ES2833530T3 - Anticuerpo anti-VEGF - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-VEGF, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, donde la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo se expone en la SEQ ID NO: 34.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-VEGF

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos y sus usos. En particular, la invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), particularmente anticuerpos de cadena pesada, y más particularmente, anticuerpos de dominio único; al igual que a los usos terapéuticos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La angiogénesis se refiere a los nuevos vasos sanguíneos formados a partir del desarrollo de capilares preexistentes o vénulas postcapilares, que es un proceso complejo que implica muchas moléculas de múltiples células. La angiogénesis es un proceso complejo de coordinación de factores angiogénicos y factores inhibitorios, que están en un estado de equilibrio en condiciones normales. El sistema vascular se activaría una vez se rompe el equilibrio, dando como resultado una angiogénesis excesiva o degeneración vascular por inhibición del sistema vascular.

[0003] Hay una serie de enfermedades conocidas por estar asociadas a la angiogénesis desregulada o no deseada. Tales enfermedades incluyen, pero de forma no limitativa, tumores, por ejemplo los denominados tumores sólidos y los tumores líquidos (o hematopoyéticos) (por ejemplo leucemias y linfomas), enfermedades inflamatorias, por ejemplo inflamación reumatoide o reumática, especialmente artritis (incluida la artritis reumatoide), u otra inflamación crónica, por ejemplo asma crónico, arteriosclerosis o arteriosclerosis postrasplante, endometriosis, enfermedades neovasculares oculares tales como retinopatías (incluida la retinopatía diabética), degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerosis. Otras enfermedades asociadas a una angiogénesis desregulada o no deseada serán evidentes para las personas expertas en la técnica.

[0004] El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un factor de crecimiento de unión a heparina específico para la célula endotelial vascular, puede inducir la angiogénesis in vivo. Incluye VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F y factor de crecimiento de la placenta.

[0005] La función principal del VEGF-A es facilitar la proliferación y la migración de la célula endotelial vascular, y la formación del lumen, al igual que aumentar la permeabilidad vascular, promover la quimiotaxis de los monocitos y la formación de las células B. Los efectos biológicos del VEGF-A están mediados por la unión con su receptor específico, que incluye principalmente los receptores específicos del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1 (VEGFR-1) y el VEGFR-2. Además, se considera que el VEGFr -2 es el VEGFR principal, que ejerce un efecto significativo en la proliferación de la célula endotelial vascular. El VEGFR-2 induce, mediante una quinasa intracelular, que el VEGF se una al dímero y los receptores que se van a autofosforilar, aumentando así la mitosis celular (Klettner A, Roider J. Treating age-related macular degeneration interaction of VEGF-antagonists with their target. Mini Rev Med Chem, 2009, 9 (9): 1127-1135). El VEGF-A que comprende ocho exones y siete intrones se empalma en varias isoformas durante la transcripción, principalmente incluidos VEGF121, VEGF145, VEGF206, VEGF165 y VEGF189, que son de diferente peso molecular, solubilidad y capacidad de unión a heparina. Entre estos, VEGF165 es la isoforma más predominante del VEGF-A (Ferrara N, Gerber HP, Le Couter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med, 2003, 9 (6): 669-676). El v Eg F165, que es una proteína soluble secretada, actúa directamente sobre la célula endotelial vascular, promoviendo así la proliferación celular, acelerando la reparación del daño celular, aumentando la permeabilidad vascular, reduciendo la trombosis intravascular y la oclusión de trombo y restringiendo la hiperplasia intimal (Huang Chen-xing, Shen Zu-guang, Vascular endothelial growth factor- fundamental research and experimental study in plastic surgery, Chinese J Reparative and Reconstructive Surgery, 2002 , 160: 64 - 68).

[0006] Los fármacos existentes contra el factor de crecimiento endotelial vascular incluyen pegaptanib sódico (Macugen™), ranibizumab (Lucentis™), bevacizumab (Avastin™), VEGF Trap, etc. Actualmente, la controversia sobre los agentes anti-VEGF se enfoca en la posible exacerbación de la formación de membranas fibrosas de tejido. Un gran problema para los agentes anti-VEGF actuales para el tratamiento clínico de varias enfermedades (como la degeneración macular relacionada con la edad) es que los agentes tienen que ser inyectados intraocularmente con frecuencia, induciendo así un potencial riesgo de endoftalmitis. Los investigadores observaron el efecto de bevacizumab y Macugen sobre las diferentes isoformas del VEGF usando la célula endotelial de la vena umbilical y el fibrocito de Tenon. Los resultados revelaron que el VEGF-165 y el VEGF-121 afectan principalmente a la angiogénesis, mientras que el VEGF-189 afecta principalmente al proceso de fibrogénesis. Bevacizumab y Lucentis pueden inhibir todas las isoformas activas del VEGF-A (Van Bergen T, Vandewalle E, Van de Veire S, et al. The role of different VEGF isoforms in scar formation after glaucoma filtration surgery. Exp Eye Res, 2011, 93: 689-699; y el grupo de investigación CATT, Martin DF, Maguire MG, et al. Ranibizumab and Bevacizumab for neovascular age-related macular degeneration. N Engl J Med, 2011. 364: 1897­ 1908), que puede ser la razón por la que el bevacizumab indujo la fibrosis de la cavidad vítrea en algunos pacientes.

[0007] Actualmente, el tratamiento mediante el uso de agentes anti-VEGF tiene que repetirse cada 4-6 semanas, mientras que la inyección media anual para el tratamiento con Lucentis en el primer año es aproximadamente 6,9 veces, y para el tratamiento con bevacizumab, aproximadamente 7,7 veces (Li X, Hu Y, Sun X, Zhang J, Zhang M. Bevacizumab for neovascular age-related macular degeneration in China. Ophthalmology. 2012 oct., 119(10): 2087-93). Debido a la inyección intraocular frecuente, hay un potencial riesgo de endoftalmitis. En consecuencia, se necesita con urgencia el desarrollo de un nuevo fármaco de anticuerpo con una eficacia de larga duración al igual que una mejor absorción y permeabilidad en la retina, para prolongar el ciclo de administración y para reducir la incomodidad y el riesgo resultantes de la inyección en el paciente.

[0008] Además, las técnicas actuales para la expresión y la purificación de agentes anti-VEGF son complejas y, en la mayoría de los casos, implican un alto coste, una mala estabilidad y una aplicación limitada.

[0009] Un anticuerpo de cadena pesada es un anticuerpo aislado del suero de un camello, que consiste exclusivamente en cadenas pesadas. Su región de unión al antígeno es meramente un dominio único conectado a la región Fc a través de una región bisagra, y la región de unión al antígeno sigue manteniendo la función de unión al antígeno tras la eliminación del anticuerpo. Así, el anticuerpo de cadena pesada se conoce también como anticuerpo de dominio único (sdAb) o nanoanticuerpo (nanocuerpo). A diferencia del anticuerpo convencional, el anticuerpo de dominio único es una cadena peptídica de aproximadamente 110 aminoácidos, con un peso molecular 1/10 de un anticuerpo convencional, que proporciona un nueva vía para la construcción molecular de un anticuerpo (Muyldermans. Single domain camel antibodies: current status. J Biotechnol 2001, 74: 277-302). Este tipo de anticuerpo de dominio único con un pequeño peso molecular es termoestable y también estable frente al detergente y una alta concentración de ácido úrico, con una permeabilidad de tejido superior in vivo y una solubilidad mejorada (Stanfield R, Dooley H, Flajnik M, Wilson I. Crystal structure of a shark single-domain antibody V region in complex with lysozyme. Science. 2004, 305 (5691)). El anticuerpo de dominio único facilita la expresión y es adecuado para la expresión en un sistema procariótico. El anticuerpo de dominio único se caracteriza, además, por ejemplo, por un bajo coste de producción, un único epítopo de reconocimiento de antígeno y la capacidad de identificar sitios antigénicos ocultos. Como resultado, el anticuerpo de dominio único juega un papel creciente e inimaginablemente enorme en cuanto a ensayos inmunológicos, diagnóstico y tratamiento (Dirk Saerens, Gholamreza Hassanzadeh Ghassabeh, Serge Muyldermans. Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics. Current Opinion in Pharmacology 2008, 8: 600-608).

[0010] La WO 2012/028716 A1 se refiere a anticuerpos de dominio VHH contra el VEGF y sus regiones CDR. Los anticuerpos se proporcionan para el uso en el tratamiento de enfermedades que están asociadas a efectos mediados por el VEGF sobre la angiogénesis.

[0011] La US 2010/0120681 A1 se refiere a secuencias de aminoácidos que están dirigidos contra el VEGF. Las secuencias de aminoácidos consisten esencialmente en un nanocuerpo y se pueden usar para fines profilácticos, terapéuticos o diagnósticos de enfermedades caracterizadas por una angiogénesis y neovascularización excesiva y/o patológica.

[0012] La EP 2471 814 A1 divulga un anticuerpo monoclonal contra el VEGF y las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo. El anticuerpo se proporciona para el uso para enfermedades mediadas por VEGF y puede ser producido por una línea celular.

[0013] La publicación S. Lien y H.B. Lowman: "Therapeutic Anti-VEGF Antibodies", Handbook of Experimenal Pharmacology, Springer Verlag, Berlín, DE, vol. 181, n.° 3, 1 de enero de 2008, páginas 131-150; XP009151730; ISSN: 0171-2004, divulga la ingeniería molecular de dos anticuerpos humanizados derivados de un anticuerpo anti-VEGF de ratón común. Los dos anticuerpos anti-VEGF han demostrado una utilidad terapéutica en el bloqueo de la angiogénesis inducida por el VEGF.

[0014] Por lo tanto, se necesita en la técnica un anticuerpo que sea capaz de superar los problemas mencionados anteriormente de los agentes anti-VEGF existentes, por ejemplo, un anticuerpo de dominio único que pueda unirse específicamente al VEGF e inhibir su actividad.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0015] La presente invención proporciona un anticuerpo anti-VEGF y las variantes o derivados del mismo, tal y como se define en las reivindicaciones, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, y donde la región variable de cadena pesada comprende (i) CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

[0016] En formas de realización particulares, la presente invención proporciona anticuerpos de cadena pesada consistentes en cadenas pesadas, donde la región variable de la cadena pesada comprende: (i) CDR1, CDR2 y CDR3, como se expone en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

[0017] En un aspecto, la región variable de la cadena pesada del anticuerpo según la presente invención comprende al menos una adición, inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos. En otro aspecto, el anticuerpo según la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico y/o un anticuerpo biespecífico al igual que fragmentos de los mismos. En una forma de realización particular, el anticuerpo según la presente invención es humanizado.

[0018] En una forma de realización particular, la cadena pesada del anticuerpo según la presente invención también puede comprender una región constante. En otra forma de realización, la cadena pesada del anticuerpo según la presente invención comprende también un fragmento Fc.

[0019] En determinadas formas de realización, el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo de cadena pesada, es decir, que consiste exclusivamente en cadenas pesadas. En determinadas formas de realización, el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo de dominio único.

[0020] La presente invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos mencionados anteriormente.

[0021] La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo según la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además uno o más compuestos terapéuticamente activos, por ejemplo los fármacos anti-VEGF o fármacos antitumorales conocidos.

[0022] En otro aspecto, la invención también se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC), que comprende el anticuerpo según la presente invención conjugado con otros agentes, por ejemplo agentes quimioterapéuticos, inhibidores de crecimiento, toxinas (como, por ejemplo, toxinas de actividad enzimática de origen bacteriano, fúngico, vegetal u animal, o fragmentos de las mismas) o radioisótopos (es decir, conjugados radiactivos).

[0023] Un conjugado de anticuerpo-fármaco también puede comprender conectores entre la unidad farmacológica y la unidad de anticuerpo.

[0024] La presente invención proporciona también un kit, que comprende a) el anticuerpo anti-VEGF según la presente invención, o la composición farmacéutica; y b) sus instrucciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

[0025]

La figura 1 muestra un gráfico de SDS-PAGE de la proteína hVEGF165 purificada. El carril 1 corresponde a un marcador de proteína estándar (Invitrogen, N.° Cat.: LC5677); el carril 2 corresponde a 2 pg de hVEGF165 no reductora; el carril 3 corresponde a 5 pg de hVEGF165 no reductora; el carril 4 corresponde a 2 pg de hVEGF165 reductora; el carril 5 corresponde a 5 pg de hVEGF165 reductora.

