由单细胞(例如产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中该抗体与FAM19A5(例如人FAM19A5)免疫特异性结合，如例如通过ELISA，或本领域已知的或本文提供的实例中的其他抗原结合或竞争性结合所测定的。在特定的实施例中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施例中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如二价)抗体。在特定实施例中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。本文所述的单克隆抗体可以例如通过如Kohler G&Milstein C(1975)《自然(Natural)》256：495中所述的杂交瘤方法制备，或者可以例如使用本文所述的技术从噬菌体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域众所周知的(参见例如《分子生物学简短方案(Short Protocols in MolecularBiology)》第11章，(2002)第五版，Ausubel FM等人，同上)。
使用杂交瘤技术生产和筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。例如在杂交瘤方法中，对小鼠或其他合适的宿主动物，诸如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或猕猴进行免疫，以诱导产生或能够产生将与用于免疫的蛋白(例如人FAM19A5)特异性结合的抗体的淋巴细胞。
也可以在体外对淋巴细胞进行免疫。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding JW(编辑),《单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)》，第59-103页(学术出版社，1986年))。另外，可以使用多位点重复免疫(RIMMS)技术来对动物进行免疫(Kilpatrick KE等人，(1997)《杂交瘤(Hybridoma)》16：381-9，其通过引用整体并入本文)。
在一些实施例中，可以用抗原(例如FAM19A5，诸如人FAM19A5)对小鼠(或其他动物，诸如鸡、大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)进行免疫，并且一旦检查到免疫反应，例如在小鼠血清中检测到对抗原具有特异性的抗体，则收集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后，通过众所周知的技术，将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞，例如可从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)的细胞系SP20获得的细胞，以形成杂交瘤。选择杂交瘤并通过有限稀释克隆。在某些实施例中，收获免疫小鼠的淋巴结并将其与NSO骨髓瘤细胞融合。
将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并在其中生长，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如如果亲代骨髓瘤细胞缺少酶——次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
具体实施例采用骨髓瘤细胞，该骨髓瘤细胞有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定地高水平产生抗体，并且对诸如HAT培养基等的培养基敏感。在这些骨髓瘤细胞系中，有鼠骨髓瘤系，诸如NSO细胞系，或源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些(可从索尔克研究所细胞分布中心获得，San Diego，CA，USA)，以及SP-2或X63-Ag8.653细胞(可从美国典型培养物保藏中心获得，Rockville，MD，USA)。下述文件已经针对人单克隆抗体的产生，对人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系进行了描述：(Kozbor D(1984)，《免疫学杂志(J Immunol)》133：3001-5；Brodeur等人，《单克隆抗体生产技术与应用(Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications)》，第51-63页(Marcel Dekker,Inc出版社，纽约，1987年))。
针对抗FAM19A5(例如人FAM19A5)的单克隆抗体的产生，测定了生长杂交瘤细胞的培养基。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本领域已知的方法，例如免疫沉淀法来确定，或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。
在鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序将克隆亚克隆，并通过标准方法生长(Goding JW(编辑)，《单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)》，同上)。适合此目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI 1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如琼脂糖凝胶蛋白A(proteinA-Sepharose)、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，适当地将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。
本文所述的抗体包括识别特异性FAM19A5(例如人FAM19A5)的抗体片段，并且可以通过本领域技术人员已知的任何技术来产生。例如本文所述的Fab和F(ab')2片段可以通过使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)等的酶，通过蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生。Fab片段对应于抗体分子的两个相同臂中的一个，并且含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。A F(ab’)2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。
进一步地，还可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法来产生本文所述的抗体或其抗原结合片段。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在带有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别是，从动物cDNA文库(例如人或非人如受影响组织的鼠或鸡cDNA文库)中扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。通过PCR，将编码VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起，并克隆到噬菌粒载体中。载体在大肠杆菌中电穿孔，并且大肠杆菌感染辅助噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是包括fd和M13的丝状噬菌体，并且VH和VL结构域通常重组融合到噬菌体基因III或基因VIII。可以使用抗原，例如使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠子的抗原，选择或鉴定表达与特定抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体。可用于制备本文所述抗体的噬菌体展示方法的实例包括在下列文献中描述的实例：Brinkman U等人,(1995)《免疫法(J Immunol Methods)》182：41-50；Ames RS等人,(1995)《免疫法(J Immunol Methods)》184：177-186；
Kettleborough CA等人,(1994)《欧洲免疫学杂志(EurJ Immunol)》24：952-958；Persic L等人,(1997)《基因(Gene)》187：9-18；Burton DR&Barbas CF(1994)《高级免疫学(Advan Immunol)》57：191-280；PCT申请第PCT/GB91/001134号；国际公开第WO 90/02809号、第WO 91/10737号、第WO 92/01047号、第WO 92/18619号、第WO 93/1 1236号、第WO 95/15982号、第WO 95/20401号和第WO 97/13844号；以及美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段在内的完整的抗体，并且在包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌在内的任何所需的宿主中表达，例如如下所述。重组产生抗体片段如Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也可以使用本领域已知的方法，如在PCT公开第WO 92/22324号中公开的那些来使用；Mullinax RL等人,(1992)《生物技术(BioTechniques)》12(6)：864-9；Sawai H等人，(1995)《美国生子免疫学杂志(Am J ReprodImmunol)》34：26-34；以及Better M等人,(1988)《科学(Science)》240：1041-1043。
一方面，为了产生完整的抗体，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护限制位点的侧翼序列的PCR引物，从例如scFv克隆的模板扩增VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可将PCR扩增的VH结构域克隆到表达VH恒定区的载体中，并将PCR扩增的VL结构域克隆到表达VL恒定区的载体中，例如人κ或λ恒定区。也可以将VH和VL结构域克隆到一个表达必需恒定区的载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，以产生表达全长抗体例如IgG的稳定或瞬时细胞系。
嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分源自不同的免疫球蛋白分子。例如嵌合抗体可以包含非人动物(例如小鼠、大鼠或鸡)单克隆抗体的可变区，该抗体与人抗体的恒定区融合。例如嵌合抗体可含有与人抗体恒定区融合的非人动物(例如小鼠、大鼠或鸡)单克隆抗体的可变区。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison SL(1985)《科学(Science)》229：1202-7；Oi VT&Morrison SL(1986)《生物技术(BioTechniques)》4：214-221；Gillies SD等人，(1989)《免疫法(J Immunol Methods)》125：191-202以及美国专利第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397和第6,331,415号。
人源化抗体能够与预定抗原结合，并且包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白(例如鼠或鸡免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在特定实施例中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，该恒定区通常是人免疫球蛋白的恒定区。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自任何类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用本领域已知的多种技术生产人源化抗体，包括但不限于CDR移植(欧洲专利第239400号；国际公开第WO91/09967号；和美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)、镶面或表面重塑(欧洲专利第592106号和第519596号；padLAN EA(1991)《分子免疫学(Mol.Immunol.)》28(4/5)：489-498；Studnicka GM等人，(1994)《蛋白质工程(Prot Engineering)》7(6)：805-814；和Roguska MA等人，(1994《美国科学院院报》(Proceedings of the National Academy of Sciences)91：969-973)、链改组(美国专利第5,565,332号)和以下中公开的技术：美国专利第6,407,213号。第5,766,886号，国际公开第WO93/17105号；Tan P等人，(2002)《免疫学杂志(J.Immunol.)》169：1119-25；CaldasC等人，(2000)《蛋白质工程(Prot Engineering)》13(5)：353-60；Morea V等人，(2000)《方法(Methods)》20(3)：267-79；Baca M等人，(1997)《生物化学杂志(J Biol Chem)》272(16)：10678-84；Roguska MA等人，(1996)《蛋白质工程(Prot Engineering)》9(\Q>y.895 904；Couto JR等人，(1995)《癌症研究(Cancer Res)》55(23Supp)：5973s-5977s；Couto JR等人，(1995)《癌症研究(Cancer Res)》55(8)：1717-22；Sandhu JS(1994)《基因(Gene)》150(2)：409-10和Pedersen JT等人，(1994)《分子生物学杂志(J Mol Biol)》235(3)：959-73。此外，亦请参见美国申请公开第US2005/0042664A1号(2005年2月24日)，其通过引用整体并入本文。
