JP2008521426A - ドメイン抗体への複合体化により血清半減期が延長されたｐｌａｄドメインペプチド - Google Patents

ドメイン抗体への複合体化により血清半減期が延長されたｐｌａｄドメインペプチド Download PDF

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Abstract

ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体を含む、薬物組成物、薬物融合体、および薬物複合体を提供する。その薬物融合体および薬物複合体は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントと融合または複合体化されているＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体を含む。薬物組成物、薬物融合体、および薬物複合体は、非複合体化または非融合の治療薬または診断薬と比較してより長いin vivo半減期を有する。

Description

関連出願
本出願は、米国を指定し２００５年１１月１０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００４３１９号の一部継続出願であり、かつ、２００４年１２月２日に出願された米国仮出願第６０／６３２，３６１号の利益を請求している米国を指定し２００５年５月３１日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２１６３号の一部継続出願である。上記出願の教示全体を参照により本明細書に組み込む。
発明の背景
治療および／または診断目的に有用と思われる活性を保持する多くの薬物は、投与しても身体から急速に排出されるため、限定的な価値しか有しない。例えば、治療上有用な活性を有する多くのポリペプチドは腎臓を経て血液循環から急速に排出される。従って、所望の治療効果を実現するためには高用量を投与しなければならない。改善した薬物動態特性を有する改善した治療薬および診断薬が必要とされている。血清アルブミンに結合するポリペプチドは当技術分野で公知である［例えば、ＥＰ ０４８６５２５ Ｂ１（Cemu Bioteknik AB）、ＵＳ ６，２６７，９６４ Ｂ１（Nygrenら）、ＷＯ ０４／００１０６４ Ａ２（Dyax, Corp.）；ＷＯ ０２／０７６４８９ Ａ１（Dyax, Corp.）、ＷＯ ０１／４５７４６（Genentech, Inc.）を参照］。
発明の要旨
本発明は、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体を含む薬物組成物、薬物融合体、および薬物複合体に関する。一態様では、本発明は、Ｘ’部分およびＹ’部分を含む薬物融合体であって、Ｘ’がＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体であり、かつＹ’がin vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分である、薬物融合体である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合性部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する。例えば、ポリペプチド結合性部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントでありうる。
ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸と同一である少なくとも約１０個連続したアミノ酸の領域を含むのが好ましい。例えば、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有しうる。別の例では、前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列は、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、薬物融合体はＸ’部分およびＹ’部分を含み、その際、Ｘ’はＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体であり、Ｙ’は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。そのような実施形態では、Ｘ’はＹ’のアミノ末端に位置していてもよく、またはＹ’がＸ’のアミノ末端に位置していてもよい。好ましくは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する。
ある実施形態では、Ｙ’は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｙ’は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸と同一である少なくとも約１０個連続したアミノ酸の領域を含むのが好ましい。例えば、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有しうる。別の例では前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列は、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
他の態様では、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと共有結合しているＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体とを含む薬物複合体（drug conjugate）である。一部の実施形態では、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体は、リンカー部分を介して、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと共有結合している。
ある実施形態では、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸と同一である少なくとも約１０個連続したアミノ酸の領域を含むのが好ましい。例えば、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有しうる。別の例では、前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列は、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
本発明はまた、本発明の薬物融合体をコードする、単離核酸または組換え核酸および核酸構築体にも関する。本発明はまた、本発明の組換え核酸を含む宿主細胞、および前記組換え核酸の発現に適当な条件下でその宿主細胞を維持し、それによって薬物融合体を生成させることを含む薬物融合体を生成する方法にも関する。
本発明はまた、本発明の薬物融合体または薬物複合体および生理学的に許容される担体を含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、炎症性疾患を患う個体を治療する方法であって、前記個体に、本発明の薬物複合体または薬物融合体の治療有効量を投与することを含む方法にも関する。特定の実施形態では、炎症性疾患が関節炎である。
本発明はまた、治療、診断、または予防に使用する薬物複合体または薬物融合体、ならびに本明細書に開示する疾患（例えば関節炎）などの炎症性疾患治療用の医薬品を製造するための、本発明の薬物複合体または薬物融合体の使用にも関する。
本発明はまた、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分に結合している、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体を含む薬物組成物であって、前記薬物組成物が、前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体に比べてより長いin vivo血清半減期を有し、かつ前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体の活性の少なくとも約９０％を有する、薬物組成物に関する。
本発明は、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドとを含む複合体タンパク質または融合タンパク質に関する。例えば、血清アルブミン、アルブミン断片、またはアルブミン変異体、または新生仔Ｆｃ受容体。本明細書に記載したように、本発明の複合体においては、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドとは、直接的または間接的に、共有結合または非共有結合により複合体化されうる。本発明の融合タンパク質においては、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドとは、任意の所望の向きで単一コピーまたは複数コピーで存在させることができる。
発明の詳細な記載
本明細書では、明瞭簡潔な明細書を書くことができるように実施形態は記載されているが、本発明から逸脱することなく、実施形態は様々に組み合わせ、または分離しうるものと意図され理解されるであろう。
本発明の実施形態のどれか一つと同じ構造式を有する物質の公知組成物はそれ自体明白に除かれる。それに対して、新規な当該組成物、既知の組成物の新規な組合せ、既知の組成物の新規な使用、または既知の組成物が関与する新規な方法は除かれない。
本明細書で使用する「薬物（drug）」は、個体において生物学的標的分子と結合し、かつ／またはその機能を改変することにより有益な治療的または診断的効果を生じさせるために、その個体へ投与されうる任意の化合物（例えば、小有機分子、核酸、ポリペプチド）をさす。標的分子は、個体のゲノムによってコードされる内在性標的分子（例えば、その個体のゲノムによってコードされる酵素、受容体、増殖因子、サイトカイン）、または病原体ゲノムによってコードされる外来性標的分子（例えば、ウイルス、細菌、真菌、線虫、または他の病原体のゲノムによってコードされる酵素）でありうる。
本明細書で使用する「薬物組成物（drug composition）」は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合性部位）を含むポリペプチド結合性部分と共有結合または非共有結合している薬物を含む組成物をさす。薬物組成物は、薬物が、ポリペプチド結合性部分と共有結合または非共有結合している複合体でありうる。薬物は、直接的または間接的に［例えば、適当なリンカーおよび／または相補的結合パートナー同士の非共有結合（例えば、ビオチンおよびアビジン）により］ポリペプチド結合性部分と共有結合または非共有結合させることができる。相補的結合パートナーを使用する場合、直接的または適当なリンカー部分を介して結合パートナーの一つに薬物を共有結合させることができ、その相補的結合パートナーは、直接または適当なリンカー部分を介してポリペプチド結合性部分と共有結合することができる。薬物が、ポリペプチドまたはペプチドである場合、薬物組成物は融合タンパク質であってよく、その際、ポリペプチドもしくはペプチド薬物とポリペプチド結合性部分とは、連続したポリペプチド鎖の別個の部分（成分）である。
本明細書で使用する「複合体（conjugate）」は、薬物に結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント、を含む組成物をさす。そのような複合体は、薬物が共有結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む「薬物複合体」、および薬物が非共有結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む「非共有結合性薬物複合体」を含む。
本明細書で使用する「薬物複合体」は、薬物が共有結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む組成物をさす。薬物は、直接的に、または適当なリンカー部分を介して間接的に、抗原結合性フラグメントと共有結合させることができる。薬物は、アミノ末端やカルボキシ末端など、任意の適当な位置で、または適当なアミノ酸側鎖（例えば、リジンのεアミノ基）を通じて抗原結合性フラグメントと結合させることができる。
本明細書で使用する「非共有結合性薬物複合体」は、薬物が非共有結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む組成物をさす。薬物は、直接（例えば、静電相互作用、疎水的相互作用）または間接的に［例えば、一つのパートナーを薬物と共有結合させ、その相補的結合パートナーを抗原結合性フラグメントと共有結合させる、相補的結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結合により］抗原結合性フラグメントと非共有結合させることができる。相補的結合パートナーを使用する場合、結合パートナーの一つは、直接的にまたは適当なリンカー部分を介して、薬物と共有結合させることができ、その相補的結合パートナーは、直接的にまたは適当なリンカー部分を介して、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントと共有結合させることができる。
本明細書で使用する「薬物融合体」は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントと、ポリペプチド薬物とを含む融合タンパク質をさす。血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントとポリペプチド薬物は、単一の連続したポリペプチド鎖の別個の部分（成分）として存在する。
本明細書で使用する「薬物基準（drug basis）」という用語は、活性を評価し、測定し、または決定するために使用する薬物（または薬物部分）量に基づいて標準化した薬物組成物および薬物の活性をさす。全体的に、本発明の薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、それが含む薬物よりも分子量が大きい。従って、等量の重量の薬物組成物および薬物は、分子比またはモル比で異なる量の薬物を含む。例えば、本発明の薬物組成物の分子量が、それが含む薬物の分子量の２倍である場合、２μｇの薬物組成物および１μｇの薬物を使用する「薬物基準」で活性を決定することができる。これらの量には（遊離薬物または薬物組成物の一部として）同量の薬物が含まれるからである。活性は、適切な計算を用いる「薬物基準」により、例えば、標的結合部位基準当たり、または酵素薬物には活性部位基準当たりの活性を表すことによって標準化し表すことができる。
本明細書で使用する「インターロイキン１受容体アンタゴニスト」（ＩＬ−１ｒａ）は、天然に存在する、すなわち内在性の哺乳動物のＩＬ−１ｒａタンパク質、ならびに天然に存在する、すなわち内在性の対応する哺乳動物のＩＬ−１ｒａタンパク質のアミノ酸配列と同じであるアミノ酸配列を有するタンパク質［例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学の方法を使用し作製したもの）］をさす。従って、本明細書で定義するように、その用語は、成熟タンパク質、多型変異体もしくは対立形質変異体、およびＩＬ−１ｒａの他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞内プロセスによって産生されるもの）、およびこれらの修飾形態（例えば、脂質付加、グリコシル化、ＰＥＧ化したもの）もしくは未修飾形態を含む。天然に存在する、すなわち内在性のＩＬ−１ｒａには、哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類）で天然に存在する野生型タンパク質、例えば、成熟ＩＬ−１ｒａ、多型変異体もしくは対立形質変異体、および他のアイソフォームを含む。そのようなタンパク質は、例えば、ＩＬ−１ｒａを天然に産生する供給源から回収し、または単離することができる。これらのタンパク質、ならびに天然に存在し、すなわち内在性の対応するＩＬ−１ｒａと同じアミノ酸配列を有するＩＬ−１ｒａタンパク質は、その対応する哺乳動物の名前によって呼ばれる。例えば、その対応する哺乳動物がヒトである場合、そのタンパク質はヒトＩＬ−１ｒａと表される。
ＩＬ−１ｒａの「機能性変異体」には、機能性フラグメント、機能性突然変異タンパク質、および／または機能性融合タンパク質が含まれ、これらは適当な方法［例えば、突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発）、組換えＤＮＡ技術］を使用し生成することができる。「機能性変異体」はインターロイキン−１の１型受容体と拮抗する。一般的に、ＩＬ−１ｒａのフラグメントまたは一部分には、成熟ＩＬ−１ｒａと比較して、アミノ酸（すなわち、一個または複数のアミノ酸）が欠失かつ／または付加（すなわち、一個または複数のアミノ酸が欠失かつ／または付加）されているもの（例えば、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、または内部欠失）が含まれる。成熟ＩＬ−１ｒａと比較して、連続したアミノ酸だけが欠失し、または非連続のアミノ酸が欠失しているフラグメントまたは一部分も想定される。
ヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体は、ヒトＩＬ−１ｒａの成熟１５２アミノ酸形態に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ヒトインターロイキン−１の１型受容体に拮抗することができる。［Eisenbergら、Nature 343:341-346（1990）を参照。］その変異体は、一個または複数の追加のアミノ酸を含むことができる（例えば、１５３、１５４またはそれ以上の数のアミノ酸を含む）。例えば、変異体ＩＬ−１ｒａは、アミノ末端メチオニン残基に続く配列番号３３の残基２６〜１７７からなるアミノ酸配列を含むことができる。［KINERET（登録商標）（anakinra）, Amgen Inc.］
本明細書で使用する「サポリン」は、サポナリアオフィシナリス（Saponaria officinalis）という植物によって産生される、一本鎖リボソームを不活化するポリペプチドのファミリーをさす［Stirpe, F.ら、Biochem. J. 216:617-625（1983）, Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820（2003）］。サポリンポリペプチドは、長さおよび／またはアミノ酸配列が異なる数種の形態で存在する［例えば、Id.およびBarthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541-6548（1993）を参照］。サポリン−６は、サポリンの中で最も活性な形態である。（Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820（2003））。成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置４８のアミノ酸がＡｓｐまたはＧｌｕであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置９１のアミノ酸がＡｒｇまたはＬｙｓである、天然に存在するサポリン−６のアイソフォームが少なくとも４種記載されている。（Barthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541-6548（1993））。別の形態のサポリン−６には、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置９９のアミノ酸がＳｅｒまたはＬｅｕであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１３４のアミノ酸がＧｌｎまたはＬｙｓであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１４７のアミノ酸がＳｅｒまたはＬｅｕであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１４９のアミノ酸がＳｅｒまたはＰｈｅであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１６２のアミノ酸がＡｓｐまたはＡｓｎであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１７７のアミノ酸がＡｌａまたはＶａｌであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１８８のアミノ酸がＩｌｅまたはＴｈｒであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１９６のアミノ酸がＡｓｎまたはＡｓｐであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置１９８のアミノ酸がＧｌｕまたはＡｓｐであり、成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置２３１のアミノ酸がＡｓｎまたはＳｅｒであるポリペプチド、および成熟ポリペプチド（配列番号６１）の位置２３３のアミノ酸がＬｙｓまたはＡｒｇであるポリペプチドが含まれる。（前掲）。これらのアイソフォームおよび変異体を包含するコンセンサス配列を図１４Ｇに示す（配列番号６３）。
従って、「サポリン」という用語には、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、または組換え手法で産生したポリペプチドを含め、前駆体タンパク質、成熟ポリペプチド、未変性タンパク質、多型変異体もしくは対立形質変異体、および他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞内プロセスによって産生されるもの）、ならびに前記のものの修飾形態（例えば、脂質付加、グリコシル化、ＰＥＧ化したもの）または未修飾形態が含まれる。天然に存在する、すなわち内在性のサポリンには、野生型タンパク質、例えば、成熟サポリン（例えば、成熟サポリン−６）、多型変異体もしくは対立形質変異体、およびサポナリアオフィシナリス中で天然に生じる他のアイソフォームが含まれる。そのようなタンパク質は、任意の適当な方法を使用して、サポナリアオフィシナリスから回収し、または単離することができる。サポリンの「機能性変異体」には、機能性フラグメント、機能性突然変異タンパク質、および／または機能性融合タンパク質が含まれ、これらは適当な方法［例えば、突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発）、組換えＤＮＡ技術］を使用し生成することができる。一般的に、サポリン（例えば、サポリン−６）のフラグメントまたは一部分には、成熟サポリンと比較して、アミノ酸（すなわち、一個または複数のアミノ酸）が欠失かつ／または付加（すなわち、一個または複数のアミノ酸が欠失かつ／または付加）されているもの（例えば、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、または内部欠失）が包含される。成熟サポリンと比較して、連続したアミノ酸だけが欠失しているか、または非連続のアミノ酸が欠失しているフラグメントまたは一部分も想定される。様々なサポリン機能性変異体を調製することができる。例えば、アミノ末端伸長を含むサポリン−６の融合タンパク質が調製され、それはウサギ網状赤血球ライセートアッセイにおいて完全リボソーム阻害活性を保持することが示されている。（Barthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541-6548（1993））。活性部位残基Ｔｙｒ７２、Ｔｙｒ１２０、Ｇｌｕ１７６、Ａｒｇ１７９、またはＴｒｐ２０８（配列番号６１の第７２、１２０、１７６、１７９、または２０８のアミノ酸）がアラニンに置換されている変異体またはサポリン−６では、in vitroアッセイで細胞傷害活性が低減した。（Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820（2003））。従って、サポリンの別の機能性変異体を調製したいと望むならば、これらの活性部位残基の変異、置換、交換、欠失、または修飾は避けるべきである。天然に存在する成熟ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含むサポリン機能性変異体は、少なくともその活性部位を含むことが好ましい。例えば、天然に存在する成熟サポリン−６よりも少ないアミノ酸を含むサポリン−６変異体は、成熟サポリン−６の活性部位残基［Ｔｙｒ７２、Ｔｙｒ１２０、Ｇｌｕ１７６、Ａｒｇ１７９、およびＴｒｐ２０８（配列番号６１の第７２、１２０、１７６、１７９、および２０８のアミノ酸）］を含むことができ、少なくとも約１３７アミノ酸長、少なくとも約１５０アミノ酸長、少なくとも約１７５アミノ酸長、少なくとも約２００アミノ酸長、少なくとも約２２５アミノ酸長、または少なくとも約２５０アミノ酸長でありうる。
サポリンの「機能性変異体」は、リボソームを不活化する活性（例えば、ｒＲＮＡ Ｎ−グリコシダーゼ活性）および／または細胞傷害活性を有する。そのような活性は、公知のウサギ網状赤血球ライセートアッセイ、または腫瘍細胞系を使用する公知の細胞毒性アッセイのいずれかを使用するタンパク質合成の阻害など、任意の適当な方法を使用し、容易に評価することができる［例えば、Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820（2003）およびBarthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541-6548（1993）を参照］。
いくつかの実施形態では、サポリンの機能性変異体は、成熟サポリン−６（配列番号６１）に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
本発明は、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分とを含む薬物組成物に関する。血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントを含む薬物組成物に関して本明細書に詳述するように、薬物とポリペプチド結合性部分は、互いに共有結合または非共有結合していてよい。いくつかの実施形態では、薬物組成物は、ポリペプチド薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含むポリペプチド結合性部分とを含む融合タンパク質である。他の実施形態では、薬物組成物は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含むポリペプチド結合性部分に共有結合または非共有結合している薬物を含む。
典型的には、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドは、in vivoで天然に存在し、かつ生物（例えばヒト）から望ましくない物質を除去する内在性機序による分解または除去に耐性を有するポリペプチドである。例えば、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドは、細胞外マトリックス由来タンパク質、血中に見られるタンパク質、血液脳関門または神経組織で見られるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚、または骨に局在するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、またはＦｃ輸送に関与するタンパク質から選択することができる。
in vivo血清半減期を延長する好適なポリペプチドには、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経医薬融合タンパク質（米国特許第５，９７７，３０７号を参照、その教示を参照により本明細書に組み込む）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子Ｘ、α１−アンチトリプシン、およびＨＮＦ１αが含まれる。血清半減期を延長する適当なポリペプチドには、α−１糖蛋白（オロソムコイド；ＡＡＧ）、α−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、α−１ミクログロブリン（タンパク質ＨＣ；ＡＩＭ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）、アポリポプロテインＡ−１（Ａｐｏ Ａ−１）、アポリポプロテインＢ（Ａｐｏ Ｂ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１ ＩＮＨ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスサイレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、およびリウマチ因子（ＲＦ）も含まれる。
細胞外マトリックスに由来する好適なタンパク質には、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン、およびフィブロネクチンが含まれる。コラーゲンは、主要な細胞外マトリックスタンパク質である。現在、約１５種類のコラーゲン分子が知られ、身体の様々な箇所で見つかっており、例えば、Ｉ型コラーゲン（身体のコラーゲンの９０％を占める）は骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内臓に見られ、またはＩＩ型コラーゲンは軟骨、椎間板、脊索、および眼の硝子体液に見られる。
血液由来の好適なタンパク質には、例えば、血漿タンパク質［例えば、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ）、血清アミロイドプロテインＡ、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ−２−ミクログロブリン］、酵素および酵素インヒビター（例えば、プラスミノゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α−１−アンチトリプシン、および膵臓トリプシンインヒビター）、免疫系タンパク質、例えば、免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ））、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α−１ミクログロブリン）、デフェンシン（例えば、β−デフェンシン１、好中球デフェンシン１、好中球デフェンシン２、および好中球デフェンシン３）などが含まれる。
血液脳関門または神経組織に見られる好適なタンパク質には、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸トランスポーターなどが含まれる。
in vivo血清半減期を延長する好適なポリペプチドには、腎臓に局在するタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機アニオントランスポーターＫ１、ヘイマン抗原）、肝臓に局在するタンパク質（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｇ２５０）、肺に局在するタンパク質（例えば、ＩｇＡに結合する分泌成分）、心臓に局在するタンパク質（例えばＨＳＰ２７、これは拡張型心筋症に関連する）、皮膚に局在するタンパク質（例えばケラチン）、骨特異的タンパク質、例えば、形態形成タンパク質（ＢＭＰ）で、これは骨形成活性を示すタンパク質のトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８）、腫瘍特異的タンパク質、例えば、栄養芽細胞抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、肝臓および脾臓に見られるカテプシンＢ））も含まれる。
好適な疾患特異的タンパク質には、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテジェリンリガンド（ＯＰＧＬ、Nature 402, 304-309（1999）参照）、ＯＸ４０［ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバー。活性化したＴ細胞に発現し、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を産生する細胞で特異的に上方調節される。Immunol. 165（1）:263-70（2000）参照］を含め、活性化したＴ細胞にのみ発現する抗原が含まれる。適当な疾患特異的タンパク質には、例えば、ＣＧ６５１２ショウジョウバエ、ヒトパラプレギン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、マウスｆｔｓＨを含む（関節炎／癌に関連する）メタロプロテアーゼ；および酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦα）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、アンジオゲニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ミッドカイン血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）を含む血管新生増殖因子、およびフラクタルカインも含まれる。
in vivo血清半減期を延長する好適なポリペプチドには、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）などのストレスタンパク質も含まれる。通常、ＨＳＰは細胞内に見られる。ＨＳＰが細胞外で見られる場合、それは細胞が死滅し、その中身が溢れ出たという指標である。外傷、疾患、または損傷の結果、細胞外ＨＳＰが免疫系から応答を誘発する時、このプログラムされていない細胞死（壊死）が生じる。細胞外ＨＳＰと結合することによって、本発明の組成物を疾患部位に局在化することができる。
Ｆｃ輸送に関与する好適なタンパク質には、例えば、ブラムベル（Brambell）受容体（ＦｃＲＢとしても知られる）が含まれる。このＦｃ受容体は、送達に潜在的に有用な２つの機能を有する。それらの機能とは（１）胎盤を通して母から子供にＩｇＧを輸送すること（２）分解からＩｇＧを保護し、それによってその血清半減期を延長することである。その受容体は、エンドソームからＩｇＧを再生すると考えられる（Holligerら、Nat Biotechnol 15（7）:632-6（1997）を参照）。