La figura 2 muestra el resultado del ensayo inmunológico, que indica una respuesta inmunitaria satisfactoria tras la inyección de antígeno al animal, y el título de suero es aproximadamente 1: 100k.

La figura 3 muestra un resultado de electroforesis en gel de agarosa del ARN total, que indica que la calidad de ARN derivado cumplía el requisito para la construcción de una biblioteca.

La figura 4 muestra el resultado de purificación por electroforesis en gel de agarosa de fragmentos V^hH derivados de la amplificación por PCR después de la transcripción inversa de ARN total en la figura 3 a ADNc. La figura 5 ilustra un vector fagémido para el ligamiento del fragmento V^hH.

La figura 6 muestra la determinación del índice de inserción de fragmento de la biblioteca de exposición en fagos. Se detectaron por PCR 72 clones seleccionados de forma aleatoria, entre los cuales se insertaron 69 clones con el fragmento de gen de anticuerpo de dominio único, y así el índice de inserción fue 69/72= 95,8%.

La figura 7 ilustra la determinación de la diversidad de secuencia de la biblioteca de anticuerpos de dominio único obtenida por secuenciación de los clones positivos con fragmento insertado de la figura 6, y se demuestra una diversidad satisfactoria de la biblioteca.

La figura 8 ilustra un vector especializado para el cribado FASEBA. Se puede usar un vector resistente a la ampicilina, que contiene SASA y un marcador 6xHis, para la expresión secretada del anticuerpo.

La figura 9 ilustra la clasificación de afinidad de los anticuerpos a través del cribado FASEBA; 9A, 9B y 9C presentan los resultados de la clasificación de afinidad de 3 lotes diferentes. La parte superior izquierda: sensograma que muestra la unión y la disociación de diferentes clones; la parte superior derecha: diagrama matricial que muestra las tasas de unión y de disociación de diferentes clones; la parte inferior izquierda: sensograma de diferentes clones normalizados; la parte inferior derecha: sensograma de anticuerpos seleccionados con alta afinidad.

La figura 10 muestra el resultado del cribado competitivo del receptor. Después del cribado del nivel de expresión y de la clasificación de afinidad, se seleccionaron 15 anticuerpos de dominio único para el cribado. Según los resultados competitivos en comparación con un control, se seleccionaron 7 clones superiores para la preparación de anticuerpos de cadena pesada y el ensayo de inhibición de la proliferación celular.

La figura 11 muestra una curva de inhibición del anticuerpo de cadena pesada en la proliferación de células HUVEC. A partir del nivel de inhibición sobre la proliferación celular por diferentes concentraciones del anticuerpo, se puede juzgar que 13 anticuerpos de cadena pesada todos mostraron un efecto inhibidor con grados variables, entre los que A80887, A80723 y A69458 mostraron la mayor inhibición en el nivel celular. La figura 12 muestra las secuencias de región variable de los 13 anticuerpos de cadena pesada del ejemplo 11.

La figura 13 es una representación esquemática de los vasos subintestinales del pez cebra. Un cierto periodo de tiempo después de la administración, se seleccionaron de forma aleatoria 15 peces cebra de cada grupo y se tomaron imágenes bajo un microscopio fluorescente, y entonces se realizó el análisis cuantitativo del área de los vasos subintestinales (SIVs). El análisis estadístico se realizó con una prueba T entre dos grupos, y con un ANOVA unidireccional y una prueba T de Dunnett entre más grupos, donde p < 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa. La eficiencia de inhibición de la angiogénesis se puede calcular según la fórmula siguiente:

La figura 14 es un gráfico que muestra el área de los vasos subintestinales. Como se muestra en el gráfico, como Avastin, el A80887 presenta una inhibición significativa sobre la angiogénesis.

La figura 15 es un gráfico que muestra la tasa de inhibición del área de los vasos subintestinales. Se usó Avastin como control positivo. Con la misma masa molar (ambas eran de aproximadamente 2,7 pmol), la eficiencia de inhibición de la angiogénesis del A80887 fue del 23,2%, que fue obviamente mejor que el 6,9% de Avastin (p < 0,001). No hay diferencia estadística en cuanto a la eficiencia de inhibición de la angiogénesis, en comparación con la administración de Avastin con una dosificación clínica convertida de 1 pg (6,7 pmol).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0026] La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente al VEGF, y a variantes o derivados de los mismos; al igual que a sus usos terapéuticos. Por ejemplo, la presente invención se refiere a anticuerpos de cadena pesada que se unen específicamente al VEGF y, más particularmente, a anticuerpos de dominio único. Mientras tanto, los anticuerpos según la presente invención muestran mejores efectos en la inhibición de la proliferación celular y la angiogénesis que el anticuerpo monoclonal anti-VEGF del estado de la técnica (por ejemplo Avastin), como se describe adicionalmente en los ejemplos siguientes.

[0027] El anticuerpo de dominio único según la presente invención con un peso molecular menor, generalmente 12-15kD, en comparación con un fragmento Fab y un anticuerpo IgG en toda su longitud, se puede usar para construir un anticuerpo polivalente, y tiene una afinidad mejorada, una vida media prolongada al igual que un intervalo de dosificación extendido por ingeniería genética. En comparación con los fármacos de anticuerpos ordinarios, la afinidad de unión al antígeno de los anticuerpos de dominio único es más estable bajo algunas condiciones extremas, como por ejemplo a alta temperatura, en ácido gástrico y proteasas, etc., y los anticuerpos de dominio único tienen una alta estabilidad conformacional. A diferencia de los fármacos de anticuerpos que son propensos a inducir efectos del complemento y respuestas citotóxicas, un anticuerpo de dominio único sin fragmento Fc, no induciría ningún efecto del complemento. Mientras tanto, debido a su pequeño peso molecular, el anticuerpo de dominio único muestra una mejor penetración cuando se administra en tejidos oculares y tejidos tumorales. Resulta factible administrar el anticuerpo de dominio único por vía oral o por otras vías, debido a la estabilidad en un entorno con proteasa, temperaturas y pH extremos, al igual que a la alta afinidad de los mismos.

[0028] Los anticuerpos de dominio único se pueden expresar dentro de células procarióticas o eucarióticas, como por ejemplo Escherichia coli o levadura, a gran escala, lo que es inmensamente beneficioso para una producción a gran escala y el control de los costes de producción, al igual que una buena perspectiva de mercado para el desarrollo farmacológico posterior.

[0029] A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente las personas expertas en la técnica.

[0030] El término "anticuerpo" es bien entendido en los campos biológico y biomédico y comúnmente se refiere a anticuerpos enteros y a cualquier fragmento de anticuerpo o cadena única del mismo. Los anticuerpos son glicoproteínas secretadas por los linfocitos B especializados conocidos como células plasmáticas. También se les denomina inmunoglobulinas (Ig) porque contienen un dominio estructural común que se halla en muchas proteínas. Los anticuerpos comprenden muy probablemente dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) conectadas típicamente por enlaces disulfuro, o una porción de unión al antígeno de los mismos. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (V^h) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está compuesta también por una región variable (V^l) y una región constante. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones V^h y V^l se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), dispersadas entre regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (Fr ). En determinadas formas de realización, el anticuerpo según la presente invención consiste exclusivamente en cadenas pesadas. En determinadas formas de realización, el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo de dominio único.

[0031] Las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo dado se pueden identificar usando los métodos descritos por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication n.° 91-3242, 1991.

[0032] La presente invención abarca las "variantes" de anticuerpos, por ejemplo, la región variable de cadena pesada del anticuerpo según la presente invención comprende al menos una adición, inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos; por ejemplo 10, 20, 30, 40, 50 y preferiblemente, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 adiciones, inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos.

[0033] La presente invención incluye también "derivados" de anticuerpos. Los "derivados" de anticuerpos son anticuerpos químicamente modificados, por ejemplo, por unión con otras partes químicas, como por ejemplo polietilenglicol, albúmina (por ejemplo albúmina de suero humana), fosforilación y glicosilación. A menos que se especifique lo contrario, el término "anticuerpo" incluye los fragmentos, los derivados y las variantes del mismo.

[0034] En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-VEGF y las variantes o los derivados del mismo, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, y donde la región variable de cadena pesada comprende: (i) CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

[0035] En formas de realización particulares, la presente invención proporciona anticuerpos de cadena pesada consistentes en cadenas pesadas, y la región variable de la cadena pesada comprende: (i) CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

[0036] En una forma de realización específica, la cadena pesada del anticuerpo según la presente invención también puede comprender una región constante. En otra forma de realización específica, la cadena pesada del anticuerpo según la presente invención comprende también un fragmento Fc.

[0037] En determinadas formas de realización, el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo de cadena pesada, es decir, que consiste exclusivamente en cadenas pesadas. En determinadas formas de realización, el anticuerpo según la presente invención es un anticuerpo de dominio único.

[0038] La cadena pesada del anticuerpo según la presente invención se expone en la SEQ ID NO: 34.

[0039] La presente invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos mencionados anteriormente.

[0040] En formas de realización particulares, la secuencia de ácido nucleico se muestra en las SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 59, como se elabora en las formas de realización a continuación.

[0041] La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo según la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además uno o más compuestos terapéuticamente activos, por ejemplo los fármacos anti-VEGF o los fármacos antitumorales conocidos, como se elabora en las formas de realización a continuación.

[0042] El compuesto terapéuticamente activo se puede administrar con el anticuerpo según la presente invención simultánea o consecutivamente.

[0043] La composición farmacéutica se puede preparar como se conoce en la técnica. El término "excipiente" generalmente se refiere a cualquier componente distinto a los ingrediente(s) terapéutico(s) activo(s). El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva y/o una sustancia no medicinalmente activa. El excipiente puede servir para varios fines, por ejemplo como un portador, vehículo, diluyente, adyuvante para comprimidos y/o para mejorar la administración y/o la absorción de la sustancia activa. La formulación de ingredientes farmacéuticamente activos con varios excipientes se conoce en la técnica, véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo la 19a edición (1995) y cualquier edición posterior). Ejemplos no limitativos de excipientes son: solventes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes quelantes y estabilizadores.

[0044] Los anticuerpos según la presente invención se pueden administrar como composiciones farmacéuticas. Se pueden preparar no solo como preparaciones líquidas por ejemplo inyecciones, formulaciones liofilizadas, aerosoles etc., sino también como preparaciones sólidas, como por ejemplo cápsulas. La vía de administración puede ser, por ejemplo, a través de inyección intravenosa, administración oral o tópica, como, por ejemplo, transdérmica, conjuntival y/u ocular, etc. En una forma de realización particular, la vía de administración es oral. En otra forma de realización particular, la vía de administración es ocular.

[0045] En otro aspecto, la presente invención también se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende el anticuerpo según la presente invención conjugado con otros agentes, por ejemplo agentes quimioterapéuticos, inhibidores de crecimiento, toxinas (como por ejemplo toxinas de actividad enzimática de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o radioisótopos (es decir, conjugados radiactivos).

[0046] La administración local de otros agentes usando un conjugado de fármaco y anticuerpo puede dirigir los agentes a un tumor, mientras que la administración sistémica de fármacos no conjugados puede llevar a una citotoxicidad inaceptable para las células normales al igual que para las células tumorales que se pretenden eliminar.

[0047] Un conjugado de anticuerpo-fármaco comprende comúnmente conectores entre la unidad farmacológica y la unidad de anticuerpo. En determinadas formas de realización, los conectores pueden ser escindidos en la célula y, así, la escisión de los conectores induciría la liberación de la unidad farmacológica del anticuerpo en el entorno intracelular. Los conectores pueden ser, por ejemplo, conectores peptídicos que pueden ser escindidos por la peptidasa o la proteasa intracelulares (incluyendo, pero de forma no limitativa: lisosomas o proteinasas de cuerpos de inclusión). En determinadas formas de realización, la longitud del conector peptídico es al menos dos aminoácidos o al menos tres aminoácidos. En una forma de realización específica, el conector peptídico que puede ser escindido por la proteasa intracelular es un conector Val-Cit o un conector Phe-Lys.