已经描述了制备多特异性(例如双特异性抗体)的方法，参见例如美国专利第7,951,917号；第7,183,076号；第8,227,577号；第5,837,242号；第5,989,830号；第5,869,620号；第6,132,992号和第8,586,713号。
单结构域抗体，例如缺乏轻链的抗体，可以通过本领域众所周知的方法产生。参见Riechmann L&Muyldermans S(1999)《免疫学(J Immunol)》231：25-38；Nuttall SD等人，(2000)《当前医药生物科技(当前医药生物科技)》1(3)：253-263；Muyldermans S，(2001)《生物科技(J Biotechnol)》74(4)：277-302；美国专利第6,005,079号；和国际公开第WO94/04678号、第WO 94/25591号和第WO 01/44301号。
进一步地，可以使用本领域技术人员众所周知的技术，将与FAM19A5抗原免疫特异性结合的抗体依次用于产生“模拟”抗原的抗独特型抗体。(例如参见，Greenspan NS&BonaCA(1989)《美国实验生物学学会联合会(FASEB)》J 7(5)：437-444；和Nissinoff A(1991)《免疫学杂志(J Immunol)》147(8)：2429-2438)。
在特定实施例中，本文所述的抗体是人抗体或其抗原结合片段，其与本文所述的抗FAM19A5抗体结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的相同表位。在特定实施例中，与本文所述的抗FAM19A5抗体一样结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的相同表位的本文所述的抗体是人抗体或其抗原结合片段。在特定实施例中，竞争性地阻断(例如以剂量依赖性方式)本文所述的抗体(例如1-65)与FAM19A5(例如人FAM19A5)结合的本文所述的抗体是人抗体或或其抗原结合片段。
可以使用本领域已知的任何方法生产人抗体。例如可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。特别是，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。特别是，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。除人重链和轻链基因外，也可将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。可以通过同源重组单独地，或与引入人免疫球蛋白基因座同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能。特别是，JH区的纯合缺失防止内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后，繁殖嵌合小鼠，以产生表达人抗体的纯合后代。用选择的抗原，例如全部或部分抗原(例如FAM19A5)以正常方式对转基因小鼠进行免疫。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关产生人抗体的这种技术的概述，参见Lonberg N&Hussar D(1995)《国际电工评论(IREE)》13：65-93。有关这种产生人抗体和人单克隆抗体的技术以及产生此类抗体的方案的详细讨论，参见例如国际公开第WO 98/24893号、第WO 96/34096号和第WO96/33735号；和美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号和第5,939,598号。能够产生人抗体的小鼠的实例包括XENOMOUSETM(Abgenix，Inc美国专利第6,075,181号和第6,150,184号)，HUAB-MOUSETM(Mederex，Inc./Gen Pharma；美国专利第5，545，806号和第5，569，825号)、TRANS CHROMO MOUSETM(Kirin),和KM MOUSETM(Medarex/Kirin)。
可通过包括上述噬菌体展示方法在内的本领域中已知的多种方法，使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库制备与FAM19A5(例如人FAM19A5)特异性结合的人抗体。另见美国专利第4,444,887号、第4,716,111号和第5,885,793号；和国际公开第WO 98/46645号、第WO98/50433号、第WO 98/24893号、第WO 98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号和第WO 91/10741号。
在一些实施例中，可以使用小鼠-人杂交瘤产生人抗体。例如可以将用爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生分泌人单克隆抗体的小鼠人杂交瘤，并且可以筛选这些小鼠人杂交瘤，以确定分泌与靶抗原(例如FAM19A5，诸如人FAM19A5)免疫特异性结合的人单克隆抗体的杂交瘤。这种方法是已知的，并且在本领域中进行了描述，参见例如Shinmoto H等人，(2004)《细胞技术学(Cytotechnology)》46：19-23；Naganawa Y等人，(2005)《人抗体(Human Antibodies)》14：27-31。
V.工程化抗体的方法
如上所述，本文公开的具有VH和VL序列的抗FAMI9A5抗体可用于通过修饰VH和/或VL序列或与其相连的恒定区，产生新的抗FAMI9A5抗体。因此，在本文所述的另一方面，本文所述的抗FAM19A5抗体的结构特征用于产生结构上相关的抗FAM19A5抗体，该结构上相关的抗FAM19A5抗体保留本文所述抗体的至少一种功能特性，诸如与人FAM19A5的结合。例如用于工程化方法的起始材料是本文提供的VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不需要实际制备(即，以蛋白形式表达)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，序列所含的信息用作起始材料，以产生源自原始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并以蛋白表达。
因此，本文提供了制备抗FAM19A5抗体的方法，包括：
(a)提供：(i)重链可变区序列，其包含如表3所示的CDR1、CDR2和/或CDR3序列，或如表5所示的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3序列；和(ii)轻链可变区序列，其包含如表4所示的CDR1、CDR2和/或CDR3序列，或如表6所示的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3序列；
(b)改变重链可变区序列和/或轻链可变区序列内的至少一个氨基酸残基，以产生至少一个改变的抗体序列；以及
(c)以蛋白表达改变的抗体序列。
可以使用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。
在一些实施例中，由改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述的抗FAM19A5抗体的一种、一些或全部功能特性的抗体，该特性包括：
(1)在人个体中的免疫原性降低；
(2)如通过Biacore所测定的，以10nM或更小的KD(例如0.01nM至10nM)与可溶性人FAM19A5结合；
(3)如通过ELISA所测定的，以10nM或更小的KD(例如0.01nM至1nM)与膜结合的FAM19A5结合；
(4)如通过ELISA所测定的，以1nM或更小的EC50(例如0.01nM至1nM)与膜结合的FAM19A5结合；
(5)减少、逆转、延缓和/或预防反应性神经胶质增生的发作；
(6)抑制反应性星形胶质细胞过度增殖；
(7)降低包括神经蛋白聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)在内的硫酸软骨素蛋白聚糖的表达；
(8)增加c-fos和pERK在神经元核中的表达；
(9)促进神经元的存活；
(10)增加GAP43在神经元中的表达；
(11)促进轴突的再生；以及
(12)用本文公开的抗FAM19A5抗体在一个方向或两个方向上竞争与人FAM19A5的结合。
改变的抗体可以展现出上述(1)至(12)所列功能特性中的一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种、六种或多种、七种或多种、八种或多种、九种或多种、十种或多种、十一种或全部。可以使用本领域可用的和/或本文所述的标准测定法，例如实施例中所述的那些测定法(例如ELISA、FACS)来评估经改变的抗体的功能性质。
在本文所述的工程化抗体方法的某些实施例中，可以沿着抗FAM19A5抗体编码序列的全部或部分随机或选择性地引入突变，并且可以针对结合活性和/或其他功能特性筛选所得到的修饰的抗FAM19A5抗体，如本文所述。突变方法已在现有领域中进行过描述。例如Short的PCT公开第WO 02/092780号描述了使用饱和诱变、合成连接组装或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等人的PCT公开第WO 03/074679号描述了使用计算筛选方法优化抗体的理化性质的方法。
VI.细胞和载体
在某些方面，本文提供了表达(例如重组地)与FAM19A5(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体(或其抗原结合片段)的细胞(例如宿主细胞)，以及相关的多核苷酸和表达载体。本文提供了包含多核苷酸的载体(例如表达载体)，所述多核苷酸包含编码抗FAM19A5抗体的核苷酸序列或用于在宿主细胞例如哺乳动物细胞中重组表达的片段。本文还提供了包含此类载体的宿主细胞，用于重组表达本文所述的抗FAM19A5抗体(例如人或人源化抗体)。在特定方面，本文提供了产生本文所述抗体的方法，包括从宿主细胞表达此类抗体。
与FAM19A5(例如人FAM19A5)特异性结合的本文所述的抗体(例如全长抗体、抗体的重链和/或轻链或本文所述的单链抗体)的重组表达涉及表达载体的构建，该表达载体含有编码抗体的多核苷酸。一旦已经获得了编码本文所述的抗体分子、抗体的重链和/或轻链或其片段(例如重链和/或轻链可变结构域)的多核苷酸，则可以使用本领域众所周知的技术，通过重组DNA技术产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的抗体或抗体片段(例如轻链或重链)的多核苷酸来制备蛋白的方法。可使用本领域技术人员众所周知的方法构建含有抗体或抗体片段(例如轻链或重链)编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了包含可操作地连接到启动子的编码本文所述的抗体分子的核苷酸序列、抗体的重链或轻链、抗体或其片段的重链或轻链可变结构域，或重链或轻链CDR的载体。这样的载体可以例如包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公开号WO86/05807和WO89/01036；和美国专利号5，122，464)和抗体的可变结构域可以克隆到这样的载体中，用于表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。此类载体可以例如包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公开第WO 86/05807号和第WO 89/01036号；以及美国专利第5,122,464号)，并且抗体的可变结构域可以克隆到此类载体中，以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。
可以通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如宿主细胞)中，然后，可以通过常规技术培养所得到的细胞以产生本文所述的抗体(例如包含本公开的抗FAM19A5抗体的VH和/或VL，或其VH和/或VL CDR中的一个或多个的抗体)或其片段。因此，本文提供了宿主细胞，该宿主细胞含有可操作地连接到启动子以在宿主细胞中表达此类序列的多核苷酸，该多核苷酸编码本文所述抗体或其片段，或其重链或轻链或其片段，或本文所述的单链抗体。在某些实施例中，为了表达双链抗体，可以单独在宿主细胞中共表达编码重链和轻链的载体，以表达整个免疫球蛋白分子，如下所述。在某些实施例中，宿主细胞包含载体，该载体包含编码本文所述抗体的重链和轻链两者或其片段的多核苷酸。在具体实施例中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一载体包含编码本文所述抗体的重链或重链可变区或其片段的多核苷酸，而第二载体包含编码本文所述抗体的轻链或轻链可变区或其片段的多核苷酸。在其他实施例中，第一宿主细胞包含第一载体，该第一载体包含编码本文所述抗体的重链或重链可变区或其片段的多核苷酸，第二宿主细胞包含第二载体，该第二载体包含编码本文所述抗体的轻链或轻链可变区的多核苷酸。在具体实施例中，由与第二细胞的轻链/轻链可变区相关联的第一细胞表达的重链/重链可变区以形成本文所述的抗FAM19A5抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，本文提供了包含此类第一宿主细胞和此类第二宿主细胞的宿主细胞群。
在特定实施例中，本文提供了一组载体，其包含第一载体，该第一载体包含编码本文所述的抗FAM19A5抗体的轻链/轻链可变区的多核苷酸；和第二载体，该第二载体包含编码本文所述的抗FAM19A5抗体的重链/重链可变区的多核苷酸。
