KR20070099584A - 도메인 항체와 컨주게이션되어 혈청 반감기가 증가된ｐｌａｄ 도메인 펩티드 - Google Patents

도메인 항체와 컨주게이션되어 혈청 반감기가 증가된ｐｌａｄ 도메인 펩티드 Download PDF

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이안 엠. 톰린슨
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도만티스 리미티드
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Abstract

본원발명은 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 약물 조성물, 융합체 및 컨주게이트를 제공한다. 상기 약물 융합체 및 컨주게이트는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편에 융합되거나 결합된 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함한다. 본원발명의 약물 조성물, 융합체 및 컨주게이트는 비결합되거나(unconjugated) 융합되지 않은 치료 제제 또는 진단 제제와 비교하여 생체내에서 더 긴 혈청 반감기를 갖는다.
PLAD 도메인, 반감기, 염증, 융합체

Description

도메인 항체와 컨주게이션되어 혈청 반감기가 증가된 ＰＬＡＤ 도메인 펩티드{PLAD DOMAIN PEPTIDES WITH INCREASED SERUM HALF LIFE DUE TO CONJUGATION TO DOMAIN ANTIBODIES}
관련된 특허출원
본원은 2005년 11월 10일자로 출원되어 미국을 지정국으로 지정한 PCT 국제 특허출원 제 PCT/GB2005/004319호의 일부계속출원이며; 2005년 5월 31일자로 출원되어 영국을 지정국으로 지정한 PCT 국제 특허출원 제 PCT/GB2005/002163호의 일부계속출원이며, 2004년 12월 2일자로 출원된 미국 가특허출원 제 60/632,361호에 대한 우선권 주장의 이익을 향유한다. 상기 특허출원의 전체 교시내용은 본원의 참조로서 여기에 포함된다.
치료 및/또는 진단 목적으로 유용하게 이용될 수 있는 활성을 갖는 많은 약물들이 그 가치가 제한되는데, 이는 이들 약물이 투여되었을 때에 신체로부터 빠르게 제거되기 때문이다. 예를 들어, 치료적으로 유용한 활성을 갖는 많은 폴리펩티드는 신장을 통한 순환으로부터 빠르게 제거된다. 이에 따라, 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해서는 많은 용량이 투여되어야 한다. 개선된 약동학적 특성을 갖는 개선된 치료 및 진단 제제에 대한 필요가 존재한다. 혈청 알부민에 결합하는 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[EP 0486525 B1(Cemu Bioteknik AB); US 6,267,964 B1(Nygren et al.); WO 04/001064 A2(Dyax, Corp.); WO 02/076489 A1(Dyax, Corp.); WO 01/45746(Genentech, Inc.)] 참조).
발명의 개요
본원 발명은 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 함유하는 약물 조성물, 융합체 및 컨주게이트에 관한 것이다. 한 측면에서, 본원 발명은 X'이 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체이고; Y'가 생체내에서 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분인, 부분 X' 및 Y'를 포함하는 약물 융합체에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드 결합 부분은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌다. 예를 들어, 폴리펩티드 결합 부분은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체는 바람직하게는 TNRR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 및 DR4의 PLAD 도메인으로부터 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열 내의 아미노산과 동일한 약 10개 이상의 연속적 아미노산의 영역을 포함한다. 예를 들어, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 및 DR4의 PLAD 도메인으로부터 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지닐 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 서열번호:87, 서열번호:88, 서열번호:89, 서열번호:90, 서열번호:91, 서열번호;92, 서열번호:93, 서열 번호:94, 서열번호:95, 서열번호:96 및 서열번호:97로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산과 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지닌다.
몇몇 구체예에서, 상기 약물 융합체는 X'이 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체이고; Y'이 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 면역 글로불린 중쇄 가변 도메인 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인인, 부분 X' 및 Y'을 포함한다. 이러한 구체예에서, X'는 Y'에 대해 아미노 말단에 위치할 수 있거나, Y'는 X'에 대해 아미노 말단에 위치할 수 있다. 바람직하게는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 인간 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지닌다.
특정 구체예에서, Y'는 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
그외 다른 구체예에서, Y'는 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체는 바람직하게는 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 및 DR4의 PLAD 도메인으로부터 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열 내의 아미노산 서열과 동일한 약 10개 이상의 연속적 아미노산의 영역을 포함한다. 예를 들어, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 및 DR4의 PLAD 도메인으로부터 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지닐 수 있다. 또 다른 일예에서, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 서열번호;S7, 서열번호:88, 서열번호;89, 서열번호:90, 서열번호:91, 서열번호;92, 서열번호;93, 서열번호:94, 서열번호:95, 서열번호:96 및 서열번호:97로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지닌다.
또 다른 측면에서, 본원 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 또는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 및 상기 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 또는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 공유적으로 결합되는 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 약물 컨주게이트에 관한 것이다. 몇몇 구체예에서, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체는 링커 부분을 통해 상기 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 또는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 공유적으로 결합된다.
특정 구체예에서, 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호; 13, 서열번호;14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 서열번호:26, 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체는 바람직하게는 TNFR1, TNFR2, FAS, LT PR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 및 DR4의 PLAD 도메인으로부터 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열 내의 아미노산과 동일한 약 10개 이상의 연속적인 아미노산 서열의 영역을 포함한다. 예를 들어, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVBM, OX40 및 DR4의 PLAD 도메인으로부터 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지닐 수 있다. 또 다른 일예에서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 서열번호:87, 서열번호:88, 서열번호:89, 서열번호:90, 서열번호:91, 서열번호:92, 서열번호:93, 서열번호:94, 서열번호:95, 서열번호:96 및 서열번호:97로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지닌다.
본원 발명은 또한 본원 발명의 약물 융합체를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산 및 핵산 구성물에 관한 것이다. 본원 발명은 또한 본원 발명의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 상기 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 유지시킴으로써 약물 융합체를 생성시키는, 약물 융합체를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본원 발명은 또한 본원 발명의 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.
본원 발명은 또한 염증성 질병을 지니는 개체에게 치료적 유효량의 본원 발명의 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체를 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 염증성 질병은 관절염이다.
본원 발명은 또한 치료, 진단 또는 예방에 사용하기 위한 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체, 및 염증성 질병, 예를 들어 본원에 기술된 질병 (예를 들어, 관절염)의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본원 발명의 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체의 용도에 관한 것이다.
본원 발명은 또한 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분에 결합되는 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 약물 조성물에 관한 것으로서, 상기 약물 조성물은 상기 PLAD 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체에 비해 더 긴 생체내 혈청 반감기를 지니고, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 활성의 약 90% 이상의 활성을 지닌다.
본원 발명은 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체 및 생체내 혈청 반감기를 연장시키는 폴리펩티드를 포함하는 컨주게이트 또는 융합 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 혈청 알부민, 알부님 단편 또는 알부민 변이체, 또는 신생아 Fc 수용체가 있다. 상기 컨주게이트에서, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체 및 생체내 혈청 반감기를 연장시키는 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같이 직접적 또는 간접적으로, 공유적 또는 비공유적으로 컨주게이팅될 수 있다. 융합 단백질에서, PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체 및 생체내 혈청 반감기를 연장시키는 폴리펩티드는 단일 또는 다중 카피로, 임의의 요망되는 배향으로 존재할 수 있다.
도 1A는 생쥐 혈청 알부민(MSA)에 대한 결합에 의해 선별된 3개의 Vκs의 아미노산 서열을 정리하여 나열한 도면이다. 상기 나열된 아미노산 서열은, MSA16(DOM7m-16(서열번호:1)으로도 기술됨), MSA12(DOM7m-12(서열번호:2)로도 기술됨), 및 MSA26(DOM7m-26(서열번호:3)으로서도 기술됨)으로 지정된 Vκs로부터 도출된 것이다.
도 1B는 래트 혈청 알부민(RSA)에 대한 결합에 의해 선별된 6개의 Vκ의 아미노산 서열을 정리하여 나열한 도면이다. 상기 나열된 아미노산 서열은 DOM7r-1(서열번호:4), DOM7r-3(서열번호:5), DOM7r-4(서열번호:6), DOM7r-5(서열번호:7), DOM7r-7(서열번호:8), 및 DOM7r-8(서열번호:9)으로 지정된 Vκ들로부터 도출된 것이다.
도 1C는 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합함에 의해 선별된 6개의 Vκ의 아미노산 서열을 정리하여 나열한 도면이다. 상기 나열된 아미노산 서열은 DOM7h-2(서열번호:10), DOM7h-3(서열번호:11), DOM7h-4(서열번호:12), DOM7h-6(서열번호:13), DOM7h-1(서열번호:14), 및 DOM7h-7(서열번호:15)으로 지정된 Vκ들로부터 도출된 것이다.
도 1D는 인간 혈청 알부민 및 컨센서스(consensus) 서열(서열번호:23)에 대한 결합에 의해 선별된 7개의 VΗ들의 아미노산 서열을 정리하여 나열한 도면이다. 상기 나열된 서열은 DOM7h-22(서열번호:16), DOM7h-23(서열번호:17), DOM7h-24(서 열번호:18), DOM7h-25(서열번호:19), DOM7h-26(서열번호:20), DOM7h-21(서열번호:21), 및 DOM7h-27(서열번호:22)로 지정된 VΗ들에서 도출된 것이다.
도 1E는 인간 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 대한 결합에 의해 선별된 3개의 Vκ의 아미노산 서열을 정리하여 나열한 도면이다. 상기 나열된 아미노산 서열은 DOM7h-8(서열번호:24), DOM7r-13(서열번호:25), 및 DOM7r-14(서열번호:26)로 지정된 Vκ들로부터 도출된 것이다.
도 2A 및 2B는 각각 MSA16IL-1ra(DOM7m-16/IL-1ra로도 언급됨) 및 IL-1raMSA16(IL-1ra/DOM7m-16으로도 언급됨) 융합체를 발현하는데 사용되는 벡터의 개괄적인 지도이다.
도 2C 내지 2D는 IL-1raMSA16 융합체(IL-1ra/DOM7m-16으로도 언급됨)를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호:27) 및 융합체의 아미노산 서열(서열번호:28)을 도시한다.
도 2E 내지 2F는 MSA16IL-1ra 융합체(DOM7m-16/IL-1ra로도 언급됨)를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호:29) 및 융합체의 아미노산 서열(서열번호:30)을 도시한다.
도 2G 내지 2H는 혈청 알부민에 결합하지 않는 더미(Dummy)IL-1ra 융합체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열(서열번호:31) 및 융합체의 아미노산 서열(서열번호:32)를 도시한다.
도 3A는 IL-1이 HeLa 세포에 의한 IL-8의 생성을 유도하는 것을 보여주고, IL-8이 ELISA 검정에서 검출되는 기전을 보여주는 도면이다.
도 3B는 IL-1ra(◆, "R&D"로 표지), MSA16IL-1ra(■) 및 IL-1raMSA16(▲) 각각이 배양된 MRC-5 세포에 의한 IL-1 유도성 IL-8 분비를 억제하였음을 도시하는 그래프이다. 관찰된 억제는 IL-1ra, MSA16IL-1ra, 및 IL-1raMSA16에 대해 용량-의존적이었다.
도 4A 내지 4C는 IL-1ra(◆) 및 MSA16IL-1ra(■) 둘 모두가 0% 생쥐 혈청 알부민(4A), 5% 생쥐 혈청 알부민(4B) 또는 10% 생쥐 혈청 알부민(4C)이 포함된 검정에서, 배양된 MRC-5 세포에 의한 IL-1 유도성 IL-8의 분비를 억제하였음을 도시하는 그래프이다. 관찰된 억제는 시험된 모든 조건에서 IL-1ra 및 MSA16IL-1ra에 대해 용량-의존적이었다.
도 5는 MSA16IL1-ra 융합체 및 IL-1raMSA16 융합체 둘 모두가 혈청 알부민에 결합하였으나, 더미IL1-ra 융합체는 결합하지 않았다는 것을 증명하는 ELISA 결과를 보여주는 개괄도이다.
도 6A 내지 6C는 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합하는 클론 DOM7h-1에 대한 바이아코어(BIACORE) 친화도(6A), HSA에 결합하는 DOM7h-7에 대한 바이아코어 친화도(6B), 및 래트 혈청 알부민(RSA)에 결합하는 DOM7r-1에 대한 바이아코어 친화도(6C)를 보여주는 센소그램 및 도표이다.
도 7은 DOM7h-1, DOM7r-1, DOM7h-2, DOM7r-3, DOM7h-7, DOM7h-8, DOM7r-8, DOM7r-13, DOM7r-14, DOM7m-16, DOM7h-22, DOM7h-23, DOM7h-26, DOM7r-16, DOM7m-26, DOM7r-27 및 DOM7R-31이 결합하는 혈청 알부민에 대한 친화도를 보여주는 도표 이다. DOM7h-8은 또한 60 nM의 친화도(KD)로 돼지 혈청 알부민에 결합한다.
도 8A는 수탁 번호 NM_173842로 진뱅크에 기탁된 인간 인터루킨 1 수용체 길항제(IL-1ra)를 엔코딩하는 핵산의 누클레오티드 서열(서열번호:33)을 도시한다. 상기 핵산은 65번 위치에서 시작하는 개방해독틀을 가지고 있다.
도 8B는 도 8A에 도시된 핵산(서열번호:33)에 의해 엔코딩된 인간 IL-1ra(서열번호:34)의 아미노산 서열을 도시한다. 성숙 단백질은 152개 아미노산 잔기로 구성된다(서열번호:34의 아미노산 잔기 26번 내지 177번).
도 9는 CD1 스트레인 수컷 동물에 1회 정맥내(i.v.) 주사(용량은 약 1.5㎎/㎏ 였슴) 후에 생쥐 혈청에서 MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질의 농도(㎍/㎖)를 시간(일)에 따라 도시한 그래프이다. 혈청 농도는 염소 항-HA(Abcam,UK) 캡쳐 및 단백질 L-HRP(Invitrogen, USA) 검출 시약을 사용하여 ELISA로 측정하였다. 시험 시료와의 비교를 명확하게 하기 위하여 공지된 농도의 MSA 결합 dAb/HA 융합체의 표준 곡선을 1x 생쥐 혈청 존재하에서 수립하였다. 1 컴파트먼트 모델을 이용한 모델링(WinNolin Software, Pharsight Corp., USA)은 MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질이 29.1시간의 말기 t1/2 및 559 hr·㎍/㎖ 커브하의 면적을 가진다는 것을 보여준다.
도 10은 래트 혈청 알부민(RSA)에 대한 결합으로 선별된 Vκ의 아미노산 서열을 도시한다. 도시된 서열은 DOM7r-15(서열번호:37), DOM7r-16(서열번호:38), DOM7r-17(서열번호:39), DOM7r-18(서열번호:40), DOM7r-19(서열번호:41)로 지정된 Vκ로부터 도출된 것이다.
도 11A 내지 11B는 래트 혈청 알부민(RSA)에 결합하는 Vнs의 아미노산 서열을 도시한다. 도시된 서열은 DOM7r-20(서열번호:42), DOM7r-21(서열번호:43), DOM7r-22(서열번호:44), DOM7r-23(서열번호:45), DOM7r-24(서열번호:46), DOM7r-25(서열번호:47), DOM7r-26(서열번호:48), DOM7r-27(서열번호:49), DOM7r-28(서열번호:50), DOM7r-29(서열번호:51), DOM7r-30(서열번호:52), DOM7r-31(서열번호:53), DOM7r-32(서열번호:54), 및 DOM7r-33(서열번호:55)으로 지정된 Vнs들로부터 도출된 것이다.
도 12는 CD1 스트레인 수컷 동물에 1회 정맥내(i.v.) 주사(용량은 약 1.5㎎/kg임) 후에 생쥐 혈청 중의, 각각이 HA 에피토프 태그를 함유하는 DOM7m-16, DOM7m-26 또는 MSA에 결합하지 않는 대조군 dAb의 농도(% 초기 용량)를 시간에 따라 도시한 그래프이다. 혈청 농도는 염소 항-HA(Abcam, UK) 캡쳐 및 단백질 L-HRP(인비트로겐, USA) 검출 시약을 사용하여 ELISA로 측정하였다. 시험 시료와의 명확한 비교를 위하여 공지된 농도의 MSA 결합 dAb/HA 융합체의 표준 곡선을 1x 생쥐 혈청의 존재하에서 수립하였다. 1 구획(compartment) 모델을 사용한 모델링(WinNolin Software, Pharsight Corp.,USA)은 대조군 dAb가 20분의 말기 t1/2β를 가지며, 한편 DOM7m-16, DOM7m-26이 혈청내에서 상당히 더 오랫동안 유지된다는 것을 보여주었다.
도 13은 DOM7m-16/IL-1ra가 생쥐 콜라겐-유도된 관절연(CIA) 모델에서 관절염을 치료하는데 IL-1ra 또는 ENBREL®(엔타레셉트, 이뮤넥스 코포레이션)보다 더 효과적이었음을 보여주는 그래프이다. 관절염이 유발되고, 21일째에 시작하여, 생 쥐에 0.4㎎/㎏의 덱사메타손(스테로이드), 1㎎/㎏(IL-1ra/항-SA 1㎎/㎏) 또는 10㎎/㎏(IL-1ra/항-SA10㎎/㎏)의 DOM7m-16/IL-1ra, 1㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏의 IL-1ra, 5㎎/㎏의 ENBREL®(엔타레셉트, 이뮤넥스 코포레이션), 또는 염수(saline)를 투여하였다. 그 결과, 본 연구에서 DOM7m-16/IL-1ra가 IL-1ra 또는 ENBREL®(엔타레셉트, 이뮤넥스 코포레이션) 보다 효과적이었음이 확인되었다. IL-1ra에 대한 반응은 기대한 바와 같이 용량-의존적이고, DOM7m-16/IL-1ra에 대한 반응 또한 용량-의존적이었다. 1㎎/㎏의 DOM7m-16/IL-1ra 투여로 획득된 평균 수치는 일관되게 10㎎/㎏의 IL-1ra 투여에 의해 얻어진 평균 수치보다 낮았다. 이는 본 연구에서 DOM7m-16/IL-1ra 처치가 IL-1ra 보다 10배 더 효과적이었음을 보여주는 결과이다.
도 14A 내지 14G는 사포린(saporin) 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다. 도 14A는 Swissprot 수탁 번호 P27559로서 기탁된 사포린-2 전구체의 아미노산 서열(서열번호:56)을 도시한다. 서열번호:56의 아미노산 서열에서 1 내지 24번의 아미노산은 시그날 펩티드이다. 도 14B는 Swissprot 수탁 번호 P27560로서 기탁된 사포린-3의 아미노산 서열(서열번호:57)을 도시한다. 도 14C는 Swissprot 수탁 번호 P27561로서 기탁된 사포린-4 전구체의 아미노산 서열(서열번호:58)을 도시한다. 서열번호:58의 아미노산 서열에서 1 내지 24번 아미노산은 시그날 펩티드이다. 도 14D는 Swissprot 수탁 번호 Q41389로서 기탁된 사포린-5의 아미노산 서열(서열번호:59)를 도시한다. 도 14E는 Swissprot 수탁 번호 P20656으로 기탁된 사포린-6 전구체의 아미노산 서열(서열번호:60)를 도시한다. 서열번호:60의 아미노산 서열에서 1 내지 24번 아미노산은 시그날 펩티드이고, 서열번호:60의 아미노산 서열에서 278 내지 299번 아미노산은 잠재적 프로펩티드이다. 도14F는 Swissprot 수탁 번호 Q41391로서 기탁된 사포린-7의 아미노산 서열(서열번호:62)을 도시한다. 도 14G는 사포린-6의 여러 변이체 및 이소폼을 포함하는 컨센서스 아미노산 서열(서열번호:63)을 도시한다.
도 15는 WO 2004/041862호에 개시된 생쥐 혈청 알부민에 결합하는 수개의 카메리드(Camelid) VHH 의 아미노산 서열을 도시한다. 서열 A(서열번호:68), 서열 B(서열번호:69), 서열 C(서열번호:70), 서열 D(서열번호:71), 서열 E(서열번호:72), 서열 F(서열번호:73), 서열 G(서열번호:74), 서열 H(서열번호:75), 서열 I(서열번호:76), 서열 J(서열번호:77), 서열 K(서열번호:78), 서열 L(서열번호:79), 서열 M(서열번호:80), 서열 N(서열번호:81), 서열 O(서열번호:82), 서열 P(서열번호:83), 서열 Q(서열번호:84).
본 명세서에서, 구체예는 명료하고 간결한 명세서가 작성되는 방식으로 기재되었으나, 이는 구체예가 본원 발명에서 벗어나지 않으면서 다양하게 조합되거나 분리될 수 있음을 의도한 것이고 그렇게 인정되어야 할 것이다.
본원 발명의 구체예들 중 임의의 하나와 동일한 구조식을 지니는 물질의 공지된 조성물은 그 자체로 명백히 포기된다. 이와는 대조적으로, 물질의 신규한 조성물, 공지된 조성물의 신규한 배합물, 공지된 조성물의 신규한 용도 또는 공지된 조성물을 포함하는 신균한 방법은 포기되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물"이라는 용어는 개체에 투여되어 개체에서 생물학적 표적 분자에 결합하고/하거나 이의 기능을 변경시켜 유익한 치료 또는 진단 효과를 생성할 수 있는 임의의 화합물(예를 들어, 작은 유기분자, 핵산, 폴리펩티드)를 의미한다. 표적 분자는 개체의 게놈에 의해 엔코딩된 내인성 표적 분자(예를 들어 효소, 수용체, 증식 인자, 개체 게놈에 의해 엔코딩된 사이토카인) 또는 병원균(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균류, 선충류 또는 다른 병원균)의 게놈에 의해 엔코딩된 외인성 표적 분자일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물 조성물"이라는 용어는 폴리펩티드 결합 부분에 공유결합 또는 비공유 결합된 약물을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드 결합 부분이 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 부위(예를 들어, 항원 결합 부위)를 함유하는 조성물을 의미한다. 약물 조성물은 약물이 폴리펩티드 결합 부위에 공유결합 또는 비공유결합된 컨주게이트일 수 있다. 약물은 폴리펩티드 결합 부분에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 적합한 링커 및/또는 상보적인 결합 파트너(예컨대, 비오틴 및 아비딘)의 비공유결합) 공유결합 또는 비공유결합될 수 있다. 상보적인 결합 파트너가 사용되는 경우에, 결합 파트너들 중 하나는 직접적으로 또는 적합한 링커 부분을 통해 약물에 공유결합될 수 있고, 상기 상보적인 결합 파트너는 직접적으로 또는 적합한 링커 부분을 통해 폴리펩티드 결합 부분에 공유결합될 수 있다. 약물이 폴리펩티드 또는 펩티드인 경우에, 약물 조성물은 폴리펩티드 또는 펩티드 약물 및 폴리펩티드 결합 부분이 연속적인 폴리펩티드 사슬의 분리된 부분(moieties)인 융합 단백질일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "컨주게이트"는 약물에 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 의미한다. 이러한 컨주게이트는 약물이 공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 "약물 컨주게이트", 및 약물이 비공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 "비공유결합성 약물 컨주게이트"를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물 컨주게이트"는 약물이 공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 의미한다. 약물은 항원 결합 단편에 직접적으로 또는 적합한 링커 부분을 통해 간접적으로 공유결합될 수 있다. 약물은 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 적합한 아미노산 곁사슬(예를 들어, 리신의 ε아미노기)을 통해서와 같이 임의의 적합한 위치에서 항원 결합 단편에 결합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "비공유결합성 약물 컨주게이트"는 약물이 비공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 약물은 항원 결합 단편에 직접적으로(예를 들어, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용) 또는 간접적으로(예를 들어, 비오틴 및 아비딘과 같은 상보적 결합 파트너의 비공유 결합을 통해서, 여기서 하나의 파트너는 약물에 공유결합되고 상보적인 결합 파트너는 항원 결합 단편에 공유결합된다) 결합될 수 있다. 상보적인 결합 파트너가 사용되는 경우에, 결합 파트너들 중 하나는 직접적으로 또는 적합한 링커 부분을 통해 공유결합될 수 있고, 상보적인 결합 파트너는 혈청 알부민에 직접적으로 또는 적합한 링커 부분을 통해 항체의 항원 결합 단편에 공유결합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물 융합체"라는 용어는 혈청 알부민 및 폴리펩티드 약물에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 혈청 알부민 및 폴리펩티드 약물에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 하나의 연속적인 폴리펩티드 사슬의 분리된 부분(moieties)로서 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물 기준(drug basis)"이라는 용어는 활성을 평가하거나 측정하거나 결정하는데 사용되는 약물(또는 약물 부분)의 양에 근거하여 표준화된 약물들 및 약물 조성물들의 활성을 의미한다. 일반적으로, 본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합성 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 이들이 함유하는 약물 보다 더 큰 분자량을 가진다. 이와 같이, 중량 기준으로 등가량의 약물 조성물 및 약물은 분자량 또는 몰 기준으로 상이한 양의 약물을 함유할 것이다. 예를 들어, 본원 발명의 약물 조성물이 이에 포함되는 약물 분자량의 두배에 달하는 분자량을 가지는 경우에, 활성은 2㎍의 약물 조성물 및 1㎍의 약물을 사용하는 "약물 기준"에 의해 결정될 수 있는데, 이는 이러한 양이 동일한 양의 약물을 (유리 약물 또는 약물 조성물의 일부로서) 함유할 것이기 때문이다. 활성은 표준화될 수 있으며, 적절한 계산법을 사용하여, 예를 들어, 표적 결합 영역 기준당, 또는 효소 약물의 경우, 활성 영역 기준 당 활성으로 표현함으로써, "약물 기준"에 기초하여 표현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "인터루킨 1 수용체 길항제"(IL-1ra)는 천연적으로 생성되거나 내인성 포유동물 IL-1ra 단백질 및 천연적으로 생성되거나 포유동물 IL-1ra 단백질에 대응되는 내인성 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질(즉, 유기화학 합성 방법을 사용하여 생산된 예컨대, 재조합 단백질, 합성 단백질)을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 IL-1ra의 성숙 단백질, 다형성 또는 대립유전자 변이체, 및 다른 이소폼(예를 들어, 대안적인 스플라이싱 또는 다른 세포 공정에 의해 생성됨), 및 변형 또는 비변형된 형태의 상기 것들(예를 들어, 지질화, 당화, PEG화)을 포함한다. 천연적으로 생성되거나 내인성인 IL-1ra는 성숙 IL-1ra, 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 포유동물(예를 들어, 인간, 인간을 제외한 영장류)에서 천연적으로 생성되는 다른 이소폼과 같은 야생형 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 예를 들어, 천연적으로 IL-1ra를 생성하는 원천으로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 이러한 단백질 및 천연적으로 생성되거나 내인성인 IL-1ra에 대응되는 단백질과 동일한 아미노산 서열을 가지는 IL-1ra 단백질은 대응되는 포유동물의 이름에 의해 지칭된다. 예를 들어, 대응되는 포유동물이 인간인 경우에 단백질은 인간 IL-1ra로서 지칭된다.