本発明での使用に好適なアルブミン、アルブミンフラグメント、またはアルブミン変異体の例は、国際公開第２００５／０７７０４２ Ａ２号に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。特に、以下のアルブミン、アルブミンフラグメント、またはアルブミン変異体を本発明で使用することができる。
− 配列番号１（国際公開第２００５／０７７０４２ Ａ２号に開示され、この配列を参照により明白に本開示に組み込む）、
− 国際公開第２００５／０７７０４２ Ａ２号の配列番号１のアミノ酸１〜３８７を含み、またはそれからなるアルブミンフラグメントまたは変異体、
− 以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン、またはそのフラグメントもしくは変異体：（ａ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸５４〜６１、（ｂ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸７６〜８９、（ｃ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸９２〜１００、（ｄ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６、（ｅ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２、（ｆ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７、（ｇ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８、（ｈ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８、（ｉ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７（ｊ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５、（ｋ）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；および（１）国際公開第２００５／０７７０４２Ａ２号の配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６。
本発明によるＴＮＦＲ１結合リガンドにおいて使用するのに好適なアルブミン、フラグメント、および類似体のさらなる例は、国際公開第０３／０７６５６７ Ａ２号に記載され、その全体を参照により本明細書に組み込む。特に、以下のアルブミン、フラグメント、または変異体を本発明で使用することができる。
− 国際公開第０３／０７６５６７ Ａ２号、例えば、図３に記載されているヒト血清アルブミン（この配列情報を参照により明白に本開示に組み込む）、
− 式分子量が６６，５００である５８５アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン（ＨＡ）［Melounら、FEBS Letters 58:136（1975）; Behrensら、Fed. Proc. 34:59（1975）; Lawnら、Nucleic Acids Research 9:6102-6114（1981）; Minghettiら、J. Biol. Chem. 261:6147（1986）を参照］、
− Weitkampら、Ann. Hum. Genet. 37:219（1973）に記載されているアルブミンの多型変異体または類似体またはフラグメント、
− 欧州特許第３２２０９４号に記載されているアルブミンフラグメントまたは変異体、例えば、ＨＡ（１−３７３）、ＨＡ（１−３８８）、ＨＡ（１−３８９）、ＨＡ（１−３６９）、およびＨＡ（１−４１９）、ならびに１〜３６９および１〜４１９のフラグメント、
− 欧州特許第３９９６６６号に記載されているアルブミンフラグメントまたは変異体、例えば、ＨＡ（１−１７７）およびＨＡ（１−２００）、ならびにＨＡ（１〜Ｘ）（Ｘは１７８〜１９９の任意の数）のフラグメント。
本発明の薬物組成物は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むあらゆるポリペプチド結合性部分を含むことができる。ポリペプチド結合性部分は、別個の分子実体として、少なくとも３１、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０個のアミノ酸、少なくとも約９０個のアミノ酸、少なくとも約１００個のアミノ酸、または少なくとも約１１０個のアミノ酸を含むのが好ましい。好ましくは、ポリペプチド結合性部分は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドと、少なくとも約５ｍＭ ＫＤのＫＤ［ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋａ）］で結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合性部分は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドと、表面プラズモン共鳴によって（例えばビアコアの装置を使用して）決定したＫＤ、約１０〜約１００ｎＭ、または約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約５００ｎＭ〜約５ｍＭで結合する。特定の実施形態では、ポリペプチド結合性部分は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドと、ＫＤ約５０ｎＭ、または約７０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約１５０ｎＭ、または約２００ｎＭで結合する。
好ましくは、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分は、原核生物または細菌のポリペプチドまたはペプチドではない。好ましくは、ポリペプチド結合性部分は、真核生物、哺乳動物、またはヒトのポリペプチドまたはペプチドである。
ある実施形態では、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分は、折り畳まれたタンパク質ドメインである。他の実施形態では、ポリペプチド結合性部分の分子量は、別個の分子実体として少なくとも約４ＫＤａ、少なくとも約４．５ＫＤａ、少なくとも約５ＫＤａ、少なくとも約５．５ＫＤａ、少なくとも約６ＫＤａ、少なくとも約６．５ＫＤａ、少なくとも約７ＫＤａ、少なくとも約７．５ＫＤａ、または少なくとも約８ＫＤａである。
in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含む好適なポリペプチド結合性部分は、任意の適当な方法、例えば、天然に存在するか、または天然に存在しないポリペプチドを適当な接着アッセイでスクリーニングする方法を使用し同定することができる。本明細書に記載したように、好ましいin vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対する抗原結合部位を有するポリペプチド結合性部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントである。しかし、in vivo血清半減期を延長する他のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントも本発明に使用することができる。
所望の場合には、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントの一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、その抗体または抗原結合性フラグメントの抗原結合特異性を保持する非免疫グロブリン構造に構成することができる。本発明の薬物組成物は、そのような非免疫グロブリン結合性部分を含むことができる。そのような非免疫グロブリン結合性部分は、任意の適当な方法を使用し調製することができ、例えば、エピトープに特異的に結合するポリペプチド結合性部分を生成するために、ＣＤＲ移植のための骨格（scaffold）としてＳｐＡなどの天然細菌の受容体が使用されてきた。この手順の詳細は、米国特許出願第５，８３１，０１２号に記載されており、その教示を参照により本明細書に組み込む。他の適当な骨格には、フィブロネクチンおよびアフィボディをベースとする骨格が含まれる。適当な手順の詳細は、国際公開第９８／５８９６５号に記載されている。他の適当な骨格には、van den Beukenら、J. Mol. Biol. 310:591-601（2001）に記載されているリポカリン（lipocallin）およびＣＴＬＡ４、ならびに国際公開第００／６９９０７号（Medical Research Council）に記載されている骨格などが含まれ、それらの骨格は、例えば、細菌ＧｒｏＥＬまたは他のシャペロンポリペプチドの環構造をベースとしている。
いくつかの実施形態では、本発明の薬物組成物は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する非免疫グロブリン結合性部分を含み、その非免疫グロブリン結合性部分は、本明細書に記載したＶＨ、Ｖκ、またはＶＨＨのＣＤＲのうち１、２、または３つと適切な骨格とを含む。ある実施形態では、非免疫グロブリン結合性部分は、本明細書に記載したＶＨ、Ｖκ、またはＶＨＨのＣＤＲ３を含むがＣＤＲ１またはＣＤＲ２は含まず、かつ適当な骨格を含む。他の実施形態では、非免疫グロブリン結合性部分は、本明細書に記載したＶＨ、Ｖκ、またはＶＨＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含むがＣＤＲ３は含まず、かつ適当な骨格は含む。他の実施形態では、非免疫グロブリン結合性部分は、本明細書に記載したＶＨ、Ｖκ、またはＶＨＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と適当な骨格を含む。他の実施形態では、薬物組成物は、本明細書に記載したＶＨ、Ｖκ、またはＶＨＨのＣＤＲ３のみと薬物を含む。
本発明の薬物組成物は、薬物融合体、薬物複合体、および非共有結合性薬物複合体を調製するために本明細書記載の方法などの適当な方法を使用して調製することができる。加えて、本発明の薬物組成物は、薬物融合体、薬物複合体、および非共有結合性薬物複合体に関して本明細書に詳述する利点および有用性を有する。
本発明は、薬物単独（非複合体化型薬物、非融合薬物）と比較して、改善された薬物動態特性（例えば、血清半減期の増大）、および他の利点を有する薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を提供する。それらの薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、および薬物融合体は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントと、一種または複数の所望の薬物とを含む。
本明細書に記載したように、本発明の薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、薬物単独と比較して、in vivo血清半減期を劇的に延長し、かつ／またはＡＵＣを増大させることができる。加えて一般的には、薬物の活性は、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）中で実質的に変化しない。しかし、薬物単独と比較して、薬物組成物の活性の幾分の変化は受容可能であり、一般的にはこの変化は薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の改善された薬物動態特性によって補われるものである。例えば、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、薬物標的と薬物単独よりも低い親和性で結合するかもしれないが、薬物組成物の薬物動態特性が改善（例えばin vivo血清半減期の延長、ＡＵＣの増大）されているために、薬物単独と比較しておよそ同等または優れた効力を有しうる。加えて、より少ない量の薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、および薬物融合体）を投与して所望の治療的または診断的効果を得ることができる。好ましくは、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の活性は、薬物単独の活性とせいぜい約１００倍、またはせいぜい約５０倍、またはせいぜい約１０倍、またはせいぜい約５倍、またはせいぜい約４倍、またはせいぜい約３倍、またはせいぜい約２倍異なるだけである。例えば、薬物のＫＤ、Ｋｉ、または中和用量５０（ＮＤ５０）が１ｎＭであり、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）のＫＤ、Ｋｉ、またはＮＤ５０が約２ｎＭ、または約３ｎＭ、または約４ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１０ｎＭでありうる。
好ましくは、薬物組成物の活性（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、薬物の活性と比較して実質的に減少しない。ある実施形態では、薬物組成物の活性は、薬物の活性と比較してせいぜい約１０％、せいぜい約９％、せいぜい約８％、せいぜい約７％、せいぜい約６％、せいぜい約５％、せいぜい約４％、せいぜい約３％、せいぜい約２％、せいぜい約１％減少するだけであるか、または実質的に変化しない。あるいは記載したように、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、薬物の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％を保持し、または薬物と実質上同じ活性を保持する。好ましくは、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）および薬物の活性を、「薬物基準」で決定し、かつ／または比較する。
本明細書に記載し示すように、本発明の薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、薬物単独よりも高い活性（例えば、in vivo活性）を有しうる。例えば、実施例６に示すように、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、マウスモデルでの関節炎の治療において、重量にて同じ用量（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合のＩＬ−１ｒａよりも有効であった。ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、その分子量がＩＬ−１ｒａの分子量の約２倍であるにもかかわらずより有効であった。すなわち、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａを与えたマウスは、ＩＬ−１ｒａを与えたマウスのＩＬ−１ｒａ（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ１−ｒａの一部分として）の約半分しか受容していなかったことになる。
ある実施形態では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、薬物よりも活性（例えば、in vivo活性）が高く、例えば、薬物組成物は、薬物の活性の少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、または少なくとも約５００％の活性を有する。好ましくは、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）および薬物の活性は、「薬物基準」で決定し、かつ／または比較する。薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）および薬物の活性は、好適なin vitro系またはin vivo系を使用して測定することができる。ある実施形態では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、in vivoで決定すると、それが含む薬物よりも高い活性を有する。他の実施形態では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、in vitroで決定すると、それが含む薬物よりも高い活性を有する。
血清アルブミンに対して結合特異性を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）はさらに利点を提供する。ドメイン抗体は、非常に安定性があり、抗体および他の抗体の抗原結合性フラグメントに比べて小さく、大腸菌または酵母（例えば、ピキア・パストリス）中で発現させることによって高収量で産生でき、また本明細書に記載したように、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合性フラグメントはヒト起源または所望する任意の種のライブラリーから容易に選択することができる。従って、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、哺乳動物細胞中で全体的に産生される治療薬（例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体）よりも容易に産生させることができ、免疫原性ではないｄＡｂを使用することができる（例えば、ヒトｄＡｂは、ヒトで疾患の治療または診断のための薬物融合体または薬物複合体に、使用することができる）。
薬物が、血清アルブミンと結合するポリペプチド結合性部分（例えば、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント）を含む薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の一部である場合、薬物の免疫原性が低減されうる。従って、血清アルブミンと結合するポリペプチド結合性部分（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む薬物組成物に関して、薬物は、（薬物単独よりも）免疫原性が低いか、または実質的に非免疫原性でありうる。従って、被験体の免疫系によって抗薬物抗体が産生されるために生じる効力の損失を最少にして、そのような薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を長時間に渡って繰り返し被験体に投与することができる。
加えて、本明細書に記載した薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、向上した安全プロフィールを有し、副作用も薬物単独より低い。例えば、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントの血清アルブミン結合活性の結果として、薬物融合体および複合体（薬物複合体、非共有結合性薬物複合体）の血管循環における滞留時間は増加する。加えて、これらの複合体および薬物融合体は、全身投与（例えば血管内投与）した後、血液脳関門を通過して中枢神経系に蓄積することは実質的にできない。従って、神経毒性または望ましくない向精神薬作用を持つ薬物を含む複合体（薬物複合体、非共有結合性薬物複合体）および薬物融合体は、薬物単独と比較して高い安全性および低い副作用で投与することができる。同様に、これらの複合体（薬物複合体、非共有結合性薬物複合体）および薬物融合体は、薬物単独よりも、特定の臓器（例えば、腎臓または肝臓）に対する毒性を低くすることができる。本明細書に記載した複合体および薬物融合体は、血管循環で薬物または薬物に結合する標的（例えば毒素）を隔離し、それによって薬物または組織上の標的の作用を減少（例えば毒の効果を阻害）させるために使用することもできる。
薬物動態を分析しin vivo半減期を決定するために適当な方法は、当技術分野で周知である。そのような方法は、例えば、Kenneth, Aら、Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists、およびPetersら、Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach（1996）に記載されている。『Pharmacokinetics』、 M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker,第２改訂版（1982）という参考文献もあり、この文献はｔαおよびｔβ半減期（ｔ１／２α、ｔ１／２β）および曲線下面積（ＡＵＣ）などの薬物動態パラメーターについて記載している。
半減期（ｔ１／２αおよびｔ１／２β）およびＡＵＣは、複合体または融合体の血清濃度の時間に対する曲線から決定することができる。WinNonlin分析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, USAから入手可能）を使用して、例えば、曲線をモデリングすることができる。第１相（α相）では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、多少除去されるが主として患者内に分散する。第２相（β相）は、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）が分散され、薬物組成物が患者から排出されるにつれて血清濃度が減少する最終相である。ｔα半減期は、第１相の半減期であり、ｔβ半減期は第２相の半減期である。従って、本発明は、１５分以上の範囲のｔα半減期を有する、本発明による薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）、または本発明による薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物を、提供する。一実施形態では、その範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間である。さらに、またはその代わりに、本発明による薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）または組成物は、１２時間またはそれを最大とする範囲のｔα半減期を有する。一実施形態では、その範囲の上限は、１１、１０、９、８、７、６、または５時間である。好適な範囲の一例は、１〜６時間、２〜５時間、または３〜４時間である。
有利には、本発明は、ｔβ半減期が２．５時間以上の範囲にある薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を提供する。一実施形態では、その範囲の下限は３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間である。いくつかの実施形態では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）のｔβ半減期が２１日またはそれ以下の範囲である。一実施形態では、その範囲の上限は１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日、または２０日である。特定の実施形態では、本発明による薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）のｔβ半減期は、１２〜６０時間の範囲である。別の実施形態では、そのｔβ半減期は１２〜４８時間の範囲である。別の実施形態では、さらに、そのｔβ半減期は１２〜２６時間の範囲である。
上記判定基準に加えて、またはそれに代えて、本発明は、ＡＵＣ値（曲線下面積）が０．０１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ以上、または１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ以上の範囲にある薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を提供する。一実施形態では、その範囲の下限は、０．０１、０．１、１、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００、または３００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬである。特定の実施形態では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）のＡＵＣは、６００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬまでの範囲にある。一実施形態では、その範囲の上限は５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、または５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬである。他の実施形態では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）のＡＵＣは、以下の範囲からなる群から選択される範囲にある：１５〜１５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜１００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜７５ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、０．０１〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、０．１〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、および１０ｔｏ５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ。
本発明は、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分とを含む薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）に関する。薬物組成物の好ましい実施形態では、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する。
いくつかの実施形態では、薬物組成物は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分と共有結合している薬物を含む。これらの実施形態では、薬物は、アミノ末端やカルボキシ末端などの任意の適当な位置で、または適当なアミノ酸側鎖（例えば、リジンのεアミノ基）により、ポリペプチド結合性ドメインと共有結合させることができる。
他の実施形態では、薬物組成物は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分と非共有結合している薬物を含む。そのような実施形態では、薬物は、直接的（例えば、静電相互作用、疎水的相互作用を通じて）または間接的に［例えば、一つのパートナーを薬物と共有結合させ、その相補的結合パートナーを抗原結合性フラグメントと共有結合させる、相補的結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結合により］抗原結合性フラグメントと非共有結合させることができる。相補的結合パートナーを使用する場合、直接的にまたは適当なリンカー部分を介して、結合パートナーの一つを薬物と共有結合させることができ、またその相補的結合パートナーを直接的または適当なリンカー部分を介してポリペプチド結合ドメインと共有結合させることができる。
他の実施形態では、薬物組成物は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分と、ポリペプチド薬物とを含む融合タンパク質である。融合タンパク質は、第１の部分として、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分を、そして第２の部分として、ポリペプチド薬物を含む一連のポリペプチド鎖を含み、これらの部分はポリペプチド鎖の別個の部分（成分）として存在する。第１および第２の部分は、ペプチド結合により互いに直接結合させ、あるいは適当なアミノ酸、またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーにより結合させることができる。追加の部分（例えば、第３、第４）および／またはリンカー配列を適宜存在させることができる。第１の部分は、第２の部分（すなわちポリペプチド薬物）に対して、Ｎ末端位置、Ｃ末端位置、または内部にあってよい。ある実施形態では、融合タンパク質は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分を一個または複数と、ポリペプチド薬物部分を一個または複数含む。これらの実施形態では、融合タンパク質は、同一であっても異なっていてもよい１〜約１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）のポリペプチド薬物部分、同一であっても異なっていてもよいin vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含む１〜約２０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８１９または２０）のポリペプチド結合性部分を含みうる。
in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分と、ポリペプチド薬物部分は任意の所望の位置に存在させることができる。例えば、アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって、それらの部分を以下の順序で存在させることができる：一個または複数のポリペプチド結合性部分、一個または複数のポリペプチド薬物部分、一個または複数のポリペプチド結合性部分。別の実施例では、アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって、それらの部分を、以下の順序で存在させることができる：一個または複数のポリペプチド結合性部分、一個または複数のポリペプチド薬物部分、一個または複数のポリペプチド結合性部分、一個または複数のポリペプチド薬物部分、一個または複数のポリペプチド結合性部分。本明細書に記載したように、ポリペプチド結合性部分とポリペプチド薬物部分は、ペプチド結合により互いに直接結合し、あるいは適当なアミノ酸、またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーにより結合させることができる。
ある実施形態では、融合タンパク質は、次式（アミノ末端からカルボキシ末端へ）を有する連続したポリペプチド鎖である。
ａ−（Ｐ）ｎ２−ｂ−（Ｘ）ｎ１−ｃ−（Ｑ）ｎ３−ｄまたはａ−（Ｑ）ｎ３−ｂ−（Ｘ）ｎ１−ｃ−（Ｐ）ｎ２−ｄ
［式中、
Ｘはポリペプチド薬物であり、
ＰおよびＱは、それぞれ独立に、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分であり、
ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、それぞれ独立に欠落しているか、または１〜約１００個のアミノ酸残基であり、
ｎ１、ｎ２、およびｎ３は、それぞれ、存在するＸ、Ｐ、またはＱ部分の数を表し、
ｎ１は、１〜約１０であり、
ｎ２は、０〜約１０であり、かつ
ｎ３は、０〜約１０であり、
但し、両方のｎ２およびｎ３が０であってはならず、かつ
但し、ｎ１およびｎ２が共に１であり、ｎ３が０である場合、Ｘは抗体鎖または抗体鎖フラグメントを含まない。］
いくつかの実施形態では、ｎ２は１、２、３、４、５、または６であり、ｎ３は０である。他の実施形態では、ｎ３は１、２、３、４、５、または６であり、ｎ２は０である。他の実施形態では、ｎ１、ｎ２、およびｎ３はそれぞれ１である。
ある実施形態では、Ｘは抗体鎖または抗体鎖フラグメントを含まない。
好ましい実施形態では、ＰおよびＱは、それぞれ独立に、血清アルブミンに対して結合特異性を有するポリペプチド結合性部分である。
特に好ましい実施形態では、薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば抗原結合部位）を含むポリペプチド結合性部分を含み、その際、ポリペプチド結合ドメインは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントである。
本発明はまた、薬物のin vivo血清半減期を増加させる方法であって、薬物を、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分に結合させて、それによって薬物に比べてin vivo血清半減期が長い薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）が生成されるステップを含む方法にも関する。
いくつかの実施形態では、その方法は、薬物の活性を実質的に低減することなく薬物のin vivo血清半減期を延長するためのものであり、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分とを結合し、それによって前記薬物に比べてin vivo血清半減期が長く、かつ前記薬物の活性の少なくとも約９０％を保持する薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を生成することを含む。
他の実施形態では、その方法は、薬物のin vivo血清半減期を延長し、薬物の免疫原性を減少させるためのものであり、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分とを結合し、それによって薬物に比べてin vivo血清半減期が長く、前記薬物よりも免疫原性が低い薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を生成することを含む。
他の実施形態では、その方法は、薬物の活性を実質的に低減することなく、薬物の免疫原性を減少させるためのものであり、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分とを結合し、それによって前記薬物よりも免疫原性が低く、前記薬物の活性の少なくとも約９０％を保持する薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を生成することを含む。