[0048] En otras formas de realización donde el conector puede no ser escindido, el fármaco se libera de, por ejemplo, la degradación del anticuerpo.

[0049] La presente invención proporciona también un kit, que comprende a) el anticuerpo anti-VEGF según la presente invención, o la composición farmacéutica; y b) sus instrucciones.

[0050] La presente invención se ilustra adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1. Preparación de antígeno

[0051] El antígeno diana en este ejemplo es la molécula de VEGF165 humano (factor de crecimiento endotelial vascular humano 165, hVEGF165) (Park JE, Keller GA, Ferrara N. The vascular endothelial growth factor (VEGF) isoforms: differential deposition into the subepithelial extracellular matrix and bioactivity of extracellular matrixbound VEGF. Mol Biol Cell. Dic.de 1993, 4(12): 1317-26; Gengrinovitch S, Greenberg s M, Cohen T, Gitay-Goren H, Rockwell P, Maione TE, Levi BZ, Neufeld G. Platelet factor-4 inhibits the mitogenic activity of VEGF121 and VEGF165 using several concurrent mechanisms. J Biol Chem. 23 de jun. de 1995; 270(25): 15059-65; y Keyt BA, Berleau LT, Nguyen HV, Chen H, Heinsohn H, Vandlen R, Ferrara N. The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 29 de mar. de 1996;

271(13): 7788-95), donde la secuencia de ácido nucleico del antígeno VEGF165 humano se expone en la SEQ ID NO: 61; la secuencia de aminoácidos del antígeno VEGF165 humano se expone en la SEQ ID NO: 62.

[0052] Los codones se optimizaron para la expresión en mamíferos según la secuencia de aminoácidos. El ADN optimizado obtenido por síntesis génica total se clonó en el vector de expresión eucariota pTT5 (autorizado por la institución NRC) para la preparación del plásmido de transfección. Se cultivaron células HEK293E durante 7 días tras la transfección y se recogieron por centrifugación. El sobrenadante se usó para una purificación de intercambio iónico en dos pasos con una columna Capto manualmente ensamblada e HiTrap™ Q HP, donde se eliminó la endotoxina. La concentración de proteína se determinó usando la absorbancia a UV280nm; el nivel de endotoxina proteica se detectó por el método LAL; y la actividad antigénica se determinó por ensayo de proliferación de células HUVEC. La proteína hVEGF165 se obtuvo con una concentración de 1,25 mg/ml, un volumen de 22 ml y una cantidad total de 27,5 mg, con un nivel de endotoxina de 0,537 UE/ml (tabla 1). Los resultados de la SDS-PAGE se muestran en la figura 1, y la proteína se almacenó a -80°C.

Tabla 1 Proteína hVEGF165 purificada

Proteína Volumen (ml) Concentración (mg/ml) Cantidad total (mg) Endotoxina (EU/ml) hVEGF165 22 1,25 27,5 0,537

Ejemplo 2. Inmunización animal y prueba de respuesta inmunitaria

1. Inmunización animal

[0053] Se seleccionó la alpaca (Lama pacos) como el animal experimental y se realizaron seis inyecciones puntuales en las regiones escapular y posterior, respectivamente, en cuatro puntos de tiempo diferentes. El antígeno se diluyó en PBS y el volumen para cada inmunización fue de 1 ml. En la tabla 2 se muestra información en relación con la cantidad de antígeno y el adyuvante. Se incluyó BSA en el reactivo inmunológico con una concentración final de 1 mg/ml. El antígeno y el adyuvante fueron recién preparados y se mezclaron antes de la inyección.

Tabla 2 Información del antígeno para la inmunización de la alpaca

[0054] El esquema de inmunización (tabla 3) se diseñó para recoger sangre de la vena yugular en cuatro puntos de tiempo diferentes, y se añadió anticoagulante durante la recogida de sangre. La primera recogida fue de 5 ml y las restantes tres recogidas fueron cada 15 ml. Tras la centrifugación en gradiente de densidad usando el reactivo Ficoll 1.077 (Sangon, N.° Cat.: F760014-100) y anticoagulante, los linfocitos de sangre periférica se aislaron y se resuspendieron para el recuento celular. Con la adición de RNAlater (TIANGEN, N.° Cat.:D P408-02), las células se almacenaron a -20 °C. Los sueros obtenidos de la centrifugación en gradiente también se almacenaron a -20°C.

Tabla 3 Programa de inmunización de alpaca

Día Feha Manipulación

Día 0 11-10-2010 se extrajeron 5 ml de sangre periférica, inmunización primaria

Día 28 08-11-2010 la primera inyección de refuerzo

Día 49 29-11-2010 la segunda inyección de refuerzo

Día 56 06-12-2010 se extrajeron 15 ml de sangre periférica

Día 70 20-12-2010 la tercera inyección de refuerzo

Día 73 23-12-2010 se extrajeron 15 ml de sangre periférica

Día 77 27-12-2010 se extrajeron 15 ml de sangre periférica

2. Prueba de respuesta inmunitaria

[0055] La respuesta inmunitaria específica antigénica de la muestra de suero preinmune y la muestra de suero obtenida tras las inyecciones tercera y cuarta se evaluaron por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). El inmunógeno se diluyó con solución de NaHCO3 (pH 9,6) y la placa de micropocillos (Corning, N.° Cat.: 9018) se recubrió a 4°C durante toda la noche. La placa de micropocillos se lavó 4 veces en un lavador de placas con solución PBS-T y se bloqueó con solución de bloqueo de BSA al 3% a 37°C durante 2 h. La placa de micropocillos se lavó cuatro veces con solución PBS-T, entonces el suero de dilución en gradiente se incubó a 37°C durante toda la noche. La placa de micropocillos se lavó cuatro veces con solución PBS-T, luego se incubó con el anticuerpo secundario IgG anti-llama de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Novus Biologicals, n.° de cat.: NB7242). Se usó TMB para el desarrollo durante 10 min, luego se añadió HCl 1M para detener la reacción. El sistema de reacción tras la terminación de la reacción se detectó para una absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas MK3 (Thermo). Se puede concluir, a partir de los resultados del ELISA, que se indujo una respuesta inmunitaria satisfactoria tras la inyección de antígeno al animal, con el título de suero de 1: 100k (figura 2).

Ejemplo 3. Construcción de biblioteca en fagos de anticuerpos

3.1. Aislamiento de ARN

[0056] Se añadió reactivo TRIzol a los linfocitos de sangre periférica aislados en un volumen según el número de células correspondiente. Tras la lisis celular, se realizaron el aislamiento y la extracción del ARN total después de la instrucción del sistema de purificación de ARN TRIzol® Plus (Invitrogen, N.° Cat.:12183-555). La calidad del ARN total se determinó por electroforesis en gel de agarosa y la concentración de ARN se midió por un método de absorción de luz. Según las mediciones, se obtuvieron 105,6 pg de ARN total. El ARN mostró una morfología intacta en la electroforesis en gel de agarosa (figura 3), que cumplía los requisitos para la construcción de la biblioteca.

3.2. PCR de transcripción inversa

[0057] El ARN total se retrotranscribió a ADNc usando un cebador oligo (dT) 20 según la instrucción del sistema SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, N.° Cat.: 18080-051). Según la característica de secuencia del anticuerpo de camello, se seleccionaron cebadores directos y cebadores inversos específicos para la amplificación de VHH (A. Bell et al., Differential tumor-targeting abilities of three single-domain antibody formats, Cancer Lett. 1 de mar. de 2010; 289(1): 81-90; y Honda Toshio, Akahori, Yasushi, Kurosawa Yoshikazu. Methods of constructing camel antibody libraries. Patente estadounidense 2005/0037421 A1) y las secuencias de los cebadores se especifican en la tabla 4. Los fragmentos que contienen un segmento v Hh de aproximadamente 600 pb se aislaron y se purificaron según los pesos moleculares de los productos de la PCR a través de la primera ronda de PCR de ADNc, luego los fragmentos VHH se obtuvieron a través de la segunda ronda de amplificación por PCR. Dos sitios de la enzima de restricción Sfi I para diferentes secuencias de reconocimiento se introdujeron simultáneamente en ambos extremos del fragmento de ADN, y se obtuvieron así un total de 101 pg de fragmentos VHH purificados en gel (figura 4).

Tabla 4 Secuencias de cebadores y amplificación por PCR

3.3 Construcción de biblioteca

[0058] Se mezclaron fragmentos VhH amplificados a partir de distintos cebadores usando diferentes lotes de células, y luego se digirieron con la enzima de restricción Sfi I. Los fragmentos VhH se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se purificaron, y se obtuvo así la VhH digerida; mientras tanto, el vector fagémido (figura 5) se digirió con la enzima de restricción Sfi I, se separó por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se purificó, y se obtuvo así el vector digerido. La concentración de VhH y vector fagémido digeridos se determinó por espectrofotometría de absorción. Posteriormente, el vector se mezcló con el fragmento con una proporción molar de 1:3, 1:5, 1:10 de vector/fragmento, respectivamente, seguido de la adición de ligasa T4 (NEB, N.° Cat.: M0202L), y así se preparó el sistema de reacción de ligamiento de igual volumen. El ligamiento se realizó a 16°C durante toda la noche. La extracción con fenol/cloroformo, la extracción con cloroformo y la precipitación con etanol se realizaron consecutivamente en el sistema de ligamiento, y luego se determinó la concentración de los productos de ligamiento purificados por espectrofotometría de absorción. Se realizó una electrotransformación para los productos obtenidos de tres sistemas de ligamiento diferentes con la misma cantidad de ADN y por células competentes TG1. El tamaño de la biblioteca de tres sistemas de ligamiento, es decir, la eficiencia de transformación, se calculó por el método de siembra y dilución en gradiente. Se seleccionaron clones positivos de forma aleatoria y se enviaron para la prueba de diversidad de la biblioteca. Se eligió un sistema de reacción con la máxima eficiencia de transformación para un ligamiento y transformación a gran escala, y se calculó la capacidad de la biblioteca. Según los resultados del recuento de las placas, la capacidad de la biblioteca fue aproximadamente 1,8*10® (tabla 5).

Tabla 5 Cálculo de la capacidad para una biblioteca de exposición en fagos de anticuerpos de dominio único Dilución Capacidad-A Capacidad-B

10-2 1920 2800

10-3 760 680

10-4 58 57

10-5 5 9

[0059] Se realizó una PCR de clonación aleatoria sobre la colonia de la biblioteca, y se puede observar que el índice de inserción del fragmento en la biblioteca fue 95,8% (figura 6). Entonces se secuenciaron los clones positivos con fragmento insertado y se demostró una diversidad satisfactoria de la biblioteca a través del alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR en los anticuerpos de dominio único (figura 7). Después de la siembra en placas durante toda la noche, las bacterias se recogieron con medio de cultivo 2YT con 100 |jg/ml de ampicilina y glucosa al 2%, y luego se centrifugaron a 5.000 g para eliminar los metabolitos celulares. Un duplicado de las células se resuspendió en el mismo medio de cultivo para el almacenamiento en la biblioteca.

Ejemplo 4. Presentación en fagos y cribado

4.1. Preparación de complejo de antígeno biotinilado

[0060] La proteína HVEGF165 se biotiniló según la instrucción del EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit (Pierce, N.° Cat.: 21335). El ensayo HABA se usó para la detección del nivel de biotinilación de la proteína. La hVEGF165 biotinilada se mezcló con 0,5 ml de esferas de estreptavidina M-280 (Invitrogen, N.° Cat.: 112.06D) y se incubó a 4°C durante toda la noche. Luego las esferas se separaron con una gradilla magnética. La proteína biotinilada que no se unió a las esferas se eluyó con solución PBS, y se usó además para la preparación de complejo antigénico acoplado a esferas. Se obtuvieron 0,52 mg de proteína hVEGF165 después de la biotinilación y la purificación, y el nivel de biotinilación detectado por ensayo HABA fue 6 moles de moléculas de biotina por mol de proteína.

