ES2873248T3

ES2873248T3 - Métodos para tratar la enfermedad de Alzheimer

Info

Publication number: ES2873248T3
Application number: ES15706100T
Authority: ES
Inventors: Robert Graham
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-02-08
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2021-11-03
Anticipated expiration: 2035-02-06
Also published as: MX2020010947A; JP2022036946A; JP2020090497A; IL247085A0; KR102476641B1; RU2016132162A; KR20160113722A; CN112826930A; EP3900738A1; MX2016010237A; TW202140070A; TWI785472B; CN106456729A; JP2017507130A; BR112016018205A8; RU2020111676A; US20170369559A9; MX388168B; TWI769970B; AU2015213741A1

Abstract

Un anticuerpo anti-beta amiloide (Aβ) monoclonal humanizado para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un paciente que padece EA leve a moderada, caracterizado por una puntuación MMSE de entre 18 y 26, comprendiendo el método detectar en una muestra del paciente la presencia o ausencia de un alelo CLUSTERIN que tiene una T en un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs 1532278 y administrar un anticuerpo anti-beta amiloide (Aβ) monoclonal humanizado en una cantidad eficaz para tratar la EA en pacientes que tienen al menos un alelo CLUSTERIN que comprende una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278, en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Aβ) es crenezumab.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para tratar la enfermedad de Alzheimer

Campo

Se proporcionan usos médicos para el tratamiento de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer de leve a moderada utilizando anticuerpos que se dirigen a p amiloide. También se proporcionan métodos para seleccionar o identificar pacientes para el tratamiento con anticuerpos que se dirigen a p amiloide. Los métodos incluyen el uso de biomarcadores pronósticos y/o predictivos.

Antecedentes

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia, que afecta a aproximadamente 4,5 millones de personas en los Estados Unidos y 26,6 millones en todo el mundo (Hebert et al, Arch. Neurol. 2003; 60:1119-22; Brookmeyer et al., Alzheimers Dement. 2007; 3:186-91). La enfermedad se caracteriza patológicamente por la acumulación de placas extracelulares de p-amiloide ("Ap") y ovillos neurofibrilares intracelulares en el cerebro. El diagnóstico se realiza mediante la evaluación clínica de los signos y síntomas neurológicos y neuropsiquiátricos de la EA y la exclusión de otras causas de demencia. La EA se clasifica comúnmente en estadios leve, moderado y grave mediante un breve examen de exploración cognitiva, el mini examen del estado mental (MMSE, por sus siglas en inglés). Las terapias médicas aprobadas que inhiben la actividad de la acetilcolinesterasa ("AChE") o antagonizan los receptores de N-metil-D-aspartato en el cerebro pueden mejorar temporalmente los síntomas de la EA en algunos pacientes, pero no modifican la progresión de la enfermedad (Cummings, N. Engl J. Med. 2004; 351:56-67).

Los factores genéticos en la EA familiar de aparición temprana y tardía están ahora bien documentados. El alelo ApoE4 está fuertemente asociado con la EA familiar y esporádica de aparición tardía, con una frecuencia de alelos notificada del 50 % -65 % en pacientes con EA, que es aproximadamente tres veces mayor que en la población general y para otros trastornos neurológicos (Saunders et al., Neurology 1993; 43:1467-72; Prekumar et al., Am. J. Pathol. 1996; 148:2083-95). Además de en la EA, el alelo ApoE4 se ha relacionado con otros trastornos con formación de amiloides, incluyendo la angiopatía amiloide cerebral ("CAA, por sus siglas en inglés") (Prekumar et al., Am. J. Pathol. 1996; 148:2083-95). Por lo tanto, los pacientes que portan el alelo ApoE4 pueden representar una población etiológicamente distinta de los pacientes con EA.

El depósito de placas de amiloides extracelulares en el cerebro es un hallazgo de un rasgo distintivo patológico en la EA, reportado por primera vez por Alois Alzheimer en 1906. Estas placas de amiloides se componen principalmente de péptidos Abeta (Haass y Selkoe, Nature 2007; 8:656-67) generados por la escisión secuencial de la proteína precursora amiloide ("APP, por sus siglas en inglés") a través de la actividad p y Y-secretasa. Abeta, particularmente en sus formas oligomerizadas, es tóxico para las neuronas y se cree que es el causante de la EA. Las terapias que reducen los niveles de Abeta en el cerebro pueden aliviar la disfunción cognitiva y bloquear una pérdida sináptica adicional, degeneración de axones y muerte de células neuronales. Abeta puede transportarse activamente a través de la barrera hematoencefálica (Deane et al., Stroke 2004; 35(Suppl I):2628-31). En modelos murinos de EA, el suministro sistémico de anticuerpos contra Abeta aumenta los niveles de Abeta en plasma mientras reduce los niveles en el sistema nervioso central (SNC) a través de varios mecanismos propuestos, incluyendo la disolución de la placa de Abeta cerebral, la eliminación fagocítica de Abeta opsonizado y, finalmente, a través de la salida de Abeta del cerebro como resultado de un cambio de equilibrio de Abeta resultante de los anticuerpos circulantes (Morgan, Neurodegener. Dis. 2005; 2:261-6).

Los fracasos importantes han marcado la formulación de anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de la EA. Los ensayos clínicos de fase tres a gran escala de bapineuzumab, un anticuerpo que se une específicamente a la porción aminoterminal de Abeta, se detuvieron cuando la administración del fármaco no logró detener el declive cognitivo en los pacientes tratados (Miles et al., Scientific Reports 2013; 3:1-4, comunicado de prensa de Johnston & Johnson del 6 de agosto de 2012, titulado "Johnson & Johnson Announces Discontinuation of Phase 3 Development of Bapineuzumab Intravenous (IV) in Mild-To-Moderate Alzheimer's Disease"). De forma notable, el bapineuzumab pareció estabilizar los niveles de placas y disminuir los niveles de tau fosforilada en el líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que la modificación de estos biomarcadores por sí sola no necesariamente predice la eficacia clínica (Miles et al., Scientific Reports 2013; 3:1-4). De manera similar, en ensayos clínicos de fase tres de solanezumab, un anticuerpo específico para Abeta monomérico que se une en la porción media del péptido, no se cumplieron los criterios de valoración cognitivos y funcionales primarios (comunicado de prensa de Eli Lilly and Company con fecha del 24 de agosto de 2012, "Eli Lilly and Company Aanounces Top-Line Results on Solanezumab Phase 3 Clinical Trials in Patients with Alzheimer's Disease"). También se han planteado preocupaciones sobre la seguridad durante la investigación de determinadas inmunoterapias para la EA; por ejemplo, la incidencia de anomalías de imagen relacionadas con amiloide (ARIA-E y ARIA-H) fue superior al 20 % entre los pacientes tratados con fármacos en los ensayos clínicos de fase dos de bapineuzumab (Sperling et al., The Lancet 2012; 11:241-249). Se estima que una de cada nueve personas mayores de 65 años tiene EA: los costes anuales añadidos de atención médica, la atención a largo plazo y los cuidados paliativos por y en nombre de las personas que padecen EA superan los 200 mil millones de dólares en 2013, y se estima que aumentarán a 1,2 millones de millones de dólares para 2050 (por y en nombre de las personas afectadas) (Alzheimer's Association 2013 Alzheimer's Disease Facts and Figures, Alzheimer's and Dementia 9:2). La EA es la sexta causa principal de muerte en los Estados Unidos a partir de 2013 (id.). Las terapias aprobadas actualmente tratan solamente algunos de los síntomas de la EA y no la degeneración subyacente. Existe una tremenda necesidad insatisfecha de un tratamiento modificador de la enfermedad para la EA y de herramientas que ayuden a la identificación de los pacientes que probablemente respondan a la terapia modificadora de la enfermedad para la EA.

Sumario

Crenezumab (también conocido como MABT5102A) es un anticuerpo IgG4 completamente monoclonal humanizado contra Abeta seleccionado por su capacidad para unirse a formas monoméricas y oligoméricas de Abeta. in vitro. Crenezumab se une tanto a Abeta1-40 como a Abeta 1-42, inhibe la agregación de Abeta y promueve la desagregación de Abeta. Debido a que crenezumab es un anticuerpo de cadena principal de IgG4 humana, tiene una afinidad de unión al receptor ^{F c y}reducida ("FcAR") en comparación con IgG1 o IgG2 humanas, que es predictivo de una respuesta efectora inmunitaria reducida. Estas propiedades, combinadas con la capacidad del crenezumab suministrado sistémicamente para disminuir los niveles en el SNC de Abeta en un modelo murino de EA, han sugerido que este enfoque terapéutico anti-Abeta puede ofrecer eficacia clínica al tiempo que reduce el riesgo de toxicidad, y podría potencialmente se capaz de modificar la progresión de la enfermedad de la EA con un riesgo menor de efectos secundarios potencialmente nocivos, tal como edema o hemorragias vasogénicas cerebrales, que se había visto previamente en los ensayos clínicos de otras terapias con anticuerpos contra Abeta.

Los resultados de los estudios clínicos de fase dos en pacientes con EA descritos en el presente documento demuestran que crenezumab de hecho retarda la progresión de la enfermedad en la EA leve a moderada, tiene un efecto aún más fuerte en pacientes ApoE4 positivos y en pacientes que padecen EA leve y muestra el mayor beneficio terapéutico en pacientes con EA más leve. Asimismo, el efecto se observa en pacientes que tienen una carga de amiloide cerebral que se observa normalmente en pacientes diagnosticados con EA. De manera adicional, los resultados demuestran que estos efectos se producen sin una incidencia significativa de eventos adversos tal como ARIA-E y ARIA-H. Por tanto, esta solicitud proporciona métodos para el tratamiento y monitorización de pacientes diagnosticados con EA leve a moderada, especialmente pacientes con EA leve y ApoE4 positivos, así como pacientes que tienen acumulación de amiloide cerebral que se observa normalmente en pacientes diagnosticados con ^{E a .}Como se ejemplifica en el presente documento, ahora se ha descubierto que un anticuerpo anti-beta amiloide monoclonal humanizado con un epítopo conformacional específico para la región media del péptido beta amiloide (Ap) (es decir,, dentro de los aminoácidos 13-24, tal como crenezumab) es eficaz para tratar la ^{e A}leve a moderada, especialmente en pacientes ApoE4 positivos y pacientes con formas más leves de EA, tal como, pero sin limitación, EA leve, sin una mayor incidencia de ARIA-E o ARIA-H. Por consiguiente, esta solicitud proporciona agentes terapéuticos para modular la gravedad de la EA y métodos mejorados de uso de los mismos.

Por consiguiente, la presente solicitud proporciona un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un paciente que padece EA leve a moderada caracterizada por una puntuación MMSE entre 18 y 26, comprendiendo el método detectar en una muestra del paciente la presencia o ausencia de un alelo CLUSTERIN que tiene una T en un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs 1532278 y administrar un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado en una cantidad eficaz para tratar la EA en pacientes que tienen al menos un alelo CLUSTERIN que comprende una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rsl532278, en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

Crenezumab

comprende seis regiones hipervariables (HVR, por sus siglas en inglés) en donde HVR-H1 es la SEQ ID NO: 2, HVR-H2 es la SEQ ID NO:3, HVR-H3 es la SEQ ID NO:4, HVR-L1 es la SEQ ID NO:6, HVR-L2 es la SEQ ID NO: 7 y HVR-L3 es la SEQ ID NO: 8 y

comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, que comprende una región variable de cadena pesada y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, que comprende una región variable de cadena ligera.

Los usos y métodos médicos proporcionados en el presente documento se pueden aplicar a pacientes que padecen EA u otra amiloidosis, como se describe adicionalmente en el presente documento. Los pacientes adecuados incluyen pacientes que padecen EA leve a moderada, pacientes con una puntuación MMSE de 18 a 26, pacientes que padecen EA leve, pacientes con una puntuación MMSE de 20 o superior (p. ej., 20-30, 20-26, 24-30, 21-26, 22-26, 22-28, 23 26, 24-26 o 25-26), pacientes que padecen EA temprana (incluidos pacientes con deterioro cognitivo leve debido a EA y pacientes con EA preclínica), pacientes amiloide positivos (o pacientes con carga de amiloide cerebral consistente con la observada en pacientes diagnosticados con ^{E a )}y pacientes ApoE4 positivos que padecen EA leve a moderada o leve.

En algunos aspectos, los usos médicos proporcionados en el presente documento son para reducir el declive debido a la EA en pacientes que padecen EA leve o leve a moderada temprana. En algunas realizaciones, el declive es uno o más de: declive clínico, declive cognitivo y declive funcional. En algunas realizaciones, el declive es declive clínico. En algunas realizaciones, el declive es un declive en la capacidad cognitiva o declive cognitivo. En algunas realizaciones, el declive comprende un declive de la capacidad funcional o un declive funcional. Se han creado varias pruebas y escalas para medir la capacidad (incluida la memoria) y/o la función cognitivas. En diversas realizaciones, una o más pruebas se utilizan para medir el declive clínico, funcional o cognitivo. Una medida convencional de la capacidad cognitiva es la prueba cognitiva de la escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer (ADAS-Cog), por ejemplo, el ADAS-Cog de 12 puntos o ADAS-Cog12. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la reducción o ralentización del declive de la capacidad cognitiva (o declive cognitivo) en pacientes que se están tratando con los anticuerpos de la invención se determina utilizando la prueba ADAS-Cog12. Un aumento en la puntuación ADAS-Cog12 es indicativo de un empeoramiento del estado de un paciente. En algunas realizaciones, la reducción o ralentización del declive cognitivo (o declive de la capacidad cognitiva) en pacientes que se están tratando con los anticuerpos de la invención se determina mediante una puntuación de la escala de calificación clínica de demencia/suma de casillas (CDR-SOB, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, la reducción o ralentización del declive funcional (o declive de la capacidad funcional) en pacientes que se están tratando con los anticuerpos de la invención se determina usando la escala de actividades instrumentales de la vida diaria (o iADL, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, se evalúa el declive de uno o más tipos y se usa una o más de las pruebas o escalas anteriores para medir la reducción o la ralentización del declive.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención se administra a una dosis que es eficaz para tratar la EA u otra amiloidosis, como se describe en el presente documento. Las dosis adecuadas se describen en el presente documento y pueden variar entre aproximadamente 0,3 mg/kg y 100mg/kg. En una realización ilustrativa, la dosis es de 15 mg/kg. En una realización ilustrativa adicional, la dosis es de 30 mg/kg. En una realización ilustrativa adicional, la dosis es de 45 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis está entre 500 mg y 1000 mg, por ejemplo, 500 mg, 700 mg, 720 mg, 750 mg, 800 mg, 820 mg, 900 mg o entre 1000 mg y 2500 mg, por ejemplo, 1050 mg, 1500 mg, o 2100 mg. En los métodos proporcionados en el presente documento, se contemplan varias pautas posológicas que incluyen pautas posológicas en las que el anticuerpo se administra de manera repetida, p. ej., en una pauta semanal o mensual, durante un periodo de tiempo prolongado, p. ej., de meses a años.

El anticuerpo anti-Abeta monoclonal humanizado de la presente divulgación proporciona un beneficio adicional porque no aumenta la incidencia de eventos adversos tales como ARIA-E y ARIA-H. Como se muestra en el presente documento, no hubo un aumento en estos eventos adversos en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de placebo. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona además métodos para tratar pacientes que padecen ^{E a}leve a moderada o EA leve sin aumentar la incidencia de eventos adversos tales como ARIA-E y/o ARIA-H.

Los análisis exploratorios de variantes genéticas revelaron la asociación entre un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) en el gen Clusterin (CLU o CLUSTERIN) y un efecto del tratamiento. Como se muestra en el presente documento, crenezumab tuvo un mayor efecto de tratamiento en comparación con placebo en pacientes que portaban al menos un alelo CLU con una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278 en comparación con los pacientes sin alelos CLU que tenían una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278. El efecto se observó en pacientes con EA leve y en pacientes ApoE4 positivos.

En algunas realizaciones, el alelo CLUSTERIN está en desequilibrio de unión con rs1532278. En algunas realizaciones, el alelo equivalente comprende un SNP en desequilibrio de unión con rs1532278. En algunas realizaciones, el desequilibrio de unión es una medida D' o una medida r2. En algunas realizaciones, la medida D' entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,60. En algunas realizaciones, la medida D' entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,70, 0,80 o 0,90. En algunas realizaciones, la medida D' entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es 1,0. En algunas realizaciones, la medida r2 entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,60. En algunas realizaciones, la medida r2 entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,70, 0,80 o 0,90. En algunas realizaciones, la medida r2 entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es 1,0.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención se administra a una dosis que es eficaz para tratar la EA u otra amiloidosis, como se describe en el presente documento. Las dosis adecuadas se describen en el presente documento y pueden variar entre aproximadamente 0,3 mg/kg y 100 mg/kg. En una realización ilustrativa, la dosis es de 15 mg/kg. En una realización ilustrativa adicional, la dosis es de 30 mg/kg. En una realización ilustrativa adicional, la dosis es de 45 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis está entre 500 mg y 1000 mg, por ejemplo, 500 mg, 700 mg, 720 mg, 750 mg, 800 mg, 820 mg, 900 mg o entre 1000 mg y 2500 mg, por ejemplo, 1050 mg, 1500 mg, o 2100 mg. En los métodos proporcionados en el presente documento, se contemplan varias pautas posológicas que incluyen pautas posológicas en las que el anticuerpo se administra de manera repetida, p. ej., en una pauta semanal o mensual, durante un periodo de tiempo prolongado, p. ej., de meses a años.

La presente invención también proporciona un método para identificar a un paciente que padece EA leve a moderada caracterizado por una puntuación MMSE entre 18 y 26 como con mayor probabilidad de responder al tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado que comprende detectar en una muestra del paciente, la presencia de un alelo CLUSTERIN que comprende un polimorfismo predictivo de una respuesta al tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden detectar en una muestra del paciente la presencia o ausencia de un alelo CLUSTERIN que tiene una T en un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278. En algunas realizaciones, los métodos de identificación de un paciente comprenden detectar en una muestra del paciente la presencia de un alelo CLUSTERIN que comprende un polimorfismo predictivo de una respuesta al tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado. En algunas realizaciones, los métodos comprenden seleccionar a un paciente como con mayor probabilidad de responder a dicho tratamiento cuando está presente una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278 en una muestra del paciente.