他の実施形態では、その方法は、薬物のin vivo血清半減期を延長し、薬物の活性を実質的に低減されることなく、薬物の免疫原性を減少させるためのものであり、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分とを結合させ、それによって前記薬物に比べてin vivo血清半減期が長く、前記薬物よりも免疫原性が低く、かつ前記薬物の活性の少なくとも約９０％を保持する薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を生成することを含む。
薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位とを含むポリペプチド結合性部分は、本明細書に記載するように、リンカーを使用するかまたは使用せずに、共有結合（例えば、ペプチド結合）または非共有結合により、結合させることができる。いくつかの実施形態では、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位とを含むポリペプチド結合性部分は共有結合により結合する。例えば、生成した薬物組成物は、薬物複合体または薬物融合体である。他の実施形態では、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分は非共有結合により結合し、その薬物組成物は非共有結合性薬物複合体である。
その方法を使用し生成した薬物組成物は、薬物よりも高い活性（例えば、in vivo活性）を有しうる。いくつかの実施形態では、その方法は、薬物単独よりも活性（例えば、in vivo活性）が高い薬物組成物を生成するものであり、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分とを結合し、それによって薬物に比べて活性が高い薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を生成することを含む方法である。そのような実施形態では、本明細書に記載したように、薬物組成物の活性は薬物の活性を超えることが好ましい。
好ましい実施形態では、ポリペプチド結合性部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する。特に好ましい実施形態では、ポリペプチド結合性部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントである。
ある実施形態では、その方法は、一個または複数のポリペプチド（例えば、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメント）から前記ポリペプチド結合性部分を選択するステップを含み、その際、選択したポリペプチド結合性部分は、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して少なくとも約５ｍＭのＫＤで結合する。
本発明は、医薬品を製造するための、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分の使用であって、該医薬が、薬物が前記ポリペプチド結合性部分に結合している薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む、薬物のin vivo血清半減期を延長するためのものである上記使用に関する。
いくつかの実施形態では、その使用は、約１０％を超えて薬物の活性を減少させることなく薬物のin vivo血清半減期を延長するために、薬物が前記ポリペプチド結合性部分に結合している薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む医薬品を製造するためのものである。
他の実施形態では、その使用は医薬品を製造するためのものであって、該医薬品は、薬物のin vivo血清半減期を延長し、薬物の免疫原性を減少させるための、薬物が前記ポリペプチド結合性部分に結合している薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含むものである。
他の実施形態では、その使用は医薬品を製造するためのものであって、約１０％を超えて薬物の活性を減少させずに薬物の免疫原性を減少させるための、薬物が前記ポリペプチド結合性部分に結合している薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含むものである。
他の実施形態では、その使用は医薬品を製造するためのものであって、薬物のin vivo血清半減期を延長し、かつ約１０％を超えて薬物の活性を減少させないように薬物の免疫原性を減少させるための、薬物が前記ポリペプチド結合性部分に結合している薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含むものである。
薬物組成物は、本明細書に記載するように、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分とを含むことができ、これらはリンカーを使用するかまたは使用せずに、共有結合（例えばペプチド結合）または非共有結合により結合されている。いくつかの実施形態では、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分は共有結合を通じて結合される。例えば、その薬物組成物は、薬物複合体または薬物融合体でありうる。他の実施形態では、薬物と、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分は、非共有結合により結合され、その薬物組成物は非共有結合性薬物複合体である。
ある実施形態では、その使用は、前記薬物よりも活性（例えばin vivo活性）を増加させるための、薬物が前記ポリペプチド結合性部分に結合されている薬物組成物（例えば、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む医薬品を製造するためのものである。そのような実施形態では、本明細書に記載したように、薬物組成物の活性は薬物の活性よりも大きいことが好ましい。
好ましい実施形態では、ポリペプチド結合性部分は血清アルブミンに対して結合特異性を有する。特に好ましい実施形態では、ポリペプチド結合性部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントである。
血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント
本発明の薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、および薬物融合体は、（すなわち、一個または複数の）血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む。抗原結合性フラグメントは、薬物複合体または薬物融合体を投与する動物の血清アルブミンに対して結合特異性を有しうる。好ましくは、抗原結合性フラグメントは、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する。しかし、獣医学的適用も企図され、抗原結合性フラグメントは、所望の動物の血清アルブミンに対して、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、ミンクなどに由来の血清アルブミンに対しても、結合特異性を有しうる。いくつかの実施形態では、抗原結合性フラグメントは、２以上の種由来の血清アルブミンに対して結合特異性を有する。例えば、本明細書に記載したように、ラット血清アルブミンおよびマウス血清アルブミンに対して結合特異性を有するヒトｄＡｂ、ならびにラット、マウス、およびヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するｄＡｂが産生されている（表１および図７）。そのようなｄＡｂは、同じ薬物複合体または薬物融合体を使用して前臨床試験および臨床試験を実施できるようにする利点をもたらし、適当な代理薬物融合体または薬物複合体を用いた前臨床試験の実施を不要にする。
本発明で使用するのに適当な抗原結合性フラグメントには、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント［一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびジスルフィド結合Ｆｖを含む］、単一可変ドメイン、およびｄＡｂ（ＶＨ、ＶＬ）が含まれる。そのような抗原結合性フラグメントは、任意の適当な方法を使用し、例えば、ペプシン、パパイン、または必要な切断特異性を有する他のプロテアーゼを使用する抗体のタンパク質分解により、または組換え技術を使用して、作製することができる。例えば、Ｆｖフラグメントは、適当なプロテアーゼによる抗体を消化することにより、または組換えＤＮＡ技術の使用によって、調製することができる。例えば、適当なペプチドリンカー、例えば、２〜約２０個のグリシル残基鎖などによって結合した軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸を調製することができる。その核酸は、任意の適当な技術（例えば、形質移入、形質転換、感染）を使用し、適当な宿主（例えば大腸菌）に導入することができ、一本鎖Ｆｖフラグメントの発現に適当な条件下でその宿主を維持することができる。様々な抗体の抗原結合性フラグメントは、一個または複数の終止コドンを天然の終止部位の上流に導入した抗体遺伝子を使用して、調製することができる。例えば、免疫グロブリン重鎖のＦ（ａｂ’）２部分をコードする発現構築体は、重鎖のヒンジ領域をコードする配列の３’末端に翻訳終止コドンを導入することによって設計することができる。本発明の薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、および薬物融合体は、血清アルブミンに結合する抗体の個々の重鎖および軽鎖、あるいは血清アルブミンに結合する個々の鎖の一部分（例えば、単一のＶＨ、Ｖκ、またはＶλ）を含みうる。
所望の血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントは、適当な天然または人工抗体のコレクションから選択するか、または適当な宿主中で適当な免疫原に対して誘起することができる。例えば、抗体は、適当な宿主［例えば、マウス、ヒト抗体遺伝子組換えマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、非ヒト霊長類（例えばサル）］を血清アルブミン（例えば、単離または精製したヒト血清アルブミン）または血清アルブミンペプチド（例えば、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３３、３５、３７、または４０個のアミノ酸残基を含むペプチド）によって免疫化することにより誘起することができる。血清アルブミンに結合する抗体および抗原結合性フラグメントもまた、ファージディスプレイライブラリーなどの組換え抗体または抗原結合性フラグメントのライブラリーから選択することができる。そのようなライブラリーは、天然または人工のアミノ酸配列を含む抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを含みうる。例えば、そのライブラリーには、人工ＣＤＲ（例えば、ランダムアミノ酸配列）およびヒトフレームワーク領域を含むＦａｂフラグメントを含めることができる［例えば、米国特許第６，３００，０６４号（Knappikら）を参照］。他の例では、ライブラリーは、一個または複数のＣＤＲ中に配列多様性を有するｓｃＦｖフラグメントまたはｄＡｂ（単一ＶＨ、単一Ｖκまたは単一Ｖλ）を含む［例えば、国際公開第９９／２０７４９号（TomlinsonおよびWinter）、国際公開第０３／００２６０９Ａ２号（Winterら）、国際公開第２００４／００３０１９Ａ２号（Winterら）を参照］。
血清アルブミンに結合する適当な抗体およびその抗原結合性フラグメントには、例えば、ヒト抗体およびその抗原結合性フラグメント、ヒト化抗体およびその抗原結合性フラグメント、キメラ抗体およびその抗原結合性フラグメント、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）抗体およびその抗原結合性フラグメント、ならびにラクダ科動物抗体およびその抗原結合性フラグメントが含まれる。ある実施形態では、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、および薬物融合体は、血清アルブミンと結合するラクダ科動物ＶＨＨを含む。ラクダ科動物のＶＨＨは、天然には軽鎖を持たない重鎖抗体に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。そのような抗体は、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含むラクダ科の動物種で生じる。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子の約１０分の１であり、単一ポリペプチドなので非常に安定しており、極端なｐＨおよび温度条件に対して抵抗性がある。血清アルブミンに結合する適当なラクダ科動物のＶＨＨには、国際公開第２００４／０４１８６２号（Ablytoc N.V.）および本明細書（図１５および配列番号：７３〜８４）に開示されたものなどが含まれる。ある実施形態では、ラクダ科動物のＶＨＨは、ヒト血清アルブミンと結合し、かつ、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、または配列番号８４に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、BLAST P［KarlinおよびAltschul, Proc. Natl. Acad. Sd. VSA 87（6）:2264-2268（1990）］などの適当な配列アラインメントアルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを使用して決定するのが好ましい。
任意の適当な技術を使用して、その免疫化抗原を調製し、ポリクローナルやモノクローナル抗体産生を実施することができる。様々な方法が記載されている［例えば、Kohlerら、Nature, 256: 495-497（1975）およびEur. J. Immunol. 6: 511-519（1976）；Milsteinら、Nature 266: 550-552（1977）；Koprowskiら、米国特許第４，１７２，１２４号；Harlow, E. およびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY）； Current Protocols In Molecular Eiology, 第2巻（Supplement 27, Summer '94）, Ausubel, F.M.ら編,（John Wiley & Sons: New York, NY）, 第11章,（1991）を参照］。一般的に、モノクローナル抗体を望む場合、不死細胞系（例えば、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、またはヘテロミエローマなどの骨髄腫細胞系）から得た適当な細胞と抗体産生細胞を融合することによってハイブリドーマを産生する。抗体産生細胞は、ヒトの末梢血から得ることができ、または好ましくはヒト抗体トランスジェニック動物または当該抗原で免疫化した他の適当な動物の脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。ヒト起源の抗体（例えばヒト抗体）を産生する細胞は、適当な方法、例えば、ヒト抗体産生細胞とヘテロミエローマもしくはトリオーマ（trioma）との融合法、または活性化させたヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスに感染させることによって不死化する方法を使用し、作製することができる［例えば、米国特許第６，１９７，５８２号（Trakht）; Niedbalaら、Hybridoma, 17:299-304（1998）; Zanellaら、J Immunol Methods, 156:205-215（1992）; Gustafssonら、Hum Antibodies Hybridomas, 2:26-32（1991）を参照］。融合し、または不死化した抗体産生細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離し、限界希釈によってクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適当なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を使用し同定することができる。
抗体はまた、ヒト、ヒト抗体トランスジェニック動物、または目的の抗原で免疫化した他の適当な動物［例えば、米国特許第５，６２７，０５２号（Schrader）を参照］の単離した抗原特異的抗体産生細胞（例えば、末梢血、または好ましくは所望の特異性を有する抗体を産生することが判明した脾臓またはリンパ節から得た細胞）から直接調製する（例えば、合成し、またはクローン化する）ことができる。
薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、または薬物融合体が、ヒトに投与するものである場合、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）と結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、あるいはそのような抗体の抗原結合性フラグメントでありうる。これらの種類の抗体および抗原結合性フラグメントは、ヒトでほとんど免疫原性でないかまたは非免疫原性であり、よく知られている利点をもたらす。例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体の抗原結合性フラグメントを含む、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、または薬物融合体は、薬物複合体または薬物融合体に結合するヒト抗体の同化のため、（他の十分に免疫原性の抗体と比較して）ほとんど効力損失せずに、または効力の損失なしに、ヒトに繰り返し投与することができる。薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、または薬物融合体が、獣医学的投与を目的とした場合、類似の抗体または抗原結合性フラグメントを使用することができる。例えば、ウマまたはウシなどの所望の動物から得たフレームワーク領域に、マウスまたはヒト抗体から得たＣＤＲを移植することができる。
そのＣＤＲをコードするヒト抗体および核酸は、例えば、ヒトまたはヒト抗体組換え動物から得ることができる。ヒト抗体トランスジェニック動物（例えばマウス）は、ヒト抗体のレパートリー、例えば、XENOMOUSE（Abgenix, Fremont, CA）、HUMAB-MOUSE、KIRIN TC MOUSE、またはKM-MOUSE（MEDAREX, Princeton, NJ）を産生することができる動物である。一般的に、ヒト抗体トランスジェニック動物ゲノムは、機能上の再構成を受け得るヒト免疫グロブリン座位から得たＤＮＡを含む導入遺伝子を含むように変化させてある。内在性遺伝子によりコードされている抗体を産生する動物の能力を排除するために、ヒト抗体トランスジェニック動物中の内在性免疫グロブリン座位を破壊しまたは欠失させることができる。ヒト抗体トランスジェニック動物を産生するのに適当な方法は、当技術分野で周知である［例えば、米国特許第５，９３９，５９８号および同第６，０７５，１８１号（Kucherlapatiら）、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および同第５，７８９，６５０号（Lonbergら）、Jakobovitsら、Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90: 2551- 2555（1993）, Jakobovitsら、Nature, 362: 255-258（1993）, Jakobovitsら、国際公開第９８／５０４３３号、Jakobovitsら、国際公開第９８／２４８９３号、Lonbergら、国際公開第９８／２４８８４号、Lonbergら、国際公開第９７／１３８５２号、Lonbergら、国際公開第９４／２５５８５号、Lonbergら、欧州特許第０８１４２５９Ａ２号、Lonbergら英国特許第２２７２４４０Ａ号、Lonbergら、Nature 368:856-859（1994）, Lonbergら、Int Rev Immunol 13（1）:65-93（1995）, Kucherlapatiら、国際公開第９６／３４０９６号、Kucherlapatiら、欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号、Kucherlapatiら、欧州特許第０７１０７１９Ａ１号、Suraniら、米国特許第５，５４５，８０７号、bruggemannら、国際公開第９０／０４０３６号、Bruggemannら、欧州特許第０４３８４７４Ｂ１号、Taylorら、Int. Immunol. 6（4）579-591（1994）, Taylorら、Nucleic Acids Research 20（23）:6287-6295（1992）, Greenら、Nature Genetics 7:13-21（1994）, Mendezら、Nature Genetics 15:146-156（1997）, Tuaillonら、Proc Natl Acad Sci USA 90（8）:3720-3724（1993）およびFishwildら、Nat Biotechnol 14（7）:845-851（1996）を参照されたい。前記のもののそれぞれの教示をその全体を参照により本明細書に組み込む］。
ヒト抗体トランスジェニック動物は、適当な抗原（例えばヒト血清アルブミン）により免疫化することができ、抗体産生細胞は、慣用の方法を使用し、単離し融合してハイブリドーマを形成することができる。所望の特性（例えば特異性、親和性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマは、任意の適当なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を使用して同定し、所望の場合には適当な培養技術を使用して選択しサブクローン化することができる。
ヒト化抗体および他のＣＤＲ移植抗体は、任意の適当な方法を使用し調製することができる。ＣＤＲ移植抗体のＣＤＲは、血清アルブミンと結合する適当な抗体（ドナー抗体と称する）から得ることができる。他の適当なＣＤＲ供給源には、ヒトまたは非ヒト供給源、例えば、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類（例えばサル）、あるいはライブラリーから得た天然および人工の血清アルブミン特異的抗体が含まれる。
ヒト化抗体のフレームワーク領域は、ヒト起源であることが好ましく、そのドナー抗体の抗原結合領域に類似する領域または等価領域（例えば重鎖可変領域または軽鎖可変領域）に対する配列類似性を有する任意のヒト抗体可変領域から得ることができる。ヒト起源のフレームワーク領域の他の供給源には、ヒト可変領域コンセンサス配列が含まれる［例えば、Kettleborough, C.A.ら、Protein Engineering 4:773-783（1991）；Carterら、国際公開第９４／０４６７９号；Kabat, E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健福祉省、米国政府印刷局（1991）を参照］。ＣＤＲ移植抗体の種類は他に、適当な起源のフレームワーク領域、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコなどの生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされるフレームワーク領域を含みうる。
ヒト起源のフレームワーク領域は、例えばヒトまたは動物起源のフレームワーク領域中のアミノ酸残基を、そのドナー抗体の対応する位置の残基に交換する「復帰突然変異」などの、アミノ酸置換または交換を含みうる。フレームワーク領域中に、一個または複数のアミノ酸の欠失、挿入、および置換を含む一個または複数の突然変異を生じさせることができる。変異体は、非ヒトドナー鎖またはヒトアクセプター鎖の突然変異誘発を含め、様々な適当な方法によって作製することができる［例えば、米国特許第５，６９３，７６２号（Queenら）および同第５，８５９，２０５号（Adairら）を参照されたい。その教示全体を参照により本明細書に組み込む］。
抗体の定常領域、抗体鎖（例えば重鎖、軽鎖）、またはそのフラグメントもしくは一部分が存在する場合は、それらは任意の適当な供給源から誘導することができる。例えば、ヒト、ヒト化、およびある種のキメラ抗体の定常領域、抗体鎖（例えば重鎖、軽鎖）、またはそのフラグメントまたは一部分が存在する場合、それらはヒト起源であっても、任意の適当なヒト抗体または抗体鎖から誘導することもできる。例えば、ヒト起源の定常領域またはその一部分は、対立形質変異体を含む、ヒトκまたはλ軽鎖、および／またはヒトγ（例えばγ１、γ２、γ３、γ４）、μ、α（例えばα１、α２）、δまたはε重鎖から誘導することができる。ある実施形態では、抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、ヒト起源の抗体、ヒト抗体）は、機能を改変しまたはあつらえる（例えばエフェクター機能）アミノ酸置換または交換を含みうる。例えば、ヒト起源の定常領域（例えばγ１定常領域、γ２定常領域）は、補体活性および／またはＦｃ受容体結合を減少するように設計することができる［例えば、米国特許第５，６４８，２６０号（Winterら）、同第５，６２４，８２１号（Winterら）および同第５，８３４，５９７号（Tsoら）を参照されたい。その教示全体を参照により本明細書に組み込む］。好ましくは、そのようなアミノ酸置換または交換を含むヒト起源の定常領域のアミノ酸配列は、ヒト起源の非改変定常領域のアミノ酸配列に対し、その全長にわたって少なくとも約９５％同一であり、より好ましくはヒト起源の非改変定常領域のアミノ酸配列に対し、その全長にわたって少なくとも約９９％同一である。
ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、あるいはヒト化抗体またはＣＤＲ移植抗体の抗原結合性フラグメントは、任意の適当な方法を使用し調製することができる。いくつかのそのような方法は、当技術分野で公知である［例えば、米国特許第５，２２５，５３９号（Winter）、同第５，５３０，１０１号（Queenら）を参照］。ヒト化抗体またはＣＤＲ移植抗体の一部分（例えばＣＤＲ、フレームワーク、定常領域）は、適当な抗体から（例えば一部分を新規に合成することによって）取得しまたは直接誘導することができ、あるいは所望の特性を有する（例えば血清アルブミンと結合する）抗体をコードする核酸またはその鎖を産生し発現させることができる。鎖の一部分を調製するために、所望の位置に一個または複数の終止コドンを導入することができる。例えば、ヒト化またはＣＤＲ移植可変領域をコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列は、既存のＤＮＡ配列を改変するためのＰＣＲ突然変異誘発法を使用し構築することができる［例えば、Kamman, M.ら、Nucl. Acids Res. 17:5404（1989）を参照］。新規なＣＤＲをコードするＰＣＲプライマーは、予めヒト化可変領域のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることができ、この可変領域は同じかまたは非常に良く似たヒト可変領域をベースとしている（Sato, K.ら、Cancer Research 53:851-856（1993））。類似するＤＮＡ配列が、鋳型として使用できない場合は、可変領域配列をコードする配列を含む核酸を合成オリゴヌクレオチドから構築することができる［例えば、Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980（1993）を参照］。シグナルペプチドをコードする配列もその核酸中に組み込むことができる（例えばベクターに挿入の際に合成）。アクセプター抗体由来の天然シグナルペプチド配列、別の抗体のシグナルペプチド配列、または他の適当な配列を使用することができる［例えば、Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4:773-783（1991）を参照］。変異体は、こうした方法または他の適当な方法を使用し容易に産生することができる。一実施形態では、クローン化した可変領域を変異させることができ、所望の特異性を有する変異
体をコードする配列を選択することができる［例えば、ファージライブラリーから、例えば、米国特許第５，５１４，５４８号（Krebberら）および国際公開第９３／０６２１３号（Hoogenboomら）を参照］。
血清アルブミンと結合する、抗体または抗原結合性フラグメントは、キメラ抗体またはキメラ抗体の抗原結合性フラグメントでありうる。キメラ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、一生物種（例えばマウス）の可変領域と別の生物種（例えばヒト）の定常領域の少なくとも一部分とを含む。キメラ抗体およびキメラ抗体の抗原結合性フラグメントは、任意の適当な方法を使用し調製することができる。いくつかの適当な方法は、当技術分野で公知である［例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabillyら）、同第５，１１６，９４６号（Caponら）を参照］。
血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合性フラグメントを得るのに好ましい方法は、抗原結合性フラグメントのレパートリーから、所望の血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗原結合性フラグメント（例えばｓｃＦｖ、ｄＡｂ）を選択することを含む。例えば、本明細書に記載したように血清アルブミンに結合するｄＡｂは、適当なファージディスプレイライブラリーから選択することができる。いくつかの適当なバクテリオファージディスプレイライブラリーおよび選択方法（例えば、一価ディスプレイ系および多価ディスプレイ系）については記載されている［例えば、Griffithsら、米国特許第６，５５５，３１３Ｂ１号（参照により本明細書に組み込む）、Johnsonら、同第５，７３３，７４３号（参照により本明細書に組み込む）、McCaffertyら、同第５，９６９，１０８号（参照により本明細書に組み込む）、Mulligan-Kehoe、同第５，７０２，８９２号（参照により本明細書に組み込む）、Winter, G.ら、Annu. Rev. Immunol. 12:433-455（1994）; Soumillion, P.ら、Appl Biochem. Biotechnol 47（2-3）:175-189（1994）; Castagnoli, L.ら、Comb. Chem. High Throughput Screen, 4（2）: 121-133（2001）、国際公開第９９／２０７４９号（TomlinsonおよびWinter）、同第０３／００２６０９Ａ２号（Winterら）、同第２００４／００３０１９Ａ２号（Winterら）を参照］。バクテリオファージライブラリーで提示されたポリペプチドは、任意の適当なバクテリオファージ、例えば、繊維状ファージ（例えばｆｄ、Ｍ１３、Ｆ１）、溶菌性ファージ（例えばＴ４、Ｔ７、λ）、またはＲＮＡファージ（例えばＭＳ２）などで提示させて、選択して血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）と結合させることができる。
一般的には、適当なファージコートタンパク質との融合タンパク質として、ポリペプチドレパートリーを提示するファージのライブラリーが使用される。そのようなライブラリーは、任意の適当な方法、例えば、提示された抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするファージベクターまたはファージミドベクターのライブラリーを適当な宿主細菌中に導入すること、および（所望の場合には、例えば、適当なヘルパーファージまたは相補プラスミドを使用し）ファージを産生するために得た細菌を培養するステップを使用することにより生成することができる。ファージライブラリーは、沈殿および遠心分離など、任意の適当な方法を使用し、そのような培養から回収することができる。
そのライブラリーは、任意の所望する量のアミノ酸配列多様性を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントのレパートリーを含みうる。例えば、レパートリーは、所望の生物から天然に生じた抗体に対応し、かつ／またはランダムもしくはランダム化したアミノ酸配列（例えばＣＤＲ配列）の一個または複数の領域を含むことができるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含みうる。そのようなレパートリーまたはライブラリー中の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所定の、ランダムまたはランダム化したアミノ酸配列領域および共通アミノ酸配列領域を含みうる。ある実施形態では、レパートリー中の全ての、または実質的に全てのポリペプチドは、所望する種類の抗体の抗原結合性フラグメント（例えばヒトＶＨまたはヒトＶＬ）である。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドは、ＶＨ、ＶＬ、またはＦｖ（例えば一本鎖Ｆｖ）を含みうる。
任意の適当な方法を使用し、抗体またはその抗原結合性フラグメントの任意の所望の領域にアミノ酸配列多様性を導入することができる。例えば、任意の適当な突然変異誘発法（例えば低忠実度ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド介在突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発、ＮＮＫコドンを使用する相異点付加）または任意の他の適当な方法を使用し、相異点を加えた抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸ライブラリーを調製することによって、抗体可変ドメインの相補性決定領域など、標的領域にアミノ酸配列相異点を導入することができる。所望の場合には、相異点を加える抗体またはその抗原結合性フラグメントの領域をランダム化することができる。