IL-1ra의 "기능적 변이체"는 적합한 방법(예컨대, 화학적 돌연변이, 방사선 돌연변이와 같은 돌연변이유발방법, 재조합 DNA 기술을 그 예로 들 수 있음)을 사용하여 생성될 수 있는 기능적 단편, 기능적 돌연변이 단백질, 및/또는 기능적 융합 단백질을 포함한다. "기능적 변이체"는 인터루킨-1 타입 1 수용체와 길항작용한다. 일반적으로, IL-1ra의 단편 또는 부분은 성숙한 IL-1ra(예를 들어 N-말단, C-말단, 또는 내부 결실)에 대하여 아미노산(예를 들어, 하나 이상의 아미노산)의 결실 및/또는 첨가(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 첨가)를 가지는 것들을 포함한다. 성숙 IL-1ra에 대하여 인접된 아미노산만이 결실되거나 인접되지 않은 아미노산이 결실된 단편 또는 부분도 또한 고려된다.
IL-1ra의 기능적 변이체는 152개 아미노산을 가지는 성숙한 형태의 인간 IL-1ra와 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90%이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 가지고 인간 인터루킨-1 타입 1 수용체와 길항작용한다(참조: Eisenberg et al., Nature 343: 341-346 (1990)). 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 153 또는 154개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다). 예를 들어, 변이체 IL-1ra는 서열번호:33의 잔기 26번 내지 177번이 뒤따르는 아미노-말단 메티오닌 잔기로 구성된 아미노산 서열을 가질 수 있다(KINERET®(아나킨라), Amgen).
본원에 사용된 바와 같이, "사포린"은 식물 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis)에 의해 생성된 단일-사슬 리보솜 불화성화 폴리펩티드의 한 패밀리임을 의미한다(Stirpe, F., et al., Biochem. J. 216:617-625 (1983), Bagga, S. et al., J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)). 사포닌 폴리펩티드는 길이 및/또는 아미노산 서열이 상이한 수개의 형태로 존재한다(참조예 : Id. and Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. [ 268:6541-6548 (1993)). 사포린-6는 가장 활성이 큰 사포린의 형태이다(Bagga, S. et al., J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)). 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 48번 위치의 아미노산이 Asp 또는 Glu이고, 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 91번 위치의 아미노산이 Arg 또는 Lys인 4개 이상의 천연적으로 생성되는 사포린-6의 이소폼이 개시되어 있다(Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. 268:6541-6548 (1993)). 사포린-6의 추가적인 형태는 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 99번 위치의 아미노산이 Ser 또는 Leu, 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 134번 위치가 Gln 또는 Lys; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 147번 위치의 아미노산이 Ser 또는 Leu; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 149번 위치의 아미노산이 Ser 또는 Phe; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 162번 위치의 아미노산이 Asp 또는 Asn; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 177번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Val; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 188번 위치의 아미노산이 Ile 또는 Thr; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 196번 위치의 아미노산이 Asn 또는 Asp; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 198번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Asp; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 231번 위치의 아미노산이 Asn 또는 Ser; 성숙 폴리펩티드(서열번호:61)의 233번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg인 폴리펩티드를 포함한다. (Id.) 이러한 이소폼 및 변이체를 포함하는 컨센서스 서열은 도 14G(서열번호:63)에 제시되어 있다.
이에 따라, "사포린"은 전구체 단백질, 성숙 폴리펩티드, 천연 단백질, 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 다른 이소폼(예를 들어, 대안적인 스플라이싱 또는 그밖의 다른 세포 공정에 의해 생성된), 및 천연 발생 또는 재조합 생성 폴리펩티드를 포함하는 변형 또는 비변형된 형태의 앞서 기술한 것들(예를 들어, 지질화, 당화, PEG화)을 포함한다. 천연적으로 생성되거나 내인성인 사포린은 성숙 사포린(예를 들어, 성숙 사포린-6), 사포나리아 오피시날리스에서 천연적으로 생성되는 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 다른 이소폼과 같은 야생 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 임의의 적절한 방법을 사용하여 사포나리아 오피시날리스로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 사포린의 "기능적 변이체"는 기능적 단편, 기능적 돌연변이 단백질, 및/또는 적합한 방법(예를 들어, 화학적 돌연변이유발방법, 방사선 돌연변이유발방법과 같은 돌연변이유발방법, 재조합 DNA 기술을 그 예로 들 수 있음)을 사용하여 생성될 수 있는 기능적 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 사포린(예를 들어, 사포린-6)의 단편 또는 부분은 성숙 사포린(N-말단, C-말단 또는 내부 결실)과 대비하여 아미노산(즉, 하나 이상의 아미노산)의 첨가 및/또는 부가(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 첨가)가 존재하는 것들을 포함한다. 성숙 사포린과 대비하여 인접한 아미노산만이 결실되거나 인접하지 않은 아미노산이 결실된 단편 또는 부분 또한 포함된다. 다양한 사포린의 활성 변이체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 아미노-말단 신장부를 포함하는 사포린-6의 융합 단백질이 제조되었으며, 상기 단백질은 토끼 망상 적혈구 파쇄물 검정에서 완전한 리보솜-억제 활성을 보유하는 것이 증명되었다(Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. 268:6541-6548 (1993)). 변이체 또는 사포린-6은 이의 활성 부위 잔기, Tyr72, Tyrl20, Glu176, Arg179 또는 Trp208(서열번호:61의 아미노산 72, 120, 176, 179, 또는 208)가 시험관내 검정에서 세포독성 활성을 감소시키는 알라닌으로 치환되었다(Bagga, S. et al., J;Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)). 따라서, 사포린의 추가 기능적 변이체를 제조하고자 하는 경우에는, 활성영역 잔기의 돌연변이, 치환, 교체, 결실 또는 변형은 회피되어야 한다. 천연적으로 생성되는 성숙 폴리펩티드 보다 더 적은 아미노산을 함유하는 사포린의 기능적 변이체는 적어도 상기 활성 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 천연적으로 생성되는 성숙 사포린-6 보다 더 적은 아미노산을 함유하는 사포린-6의 변이체는 성숙 사포린-6(Tyr72, Tyrl20, Glu176, Arg 179및 Trp208(서열번호:61의 아미노산 72, 120, 176, 179 및 208)의 활성 영역 잔기를 포함하고, 그 길이가 약 137개 이상의 아미노산, 약 150개 이상의 아미노산, 약 175개 이상의 아미노산, 약 200개 이상의 아미노산, 약 225개 이상의 아미노산, 약 250개 이상의 아미노산에 해당하는 길이이다.
사포린의 "기능적 변이체"는 리보솜-불활성화 활성(예를 들어, rRNA N-글리코시다제 활성) 및/또는 세포독성 활성을 가진다. 이러한 활성은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 종양 세포주를 사용하는 널리 공지된 토끼 망상 적혈구 파쇄물 검정 또는 임의의 널리 공지된 세포독성 검정을 사용하여 용이하게 평가될 수 있다(예컨대, Bagga, S. et al., J Biol. ; Chem.278:4813- 4820 (2003) and Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. 268:6541 6548 (1993) 참조).
일부 구체예에서, 사포린의 기능적 변이체는 성숙 사포린-6(서열번호:61)와 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 가진다.
본원 발명은 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 부위(예를 들어, 항원-결합 부위)를 함유하는 약물 및 폴리펩티드 결합 부위를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 약물 조성물에 대하여 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 약물 및 폴리펩티드 결합 부분은 서로 간의 공유결합 또는 비공유결합에 의해 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 약물 조성물은 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항원 결합 영역을 함유하는 폴리펩티드 약물 및 폴리펩티드 결합 잔기를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 구체예에서, 상기 약물 조성물은 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항원 결합 영역을 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 약물을 포함한다.
통상적으로, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 생체내에서 자연적으로 발생하며 유기체(예컨대, 사람)로부터 원치 않는 물질을 제거하는 내인성 메커니즘에 의한 분해 또는 제거에 저항하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 세포외 매트릭스로부터의 단백질, 혈액에서 발견되는 단백질, 혈뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 국소화된 단백질, 스트레스 단백질, 질병-특이적 단백질, 또는 Fc 운반에 관여하는 단백질로부터 선택될 수 있다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적합한 폴리펩티드로는 예를 들어 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약학 작용제 융합 단백질(참조, 미국특허 제 5,977,307호, 이의 교시가 본원에 참조로서 포함됨), 뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체(예컨대, 가용성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, α1-항트립신 및 HNF 1α가 있다. 또한, 혈청 반감기를 향상시키는 적합한 폴리펩티드로는 알파-1 당단백질(오로소무코이드; AAG), 알파-1 항키모트립신(ACT), 알파-1 마이크로글로불린(단백질 HC; AIM), 항트롬빈 III(AT III), 아포지단백질 A-1(아포 A-1), 아포지단백질 B(아포 B), 세룰로플라스민 (Cp), 보체 성분 C3(C3), 보체 성분 C4(C4), C1 에스테라제 억제제(C1 INH), C-반응성 단백질(CRP), 페리틴(FER), 헤모펙신(HPX), 지단백질(a)(Lp(a)), 만노오스-결합 단백질(MBP), 마이오글로빈(Myo), 프리알부민(트랜스티레틴; PAL), 레티놀-결합 단백질(RBP), 및 류마티스 인자(RF)가 있다.
세포외 매트릭스로부터의 적합한 단백질로는 예를 들어 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴이 있다. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주요 단백질이다. 약 15개 유형의 콜라겐 분자가 현재 공지되어 있고, 이는 상이한 신체 부분에서 발견되며, 예컨대 유형 I 콜라겐(신체 콜라겐의 90% 차지)은 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부 기관에서 발견되거나 유형 II 콜라겐은 연골, 척추 디스크, 척삭 및 눈의 유리체액에서 발견된다.
혈액으로부터의 적합한 단백질로는 예를 들어 혈장 단백질(예컨대, 피브린, α-2 매크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐(예컨대, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 합토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 유테로글로불린 및 β-2-마이크로글로불린), 효소 및 효소 억제제(예컨대, 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-항트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역계의 단백질, 예컨대 면역글로불린 단백질(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 면역글로불린 경쇄(카파/람다)), 운반 단백질(예컨대, 레티놀 결합 단백질, α-1-마이크로글로불린), 데펜신(예컨대, 베타-디펜신 1, 뉴트로필 데펜신 1, 뉴트로필 데펜신 2 및 뉴트로필 데펜신 3) 등이 있다.
혈뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 적합한 단백질로는 예를 들어 멜라노코르틴 수용체, 마이엘린, 아스코르베이트 트랜스포터 등이 있다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적합한 폴리펩티드로는 신장에 국소화된 단백질(예컨대, 폴리시스틴, 유형 IV 콜라겐, 유기 음이온 트랜스포터 K1, 헤이만(Heymann's) 항원), 간에 국소화된 단백질(예컨대, 알코올 데하이드로게나제, G250), 폐에 국소화된 단백질(예컨대, IgA와 결합하는 분비 성분), 심장에 국소화된 단백질(예컨대, 팽창된 심근병증과 관련된 HSP 27), 피부에 국소화된 단백질(예컨대, 케라틴), 뼈발생 활성을 입증하는 형질변환 성장 인자 β 수퍼패밀리의 서브세트(예컨대, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8)인, 형태발생 단백질(BMP)과 같은 뼈 특이적 단백질, 종양 특이적 단백질(영양막 항원, 헤르셉틴 수용체, 오에스트로겐 수용체, 카텝신(예컨대, 간 및 비장에서 발견될 수 있는 카텝신 B)이 있다.
적합한 질병-특이적 단백질의 예로는 예를 들어 LAG-3(림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테그린 리간드(OPGL; 참조 Nature 402, 304-309(1999)), OX40(활성화된 T 세포상에서 발현되고 사람 T 세포 백혈병 바이러스 유형-I(HTLV-1)-생성 세포에서 특이적으로 상향-조절되는 TNF 수용체 패밀리의 멤버; 참조 Immunol. 165(1): 263-70(2000))를 포함하는 활성화된 T-세포상에서만 발현되는 항원이 있다. 또한 적합한 질병-특이적 단백질로는 CG6512 드로소필라, 사람 파라플레긴, 사람 FtsH, 사람 AFG3L2, 뮤린 FtsH를 포함하는 금속프로테아제 (관절염/암과 관련됨); 및 산성 섬유모세포 성장 인자(FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과 인자(VEGF/VPF), 형질변환 성장 인자-α(TGF-α), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 안지오게닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판-유래된 내피 성장 인자(PD-ECGF), 태반 성장 인자(PIGF), 미드킨 혈소판-유래된 성장 인자-BB(PDGF) 및 프랙탈킨을 포함하는 혈관형성 성장 인자가 있다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적합한 폴리펩티드로는 열 쇼크 단백질 (HSP)과 같은 스트레스 단백질이 있다. HSP는 정상적으로 세포내에서 발견된다. 이들이 세포외에서 발견되는 경우, 이것은 세포가 죽었거나 그 내용물이 누출되었다는 지시자이다. 이렇게 프로그래밍되지 않은 세포 치사(괴사)는 외상, 질병 또는 상해의 결과로서, 세포외 HSP가 면역계로부터의 반응을 일으킬 때 발생한다. 세포외 HSP에 대한 결합은 질병 부위에 본원 발명의 조성물을 국소화시킬 수 있다.
Fc 운반에 관여하는 적합한 단백질로는 예를 들어 브람벨(Brambell) 수용체 (FcRB로서도 공지되어 있음)가 있다. 이러한 Fc 수용체는 두 기능을 지니며, 둘 모두는 전달에 잠재적으로 유용하다. 상기 기능은 (1) IgG를 태반을 가로 질러 모성으로부터 자손에게 운반하고 (2) 분해로부터 IgG를 보호하여 이의 혈청 반감기를 연장시키는 것이다. 수용체는 IgG를 엔도솜으로부터 재순환시키는 것으로 여겨진다(참조, Holliger 등, Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997)).
본원에 사용하기 위한 적절한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 2005/077042A2호에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 본원 발명에 사용될 수 있다:
● 서열번호:1(WO 2005/077042A2호에 기술된 서열, 본 서열은 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있다);
● WO 2005/077042 A2호의 서열번호:1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이로 구성된 알부민 단편 또는 변이체;
● (a) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 54 내지 61; (b) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 76 내지 89; (c) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 92 내지 100; (d) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 170 내지 176; (e) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 247 내지 252; (f) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 266 내지 277; (g) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 280 내지 288; (h) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 362 내지 368; (i) WO 2005/077042A2의 서열번호:1의 아미노산 439 내지 447; (j) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 462 내지 475; (k) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 478 내지 486; 및 (l) WO 2005/077042A2호의 서열번호:1의 아미노산 560 내지 566으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 알부민, 이의 단편 또는 변이체.
본원 발명에 따른 TNFR1-결합 리간드에 사용하기에 적합한 알부민, 단편 및 유사체의 추가 예는 전체 교시내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 03/076567A2호에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 단편 또는 변이체가 본원 발명에 사용될 수 있다:
● WO 03/076567A2호, 예를 들어 이의 도 3에 기술된 인간 혈청 알부민 (이 서열 정보는 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있다);
● 66,500의 화학식 분자량을 지니는 585개의 아미노산의 단일한 글리코실화되지 않은 폴리펩티드 사슬로 구성된 인간 혈청 알부민(HA)(참조: Meloun, et al, FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al, Fed. Proc. 34:59\ (1975); Lawn, et al, Nucleic Acids Research P:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261:61 Al (1986));
● 문헌[Weitkamp, et al, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)]에 기술된 알부민의 다형 변이체 또는 유사체 또는 단편;
● EP 322094호에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어 HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), 및 HA(1-419) 및 1-369과 1-419 사이의 단편;
● EP 399666호에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어 HA(1-177) 및 HA(1-200) 및 HA(1-X) 사이의 단편(여기서 X는 178에서 199중 임의의 수이다).
본원 발명의 약물 조성물은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 임의의 폴리펩티드 결합 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는 폴리펩티드 결합 부분이 31개 이상, 약 40개 이상, 약 50개 이상, 약 60개 이상, 약 70개 이상, 약 80개 이상의 아미노산, 약 90개 이상의 아미노산, 약 100개 이상의 아미노산 또는 약 110개 이상의 아미노산을 분리된 분자 물질로서 포함한다. 바람직하게는 폴리펩티드 결합 부분이 약 5 mM 이상의 KD(KD=Koff(kd)/Kon(ka))로 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드와 결합한다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드 결합 부분은 표면 플라스몬 공명(예컨대, BIACORE 기구 이용)에 의해 측정된 약 10 내지 약 100 nM, 또는 약 100 nM 내지 약 500 nM, 또는 약 500 nM 내지 약 5 mM의 KD로 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드와 결합한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드 결합 부분은 약 50 nM, 또는 약 70 nM, 또는 약 100 nM, 또는 약 150 nM 또는 약 200 nM의 KD로 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드와 결합한다.
바람직하게는 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분은 원핵 또는 세균 폴리펩티드 또는 펩티드가 아니다. 바람직하게는, 폴리펩티드 결합 부분은 진핵, 포유동물 또는 사람 폴리펩티드 또는 펩티드이다.
특정 구체예에서, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분은 폴딩된 단백질 도메인이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드 결합 부위는 분리된 분자 물질로서 약 4 KDa, 적어도 약 4.5 KDa, 적어도 약 5 KDa, 적어도 약 5.5 KDa, 적어도 약 6 KDa, 적어도 약 6.5 KDa, 적어도 약 7 KDa, 적어도 약 7.5 KDa 또는 적어도 약 8 KDa의 분자량을 지닌다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 적합한 폴리펩티드 결합 부분은 적합한 부착 검정으로 천연 발생 또는 비천연 발생 폴리펩티드를 스크리닝하는 것과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 동정될 수 있다. 본원에 기술된 대로, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 항원-결합 부위를 지니는 바람직한 폴리펩티드 결합 부분은 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편이다. 그러나, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 다른 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편이 본원 발명에 이용될 수 있다.
요망되는 경우, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드와 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)이 항체 또는 항원-결합 단편의 항원-결합 특이성을 보유하는 비-면역글로불린 구조로 배열될 수 있다. 본원 발명의 약물 조성물은 이러한 비-면역글로불린 결합 부분을 포함할 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 결합 부분은 SpA와 같은 천연 세균 수용체를 CDR의 이식을 위한 스캐폴드으로서 이용하여 에피토프에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 결합 부분을 생성시키는 것과 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 공정의 상세한 내용이 미국특허출원 제 5,831,012호에 개시되어 있고, 이의 교시가 본원에 참조로서 포함된다. 다른 적합한 스캐폴드으로는 피브로넥틴 및 애피바디(affibodies)에 기초한 것들이 있다. 적합한 공정의 상세한 내용이 WO 98/58965호에 개시되어 있다. 다른 적합한 스캐폴드로는 문헌[van den Beuken et al., J. Mol. Biol. 310: 591-601 (2001)]에 개시된 리포칼린 및 CTLA4, 및 예컨대 세균 GroEL 또는 다른 샤페론(chaperone) 폴리펩티드의 고리 구조에 기초한, WO 00/69907호(Medical Research Council)에 기재된 것들과 같은 스캐폴드가 있다.
몇몇 구체예에서, 본원 발명의 약물 조성물은 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 비-면역글로불린 결합 부분을 포함하며, 비-면역글로불린 결합 부분은 본원에 기술된 VH, Vκ 또는 VHH의 CDR 중 하나, 두개 또는 세개 및 적합한 스캐폴드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 비-면역글로불린 결합 부분은 본원에 기술된 VH, Vκ 또는 VHH의 CDR1 또는 CDR2가 아닌 CDR3 및 적합한 스캐폴드를 포함한다. 다른 구체예에서, 비-면역글로불린 결합 부분은 본원에 기술된 VH, Vκ 또는 VHH의 CDR3가 아닌 CDR1 및 CDR2 및 적합한 스캐폴드를 포함한다. 다른 구체예에서, 비-면역글로불린 결합 부분은 본원에 기술된 VH, Vκ 또는 VHH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 적합한 스캐폴드를 포함한다. 다른 구체예에서, 약물 조성물은 약물 및 본원에 기술된 VH, Vκ 또는 VHH의 CDR3만을 포함한다.
본원 발명의 약물 조성물은 약물 융합체, 약물 컨주게이트 및 비공유결합 약물 컨주게이트의 제조를 위해 본원에 기술된 방법과 같은 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 추가로, 본원 발명의 약물 조성물은 약물 융합체, 약물 컨주게이트 및 비공유결합 약물 컨주게이트에 관해 본원에 상세히 기술된 이점 및 유용성을 지닌다.
본원 발명은 단독의 약물(비컨주게이션된 약물, 비융합된 약물)에 비해 개선된 약력학 특성(예컨대, 혈청 반감기 증가) 및 다른 이점을 지니는 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 제공한다. 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 및 약물 융합체은 혈청 알부민에 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편 및 하나 이상의 요망되는 약물을 포함한다.
본원에 기술된 대로, 본원 발명의 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 단독의 약물에 비해 현저하게 연장된 생체내 혈청 반감기 및/또는 증가된 AUC를 지닐 수 있다. 또한, 약물의 활성은 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)에서 실질적으로 변화되지 않는 것이 일반적이다. 그러나, 단독의 약물에 비해 약물 조성물의 활성에서의 다소의 변화가 허용되며 이는 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 개선된 약력학 특성에 의해 일반적으로 보상된다. 예를 들어, 약물 조성물 (예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 단독의 약물보다 낮은 친화력으로 약물 표적에 결합할 수 있으나, 약물 조성물의 개선된 약력학 특성(예컨대, 연장된 생체내 혈청 반감기, 더 큰 AUC)으로 인해 단독의 약물에 비해 거의 동등하거나 우수한 효능을 지닌다. 또한, 요망되는 치료 또는 진단 효과를 달성하기 위해 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 및 약물 융합체)이 더 적은 양으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약물 조성물 (예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 활성이 약 100배 이하, 또는 약 50배 이하, 또는 약 10배 이하, 또는 약 5배 이하, 또는 약 4배 이하, 또는 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하 만큼 단독의 약물과 상이하다. 예를 들어, 약물은 1 nM의 KD, Ki 또는 중화 용량 50(ND50)을 지닐 수 있고, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 약 2 nM, 또는 약 3 nM, 또는 약 4 nM, 또는 약 5 nM 또는 약 10 nM의 KD, Ki 또는 ND50을 지닐 수 있다.
바람직하게는, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 활성이 약물의 활성에 비해 실질적으로 감소되지 않는다. 특정 구체예에서, 약물 조성물의 활성은 약물의 활성에 비해 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하로 감소되거나 실질적으로 변화되지 않는다. 바꾸어 말해, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 약물의 활성 또는 약물과 실질적으로 동일한 활성을 보유한다. 바람직하게는, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체) 및 약물의 활성이 "약물 기준(drug basis)"에 대해 측정되고/거나 비교된다.
본원에 기술되고 제시된 대로, 본원 발명의 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 단독의 약물에 비해 더 큰 활성(예컨대, 생체내 활성)을 지닐 수 있다. 예를 들어, 실시예 6에 제시된 대로, DOM7m-16/IL-Ira는 이들 작용제가 동일한 중량 당 용량(10 mg/kg 또는 1 mg/kg)으로 투여될 때, 마우스 모델에서 IL-Ira 보다 관절염을 치료하는데 보다 효과적이었다. DOM7m-16/IL-Ira은 이의 분자량이 IL-Ira의 분자량의 대략 두 배임에도 불구하고 보다 효과적이었다. 따라서, DOM7m-16/IL-Ira를 투여받은 마우스는 IL-Ira를 투여받은 마우스에 비해 약 절반의 IL-Ira 만을(DOM7m-16/IL-Ira의 부분으로서) 투여받게 된다.
몇몇 구체예에서, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 약물에 비해 더 큰 활성(예컨대, 생체내 활성)을 지니며, 예를 들어, 약물 조성물은 약물의 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450%, 또는 적어도 약 500%의 활성을 지닐 수 있다. 바람직하게는, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체) 및 약물의 활성은 "약물 기준"에 대해 측정되고/거나 비교된다. 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체) 및 약물의 활성은 적합한 시험관내 또는 생체내 시스템을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 생체내에서 측정된 대로 이를 구성하는 약물 보다 큰 활성을 지닌다. 다른 구체예에서, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 시험관내에서 측정된 대로 이를 구성하는 약물 보다 큰 활성을 지닌다.
혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 도메인 항체(dAb)를 포함하는 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 추가의 이점을 제공한다. 도메인 항체는 매우 안정하고, 항체 및 항체의 다른 항원-결합 단편에 비해 소형이며, 대장균(E. coli) 및 효모(예컨대, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris))에서의 발현에 의해 고수율로 생성될 수 있고, 본원에 기술된 대로 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원-결합 단편은 사람 기원의 라이브러리 또는 임의의 요망되는 종으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 따라서, 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 포함하는 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 포유동물 세포에서 일반적으로 생성되는 치료제(사람, 사람화된 또는 키메라 항체)보다 더 용이하게 생성될 수 있고 면역원성이 아닌 dAb가 사용될 수 있다(예컨대, 사람 dAb가 사람의 질병을 치료 또는 진단하기 위한 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트를 위해 사용될 수 있다).
약물의 면역원성은 약물이 혈청 알부민과 결합하는 폴리펩티드 결합 부분 (예컨대, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편)을 함유하는 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 일부가 될 때 감소될 수 있다. 따라서, 약물은 혈청 알부민과 결합하는 폴리펩티드 결합 부분을 함유하는 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)에서(단독의 약물에 비해) 덜 면역원성이거나 실질적으로 비면역원성일 수 있다. 따라서, 이러한 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 피검체의 면역계에 의한 항-약물 항체의 정교화로 인해 최소의 효능 손실을 지니며 경시적으로 반복하여 피검체에게 투여될 수 있다.
또한, 본원에 개시된 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 단독의 약물에 비해 향상된 안전성 프로필 및 더 적은 부작용을 지닐 수 있다. 예를 들어, 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편의 혈청 알부민-결합 활성의 결과로서, 약물 융합체 및 컨주게이트(약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트)는 혈관 순환에서 향상된 체류 시간을 지닌다. 또한, 컨주게이트 및 약물 융합체은 실질적으로 혈뇌 장벽을 가로 지르거나 전신적 투여(예컨대, 혈관내 투여) 이후에 중추신경계에 축적될 수 없다. 따라서, 신경 독성 또는 원치 않는 정신작용 효과를 지니는 약물을 함유하는 컨주게이트(약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트) 및 약물 융합체이 단독의 약물에 비해 더 안전하게 감소된 부작용을 지니며 투여될 수 있다. 유사하게, 컨주게이트 (약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트) 및 약물 융합체이 단독의 약물 보다 특정 기관 (예컨대, 신장 또는 간)에 대해 감소된 독성을 지닐 수 있다. 본원에 기술된 컨주게이트 및 약물 융합체은 혈관 순환에서 약물(예컨대, 톡신)에 결합하는 약물 또는 표적을 격리시켜 조직 상에서 약물 또는 표적의 효과를 감소(예컨대, 톡신 효과의 억제)시키는데 사용될 수 있다.
약력학 분석 및 생체내 반감기 결정에 적합한 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법이, 예를 들어 문헌[Kenneth. A et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, 및 Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach(1996)]에 기술되어 있다. 또한 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition]도 참조되며, 여기에는 t 알파 및 t 베타 반감기(t1/2 알파 및 t1/2 베타) 및 곡선아래면적(AUC)과 같은 약력학 파라미터가 기술되어 있다.