Crenezumab

comprende seis regiones hipervariables (HVR) en donde HVR-H1 es la SEQ ID NO: 2, HVR-H2 es la SEQ ID NO:3, HVR-H3 es la SEQ ID NO:4, HVR-L1 es la SEQ ID NO:6, HVR-L2 es la SEQ ID NO: 7 y HVR-L3 es la SEQ ID NO: 8 y

comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, que comprende una región variable de cadena pesada y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, que comprende una región variable de cadena ligera. En un ejemplo específico, el anticuerpo es crenezumab.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para predecir si un individuo que padece EA leve a moderada caracterizada por una puntuación MMSE entre 18 y 26 tiene probabilidades de responder al tratamiento que comprende un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado que comprende:

(a) determinar la identidad de un nucleótido en el SNP rsl532278 en una muestra del individuo; y

(b) predecir una mayor probabilidad de responder al tratamiento que comprende el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, cuando la muestra contiene al menos un alelo con un nucleótido T en el SNP rsl532278;

en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar la identidad de un nucleótido en el SNP rs1532278 en una muestra del individuo y predecir una mayor probabilidad de responder al tratamiento que comprende un anticuerpo anti-Abeta o un fragmento de unión a antígeno del mismo, cuando la muestra contiene al menos un alelo con un nucleótido T en el SNP rs1532278

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la probabilidad de que un paciente que padece EA leve a moderada caracterizada por una puntuación MMSE entre 18 y 26 se beneficie del tratamiento que comprende anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, comprendiendo el método: determinar el genotipo del paciente en una muestra obtenida del paciente, en donde el paciente que tiene al menos un alelo CLUSTERIN con un nucleótido T en el SNP rsl532278 tiene mayor probabilidad de responder al tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado que un paciente que no tiene alelos con un nucleótido T en el SNP rsl532278, en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

Crenezumab es un anticuerpo que

comprende seis regiones hipervariables (HVR) en donde HVR-H1 es la SEQ ID NO: 2, HVR-H2 es la SEQ ID NO:3, HVR-H3 es la SEQ ID NO:4, HVR-L1 es la SEQ ID NO:6, HVR-L2 es la SEQ ID NO: 7 y HVR-L3 es la SEQ ID NO: 8 o que

Los métodos proporcionados en el presente documento comprenden detectar la presencia y/o determinar la identidad, de un alelo CLUSTERIN. En algunas realizaciones, la presencia de un alelo CLUSTERIN en un individuo comprende determinar la identidad del nucleótido en el polimorfismo del ácido nucleico proporcionado a partir de una muestra de un individuo. En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico comprende ADN. En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico comprende ARN. En algunas realizaciones, se amplifica la muestra de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico se amplifica mediante una reacción en cadena de la polimerasa. En algunas realizaciones, el polimorfismo se detecta mediante secuenciación o reacción en cadena de la polimerasa. En algunas realizaciones, el polimorfismo se detecta mediante la amplificación de una región diana que contiene al menos un polimorfismo y la hibridación con al menos un oligonucleótido específico de secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con al menos un polimorfismo y detectando la hibridación. En algunas realizaciones, el polimorfismo se detecta mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en sonda de barrido y secuenciación de ADN por nanoporos, pirosecuenciación, electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE, por sus siglas en inglés), electroforesis con gradiente de temperatura temporal (TTGE, por sus siglas en inglés), electroforesis en gel de poliacrilamida de Zn(II)-cicleno, análisis de polimorfismo de un solo nucleótido fluorescente homogéneo basado en PCR, electroforesis en gel de poliacrilamida con afinidad por fosfato, plataformas de genotipificación de SNP de alto rendimiento, balizas moleculares, reacción con 5' nucleasa, ensayo con Taqman, MassArray (extensión de cebador de una sola base acoplada con desorción/ionización láser asistida por matriz y espectrometría de masas de tiempo de vuelo), etiquetas de masa de tritilo, plataformas de genotipificación (tal como Invader Assay®), ensayos de extensión de cebador de una sola base (SBE, por sus siglas en inglés), amplificación por PCR (por ejemplo, amplificación por PCR sobre nanopartículas magnéticas (MNP, por sus siglas en inglés), análisis de enzimas de restricción de productos de PCR (métodos RFLP), PCR específica de alelo, extensión de cebadores múltiples (MPEX, por sus siglas en inglés) y amplificación inteligente isotérmica. En algunas realizaciones, la identidad del nucleótido en el polimorfismo en un paciente se determina a través de genotipificación. En algunas realizaciones, la genotipificación se realiza mediante análisis por PCR, análisis de secuencia o análisis LCR.

Se proporcionan muestras adecuadas para llevar a cabo los métodos divulgados en el presente documento. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la muestra es cualquier muestra biológica de la que se pueda aislar el ADN genómico, por ejemplo, pero sin limitación, una muestra de tejido, una muestra de saliva, una muestra de hisopo de mejilla, sangre u otros fluidos biológicos que contienen ADN genómico. En algunas realizaciones, la muestra comprende ADN. En algunas realizaciones, la muestra comprende ARN.

También se describen formulaciones farmacéuticas adecuadas para su uso en los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento. Las formulaciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier vía de administración conveniente, p. ej., inyección parenteral o intravenosa, y normalmente incluirá, además del anti-Abeta de la presente divulgación, uno o más transportadores, excipientes y/o diluyentes adecuados al modo de administración deseado. En algunos casos, se puede formular un anticuerpo de la invención para administración intravenosa. En algunos casos, un anticuerpo de la invención puede formularse en un tampón de arginina, p. ej., un tampón de succinato de arginina. El tampón puede contener uno o más tensioactivos, p. ej., un polisorbato. En determinadas realizaciones, la concentración de tampón es 50 mM o mayor. En algunas realizaciones, el pH está entre 4,5 y 7,0, p. ej., pH 5,5. En el presente documento se describen realizaciones adicionales. Las formulaciones farmacéuticas se pueden envasar en formas de dosificación unitaria para facilitar su uso.

El tratamiento con anticuerpos anti-Abeta para el tratamiento de la EA u otra amiloidosis, como se describe en el presente documento, se puede combinar con otras terapias, incluyendo uno o más anticuerpos anti-Abeta distintos de crenezumab. Ejemplos no limitantes de otras terapias incluyen fármacos neurológicos, corticoesteroides, antibióticos y agentes antivíricos. Ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-Abeta distintos de crenezumab incluyen solanezumab, bapineuzumab, aducanumab y gantenerumab.

También se describen en el presente documento kits para determinar la presencia de un alelo CLUSTERIN. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un kit para determinar la presencia de al menos un polimorfismo en una muestra biológica, que comprende reactivos e instrucciones para detectar la presencia de al menos un polimorfismo en CLUSTERIN, en donde el polimorfismo es un alelo que comprende el SNP rs1532278. Los reactivos y métodos de uso del kit se describen con más detalle en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos de Abeta (1-42) (SEQ ID NO: 1) con los aminoácidos 13 a 24 subrayados.

La figura 2 proporciona la secuencia de aminoácidos de tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, respectivamente) y la secuencia de aminoácidos de tres regiones de cadena ligera (HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, respectivamente ).

La figura 3 proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (SEQ ID NO: 5), que comprende la región variable de cadena pesada que abarca los aminoácidos 1 a 112 de la SEQ ID NO: 5, y la cadena ligera (SEQ ID NO: 9), que comprende la región variable de cadena ligera que abarca los aminoácidos 1 a 112 de la SEQ ID NO: 9, de crenezumab. El subrayado en las SEQ ID NO: 5 y 9 muestra las secuencias de aminoácidos de las tres cadenas pesadas HVR correspondientes a las SEQ ID NO: 2-4 y las tres cadenas ligeras HVR correspondientes a las SEQ ID NO: 6-8, respectivamente.

La figura 4A-B proporciona un sumario de los pacientes inscritos en el ensayo clínico descrito en el ejemplo 1, que tabula el número de pacientes inscritos en cada grupo (tratamiento frente a placebo), estado de ApoE4 (ApoE4 negativo/ApoE4 positivo), estadio de EA (leve o moderada) y puntuaciones MMSE en la exploración, existencia y tipo de terapia concurrente (uso conmed) para los síntomas de la EA.

La figura 5 proporciona un esquema de los ensayos clínicos descritos en el ejemplo 1, que muestra la pauta, cantidad y ruta de dosificación.

La figura 6A-B proporciona tablas de datos que muestran el cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 a las 73 semanas con respecto al valor inicial, en el grupo de tratamiento y en el grupo de placebo. La figura 6A proporciona datos para pacientes con EA leve a moderada, EA leve, EA moderada y ApoE4 positivos y negativos. La figura 6B proporciona datos para los pacientes según la puntuación MMSE.

La figura 7 proporciona un gráfico del cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 para los pacientes con EA leve que tienen una puntuación MMSE entre 20 y 26, tratados con crenezumab (línea continua oscura) o placebo (línea continua clara).

La figura 8 proporciona un gráfico del cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 para los pacientes con EA moderada que tienen una puntuación MMSE entre 18 y 26 tratados con crenezumab (línea continua oscura) o placebo (línea continua clara).

La figura 9 proporciona un gráfico del cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 para los pacientes ApoE4 positivos con eA leve a moderada tratados con crenezumab (línea continua oscura) o placebo (línea continua clara).

La figura 10 proporciona un gráfico del cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 en todos los pacientes ApoE4 positivos y pacientes con EA leve tratados con crenezumab (línea continua oscura) o placebo (línea continua clara). La figura 11 proporciona un gráfico del cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 para los pacientes con EA leve que tienen una puntuación MMSE entre 22 y 26, tratados con crenezumab o placebo.

La figura 12A-B proporciona tablas de datos que muestren el cambio en las puntuaciones de CDR-SOB a las 73 semanas con respecto al valor inicial, en el grupo de tratamiento y en el grupo de placebo. La figura 12A proporciona datos para el cambio en las puntuaciones de CDR-SOB para los pacientes según la puntuación MMSE. La figura 12B proporciona datos para las puntuaciones de CDR-SOB, así como puntuaciones de CDR de resolución de problemas y juicio y puntuaciones de CDR de memoria de para pacientes con puntuaciones de MMSE que oscilan entre 18-26, 20-26 y 22-26.

La figura 13 proporciona un gráfico del cambio en las puntuaciones de CDR-SOB para pacientes con EA leve, que tienen una puntuación MMSE de 25 o 26, tratados con crenezumab o placebo según se indique.

La figura 14A-B proporciona un sumario de los pacientes inscritos en el ensayo clínico descrito en el ejemplo 2 al inicio y después del tratamiento, incluidos los datos de eventos adversos (A) y una línea de tiempo que muestra cuándo se realizaron en el ensayo clínico las exploraciones PET, MRI y el muestreo de LCR (B).

La figura 15A-B proporciona gráficos que muestran los niveles de amiloide en pacientes que reciben placebo (línea discontinua) o crenezumab (línea continua), medido por obtención de imágenes de florbetapir mediante análisis PET (A) y niveles de Abeta en LCR en pacientes que reciben placebo o crenezumab (B).

La figura 16A-B proporciona gráficos de lado a lado que muestran el cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 de los pacientes con EA leve a moderada en el grupo de tratamiento o en el grupo de placebo. El gráfico (A) muestra pacientes que eran SNP negativos (es decir, pacientes sin ningún alelo del gen CLUSTERIN que lleva una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278) y el gráfico (B) muestra pacientes que eran SNP positivos (es decir, pacientes con al menos un alelo del gen CLUSTERIN que lleva una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278).

La figura 17A-B proporciona gráficos de lado a lado que muestran el cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 de los ApoE4 positivos pacientes con EA leve a moderada en el grupo de tratamiento o en el grupo de placebo. El gráfico (A) muestra pacientes que eran SNP negativos (es decir, pacientes sin ningún alelo del gen CLUSTERIN que lleva una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278) y el gráfico (B) muestra pacientes que eran SNP positivos (es decir, pacientes con al menos un alelo del gen CLUSTERIN que lleva una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278).

La figura 18A-B proporciona gráficos de lado a lado que muestran el cambio en las puntuaciones ADAS-Cog12 de los pacientes con EA leve en el grupo de tratamiento o en el grupo de placebo. El gráfico (A) muestra pacientes que eran SNP negativos (es decir, pacientes sin ningún alelo del gen CLUSTERIN que lleva una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278) y el gráfico (B) muestra pacientes que eran SNP positivos (es decir, pacientes con al menos un alelo del gen CLUSTERIN que lleva una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278).

Descripción detallada

A menos que definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Singleton et al.et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, Nueva York. 1994) y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed., John Wiley & Sons (Nueva York, Nueva York. 1992) proporcionan al experto en la materia una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

Algunas definiciones y abreviaturas

Con el fin de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y siempre que sea adecuado, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una/o", "el" y "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una proteína" o un "anticuerpo" incluye una pluralidad de proteínas o anticuerpos, respectivamente; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células y similares.

Los intervalos proporcionados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas incluyen ambos extremos y todos los puntos entre los extremos. Por lo tanto, por ejemplo, un intervalo de 2,0 a 3,0 incluye 2,0, 3,0 y todos los puntos entre 2,0 y 3,0.

La expresión "sustancialmente similar", o "sustancialmente el mismo", como se usa en el presente documento, indica un grado de similitud suficientemente elevado entre dos valores numéricos (normalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación), de tal forma que un experto en la materia podría considerar que la diferencia entre los dos valores tendría una significación biológica y/o estadística pequeña o nula en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia ente dichos dos valores es menor de aproximadamente un 50 %, menor de aproximadamente un 40 %, menor de aproximadamente un 30 %, menor de aproximadamente un 20 %, menor de aproximadamente un 10 % en función del valor del anticuerpo de referencia/comparación.

Las expresiones "muestra", o la expresión "muestra de prueba" como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que se obtiene o procede de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/o molecular distinta que se va a caracterizar y/o identificar, por ejemplo, basándose en sus características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. En una realización, la definición abarca muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico y muestras de tejido, tal como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células procedentes de los mismos. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido, tal como de un órgano fresco, congelado y/o conservado o una muestra de tejido o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente de la sangre; fluidos corporales; y células procedentes de cualquier momento de la gestación o desarrollo del sujeto o plasma. La expresión "muestra biológica", como se usa en el presente documento incluye, pero sin limitación, sangre, suero, plasma, esputo, biopsias de tejido (p. ej., muestras de pulmón) y muestras nasales que incluyen hisopos nasales o pólipos nasales.

Las expresiones "muestra", "muestras biológicas", o "muestra de prueba" incluyen muestras biológicas que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento respecto de determinados componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o embebido en una matriz semisólida o sólida con fines de seccionamiento. A efectos del presente documento, una "sección" de una muestra de tejido significa una sola parte o trozo de una muestra de tejido, por ejemplo, tal como una fina sección de tejido o células cortada de una muestra de tejido. Las muestras incluyen, pero sin limitación, sangre completa, células sanguíneas, suero, plasma, líquido linfático, líquido sinovial, extractos celulares y combinaciones de los mismos. En una realización, la muestra es una muestra clínica. En otra realización, la muestra se utiliza en un ensayo de diagnóstico.

En una realización, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes del tratamiento con un anticuerpo anti-Abeta. En otra realización, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente después de al menos un tratamiento con un anticuerpo anti-Abeta.

Una "muestra de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra, patrón o nivel que se usa con una finalidad comparativa. En una realización, una muestra de referencia se obtiene de una parte sana y/o no enferma del organismo (por ejemplo, tejido o células) del mismo sujeto o paciente. En otra realización, una muestra de referencia se obtiene de un tejido y/o célula no tratados del organismo del mismo sujeto o individuo. En otra realización más, se obtiene una muestra de referencia de una parte sana y/o no enferma del organismo (por ejemplo, tejidos o células) de un individuo que no es el sujeto o paciente. En otra realización adicional más, una muestra de referencia se obtiene de una parte de tejido y/o celular sin tratar del organismo de un individuo que no es el sujeto o paciente.

En determinadas realizaciones, una muestra de referencia se encuentra en una sola muestra o en una combinación de varias muestras del mismo sujeto o paciente que se obtienen en uno o más puntos de tiempo diferentes a cuando se obtuvo la muestra de ensayo. Por ejemplo, se obtiene una muestra de referencia en un punto de tiempo anterior del mismo sujeto o paciente que cuando se obtiene la muestra de prueba. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia incluye todos los tipos de muestras biológicas como se define anteriormente bajo el término "muestra" que se obtiene de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, se obtiene una muestra de referencia de uno o más individuos con amiloidosis, p. ej., enfermedad de Alzheimer, que no es el sujeto o paciente.

En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es una combinación de muestras múltiples de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es una combinación de muestras múltiples de uno o más individuos con una enfermedad o trastorno (p. ej., amiloidosis tal como, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es una agrupación de muestras de ARN de tejidos normales o una agrupación de muestras de plasma o suero de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente.

Se aísla una muestra de ácido nucleico de una muestra biológica obtenida de un sujeto. La muestra de ácido nucleico puede aislarse de una muestra biológica usando técnicas convencionales. La muestra de ácido nucleico puede usarse en un método para determinar la presencia de una variante polimórfica. La presencia o ausencia de una variante polimórfica se puede determinar usando uno o ambos complementos cromosómicos representados en la muestra de ácido nucleico. La determinación de la presencia o ausencia de la variante polimórfica en ambos complementos cromosómicos representados en la muestra de ácido nucleico es útil para determinar la cigosidad de un individuo para la variante polimórfica.

La expresión "molécula pequeña" se refiere a una molécula orgánica que tiene un peso molecular entre 50 Dalton y 2500 Dalton.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobuNna" ("Ig") se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos triespecíficos, anticuerpos tetraespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Dichos anticuerpos pueden ser quiméricos, humanizados, humanos, sintéticos y/o madurados por afinidad. Dichos anticuerpos y los métodos para generarlos se describen con más detalle en el presente documento.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden solamente una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción preferentemente conserva al menos una y normalmente la mayoría o la totalidad, de las funciones normalmente asociadas con esa porción cuando están presentes en un anticuerpo intacto. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, por lo tanto, conserva la capacidad de unirse al antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, conserva al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como unión a FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función de CCDA y unión al complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un grupo de unión a antígeno unido a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "diana" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína natural derivada de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. La expresión abarca diana sin procesar de "longitud completa" así como cualquier forma de diana que sea el resultado del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de dianas de origen natural, p. ej., variantes de corte y empalme o variantes alélicas.

Las expresiones "amiloide beta", "beta-amiloide", "Abeta", "amiloidep", y "Ap", utilizadas indistintamente en el presente documento, se refieren al fragmento de la proteína precursora de amiloide ("APP, por sus siglas en inglés") que se produce tras la escisión de la p-secretasa 1 ("BACE1, por sus siglas en inglés") de la APP, así como modificaciones, fragmentos y cualquier equivalente funcional de la misma, incluyendo, pero sin limitación, Ap1-40 y Ap1-42. Se sabe que Ap existe en forma monomérica, así como que se asocia para formar oligómeros y estructuras fibrilares, que se pueden encontrar como miembros constituyentes de la placa amiloide. La estructura y secuencias de tales péptidos Ap son bien conocidas por un experto en la materia y se describen métodos para producir dichos péptidos o para extraerlos del cerebro y otros tejidos, por ejemplo, en Glenner y Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129: 885-890 (1984). Por otra parte, los péptidos Ap también están disponibles comercialmente en diversas formas. Una secuencia de aminoácidos ilustrativa de Api-42 humano es DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAED VGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO:1).

Las expresiones "anticuerpo contra diana" y "un anticuerpo que se une a la diana" se refieren a un anticuerpo que puede unirse a la diana con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para direccionamiento a la diana. En una realización, el alcance de la unión de un anticuerpo contra diana a una proteína inespecífica, no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a la diana según se mide, p. ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) o un ensayo biacore. En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10‘8 M o menos, p. ej., de 1o_8 M a 10‘ 13 M), p. ej., de 10‘9 M a 10‘13 M). En determinadas realizaciones, un anticuerpo contra diana se une a un epítopo de una diana que se conserva entre diferentes especies.

"Inmunoglobulina anti-Abeta", "anticuerpo anti-abeta", y "anticuerpo que se une a Abeta" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a un anticuerpo que se une específicamente a Abeta humano. Un ejemplo no limitante de un anticuerpo anti-Abeta es crenezumab. Otros ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-Abeta son solanezumab, bapineuzumab, aducanumab y gantenerumab.

Los términos "crenezumab" y "MABT5102A" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un anticuerpo anti-Abeta específico que se une a formas monoméricas, oligoméricas y fibrilares de Abeta, y que se asocia con el número de registro CAS 1095207. En una realización, dicho anticuerpo comprende las secuencias de región HVR expuestas en la figura 2. En otra de dichas realizaciones, dicho anticuerpo comprende: (1) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; (2) una secuencia HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; (3) una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; (4) una secuencia HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; (5) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y (6) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En otra realización, el anticuerpo anti-Abeta específico comprende dominios VH y VL que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en la figura 3. En otra de dichas realizaciones, dicho anticuerpo anti-Abeta específico comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4. En otra de dichas realizaciones, el anticuerpo IgG4 comprende una mutación en su dominio constante de modo que la serina 228 es, en cambio, una prolina.

El término "amiloidosis", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de enfermedades y trastornos causados por o asociados con proteínas amiloides o similares a amiloides e incluye, pero sin limitación, enfermedades y trastornos causados por la presencia o actividad de proteínas similares a amiloide en estado monomérico, fibrilar, o polimérico, o cualquier combinación de los tres, incluso por placas amiloides. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitación, amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad, tal como enfermedades que incluyen, pero sin limitación, trastornos neurológicos tal como la enfermedad de Alzheimer ("EA"), enfermedades o afecciones caracterizadas por una pérdida de la capacidad de memoria cognitiva tal como, por ejemplo, deterioro cognitivo leve (MCI por sus siglas en inglés), demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés), el complejo párkinson-demencia de Guam y otras enfermedades que se basan o están asociadas con proteínas similares a amiloide, tal como la parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple, enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ELA (esclerosis lateral amiotrófica ), miositis por cuerpos de inclusión (IBM, por sus siglas en inglés), diabetes de inicio en la edad adulta, tumor endocrino y amiloidosis cardíaca senil, y diversas enfermedades oculares, incluida la degeneración macular, neuropatía óptica relacionada con drusas, glaucoma y cataratas debido al depósito de beta-amiloide.

