TW201429988A - 介白素－６抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示提供了結合至人類介白素-6(IL6)的抗體。該抗體可以調節IL6訊息傳遞，從而使用於治療或預防IL6相關的疾病或失調，特別是炎症性失調、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、血管新生以及癌症。

Description

介白素-6抗體及其用途 【相關申請案】
本專利申請案根據35 U.S.C.§119主張於2012年10月22日提出申請的美國臨時專利申請案序號第61/716,802號的優先權權益，該申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
本發明是有關介白素-6之抗體及其用途。
人類介白素-6(IL6)是一種具有184個胺基酸的分泌型醣蛋白(21kDa)，其具有四螺旋束狀結構。IL-6是一種經由與兩種不同的受體蛋白質(IL6受體(IL6R)和醣蛋白130(gp130))結合而作用於各種細胞類型的多功能細胞介素，該等細胞類型例如B細胞、T細胞、纖維母細胞、肝細胞、破骨細胞、神經細胞、腎小球環間膜細胞、表皮角質細胞以及造血祖細胞。IL6/IL6R/gp130複合體的形成轉換了細胞內的訊息傳遞途徑，該訊息傳遞途徑包括那些由(1)磷脂醯肌醇-3'-激酶(PI3K)、(2)有絲分裂誘致劑活化蛋白激酶(MAK)以及(3)詹納斯氏酪胺酸激酶(Janus tyrosine kinase，JAK)-訊息傳遞者和轉錄活化劑1和3(STT1和STAT3)所調介者。
IL-6可發揮作為免疫調節劑、細胞生長因子、骨代謝調節劑、細胞分化因子以及對抗一些效應劑細胞的急性期蛋白誘導劑的功能。 在肝臟中，IL6誘導各種急性期蛋白，例如血清類澱粉蛋白A(SAA)、C-反應性蛋白(CRP)、鐵調節素、纖維蛋白原以及結合球蛋白抗胰凝乳蛋白酶。IL-6對於各種疾病的病理意義已在眾多的研究中被指出，該等疾病包括慢性炎症疾病、自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎、克羅恩氏症(Crohn’s disease)、巨大淋巴結增生(Castleman’s disease)及牛皮癬)、癌症(例如多發性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、前列腺癌及各種癌症)以及惡病質和冠狀動脈心臟疾病。
因此，開發新的IL6拮抗劑以用於治療與IL6訊息傳遞相關的疾病具有極大的利益。
本揭示係基於鑑定一些示例性的抗IL6抗體，例如1-4-62、Ag1-4-6(也被稱為FB704)或HAg1T-3-10，其出乎意料地顯示出對人類IL6的高結合親和力和特異性，以及在抑制IL-6誘導的細胞增生(例如癌細胞的增生)和細胞介素產生(例如炎症性細胞介素產生)、血管新生、癌症引起的惡病質及癌轉移上的優越活性。這樣的抗體也顯著增強了其它化療試劑例如奧沙利鉑(oxaliplatin)、吉西他濱(gemcitabine)及多西他賽(docetaxel)的抗癌效果。
因此，本揭示之一方面係關於結合至人類介白素6(IL-6)的分離抗體，包含：(a)重鏈變異區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、SEQ ID NO：4之重鏈互補決定區2(HC CDR2)以及SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：16之重鏈互補決定區3(HC CDR3)；或 (b)輕鏈變異區(VL)，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、SEQ ID NO：11之輕鏈互補決定區2(LC CDR2)以及SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15之輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
在一些具體實施例中，該分離的抗IL6抗體包含(i)包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：6之HC CDR3的VH；或(ii)包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：16之HC CDR3的VH。在一實例中，該抗體包含包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18之胺基酸序列的VH。
在其他的具體實施例中，該分離的抗IL6抗體進一步包含(i)包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：13之LC CDR3的VL；或(ii)包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：15之LC CDR3的VL。在一實例中，該抗體進一步包含包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20之胺基酸序列的VL。