반감기(t 1/2 알파 및 t 1/2 베타) 및 곡선아래면적(AUC)은 시간에 대한 컨주게이트 또는 융합체의 혈청 농도 곡선으로부터 측정될 수 있다. 곡선의 작도를 위해 예를 들어, 윈논린(WinNonlin) 분석 패키지(Pharsight Corp.로부터 시판됨, Mountain View, CA 94040, USA)를 이용할 수 있다. 제 1상(알파 상)에서, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 다소의 제거를 지니며 환자에서의 주된 분포를 진행한다. 제 2상(베타 상)은 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)이 분포되고 혈청 농도가 약물 조성물이 환자로부터 제거됨에 따라 감소하는 말기 상이다. t 알파 반감기는 제 1상의 반감기이고 t 베타 반감기는 제2 상의 반감기이다. 따라서, 본원 발명은 tα 반감기의 범위가 15분 이상인 본원 발명에 따른 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체) 및 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 더 낮은 범위의 끝은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로 또는 대안적으로 본원 발명에 따른 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체) 또는 조성물은 12시간 이하의 tα 반감기 범위를 지닌다. 일 구체예에서, 더 높은 범위의 끝은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간 또는 3 내지 4시간이다.
유리하게는, 본원 발명은 tβ 반감기의 범위가 2.5 시간 이상인 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 제공한다. 일 구체예에서, 더 낮은 범위의 끝은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간이다. 몇몇 구체예에서, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 21일 이하의 tβ 반감기 범위를 지닌다. 일구체예에서, 더 높은 범위의 끝은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일이다. 특정 구체예에서, 본원 발명에 따른 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 12 내지 60시간의 tβ 반감기 범위를 지닐 것이다. 추가의 구체예에서, 상기 범위는 12 내지 48시간일 것이다. 여전히 추가의 구체예에서, 상기 범위는 12 내지 26시간일 것이다.
상기 특징에 추가로 또는 대안적으로, 본원 발명은 AUC 값(곡선아래면적)의 범위가 0.01 mg.분/mL 이상, 또는 1 mg.분/mL 이상인 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 제공한다. 일 구체예에서, 더 낮은 범위의 끝은 0.01, 0.1, 1.5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.분/mL이다. 특정 구체예에서, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 600 mg.분/mL 이하의 AUC 범위를 지닌다. 일 구체예에서, 더 높은 범위의 끝은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.분/mL이다. 다른 구체예에서, 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 AUC 범위를 지닌다: 15 내지 150 mg.분/mL, 15 내지 100 mg.분/mL, 15 내지 75 mg.분/mL, 15 내지 50 mg.분/mL, 0.01 내지 50 mg.분/mL, 0.1 내지 50 mg.분/mL, 1 내지 50 mg.분/mL, 5 내지 50 mg.분/mL, 및 10 내지 50 mg.분/mL.
본원 발명은 약물 및 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분을 포함하는 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)에 관한 것이다. 약물 조성물의 바람직한 구체예에서, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분이 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지닌다.
몇몇 구체예에서, 약물 조성물은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분에 공유적으로 결합된 약물을 포함한다. 이러한 구체예에서, 약물은 아미노-말단, 카르복실-말단과 같은 임의의 적합한 위치에서 또는 적합한 아미노산 사슬(예컨대, 라이신의 ε 아미노기)을 통해 폴리펩티드 결합 도메인에 공유적으로 결합할 수 있다.
다른 구체예에서, 약물 조성물은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분에 비공유적으로 결합한 약물을 포함한다. 이러한 구체예에서, 약물은 항원-결합 단편에 직접(예컨대, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용) 또는 간접적으로(예컨대, 상보적 결합 파트너(예컨대, 비오틴 및 아비딘)의 비공유 결합을 통해, 이때 하나의 파트너는 약물에 공유적으로 결합하고 상보적 결합 파트너는 항원-결합 단편에 공유적으로 결합함) 비공유 결합할 수 있다. 상보적 결합 파트너가 사용되는 경우, 결합 파트너 중 하나는 약물에 직접 또는 적합한 링커 부분을 통해 공유적으로 결합할 수 있고, 상보적 결합 파트너는 직접 또는 적합한 링커 부분을 통해 폴리펩티드 결합 도메인에 공유적으로 결합할 수 있다.
다른 구체예에서, 약물 조성물은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분 및 폴리펩티드 약물을 포함하는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 연속하는 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 사슬은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위(예컨대, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분을 제1 부분으로서 포함하고, 폴리펩티드 약물을 제2 부분으로서 포함하며, 이들은 폴리펩티드 사슬의 별개의 성분(잔기)으로서 존재한다. 제1 및 제2 부분은 펩티드 결합을 통해 서로 직접 결합하거나 적합한 아미노산, 또는 펩티드 폴리펩티드 링커를 통해 결합할 수 있다. 추가의 부분(예컨대, 제3, 제4) 및/또는 링커 서열이 적합한 경우 존재할 수 있다. 제1 부분은 제2 부분(즉, 폴리펩티드 약물)에 대해 N-말단 위치, C-말단 위치 또는 내부에 있을 수 있다. 몇몇 구체예에서, 융합 단백질은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 함유하는 하나 이상의 폴리펩티드 결합 부분 및 하나 이상의 폴리펩티드 약물 부분을 포함한다. 상기 구체예에서, 융합 단백질은 동일하거나 상이할 수 있는 하나 내지 약 10개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 폴리펩티드 약물 부분, 및 동일하거나 상이할 수 있는 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 함유하는 하나 내지 약 20개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 폴리펩티드 결합 부분을 포함할 수 있다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 친화성을 지닌 결합 부위를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분 및 폴리펩티드 약물 부분은 임의의 요망되는 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 아미노 말단에서 카르복실 말단 방향으로, 부분들은 다음 순서로 존재할 수 있다: 하나 이상의 폴리펩티드 결합 부분, 하나 이상의 폴리펩티드 약물 부분, 하나 이상의 폴리펩티드 결합 부분. 또 다른 예에서, 아미노 말단에서 카르복실 말단 방향으로, 부분들은 다음 순서로 존재할 수 있다: 하나 이상의 폴리펩티드 결합 부분, 하나 이상의 폴리펩티드 약물 부분, 하나 이상의 폴리펩티드 결합 부분, 하나 이상의 폴리펩티드 약물 부분, 하나 이상의 폴리펩티드 결합 부분. 본원에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 결합 부분 및 폴리펩티드 약물 부분은 펩티드 결합을 통해 서로에 대해 직접 결합하거나, 적합한 아미노산, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다.
특정 구체예에서, 융합 단백질은 하기 식을 지닌 연속 폴리펩티드 사슬이다 (아미노-말단에서 카르복시-말단 방향):
a-(P)n2-b-(X)n1-c-(Q)n3-d 또는 a-(Q)n3-b-(X)n1-c-(P)n2-d
상기 식에서, X는 폴리펩티드 약물이고;
P 및 Q는 서로 독립적으로 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 친화성을 지닌 결합 부위를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분이고;
a, b, c 및 d는 서로 독립적으로 존재하지 않거나 1개 내지 약 100개의 아미노산 잔기이고;
n1, n2 및 n3는 각각 존재하는 X, P 또는 Q 잔기들의 수를 나타내고;
n1은 1 내지 약 10이고
n2는 0 내지 약 10이고;
n3는 0 내지 약 10이고,
단, n2 및 n3 둘 모두가 0이 아니고,
n1 및 n2가 둘 모두 1이고 n3가 0인 경우, X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, n2는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고, n3는 0이다. 다른 구체예에서, n3는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고, n2는 0이다. 다른 구체예에서, n1, n2 및 n3는 각각 1이다.
특정 구체예에서, X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
바람직한 구체예에서, P 및 Q는 각각 독립적으로 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌 폴리펩티드 결합 부분이다.
특히 바람직한 구체예에서, 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)는 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 친화성을 지닌 결합 부위(예를 들어, 항원-결합 부위)를 함유하는 폴리펩티드 결합 부분를 포함하며, 폴리펩티드 결합 도메인은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌 항체의 항원-결합 단편이다.
본원 발명은 또한 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분에 약물을 결합시킴으로써, 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 지니는 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유적 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 생성시키는 것을 포함하여, 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
몇몇 구체예에서, 상기 방법은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분에 약물을 결합시킴으로써, 상기 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 지니고, 상기 약물의 활성의 약 90% 이상의 활성을 지니는 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 생성시키는 것을 포함하여, 약물의 활성을 실질적으로 감소시키지 않으면서 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위한 것이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분에 약물을 결합시킴으로써, 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 지니고, 상기 약물보다 덜 면역원성인 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)를 생성시키는 것을 포함하여, 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고, 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 것이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분에 약물을 결합시킴으로써, 상기 약물에 비해 덜 면역원성이고, 상기 약물의 활성의 약 90% 이상의 활성을 지니는 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)를 생성시키는 것을 포함하여, 약물의 활성을 실질적으로 감소시키지 않고 약물의 면역원성을 증가시키기 위한 것이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분에 약물을 결합시킴으로써, 상기 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 지니고, 상기 약물에 비해 덜 면역원성이고, 상기 약물의 활성의 약 90% 이상의 활성을 지니는 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 생성시키는 것을 포함하여, 약물의 활성을 실질적으로 감소시키지 않고 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고, 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 것이다.
약물과 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분은 본원에 기술된 바와 같이 링커를 사용하거나 사용하지 않고 공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 비공유 결합을 통해 결합될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 약물 및 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분은 공유 결합을 통해 결합된다. 예를 들어, 생성된 약물 조성물은 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체이다. 기타 구체예에서, 약물 및 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분은 비공유 결합을 통해 결합되고, 이러한 약물 조성물은 비공유결합 약물 컨주게이트이다.
상기 방법을 이용하여 생성된 약물 조성물은 약물에 비해 보다 큰 활성 (예를 들어, 생체내 활성)을 지닐 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분에 약물을 결합시킴으로써, 약물에 비해 보다 큰 활성을 지니는 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 생성시키는 것을 포함하여, 약물 단독에 비해 보다 큰 활성 (예를 들어, 생체내 활성)을 지니는 약물 조성물을 생성시키기 위한 것이다. 이러한 구체예에서, 바람직하게는 약물 조성물의 활성은 본원에 기술된 약물의 활성에 비해 보다 크다.
바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 부분은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 부분은 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지니는 항체의 항원 결합 단편이다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 항체의 항원 결합 단편)으로부터 상기 폴리펩티드 결합 부분을 선택하는 것을 포함하고, 여기서 선택된 폴리펩티드 결합 부분은 약 5 mM 이상의 KD로 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 결합한다.
본원 발명은 또한 약제의 제조를 위해 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부분을 지니는 폴리펩티드 결합 부분의 용도에 관한 것으로, 상기 약제는 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위해 약물이 상기 폴리펩티드 결합 부분에 결합된 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 상기 용도는 약제의 제조를 위한 것으로, 상기 약제는 약물의 활성을 약 10% 이하로 감소시키지 않고 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위해 약물이 상기 폴리펩티드 결합 부분에 결합된 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 용도는 약제의 제조를 위한 것으로, 상기 약제는 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고, 약물의 면역원성을 감소시키기 위해 약물이 상기 폴리펩티드 결합 부분에 결합된 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 용도는 약제의 제조를 위한 것으로, 상기 약제는 약물의 활성을 약 10% 이하로 감소시키지 않고 약물의 면역원성을 감소시키기 위해 약물이 상기 폴리펩티드 결합 부분에 결합된 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 용도는 약제의 제조를 위한 것으로, 상기 약제는 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고, 약물의 활성을 약 10% 이하로 감소시키지 않고 약물의 면역원성을 감소시키기 위해 약물이 상기 폴리펩티드 결합 부분에 결합된 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함한다.
약물 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 링커를 사용하거나 사용하지 않고 비공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합) 또는 비공유 결합을 통해 결합되는 약물 및 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 약물 및 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부분을 지니는 폴리펩티드 결합 부분은 공유 결합을 통해 결합된다. 예를 들어, 약물 조성물은 약물 조성물은 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체일 수 있다. 기타 구체예에서, 약물 및 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분은 비공유 결합을 통해 결합되고, 이러한 약물 조성물은 비공유결합 약물 컨주게이트이다.
특정 구체예에서, 상기 용도는 약제의 제조를 위한 것으로, 상기 약제는 상기 약물 보다 활성 (예를 들어, 생체내 활성)을 증가시키기 위해 약물이 상기 폴리펩티드 결합 부분이 결합된 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함한다. 이러한 구체예에서, 바람직하게는 약물 조성물의 활성은 본원에 기술된 약물의 활성보다 크다.
바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 부분은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 부분은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 항체의 항원 결합 단편이다.
혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편
본원 발명의 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 및 약물 융합체는 혈청 알부민과 결합하는 항체의(하나 이상의) 항원-결합 단편을 포함한다. 항원-결합 단편은 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체가 투여되는 동물의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닐 수 있다. 바람직하게는, 항원-결합 단편은 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌다. 그러나, 수의학적 적용이 고려되며, 항원-결합 단편은 요망되는 동물로부터의 혈청 알부민, 예를 들어 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양, 돼지, 염소, 사슴, 밍크 등으로부터의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 한 가지 이상의 종으로부터의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 래트 혈청 알부민 및 생쥐 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌 인간 dAb, 및 래트, 생쥐 및 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌 dAb가 생성되었다(표 1 및 도 7). 이러한 dAb는 동일한 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체를 사용하여 전임상 및 임상 실험을 할 수 있게 하는 이점을 제공하며, 적합한 대용 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트로 전임상 실험을 수행할 필요가 없게 한다.
본원 발명에 사용하기에 적합한 항원-결합 단편으로는 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편(단일 사슬 Fv(scFv) 및 이황화물 결합된 Fv를 포함함), 단일 가변 도메인 및 dAb(VH, VL)이 있다. 이러한 항원-결합 단편은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 펩신, 파파인 또는 필요로 하는 절단 특이성을 지닌 다른 프로테아제를 사용한 항체의 단백질분해에 의해 또는 재조합 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, Fv 단편은 적합한 프로테아제를 사용하여 항체를 분해시키거나 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 2개 내지 약 20개의 글리실 잔기의 사슬과 같은 적합한 펩티드 링커에 의해 연결되는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 핵산을 엔코딩하는 핵산이 제조될 수 있다. 이러한 핵산은 임의의 적합한 기술(예를 들어, 트랜스펙션, 형질전환, 감염)을 이용하여 적합한 숙주(예를 들어, 대장균)내로 도입될 수 있고, 숙주는 단일 사슬 Fv 단편의 발현에 적합한 조건하에서 유지될 수 있다. 하나 이상의 정지 코돈이 천연 정지 부위의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 사용하여 항체의 다양한 항원-결합 단편이 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 F(ab')2 부분을 엔코딩하는 발현 구성물은 중쇄의 힌지 영역을 엔코딩하는 서열의 3' 말단에 번역 정지 코돈을 도입시킴으로써 설계될 수 있다. 본원 발명의 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 및 약물 융합체는 혈청 알부민과 결합하는 항체의 개개의 중쇄 및 경쇄 또는 혈청 알부민과 결합하는 개개의 사슬의 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, 단일 VH, Vκ 또는 Vλ).
요망되는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 천연 또는 합성 항체의 적합한 수집물로부터 선택되거나 적합한 숙주에서 적절한 면역원에 대해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민으로부터 단리되거나 정제된 것) 또는 혈청 알부민의 펩티드(예를 들어, 적어도 약 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 33개, 35개, 37개 또는 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드)를 사용하여 적합한 숙주(예를 들어, 생쥐, 인간 항체-유전자이식 생쥐, 래트, 토끼, 닭, 염소, 인간 이외의 영장류(예를 들어, 원숭이))를 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 또한, 혈청 알부민과 결합하는 항체 및 항원-결합 단편은 재조합 항체 또는 항원-결합 단편의 라이브러리, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 이러한 라이브러리는 천연 또는 합성 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 함유할 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 합성 CDR(예를 들어, 무작위 아미노산 서열) 및 인간 프레임워크 영역을 함유하는 Fab 단편을 함유할 수 있다(참조: 미국 특허 제 6,300,064호(Knappik, et al.). 다른 예에서, 라이브러리는 하나 이상의 CDR에서 서열 다양성을 지니는 scFv 단편 또는 dAb(단일 VH, 단일 Vκ 또는 단일 Vλ)를 함유한다(참조: WO 99/20749호(Tomlinson and Winter), WO 03/002609 A2호(Winter et al.), WO 2004/003019 A2호(Winter et al.)).
혈청 알부민과 결합하는 적합한 항체 및 이의 항원-결합 단편으로는 예를 들어 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화된 항체 및 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 및 이의 항원-결합 단편, 설치류(예를 들어, 생쥐, 토끼) 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 카멜리드(Camelid) 항체 및 이의 항원-결합 단편이 있다. 특정 구체예에서, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 및 약물 융합체는 혈청 알부민과 결합하는 카멜리드 VHH를 포함한다. 카멜리드 VHH는 천연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 항체는 낙타, 라마, 알파카(alpaca), 단봉낙타(dromedary) 및 과나코(guanaco)를 포함하는 카멜리드 종에서 발견된다. VHH 분자는 IgG 분자 보다 약 10배 작고, 단일 폴리펩티드로서 매우 안정하며 극심한 pH 및 온도 조건에 대해 내성이 있다. 혈청 알부민과 결합하는 적합한 카멜리드 VHH로는 WO 2004/041862호(Ablynx N.V.) 및 본원(도 15 및 서열번호:77 내지 서열번호:88)에 기재된 것들이 있다. 특정 구체예에서, 카멜리드 VHH는 인간 혈청 알부민과 결합하며, 서열번호:68, 서열번호:69, 서열번호:70, 서열번호:71, 서열번호:72, 서열번호:73, 서열번호:74, 서열번호:75, 서열번호:76, 서열번호:77, 서열번호:78, 서열번호:79, 서열번호:80, 서열번호:81, 서열번호:82, 서열번호:83 또는 서열번호:84과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열 상동성은 바람직하게는 적합한 서열 정렬 알고리듬 및 디폴트 파라미터, 예를 들어 BLAST P(Karlin and Alschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-2268 (1990))를 이용하여 측정된다.
면역화 항원의 제조, 및 폴리클로날 및 모노클로날 항체 생성은 임의의 적합한 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 다양한 방법이 공지되어 있다(참조: Kohler et al, Nature, 256: 495-497 (1975) and Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein et al, Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al, 미국 특허 제 4,172,124호; Harlow, E. and D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2(Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F.M. et al., Eds.,(John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11, (1991)). 일반적으로, 모노클로날 항체가 요망되는 경우, 무한증식 세포주로부터의 적합한 세포(예를 들어, SP2/0, P3X63Ag8.653 또는 헤테로미엘로마(Heteromyeloma)와 같은 골수종 세포주)를 항체-생성 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마가 생성된다. 항체-생성 세포는 관심 대상의 항원으로 면역화된 인간, 인간-항체 유전자이식 동물 또는 그 밖의 적합한 동물의 말초혈 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 수득될 수 있다. 인간 기원의 항체(예를 들어, 인간 항체)를 생성시키는 세포는 적합한 방법, 예를 들어 인간 항체-생성 세포와 헤테로미엘로마 또는 트리오마(trioma)의 융합, 또는 엡스타인 바르 바이러스에 의한 감염을 통한 활성화된 인간 B 세포의 무한증식화를 이용하여 생성될 수 있다(참조: 미국 특허 제 6,197,582호(Trakht); Niedbala et al., Hybridoma, 17:299-304(1998); Zanella et al., J Immunol Methods, 156:205-215(1992); Gustafsson et al., Hum Antibodies Hybridomas, 2:26-32(1991)). 융합되거나 무한증식화된 항체-생성 세포(하이브리도마)는 선택적 배양 조건을 이용하여 단리되고, 제한 희석에 의해 클로닝될 수 있다. 요망되는 특이성을 지닌 항체를 생성시키는 세포는 적합한 검정법(예를 들어, ELISA)을 이용하여 확인될 수 있다.
또한, 항체는 관심 대상의 항원으로 면역화된 인간, 인간-항체 유전자이식 동물 또는 그 밖의 적합한 동물의 단리된 항원-특이적 항체 생성 세포(예를 들어, 말초혈 또는 바람직하게는 요망되는 특이성을 지닌 항체를 생성시키는 것으로 측정된 비장 또는 림프절로부터의 세포)로부터 직접 제조(예를 들어, 합성 또는 클로닝)될 수 있다(참조: 미국 특허 제 5,627,052호(Schrader)).
약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체가 인간에게 투여하기 위한 것인 경우, 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 이러한 유형의 항체 및 항원-결합 단편은 인간에서 덜 면역원성이거나 면역원성이 아니어서, 널리 공지된 이점을 제공한다. 예를 들어, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체의 항원-결합 단편을 함유하는 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체는 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체에 결합하는 인간 항체의 정교함으로 인해 효능이 덜 손실되거나 효능 손실없이(다른 완전히 면역원성인 항체와 비교하여) 인간에게 반복 투여될 수 있다. 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체가 수의학적 투여를 위해 의도되는 경우, 유사한 항체 또는 항원-결합 단편이 사용될 수 있다. 예를 들어, 뮤린 또는 인간 항체로부터의 CDR이 요망되는 동물, 예를 들어 말 또는 소로부터의 프레임워크 영역상으로 이식될 수 있다.
인간 항체 및 이를 엔코딩하는 핵산은 예를 들어 인간 또는 인간-항체 유전자이식 동물로부터 수득될 수 있다. 인간-항체 유전자이식 동물(예를 들어, 생쥐)은 인간 항체의 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 동물, 예를 들어 XENOMOUSE(Abgenix, Fremont, CA), HUMAB-MOUSE, KIRIN TC MOUSE 또는 KM-MOUSE (MEDAREX, Princeton, NJ)이다. 일반적으로, 인간-항체 유전자이식 동물의 게놈은 작용성 재배열이 일어날 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 이식유전자(transgene)를 포함하도록 변화된다. 인간-항체 유전자이식 동물내의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 유전자에 의해 엔코딩되는 항체를 생성시킬 수 있는 동물의 능력을 제거하도록 파괴되거나 결실될 수 있다. 인간-항체 유전자이식 동물을 생성시키는 적합한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(참조: 미국 특허 제 5,939,598호 및 제 6,075,181호 (Kucherlapati et al), 미국 특허 제 5,569,825호, 제 5,545,806호, 제 5,625,126호, 제 5,633,425호, 제 5,661,016호 및 제 5,789,650호(Lonberg et al), Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 90: 2551-2555(1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258(1993), WO 98/50433호(Jakobovits et al.), WO 98/24893호(Jakobovits et al.), WO 98/24884호(Lonberg et al), WO 97/13852호(Lonberg et al), WO 94/25585호(Lonberg et al.), EP 0 814 259 A2호(Lonberg et al.), GB 2 272 440 A호(Lonberg et al.), Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994), Lonberg et al, Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995), WO 96/34096호(Kucherlapati et al.), EP 0 463 151 Bl(Kucherlapati et al.), . EP 0 710 719 Al호(Kucherlapati et al.), 미국 특허 제 5,545,807호(Surani et al.), WO 90/04036호(Bruggemann et al.), EP 0438 474 Bl(Bruggemann et al.), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146- 156 (1997), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8):3720-3724 (1993) 및 Fishwild et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996); 이들 문헌 각각의 교시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
인간-항체 유전자이식 동물은 적합한 항원(예를 들어, 인간 혈청 알부민)으로 면역화될 수 있고, 항체 생성 세포가 통상적인 방법을 이용하여 단리되고 융합되어 하이브리도마를 형성시킬 수 있다. 요망되는 특성(예를 들어, 특이성, 친화성)을 지닌 인간 항체를 생성시키는 하이브리도마는 임의의 적합한 검정법(예를 들어, ELISA)을 이용하여 확인될 수 있고, 요망되는 경우, 적합한 배양 기술을 이용하여 선택되고 서브클로닝될 수 있다.
인간화된 항체 및 다른 CDR-이식된 항체는 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. CDR-이식된 항체의 CDR은 혈청 알부민과 결합하는 적합한 항체(도너(donor) 항체로 일컬어짐)로부터 유래될 수 있다. 적합한 CDR의 그 밖의 공급원으로는 인간 또는 비인간 공급원, 예를 들어 설치류(예를 들어, 생쥐, 래트, 토끼), 닭, 돼지, 염소, 인간 이외의 영장류(예를 들어, 원숭이) 또는 라이브러리로부터 수득된 천연 및 합성 혈청 알부민-특이적 항체가 있다.
인간화된 항체의 프레임워크 영역은 바람직하게는 인간 기원이고, 도너 항체의 항원-결합 영역의 유사하거나 동등한 영역에 대해 서열 유사성을 지닌 임의의 인간 항체 가변 영역(예를 들어, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역)으로부터 유래될 수 있다. 인간 기원의 프레임워크 영역의 그 밖의 공급원으로는 인간 가변 영역 컨센서스 서열이 있다(참조: Kettleborough, CA. et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al., WO 94/04679호; Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). CDR 이식된 항체의 다른 유형은 적합한 기원의 프레임워크 영역, 예를 들어 말, 소, 개, 고양이 등으로부터의 생식계열(germline) 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는 프레임워크 영역을 함유할 수 있다.
인간 기원의 프레임워크 영역은 인간 또는 동물 기원의 프레임워크 영역내의 아미노산 잔기를 도너 항체의 상응하는 위치로부터의 잔기로 대체하는 "역돌연변이"와 같은 아미노산 치환 또는 대체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 및 치환을 포함하는 프레임워크 영역에서의 하나 이상의 돌연변이가 일어날 수 있다. 변이체는 비-인간 도너 또는 억셉터(acceptor) 인간 사슬의 돌연변이유발을 포함하는 다양한 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5,693,762호(Queen et al.) 및 제 5,859,205호 (Adair et al.); 이들 문헌의 교시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
항체, 항체 사슬(예를 들어, 중쇄, 경쇄) 또는 이들의 단편 또는 부분의 불변 영역이 존재하는 경우 이러한 영역은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간, 인간화된 및 특정 키메라 항체, 항체 사슬(예를 들어, 중쇄, 경쇄) 또는 이들의 단편 또는 부분의 불변 영역이 존재하는 경우 이들 영역은 인간 기원일 수 있고, 임의의 적합한 인간 항체 또는 항체 사슬로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 기원의 불변 영역 또는 이의 부분은 대립유전자 변이체를 포함하는 인간 κ 또는 λ 경쇄, 및/또는 인간 γ(예를 들어, γ1, γ2, γ3, γ4), μ, α(예를 들어, α1, α2), δ 또는 ε 중쇄로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 기원의 항체, 인간 항체)은 기능(예를 들어, 이펙터 기능)을 변화시키거나 조정하는 아미노산 치환 또는 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 기원의 불변 영역(예를 들어, γ1 불변 영역, γ2 불변 영역)이 보체 활성화 및/또는 Fc 수용체 결합을 감소시키도록 설계될 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5,648,260호 (Winter et al.), 제 5,624,821호(Winter et al.) 및 제 5,834,597호(Tso et al.); 이들 특허의 전체 교시 내용은 본원에 참조로 포함되어 있음). 바람직하게는, 그러한 아미노산 치환 또는 대체를 함유하는 인간 기원의 불변 영역의 아미노산 서열은 변화되지 않은 인간 기원의 불변 영역의 아미노산 서열과 전장에 걸쳐서 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 99% 이상 동일하다.
