KR20150085816A - 인터류킨-6에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

인터류킨-6에 대한 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 인간 인터류킨-6 (IL6)에 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 IL6 신호전달을 조절할 수 있고 따라서 IL6-연관 질환 또는 장애, 특히 염증성 장애, 류마티스 관절염 (RA), 혈관신생 및 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
[대표도]
도 2a

Description

인터류킨-6에 대한 항체 및 그의 용도{ANTIBODIES TO INTERLEUKIN-6 AND USES THEREOF}
본 출원은 35 U.S.C. §119에 의거하여 2012년 10월 22일에 출원된 미국 가출원 61/716,802를 우선권 주장하며, 이 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
184개 아미노산 (21 kDa)을 갖는 분비성 당단백질인 인간 인터류킨-6 (IL6)은 4-나선 다발 구조를 보유한다. IL6은 2종의 개별 수용체 단백질인 IL6 수용체 (IL6R) 및 당단백질 130 (gp130)에의 결합을 통해 다양한 유형의 세포, 예를 들어 B 세포, T 세포, 섬유모세포, 간세포, 파골세포, 신경계세포, 혈관사이세포, 표피각화세포 및 조혈전구세포에 작용하는 다기능성 시토카인이다. IL6/IL6R/gp130 복합체의 형성은 (1) 포스파티딜 이노시톨-3'-키나제 (PI3K), (2) 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAK), 및 (3) 야누스 티로신 키나제 (JAK)-신호전달물질 및 전사 활성화제 1 및 3 (STAT1 및 STAT3)에 의하여 매개된 것들을 포함하여 세포내 신호전달 경로를 변환한다.
IL6은 면역조절인자, 세포성장인자, 골대사조절인자, 세포분화인자, 및 몇몇 이펙터 세포에 대한 급성기 단백질 유도제로서 기능한다. 간에서, IL6은 다양한 급성기 단백질, 예컨대 혈청 아밀로이드 A (SAA), C-반응성 단백질 (CRP), 헵시딘, 피브리노겐, 및 합토글로빈 안티키모트립신을 유도한다. 만성 염증성 질환, 자기면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 크론병, 캐슬맨병 및 건선), 암 (예를 들어, 다발성 골수종, 백혈병, 유방암, 췌장암, 전립선암 및 각종 암), 및 악액질과 관상동맥성 심질환을 포함하여 다양한 질환에 대한 IL6의 병리학적 중요성이 다수의 연구에서 표명되어 왔다.
따라서 IL6 신호전달과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한 새로운 IL6 길항제의 개발이 많은 관심을 끌고 있다.
본 개시내용은 예기치 않게도 인간 IL6에 대한 높은 결합 친화도와 특이성, 및 IL6-유도 세포 증식 (예를 들어, 암세포 증식)과 시토카인 생산 (예를 들어, 염증성 시토카인 생산), 혈관신생, 암-유도 악액질, 및 암 전이의 억제에 있어서 보다 우수한 활성을 보인 다수의 예시적인 항-IL6 항체, 예를 들어 1-4-62, Ag1-4-6 (또한 "FB704"로도 알려져 있음) 또는 HAg1T-3-10의 동정에 기반한다. 그러한 항체는 또한 다른 화학요법제, 예컨대 옥살리플라틴, 겜시타빈 및 도세탁셀의 항암 효과를 현저히 증진시켰다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은
(a) 서열 2의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 서열 4의 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 서열 6 또는 서열 16의 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 또는
(b) 서열 9의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 서열 11의 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 서열 13 또는 서열 15의 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는, 인간 인터류킨 6 (IL6)에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-IL6 항체는 (i) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 6의 HC CDR3을 포함하는 VH; 또는 (ii) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 16의 HC CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 한 예에서, 항체는 서열 17 또는 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
다른 실시양태에서, 단리된 항-IL6 항체는 (i) 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 13의 LC CDR3을 포함하는 VL; 또는 (ii) 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 15의 LC CDR3을 포함하는 VL을 추가로 포함한다. 한 예에서, 항체는 서열 19 또는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 항-IL6 항체의 예는
(i) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 6의 HC CDR3을 포함하는 VH; 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 13의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(ii) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 16의 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 13의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(iii) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 6의 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 15의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(iv) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 16의 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 15의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(v) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(vi) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(vii) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체; 및
(viii) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체
를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것은 전장 항체이거나 또는 Fab 또는 (Fab')2일 수 있는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 대안적으로, 항-IL6 항체는 단일 쇄 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항체 중쇄 가변 영역 (VH), 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 또는 둘 다를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기에서 VH 및 VL은 본원에 기재된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 중 어느 것을 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 및 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (i) 청구항 40의 숙주 세포를 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계, 및 임의로는 (ii) 항체를 수확하는 단계를 포함하는, 인간 IL6에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 (a) 본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것, 본원에 기재된 핵산 중 어느 것, 또는 본원에 기재된 벡터 중 어느 것; 및 (b) 담체, 예컨대 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 중 어느 것은 또 다른 항암제 또는 질환 조절 항류마티스 약물 (DMARD)을 추가로 포함한다. 항암제의 예는 도세탁셀, 옥살리플라틴 및 겜시타빈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. DMARD의 예는 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 A 및 술파살라진을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에 본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것, 또는 그러한 항-IL6 항체를 코딩하는 핵산 중 어느 것의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, IL6과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. IL6과 연관된 질환의 예는 염증성 장애, 자기면역 질환, 혈관신생 및 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, IL6과 연관된 질환은 다발성 골수종, 백혈병, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 구강암 및 전립선암일 수 있는 암이다. 일부 예에서, 항체 또는 코딩 핵산의 양은 종양 전이 또는 암-관련 악액질의 감소에 유효하다. 다른 예에서, 방법은 대상체에 또 다른 항암제, 예를 들어 옥살리플라틴, 겜시타빈 또는 도세탁셀을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, IL6과 연관된 질환은 자기면역 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 (RA), 크론병, 캐슬맨병, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 건선성 관절염 또는 건선이다. 일부 예에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에 1종 이상의 질환 조절 항류마티스 약물 (DMARD), 예를 들어 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 A 및 술파살라진을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 본 개시내용의 범위 안에는 IL6과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물이 들어오며, 여기에서 제약 조성물은 (a) 본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것 또는 핵산/벡터 중 어느 것; (b) 제약상 허용되는 담체; 및 임의로는 (c) 본원에 기재된 것들과 같은 항암제 또는 DMARD를 포함한다. IL6과 관련된 예시적인 질환은 염증성 장애, 자기면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염 (RA), 크론병, 캐슬맨병, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 건선), 혈관신생, 암 (예를 들어, 다발성 골수종, 백혈병, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 구강암 및 전립선암), 종양 전이 및 암-관련 악액질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 개시내용은 의약에 있어서, 또는 본원에 기재된 것들과 같은 IL6과 연관된 질환 또는 상태 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 항-IL6 항체 중 어느 것 또는 코딩 핵산 중 어느 것의 용도를 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항이 이하의 상세한 설명에 기재된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 하기 도면과 몇몇 실시양태의 상세한 설명으로부터, 및 또한 첨부 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 세포 신호전달 경로 및 증식에 미치는 고-친화도 항-IL6 항체의 효능을 보여주는 다이어그램이다. (a) 인산화-STAT3 신호전달은 항-IL6 항체 Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10에 의하여 용량-의존적 방식으로 감소하였다. (b) 항-IL6 항체 Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10은 대조군 항체 악템라(Actemra)와 비교하여 훨씬 더 큰 수준으로 STAT3 신호전달을 억제하였다. (c) 항-IL6 항체 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10은 용량-의존적 방식으로 B9 세포 증식을 억제하였고 IC50은 각각 0.618, 0.0468 및 0.00456 ㎍/ml이었다.
도 2는 항-IL6 항체가 HUVEC 세포에서의 케모카인 생산을 억제하였음을 보여주는 다이어그램이다. HUVEC를 IL6, sIL6R, IL6과 sIL6R, 또는 IL6, sIL6R과 상기 기재된 바와 같은 항-IL6 항체의 조합과 24 h 동안 배양하였다. 배양 상청액중 MCP-1 및 sICAM-1을 ELISA에 의하여 측정하였다. (a) IL6 + sIL6R-유도 MCP-1 분비는 항-IL6 항체 Ag1-4-6 및 Hag1T-3-10에 의하여 억제되었다. (b) 항체 Ag1-4-6 및 Hag1T-3-10은 sICAM-1의 생산을 악템라보다 큰 수준으로 억제하였다.
도 3은 본원에 기재된 예시적인 항-IL6 항체의 결합 특이성을 보여주는 다이어그램이다.
도 4는 항체 Ag1-4-6 (FB704)이 생체내에서 혈관신생을 억제하였음을 보여주는 다이어그램이다. hIL6 재조합 단백질을 매트리겔(matrigel)에 첨가하여 마우스의 등쪽에 있는 두 부위에 주사하였다. 마우스는 i.v. 주사 또는 사전 혼합물을 통해 항체로 처리하였다. (a) FB704는 처리 6일 후 관찰되는 바와 같이 IL6에 의하여 유도된 혈관신생을 억제하였다. (b) 항체 FB704로의 처리는 헤모글로빈 농도를 현저히 변화시켰다.
도 5는 항체 FB704가 인간 전립선암 세포 PC-3-유도 악액질 및 전이를 억제하였음을 보여주는 다이어그램이다. 종양 주사 후, 마우스 체중을 31일차에 측정하였다. (a) PBS-처리 마우스의 체중은 대략 19% 감소하였다. 이와는 대조적으로, 고-용량 FB704- 및 악템라-처리 군은 안정한 채로 잔류하였고 유의차를 보였다 (P<0.01). (b) FB704 (n=15; P=0.00001) 및 악템라 (n=12; P=0.024)는 PC3 종양-보유 마우스의 무-증상 생존을 현저히 연장시켰다. FB704는 악템라보다 현저히 더 양호한 효능을 보였다 (P=0.03). (c) PBS 처리군의 육안적 부검은 간에서 중증 비대 및 종양세포 침윤을 보여주었다. 그러나, FB704 처리군은 간의 좌엽과 중엽에서 온건한 종양세포 침윤 및 거의 50% 정상 간세포를 보였다. (d) 면역조직화학은 종양 섹션에 FB704 처리 후 혈관밀도가 감소하였음을 보여주었다. (e) CD31 염색의 반-정량적 분석은 FB704 처리 후 현저히 감소하였음을 보여주었다 (P<0.05). (f) FB704 + 화학요법약물 도세탁셀의 조합 처리는 보다 양호한 전체생존율을 제공하였다.
도 6은 항체 FB704가 췌장 암종 이종이식편의 옥살리플라틴 또는 겜시타빈의 항-종양 활성을 증진시켰음을 보여주는 다이어그램이다. (a) 20 mg/kg의 FB704 주 2회 + 옥살리플라틴 (3 mg/kg) 주 1회로 BxPC-3 종양-보유 마우스의 처리는 49%의 통계적으로 유의한 종양성장 억제를 가져왔다 (P<0.01). (b) 마우스 체중은 처리중에 정상적으로 증가하였다. (c 및 d) 개별적인 종양괴를 실험 후에 측정하였으며 종양 중량은 처리 후에 현저히 감소하였다. (e) 종양세포 증식 마커 Ki-67이 종양 섹션의 상이한 처리에서 나타났다. (f) PBS, 옥살리플라틴, FB704 및 FB704 + 옥살리플라틴 처리군의 Ki-67 양성 세포 비율은 각각 26%, 14%, 16% 및 7.5%로 나타났다. (g) 20 mg/kg의 FB704 + 겜시타빈 (80 mg/kg) 주 2회로 BxPC-3 종양-보유 마우스의 처리는 60%의 통계적으로 유의한 종양성장 억제를 가져왔다 (P<0.01).
도 7은 본원에 기재된 예시적인 항-IL6 항체가 U937 및 인간 PBMC 세포상에서의 MCP-1 생산을 억제하였음을 보여주는 다이어그램이다. (a) U937 세포를 IL6과 배양하고 항체로 24 h 동안 처리하였다. MCP-1을 ELISA 키트에 의하여 측정하였다. 본 발명자들의 항체는 MCP-1 생산의 용량-의존적 억제를 보여준다 (n=3). (b) PBMC 세포를 IL6과 배양하고 항체로 24 h 동안 처리하였다. MCP-1을 ELISA에 의하여 측정하였다. 본 발명자들의 항체는 MCP-1 생산의 용량-의존적 억제를 보여주었다 (n=5).
도 8은 본원에 기재된 예시적인 항-IL6 항체에 의한 RA-FLS에서의 MCP-1 생산의 억제를 보여주는 다이어그램이다. (a) 시판 RA-FLS 세포 및 (b) RA 환자의 FLS 세포를 항체의 존재 하에 또는 부재 하에 24 h 동안 IL6 + sIL6R과 배양하였다. 본 발명자들의 항체는 MCP-1 생산의 용량-의존적 억제를 보여준다 (n= 6).