適当なファージディスプレイライブラリーを使用して、血清アルブミンに結合する抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを選択し、他の有益な特性を得ることができる。例えば、折り畳みが解けたときに凝集に抵抗性を示す抗体または抗原結合性フラグメントを選択することができる。凝集はポリペプチド濃度に左右され、多くの場合、部分的に折り畳まれた、または折り畳まれていない中間体から生じると思われる。高温および高ポリペプチド濃度など、部分的に折り畳まれた中間体に好都合な要因および条件は不可逆的凝集を促進する（Fink, A.L., Folding & Design 3:R1-R23（1998））。例えば、精製したポリペプチドを凍結乾燥調製物などの濃縮形態で保存することによって、しばしば、ポリペプチドのすくなくとも一部分の不可逆的凝集がもたらされる。さらに、大腸菌などの生体系での発現によるポリペプチドの産生は、しばしば、凝集ポリペプチドを含む封入体を形成する。封入体から活性ポリペプチドを回収することは、非常に困難であり、生物学的産生系に再折り畳みステップなどの追加のステップを加える必要があるであろう。
加熱されると凝集しにくく可逆的に折り畳みが解かれる抗体および抗原結合性フラグメントは、適当なファージディスプレイライブラリーから選択することができる。一般的に、提示された抗体またはその抗原結合性フラグメントのレパートリーを含むファージディスプレイライブラリーは、提示された抗体またはその抗原結合性フラグメントの少なくとも一部分の折り畳みが解ける温度（Ｔｓ）まで加熱し、次いでＴｓ＞Ｔｃの温度（Ｔｃ）まで冷却し、それによって抗体またはその抗原結合性フラグメントの少なくとも一部分が再び折り畳まれ、ポリペプチドの一部分が凝集する。次いで、可逆的に折り畳みが解けた（unfold）血清アルブミンに結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントをある温度（Ｔｒ）で回収する。回収した可逆的に折り畳みが解けた抗体またはその抗原結合性フラグメントは融解温度（Ｔｍ）を有し、好ましくは、Ｔｓ＞Ｔｍ＞ＴｃおよびＴｓ＞Ｔｍ＞Ｔｒとなるように、そのレパートリーをＴｓまで加熱し、Ｔｃまで冷却し、そして可逆的に折り畳みが解けた抗体またはその抗原結合性フラグメントをＴｒで単離した。一般的に、ファージディスプレイライブラリーを約８０℃まで加熱し、選択前に約室温または約４℃まで冷却する。可逆的に折り畳みが解ける凝集に抵抗性を示す抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所定のアミノ酸残基を可逆的に折り畳みが解ける能力を付与する残基で置換することによって、デザインしまたは作製することもできる［可逆的に折り畳みが解ける抗体またはその抗原結合性フラグメントを選択し、デザインし、または作製する方法の詳細な考察については、国際公開第２００４／１０１７９０号（Jespersら）、および米国仮特許出願第６０／４７０，３４０号（２００３年５月１４日出願）、および米国仮特許出願第６０／５５４，０２１号（２００４年３月１７日出願）を参照されたい。国際公開第２００４／１０１７９０号および前述の米国仮出願の両方の教示を参照により本明細書に組み込む］。
可逆的に折り畳みが解け凝集に抵抗性を示す抗体またはその抗原結合性フラグメントによって、いくつかの利点がもたらされる。例えば、凝集に対するその抵抗性のために、可逆的に折り畳みが解ける抗体またはその抗原結合性フラグメントは、大腸菌などの適当な生物学的産生系を使用し発現させることによって、可溶性タンパク質として高収量で容易に産生させることができる。加えて、可逆的に折り畳みが解ける抗体またはその抗原結合性フラグメントは、製剤化し、かつ／または慣用のポリペプチドよりも高濃度で、かつ凝集性低く活性を消失させて保存することができる。ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号２０）は可逆的に折り畳みが解けるヒトＶＨである。
好ましくは、血清アルブミンと結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、可変ドメイン（ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ）を含み、その際、フレームワーク領域（ＦＲ）の一つまたは複数は、（ａ）ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、（ｂ）ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８個連続したアミノ酸、または（ｃ）ヒト生殖系列抗体の遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列、を含み、前記フレームワーク領域はＫａｂａｔにより定義される通りである。ある実施形態では、フレームワーク領域の一つまたは複数のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体の遺伝子セグメントがコードする対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであり、あるいは前記フレームワーク領域の一つまたは複数のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体の遺伝子セグメントがコードする対応する前記フレームワーク領域のアミノ酸配列に比べて合計５個までのアミノ酸差異を含む。
他の実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体の遺伝子セグメントがコードする対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであり、またはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列は、前記ヒト生殖系列抗体の遺伝子セグメントがコードする対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列に比べて、合計１０個までのアミノ酸差異を含む。他の実施形態では、前記ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３のアミノ酸配列は、前記ヒト生殖系列抗体の遺伝子セグメントがコードする対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである。
特定の実施形態では、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントは、ヒト生殖系列配列をベースとする免疫グロブリン可変ドメイン（例えばＶＨ、ＶＬ）を含み、そして所望の場合には、相補性決定領域など、一個または複数の多様化領域を含むことができる。ＶＨに適当なヒト生殖系列配列には、例えば、ＶＨ遺伝子セグメントＤＰ４、ＤＰ７、ＤＰ８、ＤＰ９、ＤＰ１０、ＤＰ３１、ＤＰ３３、ＤＰ４５、ＤＰ４６、ＤＰ４７、ＤＰ４９、ＤＰ５０、ＤＰ５１、ＤＰ５３、ＤＰ５４、ＤＰ６５、ＤＰ６６、ＤＰ６７、ＤＰ６８、およびＤＰ６９、ならびにＪＨセグメントのＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ４ｂ、ＪＨ５、およびＪＨ６によってコードされる配列が含まれる。ＶＬについてのヒト生殖系列配列には、例えば、Ｖκ遺伝子セグメントＤＰＫ１、ＤＰＫ２、ＤＰＫ３、ＤＰＫ４、ＤＰＫ５、ＤＰＫ６、ＤＰＫ７、ＤＰＫ８、ＤＰＫ９、ＤＰＫ１０、ＤＰＫ１２、ＤＰＫ１３、ＤＰＫ１５、ＤＰＫ１６、ＤＰＫ１８、ＤＰＫ１９、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２４、ＤＰＫ２５、ＤＰＫ２６、およびＤＰＫ２８、およびＪκセグメントＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５によってコードされる配列が含まれる。
ある実施形態では、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、または薬物融合体は、血清アルブミンと結合するマウス、ラット、および／またはウサギの抗体、あるいはそのような抗体の抗原結合性フラグメントを含まない。
抗原結合性フラグメントは、任意の所望の親和性オン速度（結合速度）およびオフ速度（解離速度）で血清アルブミンに結合することができる。親和性（ＫＤ）、オン速度（Ｋｏｎまたはｋａ）、およびオフ速度（Ｋｏｆｆまたはｋｄ）を選択して、特定の薬物について所望の血清半減期を得ることができる。例えば、慢性炎症性疾患の炎症メディエーターを中和する薬物（例えば、炎症性サイトカインに結合し中和するｄＡｂ）について最長の血清半減期を得ることが望ましいこともありうるが、他方で多少毒性がある薬物（例えば化学療法剤）については短い半減期が望ましいであろう。一般的に、血清アルブミンとの結合には高速オン速度および高速もしくは中程度のオフ速度が好ましい。これらの特性を備えた抗原結合性フラグメントを含む薬物複合体および薬物融合体は、投与後、迅速に血清アルブミンに結合し、血清アルブミンを解離しそして速やかに再結合する。これらの特性は、（例えば腎臓を通る）迅速な薬物クリアランスを減少させるが、依然として薬物標的の効率的送達および利用を提供する。
一般的に、血清アルブミンと結合する抗原結合性フラグメント（例えばｄＡｂ）はＫＤ約１ｎＭ〜約５００μＭで結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合性フラグメントは、表面プラズモン共鳴による決定（例えばビアコアの装置を使用）で、血清アルブミンと約１０〜約１００ｎＭ、または約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約５００ｎＭ〜約５ｍＭのＫＤ［ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋａ）］で結合する。特定の実施形態では、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、または薬物融合体は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）と約５０ｎＭ、または約７０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約１５０ｎＭ、または約２００ｎＭのＫＤで結合する抗体の抗原結合性フラグメント（例えばｄＡｂ）を含む。本明細書に記載した薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、および薬物融合体の改善された薬物動態特性（例えば、ｔ１／２β延長、ＡＵＣ増加）は、血清アルブミンと結合する抗原結合性フラグメントの親和性と相関するであろう。従って、一般的に、改善した薬物動態特性を有する薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、および薬物融合体は、血清アルブミンと（例えばヒト血清アルブミン）高親和性（例えば、約５００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下、または約１００ｐＭ以下のＫＤ）で結合する抗原結合性フラグメントを使用し調製することができる。
好ましくは、血清アルブミンと結合する抗原結合性フラグメントに複合体化または融合されている薬物は、表面プラズモン共鳴（例えばビアコアの装置を使用）によって測定したところ、血清アルブミンに対する抗原結合性フラグメントの親和性よりも強い親和性（ＫＤ）、および／または血清アルブミンに対する抗原結合性フラグメントのＫｏｆｆよりも迅速なＫｏｆｆ（ｋｄ）でその標的（薬物標的）と結合した。例えば、その薬物は、ＳＡに結合する抗原結合性フラグメントのＳＡに対する親和性よりも約１〜約１０００００倍、または約１００〜約１０００００倍、または約１０００〜約１０００００倍、または約１００００〜約１０００００倍強力な親和性で、その標的に結合することができる。例えば、ＳＡに結合する抗体の抗原結合性フラグメントは、約１０μＭの親和性で結合することができるが、薬物はその標的に約１００ｐＭの親和性で結合する。
特定の実施形態では、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントは、ヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂである。例えば、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶκｄＡｂ、あるいは配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂ。他の実施形態では、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントは、ヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂであり、前記アミノ酸配列のいずれかのＣＤＲを含む。他の実施形態では、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントは、ヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂであり、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、BLAST P［KarlinおよびAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87（6）:2264-2268（1990）］など、適当な配列アラインメントアルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを使用し決定するのが好ましい。
薬物
本発明のある種の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体）は、例えば、個体中で生物学的標的分子と結びつき、かつ／またはその機能を変化させることにより、有益な治療的または診断的効果を得るために個体に投与することができる任意の薬物（例えば小型有機分子、核酸、ポリペプチド）を含むことができる。本発明の他の薬物組成物（例えば薬物融合体）は、ポリペプチドもしくはペプチド薬物を含むことができる。薬物融合体の好ましい実施形態では、薬物は、抗体鎖または抗体鎖のフラグメント（例えばＶＨ、Ｖκ、Ｖλ）を含まない。
ＴＮＦＲ１は、リガンドに結合する細胞外領域と、内因性シグナル伝達活性を持たないがシグナル伝達分子と結合することができる細胞内ドメインとを含む膜貫通型受容体である。ＴＮＦと結合したＴＮＦＲ１複合体は、３本のＴＮＦＲ１鎖と３本のＴＮＦ鎖を含む（Bannerら、Cell, 73（3） 431-445（1993））。そのＴＮＦリガンドは、３本のＴＮＦＲ１鎖により結合される三量体として存在する（前掲）。３本のＴＮＦＲ１鎖は、受容体リガンド複合体中で密接にまとまってクラスター化し、このクラスタリングがＴＮＦＲ１媒介シグナル伝達の前提条件である。実際、抗ＴＮＦＲ１抗体など、ＴＮＦＲ１に結合する多価薬剤は、ＴＮＦの不在下でＴＮＦＲ１のクラスタリングおよびシグナル伝達を誘発することができ、通常、ＴＮＦＲ１アゴニストとして使用されている［例えば、Belkaら、EMBO, 14（6）: 1156-1165（1995）; Mandik-Nayakら、J. Immunol, 167:1920-1928（2001）を参照］。従って、一般的に、ＴＮＦＲ１に結合する多価薬剤は、それがＴＮＦαとＴＮＦＲ１の結合を阻止するとしてもＴＮＦＲ１の有効なアンタゴニストではない。
ＴＮＦＲ１および他のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの細胞外領域は、プレリガンド結合アセンブリドメインまたはＰＬＡＤドメインと称する領域［配列番号８５（ヒトＴＮＦＲ１）のアミノ酸１〜５３、配列番号８６（マウスＴＮＦＲ１）のアミノ酸１〜５３］を含む［米国政府、国際公開第０１／５８９５３号；米国特許出願公開第２００３／０１０８９９２Ａ１号、Dengら、Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304（2005）］。
ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲ１の細胞外領域は以下のアミノ酸配列を有する：
LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIENVKGTEDSGTT（配列番号８５）。
マウス（Mus musculus）ＴＮＦＲ１の細胞外領域は以下のアミノ酸配列を有する：
LVPSLGDREKRDSLCPQGKYVHSKNNSICCTKCHKGTYLVSDCPSPGRDTVCRECEKGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISPCQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHFQCVDCSPCFNGTVTIPCKETQNTVCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEECMKLCLPPPLANVTNPQDSGTA（配列番号８６）。
特定の受容体のＰＬＡＤドメインは、in vivoで互いに結合し、天然リガンドの存在下で受容体の活性化を防止することができる。例えば、ＴＮＦＲ１のＰＬＡＤドメインは、in vivoでＴＮＦＲ１の別のＰＬＡＤドメイン（例えば細胞表面上に発現されたＴＮＦＲ１）に結合し、また、天然リガンドに結合した際の、受容体のクラスタリング、およびそれに続くシグナル伝達を阻害する。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーは、以下を含む当技術分野で認められたタンパク質群である：ＴＮＦＲ１（ｐ５５、ＣＤ１２０ａ、ｐ６０、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ｐ７５、ｐ８０、ＣＤ１２０ｂ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＤ（ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＴβＲ、ＴＮＦＲ２−ＲＰ、ＴＮＦＲ−ＲＰ、ＴＮＦＣＲ、ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩＩ）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１Ｌ）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５、ｐ５０、Ｂｐ５０）、Ｆａｓ（ＣＤ９５、ＴＮＦＲＳＦ６、ＡＰＯ−１、ＡＰＴ１）、ＤｃＲ３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、Ｓ１５２）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８、Ｋｉ−１、Ｄ１Ｓ１６６Ｅ）、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４−１ＢＢ、ＩＬＡ）、ＴＲＡＩＬＲ−１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＲ４、Ａｐｏ２）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＩＣＫＢ）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＯＰＧ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１、ＬＡＲＤ、ＷＳＬ−ＬＲ、ＤＤＲ３、ＴＲ３、ＡＰＯ−３）、ＤＲ３Ｌ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ）、ＴＡＣ１（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４、ＡＴＡＲ、ＴＲ２、ＬＩＧＨＴＲ、ＨＶＥＡ）、ＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＣＭ）、ＡＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＦＬＪ１４９９３（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＥＬＴ）、ＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＳＯＢａ（ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮｆｒｈ２、２８１００２８Ｋ０６Ｒｉｋ）、ｍＳＯＢ（ＴＨＦＲＳＦ２３、Ｔｎｆｒｈ１）。
数個のＰＬＡＤドメインが当技術分野で公知であり、他のＰＬＡＤドメインおよびＰＬＡＤドメインの機能性変異体は、国際公開第０１／５８９５３号、米国特許出願公開第２００３／０１０８９９２Ａ１号；Dengら、Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304（2005）に記載の方法などの任意の適当な方法を使用して、容易に単離し調製することができる。本明細書に記載したＴＮＦＲ１受容体結合アッセイなどの好適な結合アッセイと共に、ポリペプチド、タンパク質フラグメント、およびペプチド変異体を調製するための多くの適当な方法が当技術分野で公知であり慣用されている。代表的ＰＬＡＤドメインを表８に示す。
Figure 2008521426
いくつかの実施形態では、薬物融合体または薬物複合体は、ＰＬＡＤドメイン、例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＤＲ４または他のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのＰＬＡＤ、あるいはＰＬＡＤドメインの機能性変異体を含む。ＰＬＡＤドメインの機能性変異体は、例えば、一個または複数のアミノ酸が欠失、挿入、または置換されているが、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、またはＤＲ４の対応するＰＬＡＤに結合する能力は保持している、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、またはＤＲ４のＰＬＡＤドメインでありうる。機能性変異体ＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列は、その対応するＰＬＡＤ（例えばＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＤＲ４のＰＬＡＤ）のアミノ酸配列中のアミノ酸と同一である少なくとも約１０個連続したアミノ酸、少なくとも約１５個連続したアミノ酸、少なくとも約２０個連続したアミノ酸、少なくとも約２５個連続したアミノ酸、少なくとも約３０個連続したアミノ酸、少なくとも約３５個連続したアミノ酸、または少なくとも約４０個連続したアミノ酸の領域を含む。加えて、またはそれに代えて、機能性変異体ＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列は、その対応するＰＬＡＤ（例えばＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、またはＤＲ４のＰＬＡＤ）のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一でありうる。
特定の実施形態では、薬物融合体または薬物複合体は、ＰＬＡＤドメイン（例えばＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、またはＤＲ４のＰＬＡＤ）もしくは機能性ＰＬＡＤ変異体と、血清アルブミンもしくは新生仔Ｆｃ受容体に結合するｄＡｂとを含む。
本発明に使用することができるポリペプチド薬物を含む追加の好適な薬物は、２００５年５月３１日にDomantis Limitedの名で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２１６３号に開示されている。適当な薬物の開示は、その出願の４５〜５０ページと表８に開示されている。これらの薬物は、例えば、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分、および別のポリペプチド薬物を含む薬物組成物、融合体、または複合体を調製するために本発明に使用することができる。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２１６３号の教示、特に本発明での使用に適当な薬物に関する教示を参照により本明細書に組み込む。
薬物融合体
本発明の薬物融合体は、ポリペプチド薬物である第２の部分に連結されている、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを第１の部分として含む一連のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質である。第１および第２の部分は、ペプチド結合により互いに直接結合し、あるいは適当なアミノ酸、またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーにより結合させることができる。追加の部分（例えば第３、第４）および／またはリンカー配列も、適宜存在させることができる。第１の部分は、第２の部分（すなわちポリペプチド薬物）に対してＮ末端位置、Ｃ末端位置、または内部にあってよい。ある実施形態では、各部分は、一個を上回るコピーで存在しうる。例えば、その薬物融合体は、それぞれが血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、ヒト血清アルブミンと結合するＶＨを一個およびヒト血清アルブミンと結合するＶＬを一個、あるいはヒト血清アルブミンと結合する２個以上のＶＨまたはＶＬ）を含む２個以上の第１の部分を含むことができる。
いくつかの実施形態では薬物融合体は次式を有する連続したポリペプチド鎖である。
ａ−（Ｘ）ｎ１−ｂ−（Ｙ）ｎ２−ｃ−（Ｚ）ｎ３−ｄ または
ａ−（Ｚ）ｎ３−ｂ−（Ｙ）ｎ２−ｃ−（Ｘ）ｎ１−ｄ
［式中、
Ｘは、第１の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり、
Ｙは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の一本鎖抗原結合性フラグメントであり、
Ｚは、第２の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり、
ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、それぞれ独立に欠落しているか、または１〜約１００個のアミノ酸残基であり、
ｎ１は、１〜約１０であり、
ｎ２は、１〜約１０であり、かつ
ｎ３は、０〜約１０であり、
但し、ｎ１およびｎ２が共に１であり、ｎ３が０である場合、Ｘは抗体鎖または抗体鎖フラグメントを含まない。］
一実施形態では、ＸとＺのどちらも、抗体鎖または抗体鎖フラグメントを含まない。一実施形態では、ｎ１は１であり、ｎ３は１であり、ｎ２は２、３、４、５、６、７、８、または９である。好ましくは、Ｙは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）である。より好ましくは、Ｙは、ヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂ（例えばＶＨ、Ｖκ、またはＶλ）である。特定の実施形態では、ＸまたはＺはヒトＩＬ−１ｒａまたはヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体である。
ある実施形態では、Ｙは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｙは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、薬物融合体は、Ｘ’がポリペプチド薬物であるＸ’部分およびＹ’部分を含み、但しＸ’は抗体鎖または抗体鎖フラグメントを含まず、Ｙ’は血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の一本鎖抗原結合性フラグメントである。好ましくは、Ｙ’は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）である。より好ましくは、Ｙ’は、ヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂ（例えばＶＨ、Ｖκ、またはＶλ）である。Ｘ’はＹ’のアミノ末端に位置していてもよく、またはＹ’はＸ’のアミノ末端に位置していてもよい。いくつかの実施形態では、Ｘ’およびＹ’はアミノ酸によって、または２〜約１００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはポリペプチドリンカーによって分離されている。特定の実施形態では、Ｘ’は、ヒトＩＬ−１ｒａまたはヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体である。
ある実施形態では、Ｙ’は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｙ’は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、薬物融合体は、血清アルブミンと結合するｄＡｂと、ヒトＩＬ−１ｒａとを含む（例えば配列番号２８）。好ましくは、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンと結合し、ヒトフレームワーク領域を含む。
他の実施形態では、薬物融合体または薬物複合体は、ヒトＩＬ−１ｒａの成熟１５２アミノ酸形態に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ヒトインターロイキン−１の１型受容体と拮抗することができるヒトＩＬ−１ｒａ機能性変異体を含む［Eisenbergら、Nature 343:341-346（1990）を参照］。その変異体は、一個または複数の追加のアミノ酸を含むことができる（例えば１５３または１５４またはそれ以上のアミノ酸を含む）。本発明の薬物融合体は、任意の適当な方法を使用し生成することができる。例えば、いくつかの実施形態は、薬物融合体をコードする核酸を適当な発現ベクターに挿入することによって作製することができる。次いで、得られた構築体を適当な宿主細胞に導入して発現させる。発現後、任意の適当な方法を使用し、融合タンパク質を細胞ライセート、または好ましくはその培地もしくはペリプラズムから単離しまたは精製することができる［例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel, F.M.ら編、第２巻、Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8（1991）を参照］。
適当な発現ベクターは、いくつかの構成要素、例えば、複製起点、選択マーカー遺伝子、転写調節領域（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）などの一個または複数の発現調節領域、および／または一個または複数の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列などを含むことができる。発現調節領域およびシグナル配列が存在する場合、それらはベクターまたは他の供給源によって提供されたものであってよい。例えば、抗体鎖をコードするクローン化核酸の転写および／または翻訳制御配列を使用して発現を誘導することができる。
所望の宿主細胞中で発現させるためにプロモーターを提供することができる。プロモーターは構成的または誘導的でありうる。例えば、プロモーターが核酸の転写を誘導するように、抗体をコードする核酸、抗体鎖、またはその一部分にプロモーターを作動可能に連結することができる。様々な原核生物宿主に適当なプロモーター（例えば、大腸菌にｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主に適当なプロモーター（例えばサルウイルス４０初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）を入手可能である。
さらに典型的には、発現ベクターは、ベクターを保有する宿主細胞を選択するための選択マーカー、および複製可能発現ベクターの場合には複製起点を含む。抗生物質耐性または薬物耐性を付与する産物をコードする遺伝子は一般的な選択マーカーであり、原核細胞［例えばラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性にＴｅｔ遺伝子］および真核細胞［例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｇｐｔ（マイコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子］に使用することができる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子によって、様々な宿主でメトトレキサートでの選択が可能になる。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母でしばしば選択マーカーとして使用される。ウイルスベクター（例えばバキュロウイルス）もしくはファージベクター、およびレトロウイルスベクターなどの宿主細胞ゲノム中に組み込むことができるベクターの使用も企図される。哺乳動物細胞、原核細胞（大腸菌）、昆虫細胞［ドロソフィラシュニーダー（Drosophila Schnieder）Ｓ２細胞、Ｓｆ９］、および酵母［Ｐ．メタノリカ（methanolica）、Ｐ．パストリス（pastoris）、出芽酵母］で発現させるのに適当な発現ベクターは当技術分野で公知である。