인간화된 항체, CDR 이식된 항체 또는 인간화된 항체 또는 CDR 이식된 항체의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 수 가지의 이러한 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다(참조: 미국 특허 제 5,225,539호(Winter), 미국 특허 제 5,530,101호(Queen et al.)). 인간화된 항체 또는 CDR 이식된 항체의 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, 불변 영역)은 적합한 항체로부터 직접 수득되거나 유래될 수 있거나(예를 들어, 부분의 드 노보(de novo) 합성에 의해), 요망되는 특성(예를 들어, 혈청 알부민과 결합하는 특성)을 지닌 항체 또는 이의 사슬을 엔코딩하는 핵산이 생성되고 발현될 수 있다. 사슬의 부분을 제조하기 위해, 하나 이상의 정지 코돈이 요망되는 위치에 도입될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 또는 CDR 이식된 가변 영역을 코딩하는 핵산(예를 들어, DNA) 서열이 기존의 DNA 서열을 변화시키도록 PCR 돌연변이유발법을 이용하여 구성될 수 있다(참조: Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res. 17:5404(1989)). 새로운 CDR을 코딩하는 PCR 프라이머가 동일하거나 매우 유사한 인간 가변 영역을 기초로 하는 이미 인간화된 가변 영역의 DNA 주형에 하이브리드화될 수 있다(Sato, K., et al., Cancer Research 53:851-856 (1993)). 주형으로서 사용하려는 유사한 DNA 서열이 이용가능하지 않은 경우, 가변 영역 서열을 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 합성 올리고누클레오티드로부터 구성될 수 있다 (참조: Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). 또한, 신호 펩티드를 엔코딩하는 서열이 핵산내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 합성시, 벡터내로 삽입시). 억셉터 항체로부터의 천연 신호 펩티드 서열, 또 다른 항체로부터의 신호 펩티드 서열 또는 다른 적합한 서열이 사용될 수 있다 (참조: Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783(1991)). 이러한 방법 또는 다른 적합한 방법을 이용하는 경우, 변이체가 용이하게 생성될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 클로닝된 가변 영역이 돌연변이될 수 있고, 요망되는 특이성을 지닌 변이체를 엔코딩하는 서열이 선택될 수 있다(예를 들어, 파지 라이브러리로부터; 참조: 미국 특허 제 5,514,548호(Krebber et al.) 및 WO 93/06213호(Hoogenboom et al.)).
혈청 알부민과 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항체 또는 키메라 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나의 종(예를 들어, 생쥐)로부터의 가변 영역 및 또 다른 종 (예를 들어, 인간)으로부터의 불변 영역의 일부 또는 전부를 포함한다. 키메라 항체 및 키메라 항체의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 수 가지의 적합한 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다(참조: 미국 특허 제 4,816,567호(Cabilly et al.), 미국 특허 제 5,116,946호(Capon et al.)).
혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 수득하기 위한 바람직한 방법은 항원-결합 단편의 레퍼토리로부터 요망되는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지닌 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, dAb)를 선택하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 혈청 알부민과 결합하는 dAb는 적합한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 다수의 적합한 박테리오파지 디스플레이 라이브러리 및 선택 방법(예를 들어, 1가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 공지되어 있다(참조: 그리피스(Griffiths) 등의 미국 특허 제 6,555,313 Bl호(본원에 참조로 포함됨); 존슨(Johnson) 등의 미국 특허 제 5,733,743호(본원에 참조로 포함됨); 맥카퍼티(McCafferty) 등의 미국 특허 제 5,969,108호(본원에 참조로 포함됨); 뮬리건-케오에(Mulligan-Kehoe)의 미국 특허 제 5,702,892호(본원에 참조로 포함됨); Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. l2:433-455(1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189(1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133(2001); WO 99/20749호(Tomlinson and Winter); WO 03/002609 A2호(Winter et al.); WO 2004/003019 A2호(Winter et al.)). 박테리오파지 라이브러리에서 디스플레이되는 폴리펩티드는 임의의 적합한 박테리오파지, 예를 들어 섬유상 파지(예를 들어, fd, M13, F1), 용균성 파지(예를 들어, T4, T7, 람다) 또는 RNA 파지(예를 들어, MS2) 상에서 디스플레이될 수 있고, 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합하는 지의 여부에 대해 선택될 수 있다.
일반적으로, 폴리펩티드의 레퍼토리를 적합한 파지 피막 단백질과의 융합 단백질로서 디스플레이하는 파지의 라이브러리가 사용된다. 이러한 라이브러리는 디스플레이된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 엔코딩하는 파지 벡터 또는 파지미드 벡터의 라이브러리를 적합한 숙주 세균내로 도입시키고, 생성된 세균을 배양하여 파지를 생성시키는 것과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 요망되는 경우 적합한 헬퍼 파지 또는 보완 플라스미드를 사용함). 파지의 라이브러리는 침전 및 원심분리와 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 배양물로부터 회수될 수 있다.
라이브러리는 임의의 요망되는 정도의 아미노산 서열 다양성을 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 레퍼토리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리는 요망되는 생물체로부터의 천연 항체에 상응하는 아미노산 서열을 지닌 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유하고/하거나 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열(예를 들어, CDR 서열)의 하나 이상의 영역을 함유할 수 있다. 이러한 레퍼토리 또는 라이브러리 중의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열의 규정된 영역 및 공통 아미노산 서열의 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 레퍼토리내의 모든 폴리펩티드 또는 실질적으로 모든 폴리펩티드는 항체의 항원 결합 단편의 요망되는 유형(예를 들어, 인간 VH 또는 인간 VL)이다. 예를 들어, 레퍼토리내의 각각의 폴리펩티드는 VH, VL 또는 Fv(예를 들어, 단일 사슬 Fv)를 함유할 수 있다.
아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 임의의 요망되는 영역내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 돌연변이유발법(예를 들어, 저충실도(low fidelity) PCR, 올리고누클레오티드-매개된 또는 특정부위 돌연변이유발, NNK 코돈을 사용한 다양화(diversification)) 또는 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 다양화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 엔코딩하는 핵산의 라이브러리를 제조함으로써 표적 영역, 예를 들어 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역내로 도입될 수 있다. 요망되는 경우, 다양화시키려는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 영역이 무작위화될 수 있다.
적합한 파지 디스플레이 라이브러리가 혈청 알부민과 결합하는 선택된 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 대해 사용될 수 있고, 이는 유리한 특성을 지닐 수 있다. 예를 들어, 언폴딩(unfolding)된 경우 응집에 저항하는 항체 또는 항원-결합 단편이 선택될 수 있다. 응집은 폴리펩티드 농도에 의해 영향을 받으며, 많은 경우 부분적으로 폴딩되거나 언폴딩된 중간체로부터 일어나는 것으로 여겨진다. 부분적으로 폴딩된 중간체에 유리한 인자 및 조건, 예를 들어 상승된 온도 및 높은 폴리펩티드 농도는 비가역적 응집을 촉진시킨다(Fink, A.L., Folding & Design 3:R1-R23 (1998)). 예를 들어, 정제된 폴리펩티드를 동결건조된 제제와 같이 농축된 형태로 저장하는 경우 자주 폴리펩티드의 일부 또는 전부의 비가역적 응집이 일어난다. 또한, 대장균과 같은 생물학적 시스템에서의 발현에 의한 폴리펩티드의 생성은 종종 응집된 폴리펩티드를 함유하는 봉입체(inclusion body)의 형성을 초래한다. 봉입체로부터 활성 폴리펩티드를 회수하는 것은 매우 어려울 수 있고, 리폴딩(refolding) 단계와 같은 추가의 단계를 생물학적 생성 시스템에 첨가하는 것을 필요로 할 수 있다.
가열시 가역적으로 언폴딩되며 응집에 저항하는 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 디스플레이된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리가 디스플레이된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 또는 전부가 언폴딩되는 온도(Ts)로 가열된 후, 온도(Tc)(여기서 Tc는 Ts 보다 낮음)로 냉각됨으로써, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 또는 전부가 리폴딩되고, 폴리펩티드의 일부가 응집된다. 그 후, 비가역적으로 언폴딩되며 혈청 알부민과 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 온도(Tr)에서 회수된다. 가역적으로 언폴딩되는 회수된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 융점(Tm)을 지니며, 바람직하게는 레퍼토리가 Ts로 가열되고, Tc로 냉각되고, 가역적으로 언폴딩되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 Tr에서 단리되는데, 여기서 Ts>Tm>Tc이고, Ts>Tm>Tc 이다. 일반적으로, 파지 디스플레이 라이브러리는 약 80℃로 가열되고, 대략 실온 또는 약 4℃로 냉각된다. 또한, 가역적으로 언폴딩되며 응집에 저항하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특정 아미노산 잔기를 가역적으로 언폴딩되는 능력을 부여하는 잔기로 대체함으로써 설계되거나 공학처리될 수 있다 (가역적으로 언폴딩되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 선택하고 이를 설계하거나 공학처리하기 위한 방법에 관한 상세한 논의에 대해서는 WO 2004/101790호(Jespers et al.) 및 미국 가특허출원 제 60/470,340호(출원일: 2003년 5월 14일) 및 제 60/554,021호(출원일: 2004년 3월 17일)를 참조하라. WO 2004/101790호 및 상기 2건의 미국 가특허출원의 교시내용은 본원에 참조로 포함된다).
가역적으로 언폴딩되며 응집에 저항하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 수 가지 이점을 제공한다. 예를 들어, 응집에 대한 저항성으로 인해, 가역적으로 언폴딩되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 대장균과 같은 적합한 생물학적 생성 시스템을 사용하여 발현에 의해 가용성 단백질로서 고수율로 용이하게 생성될 수 있다. 또한, 가역적으로 언폴딩되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 통상적인 폴리펩티드 보다 높은 농도에서 응집 및 활성의 손실을 덜 나타내며 제형화되고/되거나 저장될 수 있다. DOM7h-26(서열번호:20)은 가역적으로 언폴딩되는 인간 VH 이다.
바람직하게는, 혈청 알부민과 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 프레임워크 영역 (FR)의 하나 이상이 (a) 인간 프레임워크 영역의 아미노산 서열, (b) 인간 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 8개 이상의 연속 아미노산, 또는 (c) 인간 생식계열(germline) 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인(VH, Vκ, Vλ)을 포함하며, 여기서 상기 프레임워크 영역은 카바트(Kabat)에 의해 규정된 바와 같다. 특정 구체예에서, 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 서열은 인간 배선 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나, 상기 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 서열은 인간 배선 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는 상기 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 비교하여 전체적으로 5개 이하의 아미노산 차이를 포함한다.
다른 구체예에서, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 아미노산 서열은 인간 배선 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 아미노산 서열은 상기 인간 배선 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 비교하여 전체적으로 10개 이하의 아미노산 차이를 함유한다. 다른 구체예에서, 상기 FR1, FR2 및 FR3의 아미노산 서열은 상기 인간 배선 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하다.
특정 구체예에서, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 인간 배선 서열을 기초로 하는 면역글로불린 가변 도메인(예를 들어, VH, VL)을 포함하며, 요망되는 경우 상보성 결정 영역과 같은 하나 이상의 다양화된 영역을 지닐 수 있다. VH에 대한 적합한 인간 배선 서열로는, 예를 들어 VH 유전자 단편인 DP4, DP7, DP8, DP9, DPl0, DP31, DP33, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68 및 DP69, 및 JH 단편인 JHl, JH2, JH3, JH4, JH4b, JH5 및 JH6에 의해 엔코딩되는 서열이 있다. VL에 대한 적합한 인간 배선 서열로는, 예를 들어 Vκ 유전자 단편인 DPKl, DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK10, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPK19, DPK20, DPK21, DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26 및 DPK28, 및 Jκ 단편인 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5에 의해 엔코딩되는 서열이 있다.
특정 구체예에서, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체는 혈청 알부민과 결합하는 생쥐, 래트 및/또는 토끼 항체 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편을 함유하지 않는다.
항원-결합 단편은 임의의 요망되는 친화성, 온 레이트(on rate) 및 오프 레이트(off rate)를 나타내며 혈청 알부민과 결합할 수 있다. 친화성(KD), 온 레이트(Kon 또는 Ka) 및 오프 레이트(Koff 또는 kd)는 특정 약물에 대해 요망되는 혈청 반감기를 수득하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 만성 염증 장애의 염증 매개물질을 중화시키는 약물(예를 들어, 염증성 사이토카인과 결합하여 이를 중화시키는 dAb)에 대해서는 최대 혈청 반감기를 수득하는 것이 바람직할 수 있고, 짧은 반감기는 약간의 독성을 지닌 약물(예를 들어, 화학요법제)에 대해 바람직할 수 있다. 일반적으로, 혈청 알부민에 결합하는 데에 있어서 신속한 온 레이트 및 신속하거나 중간 정도의 오프 레이트가 바람직하다. 이러한 특징을 지닌 항원-결합 단편을 포함하는 약물 컨주게이트 및 약물 융합체는 투여된 후 신속히 혈청 알부민과 결합하고, 신속히 해리되어 혈청 알부민과 재결합한다. 이러한 특징은 약물의 신속한 제거를 감소시키지만(예를 들어, 신장을 통해), 여전히 약물 표적에 대한 효율적인 전달 및 접근을 제공한다.
혈청 알부민과 결합하는 항원-결합 단편(예를 들어, dAb)는 일반적으로 약 1 nM 내지 약 500 μM의 KD로 결합한다. 일부 구체예예에서, 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하여(예를 들어, BIACORE 기기를 사용함) 약 10 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 500 nM, 또는 약 500 nM 내지 약 5 mM의 KD (KD=Koff(kd)/Kon(ka))로 혈청 알부민과 결합한다. 특정 구체예에서, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체는 약 50 nM, 약 70nM, 약 100 nM, 약 150 nM 또는 약 200 nM의 KD로 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 결합하는 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, dAb)을 포함한다. 본원에 기재된 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 및 약물 융합체의 개선된 약력학적 특성(예를 들어, 연장된 t1/2β, 증가된 AUC)는 혈청 알부민과 결합하는 항원-결합 단편의 친화성과 상호관련될 수 있다. 따라서, 개선된 약력학적 특성을 지닌 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 및 약물 융합체는 일반적으로 높은 친화성(예를 들어, 약 500 nM 이하, 약 250 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 100 pM 이하의 KD)으로 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 결합하는 항원-결합 단편을 사용하여 제조될 수 있다.
바람직하게는, 혈청 알부민과 결합하는 항원-결합 단편에 컨주게이션되거나 융합된 약물은 혈청 알부민에 대한 항원-결합 단편의 친화성 보다 강력한 친화성 (KD) 및/또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하여(예를 들어, BIACORE 기기를 사용함) 혈청 알부민에 대한 항원-결합 단편의 Koff 보다 빠른 Koff(kd)로 이의 표적(약물 표적)에 결합한다. 예를 들어, 약물은 SA에 대해 SA와 결합하는 항원-결합 단편의 친화성 보다 약 1 내지 약 100000배, 약 100 내지 약 100000배, 약 1000 내지 약 100000배, 또는 약 10000 내지 약 100000배 강력한 친화성으로 이의 표적과 결합할 수 있다. 예를 들어, SA와 결합하는 항체의 항원-결합 단편은 약 10 μM의 친화성으로 결합할 수 있는 반면, 약물은 약 100 pM의 친화성으로 이의 표적과 결합한다.
특정 구체예에서, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편은 인간 혈청 알부민과 결합하는 dAb이다. 예를 들어, 서열번호: 10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 지니는 Vκ dAb 또는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 지니는 VH dAb가 있다. 다른 구체예에서, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편은 인간 혈청 알부민과 결합하는 dAb이며, 이는 앞서 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편은 인간 혈청 알부민과 결합하는 dAb이며, 이는 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 서열번호:26, 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호: 18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 또는 서열번호:23과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열 동일성은 바람직하게는 적합한 서열 정렬 알고리듬 및 디폴트 파라미터, 예를 들어 BLAST P(Karlin and Altschul, Proc. Natl Acad. Sd. USA 87(6):2264-2268 (1990))를 이용하여 측정된다.
약물
본원 발명의 특정 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트)은, 예를 들어 개체내의 생물학적 표적 분자에 결합하고/하거나 이의 기능을 변화시킴으로써, 유리한 치료 또는 진단 효과를 생성시키도록 개체에 투여될 수 있는 임의의 약물(예를 들어, 소형 유기 분자, 핵산, 폴리펩티드)을 포함할 수 있다. 본원 발명의 다른 약물 조성물(예를 들어, 약물 융합체)은 폴리펩티드 또는 펩티드 약물을 포함할 수 있다. 약물 융합체의 바람직한 구체예에서, 약물은 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편(예를 들어, VH, Vκ, Vλ)을 포함하지 않는다.
TNFR1은 리간드에 결합하는 세포외 영역과 내인성 신호전달 활성이 결핍되어 있으나 신호전달 분자와 회합할 수 있는 세포내 도메인을 함유하는 막횡단 수용체이다. TNFR1과 결합 TNF의 복합체는 세개의 TNFR1 사슬 및 세개의 TNF 사슬을 함유한다(Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993). TNF 리간드는 세개의 TNFR1 사슬에 의해 결합되는 삼합체로 존재한다(Id.). 세개의 TNFR1 사슬은 수용체-리간드 복합체에서 함께 밀접하게 클러스터링되고, 이러한 클러스터링은 TNFR1 매개 신호전달에서 필수적이다. 사실, TNFR1에 결합하는 다가 작용제, 예를 들어 항-TNFR1 항체는 TNF의 부재하에서 TNFR1 클러스터링 및 신호전달을 유도할 수 있고, 보통 TNFR1 효능제로서 사용된다(참조: Belka et al., EMBO, J 4(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 767:1920-1928 (2001). 따라서, TNFR1에 결합하는 다가 작용제는 일반적으로 이들이 TNFR1에 대한 TNFα의 결합을 차단하더라도 TNFR1의 효과적인 길항제가 아니다.
TNFR1 및 그외 다른 TNF 수용체 수퍼패밀리 일원들의 세포외 영역은 프레-리간드 결합 어셈블리 도메인 또는 PLAD 도메인(서열번호:85(인간 TNFR1)의 아미노산 1-53; 서열번호:86(마우스 TNFR1)의 아미노산 1-53)으로 언급되는 영역을 포함한다(The Government of the USA, WO 01/58953호; U.S. Patent Application Publication No. 2003/0108992 A1, Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005)).
인간 (호모 사피엔스) TNFR1의 세포외 영역은 하기의 아미노산 서열을 지닌다:
Figure 112007048377730-PCT00001
뮤린 (무스 무스쿠이우스) TNFR1의 세포외 영역은 하기의 아미노산 서열을 지닌다:
Figure 112007048377730-PCT00002
특정 수용체로부터의 PLAD 도메인은 생체내에서 서로 결합하고, 천연 리간드의 존재하에서 수용체 활성화를 방지할 수 있다. 예를 들어, TNFR1의 PLAD 도메인은 또 다른 생체내 TNFR1의 PLAD 도메인 (예를 들어, 세포의 표면에서 발현된 TNFR1)에 결합하고, 천연 리간드에 결합시 수용체 클러스터링 및 이후의 신호전달을 억제할 것이다.
TNF 수용체 수퍼패밀리는 TNFR1(p55, CD 120a, p60, TNF 수용체 수퍼패밀리 일원 1A, TNFRSF1A), TNFR2(p7S, p80, CD120b, TNF 수용체 수퍼패밀리 일원 1B, TNFRSFlB), CD(TNFRSF3, LTβR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III, OX40(TNFRSF4, ACT35, TXGP1L), CD40(TNFRSF5, p50, Bp50), Fas(CD95, TNFRSF6, APO-1, APTI), DcR3(TNFRSF6B), CD27(TNFRSF7, Tp55, S152), CD30(TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137(TNFRSF9, 4-1BB, ILA), TRAILR-1(TNFRSF1OA, DR4, Apo2), TRAIL-R2(TNFRSF1OB, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3(TNFRSF1OG, DcR1, LIT, TRID), TRAILR4(TNFRSF1OD, DcR2, TRUNDD), RANK(TNFRSF11A), OPG(TNFRSF11B, OCF, TR1), DR3(TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L(TNFRSF12L), TAC1(TNERSF13B), BAFFR(TNFRSF13C), HVEM(TNFRSF14, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA), NGFR(TNFRSF16), BCMA(TKFRSF17, BCM), ATTR(TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993(TNFRSF19L, RELT), DR6(TNFRSF21), SOBa(TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), mSOB(THFRSF23, Tnfrh1)을 포함하는 단백질의 당 분야에서 승인된 그룹이다.
여러 PLAD 도메인은 당 분야에 공지되어 있고, PLAD 도메인 및 PLAD 도메인의 기능적 변이체는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 문헌[WO 01/58953호; U.S. Patent Application Publication No, 2003/0108992 Al; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10, 1038/nml304 (2005)]에 기술된 방법을 이용하여 용이하게 분리되고 제조될 수 있다. 폴리펩티드, 단백질 단편 및 펩티드 변이체를 제조하기 위한 다수의 적합한 방법 뿐만 아니라 적합한 분석, 예를 들어 본원에 기술된 TNFR1 수용체 결합 분석이 당 분야에 널리 공지되어 있고, 통상적이다. 예시적 PLAD 도메인은 표 8에 제시되어 있다.
Figure 112007048377730-PCT00003
Figure 112007048377730-PCT00004
몇몇 구체예에서, 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트는 PLAD 도메인, 예를 들어 TNFR1, TNFR2, FAS, LT pR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, DR4 또는 기타 TNF 수용체 상과 일원의 PLAD, 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함한다. PLAD 도메인의 기능적 변이체는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산이 결실되거나, 삽입되거나 치환되었으나, TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4의 상응하는 PLAD에 결합하는 능력을 보유하는 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4의 PLAD 도메인일 수 있다. 기능적 변이체 PLAD 도메인의 아미노산 서열은 상응하는 PLAD (예를 들어, TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, DR4의 PLAD)의 아미노산 서열 내의 아미노산 서열과 동일한 약 10개 이상의 연속적 아미노산, 약 15개 이상의 연속적 아미노산, 약 20개 이상의 연속적 아미노산, 약 25개 이상의 연속적 아미노산, 약 30개 이상의 연속적 아미노산, 약 35개 이상의 연속적 아미노산, 약 40개 이상의 연속적 아미노산의 영역을 포함한다. 또한, 또는 대안적으로, 기능적 변이체 PLAD 도메인의 아미노산 서열은 상응하는 PLAD (예를 들어, TNFRl, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4의 PLAD)의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 동이할 수 있다.
특정 구체예에서, 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트는 PLAD 도메인 (예를 들어, TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40 또는 DR4) 또는 기능적 PLAD 변이체 및 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 결합하는 dAb를 포함한다.
본원 발명에 사용될 수 있는 폴리펩티드 약물을 포함하는 추가의 적합한 약물은 2005년 5월 31일자로 도만티스 리미티드 (Domantis Limited)의 이름으로 출원된 국제 출원 번호 PCT/GB2005/002163에 기술되어 있다. 적절한 약물의 기재는 상기 출원의 페이지 45 내지 50 및 표 8에 기술되어 있다. 이들 약물은 예를 들어 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 지니는 결합 부위를 지니는 폴리펩티드 결합 부분, 및 또 다른 폴리펩티드 약물을 포함하는 약물 조성물, 융합체 또는 컨주게이트를 제조하기 위해 본원 발명에서 사용될 수 있다. 국제 출원 번호 PCT/GB2005/002163의 내용, 특히 본원 발명에 사용하기 위한 적합한 약물과 관련된 내용이 본원에 포함되어 있다.
약물 융합체
본원 발명의 약물 융합체는 연속 폴리펩티드 사슬을 포함하는 융합 단백질이며, 상기 사슬은 제 1 부분으로서의 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 폴리펩티드 약물인 제 2 부분에 결합된 형태로 포함한다. 제 1 및 제 2 부분은 펩티드 결합을 통해 서로 직접 결합될 수 있거나, 적합한 아미노산, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 적절한 경우, 추가의 부분(예를 들어, 제 3 부분, 제 4 부분) 및/또는 링커 서열이 존재할 수 있다. 제 1 부분은 제 2 부분(즉, 폴리펩티드 약물)에 대해 N-말단 위치, C-말단 위치 또는 내부에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 각각의 부분은 하나 이상의 복사체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 약물 융합체는 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 혈청 알부민과 결합하는 VH 및 인간 혈청 알부민과 결합하는 VL 또는 인간 혈청 알부민과 결합하는 둘 이상의 VH 또는 VL)을 각각 포함하는 둘 이상의 제 1 부분을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 약물 융합체는 하기 식을 지닌 연속 폴리펩티드 사슬이다:
a-(X)nl-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d 또는 a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)nl-d
상기 식에서, X는 제 1 표적에 대해 결합 친화성을 지닌 폴리펩티드 약물이고;
Y는 혈청 알부민에 대해 결합 친화성을 지닌 항체의 단일 사슬 항원-결합 단편이고;
Z는 제 2 표적에 대해 결합 친화성을 지닌 폴리펩티드 약물이고; a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 1개 내지 약 100개의 아미노산 잔기이고; nl은 1 내지 약 10이고; n2는 1 내지 약 10이고; n3는 0 내지 약 10이며, 단, n1 및 n2 둘 모두가 1이고 n3가 0인 경우, X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
한 가지 구체예에서, X 또는 Z 중 어느 것도 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다. 한 가지 구체예에서, n1은 1이고, n3는 1이고, n2는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 바람직하게는, Y는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지닌 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지닌 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이다. 더욱 바람직하게는, Y는 인간 혈청 알부민과 결합하는 dAb (예를 들어, VH, Vκ 또는 Vλ)이다. 특정 구체예에서, X 또는 Z는 인간 IL-1ra 또는 인간 IL-1ra의 기능적 변이체이다.
특정 구체예에서, Y는 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Y는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 약물 융합체는 X' 및 Y' 부분을 포함하며, 여기서 X'는 폴리펩티드 약물이고, 단, X'는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않으며; Y'는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지닌 항체의 단일 사슬 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, Y' 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지닌 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 지닌 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이다. 더욱 바람직하게는, Y'는 인간 혈청 알부민과 결합하는 dAb (예를 들어, VH, Vκ 또는 Vλ)이다. X'는 Y'의 아미노 말단에 위치할 수 있거나, Y'는 X'의 아미노 말단에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, X' 및 Y'는 아미노산, 또는 2개 내지 약 100개의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, X'는 인간 IL-1ra 또는 인간 IL-1ra의 기능적 변이체이다.
특정 구체예에서, Y'는 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Y'는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 약물 융합체는 혈청 알부민과 결합하는 dAb 및 인간 IL-1ra를 포함한다(예를 들어, 서열번호: 28). 바람직하게는, dAb는 인간 혈청 알부민과 결합하고, 인간 프레임워크 영역을 포함한다.
다른 구체예에서, 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트는 인간 IL-1ra의 성숙한 152개 아미노산 형태와 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지닌 인간 IL-1ra의 작용성 변이체를 포함하며, 인간 인터류킨-1 1형 수용체를 길항한다(참조: Eisenberg et al., Nature 343:341-346 (1990)). 이러한 변이체는 하나 이상의 추가의 아미노산을 포함할 수 있다(예를 들어, 153개 또는 154개 이상의 아미노산을 포함할 수 있음). 본원 발명의 약물 융합체는 임의의 적합한 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예는 약물 융합체를 엔코딩하는 핵산을 적합한 발현 벡터내로 삽입시킴으로써 생성될 수 있다. 그 후, 생성된 구성물은 발현을 위해 적합한 숙주 세포내로 도입된다. 발현시, 융합 단백질은 세포 용해질로부터 또는 바람직하게는 배지 또는 원형질막공간으로부터 임의의 적합한 방법을 이용하여 단리되거나 정제될 수 있다(참조: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al, eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8(1991)).