4.2. Recuperación de biblioteca de fagos

[0061] Se inocularon aproximadamente 100 j l (el MOI fue aproximadamente 20) de stock de biblioteca de fagos en medio 2YT, y se incubó a 225 rpm, 30°C. Se añadió el fago auxiliar M13KO7 (NEB, N.° Cat.: N0315S) durante la fase de crecimiento logarítmico (OD600=0,5), se incubó a 225 rpm, 30°C durante toda la noche. Los fagos se recogieron por centrifugación, y el sobrenadante del cultivo se mezcló con solución de PEG/NaCl y luego se centrifugó para el sedimento de fago. Finalmente, los sedimentos de los fagos recuperados se suspendieron en 1-2 ml de PBS después de múltiples centrifugaciones y resuspensiones. El título de la biblioteca de fagos recuperada se calculó por dilución en gradiente limitada, y se obtuvo así una biblioteca de 3,15*1013 pfu/ml.

4.3. Cribado de fagos contra la proteína diana

[0062] Se tomaron fagos de ~2*1011 pfu como la entrada de la primera ronda, se incubaron con 10 ul de complejo de antígeno-esfera magnética a temperatura ambiente y se mezclaron suavemente en un rotor durante 2 horas; las esferas magnéticas se separaron con una gradilla magnética. Los fagos que no se unieron a las esferas magnéticas se eliminaron por lavado. La resuspensión de las esferas magnéticas y la elución de la unión inespecífica debería realizarse 7 veces. Las esferas de la última resuspensión se añadieron a la solución de TEA.

Los fagos que se unen al complejo de antígeno-esfera se eluyeron y se separaron, y se neutralizaron inmediatamente por adición de tampón Tris-HCl. El resultado de fagos de la primera ronda de cribado se calculó por dilución en gradiente limitada, mientras que los fagos obtenidos en la primera ronda de elución se incubaron durante toda la noche y se amplificaron. Los parámetros y procedimientos detallados fueron los mismos que los anteriormente descritos para la recuperación de la biblioteca. La biblioteca amplificada a partir del resultado ~1011 pfu obtenidos en la primera ronda de cribado se usó como la entrada de la segunda ronda, y se incubó y se seleccionó con 1 ul de complejo de antígeno-esfera. Los parámetros y los procedimientos detallados fueron los mismos que en la primera ronda de cribado.

4.4. Identificación ELISA de fagos

[0063] Se seleccionó una única placa clonal de la placa incubada durante toda la noche usada para el cálculo del resultado en la segunda ronda de cribado, se inoculó en una placa de 96 pocillos profundos con 500 j l de medio 2YT en cada pocillo y se incubó a 225 rpm, 30°C. En la fase de crecimiento logarítmico (OD600=0,5) se añadió el fago auxiliar M13KO7 (NEB, N.° Cat.: N0315S), y el cultivo se incubó a 225 rpm, 30°C durante toda la noche. Las bacterias se recogieron por centrifugación, y luego se añadió el sobrenadante obtenido a una placa de micropocillos recubierta previamente con hVEGF165 y se bloqueó. El anticuerpo monoclona1HPR/anti-M13 (GE Healthcare, N.° Cat.: 27-9421-01) se usó como el anticuerpo secundario para la detección, mientras que otros parámetros para el ELISA fueron los mismos que en la prueba de respuesta inmunitaria anterior. El índice de positivos de los resultados se evaluó a partir de la absorbancia de luz. Algunos clones de fagos positivos seleccionados de forma aleatoria con reconocimiento antigénico se sometieron a la secuenciación de los fragmentos V^hH, y se infirió la diversidad de los clones derivados de la presentación en fagos a partir del alineamiento y el análisis de las secuencias. Si se requerían más rondas de cribado de presentación en fagos se puede determinar según el índice de positivos y la diversidad de secuencia. El clon de fago positivo fue más del 50% y cumplía el requisito de diversidad. Por lo tanto, los fagos obtenidos de la segunda ronda de cribado se seleccionaron para la clonación del gen sdAb y la construcción de la biblioteca FASEBA, permitiendo así un cribado clonal adicional.

Tabla 6 Panning de fagos y ensayo ELISA

Número de Entrada Resultado Relación de Enriquecimiento Índice de positivos de ronda (pfu) (pfu) resultado/entrada ELISA de los fagos 1 2*10A11 6,19*10A5 3,095x10-6 1 16,3%

2 10A11 1,35*109 1,35x10-2 4361 56,5%

Ejemplo 5. Cribado FASEBA

5.1. Construcción de la biblioteca FASEBA

[0064] Se extrajeron ADN de fagos obtenidos de la última ronda de presentación en fagos. El fragmento codificante de VhH se amplificó por PCR y se clonó en un vector FASEBA patentado por ligamiento. Como tal, la estructura general del clon construido fue VHH-conector-SASA-6xHis (figura 8). El producto de ligamiento será transformado en las células TG1.

5.2. Cribado FASEBA

5.2.1. Preparación de muestras y evaluación del nivel de expresión

[0065] Se cogieron de forma aleatoria clones únicos de la biblioteca FASEBA construida y se pusieron en una placa de 96 pocillos profundos con 500 pl de medio 2YT en cada pocillo. Cuando el cultivo alcanzó una OD600 de 0,6-0,8, se añadió IPTG para inducir la expresión durante toda la noche. Las bacterias se recogieron por centrifugación y se añadieron a una placa de micropocillos que se recubrió previamente con BSA y se bloqueó después de la eliminación de 100 pl de sobrenadante. Se usó el anticuerpo monoclonal anti-His de ratón marcado con HPR (GenScript, N.° Cat.: A00186) como el anticuerpo secundario para la detección. Mientras tanto, una parte alícuota del sobrenadante se añadió a una placa de micropocillos que se recubrió previamente con proteína hVEGF165 y se bloqueó. El anticuerpo monoclonal anti-His de ratón marcado con Hp R (GenScript, N.° Cat.: A00186) se usó como el anticuerpo secundario para la detección. La absorbancia OD450 se usó para la evaluación del nivel de expresión de diferentes clones. Se seleccionaron más de 5.000 clones en total de diferentes lotes según el nivel de expresión y la capacidad de unión al antígeno, y 138 clones positivos con una expresión relativa más alta y una mayor capacidad de unión al antígeno se seleccionaron para la clasificación de afinidad y cribados posteriores.

5.2.2. Preparación de chips

[0066] Según el manual del instrumento BIAcore T200, se inmovilizó BSA sobre la superficie del chip CM5 por el procedimiento de acoplamiento estándar (GE Healthcare, N.° Cat.: BR-1006-68). El proceso básico fue el siguiente: se usó solución HBS-EP (0,01M HEPES [pH7,4], NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005% [v/v]) como el tampón de corrida para el instrumento a 25°C con un caudal de 10 ml/min. En primer lugar, se inyectó hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) 0,4 M/N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,1 M (1:1) durante más de 7 minutos para activar la superficie de dextrano de carboximetilo. Luego se inyectaron 20 pg/ml de solución de proteína BSA diluida en acetato sódico 10 mM (pH 4,5) durante 7 minutos y finalmente se inyectó aminoetanol 1M (pH 8,5) durante 7 minutos para bloquear los sitios activos no unidos. Después de dicho procedimiento, el nivel obtenido de reacción de acoplamiento de BSA fue 327 unidades de resonancia (RU).

5.2.3. Clasificación de afinidad de los anticuerpos de dominio único anti-hVEGF165

[0067] El sobrenadante anteriormente mencionado por clonación y expresión de SdAb-SASA se filtró a través de una placa de filtración de 96 pocillos (Pall, N.° Cat.: PN5045) mediante centrifugación a 4000 g, 4°C durante 5 minutos para eliminar las bacterias y otras partículas. El sdAb que se pretendía detectar se diluyó con solución HBS-EP y luego se hizo fluir a través de la superficie del chip acoplada a BSA consecutivamente. El procedimiento de análisis de clasificación comprendió los siguientes cuatro pasos:

a. se usaron chips para la inmovilización de BSA para capturar el anticuerpo de dominio único acoplado a SASA; b. se inyectó hVEGF165, para permitir que se una a la superficie del chip que capturó un anticuerpo de dominio único; c. se inyectó tampón de corrida y se monitoreó la fase de disociación durante 300 s; d. la superficie del chip acoplado a b Sa se regeneró por inyección de 10 mM de glicina/HCI (pH 2,0), a 30 ul/min, durante 30 s. Se requirió la regeneración de la superficie para los chips de BSA después de cada ronda de captura de anticuerpo, unión al antígeno y disociación de antígeno. Se usó solución de proteína SASA purificada con una concentración de 200 nM fluyendo sobre la superficie del chip de BSA como control para el efecto de la regeneración. Las clasificaciones de los 138 clones se realizaron en 3 lotes y el clon A10981 se usó como control. Hubo una consistencia satisfactoria entre seis clones A10981 paralelos en diferentes lotes y la tasa de disociación fue aproximadamente de un 20% dentro de 400 s. 93 clones tuvieron una tasa de disociación inferior en comparación con A10981 (figura 9) y se cogieron para la secuenciación. Se seleccionaron 53 anticuerpos de dominio único para la expresión procariótica y se evaluaron por ensayo de inhibición de la proliferación celular. Se usaron 15 anticuerpos de dominio único para un cribado competitivo adicional.

5.2.4. Cribado competitivo de hVEGFR2

[0068] Después del cribado del nivel de expresión y la clasificación por afinidad, 15 anticuerpos de dominio único se seleccionaron para el cribado competitivo del receptor, para obtener un anticuerpo que pueda bloquear el antígeno hVEGF165 y la unión al receptor hVEGFR del mismo. El procedimiento detallado fue el siguiente: а. La proteína hVEGFR2 se inmovilizó sobre la superficie del chip CM5 por el método de acoplamiento de amino (ver 5.2.2); b. se inyectó la proteína hVEGF165 y se observó el perfil de unión de la misma. La inyección se detuvo cuando el perfil de unión se acercó a la saturación; c. Diferentes anticuerpos de dominio único se inyectaron en la superficie del chip unido a hVEGF165 y se observó el perfil de unión de los mismos. Mientras tanto, el fármaco anti-VEGF disponible comercialmente Avastin se inyectó como control; d. Si el epítopo al que un anticuerpo se une a VEGF165 es justo el sitio de unión entre VEGF y VEGFR2, entonces el anticuerpo ya no se unirá al VEGF, o competirá con el VEGF que ya se une a VEGFR2. Como tal, la señal de unión será significativamente inferior al propio VEGF. Si el epítopo al cual un anticuerpo se une a VEGF165 es diferente del sitio de unión entre VEGF y VEGFR2 o irrelevante para el mismo, entonces el anticuerpo se unirá a VEGF165 que ya estaba unido al receptor. Como tal, la señal de unión resultante será significativamente superior al propio VEGF. Según los resultados competitivos en comparación con el control (figura 10), se seleccionaron 7 clones superiores para la preparación de anticuerpos de cadena pesada y para el ensayo de inhibición de la proliferación celular.

Ejemplo 6: preparación del anticuerpo de dominio único

[0069] El procedimiento para la expresión procariótica, la purificación del anticuerpo de dominio único y la eliminación de endotoxina se expone a continuación.