도 9는 본원에 기재된 예시적인 항-IL6 항체에 의한 RA-FLS에서의 VEGF 생산의 억제를 보여주는 다이어그램이다. (a) 시판 RA-FLS 세포 및 (b) RA 환자의 FLS 세포를 IL6, sIL6R 및 IL1β와 배양하고 항체로 24 h 동안 처리하였다. 본 발명자들의 항체는 VEGF 생산의 용량-의존적 억제를 보여준다 (n= 6).
본 개시내용은 인간 인터류킨-6 (IL6)에 결합하고 IL6 활성을 중화시킬 수 있는 항체, 및 IL6-매개 신호전달 경로의 조절에 있어서 그들의 용도에 관한 것이다. 본원에 기재된 항-IL6 항체는 IL6-연관 질환 또는 장애, 예컨대 염증성 장애, 자기면역 질환, 혈관신생, 암, 종양 전이 및 암-관련 악액질의 치료에 유용하다.
하기 설명은 단지 본 발명의 다양한 실시양태를 설명하고자 의도된다. 그에 따라, 본원에서 논의되는 구체적 실시양태는 본 발명의 범위에 대한 제한으로 해석되지 않아야 한다. 통상의 기술자에게는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 변화 또는 그에 상당하는 것이 행해질 수 있음이 명백해질 것이다.
일반 기술
본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 안에 들어오는 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술은 다음과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
정의
본 개시내용의 명쾌하고 즉각적인 이해를 제공하기 위하여, 특정 용어가 우선 정의된다. 부가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 관사 "단수 용어"는 관사의 문법적 대상의 1개 또는 1개보다 많은 것 (즉, 적어도 1개)을 언급한다. 예로서, "요소"는 1개의 요소 또는 1개보다 많은 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 중합체를 언급한다. 용어 "단백질"은 전형적으로는 비교적 큰 폴리펩티드를 언급한다. 용어 "펩티드"는 전형적으로는 비교적 짧은 폴리펩티드 (예를 들어, 100, 80, 60, 50, 30 또는 20개까지의 아미노산 잔기를 함유)를 언급한다.
항체 (복수형으로 교환가능하게 사용)는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해서 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적 결합을 할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 무손상 (즉, 전장) 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 그들의 항원-결합 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 그들의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 여타 변형된 배치구조 (항체의 당화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체 포함)도 포함한다.
무손상 또는 전장 항체는 두 중쇄와 두 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH)과 제1, 제2 및 제3 불변영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL)과 불변영역 (CL)을 함유한다. 전장 항체는 임의 부류, 예컨대 IgD, IgE, IgG, IgA 또는 IgM (또는 그들의 하위부류)의 항체일 수 있으며, 항체는 어떤 특정 부류일 필요는 없다. 자신의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류에 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 보다 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 호칭된다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배치구조는 널리 공지되어 있다.
용어 "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 단편"은 항원 결합을 담당하는 무손상 항체 분자의 부분 또는 영역을 언급한다. 항원-결합 도메인은 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL), 또는 둘 다를 포함할 수 있다. VH 및 VL의 각각은 전형적으로 3개의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유한다. VH 또는 VL중의 3개 CDR은 프레임워크 영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)에 의하여 플랭킹된다.
항원-결합 단편의 예는 다음의 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: (1) VL-CL 쇄 및 VH-CH1 쇄를 갖는 1가 단편일 수 있는 Fab 단편; (2) 힌지 영역에서 디술피드 브리지에 의하여 연결된 두 Fab 단편을 갖는 2가 단편일 수 있는 F(ab')2 단편, 즉 Fab의 이량체; (3) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (4) 펩티드 링커를 통해 VH 도메인과 VL 도메인으로 이루어진 단일 폴리펩티드 쇄일 수 있는 단일 쇄 Fv (scFv); 및 (5) 펩티드 링커에 의하여 연결된 두 VH 도메인 및 디술피드 브리지를 통해 두 VH 도메인과 회합되어 있는 두 VL 도메인을 포함할 수 있는 (scFv)2.
용어 "인간 항체"는 인간 대상체로부터 수득되고, 예를 들어 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열 또는 그의 변이체에 의하여 코딩된 항체에 실질적으로 상응하거나 또는 그로부터 유래된 가변 및 불변영역을 갖는 항체를 언급한다. 본원에 기재된 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의하여 코딩되지 않은 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의하여 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의하여 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러한 돌연변이는 CDR의 하나 이상에서, 또는 FR의 하나 이상에서 존재할 수 있다. 일부 예에서, 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의하여 코딩되지 않는 아미노산 잔기로 치환된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 위치를 보유할 수 있다.
"단리된" 물질은 자연상태로부터 인간의 손으로 변경시켰음을 의미한다. "단리된" 물질이 자연에 존재하면, 그것은 그의 최초 환경으로부터 변화 또는 제거되거나, 또는 변화 및 제거된다. 예를 들어, 살아있는 대상체에 선천적으로 존재하는 폴리펩티드는 "단리되지" 않지만 그 폴리펩티드는 그것이 그의 자연상태의 공존 물질로부터 실질적으로 분리되고 실질적으로 순수한 상태로 존재하면 단리된다.
용어 "특이적 결합한다" 또는 "특이적으로 결합하는"은 두 분자간의 비-무작위 결합 반응, 예컨대 항원의 에피토프에의 항체 결합을 언급한다. 표적 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 관련 기술분야에서 잘 이해되어 있는 용어이며, 그러한 특이적 결합을 측정하기 위한 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 분자는 그것이 대안적인 표적/에피토프와 반응하거나 또는 회합하는 것에 비해 그것이 특정 표적 항원 또는 에피토프와 보다 빈번하게, 보다 손쉽게, 보다 큰 지속기간으로 및/또는 보다 큰 친화도로 반응하거나 또는 회합한다면 "특이적 결합"을 보인다고 말해진다. 항체는 그것이 다른 물질에 결합하는 것에 비해 그것이 보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 손쉽게, 및/또는 보다 큰 지속기간으로 결합한다면 표적 항원에 "특이적으로 결합한다". 예를 들어, IgE 에피토프에 특이적으로 (또는 우선적으로) 결합하는 항체는 그것이 다른 IgE 에피토프 또는 비-IgE 에피토프에 결합하는 것에 비해 보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 손쉽게, 및/또는 보다 큰 지속기간으로 당해 IgE 에피토프에 결합하는 항체이다. 당해 정의를 정독함으로써, 예를 들어 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있거나 또는 결합하지 않을 수도 있음이 또한 이해된다. 그에 따라, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (비록 그것이 포함할 수는 있지만) 반드시 요구한다는 것은 아니다. 반드시 그렇다는 것은 아니지만 일반적으로, 결합이라 함은 우선적 결합을 의미한다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본원에서 교환가능하게 사용되며 치료에 대해 평가되고/되거나 치료되는 포유동물을 언급한다. 대상체는 인간일 수 있지만, 다른 포유동물, 특히 인간 질환에 대한 실험실 모델로서 유용한 그들 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개 등을 또한 포함한다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 인간을 포함한 대상체를 직접적으로 또는 간접적으로 대상체의 상태를 개선할 목적으로 의료 지원에 투입시키는 행위, 적용 또는 요법을 언급한다. 특히, 일부 실시양태에서 그 용어는 발병률의 감소, 또는 증상의 완화, 재발의 제거, 재발의 방지, 발병률의 예방, 증상의 개선, 예후의 개선 또는 그들의 조합을 언급한다. 통상의 기술자라면 치료가 반드시 증상의 완전한 부재 또는 제거를 가져온다는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 암에 관하여, "치료" 또는 "치료하는"은 신생물형성성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이의 둔화, 신생물형성성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이 발생의 예방 또는 지연, 또는 그들의 일부 조합을 언급할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 약리학적 작용제의 투여와 관련하여 "유효량" 또는 "유효 용량" 또는 "치료 유효량"은 그러한 양을 투여받지 않은 상응하는 대상체와 비교하여, 의도한 약리학적 결과를, 또는 질환, 장애 또는 부작용의 치료, 치유, 예방 또는 개선에 효과를, 또는 질환 또는 장애의 진전속도에 감소를 가져오는 약물 또는 약제의 양을 언급한다. 약리학적 작용제의 유효량 또는 유효 용량은 사용된 특정 활성성분, 투여 방식, 및 치료받을 대상체의 연령, 크기와 상태에 따라 다양할 수 있다. 약리학적 작용제의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 투여될 필요가 있으며 각 개체에 고유하다.
"IL6-연관 질환 또는 상태"는 IL6이 신호전달 경로에서 조절 역할을 하여 해당 질환 또는 장애로 인도하게 되는 임의 질환 또는 상태를 언급한다. IL6은 신호-전달 당단백질 gp130의 적어도 하나의 서브유닛과 IL6 수용체 (IL6R)로 이루어진 수용체 복합체를 통하여 세포 반응을 개시하는 시토카인의 패밀리의 구성원이다. IL6은 IL6R에 결합하고, 이는 이어서 gp130을 이량체화하고 이는 gp130의 티로신 잔기의 인산화를 촉발하게 된다. 적어도 3종류의 주요 신호전달 경로가 IL6/IL6R/gp130 복합체의 형성에 관여된다: (1) 포스파티딜 이노시톨-3'-키나제 (PI3K), (2) 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAK), 및 (3) 야누스 티로신 키나제 (JAK)-신호전달물질 및 전사 활성화제 1 및 3 (STAT1 및 STAT3) 경로. IL6은 염증, 자기면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염 (RA), 크론병, 캐슬맨병, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 건선), 혈관신생, 암 (예를 들어, 다발성 골수종, 백혈병, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 구강암 및 전립선암), 종양 전이 및 암-관련 악액질을 포함하여 (그들에 제한되지 않음) 광범위의 질환 또는 장애의 발생에 소정 역할을 하는 것으로 생각되고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "류마티스 관절염"은 신체 전역에서 활막관절 염증을 특징으로 하는 자기면역 질환의 유형을 언급한다. 질환의 초기 증상은 관절통이며, 이는 관절 기형으로, 또는 신체 장기, 예컨대 혈관, 심장, 폐, 피부 및 근육에서의 손상으로 진행하게 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혈관신생"은 일반적으로 새로운 혈관이 형성되는 기본과정을 언급한다. 혈관신생은 조직 성장기 동안의 정상적인 생리학적 과정, 예컨대 근육의 증가, 상처 복구 및 임신으로서 일어날 수 있지만, 암 및 당뇨병성 망막증과 같이 혈관의 성장이 환자의 건강에 유익하지 않은 병상에 또한 관련될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 고형 암 및 비-고형 암을 포함하여 신생물형성성 또는 악성 세포 군, 증식 또는 전이에 의하여 매개된 의학적 상태를 언급한다. 암의 예는 폐암, 신장암, 위암, 유방암, 뇌암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 흑색종, 두경부암, 결장암, 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "악액질"은 일반적인 불건강 및 영양실조의 상태를 언급한다. "악액질"은 보통은 악성 암과 관련되고 그에 의하여 유도되며, 중증 식욕부진, 체중, 특히 제지방체중의 현저한 감소, 및 근육소모를 특징으로 한다.
고-친화도 항-IL6 항체
본 개시내용은 1-4-62, Ag1-4-6 (또한 "FB704"로도 알려져 있음) 및 HAg1T-3-10을 포함한 다수의 고-친화도 항-IL6 항체의 동정에 기반한다. 이들 항-IL6 항체는 인간 IL6에 높은 결합 친화도 (예를 들어, 10-8 M 미만, 바람직하게는 10-9 M 미만의 KD 값을 가짐)와 높은 특이성으로 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 예를 들어 도 3에 도시된 것들과 같은 다른 IL6 패밀리 시토카인에는 인간 IL6과 비교하여 훨씬 더 낮은 결합 친화도로 결합한다. 또한, 이들 항체는 IL6-유도 세포 증식 및 STAT3 인산화, 혈관신생과 헤모글로빈 생산을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 항-IL6 항체는 암-유도 (예를 들어, 전립선암-유도) 악액질, 췌장암 성장 및 암 전이, 예컨대 전립선암 전이를 성공적으로 억제하였고, 다른 화학요법제, 예컨대 옥살리플라틴, 겜시타빈 및 도세탁셀의 항암 효과를 현저히 증진시켰으며, HUVEC 및 PBMC 세포 및/또는 활막 섬유모세포, 예를 들어 RA 환자로부터 수득된 것들에 의한 염증성 시토카인 (예를 들어, MCP-1 및 sICAM) 및/또는 VEGF 생산을 감소시켰다.