El glaucoma es un grupo de enfermedades del nervio óptico que implica la pérdida de células ganglionares de la retina (RGC, por sus siglas en inglés) en un patrón característico de neuropatía óptica. Las RGC son las células nerviosas que transmiten señales visuales del ojo al cerebro. La Caspasa-3 y Caspasa-8, dos enzimas principales en el proceso apoptótico, se activan en el proceso que da lugar a la apoptosis de las RGC. La caspasa-3 escinde la proteína precursora amiloide (APP) para producir fragmentos neurotóxicos, incluyendo Abeta. Sin el efecto protector de la APP, la acumulación de Abeta en la capa de células ganglionares de la retina da como resultado la muerte de las RGC y la pérdida irreversible de la visión.

El glaucoma está, con frecuencia, pero no siempre, acompañado de un aumento de la presión ocular, que puede ser el resultado de un bloqueo de la circulación del humor acuoso o su drenaje. Aunque la presión intraocular elevada es un factor de riesgo significativo para la aparición de glaucoma, no se puede definir un umbral de presión intraocular que sería determinante para causar glaucoma. El daño también puede estar causado por un suministro de sangre deficiente a las fibras vitales del nervio óptico, una debilidad en la estructura del nervio y/o un problema en la salud de las propias fibras nerviosas. El glaucoma no tratado da lugar a un daño permanente del nervio óptico y la consiguiente pérdida del campo visual, que puede progresar a ceguera.

Los diferentes tipos de glaucomas se clasifican como glaucomas de ángulo abierto, si la afección es crónica o glaucomas de ángulo cerrado, si el glaucoma agudo se presenta repentinamente. El glaucoma suele afectar a ambos ojos, pero la enfermedad puede progresar más rápidamente en un ojo que en el otro.

Glaucoma crónico de ángulo abierto (COAG, por sus siglas en inglés), también conocido como glaucoma primario de ángulo abierto (POAG, por sus siglas en inglés), es el tipo más común de glaucoma. El COAG está causado por un bloqueo microscópico en la malla trabecular, lo que disminuye el drenaje del flujo de salida del humor acuoso hacia el canal de Schlemm y aumenta la presión intraocular (PIO). El POAG generalmente afecta a ambos ojos y está fuertemente asociado con la edad y antecedentes familiares positivos. Su frecuencia aumenta en las personas mayores ya que el mecanismo de drenaje ocular puede obstruirse gradualmente con el envejecimiento. El aumento de la presión intraocular en sujetos afectados por glaucoma crónico de ángulo abierto no se acompaña de ningún síntoma hasta que la pérdida se siente en el área visual central.

El glaucoma de ángulo cerrado agudo (AACG, por sus siglas en inglés) o glaucoma de ángulo cerrado es un tipo de glaucoma relativamente raro que se caracteriza por un aumento repentino de la presión intraocular de 35 a 80 mmHg, provocando dolor severo y pérdida irreversible de la visión. El aumento repentino de la presión se debe al cierre del ángulo de filtrado y al bloqueo de los canales de drenaje. Las personas con ángulos estrechos tienen un mayor riesgo de un cierre repentino del ángulo. El AACG generalmente se produce de manera monocular, pero el riesgo existe en ambos ojos. La edad, catarata y la pseudoexfoliación también son factores de riesgo, ya que están asociados con el agrandamiento del cristalino y el apiñamiento o estrechamiento del ángulo. Una crisis repentina de glaucoma puede estar asociada con dolor ocular intenso y dolor de cabeza, ojo inflamado, náuseas, vómitos y visión borrosa.

El glaucoma de mecanismo mixto o combinado es una mezcla o combinación de glaucoma de ángulo abierto y cerrado. Afecta a pacientes con ACG agudo cuyo ángulo se abre tras la iridotomía con láser, pero que continúan necesitando medicamentos para el control de la PIO, así como pacientes con GPAA o glaucoma pseudoexfoliativo que presentan gradualmente un estrechamiento del ángulo.

Glaucoma de tensión normal (NTG, por sus siglas en inglés), también conocido como glaucoma de baja tensión (LTG, por sus siglas en inglés), se caracteriza por daño progresivo del nervio óptico y pérdida de la visión periférica similar a la observada en otros tipos de glaucoma; sin embargo, la presión intraocular está dentro del intervalo normal o incluso por debajo de lo normal.

El glaucoma congénito (infantil) es un tipo hereditario de glaucoma de ángulo abierto relativamente raro. El desarrollo insuficiente del área de drenaje da como resultado un aumento de la presión en el ojo que puede provocar la pérdida de la visión por daño del nervio óptico y agrandamiento del ojo. El diagnóstico y el tratamiento tempranos son fundamentales para conservar la visión en bebés y niños afectados por la enfermedad.

El glaucoma secundario puede ser el resultado de una lesión ocular, inflamación en el iris del ojo (iritis), diabetes, cataratas o uso de esteroides en personas susceptibles a los esteroides. El glaucoma secundario también puede estar asociado con desprendimiento de retina o con oclusión o bloqueo de las venas de la retina.

El glaucoma pigmentario se caracteriza por el desprendimiento de gránulos de pigmento del iris. Los gránulos bloquean el sistema de drenaje del ojo, que da lugar a una presión intraocular elevada y daño al nervio óptico. El glaucoma exfoliativo (pseudoexfoliación) se caracteriza por depósitos de material escamoso en la cápsula anterior y en el ángulo del ojo. La acumulación de material escamoso bloquea el sistema de drenaje y aumenta la presión ocular.

El diagnóstico de glaucoma se puede realizar mediante varias pruebas. La tonometría determina la presión en el ojo midiendo el tono o firmeza de su superficie. Hay varios tipos de tonómetros disponibles para esta prueba, el más común es el tonómetro de aplanación. La paquimetría determina el grosor de la córnea que, a su vez, mide la presión intraocular. La gonioscopia permite examinar el ángulo de filtrado y el área de drenaje del ojo. La gonioscopia también puede determinar si los vasos sanguíneos anormales pueden estar bloqueando el drenaje del líquido acuoso fuera del ojo. La oftalmoscopia permite el examen del nervio óptico y puede detectar caída de la capa de fibra nerviosa o cambios en el disco óptico, o indentación (ahuecamiento) de esta estructura, que puede estar causada por un aumento de la presión intraocular o una caída axonal. La gonioscopia también es útil para evaluar el daño al nervio por flujo sanguíneo deficiente o aumento de la presión intraocular. Las pruebas de campo visual mapean el campo de visión, de forma subjetiva, que puede detectar signos de daño glaucomatoso en el nervio óptico. Esto está representado por patrones específicos de pérdida del campo visual. La tomografía de coherencia ocular, una medida objetiva de la pérdida de la capa de fibras nerviosas, se lleva a cabo observando el grosor de la capa de fibra del nervio óptico (alterada en el glaucoma) a través de un diferencial en la transmisión de luz a través del tejido axonal dañado.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en un 50 % o más y, por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un 50 % o más en un ensayo de competición. Se proporciona en el presente documento un ensayo de competición ilustrativo.

El término "biomarcador", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una molécula, incluyendo un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), proteína, estructura de carbohidrato o glucolípido, cuya expresión en o sobre un tejido o célula de mamífero puede detectarse mediante métodos convencionales (o métodos descritos en el presente documento) y es predictiva, diagnóstica y/o pronóstica de la sensibilidad de una célula o tejido de mamífero a los regímenes de tratamiento basados en la inhibición del complemento, por ejemplo, vía alternativa del complemento. Opcionalmente, un biomarcador de SNP se determina cuando un SNP (una entidad binaria) estratifica a un grupo de individuos que responden y que no responden. Por ejemplo, dado un SNP con dos nucleótidos, una G y una A en las que A es el alelo de riesgo, los portadores del alelo A (por ejemplo, individuos AA o GA) responden al tratamiento mientras que los individuos sin un alelo A (por ejemplo, individuos Gg ) no responden.

El "biomarcador predictivo", como se usa en el presente documento identifica una subpoblación de pacientes que tienen mayor probabilidad de responder a un tratamiento dado.

El "biomarcador de pronóstico", como se usa en el presente documento, es un marcador que indica el curso probable de la enfermedad en un individuo no tratado.

La expresión "polimorfismo de un solo nucleótido", también denominado en el presente documento "SNP", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustitución de una sola base dentro de una secuencia de ADN que da lugar a la variabilidad genética. Una posición de nucleótido en un genoma en la que es posible más de un tipo de base en una población se denomina, en el presente documento, "sitio polimórfico" o "polimorfismo". Un sitio polimórfico puede ser una secuencia de nucleótidos de uno o más nucleótidos, una secuencia de nucleótidos o nucleótidos insertados, una secuencia de nucleótidos o nucleótido eliminados o un microsatélite, por ejemplo. Un sitio polimórfico que tiene dos o más nucleótidos de longitud puede tener 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más, 20 o más, 30 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 500 o más o aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, donde todas o algunas de las secuencias de nucleótidos difieren dentro de la región. Un sitio polimórfico que tiene una longitud de un solo nucleótido se denomina en el presente documento SNP. Cuando hay dos, tres o cuatro secuencias de nucleótidos alternativas en un sitio polimórfico, cada secuencia de nucleótidos se denomina "variante polimórfica" o "variante de ácido nucleico". Cada posible variante de la secuencia de ADN se denomina "alelo". Donde existen dos variantes polimórficas, la variante polimórfica representada en la mayoría de las muestras de una población se denomina "alelo prevalente" o "alelo principal" y la variante polimórfica que es menos prevalente en la población se denomina "alelo poco común" o "alelo menor". Un individuo que porta dos alelos predominantes o dos alelos poco comunes es "homocigoto" con respecto al polimorfismo. Un individuo que porta un alelo prevalente y un alelo poco común es "heterocigoto" con respecto al polimorfismo. Con SNP C/G o A/T, los alelos son ambiguos y dependen de la cadena utilizada para extraer los datos de la plataforma de genotipificación. Con estos SNP C/G o A/T, el nucleótido C o G o el nucleótido A o T, respectivamente, puede ser un alelo de riesgo o un alelo protector y se determina mediante la correlación de frecuencias alélicas. Un alelo que se correlaciona con un mayor riesgo de una enfermedad o está asociado con una razón de probabilidades o riesgo relativo de > 1 se denomina "alelo de riesgo" o "alelo de efecto". El alelo de riesgo o el alelo de efecto puede ser el alelo menor o el alelo mayor. Un alelo que se correlaciona con una disminución del riesgo (o una mayor probabilidad de obtener un beneficio de la terapia) o que está asociado con una razón de probabilidades de < 1 se denomina "alelo protector". El alelo protector puede ser el alelo menor o mayor.

"Alelo equivalente" o "alelo sustituto", como se usa en el presente documento, se refiere a un alelo que se espera que se comporte de manera similar a un alelo publicado y se selecciona en función de las frecuencias alélicas y r2 alta (> 0,6) y/o D' alta (> 0,6) con los alelos publicados y/o SNP seleccionado como se define en el presente documento. En una realización, la r2 alta es > 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0. En una realización, la D' alta es > 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0.

"Desequilibrio de unión" o "LD "cuando se usa en el presente documento se refiere a alelos en diferentes locus que no están asociados al azar, es decir, no están asociados en proporción a sus frecuencias. Si los alelos están en desequilibrio de unión positivo, entonces los alelos se presentan juntos con más frecuencia de lo esperado asumiendo independencia estadística. Por el contrario, si los alelos están en desequilibrio de unión negativo, entonces los alelos se presentan juntos con menos frecuencia de lo esperado asumiendo independencia estadística. "Razón de probabilidades" u "OR", cuando se usa en el presente documento, se refiere a la razón de probabilidades de la enfermedad para individuos con el marcador (alelo o polimorfismo) en relación con las razones de la enfermedad en individuos sin el marcador (alelo o polimorfismo). "Haplotipo", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de alelos en un solo cromosoma que están lo suficientemente unidos para heredarse normalmente como una unidad.

Puede detectarse una variante polimórfica en una o ambas cadenas de un ácido nucleico bicatenario. De igual manera, una variante polimórfica puede estar ubicada dentro de un intrón o exón de un gen o dentro de una porción de una región reguladora tal como un promotor, una región 5' no traducida (UTR), una 3' UTR, y en el ADN (por ejemplo, ADN genómico (ADNg) y ADN complementario (ADNc)), en el ARN (por ejemplo, ARNm, ARNt y ARNr) o en un polipéptido. Las variaciones polimórficas pueden o no dar lugar a diferencias detectables en la expresión génica, estructura polipeptídica o función polipeptídica.

La expresión "SNP alternativo" cuando se usa en el presente documento se refiere a un SNP que se espera que se comporte de manera similar a un SNP seleccionado y se selecciona en función de las frecuencias de alelos similares y tiene desequilibrio de unión con un SNP seleccionado medido mediante una r2 > 0,6 y/o D' > 0,6.

La expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que se use para tratar una enfermedad, incluyendo, pero sin limitación, un agente que trata un síntoma de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica con el objetivo de alterar el curso natural del individuo que se está tratando, y puede realizarse durante el curso de la patología. Efectos deseables del tratamiento incluyen, pero sin limitación, el alivio o mejora de uno o más síntomas, disminución o retraso en la aparición o empeoramiento de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad y mejora o paliación de la patología. En algunas realizaciones, los anticuerpos se utilizan para retrasar la aparición de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

La expresión "emergente por el tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a un evento que se produce después de que se administre una primera dosis de un agente terapéutico. Por ejemplo, un "evento adverso emergente por tratamiento" es un evento que se identifica durante o después de la primera dosis de un tratamiento en un estudio clínico.

"Pauta de tratamiento" se refiere a una combinación de dosis, frecuencia de administración o duración del tratamiento, con o sin adición de una segunda medicación.

"Pauta de tratamiento eficaz" se refiere a una pauta de tratamiento que ofrecerá una respuesta beneficiosa a un paciente que recibe el tratamiento.

"Modificar un tratamiento" se refiere a cambiar la pauta de tratamiento que incluye, cambiar la dosis, frecuencia de administración o duración del tratamiento y/o adición de una segunda medicación.

Una "cantidad eficaz" o "dosis eficaz" de un agente se refiere a una cantidad o dosis eficaz, durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad eficaz, durante periodos de tiempo necesarios, para tratar la enfermedad, afección, patología clínica, o síntoma indicados, es decir, para modificar el curso de la progresión de la EA y/o aliviar y/o prevenir uno o más síntomas de la EA.

La presente invención proporciona métodos para usar los SNP u otros mecanismos genéticos como biomarcadores predictivos para predecir la respuesta al tratamiento y como biomarcadores pronósticos para evaluar la progresión de la EA, métodos para usar los SNP u otros mecanismos genéticos para seleccionar una estrategia de tratamiento, y métodos para usar los SNP u otros mecanismos genéticos para la estratificación de pacientes, que incluyen, pero sin limitación, la selección de pacientes para estudios clínicos o para toma de decisiones de tratamiento clínico. "Estratificación de pacientes", cuando se usa en el presente documento, se refiere a la genotipificación de individuos para determinar la probabilidad de respuesta al tratamiento. La genotipificación se realiza para identificar si el individuo es portador de un SNP. Existen muchos métodos para la medición de genotipos específicos de SNP. Los individuos que portan mutaciones en uno o más SNP pueden detectarse a nivel de ADN mediante varias técnicas que incluyen, pero sin limitación, matriz de SNP, Taqman, polarización de fluorescencia, Sequenom (u otros métodos para el análisis de SNP como se describe en el presente documento). Los ácidos nucleicos para el diagnóstico se pueden obtener de las células de un paciente, tal como de sangre, orina, saliva, biopsia de tejido y material de autopsia.

El ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse usando PCR antes del análisis del ADN genómico o los transcritos. Por ejemplo, el ADN monocatenario fragmentado de un individuo se hibrida con una matriz que contiene cientos o miles de secuencias de sondas de nucleótidos exclusivas inmovilizadas. Las secuencias de sondas de nucleótidos están diseñadas para unirse a una secuencia de ADN diana (por ejemplo, para un SNP, se usa una sonda específica de alelo para identificar y analizar la presencia o ausencia del SNP). Se utiliza un sistema de detección para registrar e interpretar la señal de hibridación entre la sonda inmovilizada y el ADN del individuo (la sonda o el ADN está marcado con un fluoróforo que se detecta y mide). La detección de una secuencia de ADN específica se puede lograr mediante métodos que incluyen, pero sin limitación, hibridación, protección de RNasa, escisión química, secuenciación directa del ADN o el uso de enzimas de restricción, transferencia Southern de ADN genómico, análisis in situ, hibridación de una muestra y control de los ácidos nucleicos con matrices de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas (Cronin et al., Hum Mutat, 7(3): 244-55 (1996) (u otros métodos para el análisis de SNP como se describe en el presente documento). Por ejemplo, las mutaciones genéticas se pueden identificar usando micromatrices (Shen et al., Mutat Res,573(1-2): 70-82 (2005))). Estas pruebas genéticas son útiles para estratificar poblaciones de individuos en subpoblaciones que tienen diferente sensibilidad al tratamiento de anti-Abeta.

El término "genotipificación", como se usa en el presente documento, se refiere a métodos para determinar diferencias en la composición genética ("genotipo") de un individuo, incluyendo, pero sin limitación, la detección de la presencia de inserciones o eliminaciones en el ADN, polimorfismos (SNP o de otro tipo), alelos (incluidos alelos menores, mayores o de riesgo en forma de SNP, examinando la secuencia de ADN del individuo usando ensayos analíticos o biológicos (u otros métodos para el análisis de SNP como se describe en el presente documento)). Por ejemplo, la secuencia de ADN del individuo determinada por secuenciación u otras metodologías (por ejemplo, otros métodos para el análisis de SNP como se describe en el presente documento), puede compararse con la secuencia de otro individuo o con una secuencia de referencia. Los métodos de genotipificación son generalmente conocidos en la técnica (por ejemplo, otros métodos para el análisis de SNP como se describe en el presente documento), incluyendo, pero sin limitación, la identificación de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) del ADN genómico, detección de polimorfismos amplificados al azar (RAPD, por sus siglas en inglés) de ADN genómico, detección de polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados (AFLPD, por su siglas en inglés), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación de ADN, sondas oligonucleotídicas específicas de alelo (ASO, por sus siglas en inglés) e hibridación con micromatrices o perlas de ADN. De manera similar, estas técnicas se pueden aplicar al análisis de transcritos que codifican SNP u otros factores genéticos. Las muestras pueden analizarse convenientemente para determinar un SNP mediante el análisis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación con matrices o utilizando micromatrices de chips de ADN para SNP, que están disponibles comercialmente, incluyendo instantáneas de micromatrices de ADN. Se puede utilizar una micromatriz para determinar si un SNP está presente o ausente en una muestra de un ácido nucleico. Una micromatriz puede incluir oligonucleótidos, y los métodos para preparar y usar micromatrices de oligonucleótidos adecuadas para uso diagnóstico se describen en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.492.806; 5.525.464; 5.589.330; 5.695.940; 5.849.483; 6.018.041; 6.045.996; 6.136.541; 6.152.681; 6.156.501; 6.197.506; 6.223.127; 6.225.625; 6.229.911; 6.239.273; y en los documentos WO 00/52625; WO 01/25485 y WO 01/29259.

En algunas realizaciones, los médicos pueden utilizar la genotipificación para dirigir los procedimientos de tratamiento adecuados a las personas que más los necesitan. Por ejemplo, los sujetos de un estudio se genotipifican y categorizan en (1) una población que responde favorablemente a un tratamiento y (2) una población que no responde significativamente a un tratamiento y (3) una población que responde de manera negativa a un tratamiento. Basándose en los resultados, un sujeto se genotipifica para predecir si el sujeto tiene probabilidades de responder favorablemente o no a un tratamiento. Los posibles participantes en los ensayos clínicos de un tratamiento pueden explorarse para identificar aquellos que tienen mayor probabilidad de responder favorablemente al tratamiento. Por lo tanto, la eficacia del tratamiento farmacológico se puede medir en personas que responden positivamente al fármaco. Por lo tanto, una realización es un método de selección de un individuo para su inclusión en un ensayo clínico de un tratamiento que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de ácido nucleico de un individuo, (b) determinar la presencia de una variante polimórfica que está asociada con una respuesta positiva al tratamiento o una variante polimórfica que está asociada con una falta de respuesta o respuesta reducida al tratamiento. En otra realización, la invención incluye un método de selección de un individuo para el tratamiento que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de ácido nucleico de un individuo, (b) determinar la presencia de una variante polimórfica que está asociada con una respuesta positiva al tratamiento y (c) tratar al individuo administrando el tratamiento.