薬物融合体を発現する組換え宿主細胞、および本明細書に記載した薬物融合体を調製する方法を提供する。その組換え宿主細胞は、薬物融合体をコードする組換え核酸を含む。薬物融合体は、適当な宿主細胞中でそのタンパク質をコードする組換え核酸の発現させることによって、または他の適当な方法を使用し生成することができる。例えば、本明細書に記載した発現構築体は、を適当な宿主細胞に導入することができ、得られた細胞は構築体の発現に適当な条件下で（例えば培地、動物中で）維持することができる。適当な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌などの細菌細胞および／または他の適当な細菌を含む原核生物、真核生物、例えば、真菌細胞または酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス、アスペルギルス種、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンブ、アカパンカビ）、あるいは他の下等真核生物の細胞および高等真核生物の細胞、例えば、昆虫細胞［例えばＳｆ９昆虫細胞（国際公開第９４／２６０８７号（O'Connor）］または哺乳動物細胞［例えばＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５１）などのＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−９０９６）、２９３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Daileyら、J. Virol. 54:739-749（1985））、３Ｔ３、２９３Ｔ（Pearら、Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 90:8392-8396（1993）］、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ７８細胞など［例えば、Ausubel, F.M.ら編、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing AssociatesおよびJohn Wiley & Sons Inc.,（1993）を参照］でありうる。
本発明は、薬物融合体の発現に適当な条件下で本発明の組換え宿主細胞を維持することを含む薬物融合体の作製方法も含む。その方法は、所望の場合にはさらに、薬物融合体を単離しまたは回収することを含むことができる。別の実施形態では、薬物融合体の成分（例えばヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂ、およびＩＬ−１ｒａ）は、一連のポリペプチド鎖を作製するために化学的に構築される。
複合体
別の態様では、本発明は、薬物に結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む複合体を提供する。そのような複合体は、薬物が共有結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む「薬物複合体」、および薬物が非共有結合している、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントを含む「非共有結合性薬物複合体」を含む。好ましくは、複合体は十分に安定的であり、その結果、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントと薬物は、in vivo条件下で（例えばヒトに投与した場合）、（共有結合でまたは非共有結合で）互いに実質的に結合したまま残存する。好ましくは、その複合体のうちせいぜい約２０％、せいぜい約１５％、せいぜい約１０％、せいぜい約９％、せいぜい約８％、せいぜい約７％、せいぜい約６％、せいぜい約５％、せいぜい約４％、せいぜい約３％、せいぜい約２％、せいぜい約１％、または実質的にゼロが、in vivo条件下で解離しまたは分解して薬物および抗原結合性フラグメントを放出するだけである。例えば、「in vivo」条件下での安定性は、薬物複合体または非共有結合性薬物複合体を血清（例えばヒト血清）中で２４時間３７℃でインキュベートすることによって好都合に評価することができる。そのような方法の一例では、薬物複合体と非複合体化薬物の等量を希釈して異なる２種の血清バイアルに入れる。各バイアルの内容物の半量を−２０℃で直ちに凍結し、他方の半量を３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウェスタンブロッティングなどの任意の適当な方法を使用し、全４試料を分析することができる。ウエスタンブロット法では、薬物に結合する抗体を使用してプローブすることができる。薬物複合体レーンの全薬物は、もし解離がなければ、薬物複合体のサイズで泳動する。他の多くの適当な方法を使用して「in vivo」条件下での安定性を評価することができ、例えば、クロマトグラフィー（例えばゲル濾過、イオン交換、逆相）、ＥＬＩＳＡ、質量分光法など、適当な分析法を使用し上記のように調製した試料を分析することによって評価できる。
薬物複合体
別の態様では、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントと、前記抗原結合性フラグメントと共有結合している薬物とを含む薬物複合体であるが、但し薬物複合体が単一の連続するポリペプチド鎖ではない薬物複合体を提供する。
いくつかの実施形態では、薬物複合体は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ならびに前記ＶＨまたはＶＬと共有結合している薬物を含むが、但し、この薬物複合体は単一の連続するポリペプチド鎖ではない。好ましくは、薬物複合体は、血清アルブミンと結合する単一のＶＨ、または血清アルブミンと結合する単一のＶＬを含む。ある実施形態では、薬物複合体は、ヒト血清アルブミンと結合し、かつ配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶλｄＡｂを含む。他の実施形態では、薬物複合体は、ヒト血清アルブミンと結合し、かつ配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨｄＡｂを含む。
薬物複合体は、任意の所望の薬物を含むことができ、任意の適当な方法を使用し調製することができる。例えば、薬物は、直接、あるいはアミノ末端やカルボキシ末端など、一個または複数の位置で適当なリンカー部分を介して、またはアミノ酸側鎖を通じて間接的に、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントと結合することができる。一実施形態では、薬物複合体は、ヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂと、ポリペプチド薬物（例えばヒトＩＬ−１ｒａまたはヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体）とを含み、ポリペプチド薬物（例えばヒトＩＬ−１ｒａまたはヒトＩＬ−１ｒａ機能性変異体）のアミノ末端は、ｄＡｂのカルボキシ末端と直接または適当なリンカー部分を介して結合する。他の実施形態では、薬物複合体は、ヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂと、ｄＡｂに共有結合している２種以上の異なる薬物とを含む。例えば、第１の薬物をｄＡｂのカルボキシル末端と（直接的または間接的に）共有結合させることができ、第２の薬物をそのアミノ末端と（直接的または間接的に）共有結合し、または側鎖アミノ基（例えばリジンのεアミノ基）を通じて共有結合させることができる。そのような薬物複合体は、公知の選択的結合方法を使用し調製することができる［例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA（1996））を参照］。
薬物を血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントと複合体化するための様々な方法を使用することができる。選択される特定の方法は複合体化する薬物に依存する。所望の場合には、抗原結合性フラグメントと薬物を結合するために、末端官能基を含むリンカーを使用することができる。一般的に、複合体化は、反応性官能基を含む（または、反応性官能基を含むように改変した）薬物をリンカーと、または直接、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントと反応させることにより実現する。適当な条件下で、第２の化学基と反応し、それによって共有結合を形成できる化学的部分または官能基を含む（または含むように改変した）薬物を反応させることによって共有結合は形成する。所望の場合には、任意の適当な方法を使用し［例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA（1996）を参照］、その抗原結合性フラグメントまたはリンカーに適当な反応性化学基を加えることができる。多くの適当な反応性化学基の組合せが、当技術分野で公知であり、例えば、アミン基を求電子性基、例えば、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などと反応させることができる。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などと反応することができる。アルデヒド官能基は、アミン含有またはヒドラジド含有分子と結合することができ、アジド基は、三価の亜リン酸基と反応して、ホスホルアミダートまたはホスホルイミド結合を形成することができる。活性基を分子に導入するのに適当な方法は、当技術分野で公知である［例えば、 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA（1996）を参照］。
いくつかの実施形態では、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントは、２個のチオールが反応してジスルフィド結合を形成することによって薬物に結合する。他の実施形態では、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントは、イソチオシアン酸基と一級アミンが反応して、イソチオ尿素結合を生成することによって薬物に結合する。
適当なリンカー部分は、直鎖または分枝鎖であってよく、例えば、テトラエチレングリコール、Ｃ２−Ｃ１２アルキレン、−ＮＨ−（ＣＨ２）Ｐ−ＮＨ−、または−（ＣＨ２）Ｐ−ＮＨ−（式中ｐは１〜１２）、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−、１〜約１００（好ましくは１〜約１２）個のアミノ酸などを含むポリペプチド鎖を含む。
非共有結合性薬物複合体
数種の非共有結合（例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用）は、安定した高度に特異的な分子間結合を生成することができる。例えば、相補的結合パートナー間の複数の非共有結合を通して実現した分子認識相互作用は、多くの重要な生物学的相互作用、例えば、酵素とその基質の結合、抗体による抗原の認識、リガンドとその受容体の結合、ならびにタンパク質およびペプチドの三次元構造の安定化の基礎をなす。従って、そのような弱い非共有結合性相互作用（例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、疎水的相互作用など）を使用して、薬物と血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントを結合させることができる。
好ましくは、抗原結合性フラグメントと薬物とを結合する非共有結合は、in vivo条件下で（例えばヒトに投与した場合）、抗原結合性フラグメントと薬物が、それぞれに実質的に結合した状態でいられるのに十分な強度である。一般的に、抗原結合性フラグメントと薬物とを結合する非共有結合は、少なくとも約１０１０Ｍ−１の強度を有する。好ましい実施形態では、非共有結合の強度は、少なくとも約１０１１Ｍ−１、少なくとも約１０１２Ｍ−１、少なくとも約１０１３Ｍ−１、少なくとも約１０１４Ｍ−１、または少なくとも約１０１５Ｍ−１である。ビオチンとアビジン間およびビオチンとストレプトアビジン間の相互作用は、多くの条件下で非常に効率的であり安定していることが知られており、本明細書に記載するように、ビオチンとアビジン間またはビオチンとストレプトアビジン間の非共有結合を使用して、本発明の非共有結合性薬物複合体を調製することができる。
非共有結合は、血清アルブミンに特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントと薬物との間に直接形成することができ、または一方のパートナーが薬物と共有結合し、その相補的結合パートナーが抗原結合性フラグメントと共有結合する適当な相補的結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジンもしくはストレプトアビジン）間に形成することができる。相補的結合パートナーを使用する場合、結合パートナーの一方は、直接または適当なリンカー部分を介して薬物と共有結合させることができ、その相補的結合パートナーは、直接または適当なリンカー部分を介して血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントと共有結合させることができる。
相補的結合パートナーは、互いに選択的に結合する分子対である。多くの相補的結合パートナー、例えば、抗体（またはその抗原結合性フラグメント）とその同族抗原またはエピトープ、酵素とその基質、および受容体とそのリガンドが当技術分野で公知である。好ましい相補的結合パートナーは、ビオチンとアビジン、およびビオチンとストレプトアビジンである。
相補的結合対メンバーと、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗原結合性フラグメントまたは薬物との直接的または間接的共有結合は、上記のように実現することができ、例えば、反応性官能基を含む（または、反応性官能基を含むように改変した）相補的結合パートナーと、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントとをリンカーの使用の有無により反応させることによって実現することができる。選択する特定の方法は、複合体化させる化合物（例えば薬物、相補的結合パートナー、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント）次第である。所望の場合には、末端反応性官能基を含むリンカー（例えばホモ二官能性リンカー、ヘテロ二官能性リンカー）は、抗原結合性フラグメントおよび／または薬物と、相補的結合パートナーとを結合するために使用することができる。一実施形態では、２個の別個の反応性部分を含むヘテロ二官能性リンカーを使用することができる。反応性部分の一つが、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントとまたは薬物と反応し、かつ他方の反応性部分がその相補的結合パートナーと反応するように、ヘテロ二官能性リンカーを選択することができる。任意の適当なリンカー（例えばヘテロ二官能性リンカー）を使用することができ、多くのそのようなリンカーが当技術分野で公知であり、市販（例えばPierce Biotechnology, Inc., IL）のものを利用することができる。
組成物および治療診断法
医薬または生理学的組成物（例えばヒトおよび／または獣医学的投与用）を含め、本発明の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物を提供する。医薬組成物または生理学的組成物は、一種または複数の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）と、薬学的もしくは生理学的に許容される担体とを含む。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝化媒体を含む、水溶液またはアルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム水溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、ならびに乳酸リンゲル液が含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液で保持する必要がある場合、生理学的に許容される適当なアジュバントは、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、およびアルギン酸塩など、増粘剤から選択しうる。静脈内ビヒクルには、リンゲルのデキストロースをベースとするものなど、液状栄養補液および電解質補液が含まれる。防腐剤および他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在しうる（Mack（1982） Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版）。
組成物には、所望の量の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含めることができる。例えば、組成物は、重量で約５％〜約９９％の薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、または薬物融合体を含むことができる。特定の実施形態では、組成物は、重量で約１０％〜約９９％、または約２０％〜約９９％、または約３０％〜約９９％または約４０％〜約９９％、または約５０％〜約９９％、または約６０％〜約９９％、または約７０％〜約９９％、または約８０％〜約９９％、または約９０％〜約９９％、または約９５％〜約９９％の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含むことができる。一例では、組成物は凍結し乾燥（凍結乾燥）されている。
典型的には、本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、以下の炎症状態（例えば、急性および／または慢性炎症性疾患）の予防、抑制、または治療に使用される：例えば、慢性閉塞性肺疾患（例えば慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫）、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、細菌性肺炎（例えばブドウ球菌性肺炎）などの肺炎、自己免疫疾患［それだけには限らないが、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節炎｛例えば骨関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、ループス関節炎、脊椎関節症（例えば強直性脊椎炎）｝が含まれる］、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）、ベーチェット症候群および重症筋無力症）、子宮内膜症、乾癬、腹部癒着（例えば腹部手術後）、喘息、および敗血症性ショック。本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、慢性または急性外傷性疼痛、慢性または急性神経因性疼痛、急性または慢性筋骨格痛、慢性または急性癌疼痛など、疼痛の予防、抑制、または治療に使用することができる。本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、診断を目的として投与することもできる。
本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、以下の疾患を予防し、抑制し、または治療するための使用にも適している：肺炎症、慢性閉塞性呼吸器疾患（例えば慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫）、喘息（例えばステロイド耐性喘息）、肺炎（例えば、ブドウ球菌性肺炎などの細菌性肺炎）、過敏性間質性肺炎、好酸球増加症による肺浸潤、環境的肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜疾患、縦隔疾患、横隔膜疾患、換気低下、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主疾病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿沈着症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患（ＥＰＤ）、インフルエンザ、非結核性放線菌、胸水浸出液、塵肺症、肺サイトーシス、肺炎、肺放線菌症、肺胞蛋白症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓、肺炎症、肺組織球症Ｘ（好酸球性肉芽腫症）、肺性高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、類肉腫症、ウェジナー肉芽腫症、および非小細胞肺癌。
本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、インフルエンザ、ＲＳＶ関連呼吸器疾患、およびウイルス性肺（呼吸性）疾患を予防し、抑制し、または治療する使用にも適している。
本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、骨関節炎または炎症性関節炎を予防し、抑制し、または治療する使用にも適している。「炎症性関節炎」は、免疫系が関節で炎症を引き起こし、または悪化させる関節の疾患をさし、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、および脊椎関節症、例えば、強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、乾癬性脊椎炎、腸疾患性関節炎、腸疾患性脊椎炎、若年発症脊椎関節症、および未分化脊椎関節症が含まれる。一般的には、炎症性関節炎は、白血球による滑膜組織および／または滑液の浸潤を特徴とする。
本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を使用して予防し、抑制し、または治療することができる癌には、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、直腸結腸癌、頭頚部癌、膵癌、肝臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、白血病（例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病）、腺癌、腎臓癌、造血器癌（例えば骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患［例えば真性多血症、本態性（または原発性）血小板血症、特発性骨髄線維症］などが含まれる。
本明細書に記載した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、子宮内膜症、線維症、不妊症、早産、勃起機能障害、骨粗鬆症、糖尿病（例えばＩＩ型糖尿病）、成長障害、ＨＩＶ感染、呼吸促迫症候群、腫瘍、および夜尿症を予防し、抑制し、または治療する使用にも適している。
本発明の適用では、「予防」という用語は、疾患が誘発される前に保護的組成物を投与することを伴う。「抑制」は、誘発的事象の後ではあるが、疾患が臨床的に出現する前に組成物を投与することを言う。「治療」は、疾患症状が顕在化した後に保護的組成物を投与することを伴う。
疾患に対する保護または疾患の治療における薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の有効性をスクリーニングするために使用可能な、動物モデル系が利用可能である。感受性マウスで全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を検査する方法は当技術分野で公知である（Knightら（1978） J. Exp. Med., 147: 1653; Reinerstenら（1978） New Eng. J. Med., 299: 515）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスで、別の種属の可溶性ＡｃｈＲタンパク質によりその疾患を誘発することによって検査する（Lindstromら（1988） Adv. Immunol., 42: 233）。関節炎は、マウス感受性株でＩＩ型コラーゲンを注射することによって誘発される（Stuartら（1984） Ann. Rev. Immunol., 42: 233）。放線菌ヒートショックタンパク質を注射することによって、感受性ラットでアジュバント関節炎を誘発したモデルが記載されている（Van Edenら（1988） Nature, 331: 171）。骨関節炎の治療の有効性は、コラゲナーゼの関節内注射によって関節炎を誘発したマウスモデルで評価することができる（Blom, A.B.ら、Osteoarthritis Cartilage 12:627-635（2004）。甲状腺炎は、記載されるようにチログロブリンを投与することによってマウスで誘発される（Maronら（1980） J. Exp. Med., 152: 1115）。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は天然に生じ、または Kanasawaら（1984） Diabetologia, 27: 113によって記載されたものなど、ある種のマウス株で誘発することもできる。マウスおよびラットのＥＡＥは、ヒトでＭＳのモデルとして役立つ。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質の投与によって脱髄性疾患が誘発される［Paterson（1986） Textbook of Immunopathology, Mischerら編, GruneおよびStratton, New York, pp. 179-213; McFarlinら、（1973） Science, 179: 478；およびSatohら、（1987） J. Immunol, 138: 179）を参照］。
本発明の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、別々に投与する組成物として、または他の薬剤と併せて使用しうる。これらには、様々な免疫療法薬物、例えば、シルコスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、免疫毒素などを含むことができる。例えば、肺炎症または呼吸器疾患を予防し、抑制し、または治療するために薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を投与する場合、以下のものと併せて投与することができる：ホスホジエステラーゼインヒビター（例えばホスホジエステラーゼ４インヒビター）、気管支拡張薬（例えばβ２−アゴニスト、抗コリン作動薬、テオフィリン）、短時間作用性β−アゴニスト［例えばアルブテロール、サルブタモール、バンブテロール、フェノテロール、イソエーテリン（isoetherine）、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、テルブタリンおよびトルンレート（tornlate）］、長時間作用性β−アゴニスト（例えば、フォルモテロールおよびサルメテロール）、短時間作用性抗コリン作動薬（例えば臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム）、長時間作用性抗コリン作動薬（例えばチオトロピウム）、テオフィリン（例えば、短時間作用性製剤、長時間作用性製剤）、吸入ステロイド（例えばベクロメタゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾンおよびトリアムシノロン）、経口ステロイド（例えばメチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾン）、短時間作用性β−アゴニストと抗コリン作動薬（例えばアルブテロール／サルブタモール／イプラトロピウム、およびフェノテロール／イプラトロピウム）の併用、長時間作用性β−アゴニスト、吸入ステロイド（例えばサルメテロール／フルチカゾン、およびフォルモテロール／ブデソニド）および粘液溶解薬（例えば、エルドステイン、アセチルシステイン、ブロムヘクシン（bromheksin）、カルボシステイン、グイアフェネシン（guiafenesin）、およびヨウ化処理したグリセロールの併用。
例えば、関節炎［例えば炎症性関節炎（例えば関節リウマチ）］を予防し、抑制し、または治療するために、薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を投与する場合、以下のものと組み合わせて投与することができる：疾患を改変する抗リウマチ剤（例えばメトトレキサート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、アザチオプリン、Ｄ−ペニシラミン、金（経口または筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ）、非ステロイド性抗炎剤［例えば、ロフェコキシブなどのＣＯＸ−２選択的ＮＳＡＩＤ）、サリチラート、グルココリコイド（glucocoricoids）（例えばプレジソン（predisone）］、および鎮痛薬。
医薬組成物には、本発明の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）、または異なる薬物を含む本発明による薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の組合せと併せて、様々な細胞傷害剤または他の薬剤の「カクテル」を含めることができる。
薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、任意の適当な技術に従い、任意の個体または被験体に投与することができる。薬物組成物および治療しようとする疾患もしくは状態に応じて、例えば、経口、食餌性、局所、経皮、経直腸、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、関節内注射）、および吸入（例えば気管支内、鼻腔内または経口吸入、鼻腔内点鼻剤）投与を含め、様々な投与経路が可能である。投与は、示すように局所的または全身的であってよい。好ましい投与方式は、選択した薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）、および治療する状態（例えば疾患）に応じて変化させることができる。投薬量および投与頻度は、患者の年齢、性別、および状態、他の薬物の同時投与、対抗指標、および臨床医が考慮すべき他のパラメーターに依存する。薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の治療有効量を投与する。治療有効量は、投与条件下で所望の治療効果を得るのに十分な量である。
本明細書では「被験体」または「個体」という用語は、動物、例えば、それだけには限らないが、霊長類（例えばヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、あるいは他のウシ類、ヒツジ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、げっ歯類、またはマウス類を含む哺乳動物を含むと定義する。
薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、中性化合物または塩として投与することができる。アミン基または他の塩基性基を含む化合物（例えば薬物組成物、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の塩は、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸など、適当な有機酸または無機酸と反応させることによって得ることができる。四級アンモニウム基を含む化合物はまた、カウンターアニオン、例えば、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、過塩素酸イオンなども含む。カルボン酸基または他の酸性官能基を含む化合物塩は、適当な塩基、例えば、水酸化塩基を反応させることによって調製できる。酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウムなどのカウンターカチオンを含む。
本発明は、被験体（例えば患者）に薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を投与するために使用され、薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）、薬物送達器具、および任意で使用説明書を含むキットも提供する。薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、凍結乾燥製剤など、製剤として提供することができる。ある実施形態では、薬物送達器具は、注射器、吸入器、鼻腔内または眼投与用器具（例えば、噴霧器、眼または鼻滴容器）、および無針注射器具からなる群から選択される。
本発明の薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、保存用に凍結乾燥し、使用前に適当な担体で再構成することができる。任意の適当な凍結乾燥法（例えばスプレー乾燥、圧搾乾燥）および／または再構築技術を使用することができる。凍結乾燥および再構築により抗体活性が様々な程度で失われる可能性があり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性の損失が非常に大きい傾向がある）、補うために使用濃度を調整する必要がありうることは当業者よって理解されよう。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した凍結し乾燥した（凍結乾燥）薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結し乾燥した（凍結乾燥）薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）は、再水和時、その活性（例えば、血清アルブミンに対する結合活性）のせいぜい約２０％、またはせいぜい約２５％、またはせいぜい約３０％、またはせいぜい約３５％、またはせいぜい約４０％、またはせいぜい約４５％、またはせいぜい約５０％が失われるだけである。活性は、凍結乾燥する前の、薬物組成物の効果をもたらすのに必要な薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の量である。例えば、所望の時間所望の血清濃度を得て維持するのに必要な薬物複合体または薬物融合体の量である。薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）の活性は、凍結乾燥前に任意の適当な方法を使用して決定することができ、再水和後に同じ方法を使用して活性を決定し、損失した活性の量を決定することができる。
薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物またはそのカクテルは、予防および／または治療のために投与することができる。ある治療用途では、投与条件下で、所望の治療または予防効果、例えば、選択した細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、または数種の他の測定可能なパラメーターを得るのに十分な量を「治療有効量または用量」として定義する。この投薬量を得るために必要な量は、疾患の重症度、患者自身の免疫系の全身状態、および全身の健康状態によって決まるが、一般的には、体重１キログラムあたり薬物複合体または薬物融合体は約１０μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、または約０．００５〜５．０ｍｇの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用されている。例えば、本発明の薬物組成物（例えば薬物融合体、薬物複合体、非共有結合性薬物複合体）は、毎日（例えば、一日当たり投与は４回まで）、２日毎に、３日毎に、週２回、週１回、２週間毎に１回、月１回、または２ヵ月毎に１回、例えば、約１０μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
予防的適用には、同様の投薬量またはわずかに少ない投薬量で、薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物またはそのカクテルを投与しうる。本発明による薬物組成物（例えば薬物複合体、非共有結合性薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物は、哺乳動物の選択標的細胞集団を変化させ、不活化し、死滅させ、または除去するのに役立てるために予防および治療レジメで使用しうる。
インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）は、ＩＬ−１インターロイキン−１ １型受容体（ＩＬ−１Ｒ１）へのＩＬ−１の結合を競合的に阻害することによって、ＩＬ−１の生物学的活性を阻害するアンタゴニストである。ＩＬ−１の産生は、炎症性刺激に応答して誘発され、炎症性応答および免疫応答を含む様々な生理学的応答を媒介する。ＩＬ−１は軟骨分解および骨吸収刺激を含むさまざまな活性を有する。関節リウマチ患者では、局所的に産生されるＩＬ−１の量が増加するので、天然に存在するＩＬ１−ｒａのレベルではこれらの異常に増加した量に競合するには不十分である。メトトレキサートなどの疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、およびKINERET（登録商標）（anakinra, Amgen Inc）などの生物製剤を始めとする、ＲＡに対して利用可能ないくつもの治療が存在する。
KINERET（登録商標）（anakinra, Amgen Inc）は、非グリコシル化形態の組換え体である、１５３個のアミノ酸からなり１７．３キロダルトンの分子量を有するヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストである。［KINERET（登録商標）（anakinra, Amgen Inc）のアミノ酸配列は、天然に存在するＩＬ−１ｒａ中の１５２個のアミノ酸および追加のＮ末端メチオニンに対応する。］KINERET（登録商標）（anakinra, Amgen Inc）では、一種または複数のＤＭＡＲＤでうまくいかなかった１８才以上の患者において中程度〜重篤な関節リウマチの徴候および症状の緩和が示されている。投薬量は、毎日の皮下注射の一回分で薬物１００ｍｇである。Ｔβ１／２は４〜６時間であり、患者の７１％は１４〜２８日後に注射部位反応を生じる。
ここで本発明者らは、治療用ポリペプチドと血清アルブミン結合性ｄＡｂとを連結することによって、（ｉ）治療用ポリペプチド単独と同様の活性を有し、かつ（ｉｉ）さらに血清アルブミンと結合する化合物が得られることを実証する。さらに、本発明は、治療用ポリペプチドの長期血清半減期種を作製するための方法を提供する。例えば、本発明者は、血清アルブミン結合性ｄＡｂとＩＬ１−ｒａを結合させ、それによってＩＬ１−ｒａ単独よりも長い血清半減期を有する化合物を得た。
実施例１．マウス、ラット、およびヒト血清アルブミンと結合するドメイン抗体の選択
本実施例は、血清アルブミンに対する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）の作製方法について説明する。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に対するｄＡｂの選択については記載されている。
マウス血清アルブミンに対するｄＡｂは、ＷＯ ２００４／００３０１９ Ａ２に記載されているように選択した。３つのヒトファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用した。各ライブラリーは、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に組み込まれているＮＮＫコドンによってコードされた側鎖多様性を有するＶＨ（Ｖ３−２３／ＤＰ４７およびＪＨ４ｂ）またはＶκ（ｏ１２／ｏ２／ＤＰＫ９およびＪｋ１）の単一ヒトフレームワークに基づいていた。
ライブラリー１（ＶＨ）：
多様性位置：Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８
ライブラリーサイズ：６．２×１０９
ライブラリー２（ＶＨ）：
多様性位置：Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ、Ｈ１００Ｂ
ライブラリーサイズ：４．３×１０９
ライブラリー３（Ｖκ）：
多様性位置：Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６
ライブラリーサイズ：２×１０９
ＶＨおよびＶκライブラリーを、それぞれ、汎用リガンドであるプロテインＡおよびプロテインＬとの結合に対して予備選択し、選択されたライブラリー中の大半のクローンが機能性であるようにした。上記に示すライブラリーのサイズは、予備選択した後のサイズに当たる。
それぞれのライブラリーを別々に使用し、血清アルブミンに対して２ラウンドの選択を実施した。各選択のために、４ｍＬのＰＢＳ中、１００μｇ／ｍｌの濃度で抗原をイムノチューブ（nunc）にコートした。１ラウンド目の選択では、３つのライブラリーのそれぞれをＨＳＡ（Sigma）またはＭＳＡ（Sigma）に対して別々にパニングした。２ラウンド目の選択では、その６つの１ラウンド目選択のそれぞれに由来するファージを（ｉ）再度同じ抗原に対して（例えば、１ラウンド目ＭＳＡ、２ラウンド目ＭＳＡ）、また（ｉｉ）相反する抗原に対して（例えば、１ラウンド目ＭＳＡ、２ラウンド目ＨＳＡ）、パニングし、その結果、合計１２の２ラウンド目選択を行った。各場合において、２ラウンド目の選択後、ＨＳＡおよびＭＳＡとの結合について４８のクローンを試験した。Harrisonら、Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109によりｓｃＦｖフラグメントについて記載されたようにして可溶性ｄＡｂフラグメントを生成し、その後、標準的ＥＬＩＳＡプロトコルを行った（Hoogenboomら（1991） Nucleic Acids Res., 19: 4133）が、但し２％ｔｗｅｅｎ ＰＢＳをブロッキングバッファーとして使用し、結合したｄＡｂをプロテインＬ−ＨＲＰ（Sigma）（Ｖκについて）およびプロテインＡ−ＨＲＰ（Amersham Pharmacia Biotech）（ＶＨについて）検出した。
ＭＳＡ、ＨＳＡまたは両方に結合することを示すバックグラウンドを超えるシグナルを生じたｄＡｂを、プラスチックのみとの結合についてＥＬＩＳＡ不溶性形態で試験したが、全てのｄＡｂは血清アルブミンに特異的であった。次いで、クローンを配列決定（表１を参照）したこところ、２１のユニークなｄＡｂが同定されたことが明らかになった。選択したＶκ ｄＡｂクローン間の最小類似性（アミノ酸レベルで）は、８６．２５％であった［（６９／８０）×１００；多様化残基が全て異なる場合、例えば、クローン２４および３４の結果］。選択したＶＨ ｄＡｂクローン間の最小類似性は９４％であった［（１２７／１３６）×１００］。
次に、その血清アルブミン結合性ｄＡｂを、溶液からビオチン化抗原を捕捉する能力について試験した。続いてＥＬＩＳＡプロトコル（上記）を行ったが、但しＥＬＩＳＡプレートは１μｇ／ｍｌのプロテインＬ（Ｖκクローン用）および１μｇ／ｍｌプロテインＡ（ＶＨクローン用）を用いてコートした。可溶性ｄＡｂを該プロトコルにあるようにして溶液から捕捉し、検出をビオチン化ＭＳＡまたはＨＳＡとストレプトアビジンＨＲＰを用いて行った。ビオチン化ＭＳＡおよびＨＳＡは、血清アルブミン分子１個につき平均２個のビオチンを達成することを目指して、製造業者の使用説明書に従って調製した。ＥＬＩＳＡで溶液からビオチン化ＭＳＡを捕捉した２４のクローンが同定された。これらのうち２つ（下記クローン２および３８）はビオチン化ＨＳＡも捕捉した。次に、ＣＭ５ビアコアチップにコートしたＭＳＡに結合する能力についてｄＡｂを試験した。８つのクローンがビアコア上のＭＳＡに結合することが判明した。
プロトコルに以下の改変を加えたこと以外は抗ＭＳＡ ｄＡｂについて先に記載した通り、ヒト血清アルブミンおよびラット血清アルブミンに対するｄＡｂを選択した：すなわち、合成ＶＨドメインのファージライブラリーは、ＤＰ４７生殖系列遺伝子を含むヒトＶＨ３とＪＨ４セグメントに基づくライブラリー４Ｇであった。変異誘導法により以下の特定の位置に多様性を導入した（ＮＮＫコドンを使用、Ｋａｂａｔによるナンバリング）：ＣＤＲ１中の３０、３１、３３、３５；ＣＤＲ２中の５０、５２、５２ａ、５３、５５、５６、およびＣＤＲ３中の４〜１２個の多様化残基：例えば４Ｇ Ｈ１１中のＨ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、およびＨ９８、ならびに４Ｇ Ｈ１９中のＨ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００ａ、Ｈ１００ｂ、Ｈ１００ｃ、Ｈ１００ｄ、Ｈ１００ｅ、およびＨ１００ｆ。最後の３個のＣＤＲ３残基はＦＤＹであり、従ってＣＤＲ３の長さは７〜１５残基で変化する。そのライブラリーは、＞１×１０１０の個別のクローンを含む。
ＶＨおよびＶκライブラリーのサブセットを、それぞれ、汎用リガンドプロテインＡおよびプロテインＬとの結合に対して予備選択し、未選択のライブラリー中の大半のクローンが機能性であるようにした。上記に示すライブラリーのサイズは、予備選択した後のサイズに当たる。
ＶＨおよびＶκライブラリーのサブセットを別々に使用して、ラットおよびヒト血清アルブミンに対し２ラウンドの選択を実施した。各選択のために、抗原を、（ｉ）４ｍｌのＰＢＳ中、１００μｇ／ｍｌの濃度でイムノチューブ（nunc）にコートしたか、あるいは（ｉｉ）ビオチン化し、それを次いで可溶性選択に使用し、続いてストレプトアビジンビーズ（１ラウンド目）およびニュートラアビジンビーズ（２ラウンド目）上に捕捉した。（各クローンを単離するために使用した選択法の詳細については表１を参照）。いずれの場合にも、２ラウンド目の選択後、２４のファージクローンをＨＳＡまたはＲＳＡとの結合について試験した。
その選択の一つにおいてクローンのかなりの割合がファージＥＬＩＳＡで陽性であった場合には、次いで可溶性ｄＡｂを製造するために、本選択から得たＤＮＡを発現ベクター中にクローン化し、個々のコロニーを採取した。可溶性ｄＡｂフラグメントを、Harrisonら（Methods Enzymol. 1996;267:83-109）によりｓｃＦｖフラグメントについて記載されたようにして製造し、続いて標準的ＥＬＩＳＡプロトコルを行った（Hoogenboomら（1991） Nucleic Acids Res., 19: 4133）が、但し２％ＴＷＥＥＮ ＰＢＳをブロッキングバッファーとして使用し、結合したｄＡｂを抗ｍｙｃ−ＨＲＰで検出した。次いで、ビアコア表面プラズモン共鳴装置（Biacore AB）を使用して、ＥＬＩＳＡで陽性であったクローンを、ＭＳＡ、ＲＳＡ、またはＨＳＡへの結合についてスクリーニングした。ＭＳＡ、ＲＳＡ、またはＨＳＡと結合したｄＡｂはさらに分析した。次いで、クローンを配列決定し、特有のｄＡｂ配列を同定した。
Figure 2008521426
次に、ビアコアチップ（Biacore AB）上の血清アルブミンに結合したｄＡｂをさらに分析して親和性についての情報を得た。分析は、血清アルブミンでコートしたＣＭ５チップ（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）を使用して実施した。フローセル１はコートせずにブロッキングした陰性対照であり、フローセル２はＨＳＡでコートし、フローセル３はＲＳＡでコートし、フローセル４はＭＳＡでコートした。血清アルブミンは、ビアコアコーティングウィザードを使用しｐＨ５．５の酢酸バッファー中で固定したが、このウィザードはコートした物質の５００レゾナンス・ユニット（ＲＵ）を目的としてプログラムされている。目的の各ｄＡｂは、２００ｍＬ〜５００ｍＬ規模で大腸菌のペリプラズム中で発現させて、ＶＨについてはプロテインＡ−流線型親和性樹脂（Amersham, UK）への、ＶκについてはプロテインＬ−アガロース親和性樹脂（Affitech、ノルウェー）へのバッチ吸着を使用して上清から精製し、続いてｐＨ２．２のグリシンを用いた溶出及びＰＢＳへのバッファー交換を行った。一連の濃度のｄＡｂ（５ｎＭ〜５μＭの範囲）を、ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＢＳ−ＥＰバッファー中への希釈によって調製し、さらにビアコアチップ上に流した。
親和性（ＫＤ）は、ＫＤの領域中のｄＡｂ濃度によって生じたトレースにオン速度およびオフ速度曲線を適合化させることによってビアコアのトレースから算出した。血清アルブミンに対して様々な異なる親和性を有するｄＡｂを同定した。１０〜１００ｎＭの範囲に含まれていたのは、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−８、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−２、およびＲＳＡに対するＤＯＭ７ｒ−１の親和性であった。１００ｎＭ〜５００ｎＭの範囲に含まれていたのは、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−７、ＲＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−８、およびＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−２６の親和性であった。５００ｎＭ〜５μＭの範囲に含まれていたのは、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−２３およびＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−１の親和性であった。実施例のトレースを図６Ａ〜６Ｃに含める。
実施例２．ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）との融合体としての抗血清アルブミン抗体の構成
本実施例は、ＩＬ−１ｒａと、血清アルブミンと結合するｄＡｂとを含む融合タンパク質の作製方法について記載する。ＩＬ−１ｒａのＮ末端にｄＡｂを有する融合体（ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ）およびＩＬ−１ｒａのＣ末端にｄＡｂを有する融合体（ＩＬ１−ｒａＭＳＡ１６）という２個の融合体を作製した。それらの融合体およびベクターの配列を図２Ｃおよび２Ｄに示す。ＭＳＡに結合しなかった対照融合体も作製し、その配列を図２Ｅに示す。
KINERET（anakinra, Amgen Inc）の半減期は４〜６時間と短く、推奨される投薬レジメでは毎日の注射が必要とされる。このレジメで事例の７１％において１４〜２８日後に注射部位反応がもたらされる。従って、血清半減期がより長いヒトＩＬ−１ｒａ形態は有利なはずであり、効力が高く投薬頻度は減少するであろう。これはどちらも医薬品として望ましい特性である。
クローニング
手短に言えば、以下に詳述するように２個のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を設計し、Ｔ７プロモーターを有する発現ベクター中に挿入した。ＩＬ１−ｒａ、ｄＡｂ、ＧＡＳリーダー、およびリンカーを挿入するために制限部位を設計した。一方（ＭＣＳ１＋３）は、ＩＬ−１ｒａのＮ末端にｄＡｂを有するタンパク質をコードし、他方（ＭＣＳ２＋４）は、ＩＬ−１ｒａのＣ末端にｄＡｂを有するタンパク質をコードする。
ｄＡｂ ＩＬ１−ｒａ融合体のためのクローニング部位１＋３
ＮｄｅＩ、隙間配列（stuffer）、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、隙間配列（stuffer）、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ
gcgcatatgttagtgcgtcgacgtcaaaaggccatagcgggcggccgctgcaggtctcgagtgcgatggatcc（配列番号３５）
ＩＬ１−ｒａ ｄＡｂ融合体のためのクローニング部位２＋４
ＮｄｅＩ、隙間配列（stuffer）、ＳｔＵＩ、ＳａｃＩ、隙間配列（stuffer）、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＴＡＡ ＴＡＡ ＢａｍＨＩ
gcgcatatgttaagcgaggccttctggagagagctcaggagtgtcgacggacatccagatgacccaggcggccgctaataaggatccaatgc（配列番号３６）
次いで、適切な制限酵素を使用してＭＣＳを消化し、ＧＡＳリーダーをコードするアニールしたプライマーをライゲートすることによって、ＧＡＳリーダーを各ベクター中に挿入した。次に、リンカーをコードするリンカーＤＮＡを同様に挿入した。ＰＣＲ（必要な制限部位を付加するように設計されたプライマーを使用する）によって、ｃＤＮＡクローンからＩＬ−１ｒａをコードするＤＮＡを得、ＴＯＰＯクローニングベクター中に挿入した。核酸配列決定によって正確な配列を確認後、ＴＯＰＯベクターからＩＬ−１ｒａをコードするＤＮＡを切り取り、リーダーおよびリンカーを含むベクター中にライゲートした。最後に、ｄＡｂ発現ベクターからｄＡｂをコードするＤＮＡを切り取り、（ゲル精製によって精製した）挿入物とベクターをＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化することによってベクター中に挿入した。
発現および精製
ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ、ＩＬ１−ｒａＭＳＡ１６、およびダミーＩＬ−１ｒａは、大腸菌のペリプラズム中で発現させ、プロテインＬ−アガロース親和性樹脂（Affitech、ノルウェー）へのバッチ吸着を使用して上清から精製し、続いてｐＨ２．２のグリシンで溶出させた。次いで、精製したｄＡｂをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析し、続いてクーマシー染色を行った。タンパク質の一方（ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６）については、タンパク質の＞９０％が推定したサイズのものであり、従ってさらに精製することなく活性を分析した。他方のタンパク質（ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａおよびダミーＩＬ−１ｒａ）には小さいバンドが混入しており、従ってＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーにより、ｐＨ９のRESOURSEQイオン交換カラムでさらに精製した。線形塩勾配０〜５００ｍＭ ＮａＣｌを使用しタンパク質を溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析後、推定したサイズのタンパク質を含む画分を１つにまとめ、＞９０％純度の混合画分を得た。このタンパク質をさらに分析に使用した。
実施例３．in vitroでのｄＡｂ ＩＬ１−ｒａ融合体の活性決定
ＭＲＣ−５ ＩＬ−８アッセイ
ＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１７１、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州マナッサス）におけるＩＬ−１によるＩＬ−８の分泌誘発を中和する能力について、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体を試験した。その方法は、ＨＵＶＥＣにおけるＩＬ−１によるＩＬ−８の誘発について記載したAkeson, L.ら、（1996） Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523のものを改変したものであり、ＨＵＶＥＣ細胞系の代わりにＭＲＣ−５細胞を使用した。手短に言えば、マイクロタイタープレートに播種したＭＲＣ−５細胞をｄＡｂＩＬ−１ｒａ融合タンパク質もしくはＩＬ−１ｒａ対照、およびＩＬ−１（１００ｐｇ／ｍＬ）と共に終夜インキュベートした。インキュベーション後、上清を細胞から吸引除去し、ＩＬ−８濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ（R&D Systems）により測定した。
その融合タンパク質中のＩＬ−１ｒａの活性はＩＬ−８分泌の減少をもたらした。ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ融合体の活性およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体の活性によって生じるＩＬ−８分泌減少をＩＬ−１ｒａ対照（組換えヒトＩＬ−１ｒａ、R&D Systems）を用いて見られた減少と比較した。試験したタンパク質のそれぞれの中和用量５０（ＮＤ５０）を決定し、表２に示す。
Figure 2008521426
その結果は、ＩＬ−１ｒａが、抗血清アルブミンｄＡｂとの融合構築体の一部として依然として活性であったことを示す。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａタンパク質は、その薬物動態を評価するためにさらに試験した（ＰＫ試験）。
血清アルブミン、抗ＩＬ−１ｒａサンドイッチＥＬＩＳＡ
血清アルブミンに結合し、同時にモノクローナル抗ＩＬ１ｒａ抗体によって検出される能力について３つのｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体を試験した。試験した融合体は、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６、およびダミーＩＬ−１ｒａであった。手短に言えば、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミンで終夜コートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで４％Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳで１時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで４％ＭＰＢＳで希釈した各ｄＡｂ，Ｉｌ−１ｒａ融合体と共に１時間インキュベートした。各融合体を１μＭ濃度および７つの連続４倍希釈液（すなわち６０ｐＭまで）でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで製造業者が推奨する、４％ＭＰＢＳで希釈したヒトＩＬ−１受容体アンタゴニスト（Abcam, UK）に対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ−２５７３）の希釈液を加えて１時間インキュベートした。このインキュベーション後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで４％ＭＰＢＳで希釈した２次抗体（抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ）の１／２０００希釈液と共に１時間インキュベートした。２次抗体とのインキュベーション後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで１ウェル当たり５０μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（KPL, MA）を加えて発色させ、１ウェル当たり５０μｌのＨＣＬで反応を停止させた。吸光度を４５０ｎＭで読み取った。
サンドイッチＥＬＩＳＡで、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６タンパク質はいずれも、１μＭ濃度でバックグラウンドレベルの２倍を超えて検出された。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａタンパク質が、３．９ｎＭまで下げた希釈でもバックグラウンドの２倍以上で検出されたのに対して、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６タンパク質は、５００ｎＭに下げただけでバックグラウンドの２倍で検出された。対照構築体（ダミーＩＬ−１ｒａ）は血清アルブミンに結合しなかったので、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体と血清アルブミンの結合は、血清アルブミンに対して特異的であることが示された。
実施例４．マウスＰＫ試験における薬物融合体の血清半減期の決定
Ａ．ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質のマウスでの血清半減期の決定
ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質は、大腸菌のペリプラズム中で発現させ、プロテインＬ−アガロース親和性樹脂（Affitech、ノルウェー）へのバッチ吸着を使用して精製し、続いてｐＨ２．２のグリシンで溶出させた。マウスでの融合タンパク質の血清半減期の決定は、ＣＤ１系統の雄動物に約１．５ｍｇ／ｋｇを一回静脈内（ｉ．ｖ．）注射した後に行った。血清濃度の分析は、ヤギ抗ＨＡ（Abcam, UK）捕捉および４％ＭａｒｖｅｌでブロッキングしたプロテインＬ−ＨＲＰ（Invitrogen, USA）検出を使用するＥＬＩＳＡを用いて行った。洗浄は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳを用いて行った。試験試料との比較可能性を確保するために、既知濃度のＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線を１×マウス血清の存在下で作成した。１コンパートメントモデル（WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA）によるモデリングによって、ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質の最終相ｔ１／２は２９．１時間であり、曲線下面積は５５９ｈｒ・μｇ／ｍｌであることが示された。これは、短くほんの数分間であり得た、ＨＡエピトープタグペプチド単独について予想された半減期を超えて大きく改善されたことを示す。
薬物モデルとしてＨＡエピトープタグを使用するこの試験結果は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント（例えばｄＡｂ）との薬物融合体または薬物複合体としてその薬物を調製した場合、薬物のin vivo血清半減期を延長できることを示している。
抗ＭＳＡ ｄＡｂであるＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｍ−２６、ならびにＭＳＡに結合しない対照ｄＡｂのマウスでのin vivo半減期も評価した。同様に、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６および対照ｄＡｂにはＨＡエピトープタグを含めたが、これは薬物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド薬物）のモデルとして機能する。この試験では、ＭＳＡと結合しない対照ｄＡｂのin vivo半減期は２０分であったが、ＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｍ−２６のin vivo半減期は大幅に延長された。（図１２）さらなる研究で、ＤＯＭ７ｍ−１６は、マウスで２９．５時間のin vivo半減期を有することが判明した。
別の研究では、ＨＡエピトープタグを含むＤＯＭ７ｈ−８のin vivo半減期（ｔ１／２β）をマウスで評価した。２コンパートメントモデル（WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA）によるモデリングによって、ＤＯＭ７ｈ−８が２９．１時間のｔ１／２βを有することが示された。
薬物（例えばタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド薬物）に対するモデルとしてＨＡエピトープタグを使用するこれら試験のそれぞれの結果は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント（例えばｄＡｂ）との薬物融合体または薬物複合体としてこの薬物を調製した場合、薬物のin vivo血清半減期を劇的に延長できることを示している。
Ｂ．ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質のマウスでの血清半減期の決定
ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質（ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ）は、大腸菌のペリプラズム中で発現させ、プロテインＬ−アガロース親和性樹脂（Affitech、ノルウェー）へのバッチ吸着を使用して精製し、続いてｐＨ２．２のグリシンで溶出させた。マウスでのＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ）、ＭＳＡに結合しないｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ダミーｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ）、およびＨＡエピトープタグに融合させた抗ＭＳＡ ｄＡｂ（ＤＯＭ７ｍ−１６ ＨＡタグ）の血清半減期の決定は、ＣＤ１系統の雄動物に約１．５ｍｇ／ｋｇを一回静脈内注射した後に行った。
血清濃度の分析は、Ｉｌ−１ｒａサンドイッチＥＬＩＳＡ（R&D Systems、米国）によって行った。試験試料との比較可能性を確保するために、既知濃度のｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体の標準曲線を１×マウス血清の存在下で作成した。モデリングは、WinNonlin薬物動態ソフトウェア（Pharsight Corp., USA）を使用して実施した。
非ＭＳＡ結合性ｄＡｂとＩＬ−１ｒａの融合体である対照と比較した場合、抗ＭＳＡ ｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体は血清半減期を大幅に増加させると予想された。対照の非ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体は短い血清半減期を有すると予想された。
試験の結果を表３に示すが、その結果は抗ＭＳＡ ｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ）の血清半減期は、ＭＳＡに結合しないｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ダミーｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ）の約１０倍長かったことを示している。その結果から、ダミー／ＩＬ−１ｒａ（ＡＵＣ：１．５ｈｒ．μｇ／ｍｌ）と比較して、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（ＡＵＣ：２６７ｈｒ．μｇ／ｍｌ）についての濃度時間曲線下の領域が＞２００倍改善（増加）したことも判明した。
Figure 2008521426
これらの試験結果は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント（例えばｄＡｂ）との薬物融合体または薬物複合体として薬物を調製した場合、薬物のin vivo血清半減期およびＡＵＣを大幅に延長できることを示している。
実施例５．ＲＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質のラットにおける血清半減期の決定
抗ラット血清アルブミンｄＡｂを、大腸菌のペリプラズム中で、Ｃ末端ＨＡタグを有して発現させ、Ｖｋ ｄＡｂに対してはプロテインＬ−アガロース親和性樹脂（Affitech、ノルウェー）へのバッチ吸着、ＶＨ ｄＡｂに対してはプロテインＡ親和性樹脂へのバッチ吸着を使用して精製し、続いてｐＨ２．２のグリシンで溶出させた。血清半減期を決定するために、４匹のラットからなる群に１．５ｍｇ／ｋｇのＤＯＭ７ｒ−２７、ＤＯＭ７ｒ−３１、ＤＯＭ７ｒ−１６、ＤＯＭ７ｒ−３、ＤＯＭ７ｈ−８、または無関係の抗原に結合する対照ｄＡｂ（ＨＥＬ４）を一回静脈内注射した。尾静脈から７日間にわたって連続的に採血することによって血清試料を得、そしてＥＬＩＳＡプレートにコートしたヤギ抗ＨＡ（Abcam、英国ケンブリッジ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析し、続いて（ＶＨ ｄＡｂに対しては）プロテインＡ−ＨＲＰまたは（Ｖκ ｄＡｂに対しては）プロテインＬ−ＨＲＰによる検出を行った。試験試料との比較可能性を確保するために、既知濃度のｄＡｂの標準曲線を１×ラット血清の存在下で作成した。２コンパートメントモデル［WinNonlin薬物動態ソフトウェア（Pharsight Corp., USA）を使用］によるモデリングを用いて、ｔ１／２βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）（表４）を計算した。ラットでのＨＥＬ４対照についてのｔ１／２βは最大３０分であり、得られたデータに基づくと、ＤＯＭ７ｈ−８についてのＡＵＣは約１５０ｈｒ．μｇ／ｍＬ〜約２５００ｈｒ．μｇ／ｍＬであると算出される。
Figure 2008521426