따라서, 1-4-62, Ag1-4-6과 HAg1T-3-10 및 그들의 기능성 변이체를 포함하여, 인간 IL6에 결합 (예를 들어, 그에 특이적으로 결합)할 수 있는 고-친화도 항체가 본원에 기재된다. 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10 각각의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다. 이들 3종 항체 중 어느 것의 기능성 변이체는 1-4-62, Ag1-4-6 또는 HAg1T-3-10의 VH의 것 (서열 17 또는 서열 18)과 적어도 85% (예를 들어, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 쇄, 1-4-62, Ag1-4-6 또는 HAg1T-3-10의 VL의 것 (서열 19 또는 서열 20)과 적어도 85% (예를 들어, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 보유하는 VL 쇄, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 이들 변이체는 인간 IL6에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 변이체는 상기 기재된 참조 항체와 비교하여 유사한 항원-결합 친화도를 소유한다 (예를 들어, 1 x 10-8 M 미만, 바람직하게는 1 x 10-9 M 또는 1 x 10-10 M 미만의 Kd를 가짐).
결합의 친화도는 용어 ka (회합속도상수), kd (해리속도상수) 또는 KD (평형 해리)에 의하여 정의된다. 전형적으로, 항체에 관하여 사용될 때 "특이적으로 결합"은 자신의 표적(들)에 10-8 M 미만, 예를 들어 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 친화도 (KD) 값으로 특이적으로 결합하는 ("인식하는") 항체를 언급한다. 보다 낮은 KD 값은 보다 높은 결합 친화도 (즉, 보다 강한 결합)를 나타냄에 따라, 10-9의 KD 값은 10-8의 KD 값 보다 높은 결합 친화도를 나타낸다.
두 아미노산 서열의 "%동일성"은 문헌 (Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993)에서와 같이 변형을 가한 문헌 (Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990)의 알고리즘을 사용하여 측정된다. 그러한 알고리즘은 문헌 (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)의 엔블라스트(NBLAST) 및 엑스블라스트(XBLAST) 프로그램 (버전 2.0)에 편입된다. 블라스트 단백질 검색을 엑스블라스트 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행하여 관심 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 두 서열간에 갭이 존재하는 경우, 문헌 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997)에 기재된 바와 같이 갭 블라스트(Gapped BLAST)가 이용될 수 있다. 블라스트 및 갭 블라스트 프로그램 이용시, 각 프로그램 (예를 들어, 엑스블라스트 및 엔블라스트)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 역시 본 개시내용의 범위 안에 들어온다.
일부 실시양태에서, 항-IL6 항체는 MHIDDSNGYXSDAF (서열 21)의 HC CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하며, 여기에서 X는 방향족 아미노산 잔기, 예컨대 F, Y, H 또는 W이다. 일부 예에서, HC CDR3은 서열 6 또는 서열 16이다. 그러한 항체의 VH 쇄는 서열 2의 HC CDR1, 서열 2의 HC CDR2 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다.
이와 달리 또는 추가로, 항-IL6 항체는 서열 13 또는 서열 15의 LC CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 그러한 항체의 VL 쇄는 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL6 항체는 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10과 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 예에서, 이들 항체는 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10과 동일한 VH 및 VL 쇄를 포함한다. VH 및 VL 쇄를 각각 중쇄 CH1 및 CL과 융합시켜 Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다. 대안적으로, VH 및 VL 쇄를 중쇄 불변영역 (예를 들어, 인간 IgG 불변 쇄) 및 경쇄 불변영역 (카파 쇄)과 융합시켜 전장 항체를 형성할 수 있다. 다른 예에서, VH 및 VL 쇄를 직접적으로 또는 링커를 통해 융합시켜 단일 쇄 항체를 형성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 기능성 변이체는 항체 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10에서의 것들과 비교하여, VH, VL 또는 둘 다의 FR에 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 보존적 치환)를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 그러한 돌연변이는 CDR 중 하나 이상과 상호작용할 것으로 예측되는 잔기에서는 발생하지 않는다. 관련 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, FR 영역내 돌연변이는 항체의 항원-결합 활성에 영향을 줄것 같지는 않다. 일부 예에서, 항체 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10의 CDR 영역 중 하나 이상에서의 변화는 비실질적이며, 즉 참조 서열과 실질적으로 동일하다.
용어 "비실질적" 또는 "실질적으로 동일한"은 변이체의 관련 아미노산 서열 (예를 들어, FR, CDR, VH 또는 VL 도메인에서)이 참조 항체와 비교하여 비실질적으로 상이하여 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환 포함), 그 변이체는 참조 항체와 견주어 실질적으로 유사한 결합 활성 (예를 들어, 친화도, 특이성 또는 둘 다) 및 생물활성을 보유하게 됨을 의미한다. 그러한 변이체는 중요치 않은 아미노산 변화를, 예를 들어 특정된 영역의 5 아미노산 서열에 1 또는 2개의 치환을 포함할 수 있다. 일반적으로, (결합 친화도를 최초 항체와 비교하여 50% 넘게 감소시키는 것과 같이) 항체의 결합 기능에 악영향을 미치지 않는 한, CDR 영역과는 대조적으로 FR 영역에 보다 많은 치환이 행해질 수 있다. 일부 실시양태에서, 최초 항체와 변형된 항체간에는 서열 동일성이 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 보다 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 동일한 결합 특이성을 보유하고 최초 항체의 친화도의 적어도 50%를 보유한다. 일부 예에서, 변이체는 항체 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10의 VH, VL 또는 둘 다의 하나 이상의 CDR 영역에 5개까지의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)을 포함한다.
보존적 치환은 그러한 변형이 행해지는 분자의 것들과 유사한 기능적 및 화학적 특징을 보유하는 분자를 산출할 것이다. 예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 그 위치에서의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 거의 또는 전혀 영향이 없도록 하는 천연 아미노산 잔기의 또 다른 잔기로의 치환을 수반할 수 있다. 목적하는 아미노산 치환 (보존적이든지 또는 비-보존적이든지 간에)은 통상의 기술자에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 이용하여 분자 서열의 중요한 잔기를 동정하거나, 또는 본원에 기재된 분자의 친화도를 증감시킬 수 있다. 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체는 통상의 기술자에게 알려져 있는 폴리펩티드 서열을 변경하는 방법을 수집하고 있는 참조문헌, 예를 들어 다음의 문헌에서 찾아볼 수 있는 바와 같이 그러한 방법에 따라 제조될 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군내 아미노산들간에 행해진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
본 개시내용은 항체의 향상된 생물학적 특성, 예컨대 보다 높은 결합 친화도를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산중으로 적당한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성을 통해서 제조될 수 있다. 그러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열내 잔기로부터의 결실, 및/또는 그러한 잔기중으로의 삽입 및/또는 그러한 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입과 치환의 임의 조합을 행하여 최종 구축물을 달성하며, 단 그 최종 구축물은 목적하는 특징을 소유한다. 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 관련 기술분야에 알려져 있는 각종 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이들 방법은 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-특이적) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 항체의 보다 일찍 제조된 변이체 또는 비-변이체 (천연) 버전의 카세트 돌연변이유발을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항-IL6 항체의 평형해리상수 (KD) 값은 10-8 M 미만, 특히 10-9 M 또는 10-10 M 미만이다. 결합 친화도는 관련 기술분야에 알려져 있는 기술, 예컨대 ELISA 또는 생체특이적 상호작용 분석, 또는 관련 기술분야에 알려져 있는 다른 기술을 이용하여 측정될 수 있다.
본원에 기재된 예시적인 항-IL6 항체는
(i) (a) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1, 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2, 및 서열 6 또는 서열 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 VH; 또는 (b) 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1, 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2, 및 서열 13 또는 서열 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(ii) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1, 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2 및 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(iii) 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1, 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 서열 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(iv) (a) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1, 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2 및 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 (b) 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1, 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 서열 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(v) 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1, 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 서열 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(vi) (a) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1, 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2 및 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 (b) 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1, 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 서열 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(vii) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1, 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2 및 서열 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 항체; 및
(viii) (a) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1, 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2 및 서열 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 (b) 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1, 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 서열 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체
를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일상적인 방법, 예를 들어 하기의 실시예에서 기재한 것들에 따라, 본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것을 검사하여 그들의 특성, 예컨대 항원-결합 활성, 항원-결합 특이성 및 생물학적 기능을 측정할 수 있다.
본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것을 예를 들어 PEG화, 과글리코실화 등에 의하여 관련 기술분야에 알려져 있고 쉽사리 이용가능한 부가적인 비-단백성 모이어티를 함유하도록 변형시킬 수 있다. 혈청 반감기를 증진시킬 수 있는 변형이 관심을 끈다.
본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것을 코딩하는 핵산, 이들 핵산을 포함하는 발현 벡터와 같은 벡터, 및 그 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 본원에 개시된다. 한 예에서, 중쇄- 및 경쇄-코딩 서열 (예를 들어, VH와 VL, VH-CH1과 VL-CL, 또는 전장 중쇄와 전장 경쇄를 코딩하는 서열) 둘 다가 하나의 발현 벡터에 포함된다. 또 다른 예에서, 항체의 중쇄와 경쇄 각각은 개별 벡터중으로 클로닝된다. 후자의 경우에, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터는 양쪽 쇄의 발현을 위해 하나의 숙주 세포중으로 공-형질감염시킬 수 있으며, 양쪽 쇄는 조립되어 생체내에서 또는 시험관내에서 무손상 항체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 중쇄를 코딩하는 발현 벡터 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터를 중쇄와 경쇄 각각의 발현을 위해 상이한 숙주 세포중으로 도입시킬 수 있으며, 이어서 이들 중쇄와 경쇄는 정제되고 조립되어 시험관내에서 무손상 항체를 형성할 수 있다.
통상의 기술자에게 알려져 있는 다수의 방법이 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 수득하는 데에 이용가능하다. 예를 들어, 항체는 재조합 DNA 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 하이브리도마의 생성에 의하여 생산될 수 있다. 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 이어서 표준 방법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 스크리닝하여 특정된 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 동정한다. 또한, 파지 제시 시스템을 이용하여 단일 쇄 항체를 스크리닝할 수 있다.
대안적으로, 항-IL6 항체 중 어느 것을 통상적인 방법론, 예를 들어 재조합 기술을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 예시적인 항체에 대하여 본원에 제공된 폴리펩티드 서열 (예를 들어 표 1 참조)을 사용하여 그러한 항체를 코딩하는 적합한 핵산 서열을 수득할 수 있으며, 그 핵산 서열은 일상적인 방법에 의하여 적합한 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포)에서 항체를 생산하기 위하여 통상적인 재조합 기술을 통해 적합한 발현 벡터중으로 클로닝시킬 수 있다. 그렇게 하여 제조된 항체는 세포 또는 배양 상청액으로부터 단리될 수 있으며 그들의 결합 특징과 생물활성은 또한 일상적인 기술에 의하여 검사될 수 있다.
한 예에서, 파지 제시 시스템을 이용하여 IL6 단일 쇄 항체를 선택한다. 일단 단리되면, 특이적 IL6 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 목적하는 특이성을 보유하는 전장 면역글로불린 및 그의 단편을 발현하도록 설계된 발현 벡터중으로 클로닝시킬 수 있다. 간단히 말하면, 단일 쇄 항체의 VH 및 VL 폴리뉴클레오티드를 면역글로불린 골격 (즉, IgG) 벡터중으로 클로닝시키고, 발현시킨 다음, 이량체화하여 단일 쇄를 완전 항체로 "전환"시킨다. 면역글로불린 골격은 필요에 따라 면역글로불린의 5가지 주요 부류 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 중 어느 것으로부터 선택될 수 있다. scFv → 무손상 면역글로불린 분자로의 전환 방법은 예를 들어 WO 94/11523, WO 97/9351 또는 EP 0481790에 기재된 바와 같이 널리 공지되어 있다.
본원에 기재된 항체를 발현하기 위한 재조합 벡터는 전형적으로는 구성적 또는 유도성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 항체 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는 둘 다에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 터미네이터, 개시 서열, 및 항체를 코딩하는 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 적어도 하나의 독립적인 터미네이터 서열을 함유하는 일반 발현 카세트, 진핵생물과 원핵생물 둘 다에서 카세트의 복제를 가능케 해주는 서열, 즉 셔틀 벡터, 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 다에 대한 선택 마커를 임의로 함유한다.