La expresión "cebador específico de alelo" o "cebador AS" se refiere a un cebador que se hibrida con más de una variante de la secuencia diana, pero es capaz de discriminar entre las variantes de la secuencia diana en que solamente con una de las variantes, el cebador se extiende de manera eficaz por la polimerasa de ácido nucleico en condiciones adecuadas. Con otras variantes de la secuencia diana, la extensión es menos eficaz o ineficaz. Cuando la extensión es menos eficaz o ineficaz, la señal es de intensidad sustancialmente menor o preferentemente, desciende por debajo del límite de detección.

La expresión "sonda específica de alelo" o "sonda AS" se refiere a una sonda que se hibrida con más de una variante de la secuencia diana, pero es capaz de discriminar entre las variantes de la secuencia diana en que solamente con una de las variantes, se genera una señal detectable. Con otras variantes de la secuencia diana, la señal es de intensidad sustancialmente menor o preferentemente, desciende por debajo del límite de detección.

La expresión "secuencia primaria" se refiere a la secuencia de nucleótidos en un polinucleótido u oligonucleótido. No forman parte de la secuencia primaria modificaciones de nucleótidos tales como modificaciones de bases nitrogenadas, modificaciones de azúcares u otras modificaciones de la cadena principal. Los marcadores, tales como los cromóforos conjugados con los oligonucleótidos tampoco forman parte de la secuencia primaria. Por tanto, dos oligonucleótidos pueden compartir la misma secuencia primaria, pero diferir con respecto a las modificaciones y marcadores.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación puede determinarse fácilmente por un experto habitual en la materia y en general, es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas de mayor longitud requieren temperaturas más elevadas para una hibridación adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad para que el ADN desnaturalizado vuelva a hibridarse cuando hay presencia de cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridada, mayor será la temperatura relativa que pueda usarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más elevadas tenderán a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas harán lo contrario. Para obtener detalles adicionales y una explicación del rigor de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones rigurosas" o "condiciones muy rigurosas", como se define en el presente documento, pueden identificarse por aquellas que: (1) emplean una baja fuera iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) conde albúmina de suero bovino al 0,1 %/Ficol1 al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) realizan la hibridación durante la noche en una solución que emplea formamida al 50 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C, con un lavado de 10 minutos a 42 °C en SSC 0,2 x (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido de un lavado de alta rigurosidad de 10 minutos que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 °C.

Las "condiciones de rigurosidad moderada" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989 e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada es incubación durante una noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida al 20 %, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 °C. El experto en la materia conocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptarse a factores tales como la longitud de la sonda y similares.

"Afinidad" o "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y un grupo de unión a antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos habituales conocidos en la técnica, que incluyen los descritos en el presente documento, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención. En el presente documento se describen realizaciones específicas ilustrativas y de ejemplo para medir la afinidad de unión.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de las regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo precursor que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "paciente" se refiere a cualquier sujeto individual para el que se desea tratamiento. En determinadas realizaciones, el paciente en el presente documento es un ser humano.

Un "sujeto" en el presente documento es normalmente un ser humano. En determinadas realizaciones, un sujeto es un mamífero no humano. Mamíferos no humanos ilustrativos incluyen animales de laboratorio, domésticos, mascotas, de deporte y de granja, p. ej., ratones, gatos, perros, caballos y vacas. Normalmente, el sujeto es elegible para tratamiento, p. ej., muestra uno o más indicios de enfermedad. Generalmente, dicho sujeto o paciente es elegible para tratamiento para amiloidosis, p. ej., EA. En una realización, dicho sujeto o paciente elegible es uno que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de EA o ha sido diagnosticado con EA, ya sea, por ejemplo, recién diagnosticado, diagnosticado previamente o en riesgo de padecer EA. El diagnóstico de EA se puede realizar basándose en la historia clínica, examen clínico y modalidades de obtención de imágenes establecidas. Un "paciente" o "sujeto" en el presente documento incluye cualquier sujeto humano individual elegible para tratamiento que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de EA. Se pretende que se incluyan como sujetos todos los sujetos implicados en ensayos de investigación clínica o sujetos implicados en estudios epidemiológicos o sujetos que alguna vez se utilizaron como controles. El sujeto puede haberse tratado previamente con un anticuerpo anti-Abeta, o un fragmento de unión a antígeno del mismo u otro fármaco, o no haberse tratado. El paciente puede no haberse tratado previamente con fármaco o fármacos que se usen cuando se inicia el tratamiento del presente documento, es decir, el paciente puede no haberse tratado previamente con, por ejemplo, una terapia diferente de anti-Abeta en el "momento inicial" (es decir, en un punto de tiempo establecido antes de la administración de una primera dosis de anti-Abeta en el método de tratamiento del presente documento, tal como el día de la exploración del sujeto antes de que comience el tratamiento). Generalmente, se considera que tales sujetos "no tratados previamente" son candidatos para el tratamiento con dicho o dichos fármacos adicionales.

Como se usa en el presente documento, "a lo largo de la vida" de un sujeto se refiere al resto de la vida del sujeto después de comenzar el tratamiento.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo antígeno. Asimismo, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en los anticuerpos procedentes de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo concreta, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos procedentes de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que tiene su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (o "isotipos"), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la que los restos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los restos de la región marco (FR, por sus siglas en inglés) de la inmunoglobulina humana están sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana o todas o sustancialmente todas las regiones f R son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o que deriva de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos, por ejemplo, producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Dichas técnicas incluyen, pero sin limitación, exploración de bibliotecas combinatorias derivadas de seres humanos, tal como bibliotecas de presentación en fagos (véase, p. ej., Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) y Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)); utilización de líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, p. ej., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 55 93 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)); y generación de anticuerpos monoclonales en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas (véanse, p. ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)). Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno de un animal no humano.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza mayor del 95 % o 99 % tal como se determina mediante, por ejemplo, métodos electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC en fase inversa). Para una revisión de los métodos para evaluar la pureza de los anticuerpos, véase, p. ej., Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, p. ej., Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Asimismo, los anticuerpos que se unen a un antígeno en particular se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para explorar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, p. ej., Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

La expresión "región hipervariable", "HVR", o "HV", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en el VH (HI, H2, H3) y tres en el VL (LI, L2, L3). Varias delimitaciones de regiones hipervariables están en uso y se abarcan en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más utilizadas habitualmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los restos de cada una de estas HVR se indican a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

HI H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat)

HI H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas" de la siguiente manera: 24-36 o 24-34 (LI), 46-56 o 49-56 o 50-56 o 52-56 (L2) y 89-97 (L3) en el VL y 26-35 (HI), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en el VH. Los restos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra para cada una de estas definiciones.

Los restos de "regiones marco" o "FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de regiones hipervariables como se define en el presente documento. La FR de un dominio variable consiste generalmente de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Un "marco aceptor humano", a efectos del presente documento, es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, como se define a continuación. Un marco aceptor humano "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco consenso humano pueden comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia del marco de VL de inmunoglobulina humana o a la secuencia de marco consenso humana.

Un "marco consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos que se encuentran más habitualmente en una selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana procede de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, NIH Publicación 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. et al.et al.

La expresión "anomalía de imagen relacionada con amiloide - Edema" o "ARIA-E" abarca el edema vasogénico cerebral y el derrame de surco.

La expresión "anomalía de imagen relacionada con amiloide - hemorragia" o "ARIA-H" abarca microhemorragia y siderosis superficial del sistema nervioso central.

"Portador de apolipoproteína E4" o "portador de ApoE4", usado indistintamente en el presente documento con "apolipoproteína E4 positivo" o "ApoE4 positivo", se refiere a un individuo que tiene al menos un alelo de apolipoproteína E4 (o "ApoE4"). Un individuo con cero alelos de ApoE4 se denomina en el presente documento "ApoE4 negativo" o "no portador de ApoE4". Véase además Prekumar, et al., 1996, Am. J Pathol. 148:2083-95.

La expresión "edema vasogénico cerebral" se refiere a una acumulación excesiva de líquido o proteína intravascular en los espacios intracelulares o extracelulares del cerebro. El edema vasogénico cerebral es detectable mediante, p. ej., MRI cerebral, incluyendo, pero sin limitación MRI FLAIR y puede ser asintomático ("edema vasogénico asintomático") o estar asociado con síntomas neurológicos, tal como confusión, mareos, vómitos y letargo ("edema vasogénico sintomático") (véase Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011).

La expresión "macrohemorragia cerebral" se refiere a una hemorragia intracraneal o sangrado en el cerebro, de un área de más de aproximadamente 1 cm de diámetro. La macrohemorragia cerebral es detectable mediante, p. ej., MRI cerebral, incluyendo, pero sin limitación, MRI GRE ponderada en T2*, y puede ser asintomática ("macrohemorragia asintomática") o estar asociada con síntomas como deterioro motor o sensorial focal transitorio o permanente, ataxia, afasia y disartria ("macrohemorragia sintomática") (véanse, p. ej., Chalela JA, Gomes J. Expert Rev. Neurother. 2004 4:267, 2004 y Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011).

La expresión "microhemorragia cerebral" se refiere a una hemorragia intracraneal o sangrado en el cerebro, de un área de menos de aproximadamente 1 cm de diámetro. La microhemorragia cerebral es detectable mediante, p. ej., MRI cerebral, incluyendo, pero sin limitación, MRI GRE ponderada en T2*, y puede ser asintomática ("microhemorragia asintomática") o puede estar potencialmente asociada con síntomas tales como deterioro motor o sensorial focal transitorio o permanente, ataxia, afasia y disartria ("microhemorragia sintomática"). Véase, p. ej., Greenberg, et al., 2009, Lancet Neurol. 8:165-74.

La expresión "derrame de surco" se refiere a un derrame de líquido en los pliegues o surcos, del cerebro. Los derrames de surco son detectables mediante, p. ej., MRI cerebral, incluyendo, pero sin limitación, MRI FLAIR. Véase Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011.

La expresión "siderosis superficial del sistema nervioso central" se refiere a sangrado o hemorragia en el espacio subaracnoideo del cerebro y es detectable mediante, p. ej., MRI cerebral, incluyendo, pero sin limitación, MRI GRE ponderada en T2*. Los síntomas indicativos de siderosis superficial del sistema nervioso central incluyen sordera neurosensorial, ataxia cerebelosa y signos piramidales. Véase Kumara-N, Am J Neuroradiol. 31:5, 2010.

El término "progresión", como se usa en el presente documento, se refiere al empeoramiento de una enfermedad a lo largo el tiempo. La "tasa de progresión" o "tasa de progresión" de una enfermedad se refiere a cuánto de rápido o lento se extiende una enfermedad a lo largo del tiempo en un paciente diagnosticado con la enfermedad. La tasa de progresión de una enfermedad se puede representar mediante cambios medibles a lo largo del tiempo de características particulares de la enfermedad. Se dice que un paciente que porta un rasgo genético particular tiene, o es más probable que tenga, una " tasa de progresión aumentada" si su estado de enfermedad progresa más rápido que la de los pacientes sin ese rasgo genético. Por otro lado, se dice que un paciente que responde a una terapia tiene, o es más probable que tenga, una "la tasa de progresión disminuida" si la progresión de la enfermedad se ralentiza después de la terapia, en comparación con su estado de enfermedad antes del tratamiento o con otros pacientes sin el tratamiento.

"Mayor probabilidad de responder", como se usa en el presente documento, se refiere a pacientes que tienen mayor probabilidad de demostrar una ralentización o prevención de la progresión de la amiloidosis, p. ej., EA. Con respecto a la EA, "mayor probabilidad de responder" se refiere a los pacientes que tienen mayor probabilidad de demostrar una reducción en la pérdida de función o capacidad intelectual con el tratamiento. La expresión "responde a" en el contexto de la presente invención indica que un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a sufrir o se le ha diagnosticado un trastorno como se describe en el presente documento, muestra una respuesta al tratamiento anti-Abeta.

La expresión "seleccionar a un paciente" o "identificar a un paciente", como se usa en el presente documento, se refiere al uso de la información o los datos generados en relación con la presencia de un alelo en una muestra de un paciente para identificar o seleccionar al paciente que tiene mayor probabilidad de beneficiarse de un tratamiento que comprende un anticuerpo anti-Abeta. La información o los datos utilizados o generados pueden ser de cualquier forma, por escrito, orales o electrónicos. En algunas realizaciones, utilizar la información o los datos generados incluye comunicación, presentación, información, almacenamiento, envío, transferencia, suministro, transmisión, dispensación o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la comunicación, presentación, información, almacenamiento, envío, transferencia, suministro, transmisión, dispensación, o combinaciones de los mismos se realizan mediante un dispositivo informático, unidad analizadora o combinación de los mismos. En algunas realizaciones adicionales, la comunicación, presentación, información, almacenamiento, envío, transferencia, suministro, transmisión, dispensación, o combinaciones de los mismos se realizan por un laboratorio o un profesional médico. En algunas realizaciones, la información o los datos incluyen una indicación de que un alelo específico está presente o ausente en la muestra. En algunas realizaciones, la información o los datos incluyen una indicación de que el paciente tiene mayor probabilidad de responder a una terapia que comprende anti-Abeta.

"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas que se pueden atribuir a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés); unión al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; regulación negativa de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B. Se sabe en la técnica que los anticuerpos IgG4 de tipo silvestre tienen menos función efectora que los anticuerpos IgG1 de tipo silvestre.

La expresión "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región carboxiterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En una realización, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226 o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina del extremo C (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. Salvo que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o en la región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, ^{m D ,}1991.

Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto", y "anticuerpo completo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Las expresiones "célula hospedadora", "línea celular hospedadora", y "cultivo de células hospedadoras" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula primaria transformada y la descendencia derivada de esta, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácidos nucleicos a una célula progenitora, sino que puede contener mutaciones. Se incluye en el presente documento la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica detectada sistemáticamente o seleccionada en la célula transformada originalmente.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo, pero sin limitación, un agente terapéutico adicional.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico incluido en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente a su ubicación cromosómica natural.

Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti- Abeta" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha una o más moléculas de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados y dicha una o más moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.

La expresión "enfermedad de Alzheimer temprana" o "EA temprana" como se usa en el presente documento (por ejemplo, un "paciente diagnosticado con EA temprana" o un "paciente que padece EA temprana") incluye pacientes con deterioro cognitivo leve, tal como un déficit de memoria, debido a la EA y a los pacientes que tienen biomarcadores de EA, por ejemplo, pacientes amiloide positivos.

La expresión "enfermedad de Alzheimer leve" o "EA leve" como se usa en el presente documento (por ejemplo, un "paciente diagnosticado con EA leve") se refiere a un estadio de EA caracterizado por una puntuación MMSE de 20 a 26.

La expresión "enfermedad de Alzheimer leve a moderada" o "EA leve a moderada", como se usa en el presente documento, abarca la EA tanto leve como moderada, y se caracteriza por una puntuación MMSE de 18 a 26.

La expresión "enfermedad de Alzheimer moderada" o "EA moderada" como se usa en el presente documento (por ejemplo, un "paciente diagnosticado con EA moderada") se refiere a un estadio de EA caracterizado por una puntuación ^{m M s E}de 18 a 19.

Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, residuo terapéutico adicional) o a un radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.

Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con diversas estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Desde el extremo amino al extremo carboxilo, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CHl, CH2 y CH3). De manera similar, desde el extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio variable ligero o dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa ^{( k )}y lambda (A), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia combinada, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos. El término "prospecto" también se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos de diagnóstico que contienen información sobre el uso previsto, principio de prueba, preparación y manipulación de reactivos, recogida y preparación de muestras, calibración del ensayo y el procedimiento del ensayo, datos de rendimiento y precisión tal como la sensibilidad y la especificidad del ensayo.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" respecto de la secuencia de un polipéptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin tomar en consideración ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNAS-TAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. A efectos del presente documento, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue programado por Genentech, Inc. y el código fuente, junto con la documentación para usuarios, se han depositado en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, donde está registrada con el n.° de registro de derechos de autor de los Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir de su código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede, como alternativa, citarse como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un % determinado de identidad de secuencia para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera:

100 veces la fracción (X/Y)

donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa informático ALIGN-2.

Las expresiones "formulación farmacéutica" y "composición farmacéutica" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que sea eficaz la actividad biológica de un principio activo que se encuentra en la misma y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.

Un "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente incluido en una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un transportador farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector en forma de una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la que se ha introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están operativamente unidos. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión".

Un "agente de formación de imágenes" es un compuesto que tiene una o más propiedades que permiten detectar su presencia y/o ubicación directa o indirectamente. Ejemplos de tales agentes de obtención de imágenes incluyen proteínas y compuestos de moléculas pequeñas que incorporan un residuo marcado que permite la detección.

Un "marcador" es un indicador acoplado con una molécula que se utilizará para la detección o la obtención de imágenes. Ejemplos de tales marcadores incluyen: un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo o una etiqueta de afinidad. En una realización, el marcador es un radiomarcador utilizado para obtención de imágenes médicas, por ejemplo, tc99m o 1123 o un marcador de spin para obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, MRI, por sus siglas en inglés), tales como nuevamente, yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso, hierro, etc.

MÉTODOS Y COMPOSICIONES

La presente divulgación proporciona usos médicos y métodos para el tratamiento, pronóstico, selección y/o identificación de pacientes con riesgo de padecer amiloidosis, incluyendo EA, que serían buenos candidatos para el tratamiento con anticuerpos anti-Abeta. En un aspecto, la invención se basa, en parte, en métodos mejorados de tratamiento.

Anticuerpos ilustrativos

En un aspecto, la invención utiliza el anticuerpo crenezumab.

Este anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 9, por ejemplo, la región variable de cadena pesada de los aminoácidos 1 a 112 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 y la región variable de cadena ligera de los aminoácidos 1 a 112 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9.

Crenezumab comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

1. A fin idad del anticuerpo

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, <0,01 nM o <0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, p. ej., de 10'9 M a 10'13 M).

En una realización, la Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA, por sus siglas en inglés) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe mediante el siguiente ensayo. La afinidad de unión de Fab en solución por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con 125I en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, capturando después el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, p. ej., Chen et al., J. Mol. Biol.

293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren durante una noche placas multipocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) con 5 pg/ml de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Número de cat.

269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de [125I]-antígeno con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Después, el Fab de interés se incuba durante una noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Después, la solución se retira y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0,1 % (TWEEN-20®) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20 TM; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT TM (Packard) durante diez minutos. Se eligen las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos de o igual al 20 % de la unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

Según otra realización, la Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE ®-3000 (Bl Acore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizados en ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluyó con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones seriadas de factor dos de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo de polisorbato 20 al 0,05 % (TWEEN-20TM) (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir de uno a uno (programa informático de evaluación BIACORE ®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación de koff/kon. Véase, p. ej., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación supera 106M 'V mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, puede determinarse la velocidad de asociación usando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o la reducción en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo (forma Fab) contra antígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno determinadas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO TM de serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Fragm entos de anticuerpo

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de algunos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, p. ej., Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de los Estados Unidos números 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden restos de epítopo de unión a receptor silvestre y que tienen semivida in vivo aumentada, véase la patente de los Estados Unidos n.° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, los documentos EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos n.° 6.248.516 B1). En determinadas realizaciones, se pueden unir dos o más anticuerpos de un solo dominio para formar una construcción de inmunoglobulina con afinidad multivalente (es decir, el extremo N o C de un primer anticuerpo de un solo dominio puede fusionarse o unirse de otro modo al extremo N o C de un segundo anticuerpo de un solo dominio).

Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitación, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción por células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

3. A nticuerpos quim éricos y hum anizados

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos, p. ej., en la patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con la clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo precursor. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, a la vez que se conserva la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano precursor. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, p. ej., las CDR, (o porciones de las mismas) derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos restos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los restos correspondientes de un anticuerpo no humano (p.ej., el anticuerpo del que derivan los restos de HVR), p. ej., para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos se revisan, p. ej., en Almagro y Fransson, Front. Biosci.

13:1619-1633 (2008) y se describen adicionalmente, p. ej., en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); las Patentes de los Estados Unidos n.° 5. 821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe la "modificación de la superficie"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).

Las regiones marco humanas que pueden usarse para humanización incluyen, pero sin limitación: regiones marco seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (véase, p. ej., Sims.et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véanse, p. ej., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco humanas maduras (mutadas somáticamente) o regiones marco de línea germinal humana (véase, p. ej., Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas de la exploración de bibliotecas de FR (véase, p. ej., Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

4. A nticuerpos hum anos

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando varias técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos, de manera general, en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición a antígenos. Dichos animales normalmente contienen la totalidad o una parte de los locus de inmunoglobulina humanos, que sustituyen los locus endógenos de inmunoglobulina, o que están presentes extracromosómicamente o integrados de forma aleatoria en los cromosomas de los animales. En dichos ratones transgénicos, generalmente se han inactivado los locus de inmunoglobulina endógenos. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos procedentes de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech.

23:1117-1125 (2005). Véanse también, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de los Estados Unidos n.° 5.770.429, que describe la tecnología HUMAB®; la Patente de los Estados Unidos n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas procedentes de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse, además, p. ej., por combinación con una región constante humana diferente.

También pueden prepararse anticuerpos humanos mediante métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, p. ej., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) También se describen anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describen hibridomas de humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

También pueden generarse anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas entre bibliotecas de presentación en fagos de origen humano. Posteriormente, pueden combinarse dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación.

5. A nticuerpos derivados de b ib lio tecas

Los anticuerpos de la invención pueden aislarse mediante exploración de bibliotecas combinatorias respecto de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica diversos métodos para generar bibliotecas de presentación en fagos y para la exploración de dichas bibliotecas respecto de anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, p. ej., en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen con más detalle, p. ej., en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.

222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En determinados métodos de presentación en fagos, se clonan por separado repertorios de genes de VH y VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en fagotecas, que posteriormente pueden someterse a exploración respecto de fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos normalmente presentan fragmentos de anticuerpo, ya sea en forma de fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o en forma de fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas. Como alternativa, el repertorio sin exposición previa se puede clonar (por ejemplo, a partir de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también pueden producirse sintéticamente bibliotecas sin exposición previa clonando segmentos de gen V no reordenados de células madre y usando cebadores para la PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 388 (1992). Las publicaciones de patente que describen fagotecas de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la Patente de los Estados Unidos n.° 5.750.373 y las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran en el presente documento anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos.

6. A nticuerpos m ultiespecíficos

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es para un Abeta y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de Abeta. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en las células. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), el documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la modificación por ingeniería de "botón en ojal" (véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos n.° 5.731.168). También pueden producirse anticuerpos multiespecíficos diseñando efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, p. ej., Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpo" para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, p. ej., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y el uso de dímeros Fv (sFv) monocatenarios (véase, p. ej. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos, como se describe, p. ej., en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos modificados por ingeniería con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, que incluyen los "anticuerpos Octopus", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento del presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a Abeta, así como a otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).

7. Variantes de anticuerpos

En determinadas realizaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo mediante la introducción de modificaciones adecuadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede efectuarse cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, p. ej., unión a antígeno.

Variantes de sustitución, inserción y eliminación

En determinadas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones conservativas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ilustrativas", y como se describen más adelante en referencia a las clases de las cadenas laterales de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés, y los productos se pueden explorar para determinar una actividad deseada, p. ej., unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad reducida o ADCC o CDC mejoradas.

TABLA 1

(continuación)

Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para su estudio posterior tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad mejorada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo precursor y/o tendrán determinadas propiedades biológicas conservadas del anticuerpo precursor. Una variante de sustitución ilustrativa es un anticuerpo madurado por afinidad. En determinadas realizaciones, los anticuerpos madurados por afinidad tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo, p. ej., usar técnicas de maduración por afinidad basadas en expresión en fagos, tales como las descritas en el presente documento. Brevemente, se mutan uno o más restos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se exploran para determina una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). También se conocen otros procedimientos. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por el reordenamiento de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los restos HVR y/o marco se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1996); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Pueden efectuarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, p. ej., para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden efectuarse en "puntos calientes" de la HVR, es decir, restos codificados por codones que sufren mutación con elevada frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, p. ej., Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o en las SDR (CDR-a), probándose la afinidad de unión de la VH o VL variante resultante. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, p. ej., en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, Nueva Jersey, (2001)). En algunas realizaciones de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para su maduración mediante cualquiera de diversos métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Después, se crea una biblioteca secundaria. A continuación, la biblioteca se explora para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica estrategias dirigidas a las HVR, en las que se aleatorizan varios restos de HVR (por ejemplo, 4-6 restos a la vez). Los restos de HVR implicados en la unión al antígeno se pueden identificar de manera específica, p. ej., utilizando mutagénesis con barrido de alanina o modelización. Con frecuencia, se usan como diana, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.

En determinadas realizaciones, pueden producirse sustituciones, inserciones o eliminaciones en una o más HVR en tanto que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden efectuarse alteraciones conservativas (por ejemplo, sustituciones conservativas, tal como se proporcionan en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden realizarse fuera de los "puntos calientes" de las HVR o SDR. En determinadas realizaciones de las secuencias variantes de VH y VL proporcionadas anteriormente, cada HVR bien está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de restos o regiones de un anticuerpo que pueden usarse como diana para mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Como alternativa, o adicionalmente, puede usarse una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos pueden usarse como diana o eliminarse como candidatos para sustitución. Las variantes se pueden explorar para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amino y/o carboxilo con un intervalo de longitudes de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones en los extremos incluyen un anticuerpo con un resto metionilo en el extremo N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

Variantes de glucosilación

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o reducir el alcance de glucosilación del anticuerpo. La adición o eliminación de sitios de glucosilación a un anticuerpo puede lograrse convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, de tal forma que se crea o elimina más de un sitio de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, puede alterarse el carbohidrato unido a esta. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden normalmente un oligosacárido ramificado biantenario que está unido generalmente mediante un enlace N al Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, p. ej., Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, p. ej., manosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas realizaciones, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpos con determinadas propiedades mejoradas.

En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidratos que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser del 1 % al 80 %, del 1 % al 65 %, del 5 % al 65 % o del 20 % al 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) como se mide mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al resto de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc (numeración de EU de los restos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar ubicado a aproximadamente ± 3 aminoácidos cadena arriba o cadena abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener mejorada la función ADCC. Véase, p. ej., las publicaciones de patente de los Estados Unidos números US 2003/0157108 (Presta, L.); el documento ^{u S}2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen los documentos: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); la solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con supresión génica, tal como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células ^{C h O}con supresión génica (véase, p. ej., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).

Las variantes de anticuerpo se proporcionan adicionalmente con oligosacáridos bisectados, p. ej., en las que se bisecciona un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo mediante GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o una función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, p. ej., en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de Estados Unidos n.° 6.602.684 (Umana et al.); y en el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, p. ej., en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).

Variantes de región Fc

En determinadas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

En determinadas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que tiene algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/eliminación de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para asegurarse de que el anticuerpo carece de actividad de unión a FcyR (careciendo, por tanto, probablemente de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, células NK, expresan solamente FcARIII, mientras que los monocitos expresan FcARI, FcARII y FcARIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); el documento 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayo no radiactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, c A; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, p. ej., en un modelo animal tal como se divulga en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad CDC. Véase, p. ej., los ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También pueden realizarse determinaciones de unión a FcRn y de aclaramiento/semivida in vivo usando métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con la sustitución de uno o más de los restos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 de la región Fc (Patente de los Estados Unidos n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc llamado "DANA" con sustitución de los restos 265 y 297 por alanina (patente de los Estados Unidos n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a FcR. (Véase, p. ej., la patente de Estados Unidos n.° 6,737,056; el documento WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, p. ej., sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración UE de los restos).

En algunas realizaciones, se han realizado alteraciones en la región Fc que dieron como resultado una unión alterada (es decir, tanto aumentada como disminuida) a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), p. ej., tal como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642, y en Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Dichos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen las que tienen sustituciones en uno o más de los restos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, p. ej., la sustitución del resto 434 de la región Fc (patente de los Estados Unidos n.° 7.371.826). Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de Estados Unidos n.° 5,648,260; la patente de Estados Unidos n.° 5,624,821; y el documento WO 94/29351 en referencia a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

Variantes de anticuerpo modificadas por ingeniería con cisteína

En determinadas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína, p. ej., "tioMAb", donde uno o más restos de anticuerpo se han sustituido por restos de cisteína. En realizaciones particulares, los restos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de esos restos con cisteína, se colocan de este modo grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármacos o restos de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinadas realizaciones, puede sustituirse uno cualquiera o más de los siguientes restos por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la región Fc de la cadena pesada.

Pueden generarse anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína como se describe, p. ej., en la patente de los Estados Unidos n.° 7.521.541.

Derivados de anticuerpos

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento puede modificarse adicionalmente para contener restos adicionales no proteicos que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero sin limitación, polímeros hidrosolubles. Ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli (n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.

En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteico que pueden calentarse selectivamente por exposición a radiación. En una realización, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede tener cualquier longitud de onda e incluye, pero sin limitación, longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan el resto no proteico a una temperatura a la que las mueren células proximales al anticuerpo-resto no proteico.

Métodos y composiciones recombinantes

Los anticuerpos se pueden producir usando métodos y composiciones recombinantes, p. ej., como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 4.816.567. En una realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-Abeta descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (p. ej., las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (p. ej., vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En una de dichas realizaciones, una célula hospedadora comprende (p. ej., se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la Vh del anticuerpo. En una realización, la célula hospedadora es eucariota, p. ej., una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (p. ej., células Y0, NS0 y Sp20). En una realización, se proporciona un método para producir un anticuerpo anti- Abeta, en donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o del medio de cultivo de la célula hospedadora).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-Abeta, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, p. ej., como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).

Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión de los vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando las funciones de glucosilación y efectora de Fc no son necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.

Además de procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son hospedadores de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden usarse junto con células de insecto, especialmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como hospedadores. Véase, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También pueden usarse como hospedadores células de vertebrado. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de células de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono trasformada mediante SV40 (COS-7); la línea de riñón de embrión humano (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, p. ej., en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares de mamífero hospedadoras útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluidas las células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares de mamífero hospedadoras adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, p. ej., Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003).

Ensayos

Los anticuerpos anti-Abeta proporcionados en el presente documento se pueden identificar, explorar o caracterizar para determinar sus propiedades fisicoquímicas y/o sus actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de unión y o tros ensayos

En un aspecto, un anticuerpo se prueba para determinar su actividad de unión a antígeno, p. ej., por métodos conocidos tales como ELISA, transferencia Western, etc.

En otro aspecto, pueden usarse ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo anti-Abeta de la invención por la unión a Abeta. En determinadas realizaciones, tal anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) al que se une crenezumab u otro anticuerpo anti-Abeta especificado en el presente documento. Se proporcionan métodos detallados para mapear un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

En un ensayo de competición ilustrativo, Abeta inmovilizado en la forma deseada (p. ej., monomérico, oligomérico o fibrilar) se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a Abeta (p. ej., crenezumab) y un segundo anticuerpo no marcado que se está probando para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a Abeta. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba Abeta inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo a Abeta, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con Abeta inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado a Abeta inmovilizado se encuentra sustancialmente reducida en la muestra de ensayo en relación con la muestra del control, entonces, esto indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión a Abeta. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cáp.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Ensayos de actividad

Pueden proporcionarse ensayos para identificar anticuerpos anti-Abeta de los mismos que tienen actividad biológica, por ejemplo, la actividad biológica de crenezumab. La actividad biológica puede incluir, pero sin limitación, p. ej., prevención de la agregación de Abeta monomérico en Abeta oligomérico, o desagregación de Abeta oligomérico en Abeta monomérico. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.

Métodos y composiciones para la identificación y selección de pacientes usando CLUSTERIN

La presente divulgación se basa en el descubrimiento de que un polimorfismo en un gen, CLUSTERIN (también conocido como apolipoproteína J o ApoJ, N.° de registro de GenPept. NP_001822), se correlaciona con la eficacia del tratamiento con anticuerpos anti-Abeta (p.ej, un anticuerpo anti-Abeta o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Como se demuestra en los ejemplos en el presente documento, la presencia de un nucleótido T en el SNP rs1532278, un SNP en el gen CLUSTERIN, se asocia con resultados favorables en pacientes con EA leve a moderada y subpoblaciones particulares de la misma. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos y herramientas, incluyendo, pero sin limitación, métodos y herramientas para identificar y seleccionar pacientes con probabilidad de beneficiarse o responder al tratamiento para la EA que comprende un anticuerpo anti-Abeta.

Los métodos divulgados proporcionan medios convenientes, eficaces y potencialmente económicos para obtener datos e información útil para evaluar terapias adecuadas o eficaces para identificar, seleccionar y/o tratar pacientes. En algunas realizaciones, una muestra puede obtenerse de un paciente y examinarse mediante varios ensayos in vitro para determinar la presencia o ausencia de un alelo asociado con el efecto del tratamiento en pacientes que padecen EA que se han tratados con un anticuerpo anti-Abeta. Las muestras adecuadas se describen en el presente documento, infra y pueden ser de sangre, saliva, hisopo de mejilla, tejido corporal o de un fluido corporal.

La presencia de un biomarcador o SNP se puede determinar basándose en cualquier criterio adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, número de copias de ARNm, ADNc, proteínas, fragmentos de proteínas y/o genes.

En algunas realizaciones, el alelo CLUSTERIN es el alelo rs1532278:T o comprende una T en el SNP rs1532278. También se pueden usar SNP alternativos, en desequilibrio de unión con rs1532278 en los métodos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el desequilibrio de unión es una medida D' o una medida r2 En algunas realizaciones, la medida D' entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,60. En algunas realizaciones, la medida D' entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,70, 0,80 o 0,90. En algunas realizaciones, la medida D' entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es 1,0. En algunas realizaciones, la medida r2 entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,60. En algunas realizaciones, la medida r2 entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es > 0,70, 0,80 o 0,90. En algunas realizaciones, la medida r2 entre el SNP seleccionado y el SNP alternativo es 1,0. En algunas realizaciones, el SNP alternativo se ubica dentro de 500.000 pares de bases cadena arriba o cadena abajo del SNP seleccionado.

El análisis de los SNP en una muestra se puede analizar en sangre, tejido u otros fluidos corporales mediante una serie de metodologías, muchas de las cuales son conocidos en la técnica y entendidos por el experto en la materia, incluyendo, pero sin limitación, secuenciación de ADN, secuenciación de ARN, análisis de ADN por reacción en cadena de la polimerasa, análisis de ARN por reacción en cadena de la polimerasa, hibridación basada en oligonucleótidos, hibridación in situ, extensión de cebadores basada en oligonucleótidos, electroforesis y HPLC. Las técnicas adicionales para detectar SNP incluyen, pero sin limitación, las siguientes técnicas: sonda de exploración y secuenciación de ADN por nanoporos, pirosecuenciación, electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE), electroforesis con gradiente de temperatura temporal (TTGE), electroforesis en gel de poliacrilamida de Zn(II)-cicleno, análisis de polimorfismo de un solo nucleótido fluorescente homogéneo basado en PCR, electroforesis en gel de poliacrilamida con afinidad por fosfato, plataformas de genotipificación de SNP de alto rendimiento, balizas moleculares, reacción con 5' nucleasa, ensayo con Taqman, MassArray (extensión de cebador de una sola base acoplada con desorción/ionización láser asistida por matriz y espectrometría de masas de tiempo de vuelo), etiquetas de masa de tritilo, plataformas de genotipificación (tal como Invader Assay®), ensayos de extensión de cebador de una sola base (SBE), amplificación por PCR (por ejemplo, amplificación por PCR sobre nanopartículas magnéticas (MNP), análisis de enzimas de restricción de productos de PCR (métodos RFLP), PCR específica de alelo, extensión de cebadores múltiples (MPEX), amplificación inteligente isotérmica. (Methods in Molecular Biology, Single Nucleotide Polymorphisms, 2a edición, editor Anton Komar, Humana Press 2009; capítulos 7-28), amplificación por PCR de polimorfismos de la longitud de secuencias simples (SSLP, por sus siglas en inglés), reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), escisión con RNasa A, escisión química de la doble hebra de ADN, análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP, por sus siglas en inglés) (Warren et al., Current Protocol in Human Genetics, Supp 15: 7.4.1-7.4.23 (2001), microensayo de perlas-chips (Lambert et al., Current Protocol in Human Genetics, Supp 78: 2.9.1-2.9.3(2013)), análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP), extensión de cebadores base única (SBE, por sus siglas en inglés) (Deshpande et al., Current Protocol in Human Genetics, Supp 34: 13.4.1-13.4.11 (2005)), ensayo de extensión de cebadores (Kwok et al., Current Protocol in Human Genetics, Supp 39: 2.11.1-2.11.10 (2003). La presencia de un SNP también puede inferirse del análisis de técnicas basadas en proteínas (para examinar, por ejemplo, niveles de expresión o función de proteínas), incluyendo inmunoensayo (por ejemplo, ELISA, ELIFA, análisis inmunohistoquímico y/o transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayos de unión molecular, separación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) y similares, ensayos cuantitativos basados en sangre (como por ejemplo, ELISA en suero) hibridación in situ o ensayos funcionales que incluyen ensayos de actividad enzimática bioquímica o sistemas basados en células, así como uno cualquiera de la gran variedad de ensayos que pueden realizarse mediante análisis de matrices de genes y/o tejidos. Se encuentran protocolos convencionales para evaluar el estado de genes y productos génicos, por ejemplo, en Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (transferencia Northern), 4 (transferencia Southern), 15 (Inmunotransferencia) y 18 (análisis por PCR). También pueden utilizarse inmunoensayos multiplexados tales como los disponibles en Rules Based Medicine, inmunoensayos basados en perlas, por ejemplo, Luminex, ELISA o Meso Scale Discovery (MSD).

Una técnica que es sensible y susceptible para el análisis de SNP de la invención es la PCR específica de alelo (AS-PCR) descrita, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 6.627.402. Esta técnica detecta mutaciones o polimorfismos en secuencias de los ácidos nucleicos en presencia de variantes de tipo silvestre de las secuencias. En una PCR específica de alelo exitosa, se amplifica la variante deseada del ácido nucleico diana, mientras que las otras variantes no lo hacen, al menos no a un nivel detectable.

Una medida de discriminación de una PCR específica de alelo es la diferencia entre los valores de Ct (ACt) en las reacciones de amplificación que implican a los dos alelos. Cada reacción de amplificación se caracteriza por una "curva de crecimiento" o "curva de amplificación" en el contexto de un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos que es un gráfico de una función, donde una variable independiente es el número de ciclos de amplificación y una variable dependiente es un parámetro medible dependiente de la amplificación medido en cada ciclo de amplificación, tal como la fluorescencia emitida por un fluoróforo. Normalmente, el parámetro medible dependiente de la amplificación es la cantidad de fluorescencia emitida por la sonda tras la hibridación, o tras la hidrólisis de la sonda por la actividad nucleasa de la polimerasa de ácido nucleico, véase Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280 y la patente de los Estados Unidos N.° 5.210.015. Una curva de crecimiento se caracteriza por un "valor umbral" (o valor Ct) que es un número de ciclos en los que se logra una magnitud predeterminada del parámetro medible. Un valor de Ct más bajo representa una amplificación más rápida, mientras que el valor de Ct más alto representa una amplificación más lenta. En el contexto de una reacción específica de alelo, la diferencia entre los valores de Ct de las dos plantillas representa una discriminación alélica en la reacción.