可以使用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的抗体分子。此类宿主表达系统代表可以通过其产生感兴趣的编码序列并随后进行纯化的载体，还代表了当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，诸如以重组噬菌体DNA、质粒DNA或含有抗体编码序列的粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；以含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母)；以含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或以含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，诸如莱茵衣藻)；或哺乳动物细胞系统(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK293、NSO、PER.C6、VERO、CRL7030、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSCl、BSC40、YB/20和BMT10细胞)，该哺乳动物细胞系统包含重组表达构建体，该构建体含有源自哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。在具体实施例中，用于表达本文所述的抗体或其抗原结合片段的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SYSTEMTM(Lonza)的CHO细胞。在特定实施例中，用于表达本文所述的抗体的细胞是人细胞，例如人细胞系。在一个具体的实施例中，哺乳动物表达载体是POPTIVEC或pcDNA3.3。在特定实施例中，细菌细胞诸如大肠杆菌，或真核细胞(例如哺乳动物细胞)，特别是用于表达整个重组抗体分子的细胞，用于表达重组抗体分子。例如哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)与载体(诸如来自人巨细胞病毒的主要即早基因启动子元件)一起是抗体的有效表达系统(Foecking MK&Hofstetter H(1986)《基因(Gene)》45：101-5；和Cockett MI等人,(1990)《生物科技(Biotechnology)》8(7)：662-7)。在某些实施例中，本文所述的抗体由CHO细胞或NSO细胞产生。在具体实施例中，免疫特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的编码本文所述的抗体的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。
在细菌系统中，根据正在表达的抗体分子的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。例如当要产生大量的这种抗体时，为了生成抗体分子的药物组合物，可能需要指导易于纯化的高水平融合蛋白产物表达的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U&Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2：1791-1794)，其中抗体编码序列可以单独地连接到载体中与lac Z编码区符合读框，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S&Inouye M(1985)《核酸研究(NUCLEIC ACIDS RESEARCH)》13：3101-3109；Van Heeke G&Schuster SM(1989)《生物化学杂志(J Biol Chem)》24：5503-5509)等。例如pGEX载体也可用于表达外源多肽作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附并与基质谷胱甘肽琼脂糖珠结合，然后在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，使得可以从GST部分释放克隆的靶基因产物。
昆虫系统中，苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)例如可以用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。可以将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用多种基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况下，可以将感兴趣的抗体编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这一嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(例如区E1或E3)将产生重组病毒，该重组病毒在被感染的宿主中能够存活并且能够表达抗体分子(参见例如Logan J&Shenk T(1984)《美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences)》81(12)：3655-9)。为了有效翻译插入的抗体编码序列，可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的——天然的和合成的。通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等，可以提高表达的效率(参见例如Bitter G等人,(1987)《酶学方法(Meth Enzymol)》153：516-544)。
另外，可以选择宿主细胞株，该宿主细胞株调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用真核宿主细胞，该真核宿主细胞具有用于基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机器。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、NSO(不会内源产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7030、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC 1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施例中，本文所述的抗FAM19A5抗体在哺乳动物细胞诸如CHO细胞中产生。
在具体实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合部分具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术来产生此类抗体。例如抗体可以在缺乏或缺少岩藻糖基化能力的细胞中表达。在具体实施例中，敲除了1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因的细胞系可用于产生岩藻糖含量降低的抗体或其抗原结合部分。系统(Lonza)可用于产生岩藻糖含量降低的抗体或其抗原结合部分的系统的实例。
为了长期、高产量地生产重组蛋白，可以生成稳定的表达细胞。例如可以工程化稳定表达本文所述的抗FAM19A5抗体及其抗原结合部分的细胞系。在具体实施例中，本文提供的细胞稳定表达轻链/轻链可变结构域和重链/重链可变结构域，它们结合形成本文所述的抗体或其抗原结合部分。
在某些方面，可以使用由合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选标记物控制的DNA来转化宿主细胞，而非使用含有病毒复制起点的表达载体。引入外源DNA/多核苷酸后，可以允许工程化细胞在富集培养基中生长1至2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的可选标记物导致对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中并生长以形成病灶，继而可以将病灶克隆并扩增到细胞系。这一方法可有利地用于工程化表达本文所述的抗FAM19A5抗体或其抗体结合部分的细胞系。此类工程化细胞系在筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的组合物时特别有用。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)Cell 11(1)：223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska EH&Szybalski W(1962)美国国家科学院院刊(Proceedings Of The National Academy OfSciences)48(12)：2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶((Lowy I等人,(1980)Cell 22(3)：817-23)基因可以分别在tk、hgprt或aprt细胞中使用。而且，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，其导致对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M等人,(1980)美国国家科学院院刊(Proceedings Of The National Academy Of Sciences)77(6)：3567-70；O'Hare K等人,(1981)美国国家科学院院刊(Proceedings Of The National Academy Of Sciences)78：1527-31)；gpt，其导致对霉酚酸的抗性(Mulligan RC&Berg P(1981)美国国家科学院院刊(Proceedings Of The National Academy Of Sciences)78(4)：2072-6)；Neo，其导致对氨基糖苷G-418的抗性(Wu GY&Wu CH(1991)《生物疗法(Biotherapy)》3：87-95；TolstoshevP(1993)《生物化学年鉴(Annual Review of Biochemistry)》32：573-596；Mulligan RC(1993)《科学(Science)》260：926-932；和Morgan RA&Anderson WF(1993)《生物化学年鉴(Annual Review of Biochemistry)》62：191-217；Nabel GJ&Feigner PL(1993)《生物技术趋势(Trends Biotechnol)》(5)：211-5)；以及hygro，其导致对潮霉素的抗性(Santerre RF等人,(1984)《基因(Gene)》30(1-3)：147-56)。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以常规地用于选择所需的重组克隆，并且此类方法例如在以下文献中进行了描述：Ausubel FM等人,(编辑.)《分子生物学最新方案(Current Protocols in MolecularBiology)》，约翰威立父子出版集团(John Wiley&Sons)，纽约(1993)；Kriegler M，《基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)》，斯托克顿出版社，纽约(1990)；Dracopoli NC等人(编辑.)，《即人类遗传学实验指南(Current Protocols inHuman Genetics)》第12和13章，约翰威立父子出版集团(John Wiley&Sons)，纽约(1994)；Colbere-Garapin F等人,(1981)《分子生物学杂志(J Mol Biol)》150：1-14中，其通过引用整体并入本文。
可以通过载体扩增来提高抗体分子的表达水平(综述参见Bebbing ton CR&Hentschel CCG，《基于基因扩增的载体在DNA克隆中的哺乳动物细胞中表达克隆基因的用途(The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning)》，第3期(学术出版社，纽约，1987年))。当表达抗体的载体系统中的标记物可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平的提高将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因相关联，因此抗体的产量也将增加(Crouse GF等人，(1983)《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》3：257-66)。
宿主细胞可与本文所述的两种或多种表达载体共转染，第一种载体编码重链源自多肽，第二种载体编码轻链源自多肽。宿主细胞可以与本文所述的两个或多个表达载体共转染，其中第一载体编码由重链源自的多肽，而第二载体编码由轻链源自的多肽。两个载体可以含有相同的可选标记物，该可选标记物使得重链多肽和轻链多肽的表达能够相等。可以用不同量的两种或多种表达载体共转染宿主细胞。例如可用以下任一比例的第一表达载体和第二表达载体转染宿主细胞：1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：12、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45或1：50。
或者，可以使用单一载体，该单一载体编码并且能够同时表达重链多肽和轻链多肽。在这种情况下，应将轻链置于重链之前，以避免过量的无毒重链(Proudfoot NJ(1986)自然322：562-565；和Kohler G(1980)《美国科学院院报》(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences)77：2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可以编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个基因/核苷酸序列，或在2至5、5至10或10至20个范围内的基因/核苷酸序列。例如双顺反子核酸构建体可按以下顺序包含启动子、第一基因(例如本文所述的抗体的重链)以及第二基因和(例如本文所述的抗体的轻链)。在此类表达载体中，两个基因的转录可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性扫描机制进行，并且来自第二基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性机制，例如通过IRES进行。