본원에 기재된 재조합 항-IL6 항체는 원핵 또는 진핵 발현 시스템, 예컨대 박테리아, 효모, 사상균, 곤충 및 포유동물 세포에서 생산될 수 있다. 본 발명의 재조합 항체가 진핵 세포에서 당화되거나 또는 발현되는 것이 필수적이지는 않지만; 포유동물 세포에서의 발현이 일반적으로 바람직하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 태아 신장 계통 (293 세포), 베이비 햄스터 신장세포 (BHK 세포), 차이니즈 햄스터 난소세포/- 또는 + DHFR (CHO, CHO-S, CHO-DG44, Flp-in CHO 세포), 아프리카 푸른 원숭이 신장세포 (VERO 세포), 및 인간 간세포 (Hep G2 세포)이다. 숙주 세포는 벡터로 (예를 들어, 화학적 형질감염 또는 전기영동 방법에 의하여) 형질전환되거나 또는 형질감염되고 프로모터의 유도, 형질전환체의 선택, 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭을 위해 통상적인 영양배지 (또는 경우에 따라 변형)에서 배양된다. 생산된 항체 단백질은 추가 단리하거나 또는 정제하여 추가 검정 및 적용을 위한 실질적으로 균질한 제제를 수득할 수 있다. 관련 기술분야에 알려져 있는 표준 단백질 정제방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 정제 절차는 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼상에서의 분획화, 에탄올 침전, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 황산암모늄 침전 및 겔 여과를 포함할 수 있다.
전장 항체를 소망하는 경우, 본원에 기재된 항-IL6 VH 및 VL 쇄 중 어느 것의 코딩 서열을 인간 면역글로불린의 Fc 영역의 코딩 서열에 연결시킬 수 있으며 전장 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 결과로서 생기는 유전자를 적합한 숙주 세포, 예를 들어 식물 세포, 포유동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포에서 발현 및 조립시킬 수 있다.
항원-결합 단편은 일상적인 방법을 통해서 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 전장 항체 분자의 펩신 소화, 및 F(ab')2 단편의 디술피드 브리지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편에 의하여 생산될 수 있다. 대안적으로, 그러한 단편은 중쇄 및 경쇄 단편을 적합한 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이, 효모, 포유동물, 식물 또는 곤충 세포)에서 발현시킴으로써 재조합 기술을 통해 제조될 수 있으며, 그들을 조립시켜 생체내에서 또는 시험관내에서 목적하는 항원-결합 단편을 형성할 수 있다.
단일 쇄 항체는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 연결시킴으로써 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 가요성 링커가 두 가변 영역 사이에 편입된다.
항-IL6 항체의 용도
본원에 기재된 항-IL6 항체는 IL6에 결합하여 IL6에 대한 길항제로서 작용하고 IL6-의존적 신호전달 경로를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 그들 항체는 IL6-의존적 세포 증식 (예를 들어, 췌장암 세포 성장) 및 인산화된 STAT 신호전달을 현저히 억제하고, 생체내에서의 IL6-유도 신생혈관형성을 감소시키고, 인간 종양 전이 (예를 들어, 전립선암 전이)를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 항체는 화학요법제, 예컨대 옥살리플라틴, 겜시타빈 및 도세탁셀과 함께 사용시, 인간 췌장 종양의 동물 모델에서 상승작용적 효능을 보였다.
따라서, 본원에 기재된 항-IL6 항체는 염증성 장애, 자기면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염 (RA), 크론병, 캐슬맨병, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 건선), 혈관신생, 암, 예컨대 고형 종양 (예를 들어, 다발성 골수종, 백혈병, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 구강암 및 전립선암), 종양 전이 및 암-관련 악액질을 포함하여 (그들에 제한되지 않음) IL6과 연관된 질환 또는 상태의 치료에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 치료방법을 실시하기 위하여, 항-IL6 항체 중 어느 것 (예를 들어, 항체 1-4-62, Ag1-4-6 또는 HAg1T-3-10과 동일한 CDR 또는 동일한 VH 및 VL 쇄를 보유하는 항체), 또는 그러한 항체를 코딩하는 핵산(들) (예를 들어, 발현 벡터)을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 가지고서 제약 조성물로 제제화시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 "제약상 허용되는"은 담체가 조성물에 함유된 활성성분과 양립성이고, 바람직하게는 활성성분을 안정화시킬 수 있으며 치료받을 대상체에게는 유해하지 않음을 의미한다. 담체는 활성성분에 대한 희석제, 비히클, 부형제 또는 매질로서 작용할 수 있다. 적합한 담체의 일부 예는 생리학적으로 적합한 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거 용액, 생리학적 염수 완충제, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 멸균수, 시럽 및 메틸 셀룰로스를 포함한다. 제약 조성물은 윤활제, 예컨대 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광유; 습윤제; 유화제와 현탁화제; 보존제, 예컨대 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트; 감미제; 및 향미제를 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Edition 16, Mack Publishing Co., Easton, Pa (1980); 및 Goodman and Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Tenth Edition, Gilman, J. Hardman and L. Limbird, eds., McGraw-Hill Press, 155-173, 2001.
본 발명에 따른 제약 조성물은 정제, 환제, 분말, 로젠지, 사쉐, 카쉐, 엘릭시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 멸균 주사가능한 용액, 및 포장된 분말의 형태일 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 임의의 생리학상 허용되는 경로를 통해 전달될 수 있다. 이들 경로는 비경구 투여, 전신 투여, 경구 투여, 비강 투여, 직장 투여, 복막내 주사, 혈관내 주사, 피하 주사, 경피 투여, 흡입 투여 및 근육내 주사를 포함할 수 있으며 그들에 결코 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
치료적 사용을 위해 제제화된 제약 조성물은 목적하는 정도의 순도를 보유하는 작용제를 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 채택되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 비독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저-분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)TM, 플루로닉스(PLURONICS)TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 암, 예컨대 전립선암의 치료를 목표로 한다. 이러한 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 암을 앓고 있거나 또는 암을 보유하고 있는 것으로 의심되는 환자일 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 항-IL6 항체의 양은 블랭크(blank) 대조군과 비교하여 IL6-유도 세포 증식을 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 억제하는 데에 유효하다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL6 항체의 양은 STAT3 인산화를 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 억제하는 데에 유효하다. 일부 예에서, 본원에 기재된 항-IL6 항체의 양은 IL6-유도 혈관신생, 암-유도 악액질 (예를 들어, 전립선암-유도 악액질), 암 전이 (전립선암 전이) 또는 그들의 조합을 억제하는 데에 유효하다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 자기면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염의 치료를 위한 것이다. 또 다른 예에서, 대상체는 그 질환을 앓고 있거나 또는 보유하고 있는 것으로 의심되는 인간 류마티스 관절염 환자이다. 일부 예에서, 본원에 기재된 항-IL6 항체의 양은 염증성 시토카인, 예컨대 MCP-1 및/또는 sICAM의 생산을 예를 들어 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 감소시키는 데에 충분하다.
표적 질환, 예컨대 암 또는 류마티스 관절염을 치료하기 위해서는, 상기 기재된 제약 조성물의 유효량이 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 치료가 필요한 인간 대상체는 IL6과 관련된 장애를 보유하거나, 그러한 장애에 대한 위험에 처해있거나 또는 그러한 장애를 보유하고 있는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 그러한 환자는 일상적인 검진에 의하여 동정될 수 있다.
본원에 기재된 항-IL6 항체 중 어느 것은 또 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 이에 관련해서 용어 "조합하여"는 항체 조성물과 치료제가 동시에 또는 순차적으로 부여됨을 의미한다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 1종의 부가적인 치료제와 동시 제제화되고/되거나 동시 투여되는 적어도 1종의 항-IL6 항체를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 부가적인 작용제는 암 화학요법제, 예를 들어 옥살리플라틴, 겜시타빈, 도세탁셀이다. 또 다른 실시양태에서, 부가적인 작용제는 RA 치료를 위한 질환 조절 항류마티스 약물 (DMARD), 예를 들어 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 A, 술파살라진일 수 있다. 그러한 조합 요법은 유리하게는 투여된 치료제의 보다 낮은 투여량을 사용할 수 있으며, 그에 따라 다양한 단독요법과 관련된 있을지도 모르는 독성 또는 합병증을 방지하게 된다. 또한, 본 개시내용의 부가적인 치료제는 IL6/IL6R/gp130 경로 이외의 경로 또는 그와는 별개의 경로에 작용할 수 있으며, 따라서 항-IL6 항체의 효과를 증진시키고/시키거나 그러한 효과와 상승작용할 것으로 예상된다.
본원에 기재된 항체 조성물이 제2 치료제와 동시 사용되는 경우에, 조성물 또는 제2 작용제 중 어느 한쪽의 치료량 이하의 투여량, 또는 둘 다의 치료량 이하의 투여량이 IL6에 의하여 매개된 세포 신호전달과 연관된 질환 또는 장애를 보유하고 있거나 또는 그러한 질환 또는 장애가 발생할 위험에 처해있는 대상체의 치료에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료량 이하의 용량"은 다른 작용제 또는 작용제들의 부재 하에 투여되는 경우 대상체에서 치료결과를 산출하게 되는 그 투여량보다 적은 투여량을 언급한다. 따라서, 작용제의 치료량 이하의 용량은 본원 기재 항-IL6 항체의 투여 부재 하에서 대상체에서 목적하는 치료적 결과를 산출하지 않을 투여량이다. 임상적 사용중에 있는 다수 작용제의 치료 용량은 의학 분야에 널리 공지되어 있고, 부가적인 치료 용량은 과도한 실험 없이 통상의 기술자에 의하여 결정될 수 있다. 치료 투여량은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., 1990)과 같은 참조문헌; 및 질환 및 장애의 치료에 대한 지침으로서 의료 종사자에 의하여 신뢰받는 다수의 다른 의학 참조문헌에 광범위하게 기재되어 있다.
치료하고자 하는 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 의학분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 통상적인 방법을 사용하여 제약 조성물을 대상체에 투여할 수 있다.
주사가능한 조성물은 다양한 담체, 예컨대 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 수용성 항체는 점적법에 의하여 투여될 수 있으며, 그리하여 항체와 생리학상 허용되는 부형제를 함유하는 제약제제가 주입된다. 생리학상 허용되는 부형제는 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거 용액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제제는 제약상 부형제, 예컨대 주사용수, 0.9% 염수 또는 5% 글루코스 용액에 용해시켜 투여될 수 있다.
본원에 기재된 항-IL6 항체를 코딩하는 핵산(들)이 치료제로서 사용되는 경우에, 항체를 발현하는 핵산(들) 또는 벡터(들)는 문헌 (Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio. 2, 139)에 기재된 것과 같은 방법에 의하여 대상체에 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 벡터는 리포솜, 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 또는 생체접착성 마이크로구체를 사용하여 세포중으로 도입시킬 수 있다. 대안적으로, 핵산 또는 벡터는 직접 주사에 의하여 또는 주입 펌프의 사용에 의하여 국소적으로 전달될 수 있다. 다른 접근법은 예를 들어 접합체 및 생분해성 중합체의 사용을 통한 다양한 수송 및 담체 시스템을 채용하는 것을 포함한다.
전달을 촉진하기 위하여, 항-IL6 항체 또는 그의 코딩 핵산 중 어느 것을 샤페론제와 접합시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "접합된"은 두 실재물이 바람직하게는 두 실재물간 회합의 치료적 이익이 실현되는 충분한 친화도로 회합되는 것을 의미한다. "접합된"은 공유 또는 비-공유 결합 및 회합의 다른 형태, 예컨대 한쪽 실재물이 다른 한쪽 실재물 위에 또는 안에, 또는 어느 한쪽 또는 양쪽 실재물이 제 3 실재물 (예를 들어, 미셀) 위에 또는 안에 포착된 형태를 포함한다.
샤페론제는 자연발생 물질, 예컨대 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 저-밀도 지질단백질 또는 글로불린), 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린 또는 히알루론산), 또는 지질일 수 있다. 샤페론제는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예컨대 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리리신 (PLL), 폴리　L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 및 폴리포스파진을 포함한다.
한 예에서, 샤페론제는 올리고뉴클레오티드/간섭 RNA가 캡슐화되는 미셀, 리포솜, 나노입자 또는 마이크로구체이다. 그러한 미셀, 리포솜, 나노입자 또는 마이크로구체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 및 5,527,5285를 참조한다.
또 다른 예에서, 샤페론제는 융합발생제 또는 축합제 중 하나 이상의 부착을 위한 기질로서 작용한다.
융합발생제는 국소 pH에 반응성이다. 예를 들어, 엔도좀내의 pH에 직면시, 융합발생제는 그의 현재 놓여진 환경에 있어서의 물리적 변화, 예를 들어 엔도좀 막의 투과성을 붕괴시키거나 또는 증가시키고, 그리하여 숙주 세포의 세포질중으로 안티센스 올리고뉴클레오티드의 방출을 촉진하게 되는 삼투 특성에 있어서의 변화를 초래할 수 있다. 바람직한 융합발생제는 전하를 변화시키며, 예를 들어 생리학적 범위보다 낮은 pH에서　(예를 들어, pH 4.5 내지 6.5에서) 양성자화된다. 융합발생제는 특정한 pH 범위에 노출시 전하의 변화 (예를 들어, 양성자화)를 겪을 수 있는 아미노 기를 함유하는 분자일 수 있다. 그러한 융합발생제는 폴리아미노 쇄를 보유하는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌이민) 및 막 붕괴제 (예를 들어, 멜리틴)를 포함한다. 다른 예는 폴리히스티딘, 폴리이미다졸, 폴리피리딘, 폴리프로필렌이민, 및 폴리아세탈 물질 (예를 들어, 양이온성 폴리아세탈)을 포함한다.