En una PCR específica de alelo, al menos un cebador es específico de alelo de manera que la extensión del cebador se produce solamente (o preferentemente) cuando está presente la variante específica de la secuencia y no se produce (o se produce de manera menos eficaz, es decir, con un ACt sustancial) cuando está presente otra variante. Normalmente, el nucleótido discriminante en el cebador, es decir, el nucleótido que coincide solamente con una variante de la secuencia diana, es el nucleótido 3'-terminal. Sin embargo, el extremo 3' del cebador es solamente uno de los muchos determinantes de la especificidad. Por ejemplo, las faltas de coincidencia adicionales también pueden afectar la discriminación. Véase la solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 12/582.068 presentada el 20 de octubre de 2009 (publicada como US20100099110.) Otro enfoque es incluir nucleótidos no naturales o modificados que alteran el emparejamiento de bases entre el cebador y la secuencia diana (Patente de los Estados Unidos N.° 6.001.611) La cinética de extensión reducida y, por lo tanto, la especificidad de un cebador está influenciada por muchos factores, incluido el contexto de secuencia general de la falta de coincidencia y otros ácidos nucleicos presentes en la reacción. No se puede predecir el efecto de estos factores externos en cada falta de coincidencia adicional, así como en cada nucleótido no natural adicional, ya sea solo o en combinación. En una realización, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos específicos para determinar el polimorfismo en CLUSTERIN, en particular, oligonucleótidos específicos para rs1532278 en CLUSTERIN.

En una realización, la presencia de polimorfismo se detecta con una sonda. La sonda puede estar marcada con un marcador radiactivo o cromóforo (fluoróforo), p. ej., un marcador que incorpora colorantes de la familia FAM, JA270, CY5 o colorantes HEX. Como un ejemplo de detección con una sonda marcada con fluorescencia, la mutación puede detectarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rt-PCR), donde la hibridación de la sonda da como resultado la digestión enzimática de la sonda y la detección de la fluorescencia resultante (método de la sonda TaqMan™, Holland et al. (1991) P.N.A.S. USA 88:7276-7280). Como alternativa, la presencia de polimorfismo y el producto de amplificación pueden detectarse mediante electroforesis en gel seguida de tinción o mediante transferencia e hibridación como se describe, por ejemplo, en Sambrook, J. y Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning, 3a ed. CSHL Press, Capítulos 5 y 9.

Un "colorante fluorescente" o un "fluoróforo" es un compuesto o un resto unido, por ejemplo, a un ácido nucleico, que es capaz de emitir radiación luminosa cuando se excita con una luz de una longitud de onda adecuada. Los colorantes fluorescentes habituales incluyen colorantes de rodamina, colorantes de cianina, colorantes fluoresceína y colorantes BODIPY®. Un fluoróforo es un cromóforo fluorescente. "FRET" o "transferencia de energía de resonancia fluorescente" o "transferencia de energía de resonancia de Foerster" es una transferencia de energía entre al menos dos cromóforos, un cromóforo donante y un cromóforo aceptor (denominado desactivador). El donante normalmente transfiere la energía al aceptor cuando el donante es excitado por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. Cuando el aceptor es un desactivador "oscuro", disipa la energía transferida en una forma distinta a la luz. Los desactivadores oscuros comúnmente utilizados son BlackHole Quenchers™ (BHQ), Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Cal.), lowa Black™, Integrated DNA Tech., Inc. (Coralville, lowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), Berry & Assoc., (Dexter, Mich.). Los pares donante-desactivador de uso común incluyen el par FAM-BHQ, el par CY5-BHQ y el par HEX-BHQ.

Puede obtenerse una muestra que comprende un biomarcador o SNP mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véase debajo del apartado Definiciones. Además, el progreso de la terapia se puede monitorizar más fácilmente analizando dichas muestras corporales para determinar SNP.

Pueden usarse matrices de genotipificación para analizar ADN o ARN para detectar la presencia de SNP. Un ejemplo de ello es la tecnología de matriz basada en Illumina, que es un sistema de micromatriz disponible comercialmente que comprende > 700 K locus (Oliphant et al., Biotechniques, Supp: 56-8, 60-1 (2002)) y es un método común utilizado para el análisis de ADN y ARN (por ejemplo, identificación de SNP en muestras de ácido nucleico). La tecnología de micromatrices de Illumina utiliza perlas de sílice de 3 mieras que se autoensamblan en micropocillos en cualquiera de dos sustratos: haces de fibra óptica o portaobjetos planos de sílice. Cada perla está cubierta con cientos de miles de copias de oligonucleótidos específicos que actúan como secuencias de captura.

La expresión de un gen o biomarcador seleccionado en una muestra de tejido o de células también puede examinarse mediante ensayos funcionales o basados en actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, se pueden realizar ensayos conocidos en la técnica para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o de células.

El estado de SNP de un paciente basado en los resultados de la prueba se puede proporcionar en un informe. El informe puede ser en cualquier forma de materiales escritos (por ejemplo, en papel o en formato digital, o en Internet) o presentaciones orales (por ejemplo, en persona (en vivo) o como grabación). El informe puede indicar además a un profesional de la salud (por ejemplo, un médico) que el paciente puede beneficiarse o tiene probabilidades de responder al tratamiento anti-Abeta.

También se proporcionan, en el presente documento, kits para detectar la presencia de un polimorfismo o determinar el genotipo del paciente a partir de una muestra. Los kits de la invención tienen varias realizaciones. En determinadas realizaciones, un kit comprende un envase, un marcador en dicho envase y una composición contenida en dicho envase; en donde la composición incluye uno o más anticuerpos primarios que se unen a una o más secuencias polipeptídicas diana correspondientes a un autoanticuerpo contra un SNP, el marcador en el envase indica que la composición se puede usar para evaluar la presencia de una o más proteínas diana en al menos un tipo de célula de mamífero y las instrucciones para usar los anticuerpos para evaluar la presencia de una o más proteínas diana en al menos un tipo de célula de mamífero. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido y aplicar anticuerpo y sonda a la misma sección de una muestra de tejido. El kit puede incluir un anticuerpo tanto primario como secundario, en donde el anticuerpo secundario está conjugado con un marcador, p. ej., un marcador enzimático.

Métodos y composiciones para diagnósticos y detección

En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Abeta proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de Abeta en una muestra biológica. El término "detectar", como se utiliza en el presente documento, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como suero, plasma, hisopos nasales, esputo, líquido cefalorraquídeo, , humor acuoso del ojo y similares, o muestras de tejido o células obtenidas de un organismo tal como muestras que contienen tejido neural o cerebral.

En una realización, se proporciona un anticuerpo anti- Abeta para su uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de Abeta en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-Abeta como se describe en el presente documento en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-Abeta a Abeta y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-Abeta y Abeta. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo.

Los trastornos ilustrativos que pueden diagnosticarse usando un anticuerpo de la invención son enfermedades y trastornos causados por o asociados con proteínas amiloides o similares a amiloides. Estos incluyen, pero sin limitación, enfermedades y trastornos causados por la presencia o actividad de proteínas similares a amiloide en estado monomérico, fibrilar, o polimérico, o cualquier combinación de los tres, incluso por placas amiloides. Las enfermedades ilustrativas incluyen, pero sin limitación, amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad, tal como enfermedades que incluyen, pero sin limitación, trastornos neurológicos tal como la enfermedad de Alzheimer ("EA"), enfermedades o afecciones caracterizadas por una pérdida de la capacidad de memoria cognitiva tal como, por ejemplo, deterioro cognitivo leve (MCI), demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés), el complejo párkinson-demencia de Guam y otras enfermedades que se basan o están asociadas con proteínas similares a amiloide, tal como la parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple, enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ELA (esclerosis lateral amiotrófica ), miositis por cuerpos de inclusión (IBM, por sus siglas en inglés), diabetes de inicio en la edad adulta, tumor endocrino y amiloidosis cardíaca senil, y diversas enfermedades oculares, incluida la degeneración macular, neuropatía óptica relacionada con drusas, glaucoma y cataratas debido al depósito de beta-amiloide.

En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-Abeta marcados. Los marcadores incluyen, pero sin limitación, marcadores o restos que se detectan directamente (tal como marcadores fluorescentes, cromóforos, densos a electrones, quimioluminiscentes y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, p. ej., mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, p. ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de los Estados Unidos n.° 4.737.456), 2,3-dihidroftalacinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, p. ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tal como uricasa y xantina oxidasa, acopladas a una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.

La presente divulgación proporciona además usos in vitro de un agente para detectar un polimorfismo en un alelo CLUSTERIN. En algunas realizaciones, se proporciona un agente para detectar un alelo CLUSTERIN, para la identificación de un paciente que tiene EA temprana, leve o leve a moderada, que tiene probabilidades de responder al tratamiento que comprende un anticuerpo anti-Abeta. En algunas realizaciones, el agente es capaz de detectar la presencia de un alelo CLUSTERIN que tiene un nucleótido T en el SNP rs1532278.

Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-Abeta como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los transportadores farmacéuticamente aceptables normalmente son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los transportadores farmacéuticamente aceptables ilustrativos en el presente documento incluyen además agentes para la dispersión intersticial de fármacos tales como las glucoproteínas de hialuronidasa neutras-activas (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinados sHASEGP ilustrativos y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de los Estados Unidos n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.

En una realización, un anticuerpo de la invención puede formularse en un tampón de arginina. En un aspecto, el tampón de arginina puede ser un tampón de succinato de arginina. En un aspecto de este tipo, la concentración del tampón de succinato de arginina puede ser 50 mM o mayor. En otro aspecto similar, la concentración del tampón de succinato de arginina puede ser 100 mM o mayor. En otro aspecto similar, la concentración del tampón de succinato de arginina puede ser 150 mM o mayor. En otro aspecto similar, la concentración del tampón de succinato de arginina puede ser 200 mM o mayor. En otro aspecto, la formulación de tampón de arginina puede contener además un tensioactivo. En otro aspecto similar, el tensioactivo es un polisorbato. En otro aspecto similar, el polisorbato es polisorbato 20. En otro aspecto similar, la concentración de polisorbato 20 en la formulación es 0,1 % o menos. En otro aspecto similar, la concentración de polisorbato 20 en la formulación es 0,05 % o menos. En otro aspecto, el pH de la formulación de tampón de arginina está entre 4,5 y 7,0. En otro aspecto, el pH de la formulación de tampón de arginina está entre 5,0 y 6,5. En otro aspecto, el pH de la formulación de tampón de arginina está entre 5,0 y 6,0. En otro aspecto, el pH de la formulación de tampón de arginina es 5,5. En cualquiera de las realizaciones y aspectos anteriores, el anticuerpo de la invención puede ser crenezumab.

Las formulaciones de anticuerpo liofilizado ilustrativas se describen en la Patente de los Estados Unidos N.° 6.267.958. Las formulaciones acuosas de anticuerpo incluyen aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.171.586 y en el documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón de histidinaacetato.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un principio activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además uno o más compuestos para prevenir o tratar los síntomas de la enfermedad de Alzheimer. Dichos principios activos están presentes de manera adecuada en combinaciones en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

Los principios activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, teniendo dichas matrices una forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, generalmente, estériles. Puede lograrse fácilmente la esterilidad, p. ej., mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Métodos y composiciones terapéuticos

Como se muestra en el presente documento, la administración intravenosa de crenezumab redujo la progresión de la enfermedad en pacientes que padecían EA. Específicamente, los pacientes con EA leve a moderada, incluyendo pacientes con eA leve y pacientes ApoE4 positivos, así como pacientes con carga de amiloide cerebral que se observa normalmente en pacientes diagnosticados con EA, mostraron una reducción en la tasa de declive cognitivo cuando se trataron con crenezumab en comparación con un placebo. Cuanto más leve es la enfermedad, basándose en el aumento de la puntuación MMSE, mayor es la reducción del declive en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de placebo. Estos resultados se vieron corroborados adicionalmente por otras indicaciones de acoplamiento de la diana por crenezumab, incluyendo un aumento de los niveles de Abeta detectados en el líquido cefalorraquídeo y una reducción de la acumulación de amiloide en el cerebro. Asimismo, una dosis comparativamente alta de anticuerpo (15 mg/kg) no aumentó la incidencia de los eventos adversos de tipo ARIA que se han observado en ensayos de otros anticuerpos anti-Abeta.

Por tanto, en una realización, un anticuerpo de la invención se usa para tratar la EA, incluyendo EA leve a moderada, EA leve y EA temprana. En otra realización, se usa un anticuerpo de la invención para tratar una amiloidosis. En una de dichas realizaciones, la amiloidosis es un deterioro cognitivo leve. En otra de dichas realizaciones, la amiloidosis es síndrome de Down. En otra de dichas realizaciones, la amiloidosis es una hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés). En otra de dichas realizaciones, la amiloidosis es el complejo Parkinson-Demencia de Guam. En otra de dichas realizaciones, la amiloidosis es una enfermedad ocular relacionada con drusas u otro depósito de amiloide en el ojo. En un aspecto, la enfermedad ocular es degeneración macular. En otro aspecto, la enfermedad ocular es una neuropatía óptica relacionada con drusas. En otro aspecto, la enfermedad ocular es glaucoma. En otro aspecto, la enfermedad ocular es catarata. En cualquiera de las realizaciones y aspectos anteriores, el anticuerpo de la invención puede ser crenezumab.

Normalmente, se evalúa en primer lugar a un paciente para determinar la presencia de una o más amiloidosis antes de determinar la idoneidad de un anticuerpo de la invención para tratar a dicho paciente. A modo de ejemplo no limitante, la EA puede diagnosticarse en un paciente utilizando los criterios "NINCDS-ADRDA" (evaluación de trastornos neurológicos y comunicativos y de trastornos relacionados con la enfermedad de Alzheimer-accidente cerebrovascular). Véase McKhann, et al., 1984, Neurology 34:939-44. Un posible paciente al que se le va a administrar uno o más anticuerpos de la invención también se puede probar para determinar la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos que pueden predisponer a dicho paciente a (i) una probabilidad mayor o menor de que dicho paciente experimente una o más amiloidosis o (ii) una probabilidad mayor o menor de que dicho paciente experimente uno o más eventos adversos o efectos secundarios durante el curso de la administración de un anticuerpo de la invención. A modo de ejemplo no limitante, se sabe que los pacientes que portan el alelo ApoE4 tienen un riesgo sustancialmente mayor de padecer EA que los que carecen del alelo (Saunders et al., Neurology 1993; 43:1467-72; Prekumar et al., Am. J. Pathol. 1996; 148:2083-95), y que dichos pacientes estaban representados de manera desproporcionada en los eventos adversos de tipo ARIA observados en el ensayo clínico de bapineuzumab, otro anticuerpo anti-Abeta (Sperling et al., Alzheimer's & Dementia 2011, 7:367-385; Salloway et al., N. Engl. J. Med. 2014, 370:322-333).

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se usa para tratar la EA de leve a moderada en un paciente. El paciente puede ser ApoE4 positivo o ApoE4 negativo. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se usa para tratar la EA leve. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se usa para tratar a un paciente ApoE4 positivo que padece EA leve a moderada o EA leve. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se usa para tratar a un paciente que padece EA leve.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se usa para tratar a un paciente que tiene una puntuación MMSE de entre 20 y 30, entre 20 y 26, entre 24 y 30, entre 21 y 26, entre 22 y 26, entre 22 y 28, entre 23 y 26, entre 24 y 26 o entre 25 y 26. En algunas realizaciones, el paciente tiene una puntuación MMSE entre 22 y 26. Como se usa en el presente documento, una puntuación MMSE entre dos números incluye los números en cada extremo del intervalo. Por ejemplo, una puntuación Mm SE entre 22 y 26 incluye puntuaciones MMSE de 22 y 26.

En algunas realizaciones, los anticuerpos se utilizan para tratar a un paciente que es 'amiloide positivo', p. ej., un paciente que tiene depósitos de amiloide cerebral que son típicos de un paciente diagnosticado con EA o un paciente que tiene una exploración PET con florbetapir positiva. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan para reducir la acumulación de depósitos de amiloide cerebral o placas neuríticas (es decir, para reducir un aumento en el peso o carga de amiloide cerebral).

Asimismo, los anticuerpos son útiles para tratar la EA de leve a moderada sin aumentar la incidencia de ARIA-E o ARIA-H. En algunas realizaciones, los pacientes padecen EA leve. En algunas realizaciones, los pacientes son ApoE4 positivos. En algunas realizaciones, los pacientes son ApoE4 positivos y padecen EA leve.

Como se evidencia en los ejemplos en el presente documento, el efecto terapéutico aumenta en pacientes con formas más leves de EA. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el anticuerpo se usa para tratar a un paciente con EA temprana. En determinadas realizaciones, el paciente a tratar tiene una o más de las siguientes características: (a) deterioro cognitivo leve (MCI) debido a la EA; (b) uno o más biomarcadores indicativos de la enfermedad de Alzheimer sin un déficit clínicamente detectable; (c) una pérdida de memoria objetiva cuantificada utilizando la prueba de recuerdo libre y selectivamente facilitado (FCSRT, por sus siglas en inglés) como una puntuación de 27 o más; una MMSE de 24-30; (d) una calificación clínica de demencia (CDR) global de 0,5; y (e) una exploración PET de amiloide positiva (según lo determine un lector calificado).

En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar la EA en un paciente que padece EA temprana, leve o leve a moderada, que comprende administrar a dicho paciente un anticuerpo anti-Abeta en una cantidad eficaz para tratar la EA, en donde el paciente tiene al menos un alelo CLUSTERIN que comprende una T en el SNP rs1532278. En el presente documento se proporcionan métodos, composiciones y herramientas para detectar o determinar la presencia o ausencia de un SNP específico, véase infra.

Los anticuerpos se formulan, dosifican y administran de una forma consistente con la buena práctica médica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, el estado clínico del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los profesionales sanitarios.

Vías de administración

Un anticuerpo (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para un tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es corta o crónica. En una realización, el anticuerpo se inyecta por vía subcutánea. En otra realización, el anticuerpo se inyecta por vía intravenosa. En otra realización, el anticuerpo se administra utilizando una jeringa (p. ej., precargada o no) o un autoinyector. En otra realización, el anticuerpo se inhala.

Dosificación

Para el tratamiento de una amiloidosis, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales diferentes) dependerá del tipo específico de enfermedad que se vaya a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo y del criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Se contemplan en el presente documento varias pautas posológicas que incluyen, pero sin limitación, administraciones individuales o múltiples a lo largo de varios puntos de tiempo, administración en bolo e infusión pulsada.

Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 0,3 mg/kg a 100 mg/kg (por ejemplo, 15 mg/kg-100 mg/kg, o cualquier dosis dentro de ese intervalo) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria habitual estará en el intervalo de aproximadamente 15 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. La dosis se puede administrar en una sola dosis o en una dosis dividida (por ejemplo, dos dosis de 15 mg/kg para una dosis total de 30 mg/kg). Para administraciones repetidas a lo largo de varias semanas o un periodo mayor, dependiendo de la afección, se continuará generalmente el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosis ilustrativa del anticuerpo se encontrará en el intervalo de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Por lo tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg o 100 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). En algunas realizaciones, la dosis total administrada está en el intervalo de 50 mg a 2500 mg. Se pueden administrar al paciente una dosis ilustrativa de aproximadamente 50 mg, aproximadamente 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 720 mg, aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 1050 mg, aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg, aproximadamente 1400 mg, aproximadamente 1500 mg, aproximadamente 1600 mg, aproximadamente 1700 mg, aproximadamente 1800 mg, aproximadamente 1900 mg, aproximadamente 2000 mg, aproximadamente 2050 mg, aproximadamente 2100 mg, aproximadamente 2200 mg, aproximadamente 2300 mg, aproximadamente 2400 mg o aproximadamente 2500 mg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada mes, cada dos meses, cada tres meses o cada seis meses. En algunas realizaciones, el paciente recibe de una a treinta y cinco dosis (por ejemplo, aproximadamente dieciocho dosis del anticuerpo). Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de esta terapia se puede monitorizar fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

En determinadas realizaciones, se administra un anticuerpo de la invención a una dosis de 15mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg o una dosis fija, p. ej., 300 mg, 500 mg, 700 mg, 800 mg o más. En algunas realizaciones, la dosis se administra mediante inyección intravenosa cada 2 semanas o cada 4 semanas durante un período de tiempo. En algunas realizaciones, la dosis se administra mediante inyección subcutánea cada 2 semanas o cada 4 semanas durante un período de tiempo. En determinadas realizaciones, el período de tiempo es de 6 meses, un año, dieciocho meses, dos años, cinco años, diez años, 15 años, 20 años o a lo largo de la vida del paciente.