б. 1. Preparación de los reactivos

6.1.1. Reactivos para la expresión procariótica

[0070] Triptona, OXOID LP0042

Extracto de levadura, OXOID LP0021

Hidrolizado ácido de caseína, Sigma C9386

KH2PO4 , Sinopharm AR CAS [7778-77-0]

Na2HPO4.12H2O, Sinopharm AR 10020318

NH4Cl, Sinopharm AR CAS [12125-02-9]

NaCl, Sinopharm AR 10019318

MgCl2, Sinopharm AR 7791-18-6

CaCl2, Sinopharm AR 10043-52-4

Glucosa, Sinopharm AR 10010518

Glicerol, Sigma G5516-500ML

IPTG, Amresco 0487-100G

VB1, Aladdin AR 1099302

Ampicilina, 100 mg/ml, filtrada con un filtro de 0,22 |_im;

Solución madre de IPTG: 1 M, filtrada con un filtro de 0,22 |_im, almacenada en partes alícuotas de 1-2 ml, crioconservada a -20°C (válida durante 3 meses);

Solución madre de MgC^: 1 M, autoclavada a 121°C durante 30 min, almacenada en partes alícuotas de 1-2 ml, a 4°C (válida durante 6 meses);

Solución madre de CaCb: 1 M, filtrada con un filtro de 0,22 |_im, almacenada en partes alícuotas de 1-2 ml, a 4°C (válida durante 6 meses);

Solución madre de VB1: 50 mg/ml, filtrada con un filtro de 0,22 |_im, almacenada en partes alícuotas de 1-2 ml, a 4°C (válida durante 6 meses);

Solución madre de glucosa: al 20% (p/v), filtrada con un filtro de 0,22 |_im, almacenada a 4°C (válida durante 3 meses);

Solución madre de glicerol: al 50% (v/v), autoclavada a 121°C durante 30 min, almacenada a 4°C (válida durante 6 meses);

Solución madre de hidrolizado ácido de caseína: al 4%, autoclavada a 121 °C durante 30 min, almacenada a temperatura ambiente (válida durante 3 meses);

Solución salina M910X: Na2HPO4 al 6% (p/v), KH2PO4 al 3% (p/v), NH4Cl al 1% (p/v), al 0,5%;

NaCl (p/v), autoclavada a 121°C durante 30 min, almacenada a temperatura ambiente (válida durante 3 meses); Medio 2YT: triptona al 1,6% (p/v), extracto de levadura al 1,0% (p/v), NaCI al 0,5% (p/v), autoclavado a 121 °C durante 30 min;

Medio TB 10X: triptona al 12% (p/v), extracto de levadura al 24% (p/v), glicerol al 4% (v/v), autoclavado a 121°C durante 30 min.

6.1.2. Reactivos y equipos para la purificación de proteína

[0071] Reactivo de extracción de proteína BugBuster 10X (Novagen, 70921-4);

PMSF 100 mM: 1,74 g de PMSF en 100 ml de solución de isopropanol (Beyotime Biotechnology, ST506);

10 mg/ml de nucleasas (DNasa I): típicamente 1 pl (Life Science Product and Service, DD0099-1) por gramo de peso húmedo de las células bacterianas;

5 mg/ml de lisozima: típicamente 100 pl (Sunshinebio, L0005-10) por gramo de peso húmedo de las células bacterianas;

Reactivo Quick StartTM Bradford (Bio-Rad, 500-0204);

Resina Ni-NTA de alta afinidad (GenScript, L00250);

HiTrapTM Desalting, 5ml, (GE Healthcare, 17-1408-01);

Purificador ÁKTA 10 (GE Healthcare);

Tampón de lisis: HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10% (v/v), imidazol 40 mM, pH 8,0;

Tampón de unión: Na2HPO420 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, pH 7,4;

Tampón de lavado: Na2HPO420 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 40 mM, pH 7,4;

Tampón de elución: Na2HPO420 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 300 mM, pH 7,4;

PBS 1X: NaCl 137 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO42 mM; pH 7,4.

6.1.3. Reactivos y equipos para la eliminación de endotoxina

[0072] Resina ToxinEraser TM Endotoxin Removal Resin 1,5 ml (GenScript, L00402);

Columnas PD-10; tampón de regeneración ToxinEraser TM Regeneration Buffer (GenScript, M01053);

Tampón de equilibrado ToxinEraser TM Equilibration Buffer (GenScript, M01054);

Kit de ensayo de endotoxina en coágulos de gel (GenScript, L00451);

Lisado de amebocitos de Tachypleus (TAL de forma abreviada, sensibilidad de 0,25 EU/ml, Chinese Horseshoe Crab Manufactory, Co., Ltd., Xiamen, China);

NaOH 0,1 M (preparado usando agua apirógena);

HCI 0,1 M (preparado usando agua apirógena);

Incubadora de temperatura constante a 37°C.

6.1.4. Reactivos y equipos para la esterilización por filtración

[0073] Unidad de filtro Millex-GP, 0,22 pm (Millipore, lote: R4AA43868).

6.1.5. Reactivos y equipos para la determinación de la concentración y la detección de proteínas

[0074] Espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo);

Gel de pAg e ExpressPlus: 4-20%, 12 pocillos (GenScript, M42012);

Polvo de tampón de corrida MOPS (GenScript, M00138);

Tampón de carga (5x, no reductor): 0,25 M Tris-HCl (pH 6 ,8), SDS al 10%, bromofenol azul al 0,5%, glicerol al 50%, DTT al 7,8%;

Tampón de carga (5 x, reductor): 0,25 M Tris-HCl (pH 6 ,8), SDS al 10%, bromofenol azul al 0,5%, glicerol al 50%.

6.2. Métodos y procedimientos

6.2.1. Preparación de cepas

[0075]

a) Transformación: el plásmido para la expresión procariótica construido con un gen de anticuerpo de dominio único fue transformado en células TG1 por transformación química o electroporación. Las células se extendieron sobre la placa con medio 2YT resistente a la ampicilina y se incubaron a 37°C durante toda la noche;

b) Selección de clon único: se añadieron ampicilina con una concentración final de 200 pg/ml y glucosa al 2% (p/v) en 10 ml de medio 2YT. La pinza se cauterizó íntegramente en una lámpara de alcohol, se enfrió y se usó para recoger una punta de pipeta esterilizada de 10 pl. Se seleccionó un único clon de la placa de transformación y se inoculó en el medio, se incubó a 225 rpm, 37°C durante toda la noche.

6.2.2. Transferencia e inducción

[0076]

a) Preparación de medio M9: se añadió glucosa con una concentración final del 0,2% (p/v), MgCl21 mM, CaCl20,1 mM, hidrolizado ácido de caseína al 0,4% (p/v), 5 mg/l de VB1 y 200 pg/ml de ampicilina a la solución salina M9 1X y la solución resultante se precalentó en un agitador a 37°C;

b) Transferencia: se retiró el cultivo de toda la noche del agitador, se transfirió a un sistema de transferencia 1:100, se centrifugó durante 10 min a 4000 rpm, se resuspendió en solución salina 1 x M9 fresca, se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min, se resuspendió de nuevo y se transfirió a un medio precalentado, luego se colocó en un agitador y se incubó a 37°C, a 225 rpm, durante 24 h;

c) Inducción: se añadieron medio TB 1x adicional, IPTG con una concentración final de 1 mM y ampicilina con una concentración final de 200 pg/ml al medio M9. Las células se incubaron a 225 rpm, 25°C durante 48 h (se añadió de nuevo ampicilina con una concentración final de 200 pg/ml a las 24 h);

d) Recogida de muestra: al final de la inducción, el cultivo de toda la noche en partes alícuotas se dispensó en tubos de centrífuga, se centrifugó a 4°C, 11.000 rpm, durante 15 min y se recogieron las células bacterianas.

6.2.3. Purificación de proteína

[0077]

a) Preparación de la muestra por el método de lisis BugBuster

i. Lisis: los sedimentos se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis por gramo de peso húmedo de las células de E. coli (tampón de lisis: reactivo de extracción de proteína BugBuster 10x se diluyó con tampón de unión a 1X; se añadieron lisozima con una concentración final de 100 pg/ml, nucleasa con una concentración final de 2 pg/ml y PMSF 1 mM) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente bajo agitación a velocidad media.

ii. Preparación de extracto crudo de proteína: las muestras lisadas se centrifugaron a 4°C, 12.000 g durante 30 min, y luego el sobrenadante se recogió y se filtró con un filtro de 0,22 pm.

b) Purificación por cromatografía de afinidad en columna de Ni

i. Equilibrado de la columna: se usaron 5 volúmenes de columna de ddH2O y tampón de equilibrado para el equilibrado de la resina Ni-NTA de alta afinidad;

ii. Unión: el extracto crudo de proteína se mezcló con una cantidad apropiada de resina Ni-NTA de alta afinidad y se incubó mientras se agitaba durante 1 h. Después de la incubación, la mezcla del extracto crudo y el relleno de la columna se añadió a una columna vacía PD-10 para recoger el relleno de columna, y se recogió el efluente para el análisis posterior;

iii. Lavado: las impurezas de proteína se eluyeron usando al menos 50 volúmenes de columna de tampón de lavado. (La solución de tinción Bradford se usó como un indicador durante el paso de lavado: se añadieron 5 pl de solución de lavado a 200 pl de solución de tinción Bradford. Si el color se volvía azul, entonces el lavado de impurezas de proteína continuaba hasta que el color de la solución de tinción se mantenía esencialmente sin cambios. Entonces se procedía al paso siguiente);

iv. Elución: la proteína diana se eluyó usando al menos 10 volúmenes de columna de tampón de elución. (La solución de tinción Bradford se usó como un indicador de una elución completa durante el paso de elución y el procedimiento fue el mismo que en el paso iii).

c) Desalación/intercambio de tampón

i. Equilibrado: se usaron 5 volúmenes de columna de ddH2O y PBS para el equilibrado de una columna de desalación HiTrapTM de 5 ml en un sistema purificador 10 ÁKTA con un caudal apropiado (0,5 ml/min);

ii. Carga de la muestra: se introdujo una cantidad apropiada de solución de proteína (0,5 ml) purificada por cromatografía de afinidad con Ni en la columna de desalación HiTrapTM con un caudal apropiado (0,5 ml/min);

iii. Elución: la elución se continuó con al menos 10 volúmenes de columna de PBS con un caudal apropiado (0,5 ml/min). La proteína en el pico de UV diana se recogió.

6.2.4. Eliminación y detección de endotoxina

[0078]

a) Eliminación de endotoxina

i. Procesamiento de muestra: la fuerza iónica se ajustó a 0,2 ± 0,5 M con cloruro sódico 1 M antes de la purificación y el pH se ajustó a 7,4 ± 0,2 con hidróxido sódico 0,1 M o ácido clorhídrico 0,1 M.

ii. Activación de la resina: la columna PD-10 se fijó verticalmente y se retiró el tapón de la parte superior de la columna preempaquetada. La resina de eliminación de endotoxina ToxinEraser TM se cargó sobre la columna. El controlador de flujo se encendió, permitiendo que el protector se drenara por gravedad. Se añadieron 5 ml de tampón de regeneración y el caudal se mantuvo a 0,25 ml/min (aproximadamente 10 gotas/min) ajustando el controlador de flujo. Se añadieron de nuevo 5 ml de tampón de regeneración adicionales cuando se drenó el tampón de regeneración. El procedimiento se repitió dos veces para asegurar que el sistema seguía siendo apirógeno (es decir, sin endotoxina);

iii. Equilibrado de la resina: cuando se completó la activación de las columnas PD-10, se añadieron 6 ml de tampón de equilibrado. El caudal se mantuvo a 0,5 ml/min ajustando el controlador de flujo y luego se drenó el tampón de equilibrado. El procedimiento se repitió dos veces.

iv. Eliminación de endotoxina: se apagó el controlador de flujo. La muestra se cargó usando puntas de pipeta apirógenas. El controlador se encendió para controlar que el caudal no fuera superior a 0. 25 ml/min. Cuando el volumen del efluente alcanzó 1,5 ml, la muestra se cargó usando tubos apirógenos. Se introdujeron 1,5 ml-3,0 ml adicionales de tampón de equilibrado para la elución cuando se secó la muestra, y se recogió el eluato. Se determinaron la concentración de muestra y el nivel de endotoxina (se usó solución Bradford como indicador de una recogida completa durante el paso de elución).

b) Ensayo de endotoxina en coágulos de gel

1. Dilución de la muestra: las muestras se diluyeron hasta una concentración apropiada (0,005 jg ; 0. 05 jg ; 0,5 jg ; 5 jg ) dependiendo del requisito de sensibilidad de TAL (0,25 UE/ml);

ii. Dilución de patrón de endotoxina: se preparó patrón de endotoxina, se reconstituyó en agua para la detección de endotoxina bacteriana, se mezcló en vórtice durante 15 min y luego se diluyó hasta una concentración apropiada (0,5 UE/ml);

iii. Detección: se añadieron reactivos TAL a 100 j l de agua para la detección de endotoxina bacteriana y se agitaron suavemente durante al menos 30 s hasta que los reactivos se disolvieron completamente. Deben evitarse las burbujas de aire. Se añadieron 100 j l de las siguientes muestras respectivamente: control positivo (patrón de endotoxina 0,5 UE/ml), control negativo (agua libre de endotoxina) y muestras diluidas que se van a detectar: las muestras que se van a detectar con cuatro concentraciones diferentes en (i). Los tubos se sellaron, se agitaron suavemente, se colocaron verticalmente en una incubadora a 37°C, se incubaron durante 1 hora y luego se retiraron para su observación;

iv. Grabación de los resultados: los tubos de ensayo se retiraron de la incubadora suavemente y se pusieron boca abajo 180° lentamente. Para el resultado positivo, se formará un gel sólido a partir del contenido del tubo, sin distorsiones, y no se deslizará fuera de la pared del tubo; de lo contrario, el resultado será negativo. Los resultados de los tubos de control positivo fueron positivos y los resultados de los tubos de control negativo fueron negativos, el estado fue el mismo en el mismo rango y, por tanto, los experimentos fueron válidos.