축합제는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 상호작용하여 그로 하여금 축합되게 하며 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 크기를 축소시키며), 그에 따라 그를 분해로부터 보호하게 된다. 바람직하게는, 축합제는 예를 들어 이온 상호작용을 통해 올리고뉴클레오티드와 상호작용하는 모이어티 (예를 들어, 하전된 모이어티)를 포함한다. 축합제의 예는 폴리리신, 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민 또는 그의 4급 염, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티드모방성 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린 및 알파 나선형 펩티드를 포함한다.
본원에 기재된 항-IL6 항체는 생물학적 샘플중 IL6의 존재 검출에도 또한 사용될 수 있다. 항체-기반 검출 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 ELISA, 면역블롯, 방사성면역검정, 면역형광, 면역침전 및 기타 관련기술을 포함한다. 항체는 단백질을 검출하기 위한 적어도 1종의 다른 성분을 혼입하는 진단 키트로 제공될 수 있다. 키트는 패키징, 사용설명서, 또는 단백질의 검출과 키트의 사용을 지원할 다른 물질을 또한 함유할 수 있다.
항체는 리간드 기 (예를 들어, 비오틴), 방사성동위원소, 형광발색단 또는 효소를 포함하여 검출가능한 마커로 변형시킬 수 있다. 효소는 그들의 활성에 의하여 검출된다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제는 분광광도계로 정량가능한, 기질 테트라메틸벤지딘 (TMB)을 청색 안료로 전환시키는 그의 능력에 의하여 검출된다. 항체는 또한 적어도 1종의 다른 분자(들), 예컨대 또 다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 또는 다중특이적 항체), 세포독성제 또는 세포증식억제제, 독소, 방사성동위원소 등에 (예를 들어, 유전자 융합, 화학적 커플링, 비-공유 회합에 의하여 또는 딴 방법으로) 기능적으로 연결시킬 수 있다.
키트
본 개시내용은 IL6과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한 키트를 또한 제공한다. 그러한 키트는 항-IL6 항체 (예를 들어, 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10) 또는 그의 코딩 핵산을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 방법 중 어느 것에 따라 사용하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 포함된 사용설명서는 본원에 기재된 방법 중 어느 것에 따라 암 (예를 들어, 전립선암) 또는 자기면역 질환 (예를 들어, RA)과 같은 IL6과 연관된 질환을 치료하거나, 그러한 질환의 발생을 지연시키거나, 또는 그러한 질환을 완화시키기 위한 항-IL6 항체의 투여 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 개체가 질환을 보유하고 있는지를 동정하는 것에 기초하여 치료에 적합한 그 개체를 선택하는 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 사용설명서는 질환의 위험에 처한 개체에 항-IL6 항체를 투여하는 설명서를 포함한다.
항-IL6 항체의 사용에 관계되는 사용설명서는 일반적으로 투여량, 투여 스케쥴, 및 의도하는 치료를 위한 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다회 용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 사용설명서는 전형적으로 라벨 또는 첨부문서 (예를 들어, 키트에 포함된 페이퍼 시트)상 서면으로의 지시이지만, 기계-판독가능한 사용설명서 (예를 들어, 자기 또는 광 저장 디스크에 게재된 사용설명서) 또한 허용된다.
라벨 또는 첨부문서는 조성물이 간 섬유증 또는 경변증의 치료, 그들의 발생 지연 및/또는 그들의 완화용으로 사용됨을 표시한다. 사용설명서는 본원에 기재된 방법 중 어느 것의 실시를 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 패키징 형태이다. 적합한 패키징은 바이얼, 병, 자(jar), 가요성 패키징 (예를 들어, 밀봉 밀라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정한 장치, 예컨대 흡입기, 비강투여 장치 (예를 들어, 분무기) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 액세스 포트를 구비할 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하주사침에 의하여 천공가능한 마개가 달린 정맥주사용액 백 또는 바이얼일 수 있다). 용기는 또한 멸균 액세스 포트를 구비할 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하주사침에 의하여 천공가능한 마개가 달린 정맥주사용액 백 또는 바이얼일 수 있다). 조성물중 적어도 1종의 활성제는 항-IL6 항체이다.
본원에 기재된 키트 중 어느 것은 부가적인 치료제, 예컨대 항암제 (예를 들어, 옥살리플라틴, 겜시타빈 또는 도세탁셀) 또는 DMARD (예를 들어, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 A 또는 술파살라진)를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 부가적인 성분, 예컨대 완충제 및 해석정보를 임의로 제공할 수 있다. 보통, 키트는 용기 및 그 용기상의 또는 그와 결합된 라벨 또는 첨부문서(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조품을 제공한다.
더 이상의 고심 없이도, 통상의 기술자라면 상기 상세한 설명에 기초하여 본 발명을 그의 최대한까지 이용할 수 있다고 생각된다. 하기 구체적 실시양태는 따라서 단지 설명적인 것으로서 해석되어야지, 어떠한 식으로도 본 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적 또는 주제를 위하여 참조로 포함된다.
실시예 1: 인간 IL6에 결합하는 고-친화도 항체의 동정
인간 IL6에 결합할 수 있는 고-친화도 인간 항체의 동정을 위해 파지-제시 인간 나이브(naive) scFv 라이브러리를 다음과 같이 구축하였다.
mRNA를 151명의 건강한 공여자의 말초혈 림프구로부터 단리하고, 그로부터 올리고 dT 프라이머를 사용하여 M-MuLV 역전사효소 (퍼멘타스, Fermentas)에 의하여 cDNA를 합성하였다. VH 및 VL 유전자를 증폭시키고, 조립한 다음, 약간 변형을 가한 표준 프로토콜에 의하여 파지미드 벡터중으로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 전기영동을 통해 TG1 이. 콜라이 세포중으로 도입시켰다. 그후, 이. 콜라이 세포를 회수하고, 100 mg/ml 앰피실린과 2% 글루코스를 함유하는 2YT 배지에서 인큐베이션하였다. M13KO7 헬퍼 파지 입자를 배양물에 첨가하여 scFv-파지 입자를 생성하였으며, 그에 따라 scFv 라이브러리가 생산된다. 1,000개 클론에 걸쳐서 서열분석함으로써 라이브러리의 다양성을 측정하였다.
scFv 라이브러리를 다음과 같이 4라운드의 바이오패닝에 투입하였다. 웰을 4℃에서 밤새 0.1M NaHCO3 완충제중 재조합 IL6으로 코팅시키고 이어서 300 ㎕의 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 2회 세정하였다. 웰을 1 h 동안 37℃에서 PBS중 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단시키고; 1% BSA를 함유하는 PBS중 100 ㎕의 파지 입자 (2x1011 pfu)로 첨가한 다음, 1 h 동안 실온 (RT)에서 진탕시켰다. 웰을 이어서 300 ㎕ 0.5% (w/v) 트윈 20/PBS로 6회 세척하였다. 결합된 파지를 용리시키고 이. 콜라이 TG1으로의 감염에 의하여 증폭시켰다. 감염된 세포를 M13KO7에 의하여 구제하였다. 결과로서 생기는 파지 입자를 PEG-침전을 통해 농축시킨 다음 바이오패닝의 후속 라운드를 위해 사용하였다.
바이오패닝의 제4 및 제5 라운드에서, 파지 클론을 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 스크리닝에 의하여 그들의 항원-결합 특이성에 대하여 검사하였다. ELISA 플레이트를 재조합 인간 IL6 또는 BSA로 0.1M NaHCO3 완충제중 2 ㎍/ml로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. PBS로 세척 후, 웰을 PBS중 1% (w/v) BSA로 1 h 동안 RT에서 차단시켰다. 파지 클론 및 scFv 단편을 플레이트에 첨가하고, 이들을 1 h 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.1% (v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척하고 이어서 1% BSA-PBS에 1:10,000으로 희석한 HRP-표지 염소 항-인간 IgG (케이피엘, KPL)로 40 min 동안 RT에서 프로빙하였다. 플레이트를 재차 세척하고 3,3',5,5′-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액을 첨가하여 발색시켰다. 정지용액 (1M H2SO4)을 이어서 첨가하고 자동 플레이트 광도계 (바이오-라드, Bio-Rad)를 사용하여 450 nm에서의 흡수를 정량하였다.
4 라운드의 바이오패닝 후, 8x102개가 넘는 파지 클론이 상기 기재된 ELISA 검정에 의하여 rhIL6에 결합할 수 있는 것으로 동정되었다. 29개 파지 클론을 서열분석을 위해 선택하여 항-IL6 항체를 코딩하는 VH 및 VL 서열을 결정하였다. 다수의 고유한 클론이 동정되었으며; 그들의 결합 활성과 특이성을 비교 ELISA 검정에 의하여 측정하였다.
상기 기재된 바이오패닝 절차로부터 동정된 부모 파지 클론인 클론 1-4-62를 친화도 성숙을 위해 선택하여 각각이 0.9x109개가 넘는 변이체 항체를 함유하는 무작위화 VL/VH CDR 파지 항체 라이브러리의 부위-특이적 돌연변이유발을 통한 구축을 통해서 고-친화도 항-IL6 항체를 생산하였다. 라이브러리는 하기 표준 프로토콜에 따라 클론 1-4-62의 VL 및 VH 서열에 기초하여 CDR 영역에 무작위화 서열을 함유하는 VL 및 VH 정방향 프라이머를 사용하여 구축하였다. CDR 무작위화 라이브러리를 본원에 기재한 바와 같은 고-엄중 조건 하에 바이오패닝 절차에 투입하였으며 적어도 두 고-친화도 클론 Ag1-4-6 (FB704)과 Hag1T-3-10이 부모 클론에 비하여 보다 높은 결합 활성을 보유하는 것으로 동정되었다.
3가지 항-IL6 항체 1-4-62, Ag1-4-6 및 Hag1T-3-10에 대하여 VH 및 VL 도메인 둘 다에 대한 상보성 결정 영역 1-3 (CDR 1-3) 및 프레임워크 영역 1-4 (FW1-4)를 하기 표 1에 제공하였다:
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2: 인간 IL6에 결합하는 고-친화도 항체의 특성화
재료 및 방법
(i) 세포주 및 항체
인간 골수종 세포인 U266 세포주 (BCRC 60437)를 타이완의 바이오리소스 컬렉션 앤드 리서치 센터(Bioresource Collection and Research Center (BCRC))로부터 입수하여 10% 소 태아 혈청으로 보충한 RPMI 1640 (바이오웨트, Biowet)에서 배양하였다.
IL6-의존적 B 세포 하이브리도마인 B9를 5% 소 태아 혈청 + 50 pg/ml 재조합 인간 IL6으로 보충한 RPMI 1640에서 배양하였다.
인간 제대정맥 내피세포 (HUVEC)를 론자(Lonza)로부터 구입하여 젤라틴-코팅 페트리디쉬상 EGMTM-2 싱글쿼츠(singleQuots)® 배지 (론자)에서 성장시켰다.
IgG-생산 세포인 프리스타일(FreeStyle)TM CHO 세포주 (인비트로젠, Invitrogen)를 프리스타일TM CHO 발현배지 (인비트로젠) + 8 mM L-글루타민에서 배양하였다.
Flp-in CHO 세포주 (인비트로젠)를 Ham's F12 (인비트로젠) + 10% 소 태아 혈청에서 배양하였다.
대조군 항-IL6 항체인 BE8을 다이아클론(Diaclone)으로부터 구입하였다. 류마티스 관절염 치료용으로 미식품의약국(FDA)에서 승인한 항체 약물 (항-IL6 항체)인 악템라를 독일 하이델베르크대학병원(Universitatsklinikum Heidelberg)으로부터 구입하였다. 인간 IgG1 뉴클레오티드를 시그마(Sigma)로부터 구입하였다.
(ii) 완전 인간 항-IL6 IgG1 항체의 생산
포유동물 세포에서의 인간 IgG 생산을 위하여 4종의 발현 벡터 (pA01-카파, pA02-감마, p2CMV 중간체 및 변형된 pcDNAFRT)를 구축하였다. 항-IL6 후보자 항체를 코딩하는 (카파 불변영역을 함유하는) 온전한 경쇄 유전자와 (감마 불변영역을 함유하는) 온전한 중쇄 유전자를 일시적인 항체 발현을 위해 pcANTAB5E로부터 별도로 pA01-카파 및 pA02-감마중으로 클로닝시켰다. 이들 발현 벡터를 진젯™ 플러스 (GenJet™ Plus) 시약 (시그널진, SignalGen)에 의하여 프리스타일TM CHO-S 세포중으로 도입시켰다.