一旦通过重组表达产生了本文所述的抗体分子，则可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如离子交换；亲和力，特别是通过针对蛋白A后的特定抗原的亲和力；以及上浆柱色谱法(sizingcolumnchromatography))、离心、差异性溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白的标准技术。此外，本文所述的抗体可以与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。
在具体实施例中，分离或纯化本文所述的抗体或其抗原结合部分。通常，分离的抗体基本上不含抗原特异性与之不同的其他抗体。例如在特定实施例中，本文所述的抗体的制剂基本上不含细胞物质和/或化学前体。术语“基本上不含细胞物质”包括抗体制剂，即其中抗体与从其分离或重组产生抗体的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白(本文也称为“污染蛋白”)和/或抗体变体的抗体，例如不同翻译后修饰形式的抗体或抗体的其他不同形式(或抗体结合部分)制剂。当重组产生抗体时，它通常也基本上不含培养基，即培养基代表小于蛋白质制剂体积的约20％>、10％>、2％、1％、0.5％或0.1％。当重组产生抗体时，其通常也基本上不含培养基，即培养基占蛋白制剂体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体时，其通常基本上不含化学前体或其他化学物质，即其与蛋白合成中所涉及的化学前体或其他化学物质分离。因此，除感兴趣的抗体以外，此类抗体的制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或化合物。在具体实施例中，本文所述的抗体是分离或纯化的。
VII.测定法
可以通过例如标准ELISA测试本文所述的抗体与FAM19A5的结合。用PBS中1至2μg/ml的纯化FAM19A5包被微量滴定板，然后用PBS中5％牛血清白蛋白封闭。将抗体的稀释液(例如来自FAM19A5免疫小鼠的血浆稀释液)加入到每个孔中，并在37℃下孵育1至2小时。用PBS/吐温洗涤板，然后与缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的第二试剂(例如对于人抗体，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Moss公司，产品：ABTS-1000)对板进行显影，并用分光光度计在OD 415-495进行分析。然后，通过流式细胞术进一步筛选与表达人FAM19A5的细胞系的结合，但不与不表达FAM19A5的对照细胞系结合的来自免疫小鼠的血清。简言之，通过将表达FAM19A5的CHO细胞与抗FAM19A5抗体以1：20的稀释度孵育来评估抗FAM19A5抗体的结合。洗涤细胞，用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACS罐流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞仪分析。优选地，将使用产生最高滴度的小鼠进行融合。
如上所述的ELISA测定法可用于筛选抗体，并且因此可以筛选产生与FAM19A5免疫原显示阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后，可以将产生优选地以高亲和力与FAM19A5结合的抗体的杂交瘤亚克隆，并进一步表征。然后，可以从每个杂交瘤中选择一个保留亲本细胞反应性的克隆(通过ELISA)，以制成细胞库并进行抗体纯化。
为了纯化抗FAMI9A5抗体，可以使所选的杂交瘤在两升的旋转瓶中生长，以进行单克隆抗体纯化。上清液可在用蛋白A-琼脂糖亲和层析前过滤并浓缩(Pharmacia，Piscataway，NJ)。可以对上清液进行过滤并浓缩，然后用琼脂糖蛋白A进行亲和色谱分析(Pharmacia，Piscataway，NJ)可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查洗脱的IgG，以确保纯度。可以将缓冲溶液更换为PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD 280确定浓度。单克隆抗体可以等分并在-80℃下保存。
为了确定所选的抗FAM19A5单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)对每种抗体进行生物素化。可以用链霉亲和素标记的探针检测生物素化的MAb结合。如上所述，可以使用FAM19A5包被的ELISA板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如为了确定人单克隆抗体的同种型，可以在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭后，使板与1μg/ml或更低的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2个小时。然后，可以使孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。如上所述，对板进行显影和分析。
如实例中所述，为了测试单克隆抗体与表达FAM19A5的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简言之，将表达膜结合的FAM19A5(在标准生长条件下生长)的细胞系与各种浓度的单克隆抗体在含0.1％BSA的PBS中于4℃下混合1小时。洗涤后，在与一抗染色相同的条件下，使细胞与荧光素标记的抗IgG抗体反应。样品可以通过FACScan仪器利用光和侧向散射特性进行分析来门控单个细胞，并且确定标记抗体的结合。除了或代替流式细胞术测定法外，可以使用荧光显微法的替代测定法。可以完全按上文所述对细胞进行染色，并通过荧光显微法检查。这种方法可以使单个细胞可视化，但取决于抗原的密度，灵敏度会降低。
可以通过蛋白印迹进一步测试抗FAM19A5抗体与FAM19A5抗原的反应性。简言之，可以制备来自表达FAM19A5的细胞的细胞提取物，并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待测单克隆抗体进行探测。可以使用抗-IgG碱性磷酸酶检测IgG结合，并用BCIP/NBT底物片剂进行显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。
用于分析各种抗FAM19A5抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定法，例如使用BIACORETM2000 SPR仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)的BIACORETM表面等离子共振(SPR)分析。
在一个实施例中，抗体特异性地与人FAM19A5的可溶形式结合。在一个实施例中，抗体特异性地与人FAM19A5的膜结合形式结合。抗体可以特异性地与FAM19A5的特定表位(例如SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：90中的片段)结合。在某些实施例中，抗体优选以高亲和力特异性与人FAM19A5结合，并且不与蛋白的FAM19亚家族的其他成员交叉反应。
VIII.双特异性分子
本文所述的抗体可用于形成双特异性分子。抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可以源自或连接到另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白(例如另一种抗体或受体配体)，以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。细胞因子诸如IL-6、CNTF、LIF、EFG和TGFα被认为是神经胶质增生和/或反应性星形胶质细胞增生发作的触发因素。(Balasingam等人，《神经科学杂志(J.Neurosci.)》14(2)：846-56(1994)；Winter等人，《美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences)》20；92(13)：5865-9(1995))，其激活蛋白信号转导与转录激活因子3(STAT3)，然后调节CNS损伤后的反应性星形胶质细胞增生的许多方面。Herrmann J.E.等人，《神经科学杂志(J.Neurosci.)》28(28)：7231-7243(2008).例如STAT3缺少或减少会导致胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的上调减弱、星形胶质细胞肥大失败、炎症扩散增加、病变体积增大以及CNS损伤后运动恢复部分减弱。Herrmann J.E.等人，《神经科学杂志(J.Neurosci.)》28(28)：7231-7243(2008)。因此，例如抗FAM19A5抗体可以连接到抗体或scFv以进行联合治疗，该抗体或scFv特异性地与任何涉及抑制神经胶质细胞增生和/或反应性星形胶质细胞增生发作的蛋白结合，例如抗体与IL-6、CNTF、LIF、EGF或TGFα结合。
而且，抗FAM19A5抗体可以连接到抗体或scFv，所述抗体或scFv治疗个体的疾病或病症，包括中枢神经系统损伤(例如创伤性脑损伤、脑脊髓损伤、中风或脑瘤)、脑脊髓系统损害、脑部退行性病症(例如亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、ALS)、脑脊髓或神经退行性病症或神经性疼痛(参见下文第XII节中的疾病或病症)。例如抗FAM19A5抗体可以连接到治疗多发性硬化症的抗体或scFv，例如Natalizumab(TYSABRI)，Alemtuzumab
事实上，本文所述的抗体可以被源自化或连接到多于一个的其他功能性分子，以产生与多于两个不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子也意在由如本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本文所述的双特异性分子，本文所述的抗体可以功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)到一个或多个其他结合分子(诸如另一抗体、其抗体结合部分、肽或结合模拟物)，从而产生双特异性分子。在一个实施例中，双特异性分子与FAM19A5和VEGF结合。在另一个实施例中，双特异性分子与FAM19A5和EGF结合。
因此，本文提供了双特异性分子，其包含针对FAM19A5的至少一个第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。在本文所述的双特异性分子是多特异性的实施例中，该分子可以进一步包括第三结合特异性。
在一个实施例中，本文所述的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体结合部分作为结合特异性，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。抗体也可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段，诸如Fv或单链构建体，如Ladner等人在美国专利第4,946,778号中所述，其内容通过引用明确并入。
尽管优选人单克隆抗体，但是可以在本文所述的双特异性分子中使用的其他抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可以使用本领域已知的方法通过缀合组分结合特异性来制备本文所述的双特异性分子。例如双特异性分子的每种结合特异性可以分别产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人，(1984)《实验医学杂志(JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE)》160：1686；Liu，MA等人，(1985)《美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy ofSciences)》82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)贝林研究所第78期，第118-132页；Brennan等人，(1985)《科学(Science)》229：81-83)，and Glennie等人，(1987)《免疫学杂志(J.Immunol.)》139：2367-2375)中描述的方法。优选的缀合剂是SATA和磺基SMCC，两者均可从皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.，伊利诺伊州罗克福德)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以经由两个重链的C末端铰链区的巯基键缀合。在一个特别优选的实施例中，在结合之前，修饰铰链区被以含有奇数个巯基残基，优选一个。
或者，两种结合特异性可以在同一载体中编码，并在同一宿主细胞中表达和组装。在双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、mAb x(scFv)2、Fab x F(ab')2或配体xFab融合蛋白的情况下，这一方法特别有用。双特异性抗体可以包含在每个重链的碳末端含有单链抗体的抗体。本文所述的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；以及美国专利第5,482,858号。
双特异性分子与其特定靶标的结合可以使用本领域公认的方法来确认，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、FACS测定法、生物测定法(例如生长抑制)或蛋白印迹测定法。这些测定法中的每一种通常通过采用对感兴趣的复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。