6.2.5. Esterilización por filtración

[0079] Las muestras se filtraron con un filtro de 0,22 jm asépticamente en una cabina de bioseguridad y se reservó una cantidad apropiada de las muestras para ensayos posteriores.

6.2.6. Determinación de la concentración y la pureza

[0080]

a) Determinación de la concentración de proteína

1. Según las secuencias de aminoácidos de las proteínas provistas, se calculó el coeficiente de absorbancia de la proteína.

ii. Se detectó la absorbancia UV (A280) de la solución de proteína.

iii. Se detectó la concentración de proteína según la fórmula: concentración de proteína = absorbancia UV (A280) de la solución de proteína / coeficiente de absorbancia de la proteína.

B) Determinación de la pureza de proteína

Una cierta cantidad de proteína (p. ej., 2 jg ) según la concentración determinada anteriormente y la misma cantidad (p. ej., 2 jg de BSA) de la proteína estándar se sometieron a una SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras. Así, se evaluó la pureza y se determinó la concentración.

Ejemplo 7. Ensayo de inhibición de la proliferación de células HUVEC del anticuerpo de dominio único

7.1. Preparación de las células

[0081] Aproximadamente 3*105 células HUVEC (ATCC, N.° Cat. PCS-100-010) se recuperaron y se inocularon en una placa de cultivo de 10 cm y se introdujo medio fresco en la placa de cultivo cada 3-4 días. Las células se dividieron en diferentes placas de cultivo cuando alcanzaron un 85%-95% de confluencia y se añadió el medio fresco. Se pueden usar células en la 7a generación para el ensayo de inhibición de la proliferación celular y se usarán típicamente células de la 6a generación.

7.2. Ensayo de inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF

[0082] Se prepararon 2xVEGF y diferentes concentraciones de muestras de anticuerpo que se van a detectar con un tampón m 199 (Medio-199 1X sales de Earle (Invitrogen n.° 11150-059), suero fetal bovino al 10% (Gibco, n.° Cat. 10100139), inactivado por calor; HEPES 10 mM (Invitrogen, n.° Cat. 15630080), 100 unidades/ml de penicilina 100 jg/m l de estreptomicina (Invitrogen, n.° Cat. 10378016)), respectivamente. Se premezclaron 50 j l 2*VEGF y diferentes concentraciones de muestras de anticuerpo que se van a detectar, respectivamente. Los micropocillos replicados se colocaron en la placa de micropocillos. Se usó el tratamiento con el medio celular como control en blanco, mientras que el tratamiento con Avastin se usó como control positivo. Las células tripsinizadas se recogieron, se lavaron con tampón M199 y se resuspendieron dos veces a una densidad celular final de 1x105 células/ml. Se introdujeron 50 j l de solución de suspensión celular en cada pocillo de la placa de micropocillos. Las células añadidas en la placa de micropocillos se colocaron entonces en una incubadora y se incubaron a 37°C, CO2 al 5% durante 96 horas. La viabilidad celular se determinó usando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, N.° Cat.: G7571) tras la finalización de la incubación. Mientras tanto, la intensidad de fluorescencia se determinó con un lector PHERAStar Plus (BMG Labtech) y se registró la unidad de luminiscencia relativa; la tasa de inhibición de la proliferación se calculó según la fórmula siguiente, tasa de inhibición de la proliferación % = 100*(1-unidad de luminiscencia relativa/producción máxima), donde la unidad de luminiscencia relativa fue el valor determinado de cada muestra y la producción máxima fue la unidad de luminiscencia relativa cuando se añadió solo VEGF. Integrando tanto los datos de inhibición máxima como de EC50, se demostró que 6 de 53 anticuerpos de dominio único expresados en procariotas mostraron un efecto inhibidor significativo, los cuales se seleccionaron para la construcción de anticuerpos de cadena pesada y el ensayo de inhibición de la proliferación posterior.

Tabla 7: los valores EC50 del ensayo de inhibición de la proliferación de células HUVEC son los siguientes:

ID del clon EC50 (jg/m l)

A69451 0,5573

A69452 0,4499

A69457 0,4596

A69458 0,1201

A69462 0,0632

A60724 0,0267

A80723 0,1142

A80744 0,1763

A80730 0,2115

A80890 0,6418

A80726 0,1225

A80887 0,0588

A80740 0,7899

Ejemplo 8. Expresión de anticuerpos de cadena pesada

[0083] Los 6 anticuerpos de dominio único con un efecto inhibidor de la proliferación del cribado inicial en el ejemplo 7 y los 7 anticuerpos de dominio único del cribado competitivo del receptor se fusionaron con el fragmento Fc de la IgG1 humana (SEQ ID NO: 60), respectivamente, para formar un constructo de anticuerpo de cadena pesada, que se clonó en un vector pTT5. El anticuerpo se expresó entonces en células HEK293E y se purificó con la eliminación de la endotoxina. Los procedimientos detallados son los siguientes:

8.1. Reactivos y preparación

[0084] Véase el ejemplo 6.

8.2. Métodos y procedimientos

8.2.1. Cultivo celular

[0085]

a) Las células en suspensión HEK293 se eliminaron del nitrógeno líquido o frigorífico a -86°C, se pusieron inmediatamente en un baño maría a 37°C y se descongelaron en 1 ~2 min.

b) Las células descongeladas se añadieron a un volumen de 10 veces de medio de expresión FreeStyleTM 293 precalentado, se mezclaron boca abajo suavemente, se recogieron por centrífuga a baja velocidad y se resuspendieron en una cantidad apropiada de medio recién precalentado.

d) Las células resuspendidas se transfirieron a un frasco y se incubaron a 37°C, CO2 al 5%,110 rpm.

8.2.2. Transfección

[0086]

a) Un día antes de la transfección, se subcultivaron células en suspensión HEK293 con una densidad apropiada para conseguir 1,5~2,0 x 106 células/ml el día de la transfección y se requirió que la viabilidad celular fuera superior a un 95%.

b) Una cantidad apropiada de ADN se mezcló íntegramente con PEI en una proporción óptima (tal como 1:3) en el medio de expresión FreeStyleTM 293 precalentado y se dejó que la mezcla reposara 10 minutos a temperatura ambiente.

C) La mezcla de ADN y PEI anteriormente mencionada se añadió al cultivo celular, se centrifugó y se mezcló suavemente. La incubación continuó a 37°C, CO2 al 5%, 110 rpm.

D) Dentro de 16-24 horas tras la transfección, se añadió triptona N1 con una concentración final del 0,5% (p/v).

E) En el 6° día tras la transfección, el sobrenadante del cultivo se recogió por centrifugación y se filtró con un filtro de 0,22 |_im para la purificación posterior.

8.2.3. Purificación de proteína

[0087]

A) Purificación de afinidad por la proteína A

i. Equilibrado: se usaron 5 volúmenes de columna de ddH2O y tampón de unión para el equilibrado del relleno de proteína A.

ii. Unión: el sobrenadante filtrado se mezcló con el relleno de columna y se incubó entonces para la unión durante 1 h. Tras la finalización de la incubación, el relleno de columna se cargó sobre una columna PD-10 de purificación manual.

iii. Lavado: la columna se lavó con al menos 30 volúmenes de columna de tampón de unión para eliminar las impurezas de proteína (se usó solución Bradford como un indicador durante el paso de lavado: se añadieron 5 |_il de solución de lavado a 200 |_il de solución de tinción Bradford. Si el color se volvía azul, entonces el lavado de impurezas de proteína continuó hasta que el color de la solución de tinción siguiera esencialmente sin cambios. Luego se procedió hasta el paso siguiente). iv. Elución: la proteína diana se eluyó usando al menos 10 volúmenes de columna de tampón de elución y el pH se ajustó a aproximadamente 7,0 con tampón de neutralización (se usó solución Bradford como un indicador de una elución completa durante el paso de elución, y el procedimiento fue el mismo que en el paso iii).

b) Desalación / intercambio de tampón:

La proteína de purificación por afinidad se cambió a tampón de PBS usando una columna de desalación HiTrapTM en un sistema purificador KTA 10. Los pasos posteriores de eliminación de endotoxina, esterilización por filtración y determinación de la concentración y la pureza fueron los mismos que los descritos en el ejemplo 6.

Tabla 8. Correspondencia entre el ID del clon del anticuerpo de dominio único y el anticuerpo de cadena pesada, así como el identificador de secuencia para la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de la región variable

Ejemplo 9. Ensayo de inhibición de la proliferación de células HUVEC del anticuerpo de cadena pesada

[0088] Se diluyeron 13 anticuerpos de cadena pesada (tabla 8) en gradiente 1:4 hasta ocho concentraciones empezando de 20 pg/ml y el procedimiento fue el mismo que el descrito en el ejemplo 7 excepto que se usó Avastin (A68467) como control. A partir del nivel de inhibición en la proliferación celular por diferentes concentraciones del anticuerpo, se puede juzgar que los 13 anticuerpos de cadena pesada todos mostraron un efecto inhibidor con grados variables (figura 11), entre los que A80887, A80723 y A69458 mostraron la mayor inhibición en el nivel celular. En particular, para A69458, se mostró un efecto inhibidor significativamente superior en comparación con el control, cuando la concentración de anticuerpo era 10-3~1 pg/ml; para A80723, se mostró un efecto inhibidor significativamente superior en comparación con el control, cuando la concentración de anticuerpo era 10-3~10-1 pg/ml; para A80887, se mostró un efecto inhibidor significativamente superior en comparación con el control, cuando la concentración de anticuerpo fue 10-2~1 pg/ml.

Tabla 9. Muestra del anticuerpo de cadena pesada

ID del clon Nivel de endotoxina (EU/|jg) Concentración (mg/ml) Observaciones

A69451 <1 0,49

A69452 <1 0,23

A69457 <1 0,29

A69458 <5 0,29

A69462 <1 1,06

A60724 <1 0,58

A80723 <1 0,51

A80744 <1 0,33

A80730 <1 0,48

A80890 <1 0,20

A80726 <1 0,31

A80887 <1 0,29

A80740 <1 0,49

Ejemplo 10. Evaluación del efecto antiangiogénico por el anticuerpo según la presente invención usando un modelo de pez cebra

[0089] Las muestras que se van a detectar (A80887), con un peso molecular de aproximadamente 75 kDa y una concentración de 5,1 mg/ml, se almacenaron en partes alícuotas a -80°C, se diluyeron con 1 x PBS (pH 7,4) inmediatamente antes del uso y se mantuvieron en hielo durante la inyección. Los equipos y los reactivos usados incluyen: microinyector (IM300, Narishige), microscopio de disección (SMZ645, Nikon Corporation); microscopio de fluorescencia de zum de enfoque eléctrico (AZ100, Nikon); placa de 6 pocillos (Nest Biotech); MESAB (Sigma), y bevacizumab (nombre de la marca Avastin, Roche).