온전한 경쇄 및 중쇄 유전자를 먼저 p2CMV 중간체 벡터중으로 클로닝한 다음 이어서 안정한 항체 발현을 위해 변형된 pcDNAFRT 단일 발현 벡터중으로 클로닝하였다. pcDNAFRT 벡터를 진젯™ 플러스 시약에 의하여 CHO 세포중으로 형질감염시키고 양성 클론을 보다 긴 발현기간 동안 히그로마이신 B (인비트로젠)로 선택하였다. 맵셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)와 단백질 A 칼럼 (지이 헬스케어, GE Healthcare)에 의하여 배양 상청액을 수확하고 정제하였다.
(iii) 결합 및 경쟁 분석
ELISA 및 웨스턴 블롯을 수행하여 항-IL6 인간 IgG 항체의 결합 활성을 검사하였다. 간단히 말하면, 플레이트를 재조합 인간 IL6 (알앤디 시스템즈, R&D Systems)으로 2 ㎍/ml로 코팅하였다. PBS로 세척 후, 웰을 PBS중 1% (w/v) BSA로 1 h 동안 RT에서 차단시켰다. 연속 희석액중 정제 항-IL6 항체 (2 ㎍/ml의 출발농도)를 웰에 넣고 RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.1% (w/v) 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척하고, 이어서 1% BSA-PBS에 1:10,000으로 희석한 HRP-표지 염소 항-인간 IgG (케이피엘)로 40 min 동안 RT에서 프로빙하였다. 플레이트를 재차 세척하고 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시켰다. 정지용액 (1M H2SO4)을 이어서 첨가하고 자동 플레이트 광도계 (바이오-라드)를 사용하여 450 nm에서의 흡수를 정량하였다.
재조합 IL6 단백질을 5X 환원 샘플 완충제 (0.15 M 트리스-HCl, pH 6.8, 50% 글리세롤, 10% SDS, 0.71 M 2-메르캅토에탄올, 0.095% 브로모페놀 블루)에서 10 min 동안 비등시킨 다음, SDS-PAGE (바이오-라드)에 투입하였다. 단백질을 이어서 니트로셀룰로스 막 (바이오-라드)으로 옮기고, 본원에 기재된 완전 인간 항-IL6 항체로 면역블로팅하였다. HRP-표지 염소 항-토끼 (서모, Thermo) 또는 HRP-표지 염소 항-마우스 (케이피엘) 항체와 인큐베이션 후, 막을 증진된 화학발광 (지이 헬스케어)에 의하여 전개시켰다.
플레이트를 0.1M NaHCO3 완충제중 2 ㎍/ml에서의 재조합 인간 IL6 수용체-α (알앤디 시스템즈)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBS로 세척 후, 웰을 PBS중 1% (w/v) BSA로 1 h 동안 RT에서 차단시켰다. 2 ㎍/ml의 출발농도로 2배 연속 희석액중 정제 항-IL6 항체를 rhIL6 (0.5 ㎍/ml)과 RT에서 1 hr 동안 미리 인큐베이션하였다. 혼합물을 플레이트에 넣고 RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.1% (v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척하고 이어서 1% BSA-PBS에 1:2,000으로 희석한 마우스 항-인간 IL6 IgG2a (아브캄, Abcam)로 1 h 동안 RT에서 프로빙하였다. 플레이트를 세척하고 이어서 1% BSA-PBS에 1:10,000으로 희석한 HRP-표지 염소 항-마우스 IgG (서모)로 40 min 동안 RT에서 프로빙하였다. 플레이트를 재차 세척하고 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시켰다. 정지용액 (1M H2SO4)을 이어서 첨가하고 자동 플레이트 광도계를 사용하여 450 nm에서의 흡수를 정량하였다.
(iv) 세포 신호전달 검정
U266 세포 (1x106/ml)를 무혈청 RPMI 1640으로 2회 세척하고 소 태아 혈청과 성장인자의 부재 하에 2 h 동안 배양하였다. 세포를 rhIL6 (5 ng/ml)으로 30 min 동안 37℃에서 자극시키고 이어서 항-IL6 항체로 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 세포를 빙냉 PBS로 세척하고, 이어서 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (로슈, Roche)로 보충한 RIPA 완충제 (서모)에서 용해시켰다. 항-pSTAT3, 및 항-STAT3 (셀 시그널링 테크놀로지, Cell Signaling Technology) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. HRP-표지 염소 항-토끼 (서모) 또는 HRP-표지 염소 항-마우스 항체 (서모)와의 인큐베이션 후, 막을 증진된 화학발광 (지이 헬스케어)에 의하여 전개하였다.
(v) 세포 증식 검정
뮤린 B9 세포 (5x104/ml)를 96-웰 플레이트에 시딩하고 rhIL6 (10 pg/ml)과 인큐베이션하였다. 뮤린 B9 세포의 IL6 수용체는 인간 IL6으로 자극시킬 수 있었다. 다양한 농도에서의 항-IL6 항체 또는 대조군 IgG 항체를 웰에 넣었다. 세포를 이어서 37℃에서 72 h 동안 배양하였다. 제조업체의 지침에 따라 수용성 테트라졸리움 (WST-1) 검정 (로슈)에 의하여 세포생존성을 검출하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었다.
(vi) 비아코어 분석
비아코어(BIAcore) T200 시스템 (지이 헬스케어)중 인간 항체 포획 키트 (지이 헬스케어)를 사용하여 IgG 결합 친화도를 측정하였다. 마우스 항-인간 IgG를 CM5 센서 칩상에 아민 커플링을 통해 고정화하였다. HBS-EP+ 완충제중 대략 700 RU의 정제 항-IL6 IgG를 고정화된 표면 위에 포획시켰다. HBS-EP+ 완충제중 25.6 nM 내지 0.4 nM 범위 농도에서의 재조합 인간 IL6 (알앤디 시스템즈)를 30 ㎕/min의 유량을 이용하여 2분 동안 주입하였다. HBS-EP+ 완충제 유동중 결합 항원의 해리가 7분 동안 후속되었다. 재생 용액 (3M MgCl2)을 사용하여 각 사이클 후에 표면 IgG를 재생시켰다. 해리상수 (KD)는 kd/ka로서 계산되었다.
(vii) 특이성 분석
플레이트를 0.1M NaHCO3 완충제중 2 ㎍/ml에서의 재조합 인간 IL3, IL4, IL5, IL6, IL11, IL17A, CNTF, OSM, IGF-1 (알앤디 시스템즈), IL2, FGF (프로스펙, Prospec), VEGF, TNF-α, EGF (페프로테크, Peprotech)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBS로 세척 후, 웰을 PBS중 1% (w/v) BSA로 RT에서 1 h 동안 차단시켰다. 2 ㎍/ml의 출발농도에서의 4배 연속 희석액중 정제 항-IL6 항체를 웰에 넣고 RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.1% (w/v) 트윈 20을 함유하는 PBS에서 세척하고 이어서 1% BSA-PBS에 1:10,000으로 희석한 HRP-표지 염소 항-인간 IgG (케이피엘)로 40 min 동안 RT에서 프로빙하였다. 플레이트를 재차 세척하고 TMB 기질 용액을 첨가하여 발색시켰다. 정지용액 (1M H2SO4)을 이어서 첨가하고 버사 맥스(VERSA max) (몰리큘라 디바이시즈, Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서의 흡수를 정량하였다.
결과
(a) 항-IL6 IgG 항체의 결합 활성
항-IL6 항체의 결합 특이성을 탐구하기 위하여, 선택된 scFv 클론을 코딩하는 VH 및 VL 유전자를 카파 및 감마 불변영역 유전자와 융합시켜 본원에 기재된 바와 같은 온전한 인간 IgG1 항체를 생성하였다. ELISA 및 웨스턴 블롯 검정은 그들 항-IL6 항체가 인간 재조합 IL6 단백질에 결합할 수 있었고 용량-의존적 방식으로 중화 활성을 나타내었음을 보여주었다.
비아코어 분석은 부모 1-4-62 클론과 비교하여 클론 Ag1-4-6 및 Hag1T-3-10의 회합속도상수 (ka)의 평균이 4.38 x 10-5 M-1s-1에서 2.24 x 10-6 M-1s-1로 증진되었음을 보여주었다. 해리속도상수 (kd)는 1.66 x 10-3 s-1에서 6 x 10-4 s- 1로 증진되었다. 평형해리상수 (KD)는 3.85 nM에서 0.27 nM로 향상되었다. 하기 표 2를 참조한다.
Figure pct00003
(b) 항-IL6 항체의 결합 특이성
본원에 기재된 바와 같은 ELISA 검정을 수행하여 본원에 기재된 고-친화도 항-IL6 항체의 결합 특이성을 확인하였다. 간단히 말하면, 플레이트를 도 3a (IL6 패밀리 시토카인) 및 도 3b (비-IL6 패밀리 시토카인)에 표시한 바와 같은 상이한 시토카인으로 코팅시키고 그들 시토카인에 대한 FB704 항체 클론 (즉, Ag1-4-6)의 결합 활성을 검사하였다. FB704는 인간 IL6 단백질에 대해서는 높은 결합 활성을 보였지만 다른 시토카인에 대해서는 그렇지 않았으며 (도 3a 및 3b), 이는 인간 IL6에 대한 그의 결합 특이성을 표시한다.
(c) 항-IL6 항체에 의한 IL6-의존적 신호전달 경로 및 세포 증식의 억제
인간 다발성 골수종 U266 세포를 사용하여 IL6-유도 신호전달 캐스케이드에 미치는 항-IL6 항체의 영향을 검사하였다. U266 세포를 항체의 존재 하에 또는 부재 하에 rhIL6과 배양하였다. 30분 후, 전 세포 용해물을 수집하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 IL6 신호전달 경로에 관여되는 주요 전사인자인 인산화된 STAT3 단백질 (P-STAT3)을 검사하였다. P-STAT3 단백질 발현은 고-친화도 항-IL6 항체 Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10에 의하여 대조군으로 사용되었던 항-IL6 수용체 인간화 항체인 악템라보다 큰 수준으로 억제되었다. (도 1a 및 1b). 항체에 의한 STAT3 인산화 억제의 수준을 하기 표 3에 나타내었다:
Figure pct00004
또한, 세포 증식에 대한 항체 활성을 검사하기 위하여, IL6-의존적 B9 뮤린 하이브리도마 세포를 다양한 농도로 이소형 대조군 항체뿐만 아니라 항-IL6 또는 항-IL6R 항체의 존재 하에서도 배양하였다. 세포 증식에 미치는 영향을 72시간 후 WST-1 검정 (로슈)에 의하여 평가하였다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 완전 인간 항-IL6 항체 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10은 B9 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 억제하였으며, 1-4-62, Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10의 IC50 값은 각각 0.618, 0.0468 및 0.00456 ㎍/ml이었다.
실시예 3: 암 치료에서 고-친화도 항-IL6 항체의 유효성
재료 및 방법
(i) 동물
수컷 NOD/SCID 마우스 (7 내지 8주령)를 모든 실험에 대해 바이오라스코 타이완 컴퍼니 리미티드(BioLASCO Taiwan Co., Ltd., 타이완 타이페이)로부터 구입하였다. 마우스를 멸균 개별 환기 케이지 (IVC)에 20℃에서 유지시키고 실험이 개시되기 적어도 7일 전 수용시설에 순응시켰다.