薬物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド薬物）に対するモデルとしてこのＨＡエピトープタグを使用するこのラット試験の結果は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント（例えばｄＡｂ）との薬物融合体または薬物複合体として薬物を調製した場合、薬物のin vivo血清半減期を劇的に延長できることを示している。
ヒトでの半減期の予測
相対成長スケーリングを使用して、動物で得られた半減期データから、ヒトでのｄＡｂ薬物融合体または薬物複合体のin vivo半減期を見積もることができる。３匹の動物で決定したin vivo半減期の対数を動物の体重の対数に対してプロットする。プロットした点を通る線を引き、その線の傾きおよびｙ切片を用い、式ｌｏｇ Ｙ＝ｌｏｇ（ａ）＋ｂ ｌｏｇ（Ｗ）［式中、Ｙはヒトでのin vivo半減期、ｌｏｇ（ａ）はｙ切片、ｂは傾き、Ｗはヒトの体重である］を使用してヒトでのin vivo半減期を計算する。その線は、約３５ｇ（例えばマウス）、約２６０ｇ（例えばラット）、および約２，７１０ｇの体重の動物で得られたin vivo半減期データを使用し作成することができる。この計算には、ヒトの体重を７０，０００ｇとして考えることができる。マウスおよびラットで得られた半減期値を基に、ＤＯＭ７ｈ−８などのヒト血清アルブミンと結合するｄＡｂは、ヒトでｔ１／２βが約５．５時間〜約４０時間、そしてＡＵＣが約１５０ｈｒ．μｇ／ｍＬ〜約２５００ｈｒ．μｇ／ｍＬであると予測される。
実施例６．関節リウマチのマウスコラーゲン誘発関節炎モデルにおける抗ＳＡ ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ薬物融合体の効力
関節リウマチの判明しているマウスモデル［ＤＢＡ／１マウスでのＩＩ型コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）］における融合体ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａの効力およびＩＬ−１ｒａの効力を評価した。試験全体を通じて、マウスは試験施設で標準型の２つのケージで飼育されたが、そのケージは、明１２時間、暗１２時間サイクル、２０〜２４℃としたＨＥＰＡフィルター付きScantainer中に収容された。食物（Harlan-Teklad社製の汎用餌２０１６）とＵＶ滅菌水は自由に与えた。確実に適切に順化させるために、試験開始の少なくとも７日前にマウスを試験施設に移した。
７〜８週齡のＤＢＡ／１マウス（デンマーク国Domholtveg在Taconic M and Bから入手）に、１：１の比率で乳濁液が安定するまで乳化させたArthrogen-CIAアジュバントおよびArthrogen-CIAコラーゲン（共にMD biosciences）の乳濁液を一回注射した。ビーカーの水に添加した乳濁液の液滴が固形の塊を形成した時、乳濁液は安定していると考えた。次いで、マウスにその乳濁液を注射した。
乳濁液を注射してから２１日後、最も進行した関節炎疾患を有する２０匹の動物を試験から排除し、残りのマウスを１０匹ずつの動物群（各群には５頭の雄と５頭の雌が含まれた）に分けた。表５に示すようにマウスを処理し、１０ｍｌ／Ｋｇが投与されるように計算した濃度で全ての処理を行った。
Figure 2008521426
関節炎の重症度についての臨床スコアを２１〜４９日目に週３回記録した。４９日目にマウスを安楽死させた。マウスが１２以上の関節炎スコアを示すかまたは移動に深刻な問題を示した場合には、それらの個々のマウスを早めに安楽死させた。
臨床スコアリングについては、以下の判定基準に従って各肢をスコアリングし、全４本の肢のスコアを加算してそのマウスについての合計スコアを出した。結果としてこの方法によって各マウスには０〜１６のスコアが与えられた。スコアリング判定基準は以下の通りである：０＝正常、１＝足首または手首の軽度ではあるが明確な発赤および腫脹、または罹患した指の数には関わらず個別の指に限定された明らかな発赤および腫脹、２＝足首および手首の中程度の発赤および腫脹、３＝指を含む手足全体の重度の発赤および腫脹、４＝複数の関節を含む最高度に炎症を起こした肢。
個々のマウスから得た臨床スコアを使用し、全ての処理日に各処理群について群平均関節炎スコアを算出した。倫理的理由によって試験から除去した全ての動物に最大スコアである１６を割り当てた。群平均関節炎スコアを時間に対してプロットした（図１３）。
ウィルコクソン検定を使用し、４９日目の群平均関節炎スコアの統計分析を実施した。この統計分析によって、生理食塩水対照群（群６）と比較した場合、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａで処理した２つの群（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（群３および４））は４９日目に有意に改善された関節炎スコア（それぞれ、Ｐ＜１％およびＰ＜０．０５％の有意レベルで）を示したことが判明した。それに対して、１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１ｒａによる処理（群１）は、４９日目の関節炎スコアでは統計上有意な改善はもたらさなかったが、１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１ｒａによる処理（群２）はＰ＜５％の有意レベルで有意な改善をもたらした。ENBREL（登録商標）（entarecept; Immunex Corporation）による処理（群５）は、４９日目の関節炎スコアにＰ＜１０％有意レベルで有意な改善をもたらした。
５ｍｇ／ｋｇのENBREL（登録商標）（entarecept; Immunex Corporation）（群５）による基準処理と比較した場合、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａによる処理（群４）は、４９日目の関節炎スコアの改善に有効であった（Ｐ＜０．５％レベルで有意）。加えて、それより少ない１ｍｇ／ｋｇ用量のＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａによる処理（群３）は、同じ投薬量のＩＬ−１ｒａ単独による処理（群１）よりも、４９日目の関節炎スコアの改善に効果的であった（Ｐ＜１０％レベルで有意）。
この試験では所定の用量のＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａまたはENBREL（登録商標）（entarecept; Immunex Corporation）よりも有効であったことを、その試験結果は示している。ＩＬ−１ｒａに対する応答は予想通り用量依存的であり、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａに対する応答も用量依存的であった。１ｍｇ／ｋｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａによる処理に対する平均スコアは、１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１ｒａによる処理によって得られた平均スコアよりも一貫して低かった。これらのプロットした結果（図１３）は、この試験ではＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａによる処理がＩＬ−１ｒａの約１０倍有効であったことを示している。
ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａのこの優れた効力は、ＤＯＭ７−１６／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質が、重量基準で半分の数のＩＬ−１受容体結合エピトープであるＩＬ−１ｒａ［例えば、１ｍｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（ＭＷ．３１．２ｋＤ）が、ＩＬ−１受容体結合エピトープ数の約半分である１ｍｇのＩＬ−１ｒａ（ＭＷ．１７．１ｋＤ）を含む］しか含まないにもかかわらず、観察された。
この試験の結果は、血清アルブミンと結合するｄＡｂはＩＬ−１ｒａと連結させることができ（臨床上証明されているＲＡ治療）、得られた薬物融合体は長期血清半減期特性（ｄＡｂによって付与される）とＩＬ−１受容体結合特性（ＩＬ−１ｒａによって付与される）の両方を有することを示している。薬物融合体の血清滞留時間のおかげで、ＣＩＡの治療に有効なＤＯＭ７−１６／ＩＬ−１ｒａの用量はＩＬ−１ｒａに比べて劇的に減少した。
この試験の結果は、半減期の延長およびＡＵＣの増加という利益に加えて、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメント（例えばｄＡｂ）との薬物融合体または薬物複合体として調製された薬物は、薬物単独に勝る利点をもたらす非常に有効な治療剤であることを示している。例えば、マウスＣＩＡモデルで実証されたように、より低用量の薬物融合体でも、ＩＬ−１ｒａ単独と比較して有効であり、より長期間にわたり、ＩＬ−１によって引き起こされた関節の炎症および関節損傷を抑制し、疾患の進行をより強くくいとめた。
実施例７．抗ＳＡ ｄＡｂ／サポリン非共有結合性薬物複合体
リボソーム不活化タンパク質サポリン（抗癌剤）は、変性剤およびプロテアーゼに対して高度に安定的であり、Ｔリンパ球に対する標的毒素として使用されてきた。ビオチン−ストレプトアビジン結合によりサポリンをＤＯＭ７ｈ−８に結合することよって、非共有結合性薬物複合体を調製した。この非共有結合性薬物複合体によって得られた結果は、ＤＯＭ７ｈ−８は、薬物に結合した場合にもその血清アルブミン結合特性を保持していることを実証している。
ＨＢ２１５１細胞中で組換え核酸を発現させることによって、位置１０８（配列番号２４の第１０８のアミノ酸）のＣ末端アルギニンがシステイン残基に置換されたＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓと称するＤＯＭ７ｈ−８変異体を作製した。その細胞を増殖し、７２時間にわたり３０℃で終夜発現自己誘導型TB readymix（Merck KGa、ドイツ）で誘発した後、遠心分離によって上清を回収した。プロテインＬ−アガロース上での親和性捕捉を使用し、ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓをその上清から精製した。次いで、その樹脂を１０倍カラム容量のＰＢＳで２回洗浄し、ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出させた。溶出したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを０．２倍容量のＴｒｉｓ ｐＨ８で中和し、［セントリコン２０ｍｌ濃縮容器（Millipore Corp., MA）を使用し］１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
濃縮したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓは、ＮＡＰ５脱塩カラム（GE Healthcare/ Amersham Biosciences, NJ）を使用してバッファーをＰＢＳに交換し、濃度を決定した。次いで、ＥＺ−ＬＩＮＫスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce Biotechnology Inc., IL）を使用し、そのｄＡｂを（一級アミンにより）ビオチン化した。ビオチン化ｄＡｂをストレプトアビジン−サポリン（Advanced Targeting Systems、サンディエゴ）と１：１のモル比で混合した。
ｄＡｂ／サポリン複合体が形成されたことを確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してインタクトな複合体を検出した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc, NY）のウェルの半分に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１０μｇ／ｍｌで１ウェル当たり１００μｌの容量で終夜コートした。終夜インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いでプレート全体を２％ＰＢＳで２時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで０．５μＭに希釈したＤＯＭ７ｈ−８／サポリン非共有結合複合体で１時間インキュベートした。同じＥＬＩＳＡプレート上の対照として、０．５μＭの未結合サポリンおよび０．５μＭの未結合ＤＯＭ７ｈ−８を２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ中でインキュベートした。追加の対照は、ＨＡＳでコートしていないＥＬＩＳＡプレートのウェルでインキュベートし、２％Ｔｗｅｅｎでブロッキングした同じ３つの希釈したタンパク質であった。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで希釈したヤギ抗サポリンポリクローナル抗体（Advanced Therapeutic Systems）の１／２０００希釈液で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで（１／２０００抗ヤギＩｇ ＨＲＰ複合体の）二次検出抗体と共に１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで一回洗浄し、紙の上で叩いて乾燥した。ＥＬＩＳＡは、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン１００μｌで発色させ、１Ｍ塩酸５０μｌで反応を停止させた。ＤＯＭ７ｈ−８とサポリンの非共有結合複合体の存在は、複合体のＯＤ６００といずれかの非複合体化部分のＯＤ６００とを比較することによって確認された。
Figure 2008521426
この試験の結果は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントに対して薬物を複合体化することができ、その複合体化した抗原結合性フラグメントが血清アルブミン結合活性を保持することを示している。加えて、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用の安定性および強度のために、この結果は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性フラグメントの血清アルブミン結合活性を保持する共有結合した複合体および非共有結合した複合体を作製できることを示している。
実施例８．抗ＳＡ ｄＡｂ／フルオレセイン複合体
イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）とタンパク質のアミノ基、スルフヒドリル基、イミダゾイル基、チロシル基、またはカルボニル基とを架橋結合させることができる。その分子量は、多くの小分子薬物に匹敵するサイズの３８９Ｄａである。この複合体で得られる結果は、この抗ＳＡ ｄＡｂは、小さい化学物質と結合させた場合、その血清アルブミン結合特性を維持することを示し、抗ＳＡ ｄＡｂに小分子薬物を複合体化できることを示している。
実施例７に記載したようにして、濃縮したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを調製した。濃縮したｄＡｂは、ＮＡＰ５脱塩カラム（GE Healthcare/ Amersham Biosciences, NJ）を使用して５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ８（結合バッファー）にバッファー交換し、次いで２ｍｌセントリコン濃縮容器（Millipore Corp., MA）を使用し２．３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。製造業者の説明書に従って、ＦＩＴＣ（Pierce Biotechnology Inc.）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いでＦＩＴＣ：ｄＡｂのモル比が２４：１の結合バッファー中でｄＡｂと混合した。３０分間かけてその反応を進行させた。この時点で、予めＰＢＳで平衡化したＰＤ１０脱塩カラム（GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ）を使用して過剰な未反応ＦＩＴＣを反応から除去し、ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓ／ＦＩＴＣ複合体をＰＢＳで溶出した。
ＦＩＴＣ／ｄＡｂ結合反応が成功したことを確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、結合したｄＡｂを検出した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc, NY）のウェルの半分にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１０μｇ／ｍｌで１ウェル当たり１００μｌの容量で終夜コートした。終夜インキュベーション後、プレート全体をＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで全てのウェルを２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで２時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで１μＭに希釈したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓ／ＦＩＴＣと共に、１時間インキュベートした。同じＥＬＩＳＡプレート上の対照として、１μＭの対照ＦＩＴＣ結合抗体および１μＭの未結合ＤＯＭ７ｈ−８を２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ中でインキュベートした。追加の対照は、ＨＳＡでコートしていないが２％ＴｗｅｅｎでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートのウェル上でインキュベートした、３つの同じ希釈したタンパク質であった。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで希釈したラット抗ＦＩＴＣ抗体（Serotec）の１／５００希釈液と共に１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで希釈した二次検出抗体（１／５０００抗ラットＩｇ ＨＲＰ複合体）と共に１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで一回洗浄し、紙の上で叩いて乾燥した。基質として１ウェル当たり１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンシジンでＥＬＩＳＡを発色させ、反応を１ウェル当たり５０μｌの１Ｍ塩酸を加えて停止させた。ＤＯＭ７ｈ−８とＦＩＴＣの複合体の存在は、複合体のＯＤ６００といずれかの非複合体化部分のＯＤ６００とを比較することによって確認された。
Figure 2008521426
実施例９．抗ＳＡ ｄＡｂ／ペプチド複合体
多くのペプチドが治療効果を有する。ＮまたはＣ末端システインを有するモデルペプチドは抗血清アルブミンｄＡｂに結合させることができる。
この場合、以下の異なる４つのペプチドを使用する：ペプチド１ YPYDVPDYAKKKKKKC（配列番号６４）、ペプチド２ CKKKKKKYPYDVPDYA（配列番号６５）、ペプチド３ HHHHHHKKKKKKC（配列番号６６）、およびペプチド４：CKKKKKKHHHHHH（配列番号６７）。ペプチド１および２は赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）の配列を含み、ペプチド３および４はＨｉｓタグの配列を含む。実施例７に記載したようにして、濃縮したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを調製する。
濃縮したｄＡｂは、５ｍＭジチオトレイトールで還元し、次いでＮＡＰ５脱塩カラム（GE Healthcare/ Amersham Biosciences, NJ）を使用して結合バッファー（２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）にバッファー交換する。ｄＡｂ溶液に添加するＤＭＳＯ中１００ｍＭジチオジピリジンのストック由来の終濃度が５ｍＭのジチオジピリジンを使用して、（ｄＡｂがそれ自体で二量体化しないように）システインをブロッキングする。ｄＡｂおよびジチオジピリジンを２０〜３０分間置いて結合させる。次いで、ＰＤ１０脱塩カラムを使用し未反応ジチオジピリジンを除去し、結合バッファー（２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）でｄＡｂを溶出させる。次いで、得られたタンパク質を必要になるまで凍結する。
ペプチド１〜４は、個別に水に溶解して濃度を２００μＭとし、５ｍＭ ＤＴＴを使用して還元し、次いでＮＡＰ５脱塩カラム（GE Healthcare/ Amersham Biosciences, NJ）を使用して脱塩する。次いで、各ペプチドを、還元しブロッキングしたｄＡｂ溶液に２０：１の比率で加え、ペプチド−ｄＡｂ結合を生じさせる。ペプチドとｄＡｂの結合反応の成功を確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して抗ＳＡ ｄＡｂ／ペプチド複合体を検出する。
ＥＬＩＳＡプレート（Nunc, NY）にヒト血清アルブミンを１０μｇ／ｍｌで１ウェル当たり１００μｌの容量で終夜コートする。終夜インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで４％Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳで２時間ブロッキングする。ブロッキング後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで４％Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳで１μＭに希釈したＤＯＭ７ｈ−８／ペプチド複合体で１時間インキュベートする。同じＥＬＩＳＡプレート上の対照として、２０μＭの未結合ペプチドおよび１μＭの未結合ＤＯＭ７ｈ−８を４％ＭＰＢＳ中でインキュベートする。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いでペプチド１および２には４％Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳで希釈したヤギ抗ＨＡ抗体（Abcam）の１／２０００希釈液で、（ペプチド３および４には）同液で希釈したＮｉ ＮＴＡ−ＨＲＰの１／２０００希釈液で１時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、４％ＭＰＢＳで１／２０００に希釈した二次抗ヤギＨＲＰ抗体でヤギ抗ＨＡ抗体を含むウェルを１時間インキュベートする（他のウェルは１時間ブロッキングした）。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで一回洗浄し、次いで紙の上で叩いて乾燥する。ＥＬＩＳＡは、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで発色させ、反応を１Ｍ塩酸を加えて停止させる。ＤＯＭ７ｈ−８／ペプチド複合体の複合体の存在は、複合体のＯＤ６００といずれかの非複合体化部分のＯＤ６００とを比較することによって確認する。
実施例１０．
この予測的実施例は、ヒトＰＬＡＤドメインと、血清アルブミンと結合する免疫グロブリン可変ドメインとを含むタンパク質融合体の作製、精製、および特徴付けに使用するのに適当な方法について記載する。
ヒトＴＮＦＲ１のプレリガンド構築ドメイン（ＰＬＡＤドメイン）をヒト血清アルブミンと結合する免疫グロブリン可変ドメイン（ＤＯＭ７ｈ−８）のＮ末端に融合した融合タンパク質（ＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８が得られる）、または血清アルブミンと結合する免疫グロブリン可変ドメインのＣ末端にＰＬＡＤを融合した融合タンパク質（ＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤが得られる）を作製する。ＰＬＡＤのアミノ酸配列は、ヒトライブラリーから単離したｃＤＮＡ配列に由来し、配列番号８５のアミノ酸残基１〜５１である。ＤＯＭ７ｈ−８のアミノ酸配列は配列番号２４である。これらのタンパク質は、異なる３種の発現用生物：大腸菌（E.coli）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞中で発現され、精製され、in vitroアッセイおよびin vivo研究の範囲で試験される。
以下のヌクレオチド配列は、配列番号８５のアミノ酸残基１〜５１をコードする：
CTGGTCCCTCACCTAGGGGACAGGGAGAAGAGAGATAGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGG（配列番号９８）。
以下のヌクレオチド配列はＤＯＭ７ｈ−８をコードする：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGGAATTCCCCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGACGTATAGGGTGCCTCCTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG（配列番号９９）
融合遺伝子の構築、クローニング、および発現
重複配列を含む一対のプライマーを使用し、両遺伝子を２つの別々の反応で増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって融合遺伝子産物を生成する。重複配列は、様々な長さおよび組成のポリペプチドリンカー配列［例えば、Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１００）など、柔軟な（flexible）６個のアミノ酸ペプチド］を導入するために使用される。このようにして形成された２つのＰＣＲ生成物は、ＳＯＥ−ＰＣＲ（「スプライシング−バイ−オーバーラップ−エクステンションＰＣＲ」）と称される方法によって一つに融合されるが、このＳＯＥ−ＰＣＲでは、両鋳型は一つに（１：１の割合で）混合され、プライマーの不在下で数ラウンドのＰＣＲ増幅にかけられる。次いで、新たに形成された融合ＰＣＲ産物を、少なくとも融合遺伝子全体を挟み込む一対の外部プライマーを使用し、ＰＣＲによってさらに増幅する。プライマーは、遺伝子融合生成物のどちらかの末端に制限部位を導入するように設計する。その制限部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼでその遺伝子融合生成物を消化し、精製し、続いて発現系に適当なベクターのマルチクローニング部位に、ベクター中の任意の必要なアミノ末端分泌配列及びプロセシング配列と融合するようにライゲートする。６個のアミノ酸リンカー（ＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒ（配列番号１００））をコードする介在ＤＮＡセグメントが付加された、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を作製するために、各反応で使用されるプライマーを表９に示す。それらのプライマーの配列を表１０に示す。
使用するベクターは以下のものである。
大腸菌用のｐＵＣ１１９：融合生成物の発現が大腸菌ペリプラズム（ジスルフィド結合を形成するためのシステインの酸化に適当な環境）を標的とするように、酵母糖脂質アンカー型表面タンパク質分泌シグナル（ＧＡＳ）をアミノ末端リーダー配列としてインフレームでクローン化する。そのリーダー配列は、大腸菌シグナルペプチダーゼによって除去されて、ＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８またはＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤ融合生成物の天然アミノ末端が得られる。この系での発現は、Ｐｌａｃプロモーターによって駆動され、終濃度０．０５〜１ｍＭのイソプロピル−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を対数増殖期培養物に添加することによって誘導される。
哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞など）での発現用のｐＤＯＭ３２：融合生成物がＶ−Ｊ２−Ｃ分泌シグナル配列とインフレームとなるように、ＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８（またはＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤ）をクローン化する。発現は、ＨＥＫ−２９３細胞中で、ｐＤＯＭ３２のＣＭＶプロモーターによって構成的に駆動される。分泌されると、そのシグナルペプチドは除去されて、アミノ末端に追加のアミノ酸をもたないインタクトな融合タンパク質が得られる。
大腸菌用のｐＥＴ２３：ＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８（またはＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤ）は、ＩＰＴＧ誘導の際にいかなるリーダーもなしに大腸菌細胞質中で不溶性タンパク質として発現される。それらのタンパク質は、融合生成物のＮ末端に追加のアミノ末端メチオニン残基を有する。この系での発現は、終濃度０．０５〜１ｍＭのイソプロピル−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を対数増殖期培養物に添加することによって誘導される。
ピキア・パストリスでの発現用のｐＰＩＣＺα：分泌が培養上清に方向づけされるように、ＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８（またはＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤ）を酵母α接合因子リーダー配列に対してインフレームでクローン化する。分泌されるとＫｅｘ２およびＳｔｅ１３プロテアーゼによってリーダー配列は除去され、アミノ末端に追加のアミノ酸を持たないタンパク質が得られる。この系での発現は、培地に１００％メタノールを添加（０．５％〜２．５％最終容量）することによって誘導される。
それらの組換え融合遺伝子は、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用してｐＵＣ１１９のマルチクローニング部位に、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＤＯＭ３２に、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを使用してｐＰＩＣＺα中にクローン化される。
最初に挿入物を含むプラスミドを大腸菌細胞中に形質転換する。次いで、そのプラスミドを取り出し、当該遺伝子を配列決定して正確な遺伝子配列の存在を確認する。次いでプラスミドを大量に調製し、タンパク質発現に適した細胞中に形質転換するために使用する。
ｐＵＣ１１９ベクターを使用する発現に適当な細胞は、以下：ＴＧ１、ＴＢ１、ＨＢ２１５１、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、ＤＨ５、ＵＴ５６００、Ｗ３１１０などから選択する。ｐＤＯＭ３２ベクターを使用する発現に適当な細胞は、以下：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＳ１、ＣＯＳ、ＣＨＯなどから選択する。ｐＥＴ２３ベクターを使用する発現に適当な細胞は、以下：ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＰＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１Ｔｕｎｅｒ、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａなどから選択する。ｐＰＩＣＺαベクターを使用する発現に適当な細胞は、ＫＭ７１Ｈ、Ｘ３３から選択する。
ｐＵＣ１１９、ｐＤＯＭ３２、およびｐＰＩＣＺαに基づく発現では、融合生成物は培養上清に分泌される。従って、発現に続いて培養液を遠心して細胞をペレット化する。その上清を回収し、ろ過して残存する細胞を除去し、直接、精製処理する。ｐＥＴ−２３に基づく発現では、融合生成物は、ペリプラズム中に封入体として蓄積される。封入体は、細胞溶解ステップおよび封入体を清浄化するための数回の洗浄ステップを含む当技術分野で公知の方法に従って調製される。高濃度の変性剤（例えば尿素、塩酸グアニジン）および還元剤（例えばＤＴＴ、β−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ）を加えることによって封入体を可溶化する。当技術分野で公知の方法に従って、漸減量の変性剤を加えたバッファーでの緩徐透析によって、または再折りたたみバッファーでの迅速希釈によって、それらの融合生成物の再折りたたみを行う。Ｌ−アルギニン、グリセロールなどの添加物、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼインヒビター、およびＧＳＨおよびＧＳＳＧなどの酸化還元剤を再折りたたみバッファーに加えると折たたみ収量は向上する。
融合タンパク質の精製
融合タンパク質は、ペプトストレプトコッカル（Peptostreptococcal）プロテインＬアガロースカラム上でアフィニティー精製する。これは、ＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８（またはＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤ）融合タンパク質の免疫グロブリン可変ドメイン成分とプロテインＬとの間の特異的高親和性相互作用を利用する。典型的には、この試料は、中性ｐＨでプロテインＬカラムにロードされる。カラムは、高塩度中性ｐＨで洗浄し、低ｐＨバッファーを加えることによって試料を溶出させる。溶出した試料を採取しｐＨを中和にする。残存するいかなる混入物質も、カチオンまたはアニオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、または別の適当な方法によって除去される。