IX.诊断
在一个实施例中，与抗FAM19A5抗体连接的部分选自由以下部分组成的群组：结合部分、标记部分和生物活性部分。
本文所述的抗体可以用于诊断目的，包括样品测试和体内成像，并且可以为此将抗体(或其结合部分)与合适的可检测试剂缀合以形成免疫缀合物。出于诊断目的，合适的试剂是可检测的标记，包括用于全身成像的放射性同位素，以及用于样品检测的放射性同位素、酶、荧光标记和其他合适的抗体标签。
可检测标记可以是体外诊断领域当前所使用的各种类型中的任一种，包括微粒标记，包括金属溶胶，诸如胶体金；同位素，诸如以例如N2S2、N3S或N4型的肽类螯合剂提供的I125或Tc”；发色团，包括荧光标记物、发光标记物、磷光标记物等；以及将给定底物转换为可检测标记物的酶标记，和在诸如通过聚合酶链反应扩增后显示的多核苷酸标签。合适的酶标记包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。例如标记可以是酶碱性磷酸酶，其通过测量以下物质转化后化学发光的存在和形成来检测：1,2二氧杂环丁烷底物诸如金刚烷基甲氧基磷酰氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.1 3,7}decan}-4-基)磷酸苯基二钠(CSPD)，以及CDP和或其他本领域技术人员众所周知的发光底物，例如合适的镧系元素(诸如铽(III)和铕(III))的螯合物。检测方式由所选标记确定。均根据标准惯例，在标记为颗粒状并以适当水平积聚的情况下，裸眼可见标记或其反应产物的出现，或者使用诸如分光光度计、发光计、荧光计等的仪器可见。
本文所述的抗体也可以与治疗剂缀合形成免疫缀合物，如抗体-药物缀合物(ADC)。合适的治疗剂包括调节神经胶质增生和/或反应性星形胶质细胞增生和/或治疗退行性脑疾病、中枢神经系统损伤或神经性疼痛的药剂。用于治疗脑部退行性病症的治疗剂包括用于治疗亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物。这包括通常用于治疗此类脑部退行性病症的药物，例如下文第XII项中公开的药物。
免疫缀合物可以通过本领域已知的方法制备。优选地，缀合方法导致基本上(或几乎)非免疫原性的键合，例如肽-(即酰胺-)、硫-、(位阻)，二硫-、腙-和醚键。这些键合几乎是非免疫原性的，并且在血清中显示出合理的稳定性(参见例如Senter,P.D.，《化学生物学新观点(CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY)》13(2009)235-244；WO2009/059278；WO95/17886)。
根据部分和抗体的生化性质，可以采用不同的缀合策略。在部分是天然存在的或是50至500个氨基酸的重组体的情况下，教科书中有描述蛋白缀合物合成的化学方法的标准程序，技术人员可以容易地遵循该标准程序(参见例如Hackenberger,C.P.R.,和Schwarzer,D.,《单原子纳米酶的设计及应用(Angew Chem Int Ed Engl)》47(2008)10030-10074)。在一个实施例中，使用马来酰亚胺部分与抗体或该部分中的半胱氨酸残基的反应。在例如使用抗体的Fab或Fab’片段的情况下，这是特别合适的偶联化学方法。或者，在一个实施例中，进行与抗体或部分的C末端的耦合。蛋白例如Fab片段的C末端修饰，可以例如按照Sunbul,M.和Yin，《有机和生物分子化学(Org.Biomol.Chem.)》7(2009)3361-3371所述进行。
通常，位点特异性反应和共价偶联基于将天然氨基酸转化为其反应性与其他存在的官能团的反应性正交的氨基酸。例如可以在醛中将稀有序列上下文中的特定半胱氨酸酶促转化(参见Frese,M.A.和Dierks,T.，《生物化学杂志(ChemBioChem.)》10(2009)425-427)。还可以通过在给定的序列上下文中利用某些酶与天然氨基酸的特异性酶反应性来获得所需的氨基酸修饰(参见例如Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，《生物化学杂志(ChemBioChem.)》15(2008)128-136；以及蛋白酶催化的碳-氮键的形成，Bordusa，F，《生物有机化学集锦(Highlights in BioorganicChemistry)》(2004)389-403)。
也可以通过末端氨基酸与适当修饰剂的选择性反应来实现位点特异性反应和共价偶联。N末端半胱氨酸与苯甲腈的反应性(参见H.等人，《单原子纳米酶的设计及应用(Angew Chem Int Ed Engl)》48(2009)9658-9662)可用于实现位点特异性共价偶联。天然化学连接也可以依赖于C末端半胱氨酸残基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B，《核算与分子生物学(Nucleic Acids and Molecular Biology)》(2009)，22(《蛋白质工程(ProteinEngineering)》)，65-96)。
EP 1 074 563描述了一种缀合方法，该方法基于一段带负电荷的氨基酸中的半胱氨酸与位于一段带正电荷的氨基酸中的半胱氨酸的更快反应。
该部分也可以是合成肽或肽模拟物。部分也可以是合成肽或肽模拟物。在化学合成多肽的情况下，可以在此类合成过程中并入具有正交化学反应性的氨基酸(参见例如deGraaf,A.J.等人，《结合物化学(Bioconjugate Chemistry)》20(2009)1281-1295)。由于各种正交官能团处于危险中，并且可以引入合成肽中，因此此类肽与接头的缀合是标准化学方法。
为了获得单标记多肽，可以通过色谱法将化学计量比1：1的缀合物与其它缀合副产物分离。可通过使用染料标记的结合对成员和带电荷的接头促进这一过程。通过使用这种标记的且高度带负电荷的结合对成员，由于电荷和分子量的差异可用于分离，因此单缀合的多肽可容易地与非标记的多肽和带有多于一个接头的多肽分离。荧光染料可用于从如标记的单价粘合剂等的未结合的组分中纯化复合物。
X.药物组合物
本文提供了组合物，该组合物包含在生理上可接受的载体、辅料或稳定剂中具有所需纯度的本文所述的抗体或其抗原结合部分(《雷氏药学大全(Remington'sPharmaceutical Sciences)》(1990)Mack Publishing Co.，美国宾夕法尼亚州伊斯顿)。可接受的载体、辅料或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯氯扎铵、苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如 或聚乙二醇(PEG)。
在具体实施例中，药物组合物在药学上可接受的载体中包含本文所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，以及任选的一种或多种附加的预防或治疗剂。在具体实施例中，药物组合物在药学上可接受的载体中包含本文所述的抗体或其抗原结合部分，以及任选地一种或多种附加的预防剂或治疗剂。在一些实施例中，抗体是药物组合物中包括的仅有活性成分。本文所述的药物组合物可用于增强、诱导或激活FAM19A5活性并治疗例如中枢神经系统损伤、脑部退行性病症或神经性疼痛等病症。
肠胃外制剂中所使用的药学上可接受的载体包括水性赋形剂、非水性赋形剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。水性赋形剂的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。非水性肠胃外赋形剂包括植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑菌或抑真菌浓度的抗菌剂加入到多剂量容器所包装的肠胃外制剂中，所述容器包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性赋形剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
可以针对个体的任何施用途径配制药物组合物。施用途径的具体实例包括鼻内、口服、肠胃外、鞘内、脑室内、肺、皮下或脑室内。本文还考虑了肠胃外施用，其特征在于皮下、肌内或静脉内注射。注射剂可以常规形式制备，可以是液体溶液或悬浮剂、适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或是乳剂。注射剂、溶液和乳剂也含有一种或多种辅料。合适的辅料是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，待施用的药物组合物也可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂和其它此类试剂，诸如蹙酸钠、脱水山梨醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
抗体的肠胃外施用制剂包括可供注射的无菌溶液；无菌干燥的可溶性产品，诸如可供在使用前与溶剂结合的冻干粉末，包括皮下注射片剂；可供注射的无菌悬浮剂；可供在使用前与赋形剂结合的无菌干燥不溶性产品；以及无菌乳剂。溶液可以是水溶液或非水溶液。
如果静脉内施用，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠和增溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
如针对局部和全身施用，如所述制备包含抗体的局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，并且可以配制成乳膏、凝胶、软膏、乳剂、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或任何其它适合局部施用的制剂。
本文所述的抗体或其抗原结合部分可以配制成用于局部应用，诸如通过吸入的气雾剂(参见例如美国专利第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号，其描述了用于递送可用于治疗炎性疾病，特别是哮喘的类固醇的气雾剂)。这些施用于呼吸道的制剂可以是用于喷雾器的气雾剂或溶液形式，或者是用于吹入的微细粉末形式，可以单独使用，也可以与惰性载体诸如乳糖组合使用。在这种情况下，在一个实施例中，制剂的颗粒的直径将小于50微米，在一个实施例中小于10微米。
本文所述的抗体或其抗原结合部分可以以凝胶、乳膏和洗剂的形式配制用于局部或外部应用，诸如局部应用于皮肤和粘膜(诸如眼中)，并且应用于眼，或应用于脑池内或脊柱内。设想局部施用用于透皮递送并且还用于眼或粘膜施用，或用于吸入疗法。也可以单独施用抗体的鼻溶液或与其他药学上可接受的辅料组合。
透皮贴剂，包括离子电渗疗法和电泳装置，是本领域技术人员熟知的，并可用于施用抗体。包括离子电渗疗法和电泳装置在内的的透皮贴剂是本领域技术人员众所周知的，并且可以用于施用抗体。例如在美国专利第6,267,983号、第6,261,595号、第6,256,533号、第6,167,301号、第6,024,975号、第6,010715号、第5,985,317号、第5,983,134号、第5,948,433号和第5,860,957号中公开了此类贴剂。
在某些实施例中，包含本文所述抗体或其抗原结合部分的药物组合物是冻干粉末，该冻干粉末可以被重构，从而以溶液、乳剂和其他混合物的形式施用。也可以将其重构并配制成固体或凝胶。通过将本文所述的抗体或其抗原结合部分或其药学上可接受的源自物溶解在合适的溶剂中来制备冻干粉。在一些实施例中，冻干粉是无菌的。溶剂可含有辅料，该辅料改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其他药理学成分。可以使用的辅料包括但不限于葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的试剂。在一个实施例中，溶剂在约中性pH下还可含有缓冲剂，诸如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂。随后进行溶液的无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供所需的制剂。在一个实施例中，将所得的溶液分装到小瓶中进行冻干。每个小瓶将包含单剂量或多剂量的化合物。冻干粉可以在适当的条件下例如在约4℃至室温下储存。
使用注射用水将这一冻干粉末重构，提供用于肠胃外施用的制剂。为了重构，将冻干粉加入无菌水或其它合适的载体中。精确的量取决于所选择的化合物。这种量可以凭经验确定。
本文所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物以及本文提供的其他组合物也可以配制为靶向待治疗的个体的特定组织、受体或身体的其他区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员众所周知的。本文考虑了所有用于本发明的组合物中的此类靶向方法。对于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利第6,316,652、第6,274,552号、第6,271,359号、第6,253,872号、第6,139,865号、第6,131,570号、第6,120,751号、第6,071,495号、第6,060,082号、第6,048,736号、第6,039,975号、第6,004,534号、第5,985,307号、第5,972,366号、第5,900,252号、第5,840,674号、第5,759,542号和第5,709,874号。在一个具体实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合部分用于治疗中枢神经系统损伤、脑部退行性病症或神经性疼痛。
用于体内施用的组合物可以是无菌的。这很容易通过如无菌过滤膜过滤来实现。
XI.试剂盒
本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或其免疫缀合物。在具体实施例中，本文提供了一种药包或试剂盒，该药包或试剂盒包含一个或多个容器，该容器填充有本文所述的药物组合物的成分中的一种或多种，诸如本文提供的一种或多种抗体或其抗原结合部分，任选地使用说明。在一些实施例中，试剂盒含有本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，诸如本文所述的那些。