(ii) 매트리겔 혈관신생 검정
액체 매트리겔 (비디 바이오사이언시즈, BD Biosciences)을 4℃에서 유지시켰다. hIL6 재조합 단백질 (알앤디 시스템즈)을 매트리겔에 첨가하여 100 ng/0.5 ml의 최종 농도가 되게 하였다. 마우스를 애버틴(Avertin) (0.2 ml/10 g, i.p. 주사)으로 마취시키고 등쪽의 두 부위에 0.5 ml의 매트리겔로 주사하였다. 이어서, 마우스를 정맥내 주사를 통하여 항-IL6 IgG 항체 또는 대조군 IgG 항체로 처리하였다. 6일차에, 마우스를 CO2 질식에 의하여 안락사시켰다. 매트리겔 플러그를 제거하고, 칭량한 다음, 사진촬영을 하였다. 헤모글로빈 수준을 측정하기 위하여, 매트리겔 플러그를 용해 완충제 (PBS중 1% SDS, 0.5% 트리톤)로 밤새 4℃에서 용해시켰다. 플러그의 헤모글로빈 함량을 드랩킨(Drabkin) 시약 (시그마)을 사용하여 정량하였다. 소 헤모글로빈 (시그마)의 표준곡선을 이용하여 플러그중 헤모글로빈의 농도를 측정하였다. 헤모글로빈 함량은 그램 매트리겔 당 마이크로그램 헤모글로빈으로 표시하였다. 스튜던트 언페어 t-검정(Student's unpaired t-test)을 이용하여 평균 + SD를 계산하였으며; p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
(iii) 비장내 이식 모델을 이용한 전립선 PC3 종양 전이 검정
마우스를 애버틴 (0.2 ml/10g)으로 마취시키고 좌측 옆구리를 제모하였다. 그들을 이어서 우측 측와위로 놓은 다음 좌측 옆구리에서 75% 알콜로 문질러 닦았다. 복벽에서의 피부를 종방향으로 (척주에 평행하게) 1 cm 절개하였다. 비장을 복부에서 끄집어 내고 부드럽게 안정화시켰다. 인슐린 주사기상의 30-게이지 침을 비장의 실질조직중으로 3 내지 4 mm 삽입하였다. 50 ㎕의 PC-3 세포 현탁액을 서서히 주사하였다. 가시적인 엷은 팽진(wheal)은 성공적인 주사를 표시한다. 이어서 침을 빼내고 작은 솜뭉치를 30초 동안 주사부위를 덮도록 올려놓아 출혈과 세포 현탁액 유출을 막았다. 비장을 복막 안으로 다시 넣었다. 복벽을 6-0 나일론 봉합사로 봉합하고, 피부를 4-0 나일론 봉합사로 봉합하였다.
이식 후, 마우스를 상이한 처리군 (도세탁셀 군, 도세탁셀 + 항-IL6 항체 군, 및 PBS 대조군)에 무작위로 배정하고, 꼬리 정맥을 통해서 또는 i.p 주사에 의하여 다회 용량의 항-IL6 항체 (매회 20 mg/kg, 주 2회), 도세탁셀 (매회 3 mg/kg, 주 1회)로 처리하였다. 그들 마우스의 체중을 주 2회 측정하였다.
모든 마우스를 이어서 CO2 질식에 의하여 안락사시키고 체중을 측정하였다. 비장 및 간에서의 원발성 종양을 절제하고, 사진촬영한 다음 칭량하였다. 장기 지수(organ index)는 그램 마우스 당 밀리그램 장기로 표현하였다. 평균 + SD는 스튜던트 t-검정을 이용하여 계산하였다. 생존 검정을 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석에 이용하였다. 종양괴의 파라핀-포매 또는 동결 절편을 준비하여 분석을 위해 항-CD31 및 Ki-67 + 헤마톡실린 염색에 의하여 염색하였다.
(iv) 이종이식편 인간 췌장 종양 모델
인간 췌장 종양세포 BxPC-3 및 MiaPaCa 세포를 PBS에 재현탁시키고 마우스의 우측 옆구리에 피하 (s.c.) 주사하였다 (5x106 세포, 총 부피 0.15 mL). 10일 후, 마우스를 상이한 처리군 (항체 FB704 군, 옥살리플라틴 군, FB704 + 옥살리플라틴 군, 겜시타빈 군, 및 PBS 대조군)에 무작위적으로 배정하고, 꼬리 정맥을 통해서 또는 i.p. 주사에 의하여 다회 용량의 FB704 (매회 20 mg/kg, 주 2회) 또는 옥살리플라틴 (매회 3 mg/kg, 주 1회), 또는 겜시타빈 (매회 80 mg/kg, 주 2회)으로 처리하였다. 마우스 체중 및 종양 크기를 주 2회 측정하였다. 종양 크기는 캘리퍼스를 사용하여 측정하였으며, 종양 부피는 길이 x 폭2 x 0.52로 계산하였다. 실험 후, 모든 마우스를 희생시키고, 마우스 혈액 샘플을 수집한 다음 종양괴를 적출하여 칭량하였다. 평균 종양 부피와 종양 중량에서의 차이를 스튜던트 t-검정에 의하여 평가하였다. 종양괴의 파라핀-포매 또는 동결 절편을 준비하여 분석을 위해 항-CD31, Ki67 또는 TUNEL + H&E 염색에 의하여 염색하였다.
결과
(i) FB704는 매트리겔 검정에서 생체내 혈관신생을 억제한다
FB704의 항-혈관신생능을 본원에 기재된 바와 같은 생체내 매트리겔 모델에서 검사하였다. 처리 6일 후, 마우스를 희생시키고 헤모글로빈 농도를 측정하였다. FB704 처리군의 절제한 매트리겔 플러그에서 색상과 혈관밀도에 관찰가능한 차이가 있었으며 (도 4a), 이는 항체의 항-혈관신생 활성을 표시한다. hIL6과 비교하여 FB704 처리는 헤모글로빈 농도를 또한 현저히 감소시켰다 (도 4b).
(ii) FB704는 인간 전립선암 세포 PC-3-유도 악액질 및 전이를 억제한다
암-유도 악액질 및 전이에 미치는 FB704의 효능을 증명하기 위하여, 마우스에 인간 전립선암 PC-3 세포 (1.0 x 106/마우스)로 비장내 주사에 의하여 이식하였다. 1일차에, 마우스를 4개 군으로 무작위화하였다 (n=12-15). 높은 (20 mg/kg) 및 낮은 (5 mg/kg) 용량의 FB704, 양성 대조군 악템라 (20 mg/kg) 및 PBS를 주 2회 i.v. (정맥내) 주사를 통해 투여하였다. PC-3 세포 이식 후 31일차에, PBS-처리 마우스의 총 체중은 대략 19% 감소하였다. 이와는 대조적으로, 고-용량 FB704 및 악템라 처리군의 총 체중은 안정한 채로 남았으며, 이는 대조군과 비교하여 유의차가 있다 (도 5a; P<0.01).
또한, 수일간의 잠복기 후, PC3 종양-보유 마우스에서는 뒷다리 마비 또는 파종성 종양 확산의 부가적인 증상이 발생하였다. FB704 (P=0.0001) 및 악템라 (P=0.024)의 반복적인 혈관내 주사는 PC3 종양-보유 마우스의 무증상 생존을 현저히 연장시켰으며, 여기에서 FB704는 악템라보다 현저히 더 양호한 효능을 보였다 (P=0.03) (도 5b). PBS 처리군의 육안적 부검은 간에서 중증 비대 및 종양세포 침윤을 보여주었다. 이와는 대조적으로, FB704 처리군은 간의 좌엽과 중엽에서 온건한 종양세포 침윤 및 50%보다 많은 정상 간세포를 보였다 (도 5c).
혈관신생은 종양 전이에서 또한 중요한 역할을 한다. 면역조직화학을 수행하여 종양 섹션상의 혈관밀도를 검증하였다. CD31 (혈관신생에 대한 마커)에 대한 염색은 FB704 처리군에서의 혈관신생이 PBS 대조군과 비교하여 현저히 감소하였음을 보여주었다 (도 5d 및 5e).
또한, FB704와 화학요법약물 도세탁셀의 조합 처리는 보다 양호한 전체생존율을 제공하였다 (도 5f).
(iii) FB704는 췌장 암종 이종이식편 모델에서 옥살리플라틴 또는 겜시타빈의 항-종양 활성을 증진시킨다
FB704는 인간 췌장암 모델에서 옥살리플라틴 또는 겜시타빈의 항-종양 활성을 증진시켰다. BxPC-3 종양-보유 마우스를 20 mg/kg의 FB704 주 2회 + 옥살리플라틴 (3 mg/kg) 주 1회 및 겜시타빈 (80 mg/kg) 주 2회로의 처리는 각각 49% 및 60%의 통계적으로 유의한 종양성장 억제를 가져왔다 (P<0.01) (도 6a 및 6g). 마우스 체중은 정상적으로 증가하였다 (도 6b). 종양괴 중량은 처리 후에 현저히 감소하였다 (도 6c 및 6d).
세포 증식 마커인 Ki-67에 특이적인 항체를 사용하여 각 군의 종양 조직에서의 종양세포 증식 속도를 검사하였다. PBS, 옥살리플라틴, FB704 및 FB704 + 옥살리플라틴 처리군에서 Ki-67 양성 세포의 %는 각각 26%, 14%, 16% 및 7.5%이었으며 (도 6e 및 6f), 이는 FB704와 옥살리플라틴 또는 겜시타빈의 조합 처리가 생체내에서 췌장 종양세포 증식의 보다 양호한 억제를 제공하였음을 시사한다.
FB704는 췌장암 모델에서 겜시타빈과의 상승작용적 이익을 또한 보여주었다. BxPC-3 종양-보유 마우스를 20 mg/kg의 FB704 및 80 mg/kg의 겜시타빈 주 2회로의 처리는 통계적으로 유의한 종양성장 억제를 가져왔다 (P<0.01) (도 6g).
실시예 4: 류마티스 관절염 치료에서 고-친화도 항-IL6 항체의 유효성
RA 환자에서, MCP-1과 같은 케모카인의 상승된 생산이 관절에서 관찰되어 왔는데, 이는 RA의 발병에 케모카인의 관여를 시사한다. 부착 분자 sICAM-1 역시 손상 조직중으로의 염증세포 침윤에 중요한 역할을 한다. HUVEC는 세포 표면에 sICAM-1을 선천적으로 발현하였다. IL6 + sIL6R 처리는 sICAM-1 발현을 유도하였다.
(i) 항-IL6 항체는 HUVEC 세포에서의 MCP-1 및 sICAM-1 생산을 억제하였다
류마티스 관절염 (RA)의 치료에 있어서 본원에 기재된 항-IL6 항체의 유효성을 검사하기 위하여, 인간 제대정맥 내피세포 (HUVEC)에 의한 단핵구 주화성 단백질-1 (MCP-1) 및 sICAM-1 분비를 다음과 같이 항체 처리 후에 측정하였다. HUVEC 세포를 48-웰 플레이트에 2x105 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 재조합 인간 IL6, IL6 수용체-α (알앤디 시스템즈)로 다양한 농도에서의 항-IL6 항체와 또는 항-IL6 항체 없이 또는 대조군 IgG 항체와 조합하여 37℃에서 24 h 동안 처리하였다. 무세포 배양 상청액을 수집하고 ELISA (레이바이오테크, RayBiotech)에 의하여 MCP-1 및 sICAM-1에 대하여 분석하였다.
당해 시험관내 검정은 IL6 + sIL6Rα가 HUVEC에 의한 MCP-1 및 sICAM-1 발현을 유도하였음을 보여주었다. 항체 Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10은 IL6 + sIL6Rα-유도 MCP-1 (도 2a) 및 sICAM-1 (도 2b)을 용량-의존적 방식으로 억제하였다. 억제 효능은 악템라보다 높았다.
(ii) 항-IL6 항체는 U937 세포 및 인간 말초혈 단핵 세포 ( PBMC ) 둘 다에서 MCP-1 생산을 억제하였다
MCP-1은 염증 부위로 단핵구, 메모리 T 세포 및 수지상 세포를 동원하는, CC 케모카인 패밀리에 속하는 소형 시토카인이다. 면역세포들 가운데, 단핵구 세포는 MCP-1의 주요 생산자인 것으로 알려져 있다. MCP-1은 염증 및 관절염에 주요 역할을 한다. 또한, IL6은 인간 단핵구에서 MCP-1을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 본원에 기재된 항-IL6 항체를 IL6에 의하여 자극된 전단핵구(promonocytic) 세포주 U937 세포에서의 MCP-1 발현의 억제에 있어서 그들의 유효성에 대하여 시험하였다.
U937 (2x106 세포/웰)을 상이한 농도에서의 항-IL6 항체의 존재 하에 RPMI 1640을 함유하는 48-웰 편평바닥 배양 플레이트 (코닝(Corning), 미국 뉴욕주 코닝)에서 24 h 동안 IL6 (100 ng/ml)과 배양하였다. 상청액중 MCP-1의 수준을 MCP-1 ELISA 키트 (이 바이오사이언스, e Bioscience)에 의하여 측정하였다. 시험관내 실험의 전부를 삼중으로 수행하였다.
U937 세포로부터의 MCP-1 생산이 IL6 자극 후에 및 용량-의존적 방식으로 관찰되었고, 항-IL6 항체는 IL6에 의하여 유도된 U937 세포에서의 MCP-1 생산을 억제하였다 (도 7a).
또한, PBMC를 5명의 건강한 공여자로부터 단리하였다. 세포 (5x105 세포/250 ㎕/웰)를 상이한 농도에서의 항-IL6 항체의 존재 하에 RPMI 1640을 함유하는 96-웰 U자형 바닥 배양 플레이트 (코닝, 미국 뉴욕주 코닝)에서 24 h 동안 IL6 (100 ng/ml)과 배양하였다. MCP-1 ELISA 키트 (이 바이오사이언스)에 의하여 상청액중 MCP-1의 수준을 측정하였다.