本文所述的抗IL6抗體之實例包括但不限於：(i)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：6之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：13之CDR3；(ii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：16之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：13之CDR3；(iii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：6之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9 之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：15之CDR3；(iv)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：16之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：15之CDR3；(v)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；(vi)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(vii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；以及(viii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
本文中描述的任何抗IL6抗體可以是全長抗體或其抗原結合片段，該抗原結合片段可以是Fab或(Fab’)2。或者，該抗IL6抗體可以是單鏈抗體、人源化抗體或人類抗體。
在另一個方面，本揭示提供一種包含核苷酸序列的核酸，該核苷酸序列編碼抗體重鏈變異區(VH)、抗體輕鏈變異區(VL)或兩者，其中該VH和該VL如本文所述。
在另一個方面，本揭示提供一種載體(例如表現載體)，該載體包含本文所描述的任何核酸以及含有這種載體的宿主細胞。
在又另一個方面，本揭示提供一種用於生產結合至人類IL-6的抗體之方法，包含：(i)在允許抗體表現的條件下培養申請專利範圍第40 項所述的宿主細胞，以及視情況(ii)獲取抗體。
本揭示的另一個方面係關於組合物(例如醫藥組合物)，該組合物包含(a)本文所描述的任何抗IL6抗體、本文所描述的任何核酸或本文所描述的任何載體；以及(b)載劑，例如醫藥上可接受的載劑。
在一些具體實施例中，本文所描述的任何組合物還包含另一種抗癌試劑或疾病修飾抗風濕藥物(disease modifying antirheumatic drug，DMARD)。抗癌試劑的實例包括但不限於多西他賽(docetaxel)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及吉西他濱(gemcitabine)。DMARDs的實例包括但不限於甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯奎寧羥氯奎寧(chloroquine hydroxychloroquine)、環孢靈(cyclosporin A)以及磺胺塞拉金(sulfasalazine)。
在又另一個方面，本揭示提供一種用於治療IL6相關疾病的方法，包含投予治療有效量的本文所述任何抗IL6抗體或任何編碼這種抗IL6抗體的核酸至需要治療IL6相關疾病的個體。IL6相關疾病之實例包括但不限於炎症性失調、自體免疫疾病、血管新生及癌症。
在一些具體實施例中，IL-6相關疾病為癌症，其可以是多發性骨髓瘤、白血病、乳癌，胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌。在一些實例中，抗體的量或編碼的核酸在減少腫瘤轉移或癌症相關的惡病質上是有效的。在其他的實例中，該方法進一步包含投予該個體另一種抗癌試劑，例如奧沙利鉑、吉西他濱或多西他賽。
在其他的具體實施例中，該IL6相關疾病為自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏症、巨大淋巴結增生、多發性硬化症、 關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎或牛皮癬。在一些實例中，本文中描述的方法進一步包含向個體投予一或多個疾病改善抗風濕藥物(DRAMD)，例如甲氨喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯喹(chloroquine)、羥氯喹、環孢素A、柳氮塞拉金(sulfasalazine)。
同樣在本揭示之範圍內的是用於治療IL-6相關疾病的醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含(a)任何的抗IL6抗體或任何本文所描述的核酸/載體；(b)醫藥上可接受的載劑；以及視情況(c)抗癌試劑或本文所述的那些DMARD。IL-6相關的示例性疾病包括但不限於炎症性失調、自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏症、巨大淋巴結增生、多發性硬化症、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎及牛皮癬)、血管新生、癌症(例如多個多發性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉移、癌症相關的惡病質。
另外，本揭示提供任何的抗IL6抗體或任何的在藥劑中編碼核酸的用途，或如本文所述用於製造治療IL-6相關疾病或病症的藥劑。
在下面的描述中提出本發明中一或多個具體實施例之細節。從以下幾個具體實施例的圖示和實施方式以及所附的申請專利範圍，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。