XII.治疗用途和方法
本文还提供了减轻有此需要的个体(例如人)的CNS损伤或损害的方法，该方法包含向个体施用本文所述的抗FAM19A5抗体、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。
在其他方面，本文提出了用于阻止、减缓、抑制、遏制、减轻、逆转或预防神经胶质增生的开始或起始及其对个体的CNS的相关有害作用的方法，该方法包含向个体施用本文公开的抗FAM19A5抗体。在一些实施例中，本文提出了用于阻止、减缓、抑制、遏制、减轻、逆转或预防反应性星形胶质细胞过度或异常增殖及其对个体的CNS的相关有害作用的方法，该方法包含向个体施用本公开的抗FAM19A5抗体。在一些实施例中，本文提出了降低、抑制或减少个体中的硫酸软骨素蛋白聚糖(包括神经蛋白聚糖、NG2或两者的水平)的表达，或降低个体中的神经蛋白聚糖、NG2或两者的活性或使其失活的方法，该方法包含向个体施用本文所述的抗FAM19A5抗体。在一些实施例中，本文提出了用于刺激、促进、增加或激活个体中神经元生长的方法，优选在个体受到损伤或损害之后，该方法包含向个体施用如本文所述的抗FAM19A5抗体。在其他实施例中，本文提出了用于在有此需要的个体中增加c-fosmRNA、c-fos蛋白或c-fos蛋白活性水平，和增加ERK mRNA、ERK蛋白或pERK活性水平的方法，优选在神经元的核内，该方法包含向个体施用本公开的抗FAM19A5抗体。在某些实施例中，本文提出了用于在有此需要的个体中，增强或增加GAP43mRNA、GAP43蛋白的水平，或增加GAP43蛋白的活性的方法，优选在神经元中，该方法包含向个体施用如本文公开的抗FAM19A5抗体。在一些实施例中，本文提出了用于在有此需要的个体中增强或促进神经元存活和/或促进轴突再生的方法，该方法包含向个体施用本文公开的抗FAM19A5抗体。在一些实施例中，个体是人，优选因例如CNS损害、外伤、损伤、脑脊髓损害、脑瘤、感染、局部缺血、中风、自身免疫反应和/或神经退行性疾病导致神经元受到损伤或损害的人。
在一些方面，本文还提出了用于在有此需要的个体中治疗疾病、病症或病状的方法，该方法包含向个体施用本公开的抗FAM19A5抗体。在一些实施例中，疾病、病症或病状包含中枢神经系统损害、脑脊髓系统损害、脑部退行性病症、脑脊髓或神经退行性病症或神经性疼痛。在一些实施例中，脑部退行性病症是亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或其组合。在一些实施例中，退化性脑疾病是亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或其组合。因此，在某些实施例中，本文公开了一种在有此需要的个体中治疗创伤性脑损伤、脑脊髓损害、中风、脑肿瘤或其组合的方法，该方法包含向个体施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其组合物。在一些实施例中，本文公开了一种在有此需要的个体中治疗亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、ALS的方法，该方法包含向个体施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其组合物。在一些实施例中，个体是人。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体可以与一种或多种附加的试剂组合施用，用于治疗中枢神经系统损害(例如创伤性脑损伤、脑脊髓损害、中风或脑瘤)、脑脊髓系统损害、脑部退行性病症(例如亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、ALS)、脑脊髓或神经退行性病症或神经性疼痛。
在一些实施例中，疾病、病症或病状包含肿瘤、纤维化、青光眼或心境障碍。在某些实施例中，疾病、病症或病状包含肿瘤。在一些实施例中，肿瘤包含黑素瘤、胰腺癌、神经胶质瘤(例如多形性胶质母细胞瘤(GBM))、乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、肾癌、前列腺癌、纤维肉瘤、结肠腺癌、肝癌或卵巢癌。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体诱导例如肿瘤内的血管的正常化。在一些实施例中，血管的正常化伴随着血管特性的变化，包含增加的连通性、增加的壁厚、减小的血管直径、更规则的血管方向和分布方式、增加的血管数量、渗漏和渗透性的降低、周细胞在血管上增大的覆盖度和接近度、增加的氧合作用或其组合。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体抑制肿瘤的生长。在一些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的个体中肿瘤的生长)相比，抑制肿瘤的生长达至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施例中，抗FAMI9A5抗体增强免疫细胞向肿瘤的浸润。在一些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的癌症个体)相比，免疫细胞向肿瘤的浸润增强/增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施例中，免疫细胞包含巨噬细胞、树突细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)或其组合。在一些实施例中，免疫细胞显示肥大。在一些实施例中，免疫细胞向肿瘤的浸润伴随着神经元细胞向肿瘤的浸润增加。在某些实施例中，神经元细胞包含星形胶质细胞、神经胶质细胞或其组合。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体增强巨噬细胞或小神经胶质细胞的吞噬活性。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体增加巨噬细胞或小胶质细胞的线粒体膜电位。在某些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的癌症个体)相比，吞噬活性或线粒体膜电位提高或增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体减少肿瘤中的坏死和水肿。在其他实施例中，抗FAM19A5抗体降低肿瘤的组织通透性。在一些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的癌症个体)相比，肿瘤的坏死和水肿或组织渗透性降低了至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体增加肿瘤中的血流速率。在某些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的癌症个体)相比，血流速度增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施例中，治疗肿瘤的方法包括施用附加的治疗剂。在某些实施例中，所述附加的治疗剂包含化疗、免疫疗法、放射疗法或其组合。在一些实施例中，免疫疗法包含单克隆抗体、嵌合抗原受体(CAR)疗法、T细胞疗法、NK细胞疗法、树突细胞(DC)疗法、过继细胞转移(ACT)、免疫检查点调节剂、细胞因子、癌症疫苗、佐剂、溶瘤病毒或其组合。在一些实施例中，化学疗法包含替莫唑胺、吉西他滨、紫杉醇、卡铂、顺铂、埃罗妥珠单抗、来那度胺、地塞米松、奥沙利铂或其组合。
在一些实施例中，施用治疗有效量的本公开的抗FAMI9A5抗体或其组合物。当治疗个体(例如人)时，本文公开的抗FAM19A5抗体的治疗有效量取决于诸如年龄、性别、疾病严重性等因素。
在一些实施例中，本公开的抗FAMI9A5抗体或其组合物通过静脉内、口服、胃肠外、经膜、鞘内、脑室内、肺内、皮下、皮内、肌内或脑室内施用。
以下实施例是说明性而非限制性的。
实施例
实施例1：人FAM19A5蛋白的表达和纯化
如下所述产生和纯化重组人FAM19A5蛋白，并且基于结合亲和力分析将纯化的蛋白用于抗体筛选测定中。首先，将表达FAM19A5基因的LPS-hT质粒转化为细菌，并诱导蛋白过表达。产生后，使用Ni-NTA亲和色谱法(Qiagen，美国加利福尼亚州巴伦西亚)纯化FAM19A5蛋白。使用逐渐升高浓度的咪唑，从镍柱上去除带有His标记的FAM19A5蛋白。使用考马斯亮蓝R-250染料测量溶液中的蛋白表达。仅采用含FAM19A5咪唑的溶液，使用PBS浓缩FAM19A5蛋白。当浓度完成时，使用蛋白印迹测定法测量FAM19A5蛋白的纯度和浓度。随后将浓缩的蛋白用于筛选FAM19A5特异性抗体。
实施例2：抗体文库FAM19A5的产生
1.免疫
FAM19A5蛋白用作白来亨鸡的抗原。将50μg合成肽KLH缀合物在750μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合，并在37℃下孵育30分钟。之后，在2％角鲨烯内毒素MPL(单磷酸化脂质A物种)中去除毒素，并且对含有油包水乳化佐剂(RIBI+MPL+TDM+CWS佐剂，Sigma，美国密苏里州圣路易)的TDW和CWS的细胞壁组分的分枝杆菌(分支杆菌)进行乳化，然后，皮下注射到鸡体内。鸡共免疫四次，每次免疫间隔约2至3周。使用过表达FAM19A5蛋白的HEK293T细胞的裂解物，通过免疫印迹来测量从免疫动物获得的抗体的滴度。使用过表达FAM19A5蛋白的HEK293T细胞的裂解液，通过免疫印迹法测定从免疫的动物获得的抗体的滴度。
2.从免疫鸡制备单链可变片段(scFv)文库
使用TRI试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA USA)，从上述免疫鸡的脾、骨髓和滑液囊提取RNA。使用Oligo-dT引物和
SUPERSCRIPTTMIII第一链合成系统(Invitrogen)合成第一链cDNA。对于从动物免疫系统获得的cDNA，使用Expand High Fidelity PCR System(罗氏分子系统，IN，USA)生成单链可变区文库。在每个反应中，1μL cDNA、60pmol每种引物、10μL 10×反应缓冲溶液、8μL2.5mM的dNTP(Promega，美国威斯康星州麦迪逊市)和0.5μL Taq DNA聚合酶与水混合。最终体积为100μL，使用以下条件进行PCR反应：30个循环，包括(I)在94℃下15秒，(ii)在56℃下30秒，以及(iii)在72℃下90秒进行30个循环，最后在72℃下延伸10分钟。将包含长度约350bp片段的PCR产物上样至1.5％琼脂糖凝胶上，并且在电泳后，使用QIAGEN Gel II提取试剂盒(QIAGEN，美国加利福尼亚州巴伦西亚)纯化核苷酸片段。通过在OD 260nm处读数定量纯化的PCR产物。(1单位OD＝50μg/ml)。
来自第二PCR的两个VH和VL第一产物通过重叠延伸PCR(重叠延伸PCR)随机连接。每个PCR反应均与100ng纯化的VL和VH产物、60pmol每种引物、10μL 10×反应缓冲溶液、8μL2.5mM dNTP、0.5μL Taq DNA聚合酶和水混合，最终体积为100μL。PRC在以下条件下进行：(I)在94℃下15秒，(ii)在56℃下30秒，以及(iii)在72℃下2分钟进行25个循环，最后在72℃下延伸10分钟。将包含长度约700bp的单链可变区片段的PCR产物上样至1.5％琼脂糖凝胶，并且在电泳后，使用QIAGEN II凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化核苷酸片段。在OD 260nm处读取定量纯化的PCR产物。(1单位OD＝50/ml)。
3.文库、连接与转化
PCR产物的scFv片段和载体pComb3X-SS(斯克利普斯研究所，Carlsbad，CA USA)用SfI I限制酶消化。将10μg纯化的重叠PCT产物与360单位的SifⅠ(每16单位μg的DNA，罗氏分子系统，Pleasanton，CA，USA)、20μL 10×反应缓冲剂和水混合，最终体积为200μL。将20μg的pComb3X-SS载体与120单位的Sfi I(每6单位μg的DNA)、20μL的10×反应缓冲溶液和水混合，最终体积为200μL。将混合物在50℃下消化8小时。之后，将包含scFv片段(约700bp)和载体(约3400bp)的消化产物上样至1％琼脂糖凝胶上，并使用凝胶提取试剂盒IIQIAGEN(QIAGEN，美国加利福尼亚州巴伦西亚)纯化。将1400ng Sfi I限制性pComb3X载体和700ng消化的scFv片段与5×连接酶缓冲剂、10μL T4 DNA连接酶(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和水混合，最终体积为200μL。将混合物在16℃下孵育16小时以进行连接。
用乙醇沉淀后，将DNA沉淀溶于15μL水中。为了产生文库，通过使用振动子基因(Gene Pulser：Bio-Rad实验室，Hercules，CA，USA)经由电穿孔将连接样品转化到大肠杆菌菌株ER2738(New England Biolabs Inc.，Hitchin，Hertfordshine，SG4 OTY，England，UK)中。将细胞在5ml Super Broth(SB)培养基中混合，并在37℃下以250rpm搅拌下孵育一小时。然后，将3μL 100mg/mL卡那霉素加入到10mL SB培养基中。为了确定文库大小，将0.1μL、1μL和10μL的培养样品涂在含有50μg/ml卡那霉素的Luria Broth(LB)琼脂平板上。搅拌1小时后，将4.5μL100 mg/mL卡那霉素加入到LB培养物中，并再搅拌1小时。然后，将2ml在水中的VCM13辅助噬菌体(>1011cfu/ml)与预热的含有92.5μL 100mg/mL卡那霉素的LB(183mL)一起加入到LB培养基中。将该混合物在37℃下以250rpm再搅拌2小时。接着，将280μL(50mg/mL)卡那霉素加入到培养物中，并在37℃下搅拌过夜。第二天，使用高速离心机(贝克曼，JA-10转子)在3，000g，4℃下离心细菌沉淀。第二天，使用高速离心机(Beckman，JA-10转子)在4℃下以3,000g离心细菌沉淀。然后，用细菌沉淀提取噬菌粒DNA，同时将上清液转移到无菌离心瓶中。接着，将8克聚乙二醇-8000(PEG-8000，Sigma)和6克氯化钠(NaCl，Merck)加入到上清液中，然后，在冰中保持30分钟然后，将上清液在4℃下以15,000g离心15分钟。然后，丢弃上清液，并将含有1％BSA的噬菌体沉淀Tris——繁殖悬浮在缓冲盐水(TBS)中。