[0090] Se obtuvieron embriones de peces cebra transgénicos con fluorescencia vascular a partir de la cría por apareamiento natural. Se prepararon 4~ 5 pares de peces cebra adultos para cada apareamiento y, así, se pueden obtener un promedio de 200- 300 embriones de cada par. Los embriones se limpiaron (se eliminó un embrión muerto) 6 horas después de la fertilización (es decir, 6 hpf) y a las 24 hpf, y los embriones apropiados se seleccionaron según sus etapas de desarrollo (Kimmel, 1995). Los embriones se incubaron con agua de cultivo de peces a 28 °C (calidad del agua de cultivo de peces: se añadieron 200 mg de sal marina instantánea a cada 1 L de agua de ósmosis inversa, la conductividad fue 480- 510 pS/cm; el pH fue 6,9- 7,2; la dureza del agua fue 53,7- 71,6 mg/l CaCOa). No hay necesidad de que los embriones sean alimentados en los 9 días después de la fertilización (9 dpf), ya que los embriones podían obtener nutrientes de su propio saco vitelino. Tras la finalización del procedimiento, el pez cebra en varias etapas de desarrollo fue anestesiado por exposición a sulfonato de metano de tricaína en exceso. Todos los procedimientos se realizaron en línea estricta con el estándar internacional de evaluación y acreditación de animales de laboratorio (AAALAC).

[0091] Mediante el uso del microinyector, la muestra se inyectó a la concentración más alta y el volumen de inyección máximo en la circulación sanguínea del pez cebra transgénico con fluorescencia en los vasos sanguíneos (equivalente a una administración intravenosa para el ser humano), y no se halló ninguna muerte o fenotipo anormal obvio. En función de los resultados experimentales anteriores, se seleccionaron para la detección 3 dosis, incluidas 1/10 de la dosis de inyección máxima (concentración máxima x volumen de inyección máxima), 1/3 de la dosis de inyección máxima y la dosis de inyección máxima, mientras que se definieron un grupo de control positivo (Avastin), un grupo de control de solvente (PBS) y un grupo en blanco. Se trataron 30 peces en cada grupo. Un cierto periodo de tiempo después de la administración, se seleccionaron 15 peces cebra de cada grupo de forma aleatoria y se fotografiaron bajo un microscopio fluorescente, y luego se realizó el análisis cuantitativo del área de los vasos subintestinales (SIVs). El análisis estadístico se realizó con una prueba T entre dos grupos y con un ANOVA unidireccional y una prueba T de Dunnett entre más grupos, donde p < 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa. La eficiencia de inhibición de la angiogénesis se puede calcular según la fórmula siguiente:

[0092] No hubo muertes o fenotipos anormales en ninguno de los grupos experimentales durante todo el procedimiento. No hubo ninguna diferencia estadísticamente entre el grupo de control en blanco y el grupo de control de solvente (p > 0,05); mientras que hubo una diferencia estadísticamente entre el grupo de control positivo (Avastin) y el grupo de control de solvente (p < 0,05).

[0093] Durante la experimentación preliminar para una dosis apropiada, no se halló ninguna muerte o fenotipo anormal obvio usando la mayor concentración de 5,1 mg/ml para la inyección. Por lo tanto, 40,8 ng (0,544 pmol), 136 ng (1,81 pmol) y 408 ng (5,44 pmol) son elegidas como las dosis totales para la administración.

[0094] Los resultados experimentales demostraron que la tasa de inhibición de la angiogénesis fue del 10,9% (p > 0,05), 18,5% (p < 0,05) y 23,2% (p < 0,001), respectivamente, cuando la dosis de A80887 fue 20,4 ng (0,272 pmol), 68 ng (0,907 pmol) y 204 ng (2,72 pmol). La tasa de inhibición de la angiogénesis fue del 6,9% (p > 0,05) y 19,5% (p < 0,01), respectivamente, cuando la dosis de Avastin fue 400 ng (2,68 pmol) y 1 pg (6,7 pmol), y p < 0,05 entre estas dos dosis. Con la misma masa molar (ambos tenían aproximadamente 2,7 pmol), la eficiencia de inhibición de la angiogénesis de A80887 fue del 23,2%, que fue obviamente mejor que el 6,9% de Avastin (p < 0,001). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia estadística para la eficiencia inhibidora de la angiogénesis entre Avastin 1 pg (6,7 pmol) y A80887 20,4 ng (0,272 pmol), 68 ng (0,907pmol) y 204 ng (2,72 pmol). Los datos originales se mostraron en la siguiente tabla.

Tabla 10. Inhibición de A80887 sobre la angiogénesis

N.° Control PBS Avastin 1 pg Avastin 400 ng A8088720,4 ng A8088768 ng A80887204 ng 1 28570 25256 17558 21458 29976 21313 23713

2 32065 29797 24571 32339 27791 27954 18080

3 37021 23013 25549 27167 23297 17394 17747

4 28673 25430 21128 24991 20170 18220 23999

5 28975 28480 13377 24967 25530 20615 23189

6 28339 26380 25086 23503 23249 29979 21405

7 28935 31562 14578 23961 22736 22681 16435 8 23813 25505 22460 27848 21046 16633 19774

9 29959 26899 22546 22500 22210 25854 17904

10 37825 26429 24451 23191 27868 22022 18429

11 37873 23567 21695 29455 21018 22680 22039

12 37653 23676 22753 26385 23751 15159 21179

13 26171 24986 20942 20935 27618 23078 20235

14 21934 30155 24472 28212 26562 21085 19751

15 20596 33174 24169 19367 17349 24991 26435

media 29893 26954 21689 25085 24011 21979 20688 SL7 5672 3049 3745 3508 3479 4135 2807

CV 19 11 17 14 14 19 14

SE 1464 787 967 906 898 1068 725

[0095] El modelo de angiogénesis de pez cebra para la evaluación farmacodinámica y la validación de nuevas dianas farmacológicas está ampliamente aceptado. Actualmente, varios fármacos anticancerosos que han entrado en la fase de ensayo preclínico o fase de ensayo clínico (incluidos fármacos aprobados por la FDA), como por ejemplo vatalanib (Novartis) (Chan, 2002), talidomida (Celgene) (Yabu, 2005), compuesto 6 (TargeGen) (Murphy, 2010), rosuvastatina (Wang 2010), solenopsina (Eli Lilly) (Arbiser, 2007), etc., han sido exitosamente verificados usando el modelo de inhibición de la angiogénesis de pez cebra. Típicamente, los vasos subintestinales (SIVs) o los vasos intermetaméricos de un pez cebra transgénico con fluorescencia vascular se seleccionaron para la evaluación del efecto sobre la angiogénesis por un compuesto y, así, en este estudio, se usó el análisis cuantitativo del área de los vasos subintestinales (SIVs) para la evaluación del efecto sobre la angiogénesis por la muestra A80887.

[0096] Avastin es un anticuerpo IgG1 monoclonal humano recombinante que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y evita su unión con el receptor de superficie (Flt-1 y KDR) de la célula endotelial. En este estudio se seleccionó Avastin (peso molecular de 149 kDa) como control positivo del fármaco macromolecular para la inhibición de la angiogénesis. Los resultados experimentales demostraron que Avastin mostró un buen efecto inhibidor de la angiogénesis y, por lo tanto, resulta fiable usar Avastin como control positivo para la evaluación.

[0097] En resumen, ® tanto A80887 como Avastin mostraron un efecto inhibidor significativo sobre la angiogénesis del pez cebra. @ En comparación con Avastin, A80887 mostró un efecto inhibidor obviamente superior sobre la angiogénesis con la misma masa molar (aproximadamente 2,7 pmol). @ Cuando la dosis de A80887 fue 20,4 ng, 40,8 ng, 68 ng, 136 ng, 204 ng y 408 ng, respectivamente, la dosis de referencia correspondiente para la administración en seres humanos fue aproximadamente 81,6, 163,2, 272, 544, 816 y 1632 pg/kg de peso corporal.

[0098] Aunque se han ilustrado y descrito aquí determinadas características de la invención, muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes ocurrirán ahora para las personas expertas en la técnica.

<110> Zhuhai Essex Bio-Pharmaceutical Co., Ltd.

<120> Anticuerpo anti-VEGF

<130> 1

<160> 71

<170> versión de PatentIn 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 1

Ser Tyr Ala Met Gly

1 5

<210>2

<211> 21

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 2

Ala lie Ser Trp Ser Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Val

1 5 10 15

Asp Ser Val Arg Gly

20

<210>3

<211> 15

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Asp Phe Gly Thr Arg Leu Arg Phe Thr Thr Asn Asp Tyr Gln Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 4

Asn Asn Val Met Gly

1 5

<210>5

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 5

Ala Phe Asn Gly Trp Ser Ser Val Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly

<210>6

<211> 14

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 6

Gly Arg Arg Trp Arg Ala Asn Arg Glu Thr His Tyr Asp Tyr 1 5 10

<210>7

<211>5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 7

Tyr Tyr Ala Val Ser

1 5

<210>8

<211 > 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 8

Gly lie Ser Arg Ser Gly Gly Ser Val Asn Phe Ala Gly Phe Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>9

<211 > 15

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 9

Asp Thr Asn Val Tyr Ala Ser Ala Thr Leu Ser Asn Tyr Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 10

<211>5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 10

Ser Tyr Arg Leu Gly

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 11

Ala lie Ser Trp Lys Asp Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 12

Arg Gly Tyr Ser Arg Ser Trp Asn Pro Trp Ser Glu Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 13

Val Pro Asp Met His

1 5

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 14

Thr lie Thr Arg Gly Gly Asn Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 15

Asp Val Trp Ser Ser Val Ala Leu Lys Leu Val Glu Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 16

Ala Tyr Asn Met Gly

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 17

Ala lie Asn Trp Ser Gly lie Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 18

Asn Arg Gly Gly Asn Tyr Glu Lys Val Tyr Leu Tyr Asn Asn 1 5 10

<210> 19

<211>5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 19

Thr Tyr Thr lie Gly

1 5

<210> 20

<211 > 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 20

Gly lie Thr Trp Gly Gly Gly lie lie Asp Ser lie Asp Ser Met Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 21

Gly Arg Asn Thr Gly Gly Tyr Thr Arg Leu Trp Arg Ser Tyr Asp Tyr

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 22

Thr Tyr Ala Met Gly

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 23

His lie lie Val Thr Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 24

Asp Arg Ser Ala Arg Trp Glu Pro Gly Thr His Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 25

Val Pro Asn Met His

1 5

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 26

Thr lie Thr Arg Gly Gly Asn Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 27

Asp Val Trp Ser Ser Ala Leu Phe Lys Tyr Val Glu Tyr

1 5 10

<210> 28

<211>5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 28

Ser Gly Val Met Gly

1 5

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 29

Ser lie Asn Trp Ser Gly Val Thr Asp Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 30

Gly Ser Arg Trp Arg Ala Asn Ser Gly Arg His Tyr Asp Tyr 1 5 10

<210> 31

<211>5

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 31

Val Pro Asp Met, His

1 5

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 32

Thr lie Thr Arg Gly Gly Asn Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 33

Asp Val Trp Ser Ser Val Leu Phe Lys Leu Val Glu Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 128

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 34

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Glv Leu Val Gln Thr Gly Gly

I 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala lie Ser Trp Ser Gly Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala 50 55 60

Val Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Gly Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Gly Thr Arg Leu Arg Phe Thr Thr

100 105 110

Asn Asp Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 35

<211> 123

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 35

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Ser Asn Asn

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Ala Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Ala Phe Asn Gly Trp Ser Ser Val Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Phe Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Ser Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met lie Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Arg Arg Trp Arg Ala Asn Arg Glu Thr His Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 124

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 36

Asp Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Leu Ser Gly Arg Pro Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gly Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly lie Ser Arg Ser Gly Gly Ser Val Asn Phe Ala Gly Phe Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ala Val Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Thr Asn Val Tyr Ala Ser Ala Thr Leu Ser Asn Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 37

<211> 124

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 37

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala lie Ser Trp Lys Asp Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95

Ala Ala Arg Gly Tyr Ser Arg Ser Trp Asn Pro Trp Ser Glu Tyr Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 38

Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Ala Gly Asp

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser lie Pro Tyr Val Pro

20 25 30

Asp Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gln Arg Gln Leu Val

35 40 45

Ala Thr lie Thr Arg Gly Gly Asn Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95

Ala Asp Val Trp Ser Ser Val Ala Leu Lys Leu Val Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly lie Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 39

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Pro Tyr Val Pro

20 25 30

Asp Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gln Arg Gln Leu Val

35 40 45

Ala Thr lie Thr Arg Gly Gly Asn Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95

Ala Asp Val Trp Ser Ser Val Ala Leu Lys Leu Val Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly lie Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 123

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Asp Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala lie Asn Trp Ser Gly lie Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Cys

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Asn Arg Gly Gly Asn Tyr Glu Lys Val Tyr Leu Tyr Asn Asn

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211 > 123

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala lie Asn Trp Ser Gly lie Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Asn Arg Gly Gly Asn Tyr Glu Lys Val Tyr Leu Tyr Asn Asn

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 42

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Asn Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Thr lie Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe lie

35 40 45

Val Gly lie Thr Trp Gly Gly Gly lie lie Asp Ser lie Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95

Ala Ala Gly Arg Asn Thr Gly Gly Tyr Thr Arg Leu Trp Arg Ser Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 43

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 43

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Pro Glu Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala His lie lie Val Thr Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Asp Arg Ser Ala Arg Trp Glu Pro Gly Thr His Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 44

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 44

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Ser His Val Pro

20 25 30

Asn Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Lys Arg Gln Leu Val

35 40 45

Ala Thr lie Thr Arg Gly Gly Asn Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr lie Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95

Ala Asp Val Trp Ser Ser Ala Leu Phe Lys Tyr Val Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 45

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Gly

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Ser lie Asn Trp Ser Gly Val Thr Asp Tyr Ser Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Phe lie Ser Arg Asp Thr Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

His Met Phe Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95

Ala Gly Ser Arg Trp Arg Ala Asn Ser Gly Arg His Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 46

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de región variable

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Ser Tyr Val Pro

20 25 30

Asp Met His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gln Arg Gln Leu Val

35 40 45

Ala Thr lie Thr Arg Gly Gly Asn Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95

Ala Asp Val Trp Ser Ser Val Leu Phe Lys Leu Val Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 384

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 47

caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcaga ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt tcctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagctgga gtggtggtca cacatactat 180

gcagactcag ctgttgactc cgtgaggggc cgattcacca tctccagagg caacgccaag 240

aacacggtat atctgcaaat gaacaatctg aaacctgagg acacggccgt ttactactgt 300

gcagccgact. tcggtactag actacggttt acaactaatg actatcagta ctggggccag 360

gggacccagg tcaccgtctc ctca 384

<210> 48

<211> 369

<212> ADN

<213> Secuencia

artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 48

gatgtacagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60

tcctgtgcgt actctggcgc aaccttcagt aacaatgtca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaggg cgcgtgactt tgtagcagca tttaacggtt ggagtagtgt tacagagtat 180

gcagactccg tgaagggccg attcttcgtc tccagagaca acgacaagag cacgatgtat 240

ctgcaaatga tcaacctcaa acccgacgac acggccgttt atttttgtgc agcagggagg 300

cgttggcgtg caaataggga gactcactat gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 49

<211> 372

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 49

gatgtacagc tggtggattc tgggggagga ttggtgcagc ctgggggctc tctgaccctc 60

tcctgtgtgc tctctggacg tccctttagt tactatgccg tgagctggtt ccgccaggct 120

ccaggggggg agcgcgagtt cgtagcagga atttcgagga gtggtggaag tgtaaacttt 180

gcaggcttcg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgc.caagag cgcggtgaat 240

ctccaaatga acagcctgaa ac.gcgaggac acggccgttt attactgtgc agccgatact 300

aatgtctatg cctccgcgac gttgtccaat tatgcctatt ggggccaggg gacccaggtc 360

accgtctcct ca 372 <210> 50

<211> 372

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 50

caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt agttatcgct tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagctgga aagatgatac cacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctacaaatga acagcctgac acctgaggac tcggccgttt attcttgtgc agccaggggt 300

tatagtagat cttggaaccc gtggagcgag tatgactact ggggtcaggg gacccgggtc 360

accgtctcct ca 372 <210> 51

<211> 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 51

ggggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt tgggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60

tcctgtacag cctctggaag cataccatat gtccctgaca tgcactggta ccgccaggct 120

ccagggcaac agcgccaatt ggtcgcaact attactcgtg gaggcaacac aatgtatgct 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtatatcta 240

caaatgacct ccctgaaacc tgaggacacg gccgtctact actgtaatgc agacgtttgg 300

tcgagtgttg cattgaagct tgtggaatac tggggccagg ggatccaggt caccgtctcc 360

tea 363 <210> 52

<211 > 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 52

caggtaaagc tggaggagtc tgggggaggg ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaag cataccatat gtccctgaca tgcactggta ccgccaggct 120

ccagggcaac agcgccaatt ggtcgcaact attactcgtg gaggcaacac aatgtatgct 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtatatcta 240

caaatgacct ccctgaaacc tgaggacacg gccgtctact actgtaatgc agacgtttgg 300

tcgagtgttg cattgaagct tgtggaatac tggggccagg ggatccaggt caccgtctcc 360

tea 363 <210> 53

<211 > 369

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 53

caggtacagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtacag actctgggcg caccttcggt gcttataaca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attaactgga gtggtattag tacatactat 180

acagactccg tgaagggccg attcactatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtgt 240

ctgcaaatga acaacctgag ccctgaggac acggccgttt attactgtgc agcaaatcgg 300

ggtggtaatt acgaaaaggt ctatctctac aacaactggg gccaggggac ccaggtcacc 360

gtctcctca 369 <210> 54

<211> 369

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 54

caggtacagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtacag cctctgggcg caccttcggt gcttataaca tgggctggtt ccgccagact 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attaactgga gtggtattag tacatactat 180

acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acaacctgag ccctgaggac acggccgttt attactgtgc agcaaatcgg 300

ggtggtaatt acgaaaaggt ctatctctac aacaactggg gccaggggac ccaggtcacc 360

gtctcctca 369 <210> 55

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 55

gctgtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggact caacttcagg acctatacca taggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tatagttggt attacttggg gtggtggtat catagactcc 180

atagactcca tgaagggccg cgccaccatc tccagagaca acgccgagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attcttgtgc agcaggcagg 300

aacacaggag gctacacacg actgtggcga agctatgact actggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct cctca 375 <210> 56

<211 > 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 56

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggg ttggtacagg ctgggggctc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg cgcccccgag acctatgcca tgggctggtt ccgtcaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcgcat attattgtga ctggtgatag gacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagaaaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa accggaggac acggccgttt attactgtgc agcagatcga 300

tcagcccgat gggaacctgg tacacactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tea 363 <210> 57

<211 > 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 57

caggtaaagc tggaggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaag catctcacat gtccctaaca tgcactggta ccgtcaggct 120

ccgggtcaaa agcgccaatt ggtcgctact attactcgtg gaggcaacac aatgtatgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagagaacg ccaagaatac. gatatatctg 240

caaatgacca ccctgaaacc tgaggacacg gccgtctact actgtaatgc agacgtttgg 300

tcgagtgctt t,att,caaata cgtggagtac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tea 363 <210> 58

<211> 366

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 58

caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60

tcctgtacag cctctggcgg aacctacagt agcggtgtca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgactt tgtagcatcg attaactgga gtggtgttac agactattca 180

gactccgtga agggccgatt cttcatctcc agagacaccg ccaagagcac ggtctatctg 240

cacatgttca gcctcaaagc cgacgacacg gccgtttatt tctgtgcagc agggagccgt 300

tggcgtgcaa atagtggtcg tcactatgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctca 366 <210> 59

<211> 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la región variable

<400> 59

gaggtacagc tggtggattc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaag catctcatat gtccctgaca tgcactggta ccgccaggct 120

ccagggcaac agcgccaatt ggtcgcaact attactcgtg gaggcaacac aatgtatgca 180

gactccgtga agggccgatt cac.catctcc agagacaacg ccaagaacac ggtatatctg 240

caaatgacct ccctgaaacc tgaggacacg gccgtgtact actgtaatgc agacgtttgg 300

tcgagtgttt tattcaaact tgtggagtac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tea 363

<210> 60

<211> 232

<212> PRT

<213> ^ (Homo sapiens)

<400> 60

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 61

<211> 498

<212> ADN

<213> ^ (Homo sapiens)

<400> 61

gcacccatgg cagaaggagg agggcagaat catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc 60 tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtaccct 120 gatgagatcg agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc 180 tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac catgcagatt 240 atgcggatca aacctcacca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct acagcacaac 300 aaatgtgaat gcagaccaaa gaaagataga gcaagacaag aaaatccctg tgggccttgc 360 tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa gatccgcaga cgtgtaaatg ttcctgcaaa 420 aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt 480 gacaagccga ggcggtga 498 <210> 62

<211> 165

<212> PRT

<213> ^ (Homo sapiens)

<400> 62

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp lie Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gln lie

65 70 75 80

Met Arg lie Lys Pro His Gln Gly Gln His lie Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe

115 120 125

Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser

130 135 140

Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys

145 150 155 160

<210> 63

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VHHF1

<400> 63

gcccagccgg ccatggccsm bgtrcagctg gtggaktctg gggga 45 <210> 64

<211> 45

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VHHF2

<400> 64

gcccagccgg ccatggccca ggtaaagctg gaggagtctg gggga 45 <210> 65

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VHHF3

<400> 65

gcccagccgg ccatggccca ggctcaggta cagctggtgg agtct 45 <210> 66

<211>41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VHHF4

<400> 66

gcccagccgg ccatggccga ggtgcagctg gtggagtgtg g 41 <210> 67

<211>21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CH2R

<400> 67

cgccatcaag gtaccagttg a 21

<210> 68

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CH2b3R

<400> 68

ggggtacctg tcatccacgg accagctga 29

<210> 69

<211> 34

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VHHF

<400> 69

catgtgtaga ctcgcggccc agccggccat ggcc 34

<210> 70

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VHHR

<400> 70

catgtgtaga ttcctggccg gcctggcctg aggagacggt gacctgg 47

<210> 71

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> VHHR

<400> 71

catgtgtaga ttcctgcggc cgctgaggag acggtgacct gg 42

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo anti-VEGF, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, donde la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo se expone en la SEQ ID NO: 34.

2. Anticuerpo anti-VEGF según la reivindicación 1, donde la cadena pesada comprende además una región constante, o donde la cadena pesada comprende además una región Fc.

3. Anticuerpo anti-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-2, donde el anticuerpo consiste en cadenas pesadas.

4. Anticuerpo anti-VEGF según la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

5. Secuencia de ácido nucleico aislada, que codifica el anticuerpo anti-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-4.

6. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5, que se expone en la SEQ ID NO: 47.

7. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-4 y un excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más compuestos terapéuticamente activos.

8. Conjugado de fármaco y anticuerpo, que comprende el anticuerpo anti-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-4 conjugado con otros agentes, opcionalmente por un conector.

9. Kit que comprende

a) el anticuerpo anti-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-4, o la composición farmacéutica según la reivindicación 7; y

b) sus instrucciones.

10. Anticuerpo anti-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para usar en medicina, donde el anticuerpo inhibe la angiogénesis.

11. Anticuerpo anti-VEGF según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para usar en el tratamiento de tumores o cánceres o enfermedades oculares; preferiblemente cáncer de mama, tumores cerebrales, carcinoma renal, carcinoma ovárico, carcinoma de tiroides, cáncer pulmonar, cáncer colorrectal, cáncer endométrico, angiosarcoma, cáncer de la vejiga, cáncer de tejido embrionario, tumor cervical, glioma maligno, cáncer gástrico, cáncer pancreático o carcinoma nasofaríngeo; o preferiblemente edema macular, incluidos el edema macular diabético, el edema macular después de una operación de cataratas o el edema macular causado por una uveítis, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, oclusión de la vena central de la retina, glaucoma neovascular y otras enfermedades oculares que implican una neovascularización.