Monitorización/evaluación de la respuesta al tratamiento terapéutico

Como se usa en los métodos de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, proporciona un efecto o beneficio terapéutico al paciente. En determinadas realizaciones, el beneficio terapéutico es un retraso o inhibición de la progresión de la EA o una reducción en el declive clínico, funcional o cognitivo. En algunas realizaciones, el efecto o beneficio terapéutico se refleja en una "respuesta del paciente" o "respuesta" (y variaciones gramaticales de las mismas). La respuesta del paciente se puede evaluar utilizando cualquier criterio de valoración que indique un beneficio para el paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, hasta cierto punto, de la progresión de la enfermedad, incluyendo su ralentización y detención completa; (2) reducción de la cantidad de placa o reducción de la acumulación de amiloide cerebral; (3) mejora en una o más métricas de evaluación, incluyendo, pero sin limitación, las escalas ADAS-Cog, iADL y CDR-SOB; (4) mejora en el funcionamiento diario del paciente; (5) aumento de la concentración de uno o más biomarcadores, p. ej., Abeta, en líquido cefalorraquídeo; y (6) disminución de uno o más biomarcadores indicativos de la presencia de eA. Una evaluación de la respuesta del paciente también puede incluir una evaluación de cualquier evento adverso que pueda producirse y que pueda estar relacionado con el tratamiento.

En una realización, la capacidad cognitiva y el funcionamiento diario del paciente se evalúan antes de, durante, y/o después de un curso de terapia con un anticuerpo de la invención. Se han creado varias herramientas de evaluación cognitiva y funcional para su uso en la evaluación, diagnóstico y puntuación de la función mental, capacidad intelectual y déficit neurológico. Estas herramientas incluyen, pero sin limitación, la ADAS-Cog, incluyendo el ADAS-Cog de 12 puntos (ADAS-Cog12), el ADAS-Cog de 13 puntos (ADAS-Cog13), el ADAS-Cog de 14 puntos (ADAS-Cog14); la CDR-SOB, incluyendo los componentes de CRD de resolución de problemas y juicio y de CDR de memoria; las actividades instrumentales de la vida diaria (iADL); y el MMSE.

"ADAS-Cog" se refiere a la subescala cognitiva de la escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer, una evaluación cognitiva de varias partes. Véase Rosen et al., 1984, Amer. J. Psych. 141:1356-1364; Mohs et al., 1997, Alzheimer's Disease Assoc. Disorders 11(2):S13-S21. Cuanto mayor sea la puntuación numérica en la ADAS-Cog, mayor será el déficit o deterioro del paciente evaluado en relación con otro individuo con una puntuación más baja. La ADAS-Cog puede usarse como una medida para evaluar si un tratamiento para la EA es terapéuticamente eficaz. Un aumento en la puntuación ADAS-Cog indica un empeoramiento del estado del paciente, mientras que una disminución en la puntuación ADAS-Cog indica una mejora del estado del paciente. Como se usa en el presente documento, una "disminución en el rendimiento de ADAS-Cog" o un "aumento en la puntuación de ADAS-Cog" indica un empeoramiento del estado del paciente y puede reflejar la progresión de la EA. La ADAS-Cog es una batería administrada por un examinador que evalúa múltiples dominios cognitivos, incluyendo la memoria, comprensión, práctica, orientación y habla espontánea (Rosen et al. 1984, Am J Psychiatr 141:1356-64; Mohs et al. 1997, Alzheimer Dis Assoc Disord 11(S2):S13-S21). La ADAS-Cog es un criterio de valoración primario patrón en los ensayos de tratamiento de la EA (Mani 2004, Stat Med 23:305-14). La ADAS-Cog12 es la versión de 70 puntos del ADAS-Cog más un elemento de recuperación de palabras tardía de 10 puntos que evalúa la recuperación de una lista de palabras aprendidas. Otras escalas ADAS-Cog incluyen ADAS-Cog13 y ADAS-Cog14.

En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento proporcionados en el presente documento proporcionan una reducción en el declive cognitivo medido por una puntuación ADAS-Cog que es de al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, o al menos aproximadamente un 45 % menos en relación con el placebo.

"MMSE" se refiere al mini examen del estado mental, que proporciona una puntuación entre 1 y 30. Véase Folstein, et al., 1975, J. Psychiatr. Res. 12:189-98. Las puntuaciones de 26 o menos generalmente se consideran indicativas de un déficit. Cuanto menor sea la puntuación numérica en el MMSE, mayor será el déficit o deterioro del paciente evaluado en relación con otro individuo con una puntuación más baja. Un aumento en la puntuación MMSE puede ser indicativo de una mejora del estado del paciente, mientras que una disminución en la puntuación MMSE puede indicar un empeoramiento del estado del paciente.

"CDR-SOB" se refiere a la escala de calificación clínica de demencia/suma de casillas. Véase Hughes et al, 1982. La CDR evalúa 6 componentes: memoria, orientación, juicio/resolución de problemas, asuntos de comunidad, hogar y pasatiempos y cuidado personal. La prueba se administra tanto al paciente como al cuidador y cada componente (o cada "casilla"), se puntúa en una escala de 0 a 3. Una puntuación CDR-SOB completa se basa en la suma de las puntuaciones en las 6 casillas. También se pueden obtener subpuntuaciones para cada una de las casillas o componentes individualmente, p. ej., CDR/memoria o CDR/juicio y resolución de problemas. Como se usa en el presente documento, una "disminución en el rendimiento de CDR-SOB" o un "aumento en la puntuación de CDR-SOB" indica un empeoramiento del estado del paciente y puede reflejar la progresión de la EA. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento proporcionados en el presente documento proporcionan una reducción en el declive del rendimiento de CDR-SOB de al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 % o al menos aproximadamente un 40 % en relación con el placebo.

"iADL" se refiere a la escala de actividades instrumentales de la vida diaria. Véase Lawton, MP, y Brody, E.M., 1969, Gerontologist 9:179-186. Esta escala mide la capacidad para realizar actividades diarias típicas, como las tareas domésticas, lavado de ropa, manejar un teléfono, compras, preparar comidas, etc. Cuanto menor sea la puntuación, más deteriorado está el individuo en la realización de las actividades de la vida diaria. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento proporcionados en el presente documento proporcionan una reducción en el declive de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, o al menos aproximadamente un 20 % en la escala iADL en relación con el placebo.

La carga o peso de amiloide cerebral se puede determinar utilizando técnicas y herramientas de obtención de imágenes neurológicas, por ejemplo, utilizando exploración PET (tomografía por emisión de positrones). Las exploraciones PET en serie de un paciente tomadas a lo largo del tiempo, p. ej., antes y después de la administración de un tratamiento (o en uno o más intervalos durante el curso de una pauta de tratamiento), puede permitir la detección de carga de amiloide aumentada, disminuida o sin cambios en el cerebro. Esta técnica se puede utilizar además para determinar si la acumulación de amiloide aumenta o disminuye. En algunas realizaciones, la detección de depósitos de amiloide en el cerebro se realiza utilizando florbetapir. 18F. En algunas realizaciones, una exploración PET con florbetapir se considera positiva si, basándose en una lectura visual centralizada de la exploración, establece la presencia de placas neuríticas de moderadas a frecuentes.

Coadministración

Aunque no es necesario, el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestión o uno o más de sus síntomas. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan generalmente con las mismas dosis y por vías de administración como las descritas en el presente documento o de aproximadamente el 1 al 99 % de las dosis descritas en el presente documento o en cualquier dosis y por cualquier vía que se haya determinado empíricamente/clínicamente como adecuada. Un experto en la materia entenderá que un anticuerpo de la invención puede coadministrarse simultáneamente con cualquiera de los compuestos anteriores o puede administrarse antes o después de la administración de cualquiera de los compuestos anteriores.

Cuando se trata una amiloidosis con un anticuerpo de la invención, se puede coadministrar un fármaco neurológico. Dicho fármaco neurológico se puede seleccionar del grupo que incluye, pero sin limitación, un anticuerpo u otra molécula de unión (que incluye, pero sin limitación, una molécula pequeña, un péptido, un aptámero u otro aglutinante de proteínas) que se une específicamente a una diana seleccionada de: beta secretasa, tau, presenilina, proteína precursora de amiloide o porciones de las mismas, péptido beta amiloide u oligómeros o fibrillas del mismo, receptor de muerte 6 (DR6), receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE, por sus siglas en inglés), parkina y huntingtina; un inhibidor de la colinesterasa (es decir, galantamina, donepezil, rivastigmina y tacrina); un antagonista del receptor de NMDA (es decir, memantina), un reductor de monoaminas (es decir, tetrabenazina); un mesilato ergoloide; un agente antiparkinsoniano anticolinérgico (p. ej., prociclidina, difenhidramina, trihexifenidilo, benzatropina, biperideno y trihexifenidilo); un agente antiparkinsoniano dopaminérgico (es decir, entacapona, selegilina, pramipexol, bromocriptina, rotigotina, selegilina, ropinirol, rasagilina, apomorfina, carbidopa, levodopa, pergolida, tolcapona y amantadina); una tetrabenazina; un antiinflamatorio (que incluye, pero sin limitación, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (p. ej., indometicina y otros compuestos enumerados anteriormente); una hormona (es decir, estrógeno, progesterona y leuprolida); una vitamina (es decir, folato y nicotinamida); una dimebolina; una homotaurina (es decir, ácido 3-aminopropanosulfónico; 3APS); un modulador de la actividad de receptores de serotonina (es decir, xaliprodeno); un interferón y un glucocorticoide o corticosteroide. En algunas realizaciones, se coadministran uno o más anticuerpos anti-Abeta distintos de crenezumab. Ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos anti-Abeta incluyen solanezumab, bapineuzumab, aducanumab y gantenerumab. El término "corticosteroide" incluye, pero sin limitación, fluticasona (incluido propionato de fluticasona (FP)), beclometasona, budesonida, ciclesonida, mometasona, flunisolida, betametasona y triamcinolona. "Corticosteroide inhalable" significa un corticosteroide que es adecuado para suministrarse por inhalación. Corticosteroides inhalables ilustrativos son fluticasona, dipropionato de beclometasona, budenósido, furoato de mometasona, ciclesonida, flunisolida y acetónido de triamcinolona.

Cuando se trata una amiloidosis que es una enfermedad o trastorno ocular con un anticuerpo de la invención, puede seleccionarse un fármaco neurológico que sea un agente oftálmico antiangiogénico (es decir,, bevacizumab, ranibizumab y pegaptanib), un agente oftálmico para glaucoma (es decir, carbacol, epinefrina, bromuro de demecario, apraclonidina, brimonidina, brinzolamida, levobunolol, timolol, betaxolol, dorzolamida, bimatoprost, carteolol, metipranolol, dipivefrina, travoprost y latanoprost), un inhibidor de la anhidrasa carbónica (es decir, metazolamida y acetazolamida), un antihistamínico oftálmico (es decir, nafazolina, fenilefrina y tetrahidrozolina), un lubricante ocular, un esteroide oftálmico (es decir, fluorometolona, prednisolona, loteprednol, dexametasona, difluprednato, rimexolona, fluocinolona, medrisona y triamcinolona), un anestésico oftálmico (es decir, lidocaína, proparacaína y tetracaína), un antiinfeccioso oftálmico (es decir, levofloxacino, gatifloxacino, ciprofloxacino, moxifloxacino, cloranfenicol, bacitracina/polimixina b, sulfacetamida, tobramicina, azitromicina, besifloxacino, norfloxacino, sulfisoxazol, gentamicina, idoxuridina, eritromicina, natamicina, gramicidina, neomicina, ofloxacino, trifluridina, ganciclovir, vidarabina), un agente antiinflamatorio oftálmico (es decir, nepafenaco, ketorolaco, flurbiprofeno, suprofeno, ciclosporina, triamcinolona, diclofenaco y bromfenaco) y un antihistamínico o descongestionante oftálmico (es decir,, ketotifeno, olopatadina, epinastina, nafazolina, cromolina, tetrahidrozolina, pemirolast, bepotastina, nafazolina, fenilefrina, nedocromilo, lodoxamida, fenilefrina, emedastina y azelastina). Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores puede llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-Abeta.

Artícu los de fabricación

También se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y un marcador o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los envases pueden formarse a partir de diversos materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que está sola o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Por otra parte, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en este, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indica que las composiciones pueden usarse para tratar una afección concreta. Como alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Ejemplos

EJEMPLO 1 - Estudio clínico de crenezumab, un anticuerpo anti-Ap monoclonal humanizado, en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer leve a moderada

Diseño del estudio y objetivos

Se realizó un ensayo de fase II aleatorizado con doble enmascaramiento, usando un control con placebo, para evaluar el impacto del anticuerpo anti-beta amiloide ("Ap") monoclonal humanizado crenezumab en pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer (EA) leve a moderada. Los pacientes incluidos en el estudio tenían, en el momento de la exploración, entre 50 y 80 años y tenían un diagnóstico de probable EA según los criterios NINCDS-ADRDA con: una puntuación en el miniexamen del estado mental (MMSE) de 18 a 26 puntos, una puntuación de la escala de depresión geriátrica (GDS-15) de menos de 6, habían completado 6 años de educación (o buen historial laboral consistente con la exclusión del retraso mental u otros trastornos generalizados del desarrollo). De manera adicional, para aquellos pacientes que reciben tratamiento concomitante para la EA (tal como inhibidores de la acetilcolinesterasa o memantina), se confirmó que el paciente había estado tomando el medicamento durante al menos 3 meses y en una dosis estable durante al menos 2 meses antes de la aleatorización. Al menos el 50 % de los pacientes inscritos eran ApoE4 positivos (que portaban al menos un alelo de ApoE4). También se permitió inscribirse a pacientes que reciben simultáneamente uno o más medicamentos recetados o de venta libre no excluidos, tal como antidepresivos no anticolinérgicos, antipsicóticos atípicos, ansiolíticos no benzodiazepínicos, soporíferos, antihistamínicos anticolinérgicos de acción central y antiespasmódicos anticolinérgicos de acción central, siempre que la dosis administrada fuera constante durante al menos 1 mes antes de la aleatorización y permaneciera igual durante la duración del estudio.

Las personas se excluían del ensayo si: padecen una enfermedad grave o inestable que, en opinión del investigador o patrocinador, interferiría con la capacidad del paciente para completar las evaluaciones del estudio o requeriría el equivalente a atención institucional u hospitalaria; hay antecedentes o presencia de enfermedad vascular clínicamente evidente que podría afectar al cerebro; hay antecedentes de trauma del sistema nervioso central clínicamente significativo, grave (tal como déficit neurológico persistente o daño cerebral estructural); han estado hospitalizados en las 4 semanas previas a la detección; se han tratados previamente con crenezumab o cualquier otro agente que se dirija a Ap; o si han recibido tratamiento con alguna terapia biológica (que no sean las vacunas habituales) dentro de las 5 semividas más largas del agente terapéutico en la terapia biológica o 3 meses antes de la selección.

El estudio tuvo tres períodos: un período de selección que dura hasta 35 días, un período de tratamiento que dura 68 semanas (denominado en el presente documento semana 1, semana 2, etc., hasta la semana 69), y un período de seguimiento de seguridad que dura otras 16 semanas (denominado en el presente documento, semana 70, etc., hasta la semana 85). El tratamiento (o placebo) se administró mediante infusión intravenosa.

Los pacientes se inscriben en el ensayo y se asignan al azar a uno de dos grupos, un grupo de tratamiento (es decir, crenezumab) y un grupo de placebo en una aleatorización 2:1 (grupo de tratamiento:grupo de placebo). Se inscribieron en el ensayo 249 pacientes con una puntuación MMSE de 18 a 26 (categorizada como EA leve a moderada), de los cuales 165 recibieron tratamiento y 84 recibieron placebo. 121 pacientes en el grupo de tratamiento y 61 pacientes en el grupo de placebo tenían una puntuación MMSE entre 20 y 26 (categorizada como EA leve). Dentro de la técnica de tratamiento 117 (o el 70,9%) eran ApoE4 positivos. En el grupo de placebo, 60 pacientes (o 71,4%) eran ApoE4 positivos. Véanse las figuras 4A-B (Tabulación de la disposición del paciente).

Se realizó una evaluación inicial de seguridad de 43 días para determinar la seguridad y tolerabilidad de una dosis intravenosa de 15 mg/kg frente a una dosis intravenosa de 10 mg/kg y se eligió una dosis de 15 mg/kg. Los pacientes de ambos grupos del ensayo recibieron una inyección intravenosa con enmascaramiento cada cuatro semanas durante 68 semanas; basándose en los resultados de la seguridad inicial, los pacientes del grupo de tratamiento reciben 15 mg/kg, mientras que los pacientes del grupo de placebo recibieron una inyección intravenosa de placebo. Véase la figura 5 (Esquema de protocolo).

Los pacientes se evaluaron después de 72 semanas para (a) determinar cambios en la puntuación ADAS-Cog12 y en la puntuación CDR-SOB en las semanas 25, 49 y 73 desde el valor inicial al comienzo del ensayo, para evaluar la inhibición de la progresión de la enfermedad y (b) para determinar la seguridad y tolerabilidad de crenezumab en comparación con placebo. Para estimar la significancia estadística de cualquier cambio medido, se calcularon análisis de covarianza, intervalos de confianza y estimaciones de mínimos cuadrados de la diferencia en el cambio medio con respecto al valor inicial.

La seguridad y tolerabilidad de crenezumab se evaluó midiendo la frecuencia y gravedad de los eventos adversos emergentes del tratamiento a lo largo del ensayo, especialmente casos de ARIA-E sintomática o asintomática (incluyendo edema vasogénico cerebral), ARIA-H sintomática o asintomática (incluyendo microhemorragia cerebral) y macrohemorragia cerebral. La presencia y/o el número de casos de edema vasogénico cerebral durante el período de selección (antes del inicio de la dosificación) o durante el período de tratamiento (después del inicio de la dosificación con placebo o crenezumab) se evaluó mediante la obtención de imágenes por resonancia magnética de recuperación de inversión atenuada de fluido (MRI FLAIR). Véase, p. ej., Sperling et al., 2011, Alzheimer's & Dementia 7:367-385. La presencia y/o el número de microhemorragias cerebrales durante el período de selección (antes del inicio de la dosificación) o durante el período de tratamiento (después del comienzo de la dosificación con placebo o crenezumab) se evaluó mediante el tiempo de relajación de magnetización transversal con obtención de imágenes por resonancia magnética de eco de gradiente de recuperación de desfase adicional no homogéneo (MRI GRE ponderada en T2*).

Resultados

Las mediciones de ADAS-Cog12 a las 73 semanas demuestran que los pacientes que recibieron crenezumab mostraron menos progresión de la enfermedad que los pacientes que recibieron placebo. Como se resume en las tablas que se muestran en la figura 6A-B y en los gráficos que se muestran en las figuras 7-8, el cambio en la puntuación ADAS-Cog12 fue aproximadamente un 24 % (p = 0,12) menos en el grupo de tratamiento que en el grupo de placebo para pacientes con EA leve y aproximadamente un 16 % (p = 0,19) menos en el grupo de tratamiento que en el grupo de placebo, para pacientes con EA leve a moderada. Este efecto también se observó entre los pacientes ApoE4 positivos en el grupo de tratamiento frente al grupo de placebo: hubo un 24,4 % (p = 0,08, no ajustado por multiplicidad) menos de aumento en la puntuación ADAS-Cog12 (donde un aumento en la puntuación ADAS-Cog12 es indicativo de progresión de la enfermedad) en los pacientes que recibieron crenezumab en relación con los pacientes que recibieron placebo. Véanse la figura 6A y la figura 9. Los pacientes ApoE4 positivos incluyeron pacientes con EA tanto leve como moderada. El efecto fue aún más pronunciado cuando se combinaron los resultados de los pacientes leves y ApoE4 positivos: se observó una reducción del 32,4 % (p = 0,05, no ajustado por multiplicidad) en el grupo de tratamiento en relación con el grupo de placebo. Véanse la figura 6A y la figura 10. El efecto del tratamiento aumentó con el aumento de la puntuación MMSE en el momento de la inscripción. Como se muestra en la fig. 6B, cuanto mayor sea la puntuación MMSE, mayor será el porcentaje de reducción de ADAS-Cog12 en el grupo de tratamiento frente al grupo de placebo, que varían desde aproximadamente el 16 % para pacientes con un MMSE entre 18-26 hasta una reducción del 49 % en pacientes con un MMSE entre 25 y 26. Véanse también, la figura 11. Para los pacientes, que tienen una puntuación MMSE entre 22 y 26, el porcentaje de reducción de ADAS-Cog12 en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de placebo fue de aproximadamente el 35 %.