PBMC 세포에 의한 MCP-1의 생산이 IL6 자극 후에 관찰되었다. 항체 Ag1-4-6 및 HAg1T-3-10의 존재는 MCP-1 생산을 용량-의존적 방식으로 억제하였으며, 반면에 대조군 이소형 IgG1은 이러한 억제 효과를 보이지 않았다 (도 7b).
(iii) 항-IL6 항체는 류마티스 관절염 환자로부터의 활막 섬유모세포에서의 MCP-1 및 VEGF 생산을 억제하였다
신선한 활막조직을 세절한 다음 콜라게나제와 DNase의 용액에서 소화시켰다. 단리된 섬유모세포를 70-mm 나일론 필터를 통해 여과하였다. 플라스틱 세포 배양 접시에서 95% 공기/5% CO2중에서 20mM HEPES와 10% 열-불활성화 FBS, 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신 (pH 7.6으로 조정)으로 보충한 RPMI 1640 (라이프 테크놀로지스, Life Technologies)에서 세포를 성장시켰다. 섬유모세포 단백질 마커 비멘틴(vimentin)에 대하여 특이적인 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의하여 특징해석하여 95%가 넘는 세포가 섬유모세포이었다. 4 내지 9 계대차로부터의 섬유모세포가 실험용으로 사용되었다.
상기 기재된 바와 같은 인간 RA 환자로부터 유래한 섬유모세포-유사 활막세포 (RA-FLS 세포)를 6-웰 편평바닥 배양 플레이트 (코닝, 미국 뉴욕주 코닝; 2x105 세포/2ml/웰)에서 2일 동안 배양하고 IL6과 sIL6R 둘 다로 자극시켰다. 다양한 농도에서의 항체를 웰에 첨가하고 세포와 24 h 동안 인큐베이션하였다. 이어서 MCP-1 ELISA 키트 (이 바이오사이언스)에 의하여 MCP-1 수준을 측정하였다.
RA-FLS 세포는 선천적으로는 MCP-1을 낮은 수준으로 발현하며 IL6과 sIL6R로의 전처리는 고-수준 MCP-1 생산을 자극할 수 있었다. 본원에 기재된 항-IL6 항체는 시판 RA-FLS 세포 (도 8a) 및 상기 기재된 바와 같은 RA 환자로부터 수득한 RA-FLS 세포 (도 8b)에서 MCP-1 생산의 현저한 억제를 보여주었다.
혈관내피성장인자 (VEGF)는 RA의 발병에서 중요한 역할을 한다. VEGF 수준은 RA 환자로부터의 활액에서 현저히 더 높다. VEGF는 또한 혈관 투과성을 유도하고 염증을 매개한다. RA-FLS 세포에서의 VEGF 생산에 미치는 항-IL6 항체의 영향을 검사하기 위하여, 그들 세포를 다음과 같이 IL6 (100 ng/ml), sIL6R (100 ng/ml) 및 IL1β (5 ng/ml)의 존재 하에 본원에 기재된 항-IL6 항체로 처리하였다.
RA-FLS 세포 (2x104 세포/500㎕/웰)를 48-웰 편평바닥 배양 플레이트 (코닝, 미국 뉴욕주 코닝)에서 24시간 동안 배양하고 이어서 IL6과 sIL6R 및 IL1β 둘 다로 자극시켰다. 다양한 농도에서의 항체를 웰에 첨가하고 세포와 48시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 수집한 다음 인간 VEGF ELISA 키트 (프리프로테크, PreproTech)에 의하여 VEGF의 수준을 측정하였다.
IL6, IL6R과 IL1β의 조합으로 자극한 RA-FLS 세포의 배양 상청액중 VEGF는 시토카인에 의하여 자극되지 않은 세포로부터의 상청액중의 것들보다 3 내지 5배 더 높았다. 항-IL6 항체는 시판 RA-FLS 세포 (도 9a) 및 본원에 기재된 바와 같은 RA 환자로부터 준비한 RA-FLS 세포 (도 9b) 둘 다에서 VEGF 생산을 현저히 감소시켰다.
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 특징의 전부는 어떤 조합으로도 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 만족시키는 대안의 특징에 의하여 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등한 또는 유사한 특징의 일반적 시리즈의 예일 뿐이다.
상기 상세한 설명으로부터, 통상의 기술자라면 본 발명의 본질적 특징을 손쉽게 확인할 수 있고, 본 발명의 취지와 범위로부터 벗어나지 않고 본 발명의 다양한 변화와 변형을 행하여 본 발명을 다양한 용법 및 상태에 순응시킬 수 있다. 따라서, 그 밖의 실시양태 역시도 청구범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Fountain Biopharma Inc. Lin, Willie Lee, Tong-Young Wu, Han-Chung Tanny Chen Tsao <120> ANTIBODIES TO INTERLEUKIN-6 AND USE THEREOF <130> F0720.70000WO00 <140> TBD <141> 2013-09-18 <150> US 61/716,802 <151> 2012-10-22 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Thr Gly Gly Met Ser Val Ser 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Thr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Thr Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Ile Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Met His Ile Asp Asp Ser Asn Gly Tyr Phe Ser Asp Ala 100 105 110 Phe His Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 19 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Asp Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Val Arg Asn Asn Trp Pro 85 90 95 Pro Arg Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 110 <212> PRT <213> 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Claims (42)

  1. (a) 서열 2의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 서열 4의 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 서열 6 또는 서열 16의 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 또는
    (b) 서열 9의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 서열 11의 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 서열 13 또는 서열 15의 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는, 인간 인터류킨 6 (IL6)에 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, (i) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 6의 HC CDR3을 포함하는 VH; 또는 (ii) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 16의 HC CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 단리된 항체.
  3. 제2항에 있어서, 서열 17 또는 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 단리된 항체.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, (i) 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 13의 LC CDR3을 포함하는 VL; 또는 (ii) 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 15의 LC CDR3을 포함하는 VL을 추가로 포함하는 단리된 항체.
  5. 제4항에 있어서, 서열 19 또는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    (i) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 6의 HC CDR3을 포함하는 VH; 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 13의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
    (ii) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 16의 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 13의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
    (iii) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 6의 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 15의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체; 및
    (iv) 서열 2의 HC CDR1, 서열 4의 HC CDR2 및 서열 16의 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 9의 LC CDR1, 서열 11의 LC CDR2 및 서열 15의 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    (i) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
    (ii) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
    (iii) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체; 및
    (iv) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 단리된 항체.
  9. 제8항에 있어서, 그의 항원-결합 단편이 Fab 또는 (Fab')2인 단리된 항체.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 쇄 항체인 단리된 항체.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체 또는 인간 항체인 단리된 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 및 담체를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물인 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 및 또 다른 항암제 또는 질환 조절 항류마티스 약물 (DMARD)을 포함하는 조합물.
  15. 제14항에 있어서, 항암제가 도세탁셀, 옥살리플라틴 및 겜시타빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조합물.
  16. 제14항에 있어서, DMARD가 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 A 및 술파살라진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조합물.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 항체.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, IL6과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, IL6과 연관된 질환이 염증성 장애; 임의로는 류마티스 관절염, 크론병, 캐슬맨병, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자기면역 질환; 혈관신생; 다발성 골수종, 백혈병, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 구강암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택되는 암; 종양 전이; 및 암-관련 악액질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  20. 제18항에 있어서, IL6과 연관된 질환이 암인 제약 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 또 다른 항암제와 동시사용되는 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 항암제가 옥살리플라틴, 겜시타빈 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  23. 제18항에 있어서, IL6과 연관된 질환이 자기면역 질환인 제약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 자기면역 질환이 RA인 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 1종 이상의 질환 조절 항류마티스 약물 (DMARD)과 동시사용되는 제약 조성물.
  26. 제25항에 있어서, DMARD가 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 A 및 술파살라진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  27. IL6과 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, IL6과 연관된 질환을 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, IL6과 연관된 질환이 염증성 장애, 자기면역 질환, 혈관신생 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, IL6과 연관된 질환이 다발성 골수종, 백혈병, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 구강암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 항체의 양이 종양 전이 또는 암-관련 악액질의 감소에 유효한 것인 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 대상체에게 또 다른 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 다른 항암제가 옥살리플라틴, 겜시타빈 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, IL6과 연관된 질환이 류마티스 관절염 (RA), 크론병, 캐슬맨병, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 자기면역 질환인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 대상체에게 1종 이상의 질환 조절 항류마티스 약물 (DMARD)을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, DMARD가 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린 A 및 술파살라진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. IL6과 연관된 질환 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  37. 항체 중쇄 가변 영역 (VH), 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 또는 둘 다를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 제시된 것인 핵산.
  38. 제37항의 핵산을 포함하는 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  40. 제37항의 핵산 또는 제38항 또는 제39항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  41. 제40항의 숙주 세포를 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL6에 결합하는 항체를 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 항체를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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EP2722341B1 (en) 2012-10-22 2017-12-06 Fountain Biopharma Inc. Antibodies to interleukin-6 and uses thereof
CN105198982B (zh) * 2014-06-18 2019-07-26 上海交通大学 基于il-6的抗原表位及其应用
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
WO2017117464A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
CN109867723B (zh) * 2017-12-05 2022-06-17 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗人il6单克隆抗体及其制备方法和用途
US12071476B2 (en) * 2018-03-02 2024-08-27 Kodiak Sciences Inc. IL-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CN109517064B (zh) * 2018-10-10 2020-05-08 北京汇智和源生物技术有限公司 白介素-6的人源化单克隆抗体、其编码基因及应用
JP2022553640A (ja) 2019-10-10 2022-12-26 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド 眼障害を処置する方法
WO2023042314A1 (ja) * 2021-09-15 2023-03-23 和幸 吉崎 免疫異常性炎症性疾患を治療または予防するための組成物
WO2023042209A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of myeloid malignancies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080017014A (ko) * 2005-04-29 2008-02-25 센토코 인코포레이티드 항-ｉｌ-6 항체, 조성물, 방법 및 용도
KR20110031152A (ko) * 2008-06-18 2011-03-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｉｌ-６에 대한 항체 및 그의 용도
KR20110094307A (ko) * 2008-11-13 2011-08-23 펨타 파마슈티컬스, 인크. 인간화된 항-ｉｌ-6 항체

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
JP2007528691A (ja) * 2001-11-14 2007-10-18 セントカー・インコーポレーテツド 抗ｉｌ−６抗体、組成物、方法および使用
US7482436B2 (en) * 2002-08-30 2009-01-27 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Human antihuman interleukin-6 antibody and fragment of antibody
KR101339628B1 (ko) 2005-05-09 2013-12-09 메다렉스, 인코포레이티드 예정 사멸 인자 1(ｐｄ-1)에 대한 인간 모노클로날 항체, 및 항-ｐｄ-1 항체를 단독 사용하거나 기타 면역 요법제와 병용한 암 치료 방법
EP2336181A1 (en) * 2005-12-09 2011-06-22 UCB Pharma, S.A. Antibody molecules having specificity for human IL-6
CN101563365B (zh) 2006-08-03 2012-10-31 瓦西尼斯公司 抗-il-6单克隆抗体及其用途
TW200831528A (en) 2006-11-30 2008-08-01 Astrazeneca Ab Compounds
EP2367570B1 (en) * 2008-11-25 2017-12-20 AlderBio Holdings LLC Antibodies to il-6 and use thereof
AU2010208125B2 (en) * 2009-01-29 2015-02-12 Medimmune, Llc Human anti-IL-6 antibodies with extended in vivo half-life and their use in treatment of oncology, autoimmune diseases and inflammatory diseases
WO2011079308A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Emergent Product Development Seattle, Llc Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof
JP4934207B2 (ja) * 2010-01-28 2012-05-16 セントカー・インコーポレーテツド 抗ｉｌ−６抗体、組成物、方法および使用
ES2899186T3 (es) 2010-12-31 2022-03-10 Bioatla Inc Humanización rápida de anticuerpos
EP2722341B1 (en) 2012-10-22 2017-12-06 Fountain Biopharma Inc. Antibodies to interleukin-6 and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080017014A (ko) * 2005-04-29 2008-02-25 센토코 인코포레이티드 항-ｉｌ-6 항체, 조성물, 방법 및 용도
KR20110031152A (ko) * 2008-06-18 2011-03-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｉｌ-６에 대한 항체 및 그의 용도
KR20110094307A (ko) * 2008-11-13 2011-08-23 펨타 파마슈티컬스, 인크. 인간화된 항-ｉｌ-6 항체

Also Published As

Publication number Publication date
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IL238366A0 (en) 2015-06-30
TW201429988A (zh) 2014-08-01
US9758580B2 (en) 2017-09-12
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AU2013335004A1 (en) 2015-05-14
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