圖1為圖示高親和力抗IL6抗體對細胞訊息傳遞途徑和增生的功效之圖。(A)磷酸化STAT3訊息傳遞被抗IL6抗體Ag1-4-6和HAgT1-3-10以劑量依賴的方式減少。(B)抗IL6抗體Ag1-4-6和HAgT1-3-10抑制STAT3訊息傳遞的程度遠大於對照抗體Actemra。(C)抗IL6抗體1-4-62、Ag1-4-6 及HAg1T-3-10以劑量依賴的方式抑制B9細胞增生且IC50分別為0.618、0.0468及0.00456μg/ml。
圖2為圖示抗IL6抗體抑制人臍靜脈內皮(HUVEC)細胞中趨化素生產之圖。使用IL6、sIL6R、IL6和sIL6R或IL6、sIL6R和指示的抗IL6抗體之組合培養HUVEC24小時。以ELISA量測培養上清液中的MCP-1和sICAM-1。(A)IL6+ sIL6R誘導MCP-1的分泌被抗IL6抗體Ag1-4-6和Hag1T-3-10抑制。(B)抗體Ag1-4-6和Hag1T-3-10抑制sICAM-1生產的程度大於Actemra。
圖3為圖示本文所述示例性抗IL6抗體之結合特異性的圖。
圖4為圖示抗體Ag1-4-6(FB704)體內抑制血管新生的圖。將hIL6重組蛋白加入基質膠並注入小鼠背側的兩個位點上。經由靜脈注射抗體或預混合物來治療小鼠。(A)在治療6天後觀察FB704抑制IL6誘導的血管新生。(B)用抗體FB704治療明顯改變了血紅蛋白的濃度。
圖5為圖示抗體FB704抑制人類前列腺癌細胞PC-3誘導的惡病質和轉移之圖。腫瘤注射之後，在第31天量測小鼠的體重。(A)PBS治療的小鼠體重下降了約19%。與此相反，高劑量FB704和Actemra治療的組保持穩定並且表現出顯著的差異(P<0.01)。(B)FB704(n=15；P=0.00001)和Actemra(n=12；P=0.024)明顯地延長了PC3腫瘤小鼠的無症狀存活期。FB704表示出比Actemra(P=0.03)明顯更佳的療效。(C)PBS治療組之總解剖顯示肝臟有嚴重的腫大和腫瘤細胞浸潤。然而，FB704治療組表現出中度的腫瘤細胞浸潤，並且在肝臟的左葉和中葉有近50%的正常肝細胞。(D)免疫組織化學顯示以FB704治療腫瘤切片後血管密度降低。(E)CD31染 色的半定量分析顯示，FB704治療後明顯減少(P<0.05)。(F)FB704加上化療藥物多西他賽的結合治療提供了更佳的總體存活率。
圖6為圖示抗體FB704增強奧沙利鉑或吉西他濱對胰臟癌移植瘤的抗腫瘤活性之圖。(A)每週兩次用20mg/kg的FB704治療BxPC-3腫瘤小鼠加上每週一次的奧沙利鉑(3mg/kg)產生統計學上49%的顯著腫瘤生長抑制(P<0.01)。(B)小鼠的體重在治療過程中正常增加了。(C和D)實驗之後量測個別的腫瘤塊，而且治療之後腫瘤的重量明顯減少。(E)在不同治療的腫瘤切片上顯示出腫瘤細胞增生標記物Ki-67。(F)PBS、奧沙利鉑、FB704及FB704加上奧沙利鉑治療組的Ki-67陽性細胞率分別顯示為26%、14%、16%及7.5%。(G)以每週兩次20mg/kg的FB704加上吉西他濱(80mg/kg)治療BxPC-3腫瘤小鼠產生統計學上60%的明顯腫瘤生長抑制(P<0.01)。
圖7為圖示本文所述的示例性抗IL6抗體對U937和人類PBMC細胞抑制MCP-1產生之圖。(A)用IL6培養U937細胞並以抗體治療24小時。以ELISA套件量測MCP-1。我們的抗體表現出劑量依賴的MCP-1生產抑制(n=3)。(B)用IL6培養PBMC細胞並以抗體治療24小時。藉由ELISA量測MCP-1。我們的抗體表現出劑量依賴的MCP-1生產抑制(n=5)。
圖8為圖示以本文所述示例性抗IL6抗體抑制RA-FLS之MCP-1產生的圖。(A)商業用RA-FLS細胞及(B)用IL6加上sIL6R在抗體存在或不存在下培養RA患者的FLS細胞24小時。我們的抗體表現出劑量依賴的MCP-1生產抑制(n=6)。
圖9為圖示以本文所述示例性抗IL6抗體抑制RA-FLS之VEGF產生的圖。(A)商業用RA-FLS細胞及(B)用IL6、sIL6R及IL1β培養RA患者的FLS 細胞並用抗體治療24小時。我們的抗體表現出劑量依賴的VEGF生產抑制(n=6)。
本揭示係關於結合人類介白素-6(IL6)的抗體(該抗體可以中和IL6的活性)以及該抗體在調節IL6調介的訊息傳遞途徑的用途。本文所述的抗IL6抗體可用於治療IL6相關的疾病或失調，例如炎症性失調、自體免疫疾病、血管新生、癌症、腫瘤轉移及癌症相關的惡病質。
以下的描述只是為了說明本發明的各種具體實施例。因此，本文所討論的特定具體實施例不應被解讀為限制本發明的範圍。對於本技術領域中具有通常知識者而言，顯而易見的是可以在不脫離本發明之範圍下作出各種改變或等同。
一般技術
除非另有指明，否則本發明之實施將採用傳統的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學技術，該等技術係在技術領域之技藝內。該等技術已在文獻中有完整的解釋，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press ; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press ; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987) ; Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press ; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons ; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) ; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987) ; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987) ; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994) ; Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997) ; Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989) ; Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) ; Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。