적합한 발현 벡터는 다수의 성분, 예를 들어 복제 원짐, 선택성 마커 유전자, 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트, 예를 들어 전사 조절 엘리먼트(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 터미네이터) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 리더 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 조절 엘리먼트 및 신호 서열은 존재하는 경우 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 조절 서열이 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
프로모터는 요망되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 핵산의 전사를 유도하도록 항체, 항체 사슬 또는 이의 일부를 엔코딩하는 핵산에 작동적으로 결합될 수 있다. 원핵(예를 들어, 대장균에 대한 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵(예를 들어, 시미안 바이러스 40 초기 또는 후기 프로모터, 루스(Rous) 사르코마 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터) 숙주에 대한 다수의 적합한 프로모터가 이용가능하다.
또한, 발현 벡터는 전형적으로 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 위한 선택성 마커, 그리고 복제가능한 발현 벡터의 경우에는 복제 원점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 엔코딩하는 유전자가 통상적인 선택성 마커이며, 이는 원핵 세포(예를 들어, 락타마아제 유전자(앰피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(미코페놀산), 암피실린 또는 히드로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디히드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트에 의한 선택을 가능하게 한다. 숙주의 옥소트로픽(auxotrophic) 마커(예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자가 종종 효모에서 선택성 마커로서 사용된다. 바이러스(예를 들어, 바큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포의 게놈내로 삽입될 수 있는 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용하는 것이 또한 고려된다. 포유동물 세포 및 원핵 세포(대장균), 곤충 세포(드로소필라 쉬니에더(Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9) 및 효모 (피. 메타놀리카(P. methanolica), 피. 파스토리스(P. pastoris), 에스. 세리비시애(S. cerevisiae))에서 발현되는 적합한 발현 벡터는 당 분야에 잘 공지되어 있다.
약물 융합체를 발현하는 재조합 숙주 세포 및 본원에 기술된 약물 융합체를 제조하는 방법이 제공된다. 재조합 숙주 세포는 약물 융합체를 엔코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 약물 융합체는 적합한 숙주 세포에서 단백질을 엔코딩하는 재조합 핵산을 발현시킴으로써 또는 다른 적합한 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 발현 구성물은 적합한 숙주 세포내로 도입될 수 있고, 생성된 세포는 구성물의 발현에 적합한 조건하에서 유지될 수 있다(예를 들어, 배양물에서, 동물에서). 적합한 숙주 세포는 대장균, 비. 서브틸리스(B. Subtilis) 또는 다른 적합한 세균과 같은 세균 세포를 포함하는 원핵 세포 또는 진균 또는 효모 세포(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스퍼길러스 종(Aspergillus species), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), 또는 그 밖의 하등 진핵 세포, 및 고등 진핵 세포, 예를 들어 곤충 (예를 들어, Sf9 곤충 세포(WO 94/26087호(O'Connor)) 또는 포유동물(예를 들어, COS 세포, 예를 들어 COS-1(ATCC 수탁 번호 CRL-1650) 및 COS-7(ATCC 수탁 번호 CRL-1651), CHO(예를 들어, ATCC 수탁 번호 CRL- 9096), 293(ATCC 수탁 번호 CRL-1573), HeLa(ATCC 수탁 번호 CCL-2), CV1(ATCC 수탁 번호 CCL-70), WOP(Dailey et al, J. Virol. 54:739-749 (1985)), 3T3, 293T(Pear et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)), NSO 세포, SP2/0, HuT 78 세포 등(참조: Ausubel, F.M. et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993))로부터 기원한 세포이다.
또한, 본원 발명은 약물 융합체의 발현에 적합한 조건하에서 본원 발명의 재조합 숙주 세포를 유지시키는 것을 포함하여 약물 융합체를 생성시키는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 요망되는 경우 약물 융합체를 단리하거나 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 약물 융합체의 성분들(예를 들어, 인간 혈청 알부민과 결합하는 dAb 및 IL-1ra)이 어셈블링되어 연속 폴리펩티드 사슬을 생성시킨다.
컨주게이트
또 다른 측면에서, 본원 발명은 약물에 결합되는 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 컨주게이트를 제공한다. 이러한 컨주게이트는 약물이 공유결합되는 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 "약물 컨주게이트" 및 약물이 비공유결합되는 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 "비공유결합 약물 컨주게이트"를 포함한다. 바람직하게는, 컨주게이트는 충분히 안정하여, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편 및 약물이 생체내 조건하에서(예를 들어, 인간에게 투여된 경우) 서로에 대해 실질적으로 결합된(공유결합 또는 비공유결합) 상태로 유지한다. 바람직하게는, 컨주게이트의 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하,약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하가 생체내 조건하에서 해리되거나 분해되어 약물 및 항원-결합 단편을 방출하거나, 실질적으로 전혀 해리되거나 분해되지 않는다. 예를 들어, "생체내" 조건하에서의 안정성은 약물 컨주게이트 또는 비공유결합 약물 컨주게이트를 37℃에서 혈청(예를 들어, 인간 혈청) 중에서 24시간 동안 인큐베이션함으로써 편리하게 평가될 수 있다. 이러한 방법의 한 가지 예에서, 동일한 양의 약물 컨주게이트 및 컨쥬게이션되지 않은 약물이 두 개의 상이한 혈청 바이알내로 희석된다. 각각의 바이알의 함량의 절반이 -20℃에서 즉시 동결되고, 나머지 절반은 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 그 후, 모든 4개의 샘플은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 SDS-PAGE 및/또는 웨스턴 블롯팅을 이용하여 분석될 수 있다. 웨스턴 블롯은 약물과 결합하는 항체를 사용하여 프로빙될 수 있다. 약물 컨주게이트 레인내의 모든 약물은 해리가 없는 경우 약물 컨주게이트의 크기에서 러닝(running)된다. 다수의 다른 적합한 방법이 "생체내" 조건하에서 안정성을 평가하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과, 이온 교화 및 역상)와 같은 적합한 분석 방법을 이용하여 상기 기술된 바와 같이 제조된 샘플을 분석할 수 있다.
약물 컨주게이트
또 다른 일 측면에서, 본원 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 약물 컨주게이트, 및 상기 항원-결합 단편에 공유 결합되는 약물을 제공하는데, 단, 상기 약물 컨주게이트는 단일의 연속 폴리펩티드 사슬이 아니다.
일부 구체예에서, 약물 컨주게이트는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 상기 VH 또는 VL에 공유 결합되는 약물을 포함하는데, 단, 상기 약물 컨주게이트는 단일의 연속 폴리펩티드 사슬이 아니다. 바람직하게는 약물 컨주게이트는 혈청 알부민과 결합하는 단일 VH 또는 혈청 알부민과 결합하는 단일 VL을 포함한다. 특정 구체예에서, 약물 컨주게이트는 사람 혈청 알부민과 결합하는 VκdAb를 포함하며 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 약물 컨주게이트는 사람 혈청 알부민과 결합하는 VH dAb를 포함하며 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
약물 컨주게이트는 임의의 바람직한 약물을 포함하며, 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 약물은 하나 이상의 위치에 적합한 링커 잔기, 예컨대, 아미노-말단, 카르복실-말단 또는 아미노산 측쇄를 통해서 혈청 알부민과 직접 또는 간접적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편에 결합할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 약물 컨주게이트는 사람 혈청 알부민과 결합하는 dAb 및 폴리펩티드 약물(예를 들어, 사람 IL-lra 또는 사람 IL-lra의 작용성 변이체)을 포함하며, 폴리펩티드 약물(사람 IL-lra 또는 사람 IL-lra의 작용성 변이체)의 아미노-말단은 dAc의 카르복실-말단에 직접적으로 결합하거나 적합한 링커 잔기를 통해서 결합한다. 또 다른 구체 예에서, 약물 컨주게이트는 사람 혈청 알부민과 결합하는 dAb 및 인슐린 분비 약물(예를 들어, GLP-1 또는 GLP-1 유사체)을 포함하며, 인슐린 분비 약물의 아미노-말단은 유리되어 있고(즉, 컨주게이트에서 커플링되지 않거나 결합되지 않음), 카르복실 말단은 dAb의 아미노-말단에 직접적으로 결합되거나 적합한 링커를 통해서 결합된다. 또 다른 구체 예에서, 약물 컨주게이트는 사람 혈청 알부민과 결합하는 dAb 및 dAb에 공유 결합되는 둘 이상의 상이한 약물을 포함한다. 예를 들어, 첫 번째 약물은 dAb의 카르복실 말단에 공유결합(직접적으로 또는 간접적으로)될 수 있으며, 두 번째 약물은 아미노-말단에 공유결합(직접적으로 또는 간접적으로)되거나 측쇄 아미노기(예를 들어, 라이신의 ε 아미노기)를 통해서 결합될 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 인슐린 분비 약물(예를 들어, GLP-1 또는 GLP-1 유사체)의 아미노-말단은 유리되어 있다. 그러한 약물 컨주게이트는 공지된 선택적 커플링 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 참조예[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA(1996)]
혈청 알부민에 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편에 약물을 컨주게이트시키는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 선택되는 특정의 방법은 컨주게이트되는 약물에 좌우될 것이다. 요구되는 경우, 말단 작용기를 함유하는 링커가 항원-결합 단편과 약물을 연결하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 컨주게이션은 반응성 작용기를 함유(또는 반응성 작용기를 함유하도록 변화되는)하는 약물을 링커와 반응시키거나, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편과 직접적으로 반응시킴으로써 수행된다. 공유결합은 적절한 조건하에서 이차 화학기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 화학 잔기 또는 작용기를 함유(또는 함유하도록 변화되는)하는 약물을 반응시킴으로써 형성된다. 요구되는 경우, 적합한 반응성 화학기는 어떠한 적합한 방법을 이용하여 항원-결합 단편 또는 링커에 첨가될 수 있다. 참조예[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA(1996)]. 많은 적합한 반응성 화학기 조합이 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 아미노기는 친전자성기, 예컨대, 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), 및 N-히드록시석신이미딜 에스테르(NHS) 등과 반응할 수 있다. 티올은 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤릴, 피리딜 디설파이드, 및5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등과 반응할 수 있다. 알데히드 작용기는 아미노- 또는 히드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있으며, 아지드기는 삼가 인기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 연결을 형성할 수 있다. 활성화기를 분자내로 도입하는 적합한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다[참조예: Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)].
일부 구체예에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편이 두 개의 티올의 반응에 의해서 약물에 결합되어 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 혈청 알부민에 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편이 이소티오시아네이트기와 일차 아민의 반응에 의해서 약물에 결합되어 이소티오우레아 결합을 생성시킨다.
적합한 링커 잔기는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, C2-C12 알킬렌, -NH-(CH2)p-NH- 또는 -(CH2)p-NH-(여기서, p는 2 내지 12이다), -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH- 및 1개 내지 약 100개(바람직하게는 1 내지 약 12개)의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 사슬 등을 포함한다.
비공유결합 약물 컨주게이트
일부의 비공유 결합(예를 들어, 수소 결합, 판데르 발스 상호작용)이 안정하고 고도로 특이적인 분자간 연결을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상보성 결합 파트너들 사이의 다중 비공유 결합을 통해서 달성되는 분자 인식 상호작용은 많은 중요한 생물학적 상호작용, 예컨대, 기질에 대한 효소의 결합, 항체에 의한 항원의 인식, 수용체에 대한 리간드의 결합, 및 단백질과 펩티드의 삼차원 구조의 안정화에 기초를 두고 있다. 따라서, 그러한 약한 비공유 상호작용(예를 들어, 수소 결합, 반데르 발스 상호작용, 정전기적 상호작용, 및 소수성 상호작용 등)이 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편에 약물을 결합시키는데 이용될 수 있다.
바람직하게는, 항원-결합 단편과 약물을 연결하는 비공유 결합은 항원-결합 단편과 약물이 생체내 조건(예를 들어, 사람에게 투여되는 경우)하에서 서로 실질적으로 결합되어 유지될 수 있게 할 정도로 충분히 강하다. 일반적으로, 항원-결합 단편과 약물을 연결하는 비공유 결합은 약 1010M-1 이상의 세기를 지닌다. 바람직한 구체 예에서, 비공유 결합의 세기는 약 1011M-1 이상, 1012M-1 이상, 1013M-1 이상, 1014M-1 이상, 또는 1015M-1 이상이다. 비오틴과 아비딘 사이의 상호작용 및 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 상호작용은 다양한 조건하에서 아주 효율적이고 안정한 것으로 공지되어 있으며, 본원에 기재된 바와 같이 비오틴과 아비딘 사이의 비공유 결합 또는 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 비공유 결합은 본원 발명의 비공유결합 약물 컨주게이트를 제조하는데 이용될 수 있다.
비공유 결합은 혈청 알부민에 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편과 약물 사이에서 직접적으로 형성하거나, 적합한 상보성 결합 파트너들(예를 들어, 비오틴과 아비딘 또는 스트렙트아비딘) 사이에서 형성될 수 있으며, 상기 파트너들에서 하나의 파트너는 약물에 공유 결합하며 상보성 결합 파트너는 항원-결합 단편에 공유 결합 한다. 상보성 결합 파트너가 이용되는 경우, 결합 파트너 중 하나는 약물에 직접적으로 또는 적합한 링커 잔기를 통해서 공유 결합할 수 있으며, 상보성 결합 파트너는 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편에 직접적으로 또는 적합한 링커 잔기를 통해서 공유 결합할 수 있다.
상보성 결합 파트너는 서로 선택적으로 결합하는 분자의 쌍이다. 많은 상보성 결합 파트너가 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 항체(또는 이의 항원-결합 단편)과 이의 동족 항원 또는 에피토프, 효소와 이의 기질, 및 수용체와 이의 리간드가 있다. 바람직한 상보성 결합 파트너는 비오틴과 아비딘, 및 비오틴과 스트렙트아비딘이다.
혈청 알부민에 결합 특이성을 지니는 항원-결합 단편 또는 약물에 대한 많은 상보성 결합쌍의 직접적 또는 간접적 공유 결합은 상기된 바와 같이, 예를 들어, 링커를 사용하거나 사용하지 않으면서 반응성 작용기를 함유(또는 반응성 작용기를 함유하도록 변화되는)하는 상보성 결합 파트너를 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편과 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 선택되는 특정의 방법은 컨주게이트되는 화합물(예를 들어, 약물, 상보성 결합 파트너, 혈청 알부민과 결합하는 항체의 항원-결합 단편)에 좌우될 것이다. 요구되는 경우, 말단 반응성 작용기를 함유하는 링커(예를 들어, 호모이작용성 링커, 헤테로이작용성 링커)가 항원-결합 단편 및/또는 약물을 상보성 결합 파트너에 연결하는데 사용될 수 있다. 한 가지 구체 예에서, 두 개의 구별되는 반응성 잔기를 함유하는 헤테로이작용성 링커가 사용될 수 있다. 헤테로이작용성 링커는 반응성 잔기중 하나가 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 지니는 항체의 항원-결합 단편 또는 약물과 반응하며 다른 반응성 잔기가 상보성 결합 파트너와 반응하도록 선택될 수 있다. 어떠한 적합한 링커(예를 들어, 헤테로이작용성 링커)가 사용될 수 있으며, 많은 그러한 링커가 본 기술 분야에서 공지되어 있고 시판 공급원(예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., IL)으로부터 입수될 수 있다.
조성물 및 치료 및 진단 방법
약제학적 조성물 또는 생리학적 조성물(예를 들어, 사람 및/또는 가축 투여용)을 포함한 본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함하는 조성물이 제공된다. 약제학적 또는 생리학적 조성물은 하나 이상의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)과 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 전형적으로는 이들 담체는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 및 염수 및/또는 완충된 매질을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화된 링거액을 포함한다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액중에 유지시키기 위해서, 필요한 경우에, 적합한 생리학적으로 허용되는 보조제가 증점제, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다. 정맥용 비히클은 액제 및 영양 보충제 및 전해질 보충제, 예컨대, 링거 덱스트로스를 기재로 하는 것들을 포함한다. 보존제 및 그 밖의 첨가제, 예컨대, 항생제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성가스가 존재할 수 있다[Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition].
조성물은 요구된 양의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 5 중량% 내지 약 99 중량%의 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체를 포함할 수 있다. 특정의 구체 예에서, 조성물은 약 10중량% 내지 약 99중량%, 또는 약 20중량% 내지 약 99중량%, 약 30중량% 내지 약 99중량%, 약 40중량% 내지 약 99중량%, 약 50중량% 내지 약 99중량%, 약 60중량% 내지 약 99중량%, 약 70중량% 내지 약 99중량%, 약 80중량% 내지 약 99중량%, 약 90중량% 내지 약 99중량%, 또는 약 95중량% 내지 약 99중량%의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함할 수 있다. 한 가지 예에서, 조성물은 동결 건조(냉동건조)된다.
약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)는 전형적으로는 염증성 상태(예를 들어, 급성 및/또는 만성 염증성 질환), 예컨대, 만성 폐쇄성 폐 질환(예를 들어, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 폐공기종), 알레르기성 과민성, 암, 세균성 또는 바이러스성 감염증, 폐렴, 예컨대, 박테리아성 폐렴(예를 들어, 스타필로코쿠스성 폐렴)), 자가면역질환(이로 한정되는 것은 아니지만, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 관절염(예를 들어, 골관절염, 류머티스 관절염, 소아 류머티스 관절염, 건선 관절염, 루푸스 관절염, 척추관절증(예를 들어, 강직 척추염)을 포함), 전신홍반루프스, 염증성 장 질환(예를 들어, 크론 질환, 궤양성 결장염), 벤체트병 및 중증 근육 무력증), 장궁내막증, 건선, 복부 유착(예를 들어, 복부 수술후 유착), 천식 및 패혈쇼크를 예방하거나, 억제하거나, 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 통증, 예컨대, 만성 또는 급성 외상성 통증, 만성 또는 급성 신경병성 통증, 급성 또는 만성 근스캐폴드 통증, 및 만성 또는 급성 암 통증 등을 예방하거나, 억제하거나, 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 또한 진단 목적으로 투여될 수 있다.
본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합된 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 또한 폐 염증, 만성 폐쇄성 기관지 질환(예를 들어, 만성 기과지염, 만성 패쇄성 기관지염, 폐기종), 천식(예를 들어, 스테로이드 내성 천식), 폐렴(예를 들어, 포도상구균성 폐렴(Staphylococcal pneumonia)와 같은 박테리아성 폐렴), 과민성 폐렴, 호산구 증가성 폐침윤(pulmonary infiltrate with eosinophilia), 환경성 폐질환, 폐렴, 기관지확장증, 낭포성 섬유증, 간질성 폐질환, 원발성고혈압, 폐동맥색전증, 늑막의 질환, 격막의 질환, 횡격막의 질환, 저도호흡증, 과도호흡증, 수면 무호흡, 급성호흡곤란증후군, 중피종, 육종, 이식편거부, 이식편대숙주병, 폐암, 알레르기성 비염, 알레르기, 석면 침착증, 진균종, 아스페르길루스증, 기관지확장증, 만성기관지염, 폐기종, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 침습적 폐렴쌍구균성 질병(invasive pneumococcal disease EPD), 인플루엔자, 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria), 흉막 삼출, 진폐증, 뉴모사이토시스병(pneumocytosis), 폐렴, 폐방선균증, 폐단백증, 폐탄저, 폐부종, 폐색전, 폐염증, 폐 대식세포괴사(pulmonary histiocytosis) X (호산구성 육아종(eosinophilic granuloma)), 폐 고혈압, 폐 노카르디아증(pulmonary nocardiosis), 폐결핵(pulmonary tuberculosis), 폐 정맥-패쇄성 질환(pulmonary veno-occlusive disease), 류머토이드 폐질환(rheumatoid lung disease), 유육종증(sarcoidosis), 베게너 육아육종(Wegener's granulomatosis), 및 비-소세포 폐암의 예방, 억제 또는 치료에 사용하기 적합하다.
본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 또한 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스 기인성 호흡기 질환(RSV-associated respiratory disease) 및 바이러스성 폐(호흡기) 질환을 예방, 억제 또는 치료에 사용하기 적합하다.
본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 골관절염 또는 염증성 관절염을 예방, 억제 또는 치료에 사용하기 적합하다. "염증성 관절염"은 면역 시스템이 관절에서 염증을 일으키거나 악화시킴으로서 발생하는 관절의 염증성 질환을 의미하며, 이러한 질환으로써는 류머티즘성 관절염, 소아류머티스관절염, 및 척추염이 포함되며, 예컨대, 강직성 척추염, 반응성 관절염, 리이터 증후군(Reiter's syndrome), 건선 관절염, 건선성 척추염(psoriatic spondylitis), 장질환성 관절염, 장질환성 척추염, 연소기형 척추관절증(juvenile-onset spondyloarthropathy) 및 미분화 척추관절증을 그 예로 들 수 있다. 염증성 관절염은 일반적으로 백혈구에 의한 활막조직(synovial tissue) 및/또는 관절활액의 침윤이 그 특징으로 나타난다.
본원에 기재된 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 사용하여 예방, 억제 또는 치료할 수 있는 암은 림프종(예를 들어, B 세포 림프종, 급성 골수 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 폐암(예를 들어, 소세포폐암, 비소세포폐암), 대장결장암, 두경부암, 췌장암, 간암, 위암, 유방암, 난소암, 방광암, 백혈병(예를 들어, 급성골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병), 샘암종, 신장암, 조혈암(예를 들어, 골수형성이상증후군, 및 골수증식질환(예를 들어, 진성적혈구증가증, 본태성(또는 원발성) 고혈소판증, 특발성 골수섬유증) 등을 포함한다.
본원에 기재된 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 자궁내막증, 섬유증, 불임증, 조숙산통, 발기부전, 골다공증, 당뇨병(예를 들어, 타입 II 당뇨병), 성장장애, HIV 감염증, 호흡곤란증후군, 종양 및 야뇨증을 예방, 억제 또는 치료용으로 적합하다.
본원에서, 용어 "예방"은 질환의 유도 전에 보호 조성물의 투여를 포함한다. "억제"는 질환의 발병 후에 그러나 질환의 임상적 발생 전에 조성물을 투여함을 의미한다. "치료"는 질환 증상이 명백하게 된 후에 보호 조성물을 투여함을 포함한다.
질병을 예방하거나 질환을 치료하는데 있어서, 약물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 효과를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용될 수 있다. 민감한 생쥐(mouse)에서 전신 홍반성 낭창(SLE)의 시험을 하기 위한 방법은 본 기술 분야에서 공지되어 있다[Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515]. 중증근무력증(MG)을 SJL/J 자성 생쥐에서 다른 종으로부터의 AchR 단백질로 질환을 유도함으로써 시험한다[Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233]. 민감한 생쥐 종에 타입 II 콜라겐을 주사함으로써 관절염이 유도된다[Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233]. 민감한 래트에 미코박테리움 열 쇼크 단백질을 주사함으로써 유도되는 애주번트 관절염(adjuvant arthritis) 모델이 개시되어 있다[Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171]. 골관절염을 치료하는 효과는 콜라게나제의 관절내 주사에 의해서 관절염이 유도되는 뮤린 모델에서 검증될 수 있다[Blom, A.B. et al., Osteoarthritis Cartilage 12:627-635 (2004)]. 갑상선염은 마론 등의 논문[Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115]에 개시된 바와 같이 티로글로불린을 투여함으로써 생쥐에서 유도된다. 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)은 자연적으로 발생하거나 특정의 생쥐 종, 예컨대, 카나사와 등의 논문[Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113]에 개시된 종에서 유도될 수 있다. 생쥐 및 래트중의 EAE는 사람 MS에 대한 모델로서 활용된다. 이러한 모델에서, 말이집탈락병은 미엘린 염기성 단백질의 투여에 의해서 유도된다[참조: Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al, eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et. al. (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al. (1987) J Immunol, 138: 179].
본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 별도의 투여 조성물로서 또는 그 밖의 작용제와 함께 사용될 수 있다. 이들 약물은 다양한 면역 치료 약물, 예컨대, 실코스포린(cylcosporine), 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin) 또는 시스플라티눔(cisplatinum), 및 면역독소 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원 발명의 약물 조성물{예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)이 폐 염증 또는 호흡기 질환의 예방, 억제 또는 치료를 위해 투여될 때, 상기 약물 조성물은 포스포다이에스터라제 차단제[예를 들어, 포스포다이에스터라제(phosphodiesterase) 4의 차단제(inhibitors)], 기관지확장제[예를 들어, 베타2-아고니스트, 항콜린제(anticholinergerics), 테오필린(theophylline), 단기간-작용성 베타-촉진제(agonist)(예를 들어, 알부테롤, 살부타몰, 밤부테롤, 레노테롤, 이소에터린, 이소프로터레놀, 레발부테롤, 메타프로터레놀, 피르부테롤, 테르부탈린 및 토른레이트), 장기-작용성 베타-촉진제(예를 들어, 포르모테롤 및 살메테롤), 단기 작용성 항콜린제(예를 들어, 이프라트로피움 브로마이드 및 옥시트로피움 ㅂ브로마이드), 장기-작용성 항콜린제(예를 들어, 티오트로피움), 테오피린(예를 들어, 단기 작용성 제형, 장기 작용성 제형), 흡입용 스테로이드제(예를 들어, 베클로에타손, 베클로메타손, 부데소나이드, 플루니솔라이드, 플루티카손 프로피오네이트 및 트리암시놀론), 경구 스테로이드[예를 들어, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니솔론(prednisolon) 및 프레드니손], 항콜린제와 조합된 단기-작용성 베타-촉진제(예를 들어, 알부테롤/살부타몰/이프라토피움, 및 ㅍ페펜페노테롤/이프라토피움), 흡입용 스테로이드제와 조합된 장기-작용성 베타-촉진제(예를 들어, 살메테롤/피우티카손, 및 포르모테롤/부데소나이드) 및 점액용해제(mucolytic agents)(예를 들어, 에르도스테인, 아세틸시스테인, 브롬헥신, 카르보시스테인, 구이아페네신 및 요오드화 글리세롤)과 함께 투여될 수 있다.
예를 들어, 본원발명의 약물 조성물(예컨대, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)이 관절염(예를 들어, 염증성 관절염(예컨대, 류머티즘성관절염))의 예방, 억제 또는 치료를 위해 투여될 때, 상기 약물 조성물은 질병 개선용 항-류머티즘 제제(disease modifying anti-rheumatic agents)[예를 들어, 메토트렉세이트, 히드로시클로로퀸, 설파살라진, 레플루노마이드, 아자티오프린, D-페니실라민, 금(경구용 또는 근육주사용), 미노시클린, 시클로스포린, 포도상구균 단백질(staphylococcal 단백질) A], 비스테로이드성 항-염증 제제(예를 들어, 로페콕시브와 같은 COX-2 선택성 NSAID), 살리실레이트, 글루코코리코이드(예를 들어, 프레디손) 및 진통제(analgesics)과 함께 투여될 수 있다.
약제 조성물은 본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)와 함께 다양한 세포 독성 또는 그 밖의 작용제의 "칵테일", 또는 상이한 약물을 포함하는 본원 발명에 따른 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 조합물을 포함할 수 있다.