アミノ末端配列決定およびＭＡＬＤＩ質量分析によって、得られた配列および質量がＤＮＡ配列を基に予想したものと適合することで、精製融合タンパク質の正体（identity）を確認する。
融合タンパク質の活性
次いで、任意のリンカーを有する融合生成物の生物活性についてアッセイする。
ＰＬＡＤ活性：ＰＬＡＤドメインが細胞表面のＴＮＦＲ１と阻害性複合体を形成しうるように、精製したＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８（またはＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤ）融合タンパク質と共にヒトＭＲＣ−５細胞を予めインキュベートする。次いで、細胞をヒトＴＮＦ−αで処理し、３７℃でインキュベートする。次いで、ＩＬ−８ ＥＬＩＳＡを使用して、ＴＮＦ刺激に応答してＭＲＣ−５細胞が分泌するＩＬ−８の量を測定する。融合タンパク質のＰＬＡＤ活性は、用量応答的様式でＩＬ−８の分泌が阻害されることによって示される。
抗血清アルブミンの活性：ＰＬＡＤ−ＤＯＭ７ｈ−８（またはＤＯＭ７ｈ−８−ＰＬＡＤ）融合タンパク質の血清アルブミンに対する親和性を分析するために、ＣＭ−５ビアコアチップをｐＨ５．５で約５００レゾナンス・ユニットのアルブミンと結合させ、ビアコアチップ上にビアコアＨＢＳ−ＥＰバッファー中に５ｎＭ〜５μＭの範囲で希釈した精製融合タンパク質を流すことによって結合曲線を得る。親和性（ＫＤ）は、各融合タンパク質のＫＤの範囲で生成されたトレースに対してオン速度曲線とオフ速度曲線を適合させることよって計算され、融合パートナー（別の分子実体としての）の不在下でＤＯＭ７ｈ−８の親和性（ヒト血清アルブミンに対してＫｄ：７０ｎＭ）と比較する。
薬物動態試験：４匹ずつのラット群には、融合タンパク質、または血清アルブミンと結合する対照免疫グロブリン可変ドメイン（どちらについても［３Ｈ］−ＮＳＰで放射性標識する）の１．５ｍｇ／ｋｇを静脈内ボーラスで与え、放射活性計数値分析用に７日間にわたって尾静脈から血清試料を採取する。血清濃度 対 時間曲線は、WinNonlinソフトウェアを使用する１または２コンパートメントモデルに適合させる。融合タンパク質については、ＰＬＡＤ部分が血清アルブミンと結合する免疫グロブリン可変ドメインの最終半減期に影響を及ぼさない限り、１５時間のオーダーの最終半減期が予測される。
Figure 2008521426
Figure 2008521426
本発明は、特に、その好ましい実施形態に関して示し記載されているが、その中で、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなしに、形態および詳細に様々な変化を加えうることは当業者には理解されよう。
図１Ａはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）と結合させることにより選択した３個のＶκのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ぶＭＳＡ１６（配列番号１）、ＤＯＭ７ｍ−１２とも呼ぶＭＳＡ１２（配列番号２）、およびＤＯＭ７ｍ−２６とも呼ぶＭＳＡ２６（配列番号３）と名付けられたＶκ由来のものである。 図１Ｂはラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合させることにより選択した６個のＶκのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号５）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号６）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号７）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号８）、およびＤＯＭ７ｒ−８（配列番号９）と名付けられたＶκ由来のものである。 図１Ｃはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合させることにより選択した６個のＶκのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号１０）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号１１）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号１２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号１３）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号１４）、およびＤＯＭ７ｈ−７（配列番号１５）と名付けられたＶκ由来のものである。 図１Ｄはヒト血清アルブミンおよびコンセンサス配列（配列番号２３）と結合させることにより選択した７個のＶＨアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントした配列は、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号１６）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号１７）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号１８）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号１９）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号２０）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号２１）、およびＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号２２）と名付けられたＶＨ由来のものである。 図１Ｅはヒト血清アルブミンおよびラット血清アルブミンと結合させることにより選択した３個のＶκアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号２４）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号２５）、およびＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号２６）と名付けられたＶκ由来のものである。 図２Ａおよび２ＢはそれぞれＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａとも呼ぶ）融合体およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６（ＩＬ−１ｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ぶ）融合体を発現させるために使用するベクターの模式図である。 図２Ｃおよび２ＤはＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−１ｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ぶ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）および該融合体のアミノ酸配列（配列番号２８）を示す図である。 図２Ｃおよび２ＤはＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−１ｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ぶ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）および該融合体のアミノ酸配列（配列番号２８）を示す図である。 図２Ｅおよび２ＦはＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａとも呼ぶ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）および該融合体のアミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。 図２Ｅおよび２ＦはＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａとも呼ぶ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）および該融合体のアミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。 図２Ｇおよび２Ｈは血清アルブミンに結合しなかったダミーＩＬ−１ｒａ融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）および該融合体のアミノ酸配列（配列番号３２）を示す図である。 図２Ｇおよび２Ｈは血清アルブミンに結合しなかったダミーＩＬ−１ｒａ融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）および該融合体のアミノ酸配列（配列番号３２）を示す図である。 図３ＡはＩＬ−１がＨｅＬａ細胞によるＩＬ−８の産生を誘発することを示し、かつＩＬ−８がＥＬＩＳＡアッセイで検出される機序を示す図である。図３ＢはＩＬ−１ｒａ（◆、「Ｒ＆Ｄ」と記載）、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（■）、およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６（△）のそれぞれが、ＩＬ−１が誘発する培養ＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−８の分泌を、阻害したことを示すグラフである。観察された阻害は、ＩＬ−１ｒａ、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６について用量依存的であった。 図４Ａ〜４Ｃはマウス血清アルブミン不含（４Ａ）、５％マウス血清アルブミン含有（４Ｂ）、または１０％マウス血清アルブミン含有（４Ｃ）のアッセイにおいて、ＩＬ−１ｒａ（◆）およびＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（■）の両方が、ＩＬ−１が誘発する培養ＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−８の分泌を阻害したことを示すグラフである。観察された阻害は、試験した全ての条件下で、ＩＬ−１ｒａおよびＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａについて用量依存的であった。 図５はＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ融合体およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体の両方が血清アルブミンと結合したが、ダミーＩＬ１−ｒａ融合体は結合しなかったことを示すＥＬＩＳＡの結果の概略図である。 図６Ａ〜６Ｃはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｈ−１（６Ａ）、ＨＳＡと結合するクローンＤＯＭ７ｈ−７（６Ｂ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｒ−１（６Ｃ）のビアコア（BIACORE）親和性データを示すセンサグラムおよび表である。 図６Ａ〜６Ｃはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｈ−１（６Ａ）、ＨＳＡと結合するクローンＤＯＭ７ｈ−７（６Ｂ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｒ−１（６Ｃ）のビアコア（BIACORE）親和性データを示すセンサグラムおよび表である。 図６Ａ〜６Ｃはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｈ−１（６Ａ）、ＨＳＡと結合するクローンＤＯＭ７ｈ−７（６Ｂ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｒ−１（６Ｃ）のビアコア（BIACORE）親和性データを示すセンサグラムおよび表である。 図６Ａ〜６Ｃはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｈ−１（６Ａ）、ＨＳＡと結合するクローンＤＯＭ７ｈ−７（６Ｂ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｒ−１（６Ｃ）のビアコア（BIACORE）親和性データを示すセンサグラムおよび表である。 図６Ａ〜６Ｃはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｈ−１（６Ａ）、ＨＳＡと結合するクローンＤＯＭ７ｈ−７（６Ｂ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｒ−１（６Ｃ）のビアコア（BIACORE）親和性データを示すセンサグラムおよび表である。 図６Ａ〜６Ｃはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｈ−１（６Ａ）、ＨＳＡと結合するクローンＤＯＭ７ｈ−７（６Ｂ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するクローンＤＯＭ７ｒ−１（６Ｃ）のビアコア（BIACORE）親和性データを示すセンサグラムおよび表である。 図７はＤＯＭ７ｈ−１、ＤＯＭ７ｒ−１、ＤＯＭ７ｈ−２、ＤＯＭ７ｒ−３、ＤＯＭ７ｈ−７、ＤＯＭ７ｈ−８、ＤＯＭ７ｒ−８、ＤＯＭ７ｒ−１３、ＤＯＭ７ｒ−１４、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｈ−２２、ＤＯＭ７ｈ−２３、ＤＯＭ７ｈ−２６、ＤＯＭ７ｒ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６、ＤＯＭ７ｒ−２７、およびＤＯＭ７Ｒ−３１の、それらが結合する血清アルブミンに対する親和性を示す表である。ＤＯＭ７ｈ−８は、ブタ血清アルブミンにも６０ｎＭの親和性（ＫＤ）で結合する。 図８ＡはGenBankにアクセッション番号ＮＭ_１７３８４２で登録されているヒトインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号３３）を示す図である。この核酸は、位置６５から始まるオープンリーディングフレームを有する。図８Ｂは図８Ａに示す核酸（配列番号３３）によってコードされるヒトＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。この成熟タンパク質は、１５２アミノ酸残基（配列番号３４のアミノ酸残基２６〜１７７）からなる。 ＣＤ１系統の雄動物に一回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（用量は約１．５ｍｇ／ｋｇであった）を行った後、マウス血清中のＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質の濃度（μｇ／ｍＬ）を経時的（日）に示すグラフである。血清濃度は、ヤギ抗ＨＡ（Abcam, UK）捕捉剤およびプロテインＬ−ＨＲＰ（Invitrogen, USA）検出試薬を使用しＥＬＩＳＡによって決定した。試験試料との比較可能性を確保するために、既知濃度のＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線を１×マウス血清の存在下で作成した。１コンパートメントモデル（WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA）によるモデリングによって、ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質の最終相ｔ１／２は２９．１時間であり、曲線下面積は５５９ｈｒ・μｇ／ｍＬであることが示された。 図１０はラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合させることにより選択したＶκのアミノ酸配列を示す図である。図示する配列は、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号３７）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号３８）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号３９）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号４０）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号４１）と名付けられたＶκ由来のものである。 図１１Ａ〜１１Ｂはラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨアミノ酸配列を示す図である。図示する配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５４）、およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５５）と名付けられたＶＨ由来のものである。 図１１Ａ〜１１Ｂはラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨアミノ酸配列を示す図である。図示する配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５４）、およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５５）と名付けられたＶＨ由来のものである。 図１１Ａ〜１１Ｂはラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨアミノ酸配列を示す図である。図示する配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５４）、およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５５）と名付けられたＶＨ由来のものである。 図１１Ａ〜１１Ｂはラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨアミノ酸配列を示す図である。図示する配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５４）、およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５５）と名付けられたＶＨ由来のものである。 図１２はＣＤ１系統の雄動物に一回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（用量は約１．５ｍｇ／ｋｇであった）を行った後、それぞれＨＡエピトープタグを含むＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６、またはＭＳＡに結合しない対照ｄＡｂのマウス血清中濃度（初期投与量に対する％）を経時的に示すグラフである。血清濃度は、ヤギ抗ＨＡ（Abcam, UK）捕捉剤およびプロテインＬ−ＨＲＰ（Invitrogen, USA）検出試薬を使用するＥＬＩＳＡによって決定した。試験試料との比較可能性を確保するために、既知濃度のＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線を１×マウス血清の存在下で作成した。１コンパートメントモデル（WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA）によるモデリングによって、対照ｄＡｂの最終相ｔ１／２βは２０分であったが、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６は血清中に非常に長く残存したことが示された。 図１３はコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルでの関節炎の治療において、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａが、ＩＬ−１ｒａまたはENBREL（登録商標）（entarecept; Immunex Corporation）よりも有効であったことを示すグラフである。関節炎を誘導し、２１日目から、マウスをデキサメタゾン０．４ｍｇ／ｋｇ（ステロイド）で、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ １ｍｇ／ｋｇ（ＩＬ−１ｒａ／抗ＳＡ １ｍｇ／ｋｇ）または１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＬ−１ｒａ／抗ＳＡ １０ｍｇ／ｋｇ）で、ＩＬ−１ｒａ １ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで、ENBREL（登録商標）（entarecept; Immunex Corporation）５ｍｇ／ｋｇで、または生理食塩水で、処置した。結果は、この研究では、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａが、ＩＬ−１ｒａまたはENBREL（登録商標）（entarecept; Immunex Corporation）よりも有効であったことを示している。ＩＬ−１ｒａに対する応答は、予想通り用量依存的であり、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａに対する応答も用量依存的であった。１ｍｇ／ｋｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａによる治療の平均スコアは、１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１ｒａによる治療によって得られた平均スコアよりも一貫して低かった。結果は、この研究では、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａによる治療が、ＩＬ−１ｒａよりも１０倍有効性が高かったことを示している。 図１４Ａ〜１４Ｇは、サポリンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図１４Ａは、Swissprotアクセッション番号Ｐ２７５５９として登録されているサポリン−２前駆体のアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。そのシグナルペプチドは、配列番号５６のアミノ酸１〜２４である。図１４Ｂは、Swissprotアクセッション番号Ｐ２７５６０として登録されているサポリン−３のアミノ酸配列（配列番号５７）を示す。 図１４Ａ〜１４Ｇは、サポリンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図１４Ｃは、Swissprotアクセッション番号Ｐ２７５６１として登録されているサポリン−４前駆体のアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。そのシグナルペプチドは、配列番号５８のアミノ酸１〜２４である。図１４Ｄは、Swissprotアクセッション番号Ｑ４１３８９として登録されているサポリン−５のアミノ酸配列（配列番号５９）を示す。 図１４Ａ〜１４Ｇは、サポリンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図１４Ｅは、Swissprotアクセッション番号Ｐ２０６５６として登録されているサポリン−６前駆体のアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。そのシグナルペプチドは、配列番号６０のアミノ酸１〜２４であり、可能性のあるプロペプチドは配列番号６０のアミノ酸２７８〜２９９である。成熟ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸２５〜２７７（配列番号６１）である。図１４Ｆは、Swissprotアクセッション番号Ｑ４１３９１として登録されているサポリン−７のアミノ酸配列（配列番号６２）を示す。 図１４Ａ〜１４Ｇは、サポリンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図１４Ｇは、サポリン−６の数種の変異体およびアイソフォームを包含するコンセンサスアミノ酸配列（配列番号６３）を示す。 国際公開第２００４／０４１８６２号に開示されている、マウス血清アルブミンに結合する数種のラクダ科動物のＶＨＨのアミノ酸配列を示す。配列Ａ（配列番号６８）、配列Ｂ（配列番号６９）、配列Ｃ（配列番号７０）、配列Ｄ（配列番号７１）、配列Ｅ（配列番号７２）、配列Ｆ（配列番号７３）、配列Ｇ（配列番号７４）、配列Ｈ（配列番号７５）、配列Ｉ（配列番号７６）、配列Ｊ（配列番号７７）、配列Ｋ（配列番号７８）、配列Ｌ（配列番号７９）、配列Ｍ（配列番号８０）、配列Ｎ（配列番号８１），配列Ｏ（配列番号８２），配列Ｐ（配列番号８３），配列Ｑ（配列番号８４）。

Claims (35)

  1. Ｘ’部分およびＹ’部分を含む薬物融合体であって、
    Ｘ’が、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体であり、かつ
    Ｙ’が、in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分である、薬物融合体。
  2. 前記ポリペプチド結合性部分が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する、請求項１に記載の薬物融合体。
  3. 前記ポリペプチド結合性部分が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合性フラグメントである、請求項１に記載の薬物融合体。
  4. 前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体が、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸と同一である少なくとも約１０個連続したアミノ酸の領域を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬物融合体。
  5. ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列が、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項４に記載の薬物融合体。
  6. 前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列が、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項５に記載の薬物融合体。
  7. Ｘ’部分およびＹ’部分を含む薬物融合体であって、
    Ｘ’が、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体であり、かつ
    Ｙ’が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、薬物融合体。
  8. Ｘ’が、Ｙ’のアミノ末端に位置する、請求項７に記載の薬物融合体。
  9. Ｙ’が、Ｘ’のアミノ末端に位置する、請求項７に記載の薬物融合体。
  10. 前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の薬物融合体。
  11. Ｙ’が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の薬物融合体。
  12. Ｙ’が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の薬物融合体。
  13. 前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体が、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸と同一である少なくとも約１０個連続したアミノ酸の領域を含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の薬物融合体。
  14. ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列が、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１３に記載の薬物融合体。
  15. ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列が、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１４に記載の薬物融合体。
  16. 血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと共有結合しているＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体とを含む薬物複合体。
  17. ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体が、リンカー部分を介して、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと共有結合している、請求項１６に記載の薬物複合体。
  18. 血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６または１７に記載の薬物複合体。
  19. ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体が、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸と同一である少なくとも約１０個連続したアミノ酸の領域を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の薬物複合体。
  20. ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列が、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＦＡＳ、ＬＴβＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、およびＤＲ４のＰＬＡＤドメインから選択されるＰＬＡＤドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１９に記載の薬物複合体。
  21. ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体のアミノ酸配列が、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２０に記載の薬物複合体。
  22. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の薬物融合体をコードする単離または組換え核酸。
  23. 請求項２２に記載の組換え核酸を含む核酸構築体。
  24. 請求項２２に記載の組換え核酸または請求項２３に記載の構築体を含む宿主細胞。
  25. 請求項２４に記載の宿主細胞を前記組換え核酸の発現に適当な条件下で維持し、それによって薬物融合体を生成させることを含む、薬物融合体を生成する方法。
  26. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の薬物融合体または薬物複合体および生理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  27. 炎症性疾患を患う個体を治療する方法であって、前記個体に、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の薬物複合体または薬物融合体の治療有効量を投与することを含む方法。
  28. 炎症性疾患が関節炎である、請求項２７に記載の方法。
  29. 治療、診断、または予防に使用する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の薬物複合体または薬物融合体。
  30. 炎症性疾患治療用医薬品を製造するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の薬物複合体または薬物融合体の使用。
  31. 炎症性疾患が関節炎である、請求項３０に記載の使用。
  32. 肺炎症または呼吸器疾患の治療用医薬品を製造するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の薬物複合体または薬物融合体の使用。
  33. in vivo血清半減期を延長するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合性部分に結合している、ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体を含む薬物組成物であって、前記薬物組成物が、前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体に比べてより長いin vivo血清半減期を有し、かつ前記ＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体の活性の少なくとも約９０％を有する、薬物組成物。
  34. 第１の部分および第２の部分を含む薬物融合体であって、第１の部分がＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体であり、第２の部分がin vivo血清半減期を延長するポリペプチドである、薬物融合体。
  35. in vivo血清半減期を延長するポリペプチドと複合体化したＰＬＡＤドメインまたはＰＬＡＤドメインの機能性変異体を含む、薬物複合体。
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