实施例3：固定化抗原的文库淘选(生物淘选)
使用磁珠进行生物淘选(Dynabeads M-270环氧树脂，Invitrogen)。在室温下，一边同时旋转珠子和蛋白，一边通过搅拌用5μg重组FAM19A5蛋白包被约1×107个珠子20小时。一旦包被完成，珠子用磷酸盐缓冲盐水洗涤4次，并在室温下在含3％ BAS的PBS中封闭1小时。然后，用上述的噬菌体展示的scFv将包被的珠子在室温下培养两个小时。为了去除任何不与抗原包被的珠子结合的噬菌体，用0.05％Tween20/PBS洗涤珠子。然后，用50μL 0.1M甘氨酸/氯化氢(0.1M甘氨酸-HCI，pH 2.2)洗脱结合的噬菌体，并用3μL 2m Tris和氯化氢(Tris-HCI，pH 9.1)进行中和。这种含噬菌体的上清液用于感染大肠杆菌ER2738细胞，VCSM13辅助噬菌体用于扩增和拯救过夜。使用这一含噬菌体的上清液感染大肠杆菌ER2738细胞，并使用VCSM13辅助噬菌体扩增并拯救过夜。而且，通过将噬菌体感染的培养物在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上进行印迹，确定来自噬菌体感染的培养物的噬菌体滴度的输入(输入)和产量(输出)。第二天，使用PEG-8000和NaCl沉淀噬菌体，该噬菌体随后用于生物淘选。通过重复上述过程，总共进行五次生物淘选。每次扩增，针对对FAM19A5蛋白的高度亲和力，筛选和选择噬菌体。
实施例4：通过噬菌体ELISA的克隆选择
为了分析从生物淘选中选择的克隆，从噬菌体展示的scFv中随机选择单独的克隆，并使用ELISA确认克隆与FAM19A5重组蛋白结合。将FAM19A5重组蛋白在0.1M NaHCO3缓冲剂中稀释，并用100ng/孔的蛋白在4℃下包被96孔微量滴定板16小时。第二天，将板在37℃下用3％ BSA/PBS封闭1小时。然后，将噬菌体上清液与6％BSA/PBS混合并在37℃下培养2小时。然后，用0.05％Tween-20/PBS洗涤含有上清液的板。将HRP缀合的M13抗体(a-M13-HRP，Pierce Chemical Co，Rockford，IL，USA)稀释至1/5000。将50μl稀释的抗体加入到板中，并在37℃下孵育1小时。孵育和洗涤后，向板中加入0.05M柠檬酸盐缓冲溶液，1μg/ml的2,2'-叠氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Amresco，Solon，OH，USA)和0.1％H2O2用于显色。在405nm处测量每个孔的吸光度。
从初步鉴定的96个克隆中，筛选出8个具有独特的重链CDR3(HCDR3)序列并与FAM19A5蛋白高结合的scFv克隆作进一步分析。图1A-1C
实施例5：抗FAM 19A5-IGG2/4抗体的产生
将抗FAM19A5 scFv克隆到哺乳动物表达载体中。在FAM19A5单链抗体基因序列中，一个人Ck基因连接到轻链可变区，CH1、CH2和CH3基因的人免疫球蛋白同种型IgG2/4连接到重链可变区。通过添加限制性位点(Genscript，USA)合成具有每个轻链和每个重链的抗体。将合成的基因插入到具有修饰的限制性位点的哺乳动物细胞表达载体中，以利于克隆。首先，使用Hind III和Xba I(新英格兰生物实验室，UK)限制性内切酶将轻链基因插入到载体，然后使用Nhel和BamHI(新英格兰生物实验室，英国)限制性内切酶将重链基因加入到载体。
为了表达和纯化抗FAMIL9 a5-IGg 2/4抗体，使用哺乳动物细胞转染和过表达注射系统。将约2μg/ml的哺乳动物表达载体与4μg聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences，Warrington，PA，USA)在150mM氯化钠(NaCl，Merck)中混合，相当于细胞培养体积的1/10。将混合物在室温下静置15分钟。将所述混合物加入HEK293F细胞(2×106cells/ml，Invitrogen)，然后将其在含有100U/ml青霉素和链霉素(Invitrogen)的FreestyleTM293表达培养基中，在7％ CO2和37℃并在135rpm的搅拌条件下孵育六天。为了从细胞培养物上清液中纯化表达的抗FAM19A5 IgG2/4抗体，使用了蛋白A珠(RepliGen，Waltham，MA，USA)亲和凝胶色谱法。蛋白质A色谱采用4～12％Bis-Tris梯度凝胶电泳。通过考马斯亮蓝染色确定了蛋白的大小和产量。用ELISA法测定抗体的结合能力。
如图2A所示，测试的不同抗体(即1-28、1-85、2-13、2-14、2-20、2-29、3-2和3-26)的大小相当。除1-85抗体外，测试的抗体均能不同程度地与FAM19A5蛋白结合。图2B。
实施例6：抗FAM 19A5抗体的中和能力分析
为了进一步评估抗体的功能特性，使用了以下方法：
1.重组FAM19A5兔Fc融合蛋白的制备
为了构建FAM19A5表达载体，化学合成了编码人FAM19A5的基因(Genscript，Picataway，NJ，USA)。所述基因被亚克隆到编码人IgGl的铰链区和兔IgG的CH2-CH3结构域的哺乳动物表达载体中。参见Han，J.，等人，《分子与实验医学(Experimental&MolecularMedicine)》48(11)：e271(2016)。
如前所述，使用25-kDa线性聚乙烯亚胺(Polyscience，Warrington，PA，USA)将编码FAM19A5兔Fc融合的表达载体转染到HEK293F细胞(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。参见Boussif，O.等人，《美国国家科学院院刊(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences)》92(16)：7297-301(1995)。根据制造商的说明，使用蛋白A琼脂糖凝胶柱(Repligen，Waltham，MA，USA)从瞬时转染的HEK293F细胞的培养上清液中纯化FAM19A5兔融合蛋白。
2.重组抗FAM19A5单链抗体人Ck融合蛋白的制备
将所选克隆的基因亚克隆到前文报道的编码Ck结构域(人免疫球蛋白k轻链恒定结构域)5'区的修饰的pCEP4载体中。参见Lee，Y.，等人，《分子与实验医学(Experimental&Molecular Medicine)》46：ell4(2014)。如上所述，将编码抗FAM19A5 scFv人Ck融合的表达载体转染到HEK293F细胞(Invitrogen)中。根据制造商的说明，使用蛋白A琼脂糖凝胶柱(Repligen，Waltham，MA，USA)从瞬时转染的HEK293F细胞的培养上清液中纯化scFv-hCK融合蛋白。
3.抗FAM19A5抗体对胶质细胞的中和作用
如前面所述，通过流式细胞术分析证实了评估抗体的中和功效。参见Kim，m.，等人，《科学公共图书馆综合(PLoS One)》7(4)：e35100(2012)。将小鼠和人神经胶质细胞接种到v型底部96孔板(Corning Inc.，Corning，NY，USA)中，最终密度为每孔3×io5个细胞。用1pM的重组FAM19A5兔Fc和5pM的抗FAM19A5单链抗体人Ck融合蛋白在流式细胞仪缓冲液[含0.05％(w/v)叠氮化钠的1％(w/v)BSA的PBS中]中，在37℃下处理细胞1小时。用流式细胞仪缓冲液洗涤后，将细胞与Alexa Fluor 488缀合的抗兔IgG(Fc特异性)抗体(JacksonImmuno Research Inc.，PA，USA)一起孵育。用相同的缓冲液再次洗涤后，将细胞重新悬浮在300微升的PBS中，并使用配备488纳米激光的FASCANCOTMII仪器(BD Bioscience，CA，USA)通过流式细胞术对所述细胞进行分析。用FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR，USA)对数据进行分析。
如图3A所示，所有测试的抗体(即1-28、1-85、2-13、2-14、2-20、2-29、3-2和3-26)均能不同程度地抑制FAM19A5与小鼠原代神经胶质细胞的相互作用。在人胶质母细胞瘤细胞系中，2-20抗体不能中和FAM19A5与细胞系的相互作用。图3B.其他抗体能够中和FAM19A5活性，尽管程度不同。1-28、2-13和3-2抗体在人胶质母细胞瘤细胞系中显示出最大的中和功效。
实施例7：使用FAM19A5表位片段F1-F6的表位作图分析
由于其能够中和FAM19A5在小鼠和人胶质细胞上的表达，因此选择3-2抗体进行表位作图分析。合成人FAM19A5蛋白的重叠肽片段(F1-F6，参见图。4)并将其与牛血清白蛋白结合。用ELISA法测定不同抗FAM19A5抗体与BSA结合肽片段F1-F6的结合。简言之，使用FAM19A5片段F1-F6(在50mM碳酸盐缓冲液(Biosesang)中稀释至1μg/ml，或在高浓度分析中稀释至20μg/ml)用于在4℃过夜涂布96孔免疫板(Thermo Scientific)(100μL/孔)的孔，然后在IX PBS中洗涤两次。然后在室温下用封闭缓冲液(100μL/well)封闭板1小时。在1小时的孵育过程中，将相关抗FAM19A5抗体在稀释缓冲液中稀释至1μg/ml(或20μg/ml，用于高浓度分析)。一旦洗涤板(使用lx PBS洗涤2次)，将稀释的抗FAM19A5抗体加入到适当的孔中，并将板在室温下孵育1小时。随后，使用洗涤缓冲液对板进行总共五次洗涤。接着，将ODP底物(通过将一片ODP片剂(邻苯二胺二盐酸盐，Thermo)溶解于9mL灭菌去离子水和1mL 10倍稳定过氧化物稳定缓冲液(Thermo)中制备)加入到每个孔中，并进行变色反应10分钟。向孔中加入100μL 2N h2so 4(Daejung)，停止反应。使用96孔微孔板阅读器(分子装置)在492nm处检测每个孔的吸收值。
如图5所示，3-2抗体与表位片段F2结合力强，与其它片段的结合力最小。
接下来，为了鉴定3-2抗体结合的表位片段F2中的特定氨基酸残基，进行丙氨酸扫描分析。如图6A所示，当氨基酸残基R4、D5、P9、R10或Rll突变为丙氨酸时，3-2抗体结合表位片段F2的能力大大降低。对3-2抗体的几个脱免疫变体进行了类似的分析(关于脱免疫过程的细节，参见实施例8)。如图6B、6C、6D、6F、6G、6I和6J所示，氨基酸残基R4、P9、R10和Rll对于抗体1-30、1-32和6-10与FAM19A5结合很重要。氨基酸残基R4、P9和R10对于抗体1-17和4-11是重要的(参见图6E和6H)。
实施例8：抗FAM19A5抗体的脱免疫
1.计算机模拟免疫原性评估
为了降低给药于人类个体时的免疫原性风险，进行了计算机模拟分析，以鉴定3-2和2-13抗FAM19A5抗体内的高免疫原性的特异性区。
为了鉴定混杂的MHC II类结合肽，对跨越整个序列的重叠的9聚体肽进行iTope1M(Abzena Pic.，UK)分析。通过对34个MHCⅡ类等位基因的相互作用分析，预测了潜在的T细胞表位。如图7和8所示，克隆3-2分别含有总共11个结合肽，克隆2-13含有总共10个非种系混杂MHC II类结合肽。
另外，通过TCEDlm(Abzena Pic.，UK)分析混杂的MHC II类结合肽，所述分析是通过针对10,000多个肽的T细胞刺激试验构建的CD4+T细胞表位数据库。克隆2-13揭示了两个混杂的MHCⅡ类结合肽与已知T细胞表位具有高度同源性。图8(以绿色突出显示)。克隆3-2具有三个混杂的MHCⅡ类结合肽，与已知T细胞表位高度同源。图7(以绿色突出显示)。
2.复合抗体文库的构建
设计复合抗体文库以避免与免疫原性相关的CD4+T细胞表位。为了选择最同源的人类种系用于文库构建，将克隆2-13和克隆3-2的框架分析到IgBLAST数据库(NCBI)。为克隆3-2选择人种系IGLV1-51*02、IGLJ2*01、IGLV3-64*04和IGHJT*01基因(图9A和9B)。为克隆2-13选择人种系IGLV3-27*01、IGLJ2*01、IGHV3-64*04和IGHJ1*01基因(图10)。
构建文库，将克隆2-13和克隆3-2的MHC II类结合区中某些不完全相同的氨基酸残基替换为最同源的人种系序列中的相应氨基酸。对编码人和鸡氨基酸的简并密码子的寡核苷酸进行连续重叠延伸聚合酶链反应(PCR)以产生定点突变文库，如先前所述。Baek DS，Kim YS.《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)》463(3)：414-20(2015)。将PCR产物亚克隆到噬菌体载体中并转化到大肠杆菌菌株ER2738(New EnglandBioLabs，Ipswich，MA，USA)中用于噬菌体制备，如先前所述。Han，J.，等人，《分子与实验医学(Experimental&Molecular Medicine)48(11)：e271(2016)。
3.生物淘选和克隆选择
为了分离阳性克隆，进行生物淘选和噬菌体酶免疫测定，如先前所述(Barbas CF.噬菌体展示：冷泉港实验室手册，纽约：冷泉港实验室出版社；2001)。选择对FAM19A5具有反应性的噬菌体克隆，并通过sanger测序确定其核苷酸序列。最后，选择对FAM19A5保留亲和力的、具有最少混杂MHC II类结合表位的scFv克隆。
如图9B所示，在脱免疫克隆3-2中去除克隆3-2中7个混杂的MHC II类结合表位。去除的表位对应于结合肽#2、3、4、5、9、10和11，如图7所示。无法去除CDRH1中的混杂的MHC II类结合表位(即图7中的结合肽#6)。而且，由于位于CDRH2中的p3残基在结合活性(即图7中的结合肽#8)中起关键作用，因此无法去除HFR2中混杂的MHC II类结合表位。如图9C所示，通过突变所有上述残基完全脱免疫3-2抗体，导致3-2抗体不能结合FAM19A5蛋白。然而，当VH的氨基酸残基Q50未发生突变时，脱免疫的3-2抗体能够与FAM19A5蛋白结合的情况与野生型3-2抗体相似。
如图10A所示，在脱免疫克隆2--13中去除克隆2-13中7个混杂的MHC II类结合表位。去除的表位对应于结合肽#1、2、3、4、5、8和9，如图8所示。而且，由于位于CDRH2中的p3残基在结合活性(即图8中的结合肽#6)中起关键作用，因此无法去除HFR2中混杂的MHC II类结合表位。与3-2抗体一样，完全脱免疫2-13抗体也会对与FAM19A5蛋白的结合产生负面影响。图10B.