약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 임의의 적합한 기술을 이용하여 임의의 개인 또는 대상에게 투여될 수 있다. 다양한 투여 경로가 가능한데, 약물 조성물 및 치료되는 질환 또는 병태에 따라서, 예를 들어, 경구, 식품, 국소, 경피, 직장, 비경구(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 피부내, 복강내, 경막내, 관절내 주입), 및 흡입(예를 들어, 기관지내, 비강내 또는 경구 흡입, 비강내 점적) 투여 경로를 포함한 경로가 가능하다. 투여는 상기된 바와 같이 국소 또는 전신일 수 있다. 바람직한 투여 방식은 선택된 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체), 및 치료되는 병태(예를 들어, 질환)에 따라 다양할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 그 밖의 동시투여 약물, 임상의에 의해서 고려되어야 할 반대처방 및 그 밖의 변수에 좌우될 것이다. 치료학적 유효량의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)이 투여된다. 치료학적 유효량은 투여 조건하에서 요구된 치료효과를 달성하기에 충분한 양이다.
용어 "피검체" 또는 "개체"는 본원에서 영장류(예를 들어, 사람), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 래트, 생쥐, 또는 기타 소과, 양과, 말과, 개과, 고양이과, 설치류 또는 쥐과 종을 포함하나 이들에 제한되지 않는 포유동물과 같은 동물을 포함하도록 정의된다.
약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 콘쥬게이트, 약물 융합체)은 천연 화합물 또는 염으로서 투여될 수 있다. 아민 또는 기타 염기성 기를 함유하는 화합물의 염(예를 들어, 약물 조성물, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 예를 들어, 적합한 유기 또는 무기 산(예컨대 염산, 브롬화수소, 아세트산, 과염소산 등)과 반응시킴으로써 수득될 수 있다. 4차 암모늄 기를 갖는 화합물은 또한 반대 이온, 예컨대 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 퍼클로레이트 등을 함유한다. 카르복실산 또는 기타 산성 작용기를 함유하는 화합물의 염은 적합한 염기, 예를 들어 히드록사이드 염기와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 산성 작용기의 염은 나트륨, 칼륨 등과 같은 반대이온을 함유한다.
본원 발명은 또한, 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체), 약물 전달 장치, 및 선별적으로는 이의 사용을 위한 지시를 포함하며, 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 피검체(예를 들어, 환자)에게 투여하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 예컨대, 동결 건조된 제형과 같은 제형으로서 제공될 수 있다. 특정 구체예에서, 약물 전달 장치는 주사기, 흡입기, 비내 또는 안구 투여 장치(예를 들어, 연무 발생기(mister), 또는 눈 또는 코 점적기), 및 무침 주사 장치로 구성되는 군으로부터 선별된다.
본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적합한 캐리어 중에서 재구성될 수 있다. 임의의 적합한 동결건조 방법(예를 들어, 분무 건조, 케이크 건조) 및/또는 재구성 기술이 적용될 수 있다. 동결건조 및 재구성에 의해 다양한 정도의 항체 활성 손실(예를 들어, 통상적인 면역글로불린을 사용하는 경우, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 높은 활성 손실도를 갖는 경향이 있다)이 야기될 수 있으며, 사용 수준은 보상을 위해 조절될 수 있다. 특정의 일 구체예에서, 본원 발명은 본원에 기술된 바와 같은 동결건조된 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 동결건조된 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)은 재수화되는 경우 약 20% 이하, 또는 약 25% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 45% 이하, 또는 약 50% 이하의 이의 활성(예를 들어, 혈청 알부민에 대한 결합 활성)을 상실한다. 활성은 약물 조성물이 동결건조되기 전에 약물 조성물의 효과를 나타내는 데 필요한 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 양이다. 예를 들어, 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체의 양은 목적하는 기간 동안 목적하는 혈청 농도를 달성하고 유지하는 데 요구되었다. 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)의 활성은 동결 건조 전에 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 활성은 상실된 활성의 양을 결정하기 위해 재수화시킨 후에 동일한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
약물 조성물(예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 특정의 치료적 응용에서, 투여 조건 하에서 목적하는 치료적 또는 예방적 효과, 예컨대 선별된 세포 집단의 적어도 부분적인 억제, 억제, 조절, 치사 또는 일부 그 밖의 측정가능한 파라미터를 달성하기에 충분한 양은 "치료적 유효량 또는 용량"으로 정의된다. 이러한 용량을 달성하는 데 필요한 양은 질환의 중증도, 및 환자 자신의 면역 체계의 일반적인 상태 및 일반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이지만, 일반적으로 약 10 ㎍/kg 내지 약 80 mg/kg, 또는 체중 킬로그램 당 약 0.005 내지 5.0 mg의 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체의 범위 내이며, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량의 용량이 보다 일반적으로 사용된다. 예를 들어, 본원 발명의 약물 조성물(예를 들어, 약물 융합체, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트)은 매일(예를 들어, 일 당 4회 이하의 투여로), 이틀 간격으로, 3일 간격으로, 1주일에 두번, 1주일에 한번, 2주일에 한번, 한달에 한번, 또는 두달에 한번의 회수로, 예를 들어 약 10 ㎍/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 100 ㎍/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 예방적 응용을 위해, 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 상기와 유사하거나 약간 더 적은 용량으로 투여될 수 있다. 본원 발명에 따른 약물 조성물 (예를 들어, 약물 컨주게이트, 비공유결합 약물 컨주게이트, 약물 융합체)을 함유하는 조성물은 포유동물에서 선별된 표적 세포 집단의 변경, 불활성화, 치사 또는 제거를 보조하기 위해 예방적 및 치료적 셋팅으로 사용될 수 있다.
인터루킨 1 수용체 길항제 (IL1-ra)는 인터루킨-1 유형의 1 수용체 (IL-1R1)에 결합하는 IL-1을 경쟁적으로 억제함으로써 IL-1의 생물학적 활성을 차단하는 길항제이다. IL-1의 생성은 염증성 자극에 따라 유도되며, 이는 염증 및 면역 반응을 포함하는 다양한 생리학적 반응을 매개한다. IL-1은 연골 퇴행 및 뼈 흡수의 자극을 포함하는 소정 범위의 활성을 갖는다. 류마티스 관절염의 환자에서, 국소적으로 생성된 IL-1의 양은 증가되며 천연적으로 생성되는 IL1-ra의 수준은 비정상적으로 증가된 상기 IL-1의 양에 필적하기에는 불충분하다. 메토트렉세이트와 같은 항류마티스 약물(disease modifying antirheumatic drugs, DMARD) 및 KINERET®(아나킨라, Amgen)과 같은 생물제제를 포함하는 RA에 대해 이용가능한 다수의 치료제가 존재한다.
KINERET® (아나킨라, Amgen)는 재조합되고 비글리코실화된 형태의 사람 인 터루킨-1 수용체 길항제로서, 이는 153개의 아미노산으로 구성되며 17.3 킬로달톤의 분자량을 지닌다. (KINERET® (아나킨라, Amgen)의 아미노산 서열은 천연 IL-1ra에서 152개의 아미노산 및 추가적인 N-말단 메티오닌에 상응한다). KINERET® (아나킨라, Amgen)은, 하나 이상의 DMARD에 약효를 나타내지 않는 18세 이상의 환자에게서 보통 내지 중증의 류마티스 관절염의 징후 및 증상에서 감소를 나타낸다. 용량은 하루당 1회 사용 및 피하 주사로 100 mg의 약물로 사용된다. Tβ1/2는 4 내지 6시간이며, 환자의 71%에서 14 내지 28일 내에 주사 부위 반응이 일어난다.
본원에서 발명자들은 치료적 폴리펩티드를 혈청-알부민 결합 dAb에 연결시켜, 결과적으로 (i) 치료적 폴리펩티드 단독으로 사용한 경우와 유사한 활성을 가지며, (ii) 또한 혈청 알부민에도 결합하는 화합물이 생성됨을 입증하고 있다. 또한, 본원 발명은 긴 혈청 반감기를 지닌 치료적 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원 발명자들은 혈청 알부민 결합 dAb을 IL1-ra에 연결시켜 IL1-ra를 단독으로 사용한 경우보다 더 긴 혈청 반감기를 지닌 화합물을 획득하였다.
실시예 1. 생쥐, 래트 및 사람 혈청 알부민을 결합시키는 도메인 항체의 선별
본 실시예는 혈청 알부민에 대해 유도된 단일 도메인 항체(dAb)를 제조하는 방법을 설명한다. 생쥐 혈청 알부민(MSA), 사람 혈청 알부민(HSA) 및 래트 혈청 알부민(RSA)에 대한 dAb의 선별이 설명된다.
생쥐 혈청 알부민에 대한 dAb를 WO 2004/003019 A2호에 기술된 바와 같이 선별하였다. 3개의 사람 파아지 디스플레이 항체 라이브러리를 사용하였다. 각각의 라이브러리는 상보적 결정 구역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 내에 혼입된 NNK 코돈에 의해 엔코딩된 측쇄 다양성(Diversity)를 지닌 VH(V3-23/DP47 및 JH4b) 또는 V ㅏ (o12/o2/DPK9 및 JK1)에 대한 단일의 사람 프레임 워크를 토대로 하였다.
라이브러리 1 (VH):
위치에서의 다양성(Diversity): H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98.
라이브러리 크기: 6.2 ×109
라이브러리 2 (VH):
위치에서의 다양성: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100A, H100B.
라이브러리 크기: 4.3 ×109
라이브러리 3 (Vκ):
위치에서의 다양성(Diversity): L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96.
라이브러리 크기: 2 ×109
상기한 VH 및 Vκ라이브러리는 각각 제네릭 리간드 단백질 A 및 단백질 L에 대한 결합을 위해 사전 선별되었으며, 그래서 선별된 라이브러리 내의 대다수의 클론은 기능적이었다. 상기 개시된 라이브러리들의 크기는 사전선별(preselection) 후의 크기와 일치한다.
각각의 라이브러리를 개별적으로 사용하여 혈청 알부민에 대한 2회의 선별을 수행하였다. 각각의 선별에 있어서, 항원을 100 ㎍/ml의 농도에서 4 ml의 PBS 중의 면역튜브(nunc) 상에서 코팅시켰다. 제 1차 선별에서, 세개의 라이브러리 각각을 HSA(Sigma) 또는 MSA(Sigma)에 대해 개별적으로 패닝(panning)하였다. 제 2차 선별에서, 상기 제 1회차에 선별된 6개 각각으로부터 얻은 파아지를 (i) 동일한 항원(예를 들어, 1회째의 MSA, 2회째의 MSA)에 대해 다시 그리고 (ii) 동등한 항원(reciprocal antigen)(예를 들어, 제 1회차의 MSA, 2회차의 MSA)에 대해 패닝하여, 총 12개의 선별체를 얻었다. 각각의 경우에 있어서, 상기 제 2차 선별후 48개의 클론을 HSA 및 MSA로의 결합을 위해 검정하였다. 해리슨과 동료 저자들의 논문(참조: Harrison et al., Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109)에서 scFv 단편에 대해 설명된 바에 따라 가용성 dAb 단편을 제조하였으며, 2% 트윈 PBS를 차단용 완충액으로 사용하고 결합된 dAb를 단백질 L-HRP(Sigma)(Vκs에 대해) 그리고 단백질 A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(VHs에 대해)을 사용하여 검출하는 것을 제외하고는 표준 ELISA 프로토콜을 준수하였다(참조: Hoogenboom et al., (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133).
MSA, HSA 또는 이둘 모두에 결합 친화성을 나타내는 상기한 단일의 배경을 제공하는 dAb를 플라스틱에만 단독으로 결합시키기 위해 ELISA 불용성 형태로 시험하였으나, 상기 모두 혈청 알부민에 대해 특이적이었다. 그런 다음, 클론을 시퀀싱(표 1)하여, 21개의 독특한 dAb 서열이 동정되었음을 확인하였다. 선별된 VκdAb 클론 사이에서의 최소 유사도(아미노산 수준에서)는 86.25% ((69/80) X 100; 분기된 모든 잔기가 상이한 경우의 결과, 예를 들어 클론 24와 34)이었다. 선별된 VH dAb 클론 사이에서의 최소 유사도(similarity)는 94%((127/136) X 100))이었다.
다음으로, 혈청 알부민 결합 dAb들이 용액으로부터 비오티닐화된 항원을 포획하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. ELISA 플레이트를 1 ㎍/ml 단백질 L (V κ 클론에 대해) 및 1 ㎍/ml 단백질 A (VH 클론에 대해)로 코팅시키는 것을 제외하고는 ELISA 프로토콜(상기함)을 준수하였다. 가용성 dAb를 상기 프로토콜에서와 같이 용액으로부터 포획하고, 비오티닐화된 MSA 또는 HSA 및 스트렙트아비딘 HRP를 사용하여 검출을 수행하였다. 혈청 알부민 분자 당 평균 2개의 비오틴을 얻기 위해, 비오티닐화된 MSA 및 HSA를 제조업자의 지시에 따라 제조하였다. 용액으로부터 비오티닐화된 MSA를 포획한 24개의 클론을 ELISA로 동정하였다. 이들 중 2개 (하기한 클론 2 및 38)는 또한 비오티닐화된 HSA를 포획하였다. 다음으로, dAb가 CM5 바이아코어 칩 상에 코팅된 MSA에 결합하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 8개의 클론이, 바이아코어 상의 MSA에 결합하는 것을 확인하였다.
사람 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 대한 dAb를 프로토콜에 대한 하기 변형사항을 제외하고는 항-MSA dAb에 대해 이전에 설명된 바와 같이 선별하였다: 합성 VH 도메인의 파아지 라이브러리는 라이브러리 4G이었으며, 이것은 DP47 생식세포 유전자 및 JH7 단편을 포함하는 사람 VH3에 기초한 것이다. 하기한 특정 위치에서의 다양성(Diversity)은 돌연변이유발방법에 의해 CDR1의 30, 31, 33, 35; CDR2의 50, 52, 52a, 53, 55, 56; CDR3의 4 내지 12 분기된 잔기, 예를 들어, 4GH11 내의 H95, H96, H97 및 H98, 및 4G H19 내의 H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b, H100c, H100d, H100e 및 H100f에 도입되었다(NNK 코돈을 사용하여; Kabat에 따른 넘버링). 가장 마지막의 3개의 CDR3 잔기는 FDY이어서, CDR3의 길이는 7 내지 15개의 잔기로 달라진다. 라이브러리는 1 ×1010개를 초과하는 개별 클론을 포함한다.
VH 및 V κ 라이브러리의 서브셋을 각각 제네릭 리간드 단백질 A 및 단백질 L에 대한 결합을 위해 사전 선별하였으며, 그래서 사전 선별된 라이브러리 내의 클론의 대부분이 기능적이있다. 상기 개시된 라이브러리의 크기는 사전 선별후의 크기와 일치한다.
VH 및 Vκ라이브러리의 서브셋을 개별적으로 사용하여 래트 및 사람 혈청 알부민에 대한 2회의 선별을 수행하였다. 각각의 선별의 경우에 있어서, 항원을 (i) 100 ㎍/ml의 농도에서 4 ml의 PBS 중의 면역튜브(nunc) 상에 코팅시키거나, (ii) 상기 항원를 비오티닐화시킨 다음 가용성 선별을 위해 사용한 후에, 스트렙타비딘 비드(제 1차 선별에서) 및 뉴트라비딘 비드(제 2차 선별에서) 상에서 포획시켰다(각각의 클론을 분리시키는 데 사용된 선별 방법의 상세사항에 대해서는 표 1을 참조하기 바란다). 각각의 경우에서, 제 2차 선별 후에, 24개의 파아지 클론을 HSA 또는 MSA에 대한 결합을 위해 시험하였다.
어느 하나의 선별에서 파아지 ELISA시 현저한 비율의 클론이 양성으로 나타나는 경우, 이들 선별으로부터 획득한 DNA를 가용성 dAb를 생성하기 위한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 개별 콜로니를 수집하였다. 가용성 dAb 단편을,해리슨 및 그 동료 저자들의 논문(참조: Harrison et al.: Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109))에서 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 제조하였고, 2% 트윈 PBS를 차단용 완충액으로 사용하고 결합된 dAb를 항-myc-HRP를 사용하여 검출하는 것을 제외하고는, 표준 ELISA 프로토콜을 준수하였다(참조: Hoogenboom et al., (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133). 그런 다음, 바이아코어 표면 플라스몬 공명 장치(Biacore AB)를 사용하여 ELISA에서 양성을 나타내는 클론의 MSA, RSA 또는 HSA에 대한 결합여부를 스크리닝하였다. MSA, RSA 또는 HSA에 결합된 dAb를 추가로 분석하였다. 이후, 클론을 시퀀싱하고, 특이 dAb 서열을 동정하였다.
Figure 112007048377730-PCT00005
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Figure 112007048377730-PCT00006
그런 다음, BIACORE 칩(Biacore AB) 상에서 혈청 알부민에 결합된 dAb를 추가로 분석하여 친화도에 대한 정보를 얻었다. 상기 분석은 혈청 알부민으로 코팅된 CM5 칩 (카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스)을 사용하여 수행되었다. 유동 세포(Flow Cell) 1은 코팅되지 않고 차단된 음성 대조군이며, 유동 세포 2는 HSA로 코팅되었고, 유동 세포 3은 RSA로 코팅되었고, 유동 세포 4는 MSA로 코팅되었다. 코팅된 물질에 대해 500 공명 단위 (RU)로 맞춰지도록 프로그래밍된 바이아코어 코팅 마법사를 사용하여 pH 5.5의 아세테이트 완충액 중에서 혈청 알부민을 고정시켰다. 관심있는 각각의 dAb를, 200 mL 내지 500 mL 규모 상에서의 대장균의 원형질막공간 내에서 발현시켰으며, 이를 VHs에 대해서는 단백질 A-스트림라인 친화도 수지(Amersham, UK)에 대한 흡착 배치(batch), 및 Vκs에 대해서는 단백질 L-아가로오스 친화도 수지(Affitech, Norwary)에 대한 흡착 배치를 이용하여 상등액으로부터 정제한 다음, pH 2.2에서 글리신으로 용리시키고 완충액을 PBS로 교체하였다. BIACORE HBS-EP 완충액으로의 희석에 의해일정 농도 범위의 dAb를 제조하였으며, 이를 BIOCORE 칩 전역에 걸쳐 흘려주었다.
친화도(KD)를 KD 구역에서의 dAb의 농도에 의해 형성된 자취에 대해 온-속도 및 오프-속도 곡선을 피팅(Fitting)함으로써 BIACORE 자취로부터 계산하였다. 혈청 알부민에 대한 상이한 친화도 범위를 갖는 dAb가 동정되었다. HSA에 대한 DOM7h-8, HSA에 대한 DOM7h-2, 및 RSA에 대한 DOM7r-1의 친화도가 10 내지 100 nM의 범위 내에 포함되는 것으로 나타났다. 100 nM 내지 500 nM의 범위 내에는 HSA에 대한 DOM7h-7, RSA에 대한 DOM7h-8, 및 HSA에 대한 DOM7h-26이 포함되었다. 500 nM 내지 5 μM의 범위 내에는 HSA에 대한 DOM7h-23 및 HSA에 대한 DOM7h-1이 포함되었다. 실시예의 자취는 도 6a 내지 6c에 포함되어 있다.
실시예 2. IL -1 수용체 길항제( IL -1 ra )를 함유한 융합체로서 항-혈청 알부민 항체의 제조
본 실시예는 혈청 알부민에 결합하는 dAb 및 IL-1ra를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법을 설명한다. 2개의 융합체를 제조하였으며, 하나는 IL-1ra의 N-말단에 결합된 dAb(MSA16IL1-ra)을 가지고, 나머지 하나는 IL-1ra의 C-말단에 결합된 dAb(IL1-raMSA 16)을 가진다. 융합체의 서열 및 벡터가 도 2c 및 2d에 도시되어 있다. MSA에 결합하지 않는 대조군 융합체를 또한 제조하였으며, 이의 서열은 도 2e에 도시되어 있다.
KINERET(아나킨라, Amgen)은 4 내지 6시간의 짧은 반감기를 가지며, 일일 주사를 위해 권장된 투약 섭생이 요구된다. 이 투약 섭생에 의해 14 내지 28일 내에 71%의 경우에서 주사 부위 반응이 일어난다. 따라서, 더 긴 혈청 반감기를 갖는 사람 IL-1ra의 형태는 유리할 것이며, 투여 약제의 효능을 증가시키고 투여 빈도를 감소시킬 수 있었다. 이들은 모두 약제에 대해 요망되는 특성들이다.
클로닝
간단하게, 2개의 다중 클로닝 부위(MCS)를 하기 상술된 바와 같이 설계하고, 이를 T7 프로모터를 가진 발현 벡터 내로 삽입시켰다. IL1-ra, dAb, GAS 리더 및 링커의 삽입을 위해 제한효소 부위를 설계하였다. 하나(MCS 1+3)는 IL-1ra의 N-말단에 결합된 dAb를 포함하는 단백질을 엔코딩하고, 나머지 하나(MCS 2+4)는 IL-1ra의 C-말단에 결합된 dAb를 포함하는 단백질을 엔코딩하였다.
dAbIL1-ra 융합체에 대한 클로닝 부위 1+3
NdeI, 스터퍼(stuffer), SalI, NotI, 스터퍼, XhoI, BamHI
Figure 112007048377730-PCT00007
IL1-ra dAb 융합체에 대한 클로닝 부위 2+4
NdeI, 스터퍼, StUI, SacI, 스터퍼, SalI, NotI, TAA TAA BamHI
Figure 112007048377730-PCT00008
그런 다음, 적합한 제한 효소를 사용하여 상기 MCS를 절단하고 리더를 코딩하는 어닐링된 프라이머를 라이게이팅시킴으로써 GAS 리더를 각각의 벡터에 삽입하였다. 다음으로, 링커를 코딩하는 링커 DNA를 유사한 방식으로 삽입하였다. IL-1ra을 코딩하는 DNA를, cDNA 클론으로부터 PCR(요망되는 제한 부위를 추가하기 위해 설계된 프라이머를 사용하여)에 의해 얻고, 이것을 TOPO 클로닝 벡터 내로 삽입하였다. 핵산 시퀀싱에 의해 정확한 서열을 확인한 후에, IL-1ra를 코딩하는 DNA를 TOPO 벡터로부터 잘라내고, 이를 리더 및 링커를 함유하는 벡터 내로 결합시켰다. 마지막으로, dAb를 코딩하는 DNA를 dAb 발현 벡터로부터 잘라내고, 삽입물(겔 정제에 의해 정제됨) 및 벡터에 대한 SalI/NotI 절단으로 상기 벡터들 내로 삽입시켰다.
발현 및 정제
MSA 16IL 1-ra, IL 1-ra MSA 16 및 더미IL-1ra를 대장균의 원형질막공간 내에서 발현시키고, 이것을 단백질 L-아가로오스 친화도 수지(Affitech, Norway)에 대한 흡착 배치를 사용하여 상등액으로부터 정제한 다음, pH 2.2에서 글리신으로 용리시켰다. 이후, 정제된 dAb를 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 분석한 다음 쿠마시 염색(coomassie staining)을 실시하였다. 단백질 중 하나 (IL-1raMSA 16)의 경우, 90%를 초과하는 단백질이 예상된 크기를 지니고 있었고, 이에 따라 추가적인 정제없이 활성을 분석하였다. 다른 단백질(MSA 16IL1-ra 및 더미 IL-1ra)은 더욱 작은 밴드에 의해 오염되었고, 이에 따라 pH 9에서 RESOURSEQ 이온 교환 컬럼 상에서 FPLC 이온 교환 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 단백질을 선형 염 구배 형태의 0 내지 500 mM NaCl을 사용하여 용리시켰다. SDA-PAGE 겔 전기영동에 의해 분석한 후에, 예상 크기의 단백질을 함유하는 분획을 합쳐서, 90%를 초과하는 순도의 통합 분획을 얻었다. 추가 분석에 이 단백질을 사용하였다.
실시예 3. 시험관 내 MRC -5 IL -8 검정에서 dAb IL1 - ra 의 활성 측정
MRC-5 세포(ATCC 기탁 번호 CCL-171; American Type Culture Collection, Manassas, VA) 내에서 IL-1에 의한 IL-8 분비 유도를 중화시키는 MSA16IL-1ra 융합체의 활성을 시험하였다. 이 방법은 아케손 및 그의 동료 저자들의 논문 (Akeson, L et al (1996), Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523)에 기재된 것을 채택하였으며, 상기 논문에서는 HUVEC 내의 IL-1에 의해 IL-8의 유도에 대해 설명하고 있으며, 본원에서는 상기 HUVEC 세포주 대신 MRC-5 세포를 사용하였다. 간단히 요약하면, 미세 역가판에 플레이팅된 MRC-5 세포를 dAbIL-1ra 융합체 단백질 또는 IL-1ra 대조군, 및 IL-1 (100 pg/ml)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 세포들로부터 상등액을 수득하여, 샌드위치 ELISA (R & D Systems)를 통해 IL-8 농도를 측정하였다.
융합체 단백질 내의 IL-1ra의 활성에 의해 IL-8의 분비가 감소되었다. MSA 16IL-1ra 융합체의 활성으로부터 그리고 IL-1ra MSA16 융합체의 활성으로부터 기인하는 IL-8 분비의 감소율을 IL-1ra 대조군(재조합 사람 IL-1ra, R & D Systems)을 사용한 경우에 확인되는 감소율과 비교하였다. 시험된 각각의 단백질의 중화 용량 50(ND50)을 측정하였으며, 이것을 하기 표 2에 기재하였다.
단백질 ND50
IL-1ra 0.5 nM
MSA16IL-1ra 2 nM
IL-1raMSA16 8 nM
상기 결과는 IL-1ra가 항-혈청 알부민 dAb를 포함하는 융합 컨스트럭트의 일부로서 활성을 유지한다는 것을 입증한다. MSA 16IL-1ra 단백질은 이의 약동학(PK study)을 평가하기 위해 추가로 연구되었다.
혈청 알부민, 항 IL -1 ra 샌드위치 ELISA
혈청 알부민에 결합함과 동시에 단일클론성 항-IL 1ra 항체에 의해 검출되는 3개의 dAb/IL-1ra 융합체들의 능력에 대해 시험하였다. 시험된 융합체는 MSA16IL-1ra, IL-1raMSA16 및 더미IL-1ra이었다. 간단하게 요약하면, ELISA 플레이트를 10 ㎍/ml에서 생쥐 혈청 알부민으로 밤새 코팅하고, 0.05% 트윈 PBS로 5회 세척한 다음, 4% 마벨 PBS로 1시간 동안 블록킹하였다. 블록킹 후에, 플레이트를 0.05% 트윈 PBS로 5회 세척한 다음, 각각의 dAB를 처치하여 1시간 동안 인큐베이션시키고, IL-1ra 융합체를 4% MPBS로 희석시켰다. 각각의 융합체를 1 μM 농도에서 인큐베이션하고, 7회의 연속적인 4배 희석 (즉, 60 pM 이하가 되도록)시켰다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 0.05% 트윈 PBS로 5회 세척한 후에, 4% MPBS로 희석된 사람 IL-1 수용체 길항제 (Abcam, UK)에 대한 제조업자에 의해 권장된 래빗 폴리클로날 항체 (ab-2573)의 희석을 실시하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이렇게 인큐베이션한 후에, 플레이트를 0.05% 트윈 PBS로 세척하고 나서, 4% MPBS로 희석된 2차 항체 (항-토끼 IgG-HRP)를 1/2000 희석시키면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체를 사용한 인큐베이션 후에, 플레이트를 0.05% 트윈 PBS로 3회 세척하고 PBS로 2회 세척한 다음, 웰 당 TMB 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질 (KPL, MA)을 50 ㎕ 처치하여 발색시키고, 웰당 50 ㎕의 HCl을 처치하여 반응을 중단시켰다. 450 nM에서 흡광도를 판독하였다.