El cambio en CDR-SOB mostró una tendencia similar en el efecto del tratamiento. Como se muestra en la figura 12A, se observó una reducción del 19 % en el cambio en las puntuaciones de CDR-SOB en el grupo de tratamiento frente a placebo para los pacientes que tenían un MMSE de 22-26, y este efecto fue aún más pronunciado en los pacientes que tenían una puntuación MMSE de 25-26, donde el porcentaje de reducción fue de aproximadamente el 63 % (véase también la figura 13). La figura 12B muestra que cuando se observan las puntuaciones de los componentes memoria o juicio y resolución de problemas para pacientes que tienen un MMSE de 22-26, el porcentaje de reducción fue de aproximadamente 42 % y 30 % respectivamente.

El estudio demostró además que crenezumab no aumentó la incidencia de eventos de tipo ARIA cuando se dosificó a 15 mg/kg. Se observó un evento ARIA-E asintomático único en el estudio, en un paciente que recibió crenezumab. El número de incidentes de ARIA-H se equilibró entre los grupos de tratamiento y placebo.

Estos datos demuestran que crenezumab inhibe la progresión de la enfermedad sin aumentar la incidencia de un evento adverso emergente del tratamiento como ARIA-E o ARIA-H cuando se administra a una dosis de 15 mg/kg en pacientes que padecen EA leve a moderada, particularmente en pacientes con EA leve y/o que son ApoE4 positivos.

EJEMPLO 2 - Estudio clínico de crenezumab, un anticuerpo anti-Ap monoclonal humanizado, en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer leve a moderada y para evaluar el impacto en la carga de amiloide

Diseño del estudio y objetivos

Se realizó un ensayo de fase II aleatorizado con doble enmascaramiento, usando un control con placebo, para evaluar el impacto del anticuerpo anti-beta amiloide ("Ap") monoclonal humanizado crenezumab en pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer (EA) leve a moderada. Los pacientes incluidos en el estudio tenían, en el momento de la exploración, entre 50 y 80 años y tenían un diagnóstico de probable EA según los criterios NINCDS-ADRDA con: una puntuación en el miniexamen del estado mental (MMSE) de 18 a 26 puntos, una puntuación de la escala de depresión geriátrica (GDS-15) de menos de 6, habían completado 6 años de educación (o buen historial laboral consistente con la exclusión del retraso mental u otros trastornos generalizados del desarrollo). Solamente se inscribieron los pacientes con una exploración PET con florbetapir positiva ("amiloide positivo") en el momento de la selección, indicativa de un aumento de la carga de amiloide cerebral en el intervalo esperado para pacientes diagnosticados con EA según la evaluación de la exploración PET con florbetapir. De manera adicional, al menos el 50 % de los pacientes inscritos eran ApoE4 positivos.

Los pacientes se inscribieron en el ensayo y se asignaron al azar a uno de dos grupos, un grupo de tratamiento (es decir, crenezumab) y un grupo de placebo en una aleatorización 2:1 (grupo de tratamiento:grupo de placebo). 52 pacientes de ambos grupos del ensayo recibieron una inyección intravenosa con enmascaramiento cada cuatro semanas durante 73 semanas. En el grupo de tratamiento, los pacientes recibieron una dosis de 15 mg/kg de crenezumab. Los pacientes se estratificaron según: el estado de ApoE4 (portador frente a no portador) y puntuación MMSE.

Se recopilaron datos sobre los cambios en: ADAS-Cog12, carga de amiloide medida por PET con florbetapir-PET y niveles de Abeta en líquido cefalorraquídeo (LCR). Las exploraciones PET con Florbetapir se adquirieron en las visitas de selección, a los 12 y 18 meses con florbetapir 10 mCi, con periodo de captación de 50 min. y exploración de emisiones de 30 min. Las imágenes de cuadros de 6X5 minutos (o cuadros de 1X15 minutos en escáneres sin capacidad dinámica) se normalizaron al espacio patrón donde se utilizó una plantilla para extraer las señales medias de varias regiones de interés (ROI, por sus siglas en inglés). Se utilizaron exploraciones de MRI ponderadas en T1 como valor inicial para refinar los volúmenes de las ROI de la plantilla. Los análisis se realizaron utilizando la corteza cerebelosa o la sustancia blanca subcortical como región de referencia. Se recogió LCR en la selección y antes de la dosificación en el mes 18. Se midieron Abeta, tau y p-tau (181) en el LCR. Se utilizó ANCOVA o modelo mixto para medidas repetidas para el análisis estadístico de las diferencias de tratamiento en los criterios de valoración del estudio.

Las características del paciente, los eventos adversos y el momento de las exploraciones PET, las exploraciones MRI y el muestreo de LCR se muestran en la figura 14A-B.

Resultados. Las mediciones de ADAS-Cog12 al final del período de tratamiento demuestran que los pacientes que recibieron crenezumab mostraron una menor progresión de la enfermedad que los pacientes que recibieron placebo. Se observó una reducción del 54,3 % en el declive cognitivo en pacientes con una puntuación MMSE inicial entre 20 y 26 (p = 0,2). Consistente con esta ralentización observada en la progresión de la enfermedad, también se observó una disminución en la acumulación de depósitos de amiloide mediante análisis de PET (con una región de referencia de sustancia blanca subcortical) en pacientes tratados con crenezumab frente a pacientes que recibieron placebo. Véase la figura 15A. Asimismo, se detectó un aumento en la concentración de Abeta en el líquido cefalorraquídeo en el grupo de tratamiento, consistente con el acoplamiento de la diana por crenezumab. Véase la figura 15B. Se detectó un aumento similar en la concentración de Abeta en el líquido cefalorraquídeo en pacientes tratados con administración subcutánea de 300 mg de crenezumab cada dos semanas en comparación con los pacientes que recibieron placebo.

Estos datos demuestran que crenezumab actúa sobre su diana, beta amiloide, e inhibe la progresión de la enfermedad cuando se administra a una dosis de 15 mg/kg en pacientes que padecen EA leve a moderada, particularmente en pacientes con EA leve, incluso en pacientes que tienen una carga de amiloide cerebral que es típica de la que se observa en pacientes diagnosticados con EA.

EJEMPLO 3: Estudio de polimorfism os de un solo nucleótido en un estudio c lín ico de crenezumab, un anticuerpo anti-Ap monoclonal humanizado, asociado con la respuesta al tratam iento en el tratam iento de la enfermedad de Alzheimer leve a moderada

Diseño del estudio y objetivos

Se realizó un ensayo de fase II aleatorizado con doble enmascaramiento usando un control con placebo, para evaluar el impacto del anticuerpo anti-beta amiloide ("Ap") monoclonal humanizado crenezumab en pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer (EA) leve a moderada. Los pacientes incluidos en el estudio tenían, en el momento de la exploración, entre 50 y 80 años y tenían un diagnóstico de probable EA según los criterios NINCDS-ADRDA con: una puntuación en el miniexamen del estado mental (MMSE) de 18 a 26 puntos, una puntuación de la escala de depresión geriátrica (GDS-15) de menos de 6, habían completado 6 años de educación (o buen historial laboral consistente con la exclusión del retraso mental u otros trastornos generalizados del desarrollo). De manera adicional, para aquellos pacientes que reciben tratamiento concomitante para la EA (tal como inhibidores de la acetilcolinesterasa o memantina), se confirmó que el paciente había estado tomando el medicamento durante al menos 3 meses y en una dosis estable durante al menos 2 meses antes de la aleatorización. Al menos el 50 % de los pacientes inscritos eran ApoE4 positivos (que portaban al menos un alelo de ApoE4). Los pacientes que reciben simultáneamente uno o más medicamentos recetados o de venta libre no excluidos, tal como antidepresivos no anticolinérgicos, antipsicóticos atípicos, ansiolíticos no benzodiazepínicos, soporíferos, antihistamínicos anticolinérgicos de acción central y antiespasmódicos anticolinérgicos de acción central, también se les permitió inscribirse siempre que la dosis administrada fuera constante durante al menos 1 mes antes de la aleatorización y permaneciera igual durante la duración del estudio.

Los pacientes se inscribieron en el ensayo y se asignaron al azar a uno de dos grupos, un grupo de tratamiento (es decir, crenezumab) y un grupo de placebo en una aleatorización 2:1 (grupo de tratamiento:grupo de placebo). Se inscribieron en el ensayo 249 pacientes con una puntuación MMSE de 18 a 26 (categorizada como EA leve a moderada), de los cuales 165 recibieron tratamiento y 84 recibieron placebo. 121 pacientes en el grupo de tratamiento y 61 pacientes en el grupo de placebo tenían una puntuación MMSE entre 20 y 26 (categorizada como EA leve). Dentro de la técnica de tratamiento 117 (o el 70,9 %) eran ApoE4 positivos. En el grupo de placebo, 60 pacientes (o 71,4 %) eran ApoE4 positivos. Véanse las figuras 4A-B (Tabulación de la disposición del paciente).

Los pacientes de ambos grupos del ensayo recibieron una inyección intravenosa con enmascaramiento cada cuatro semanas durante 68 semanas; los pacientes del grupo de tratamiento recibieron 15 mg/kg, mientras que los pacientes del grupo de placebo recibieron una inyección intravenosa de placebo.

Los pacientes se evaluaron después de 72 semanas para (a) determinar cambios en la puntuación ADAS-Cog12 y en las semanas 25, 49 y 73 desde el valor inicial al comienzo del ensayo, para evaluar la inhibición de la progresión de la enfermedad en comparación con el placebo. Para estimar la significancia estadística de cualquier cambio medido, se calcularon análisis de covarianza, intervalos de confianza y estimaciones de mínimos cuadrados de la diferencia en el cambio medio con respecto al valor inicial.

De las 224 personas inscritas en el ensayo con medidas ADAS-Cog12 elegibles como valor inicial y en la semana 73, 156 personas dieron su consentimiento informado para los estudios de asociación genética. 55 individuos estaban en el grupo de placebo y 101 estaban en el grupo de tratamiento. Se recogieron muestras de ADN de estos individuos y se sometieron a pruebas de genotipificación y control de calidad. La genotipificación se realizó utilizando un HumanOmni 2.5-8 BeadChip de Illumina (http://support.illumina.com/array/array_kits/humanomni2_5-8_beadchip_kit.ilmn) de acuerdo con protocolos convencionales.

Los datos del genotipo se analizaron para controlar los errores de genotipificación y la calidad de la siguiente manera. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con una tasa de genotipificación > 50 % se conservaron para análisis adicionales. Los SNP que no cumplían con los estándares de control de calidad del ensayo descritos a continuación se eliminaron de la consideración, al igual que los subgrupos que no representaban entre el 25 % y el 75 % de la población del estudio con resultados de SNP. A efectos de control de calidad, se excluyeron las muestras con > 10 % de datos ausentes totales. Las variantes individuales con> 5 % de datos ausentes se excluyeron del análisis adicional. Las variantes restantes se probaron para determinar la relación críptica (a través de la estimación de IBD) (Laurie et al., 2010, Genet Epidemiology 34(6):591-602) y para determinar la contaminación de la muestra (a través de pruebas de exceso de heterocigosidad en un subconjunto representativo de las variantes) como se describe en Turner. et al., 2011, Curr Protoc Hum Genet capítulo 1:Unidad1.19.

Se realizaron análisis exploratorios de 21 variantes genéticas preespecificadas para determinar si había evidencia de un beneficio del tratamiento potencialmente mejorado asociado con la terapia con anticuerpos anti-beta amiloide ("Ap"). Las variantes se seleccionaron de los locus candidatos indicados en la exploración de todo el genoma de EA (véase Lambert et al., 2013) o asociados a múltiples enfermedades. Si no se tipificó una variante en e1HumanOmni 2.5-8 BeadChip de Illumina, se identificó una variante proxy al encontrar variantes altamente correlacionadas dentro de una distancia de 500 kb (desequilibrio de enlace por pares calculado usando r2). Los datos de referencia utilizados para calcular las variantes de proxy con r2 > 0,80 a las 2 l variantes preespecificadas incluyen 1000 Genomes Pilot 1, HapMap3 (versión 2). Dos variantes de interés preespecificadas no tenían un proxy que cumpliera con los criterios r2 y se eliminaron de los análisis posteriores. Se conservaron diecinueve variantes preespecificadas o proxy para los análisis de asociación.

Para probar la existencia de una asociación entre las variantes seleccionadas y el beneficio terapéutico, el cambio medio en ADAS-Cog12 en la semana 73 en el grupo de tratamiento frente al grupo de placebo se evaluó utilizando dos modelos genéticos de herencia. En el primer modelo, se contrastó el cambio medio de ADAS-Cog12 a lo largo del tiempo entre un grupo que consistía en portadores homocigotos y heterocigotos de alelos de riesgo en el grupo de tratamiento frente a todos los individuos del grupo de placebo utilizando un modelo de regresión lineal (como se describe en Lynch, et al., GENETICS AND ANALYSIS OF QUANTITATIVE TRAITS (Sunderland, MA, Sinauer, 1998)). En el segundo modelo, se contrastó el cambio medio de ADAS-Cog12 a lo largo del tiempo entre un grupo que consistía en portadores homocigotos y heterocigotos de alelos protectores en el grupo de tratamiento frente a todos los individuos en el de placebo utilizando el mismo modelo de regresión lineal. Para ambos modelos genéticos, el cambio de ADAS-Cog12 a lo largo del tiempo se designó como el resultado de interés y el estado del grupo como variable predictiva. La importancia del estado del grupo como variable predictiva se evaluó mediante un estadístico t y un valor p bilateral.

Se realizó un análisis de modelo mixto para medidas repetidas (MMRM, por sus siglas en inglés) utilizando SAS™ versión 9.2 en poblaciones portadoras de alelos protectores, así como en poblaciones no portadoras, para analizar los datos longitudinales de ADAS-Cog12. Los modelos tenían efectos fijos para el valor inicial de la medida de resultado, estratos MMSE (<22 frente a> 22), estado de ApoE4, estratos de MMSE por interacción con el estado de ApoE4, visita, tratamiento y visita por interacción con el tratamiento, utilizando matrices de varianza-covarianza no estructuradas.

Resultados Se probaron un total de 19 variantes previamente asociadas con el riesgo de padecer EA para determinar un efecto predictivo sobre la respuesta al tratamiento con crenuzumab. Se identificaron varios SNP con un valor de p de 0,06 o menos para la asociación de un alelo de riesgo o un alelo protector con un efecto de tratamiento basado en el delta de tratamiento estimado en ADAS-Cog12 en la semana 73 entre el grupo de tratamiento y el grupo de placebo. Uno de los SNP identificados fue rs1532278 del gen CLUSTERIN (CLU, también conocido como ApoJ) donde, al ser un portador del alelo protector, T, tenía efectos de tratamiento potencialmente mejorados. Basándose en el análisis MMRM, el delta de tratamiento estimado en ADAS-Cog12 en la semana 73 fue 3,45 en la población SNP positiva (individuos que tienen al menos un alelo protector) frente a -0,78 en la población SNP negativa (individuos que no tienen alelo protector). Estos representan reducciones en porcentaje en el grupo de crenezumab en relación con el grupo de placebo del 35,9 % para los pacientes SNP positivos frente al -7,4 % para los pacientes SNP negativos. Véase la figura 16A-B. El análisis adicional del SNP de CLUSTERIN dentro de la población ApoE4 positiva (figura 17A-B) y población con Alzheimer leve (MMSE 20-26) (figura 18A-B) mostró resultados similares.

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto nivel de detalle a modo de ilustración y ejemplo a efectos de claridad de comprensión, no debe interpretarse que las descripciones y ejemplos limitan el alcance de la invención.

CLAVE DE LISTADO DE SECUENCIAS

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un paciente que padece EA leve a moderada, caracterizado por una puntuación MMSE de entre 18 y 26, comprendiendo el método detectar en una muestra del paciente la presencia o ausencia de un alelo CLUSTERIN que tiene una T en un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs 1532278 y administrar un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado en una cantidad eficaz para tratar la EA en pacientes que tienen al menos un alelo CLUSTERIN que comprende una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs1532278, en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

2. Un método para seleccionar a un paciente que padece EA leve a moderada, caracterizado por una puntuación MMSE de entre 18 y 26, para el tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, que comprende:

(a) detectar en una muestra del paciente la presencia o ausencia de un alelo CLUSTERIN que tiene una T en un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs 1532278; y

(b) seleccionar al paciente como con mayor probabilidad de responder al tratamiento con un anticuerpo anti-Ap monoclonal humanizado cuando en la muestra está presente una T en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs 1532278;

en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

3. Un método para identificar a un paciente que padece EA leve a moderada, caracterizado por una puntuación MMSE de entre 18 y 26, como con mayor probabilidad de responder al tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, que comprende detectar en una muestra del paciente la presencia de un alelo CLUSTERIN que comprende un polimorfismo predictivo de una respuesta al tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

4. Un método para predecir si un individuo que padece EA leve a moderada, caracterizado por una puntuación MMSE de entre 18 y 26, tiene probabilidades de responder al tratamiento que comprende un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, que comprende:

(a) determinar la identidad de un nucleótido en el SNP rs1532278 en una muestra del individuo; y

(b) predecir una mayor probabilidad de responder al tratamiento que comprende el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, cuando la muestra contiene al menos un alelo con un nucleótido T en el SNP rs1532278;

en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

5. Un método para determinar la probabilidad de que un paciente que padece EA leve a moderada, caracterizado por una puntuación MMSE de entre 18 y 26, se beneficie del tratamiento que comprende el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado, comprendiendo el método: determinar el genotipo del paciente en una muestra obtenida del paciente, en donde el paciente que tiene al menos un alelo CLUSTERIN con un nucleótido T en el SNP rs1532278 tiene mayor probabilidad de responder al tratamiento con un anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) monoclonal humanizado que un paciente que no tiene alelos con un nucleótido T en el SNP rs1532278, en donde el anticuerpo anti-beta amiloide (Ap) es crenezumab.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra de un fluido corporal.

7. El método de la reivindicación 6 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde el fluido corporal es una muestra de sangre, saliva, un hisopo de mejilla o una muestra de tejido.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde se detecta un polimorfismo mediante reacción en cadena de la polimerasa.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde se detecta un polimorfismo mediante secuenciación.

10. El método de las reivindicaciones 8 o 9 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1 o en donde se detecta un polimorfismo mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en una sonda de exploración y secuenciación de ADN por nanoporos, pirosecuenciación, electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE), electroforesis con gradiente de temperatura temporal (TTGE), electroforesis en gel de poliacrilamida de Zn(II)-cicleno, análisis de polimorfismo de un solo nucleótido fluorescente homogéneo basado en PCR, electroforesis en gel de poliacrilamida con afinidad por fosfato, plataformas de genotipificación de SNP de alto rendimiento, balizas moleculares, reacción con 5' nucleasa, ensayo con Taqman, MassArray (extensión de cebador de una sola base acoplada con desorción/ionización láser asistida por matriz y espectrometría de masas de tiempo de vuelo), etiquetas de masa de tritilo, plataformas de genotipificación (tal como Invader Assay®), ensayos de extensión de cebador de una sola base (SBE), amplificación por PCR (por ejemplo, amplificación por PCR sobre nanopartículas magnéticas (MNP), análisis de enzimas de restricción de productos de PCR (métodos RFLP), PCR específica de alelo, extensión de cebadores múltiples (MPEX) y amplificación inteligente isotérmica.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde se detecta un polimorfismo mediante la amplificación de una región diana que contiene al menos un polimorfismo y la hibridación con al menos un oligonucleótido específico de secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con al menos un polimorfismo y la detección de la hibridación.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde el paciente tiene una puntuación MMSE de entre 22 y 26.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12 o el anticuerpo para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde el paciente es ApoE4 positivo.