上述结果表明，有可能降低抗FAM19A5抗体的免疫原性，而不会对其与FAM19A5蛋白结合的能力产生负面影响。
实施例9：脱免疫2-13抗体的亲和力成熟
静电相互作用在抗体和抗原的结合中很重要。Lee J.Y.，等人，《自然通讯(NatCommun.)》7：13354(2016)。除脱免疫克隆2-13的CDRH3之外的5个CDR中的每个氨基酸被谷氨酸和天冬氨酸取代，以引入人工带负电荷的R基团。化学合成了共70个编码点突变scFvs的基因(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA，USA)和亚克隆到噬菌体载体中以构建展示噬菌体的突变scFv，如前所述。Yoon，a.，等人，《科学公共图书馆综合(PLoS One)》11(1)：e0146907(2016)。
保存显示噬菌体的电荷变异突变scFv，并进行如前所述的噬菌体酶免疫测定(Barbas CF.(Barbas CF.《噬菌体展示：实验室手册(Barbas CF.Phage display:alaboratory manual.)》，冷泉港实验室出版社；2001)。如图11所示，所有的克隆都展现出不同程度的FAM19A5结合活性。其中两个克隆(36.H1-3TE和37.H1-3TD)比脱免疫的DON2-13展示出更高的结合亲和力。图15中提供了(i)野生型2-13抗体，(ii)脱免疫克隆2-13抗体，和(iii)脱免疫和亲和力成熟的2-13抗体(2-I3D-37)的VH和VL的序列比较。
实施例10：脱免疫2-13D-37抗体的亲和力成熟
为构建CDR-H3定点突变文库，使用编码脱免疫克隆2-13D-37scFv的基因为模板进行PCR。用编码NNK简并密码子的寡核苷酸(N＝A、T、G或C，K＝G或T)，将CDR-H3中的三个连续残基随机化，如前所述(Lee Y，Kim H，Chung《分子与实验医学(Experimental&MolecularMedicine)2014；46：el 14)。通过PCR方法在CDR-H3中引入随机密码子。通过重叠延伸PCR扩增的scFv片段亚克隆到噬菌体载体中，并转化到ER2738(New England BioLabs)中用于噬菌体制备，如上所述。共产生了8个CDR-H3随机文库。
如前所述进行生物筛选和噬菌体酶免疫测定以分离阳性克隆(Barbas CF.《噬菌体展示：实验室手册(Barbas CF.Phage display:a laboratory manual.)》，纽约冷泉港冷泉港实验室出版社；2001；也要参见实施例8)。选择展现对FAM19A5具有较高反应性的噬菌体克隆，并通过sanmger测序法确定其核苷酸序列。图16B-16C提供了使用SDS-PAGE和Western Blotting测定的候选克隆(即2-13D-37-1.5W-41和2-13D-37-3W-16)的大小和表达水平。图17A中提供了候选克隆(即2-13D-37-1.5W-41和2-13D-37-3W-16)与脱免疫克隆2-13D-37的序列比较。与2-13D-37抗体相比，通过ELISA测定，这些亲和力成熟的脱免疫抗体展示出与FAM19A5蛋白的结合更强(图17B)。
实施例11：改善脱免疫的3-2抗体的理化性质
为了改善脱免疫的抗FAMI9A5抗体的理化性质，使用来自轻链CDR1、CDR2和CDR3以及来自3-2抗体的重链CDR 1和CDR2的随机序列构建噬菌体展示文库。为构建CDR定点突变文库，使用编码脱免疫克隆3-2从scFv的基因为模板进行PCR。用编码NNK简并密码子(N＝A，T，G或C，K＝G或T)的寡核苷酸将CDR中的四个或五个连续残基随机化，如前所述。Lee，y.，等人，《分子与实验医学(Experimental&Molecular Medicine)46：ell4(2014)。通过PCR方法在除CDRH3外的5个CDR中引入随机密码子。通过重叠延伸PCR扩增的scFv片段亚克隆到噬菌体载体中，并转化到ER2738(New England BioLabs)中用于噬菌体制备，如上所述。图12。
如前所述进行生物筛选和噬菌体酶免疫测定以分离阳性克隆(Barbas CF(BarbasCF.《噬菌体展示：实验室手册(Barbas CF.Phage display:a laboratory manual.)》，冷泉港实验室出版社；2001).选择对FAM19A5具有反应性的噬菌体克隆，并通过sanger测序确定其核苷酸序列。如前所述计算单个克隆的固有溶解度分数和GRAVY分数。Sormanni，p.，等人，《科学报告(Scientific Reports)》7(l)：8200(2017)。选择溶解度提高但对FAM19A5表现出类似反应性的克隆：(i)具有低等电点(“PI值偏低”)的抗体，(ii)1-17，(iii)1-30，(iv)1-32，(v)4-11和(vi)6-10。图13A和13B中显示了结果。图14A和14B中分别提供了不同脱免疫变体3-2抗体的VH和VL序列与野生型3-2抗体的序列比较。
实施例12：2-13抗体的HDX-MX表位作图
如下所述利用氢/氘交换质谱法(HDX-MS)探测克隆2-13抗FAM19A5抗体的人FAM19A5的结合表位。见图18。
FAM19A5最大覆盖条件的优化
在表位作图实验之前，进行非氘化实验以产生FAM19A5蛋白的常见肽列表。分别采用离线和在线胃蛋白酶消化法消化FAM19A5蛋白。Houde，D.，等人，《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》988：269-89(2013)。在线消化法是使用胃蛋白酶固定化柱(～20℃)，并通过调节流速调节反应的效率。离线法是用胃蛋白酶在4℃下人工消化FAM19A5蛋白5分钟，然后将混合物上样到液相色谱柱上进行分析。为了确定最大蛋白复盖率的条件，调整以下一个或多个参数：磷酸钾、磷酸钠、淬火保持时间、还原剂(TCEP)、尿素浓度和胃蛋白酶浓度。使用Waters PLGS软件分析生成的原始质谱(MS)数据，以确定是否获得最大的蛋白覆盖率。为了确认实验的重复性，每个实验条件重复至少两次，并确认产生的肽。图19显示了使用的不同实验条件和达到的覆盖率。
在以下条件下观察到最大覆盖率：IM TCEP、2M尿素(pH2.66)和1：2浓度的胃蛋白酶。如图20A和20B所示，使用这些条件，鉴定了44个肽片段，其覆盖了大约97％的FAM19A5蛋白。
2.FAM19A5表位作图
为了获得最大(100％)结合(Kd＝1nM)，即使抗体-蛋白复合物在标记缓冲液中稀释15倍，抗原-抗体复合物样品在氢/氘标记前至少孵育3小时。标记后，使用平衡缓冲液使样品达到相同体积。
为了开始标记反应，将在1：15标记缓冲液中稀释的2.5μL制备的样品(单独的抗原、单独的抗体或抗原-抗体复合物)与D2O标记溶液(1.8pM)混合。在不同的时间段进行反应：0分钟(即非氘)、20秒、10分钟、60分钟和240分钟。对于非氘反应，将制备的样品与平衡缓冲液混合。在每个标记期结束时，用淬灭缓冲液停止反应。然后对样品进行涡流处理，立即冷冻在液氮中，并在-80℃下保存至分析。
在用质谱仪分析之前，允许融化储存的冷冻样品，然后用胃蛋白酶在冰上消化约5分钟(即，上述离线方法)。使用软件程序Dynamx3.0TM(Waters)绘制了所得的相对氘水平与交换时间的关系图。最终序列覆盖和冗余数据如图21所示。
图22A-22E和23A-23C显示了每个已鉴定肽的氘摄取数据(单一抗原/抗体&抗原-抗体复合物)的比较(见图21)。如图所示，在下列肽序列中观察到显著的氘摄取：(i)ACRKGQIAGTTRARPAC(SEQ ID NO：101的残基37-53)，(ii)ACRKGQIAGTTRARPACVD(SEQ IDNO：101的残基37-55)，(iii)ACRKGQIJATTRARPACVDA(SEQ ID NO：101的残基37-56)，(iv)ARIIKTKQWC(SEQ ID NO：101的残基56-65)，(v)ARIKTKQWCDM(SEQ ID NO：101的残基56-67)，(vi)ARIIKTKQWCDML(SEQ ID NO：101的残基56-68)，(vii)ARIIKTKQWCDMLPCL(SEQ IDNO：101的残基56-71)，(viii)RIIKTKQWCDM(SEQ ID NO：101的残基57-67)，和(ix)RIIKTKQWCDML(SEQ ID NO：101的残基57-68)。
利用上述结果构建热图，鉴定FAM19A5蛋白内单抗原/抗体样品和抗原-抗体复合物之间氘摄取差异最显著的区。如图24中所示，SEQ ID NO：101的氨基酸残基38-50(CRKGQIAGGTTRAR)和氨基酸残基51-64(PACVDARIKTKQW)被鉴定为2-13抗体的重要结合残基。图25中显示了这些残基在FAM19A5蛋白三维结构中的位置。
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Claims (22)

1.一种抗FAM19A5抗体，为分离的抗体或其抗原结合部分，其与人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)蛋白特异性结合，所述抗FAM19A5抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其特征在于，
(i)所述重链CDR1由SEQ ID NO：16或19所示的氨基酸序列组成；
(ii)所述重链CDR2由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成；
(iii)所述重链CDR3由SEQ ID NO：18、128或129所示的氨基酸序列组成；
(iv)所述轻链CDR1由SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列组成；
(v)所述轻链CDR2由SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列组成；以及
(vi)所述轻链CDR3由SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其特征在于，所述重链CDR1由SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列组成；所述重链CDR2由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成；以及所述重链CDR3由SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其特征在于，所述重链CDR1由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成；所述重链CDR2由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成；以及所述重链CDR3由SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其特征在于，所述重链CDR1由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成；所述重链CDR2由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成；以及所述重链CDR3由SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其特征在于，所述重链CDR1由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成；所述重链CDR2由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成；以及所述重链CDR3由SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其特征在于，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH由与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列组成，其中VL由与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区由SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区由SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区由SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成。
10.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗FAM19A5抗体与参照抗体交叉竞争，所述参照抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区由SEQ IDNO：131所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗体选自由以下组成的群组：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、其变体及其任何组合。
12.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗FAM19A5抗体为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
13.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗FAM19A5抗体包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv(scFv)。
14.根据权利要求13所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗FAM19A5抗体为scFv。
15.根据权利要求14所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述scFv包含VH和VL，
(a)VH由SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成；
(b)VH由SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成；
(c)VH由SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成；或
(d)VH由SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列组成，并且VL由SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列组成。
16.根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体，其中，所述抗体展现出一种或多种以下特性：
(a)与可溶性人FAM19A5结合，通过ELISA测得的KD为10nM或更小；或
(b)与膜结合人FAM19A5结合，通过ELISA测定KD为10nm或更小。
17.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体。
18.一种载体，其包含根据权利要求17所述的核酸。
19.一种细胞，其包含根据权利要求18所述的载体。
20.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体、根据权利要求17所述的核酸、根据权利要求18所述的载体、或根据权利要求19所述的细胞，以及载体。
21.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的抗FAM19A5抗体、根据权利要求17所述的核酸、根据权利要求18所述的载体、或根据权利要求19所述的细胞，和使用说明书。
22.一种产生与人FAM19A5蛋白特异性结合的抗FAM19A5抗体的方法，其包含在合适的条件下培养根据权利要求19所述的细胞并分离所述抗体。
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