MSA16IL-1ra 및 IL-1raMSA16 단백질 둘 모두는 샌드위치 ELISA 실행시, 1μM 농도에서 백그라운드 수준의 2배 이상으로 검출된다. MSA16IL-1ra 단백질은 3.9 nM 이하의 희석액에서 백그라운드의 두배 이상으로 검출되고 한편, IL-1ra MSA16 단백질은 500 nM 이하에서 백그라운드의 두배로만 검출된다. 대조군 컨스트럭트(더미 IL-1ra)가 혈청 알부민에 결합하지 않기 때문에, MSA16IL-1ra 융합체는 혈청 알부민에 대해 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 생쥐 PK 연구에서의 약물 융합체의 혈청 반감기 결정.
A. MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질의 생쥐에서의 혈청 반감기 결정.
MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질을 대장균의 원형질막 주위공간에서 발현시키고, pH 2.2에서 글리신을 이용한 용리가 바로 뒤 이어 수행되는 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitech, Norway)에 의한 흡착 배치를 이용하여 단백질을 정제하였다. CD1 계통의 수컷 동물인 생쥐를 대상으로 약 1.5 mg/kg의 용량으로 1회 정맥내 (i.v.) 주사 후 상기 생쥐에서 융합 단백질의 혈청 반감기를 결정하였다. 염소 항-HA(Abcam, UK) 포획 및 4% 마블(Marvel)로 블로킹된 단백질 L-HRP (Invitrogen, USA) 검출을 이용하는 ELISA로 혈청 수준을 분석하였다. 0.05% Tween-20, PBS로 세척하였다. 시험 샘플과의 명확한 비교를 위해 1x 생쥐 혈청의 존재하에서 공지된 농도의 MSA 결합 dAb/HA 융합체의 표준 곡선을 작성하였다. 1 구획 모델(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)을 이용한 모델링은 MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질이 29.1 시간의 말기 t1/2 및 559 hr.㎍/ml의 곡선 아래 영역을 가짐을 보여주었다. 이는 HA 에피토프 태그 펩티드를 단독으로 사용한 경우에 예상되는 반감기(반감기가 단지 수분정도로 짧을 수 있음)에 비하여 반감기가 훨씬 개선되었음을 입증한다.
약물 모델로서 HA 에피토프 태그를 이용하는 이러한 연구의 결과는 약물이 약물 융합체 또는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, dAb)과의 약물 컨주게이트로 제조되는 경우 약물의 생체내 혈청 반감기가 연장될 수 있다는 것을 입증한다.
항-MSA dAb D0M7m-16 및 D0M7m-26, 및 MSA에 결합하지 않는 대조군 dAb의 생쥐에서의 생체내 반감기를 또한 측정하였다. 또 다시, DOM7m-16, DOM7m-26 및 대조군 dAb는 약물(예를 들어, 펩티드 약물)에 대한 모델로서 제공되는 HA 에피토프 태그를 함유하였다. 본 연구에서, MSA에 결합하지 않는 대조군 dAb는 20분의 생체내 반감기를 지니는 반면, DOM7m-16 및 DOM7m-26의 생체내 반감기는 현저하게 연장되었다(도 12). DOM7m-16은 추가 연구에서 29.5 시간의 생쥐에서의 생체내 반감기를 지니는 것으로 밝혀졌다.
또 다른 연구에서, HA 에피토프 태그를 함유한 DOM7h-8의 생체내 반감기 (t1/2β)를 생쥐에서 평가하였다. 2 구획 모델(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)을 이용한 모델링은 DOM7h-8이 29.1 시간의 t1/2β를 지님을 나타내었다.
약물(예를 들어, 펩티드 약물)에 대한 모델로서 HA 에피토프 태그를 이용한 본 연구의 각각의 결과는 약물이 약물 융합체 또는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, dAb)과의 약물 컨주게이트로 제조되는 경우 약물의 생체내 혈청 반감기가 극적으로 연장될 수 있음을 입증한다.
B. MSA 결합 dAb/IL-1ra 융합 단백질의 생쥐에서의 혈청내 반감기 결정.
MSA 결합 dAb/IL-1ra 융합 단백질 (MSA16IL-1ra)을 대장균의 원형질막 주위공간에서 발현시키고, pH 2.2에서 글리신을 이용한 용리가 바로 뒤 이어 수행되는 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitech, Norway)에 의한 흡착 배치를 이용하여 정제하였다. MSA16IL-1ra (DOM7m-16/IL-1ra), MSA에 결합하지 않는 dAb를 지니는 IL-1ra 융합체 (더미 dAb/IL-1ra), HA 에피토프 태그에 융합된 항-MSA dAb (DOM7m-16 HA 태그)의 혈청 반감기를 CD1 계통의 수컷 동물로의 약 1.5 mg/kg의 1회의 정맥내 주사 후에 생쥐에서 결정하였다.
IL-1ra 샌드위치 ΕLISA(R&D Systems, USA)로 혈청 수준을 분석하였다. 시험 샘플과 비교하기 위해, 1x 생쥐 혈청의 존재하에서 공지된 농도의 dAb/IL-1ra 융합체의 표준 곡선을 작성하였다. 윈논린(WinNonlin) 약동학 소프트웨어(Pharsight Corp., USA)를 이용하여 모델링을 수행하였다.
항-MSA dAb와의 IL-1ra 융합체는 비-MSA 결합 dAb와 IL-1ra의 융합체인 대조군과 비교하여 혈청 반감기를 현저하게 증가시킬 것으로 예상되었다. 대조군인 비-MSA 결합 dAb/IL-1ra 융합체는 짧은 혈청 반감기를 지니는 것으로 예상되었다.
상기 연구의 결과는 표 3에 제시되어 있으며, 이는 항-MSA dAb와의 IL-1ra 융합체(DOM7m-16/IL-1ra)가 MSA에 결합하지 않는 dAb를 지니는 IL-1ra 융합체(더미 dAb/IL-1ra) 보다 대략 10배 이상의 혈청 반감기를 지니는 것을 나타낸다. 상기 결과는 또한 더미/IL-1ra(AUC: 1.5 hr.μg/ml)와 비교하여 DOM7m-16/IL-1ra(AUC: 267 hr.μg/ml)에 대한 농도 시간 곡선 아래 영역이 200배 초과로 개선(증가)되었음을 나타낸다.
작용제 혈청 반감기
DOM7m-16/IL-1ra 4.3 시간
더미/IL-1ra 0.4 시간
DOM7m-16 HA 태그 29 시간
본 연구의 결과는 약물이 약물 융합체 또는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, dAb)과 함께 약물 융합체 또는 컨주게이트로 제조되는 경우 약물의 생체내 혈청 반감기 및 AUC가 현저하게 연장될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 5. RSA 결합 dAb / HA 에피토프 태그 융합 단백질의 래트에서 의 혈청 반감기 결정
항-래트 혈청 알부민 dAb를 대장균의 원형질막 주위공간에서 C-말단 HA 태그와 함께 발현시키고, Vκ dAb에 대해서는 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitech, Norway)로의 흡착 배치 및 VH dAb에 대해서는 단백질 A 친화성 수지로의 흡착 배치 후 글리신(pH 2.2)을 이용한 용리에 의해 정제하였다. 혈청 반감기를 결정하기 위해, 4마리의 래트의 그룹에 1.5 mg/Kg의 DOM7r-27, DOM7r-31, DOM7r-16, DOM7r-3 또는 관련이 없는 항원에 결합하는 대조군 dAb(HEL4)를 1회 정맥내 주사하였다. 혈청 샘플을 7일에 걸쳐 꼬리 정맥으로부터 연속적으로 채혈하여 수득하고, ELISA 플레이트에 코팅된 염소 항-HA(Abcam, Cambridge UK)를 이용하는 샌드위치 ELISA로 분석한 후, 단백질 A-HRP(VH dAb에 대해서임) 또는 단백질 L-HRP (Vκ dAb에 대해서임)를 이용하여 검출하였다. 시험 샘플과 비교하기 위해 1x 래트 혈청의 존재하에서 공지된 농도의 dAb의 표준 곡선을 작성하였다. 2 구획 모델(윈논린 약동학 소프트웨어 (Pharsight Corp., USA)를 이용함)을 이용한 모델링을 t1/2β 및 곡선아래영역 (AUC)을 계산하기 위해 사용하였다(표 4).
작용제 스캐폴드 래트 혈청 알부민에 대한 친화도 (KD) t1/2β AUC (hr·㎍/㎖)
DOM7r-3 Vκ 12 nM 13.7 시간 224
DOM7r-16 Vκ 1 μM 34.4 시간 170
DOM7r-27 VH 250 nM 14.8 시간 78.9
DOM7r-31 VH 5 μM 5.96 시간 71.2
약물(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 약물)에 대한 모델로서 HA 에피토프 태그를 이용한 상기 래트 연구의 결과는 약물이 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, dAb)과 함께 약물 융합체 또는 컨주게이트로 제조되는 경우에 약물의 생체내 혈청 반감기가 극적으로 연장될 수 있음을 입증한다.
인간에서의 반감기 예측
인간에서의 dAb, 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트의 생체내 반감기는 상대성 스케일링(allometric scaling)을 이용하여 동물에서 수득된 반감기 데이터로부터 예측할 수 있다. 3마리의 동물에서 결정된 생체내 반감기의 로그를 동물의 체중의 로그에 대해 작도하였다. 작도된 점 및 기울기를 따라 선을 그리고, 선의 y-절편을 식 log Y = log(a) + b log(W)(여기서, Y는 인간에서의 생체내 반감기이고, log(a)는 y-절편이고, b는 기울기이고, W는 인간의 체중임)을 이용하여 인간에서의 생체내 반감기를 계산하기 위해 사용하였다. 선은 약 35 그램(예를 들어, 생쥐), 약 260 그램(예를 들어, 래트) 및 약 2,710 그램의 체중의 동물에서 수득된 생체내 반감기 데이터를 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 계산을 위해, 인간의 체중을 70,000 그램으로 간주할 수 있다. 생쥐 및 래트에서 획득된 반감기 수치에 근거하여, 예컨대, DOM7h-8과 같은, 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb들은 인간의 경우에 있어서 약 5.5 시간 내지 약 40시간의 t1/2β 및 약 150 hr·㎍/㎖ 내지 약 2500 hr·㎍/㎖의 AUC를 가질 것으로 예상된다.
실시예 6. 생쥐의 콜라겐에 의해 유발된 류마티스 관절염의 관절염 모델에서의 항- SA dAb / IL -1 ra 약물 융합체의 효능
류마티스 관절염의 승인된 생쥐 모델 (DBA/1 생쥐에서의 타입 II 콜라겐에 의해 유발된 관절염(CIA))에서 융합체 DOM7m-16/IL-1ra의 효능 및 IL-1ra의 효능을 측정하였다. 연구 내내, 생쥐를 HEPA-여과된 스캔테이너(Scantainer) 안에 수용되는 2개의 표준 타입 우리의 시험 설비에서 12시간의 빛, 12시간의 어둠 사이클로 20 내지 24℃에서 사육하였다. 먹이 (Harlan-Teklad universal diet 2016) 및 UV 멸균된 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 적합한 기후순응을 보장하기 위해 최소한 연구 시작 7일 전에 생쥐를 시험 설비에 두었다.
7-8 주령의 DBA/1 생쥐(덴마크, 돔홀트베그, 타코닉 M 앤드 B로부터 입수)에 에멀젼이 안정될 때까지 1:1의 비로 유화된 아르트로겐(Arthrogen)-CIA 애쥬번트 및 아르트로겐-CIA 콜라겐 (둘 모두 MD biosciences)의 에멀젼을 1회 주사하였다. 에멀젼의 점적이 비이커의 물에 첨가되어 고형 클럼프(Clump)가 생성될 때 에멀젼이 안정된 것으로 간주하였다. 이후, 생쥐에 에멀젼을 주사하였다.
에멀젼 주사 21일 후, 가장 많이 진행된 관절염을 지니는 20 마리의 동물을 연구에서 배제시키고, 나머지 생쥐를 10 마리의 동물의 그룹으로 나누었다 (각각의 그룹은 5 마리의 수컷 및 5 마리의 암컷을 포함함). 생쥐를 표 5에 기재한 바와 같이 처치하였으며, 모든 처치(treaments)는 10 ml/Kg로 투여되어 계산된 농도로 전달되었다.
그룹 처치
1 IL-1ra, 1 mg/Kg(복막내(ip.) 볼루스)
2 IL-1ra, 10 mg/Kg(복막내(ip.) 볼루스)
3 DOM7m-16/IL-1ra, 1 mg/Kg(복막내(ip.) 볼루스)
4 DOM7m-16/IL-1ra, 10 mg/Kg(복막내(ip.) 볼루스)
5 엔브렐®(entarecept; Immunex Corporation), 5 mg/Kg(복막내(ip.) 볼루스)
6 염수(음성 대조군), 10 mg/Kg (복막내(ip.) 볼루스)
7 덱사메타손(양성 대조군), 0.4 mg/Kg(피하 주사)
관절염의 중증도에 대한 임상 스코어를 21일 내지 49일로부터 1주일에 3회 기록하였다. 49일째에 생쥐를 마취시켰다. 이들이 12 이상의 관절염 스코어를 나타내거나, 심각한 이동 장애가 나타나는 경우 개별 생쥐를 보다 조기에 마취시켰다.
임상 스코어링을 위해, 각각의 사지를 하기 기준에 따라 스코어를 정하고, 4개의 사지 모두에서의 스코어를 합하여 생쥐에 대한 전체 스코어를 산출하였다. 이러한 방법에 의한 결과, 각각의 생쥐에 대해 0 내지 16의 스코어가 부여되었다. 스코어 기준은 하기와 같다: 0 = 정상; 1 = 병에 걸린 발가락의 수에 상관 없이, 경증이지만 명확한 발적(redness) 및 발목 또는 손목의 부어오름(swelling), 또는 개별 발가락에 한정되는 명백한 발적 및 부어오름; 2 = 발목 및 손목의 중간정도의 발적 및 부어오름; 3 = 발가락을 포함하는 전체 발의 중증의 발적 및 부어오름; 4 = 다수의 관절을 포함하는 최대로 염증이 발생된 사지를 의미한다.
그룹 평균 관절염 스코어를 개별 생쥐로부터의 임상 스코어를 이용하여 매 처치에 대한 각각의 처치시 각각의 처치군에 대해 계산하였다. 윤리적인 이유로 연구로부터 배제된 임의의 동물은 16의 최대 스코어로 할당하였다. 그룹의 평균 관절염 스코어를 시간에 대해 작도하였다 (도 13).
49일째에 그룹 평균 관절염 스코어의 통계 분석을 윌콕슨 (Wilcoxon) 테스트를 이용하여 수행하였다. 염수 대조군 그룹(그룹 6)과 비교하였을 때, DOM7m-16/IL-1ra로 처치된 두개의 그룹(1 mg/Kg 또는 10 mg/Kg(그룹 3 및 4))이 49일째에 관절염 스코어가 현저하게 개선(각각 P <1% 및 P <0.05%의 유의성 수준)되었음이 이러한 통계분석결과 드러났다. 대조적으로, 1 mg/Kg의 IL-1ra로 처치된 그룹(그룹 1)은 49일째에 관절염 스코어에서 통계적으로 유의한 개선을 보여주지 않은 반면, 10 mg/Kg의 IL-1ra로 처치된 그룹(그룹 2)은 P <5%의 유의성 수준으로 현저히 개선된 결과를 보여주었다. ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation)로 처치된 그룹 (그룹 5)은 P <10%의 유의성 수준으로 49일째에 관절염 스코어를 현저하게 개선시켰다.
10 mg/Kg 용량의 DOM7m-16/IL-1ra로 처치된 그룹(그룹 4)은 5mg/Kg의 ENBREL®(entarecept; Immunex Corporation)로 표준 처치된 그룹(그룹 5)과 비교하였을 때, 49일째에 관절염 스코어가 효과적으로 개선되었다(P<0.5% 수준의 유의성). 또한, 보다 낮은 1 mg/Kg 용량의 DOM7m-16/IL-1ra의 처치(그룹 3)는 동일한 용량의 IL-1ra를 단독으로 처치(그룹 1)한 경우 보다 49일째에 관절염 스코어를 보다 유익한 수준으로 개선시켰다(P<10% 수준의 유의성).
이러한 연구의 결과는 본 연구에서 특정 용량의 DOM7m-16/IL-1ra가 IL-1ra 또는 ENBREL®(entarecept; Immunex Corporation) 보다 효과적임을 나타낸다. IL-1ra에 대한 반응은 예상되는 바와 같이 용량 의존적이고, D0M7m-16/IL-1ra에 대한 반응 또한 용량 의존적이다. 1 mg/Kg의 D0M7m-16/IL-1ra로 처치된 그룹의 평균 스코어는 10 mg/k의 IL-1ra로 처치된 그룹에 의해 수득된 평균 스코어보다 일관적으로 낮았다. 이러한 작도된 결과(도 13)은 본 연구에서 DOM7m-16/IL-1ra의 처치가 IL-1ra 보다 10배 이상 효과적임을 나타낸다.
DOM7m-16/IL-1ra의 보다 우수한 효능은 DOM7-16/IL-1ra 융합 단백질이 중량 기준으로 IL-1ra와 같은 IL-1 수용체 결합 에피토프의 수의 대략 반을 함유하는 경우에도 관찰된다(예를 들어, 1 mg의 DOM7m-16/IL-1ra(MW. 31.2 kD)는 1 mg의 IL-1ra(MW. 17.1 kD)와 같은 IL-1 수용체 결합 에피토프의 수의 대략 반을 함유한다).
본 연구의 결과는 혈청 알부민에 결합하는 dAb가 IL-1ra(RA에 대한 임상적으로 증명된 치료제)에 연결될 수 있고, 생성된 약물 융합체가 긴 혈청 반감기 특성(dAb에 의해 부여됨) 및 IL-1 수용체 결합 특성(IL-1ra에 의해 부여됨) 둘 모두를 지님을 입증한다. 약물 융합체의 혈청 잔류 시간으로 인해, CIA를 치료하는데 효과적인 DOM7-16/IL-1ra의 용량은 IL-1ra에 비해 극적으로 감소된다.
이러한 연구의 결과는 연장된 반감기 및 증가된 AUC의 이점 이외에, 약물 융합체 또는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, dAb)과의 약물 컨주게이트로서 제조된 약물이 약물 단독을 능가하는 이점을 제공하는 매우 효과적인 치료제임을 입증한다. 예를 들어, 생쥐 CIA 모델에서 입증된 바와 같이, 낮은 용량의 약물 융합체가 IL-1ra 단독에 비해 보다 긴 기간에 걸쳐 IL-1에 의해 야기된 관절 염증 및 관절 손상에 효과적이며, 이를 억제하고, 질병 진행에서의 보다 큰 보호를 제공한다.
실시예 7. 항- SA dAb / 사포린 비공유결합 약물 컨주게이트
리보솜 불활성화 단백질 사포린(항암 약물)은 변성제 및 프로테아제에 대해 매우 안정하며, T 림프구에 대한 표적화된 독소로 사용된다. 비공유결합 약물 컨주게이트를 비오틴-스트렙트아비딘 링크를 통해 사포린을 DOM7h-8에 커플링시킴으로써 제조하였다. 비공유결합 약물 컨주게이트로 획득한 결과는 DOM7h-8이 약물에 커플링되는 경우 이의 혈청 알부민 결합 특성이 유지됨을 입증한다.
위치 108(서열번호: 24의 아미노산 108)의 C-말단 아르기닌이 시스테인 잔기로 대체된 DOM7h-8cys로 언급되는 변이체 DOM7h-8을 HB2151 세포에서 재조합 핵산을 발현시켜 제조하였다. 세포를 성장시키고, 밤새 30℃로 72시간 동안 자가유도 TB 레디믹스(readymix, Merck KGa, Germany)에서 발현을 유도한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. DOM7h-8cys를 단백질 L-아가로오스 상에서의 친화성 포획을 이용하여 상층액으로부터 정제시켰다. 이후, 수지를 10 컬럼 부피의 2 x PBS로 세척하고, DOM7h-8cys를 0.1 M 글리신(pH 2)으로 용리시켰다. 용리된 DOM7h-8cys를 0.2 x 부피의 Tris(pH 8)로 중화시키고, 1 mg/ml으로 농축시켰다(CENTRICON 20 ml 농축기 (Millipore Corp., MA)를 이용함).
농축된 DOM7h-8cys를 NAP5 탈염 컬럼(GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ)을 이용하여 PBS로 완충용액을 교체하고, 농도를 결정하였다. 이후, dAb를 EZ-LINK 설포-NHS-LC-비오틴(Pierce Biotechnology Inc., IL)을 이용하여 비오티닐화시켰다. 비오티닐화된 dAb를 1:1의 몰비의 스트렙트아비딘-사포린과 혼합시켰다.
dAb/사포린 복합체가 형성된 것을 확인하기 위해, 샌드위치 ELISA를 사용하여 무손상 복합체를 검출하였다. 인간 혈청 알부민(HAS)를 웰당 100 μl의 부피로 10 μg/ml 농도로 처리하여 ELISA 플레이트(Nunc, NY)의 웰의 반을 밤새 코팅시켰다. 밤새 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척한 후, 전체 플레이트를 2% PBS로 2시간 동안 블로킹시켰다. 블로킹 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척한 후, 2% Tween PBS 중에 0.5 μM로 희석된 DOM7h-8/사포린 비공유 컨주게이트와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 대조군으로서, 동일한 ELISA 플레이트 상에서, 0.5 μM의 커플링되지 않은 사포린 및 0.5 μM의 커플링되지 않은 DOM7h8을 2% Tween PBS에서 인큐베이션하였다. HSA로 코팅되지 않고, 2% Tween으로 블로킹된 ELISA의 웰에서 인큐베이션된 동일한 세개의 희석 단백질을 추가 대조군으로 하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척한 후, 2% Tween PBS에 희석된 염소 항-사포린 폴리클로날 항체 (Advanced Therapeutic Systems)의 1/2000 희석액과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척하고, 제 2의 검출 항체 (1/2000의 항-염소 Ig HRP 컨주게이트)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척하고, PBS로 1회 세척하고, 종이 상에서 탭 건조시켰다. ELISA를 기질로서 100 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 함께 수행하고, 50 μl의 1M 염산으로 반응을 중지시켰다. DOM7h-8과 사포린의 비공유 컨주게이트의 존재를 컨주게이트의 OD600과 컨쥬게이션되지 않은 부분의 OD600을 비교함으로써 확인하였다.
DOM7h-8/사포린 DOM7h-8 단독 사포린 단독
OD600 (HAS로 코팅된 플레이트) 0.311 0.060 0.079
OD600 (2% Tween PBS로 블로킹된 플레이트) 0.078 0.068 0.075
본 연구의 결과는 약물이 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편에 컨쥬게이션될 수 있고, 컨쥬게이션된 항원 결합 단편이 혈청 알부민 결합 활성을 보유함을 입증한다. 또한, 비오틴-스트렙트아비딘 상호작용의 안정성 및 강도로 인해, 상기 결과는 공유적으로 결합된 컨주게이트 및 비공유적으로 결합된 컨주게이트가 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편의 혈청 알부민 결합 활성을 유지하도록 제조될 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. 항- SA dAb / 플루오레신 컨주게이트
플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC)는 단백질 상에서 아미노, 술프히드릴, 이미다조일, 티로실 또는 카르보닐기와 함께 교차 결합될 수 있다. 이는 크기에서 다수의 저분자 약물에 필적하는 389 Da의 분자량을 갖는다. 이러한 컨주게이트를 이용하여 수득된 결과는 항-SA dAb가 작은 화학적 존재물에 커플링되는 경우 이의 혈청 알부민 결합 특성을 유지하는 것을 입증하고, 이는 저분자 약물이 항-SA dAb에 컨쥬게이션될 수 있음을 나타낸다.
농축된 DOM7h-8cys를 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조하였다. 농축된 dAb를 NAP5 탈염 컬럼(GE Healthcare/ Amersham Biosciences, NJ)을 이용하여 50 mM 보레이트(pH 8)로 완충용액 교환시킨 후, 2 ml CENTRICON 농축기 (Millipore Corp., MA)를 이용하여 2.3 mg/ml로 농축시켰다. FITC(Pierce Biotechnology Inc.)를 제조 업체의 설명서에 따라 디메틸 포름아미드(DMF) 중에서 10 mg/ml로 희석시킨 후, 24:1 몰비의 FITC:dAb로 커플링 완충용액 중에서 dAb와 함께 혼합시켰다. 30분 동안 반응이 진행되도록 하였다. 이 시점에서, 과량의 반응되지 않은 FITC를 PBS로 미리 평형화된 PD1O 탈염 컬럼(GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ)을 이용하여 반응으로부터 제거하고, DOM7h-8cys/FITC 컨주게이트를 PBS로 용리시켰다.
FITC/dAb 커플링 반응이 성공적임을 확증하기 위해, 샌드위치 ELISA를 사용하여 커플링된 dAb를 검출하였다. 인간 혈청 알부민(HSA)을 웰당 100 μl의 부피로 10 μg/ml 농도로 처리하여 밤새 ELISA 플레이트(Nunc, NY)의 웰의 반에 코팅시켰다. 밤새 인큐베이션시킨 후, 전체 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척한 후, 모든 웰을 2% Tween PBS로 2시간 동안 블로킹시켰다. 블로킹 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척한 후, 2% Tween PBS 중에 1 μM로 희석된 DOM7h-8cys/FITC와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 동일한 ELISA 플레이트 상에서, 대조군인 1 μM의 FITC 커플링된 항체 및 1 μM의 커플링되지 않은 DOM7h8을 2% Tween PBS에서 인큐베이션하였다. HSA로 코팅되지 않고, 2% Tween으로 블로킹된 ELISA 플레이트의 웰에서 인큐베이션된 동일한 세개의 희석된 단백질을 추가 대조군으로 하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척한 후, 2% Tween PBS에 희석된 래트 항 FITC 항체 (Serotec)의 1/500 희석액과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척한 후, 2% Tween PBS 중에 희석된 제 2의 검출 항체(1/5000의 항-래트 Ig HRP 컨주게이트)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척하고, PBS로 1회 세척하고, 종이 상에서 탭 건조시켰다. ELISA를 기질로서 웰당 100 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 함께 수행하고, 웰당 50 μl의 1M 염산으로 반응을 중지시켰다. DOM7h-8과 FITC의 컨주게이트의 존재를 컨주게이트의 OD600과 컨쥬게이션되지 않은 부분의 OD600을 비교함으로써 확인하였다.
DOM7h-8/FITC DOM7h-8 단독 FITC 커플링된 항체 (음성 대조군)
OD600 (HSA로 코팅된 플레이트) 0.380 0.042 0.049
OD600 (2% Tween PBS로 블로킹된 플레이트) 0.041 0.041 0.045
실시예 9. 항- SA dAb /펩티드 컨주게이트
다수의 펩티드가 치료 효과를 갖는다. N 또는 C 말단 시스테인을 지닌 모델 펩티드는 항-혈청 알부민 dAb에 커플링될 수 있다.
이 경우, 하기의 4개의 상이한 펩티드가 사용될 것이다: 펩티드 1 YPYDVPDYAKKKKKKC(서열번호:64); 펩티드 2 CKKKKKKYPYDVPDYA(서열번호:65); 펩티드 3 HHHHHHKKKKKKC(서열번호:66) 및 펩티드 4: CKKKKKKHHHHHH(서열번호:67). 펩티드 1 및 2는 헤마글루티닌 태그(HA 태그)의 서열을 포함하고, 펩티드 3 및 4는 His 태그의 서열을 포함한다. 농축된 DOM7h-8cys는 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조될 것이다.
농축된 dAb는 5 mM 디티오트레이톨을 이용하여 환원될 것이고, 그 후 완충용액이 NAP5 탈염 컬럼(GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ)에 사용되는 커플링 완충용액(20 mM BisTris pH 6.5, 5 mM EDTA, 10% 글리세롤)으로 교체될 것이다. 시스테인은 dAb 용액에 첨가되어 DMSO 중의 100 mM 디티오디피리딘의 스톡을 형성하게 되는 5 mM의 디티오디피리딘의 최종 농도를 이용하여 블로킹(dAb 자체의 이합체화를 방지하기 위함)될 것이다. dAb 및 디티오디피리딘은 20-30분 동안 커플링되도록 두어질 것이다. 이후, 반응하지 않은 디티오디피리딘은 PD1O 탈염 컬럼을 이용하여 제거될 것이고, dAb는 커플링 완충용액 (20 mM BisTris pH 6.5, 5 mM EDTA, 10% 글리세롤) 중에서 용리될 것이다. 생성된 단백질은 이후 필요시까지 냉동될 것이다.
펩티드 1 내지 4는 개별적으로 200 μM의 농도로 물에 용해될 것이고, 5 mM DTT를 이용하여 환원될 것이고, 이후 NAP5 탈염 컬럼(GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ)을 이용하여 탈염될 것이다. 이후, 각각의 펩티드는 펩티드-dAb 커플링이 발생하기 위해 20:1의 비로 환원되고 블로킹된 dAb의 용액에 첨가될 것이다. 펩티드, dAb 커플링 반응의 성공을 확인하기 위해, 샌드위치 ELISA를 이용하여 항-SA dAb/펩티드 컨주게이트를 검출할 것이다.
인간 혈청 알부민은 웰당 100 μl의 부피로 10 μg/ml로 밤새 ELISA 플레이트(Nunc, NY)에 코팅될 것이다. 밤새 인큐베이션 후, 플레이트는 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척될 것이고, 이후 4% Marvel PBS로 2시간 동안 블로킹될 것이다. 블로킹 후, 플레이트는 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척될 것이고, 이후 4% Marvel PBS 중에서 1 μM로 희석된 DOM7h-8/펩티드 컨주게이트와 함께 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 대조군으로서, 동일한 ELISA 플레이트 상에서 20 μM의 커플링되지 않은 펩티드 및 1 μM의 커플링되지 않은 DOM7h-8이 4% MPBS에서 인큐베이션될 것이다. 인큐베이션 후, 플레이트는 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척될 것이고, 이후 펩티드 1 및 2에 대해서는 4% Marvel PBS 중에 희석된 염소 항-HA 항체(Abcam)의 1/2000 희석액, 및 4% Marvel PBS 중에 희석된 Ni NTA-HRP(펩티드 3 및 4에 대해)의 1/2000 희석액으로 1시간 동안 인큐베이션될 것이다. 인큐베이션후, 플레이트는 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척될 것이고, 이후 염소 항 HA 항체를 지닌 웰은 4% MPBS 중에 1/2000로 희석된 제 2의 항-염소 HRP 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션될 것이다(기타 웰은 1시간 동안 블로킹됨). 인큐베이션후, 플레이트는 PBS, 0.05% Tween으로 3회 세척될 것이고, PBS로 1회 세척될 것이고, 이후 종이 상에서 탭 건조될 것이다. ELISA는 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 함께 수행될 것이고, 1M 염산으로 반응이 중지될 것이다. DOM7h-8/펩티드 컨주게이트의 존재는 컨주게이트의 OD600과 컨쥬게이션되지 않은 부분들 중 어느 하나의 OD600을 비교함으로써 확인될 것이다.
실시예 10.
본원의 예시적인 실시예는 인간 PLAD 도메인 및 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 융합 단백질의 생산, 정제 및 특성분석에 사용될 적합한 방법을 개시한다. 융합 단백질은 PLAD 도메인(pre-ligand assembly domain of human TNFR1)이 인간 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 가변 도메인(DOM7h-8)의 N-말단에 융합되거나(PLAD-DOM7h-8) 상기 PLAD가 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 가변 도메인의 C-말단에 결합되어(DOM7h-8-PLAD 생산) 생산될 것이다. PLAD의 아미노산 서열은 인간 라이브러리로부터 동정된 cDNA 서열에서 유래되며, 서열번호:85로 기재된 서열에서 1번 위치에서 51번째 위치까지의 부가된 아미노산 잔기들이다. DOMTh-8의 아미노산 서열은 서열번호:24로 기재된다. 이러한 단백질들은 세개의 상이한 개체[대장균(Echerichia coli), 피치차 파스토리스(Pichia pastoris) 및 HEK293T 세포와 같은 포유동물]에서 발현될 것이며, 정제되고, 생체외조건(in vitro) 검정 및 생체내조건(in vivo) 연구의 범위에서 시험될 것이다.
하기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호:85의 1번 위치에서 52번째 위치까지의 아미노산 잔기들을 엔코딩한다:
CTGGTCCCTCACCTAGGGGACAGQGAGAAGAGAGATAGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAOGATACGGACTGCAGG(서열번호:98).
하기 뉴클레오타이드 서열은 DOM7h-8을 엔코딩한다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGGAATTCCCCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGACGTATACSGGTGCCTCCTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(서열번호:99).
융합 유전자 작제, 클로닝 및 발현
융합 유전자 산물은 두 유전자가 오버랩핑 서열(overlapping sequence)을 포함하는 한 쌍의 프라이머를 이용하여 2개의 상이한 반응으로 증폭되는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산될 것이다. 상기 오버랩핑 서열은 또한 다양한 길이 및 조합의 폴리펩티드 링커 서열(예를 들어, Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(서열번호:100)과 같은 6개의 플렉서블 아미노산으로 구성된 펩티드)을 도입하기 위해 사용될 것이다. 이러한 방법으로 제조된 2개의 PCR 산물들은 두 템플레이트들이 같이 혼합되고(1:1 비율) 프라이머 없이 수회의 PCR 증폭 라운드를 거치게 되는 SOE-PCR('splicing-by-overlap-extension PCR')이라고 불리우는 과정에 의해 융합 될 것이다. 이후 상기 새롭게 제조된 융합 PCR 산물은 적어도 전체 융합 유전자를 망라하는 한 쌍의 외래 프라이머(external primers)를 이용하는 PCR에 의히 추가로 증폭될 것이다. 프라이머들은 상기 유전자 융합 산물의 어느 한쪽 말단에 제한효소 부위를 도입하도록 디자인될 것이다. 상기 유전자 융합 산물은 상기 제한효소 부위에 특이적인 제한효소로 잘려지게 되고, 정제되고, 연이서 발현 시스템을 위한 적합한 벡터의 다클로닝부위에 라이게이션될 것이며, 이러한 융합은 벡터내에서 임의의 요망되는 아미노-말단 생성(secretion) 및 프로세싱 서열(processing sequences)의 생산이 가능하도록 한다. 6개 아미노산 링커(Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(서열번호:100))를 코딩하는 중간에 끼어든 DNA 세그먼트를 포함하는 융합 단백질을 엔코딩하는 융합 유전자를 생산하기 위한 각각의 반응에 사용될 각각의 프라이머들은 표 9에 제시되어 있다. 상기 프라이머들의 서열은 하기 표 10에 제시되어 있다.
하기 벡터가 사용될 것이다:
대장균(E. coli)에서의 발현을 위한 pUC119: 효모 당지질 부착 표면 단백질 분비 서열(yeast glycolipid anchored surface 단백질 secretion signal, GAS)이 상기 대장균의 주변세포질(periplasm)(이황화결합을 형성하기 위한 시스테인의 산화에 적합한 환경)에서 상기 융합 산물의 발현을 타겟팅하기 위한 아미노-말단 리더 서열로서 프레임내에 클로닝될 것이다. 상기 리더 서열은 상기 PLAD-DOM7h-8 또는 DOM7h-8-PLAD 융합 산물의 본래 아미노 말단을 생성하기 위해서 대장균 시그날 펩티다제에 의해 제거될 것이다. 이러한 시스템에서의 발현은 Plac 프로모터에 의해 개시되며, 0.05mM의 이소프로필-티오-베타-갈락토사이드(IPTG) 첨가로 유도되어 최종 농도 1.mM 까지 기하급수적으로 배양물(cultures)이 증가하게 될 것이다.
포유동물 세포(예컨대, HEK293T cell)에서의 발현을 위한 pDOM32: 상기 PLAD-DOM7h-8(또는 상기 DOM7h-8-PLAD)은 이것이 V-J2-C 분비 시그날 서열과 함께 프레임내에 도입되는 방식으로 클로닝될 것이다. 발현은 구성적으로 HEK-293 세포내의 pDOM32의 CMV 프로모터에 의해서 개시된다. 분비시에, 상기 시그날 펩티드는 아미노-말단에 부가된 아미노산이 존재하지 않는 온전한 융합 단백질을 생산하기 위해 제거될 것이다.
대장균에서의 발현을 위한 pET23: 상기 PLAD-DOM7h-8(또는 상기 DOM7h-8-PLAD)은 리더 서열 없이 IPTG 유도에 의해 대장균 세포질에서 불용성 단백질로 발현될 것이다. 단백질은 융합 산물의 N-터미날 말단에 부가적인 아미노-말단 메티오닌 잔기를 가질 것이다. 이러한 시스템에서의 발현은 0.05mM의 이소프로필-티오-베타-갈락토사이드(IPTG) 첨가로 유도되어 최종 농도 1.mM 까지 기하급수적으로 세포배양물(cultures)이 증가하게 될 것이다.
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현을 위한 pPICZα: 상기 PLAD-DOM7h-8(또는 상기 DOM7h-8-PLAD)은 세포배양물 상등액으로 직접적인 분비를 유도하기 위해 효모 알파 메이팅 인자 리더 서열(yeast alpha mating factor leader sequence)과 함께 프레임 내에 클로닝될 것이다. 상기 리더 서열은 아미노-말단에 부가적인 아미노산이 존재하지 않는 단백질을 생산하기 위해 Kex2 및 Stel3 프로테아제에 의해서 분비시에 제거될 것이다. 이러한 시스템에서의 발현은 배양 배지에 100 % 메탄올을 첨가함으로써 유도될 것이다(0.5% 내지 2.5% 최종 부피)
재조합 융합 유전자는 SalⅠ 및 NotⅠ를 사용하여 pUC119, BamHⅠ및 HindⅢ를 사용하여 pDOM32, 및 XhoⅠ 및 NotⅠ를 사용하여 pPICZα의 다클로닝 부위에 클로닝될 것이다.
삽입물을 포함하는 상기 플라스미드들은 우선 대장균 세포에 형질도입될 것이다. 이후 상기 플라스미드들은 제거될 것이며, 관심있는 유전자들은 올바른 유전자 서열을 가지고 있는지 여부를 확증하기 위해 시퀀싱될 것이다. 플라스미드들은 이후 대량으로 제조될 것이며, 단백질 발현에 적합한 세포에 형질도입시키기 위해 사용될 것이다.
pUCl19 벡터를 사용할 경우 이의 발현에 적합한 세포로서 하기 세포들이 선택될 것이다: TGl, TBl, HB2151, XL-I Blue, DH5, UT5600, W3110, 등.
pDOM32 벡터를 사용항 경우 이의 발현에 적합한 세포로서 하기의 세포들이 선택될 것이다: HEK293T 세포, NSl, COS, CHO, 등. pET23 벡터를 사용할 경우 이의 발현에 적합한 세포로서 하기의 세포들이 선택될 것이다: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, PL21(DE3)pLysE, BL21 터너, 오리가미(Origami), 로제타(Rosetta), 등. Suitable cells for expression using the pPICZα 벡터를 사용할 경우 이의 발현에 적합한 세포로서 하기의 세포들이 선택될 것이다: KM71H, X33.
pUCl19-, pDOM32- 및 pPICZα-기반 발현에 있어서, 상기 융합 산물은 세포배양물 상등액에 분비될 것이다. 그러므로, 발현후, 상기 배양물은 원심분리에 의해 가라 앉혀지게 되고 세포들을 펠렛을 형성하게 될 것이다. 상등액을 회수하고 잔여 세포들을 제거하기 위해 여과되고, 정제를 위해 직접적으로 가공될 것이다. pET23-기반 발현에 있어서, 상기 융합 산물은 봉입체(inclusion bodies)로서 주변세포질에 축적될 것이다. 봉입체들은 본원발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 세포 용해(cell lysis) 단계 및 상기 봉입체들을 깨끗하게 하기 위한 수회의 세척 단계를 포함하는 공지된 방법에 의해 으로 제조될 것이다. 상기 봉입체들은 고 농도의 변성제(예를 들어, 우레아, 구아니디니움 히드로클로라이드) 및 환원제(예를 들어, DTT, 베타-머캅토에탄올, TCEP)의 첨가에 의해 용해될 것이다. 상기 융합 단백질들의 리폴딩은 본원발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 이미 알려진 방법인 변성제 양을 감소시키면서 버퍼내에서의 느린-투석, 또는 리폴딩 버퍼에서의 빠른-희석 중 어느 한 가지의 방법에 따라 수행될 것이다. L-아르기닌, 글리세롤, 프로테아제 억제제(예컨대, PMSF) 및 산화-환원제(예컨대, GSH 및 GSSG)와 같은 첨가제를 상기 리폴딩 버퍼에 첨가함으로써, 폴딩률을 개선시킬 수 있을 것이다.
융합 단백질의 정제
융합 단백질은 렙토스트렙토코컬 (Peptostreptococcal) 단백질 L 아가로스 컬럼상에서 친화도-정제될 것이다. 이는 상기 PLAD-DOM7h-8(또는 상기 DOM7h-8-PLAD) 융합 단백질의 면역글로불린 가변 도메인 부분과 단백질 L 간의 특이적인 고 친화 상호작용을 이용하는 것이다. 일반적으로, 샘플은 중성 pH에서 상기 단백질 L 컬럼상에 로딩될 것이다. 상기 컬럼은 중성 pH에서 고농도의 염으로 세척될 것이며, 샘플은 낮은 pH 버퍼를 첨가함으로써 용리될 것이다. 용리된 샘플은 수집되고 상기 pH는 중화될 것이다. 임의의 잔여 오염체들은 음이온- 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토 그래피 또는 그외 또 다른 적합한 방법에 의해 제거될 것이다.
상기 정제된 융합 단백질의 동일성은 획득된 서열 및 질량을 DNA 서열에 근거하여 예상된 서열 및 질량과 매칭시키는 아미노-말단 시퀀싱, 및 MALDI-질량스펙트로메트리 분석에 의해 확증될 것이다.
융합 단백질의 활성
이후 임의의 링커를 포함하는 상기 융합 산물의 생물학적 활성이 검증될 것이다.
PLAD 활성: 인간 MRC-5 세포가 정제된 PLAD-DOM7h-8 (or the DOM7h-8-PLAD) 융합 단백질과 함께 미리-인큐베이션될 것이며, 그래서 상기 PLAD 도메인은 세포 표면상의 TNFRl과 억제 복합체를 형성할 수도 있다. 이후 상기 세포들은 인간 TNF-알파로 처리될 것이며, 37℃에서 인큐베이션될 것이다. TNF 자극에 반응하여 MRC-5 세포가 분비하는 IL-8의 양은 IL-8 ELISA를 이용하여 측정될 것이다. 융합 단백질의 PLAD 활성은 용량 의존적 방식으로 IL-8 분비의 억제에 의해 나타내어질 것이다.
항-혈청 알부민 활성: 혈청 알부민에 대한 PLAD-DOM7h-8(또는 DOM7h-8-PLAD) 융합 단백질의 친화도 분석을 위해, CM-5 BIAcore 칩이 pH 5.5에서 약 500 레조넌스 단위의 알부민과 커플링될 것이며, 결합 곡선이 정제된 융합 단백을 BIAcore 칩 전체적으로 5nM 내지 5μM 범위의 BIAcore HBS-EP 버퍼에 희석시킨 다음에 작성될 것이다. 친화도(KD)는 각 융합 단백질의 KD 범위에서 생성된 자취에 대한 온-레이트(on-rate) 및 오프-레이트(off-rate) 곡선을 피팅(fitting)함으로서 계산될 것이며, 융합 파트너(별개의 분자 엔티디로서) 부재시의 DOM7h-8의 친화도(Kd: 인간 혈청 알부민에 대해서 70 nM)와 비교될 것이다.
약동학 연구: 4마리의 래트 군이 정맥내 볼루스로 1.5mg/kg 의 융합 단백질 또는 혈청 알부민에 결합하는 대조 면역글로불린 가변 도메인(둘 모두는 방사능 동위원소 [3H]-NSP로 표지될 것임)을 주입받게 될 것이며, 혈청 샘플은 방사능 계측 분석을 위해 7일 이상 꼬리 정맥으로부터 획득될 것이다. 혈청 농도 대비 시간 곡선은 윈논린(WinNonlin) 소프트웨어를 이용하여 1 또는 2 구획 모델로 피팅될 것이다. 상기 PLAD 부분은 혈청 알부민과 결합하는 면역글로불린 가변 도메인의 최종 반감기에는 영향을 주지 않는 것으로 전제로 하여, 15시간의 오더에서의 상기 융합 단백질에 대한 최종 반감기가 예측될 것이다.
템플레이트 1 1의 PCR을 위한 프라이머 템플레이트 2 2의 PCR을 위한 프라이머 2와 함께 1의 SOE-PCR을 위한 프라이머 라이게이션되는 플라스미드
DOM7h-8 DOM008, 1399 PLAD 1398, 1400 DOM008, 1400 pUC119
DOM7h-8 VK EAEA. 1399 PLAD 1398, 1400 VK EAEA, 1400 pPICZα
DOM7h-8 1393, 1399 PLAD 1398, 1401 1393, 1401 pDOM32
프라이머 명칭 서열
DOM008 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (서열번호:101)
VK EAEA (또는 VK) TATCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCAGACATCCAGATGACCC AGTCTC (서열번호:102) (TATCTCGAGAAAAGAGACATCCAGATGACCCAGTCTC (서열번호:103))
1393 CCCGGATCCACCGGCGACATCCAGATGACCCAGTCTC(서열번호:104)
1399 GAGGGACCAGAGATGGAGCAGCGACGGTCCGTTTGAITTCCAC CTTGGTCCC (서열번호:105)
1398 CAAACGGACCGTCGCTGCTCCATCTCTGGTCCCTCACCTAGGGG ACAG (서열번호:106)
1400 GCGACAGGGAGCGGCCGCTCATTACCTGCAGTCCGTATCCTGC CCC (서열번호: 107)
1401 GACAGAAGCTTATCACCTGCAGTCCGTATCCTGCCCC (서열번호:108)
본원 발명이 특히 본원 발명의 바람직한 구체예들을 참조하여 도시 및 기술되어 왔으나, 본원 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 첨부된 특허청구범위에 기재된 청구항들이 포괄하는 본원 발명의 영역으로부터 벗어나지 아니하면서 발명의 형태 및 세부적인 부분들에 있어서의 다양한 변형이 시도될 수 있음을 인정할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Tomlinson, Ian M. <120> PLAD Domain Peptides With Increased Serum Half Life Due To Conjugation To Domain Antibodies <130> 3440.1002-006 <140> PCT/GB2005/004603 <141> 2005-12-01 <150> US 60/632,361 <151> 2004-12-02 <150> PCT/GB2005/002163 <151> 2005-05-31 <150> PCT/GB2005/004319 <151> 2005-11-10 <160> 108 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Tyr His 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ile Gln Thr Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Arg Met Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Met Gln Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Gly Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Leu Gln Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Arg Gln 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly 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Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Phe Ser Lys Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Ala Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gln Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ala Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 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Arg 100 105 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Leu Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Asn Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp 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Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Thr Ser Met Leu Pro Met Lys Gly Lys Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr His Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asn Pro Ser Tyr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 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Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser 1 5 10 15 Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn 20 25 30 Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro 35 40 45 Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp 50 55 60 <210> 91 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD domain LTbetaR <400> 91 Cys Arg Asp Gln Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys 1 5 10 15 Cys Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg 20 25 30 Ile Arg Asp Thr Val Cys 35 <210> 92 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD domain CD40 <400> 92 Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys 1 5 10 15 Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr 20 25 30 Glu Cys <210> 93 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD domain CD30 <400> 93 Cys His Gly Asn Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys 1 5 10 15 Cys Tyr Arg Cys Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln 20 25 30 Arg Pro Thr Asp Cys Arg Lys Gln Cys 35 40 <210> 94 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD domain CD27 <400> 94 Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val Gly Leu Ser Ala Thr Pro 1 5 10 15 Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly Lys Leu 20 25 30 Cys Cys Gln Met 35 <210> 95 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD domain HVEM <400> 95 Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys 1 5 10 15 Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr 20 25 30 Val Cys <210> 96 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD domain OX40 <400> 96 Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val Gly Asp 20 25 30 Thr Tyr <210> 97 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLAD domain DR4 <400> 97 Ala Thr Ile Lys Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu 1 5 10 15 His Ser Pro Leu Gly Glu Leu Cys Pro Pro Gly Ser His Arg 20 25 30 <210> 98 <211> 159 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 98 ctggtccctc acctagggga cagggagaag agagatagtg tgtgtcccca aggaaaatat 60 atccaccctc aaaataattc gatttgctgt accaagtgcc acaaaggaac ctacttgtac 120 aatgactgtc caggcccggg gcaggatacg gactgcagg 159 <210> 99 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgg aattcccctt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgtataggg tgcctcctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker <400> 100 Thr Val Ala Ala Pro Ser 1 5 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 gcggataaca atttcacaca gga 23 <210> 102 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 atctcgagaa aagagaggct gaagcagaca tccagatgac ccagtctc 48 <210> 103 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 atctcgagaa aagagacatc cagatgaccc agtctc 36 <210> 104 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 ccggatccac cggcgacatc cagatgaccc agtctc 36 <210> 105 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 gagggaccag agatggagca gcgacggtcc gtttgatttc caccttggtc cc 52 <210> 106 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 aaacggaccg tcgctgctcc atctctggtc cctcacctag gggacag 47 <210> 107 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 cgacagggag cggccgctca ttacctgcag tccgtatcct gcccc 45 <210> 108 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 acagaagctt atcacctgca gtccgtatcc tgcccc 36

Claims (35)

  1. X' 및 Y' 부분(moiety)을 포함하는 약물 융합체로서,
    여기서 X'은 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체이고;
    Y'은 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에 대하여 결합 특이성을 나타내는 결합 부위를 가지는 폴리펩티드 결합 부분인 약물 융합체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 부분이 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가짐을 특징으로 하는 약물 융합체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 부분이 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 항원-결합 단편인 약물 융합체.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체가 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, 및 DR4의 PLAD 도메인들 중에서 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 동일한 10개이상의 연속하는 아미노산으로 이루어진 지역을 포함하는 약물 융합체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, 및 DR4 의 PLAD 도메인들 중에서 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 가짐을 특징으로 하는 약물 융합체.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 서열번호:87, 서열번호:88, 서열번호:89, 서열번호 90, 서열번호;91, 서열번호:92, 서열번호:93, 서열번호:94, 서열번호:95, 서열번호:96, 및 서열번호:97으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 약 90%이상의 서열 동일성을 가짐을 특징으로 하는 약물 융합체.
  7. X' 및 Y' 부분(moiety)을 포함하는 약물 융합체로서,
    여기서 X'은 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체이고;
    Y'은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 또는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인인 약물 융합체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 X'이 Y'의 아미노 말단에 위치함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 Y'이 X'의 아미노 말단에 위치함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가짐을 특징으로 하는 약물 융합체.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 Y'이 서열번호: 10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 Y'이 서열번호:16, 서열번호:17, SEQ JD NO: 18, 서열번호; 19, SEQ JD NO:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 융합체.
  13. 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체는 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, 및 DR4의 PLAD 도메인들 중에서 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 동일한 10개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어진 지역을 포함하는 약물 융합체.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, 및 DR4의 PLAD 도메인들 중에서 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 가짐을 특징으로 하는 약물 융합체.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 서열번호:87, 서열번호:88, 서열번호:89, 서열번호:90, 서열번호:91, 서열번호:92, 서열번호:93, 서열번호:94, 서열번호:95, 서열번호:96, 및 서열번호:97으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 약 90%이상의 아미노산 서열 동일성을 가짐을 특징으로 하는 약물 융합체.
  16. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 또는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 및
    상기 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 또는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 공유적으로 결합된 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 약물 컨주게이트.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체가 링커 부분을 통해 상기 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 또는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 공유적으로 결합되는 약물 컨주게이트.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 또는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호: 12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 서열번호:26, 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 약물 컨주게이트.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인은 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, 및 DR4의 PLAD 도메인들 중에서 선택된 어느 한 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 동일한 10개 이상의 연속하는 아미노산으로 이루어진 지역을 포함하는 약물 컨주게이트.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 TNFR1, TNFR2, FAS, LT βR, CD40, CD30, CD27, HVEM, OX40, 및 DR4의 PLAD 도메인들 중에서 선택된 PLAD 도메인의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 가짐을 특징으로 하는 약물 컨주게이트.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 서열번호:87, 서열번호:88, 서열번호:89, 서열번호:90, 서열번 호:91, 서열번호:92, 서열번호:93, 서열번호:94, 서열번호:95, 서열번호:96, 및 서열번호:97로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 약 90% 이상의 서열 동일성을 가짐을 특징으로 하는 약물 컨주게이트.
  22. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 약물 융합체를 엔코딩하는 분리 또는 재조합된 핵산.
  23. 제 22항의 재조합 핵산을 포함하는 핵산 컨스트럭트.
  24. 제 22항의 재조합 핵산 또는 제 23항의 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제 24항의 숙주 세포를 상기 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 유지하고, 이로써 약물 융합체가 생산되는 것을 포함하는 약물 융합체 생산 방법.
  26. 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 약물 융합체 또는 약물 컨주게이트 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 염증성 질환(inflammatory disease)을 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 방법으로써, 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체를 치료적으로 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 염증성 질환이 관절염인 방법.
  29. 치료, 진단 또는 예방에 있어서의 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체의 용도.
  30. 염증성 질환의 치료를 위한 약제(medicament) 제조에 있어서의 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체의 용도.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 염증성 질환이 관절염인 용도.
  32. 폐 염증 또는 호흡기 질환 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 약물 컨주게이트 또는 약물 융합체의 용도.
  33. 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드 결합 부분에 결합된 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 약물 조성물로서, 상기 약물 조성물은 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체에 비해 생체내에서 더 긴 혈청 반감기를 가지고, 상기 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체의 활성의 약 90% 이상을 가지는 약물 조성물.
  34. 제 1 부분(moiety) 및 제 2 부분(moiety)을 포함하는 약물 융합체로서, 상기 제 1 부분은 PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체이고 상기 제 2부분은 생체내에서의 혈청 반감기를 연장시키는 폴리펩티드인 약물 융합체.
  35. 생체내에서 혈청 반감기를 신장시키는 폴리펩티드에 결합된(conjugated) PLAD 도메인 또는 PLAD 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 약물 컨주게이트.
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