定義
為了提供對本揭示明確的和立即的瞭解，首先定義若干用詞。其他的定義載於實施方式各處。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學用詞具有的涵義與在相關技術領域中具有通常知識者通常瞭解的相同。
本文所使用的冠詞「一」(a、an)是指一個或一個以上的(即至少一個)文章之語法對象。藉由舉例的方式，「一元素」意指一個元素或一個以上的元素。
本文所使用的「多胜肽」乙詞是指由胜肽鍵連接的胺基酸殘基所組成的聚合物。「蛋白質」乙詞通常是指相對大的多胜肽。「胜肽」乙詞通常是指相對短的多胜肽(例如含有至多100個、80個、60個、50個、30個或20個胺基酸殘基)。
抗體(可與複數形互換使用)是能夠經由至少一個位在免疫球蛋白分子之變異區中的抗原識別位點特異性結合到標靶的免疫球蛋白分子，該標靶例如碳水化合物、多聚核苷酸、脂質、多胜肽等。本文所使用的「抗體」乙詞不僅含括完整的(即全長的)多株或單株抗體，而且還含括其抗原結合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其變異體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及任何其他包含所需特異性的抗原識別位點之免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗體的醣基化變體、抗體的胺基酸序列變體及共價修飾的抗體。
完整或全長的抗體包含兩個重鏈和兩個輕鏈。每個重鏈含有重鏈變異區(VH)和第一、第二及第三恆定區(CH1、CH2及CH3)。每個輕鏈含有輕鏈變異區(VL)和恆定區(CL)。全長的抗體可以是任何種類的抗體，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述之子類)，而且該抗體不需要屬於任何特定的類別。取決於重鏈之恆定域的抗體胺基酸序列，可以將免疫球蛋白指定為不同的類別。免疫球蛋白有五種主要的類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且這些類別中有幾個可以再被進一步區分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同免疫球蛋白類別的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ、以及μ。不同類別的免疫球蛋白之 子單元結構和三維架構皆為眾所周知的。
「抗原結合域」或「抗原結合片段」乙詞是指負責抗原結合的完整抗體分子之一部分或區域。抗原結合域可以包含重鏈變異區(VH)、輕鏈變異區(VL)或上述兩者。VH和VL中的每個典型地含有三個互補決定區CDR1、CDR2及CDR3。在VH或VL中的三個CDR係由框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)遞送。
抗原結合片段的實例包括但不限於：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL鏈和VH-CH1鏈的單價片段；(2)F(ab')2片段，其可以是具有兩個Fab片段的二價片段，該兩個Fab片段由鉸鏈區的二硫橋(即Fab的二聚物)連接；(3)具有抗體之單臂的VL和VH域的Fv片段；(4)單鏈Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域經由胜肽連接子組成的單一多胜肽鏈；以及(5)(scFv)2，其可以包含兩個由胜肽連接子連接的VH域和兩個VL域，該兩個VL域係經由二硫橋與該兩個VH域組合。
「人類抗體」乙詞是指所具有的變異和恆定區大致上對應於(或衍生自)取自人類個體的抗體之抗體，例如由人類生殖免疫球蛋白序列或其變體所編碼者。本文所描述的人類抗體可以包括一或多個非由人類生殖免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如由體外或體內體細胞突變的隨機或位點特異性誘變引入的突變)。這樣的突變可以存在於一或多個CDR或一或多個FR中。在一些實例中，人類抗體可以具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多的位置被不是由人類生殖免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基取代。
「分離的」物質意指其已藉由人力從自然狀態改變了。假使 「分離的」物質出現在本質上，則其已被從其原始環境改變或移除，或兩者兼而有之。舉例來說，天然存在於活的個體的多胜肽不是「分離的」，但假使該多胜肽已被實質地從其天然狀態的共存材料中分開並存在於實質上純的狀態，則該多胜肽為分離的。
「特異性結合」或「特異地結合」乙詞是指兩個分子之間的非隨機結合反應，例如抗體至抗原表位的結合。「特異地結合」至標靶或表位的抗體為本技術領域中眾所瞭解的詞語，並且決定這種特異性結合的方法也是本技術領域中眾所周知的。假使分子與特定標靶抗原或表位的反應或結合比與替代標靶/表位的反應或結合更頻繁、更迅速、並且具有更長的持續時間及/或更大的親和力，則可說該分子表現出「特異性結合」。假使抗體結合至標靶抗原比結合至其他物質具有更大的親和力、結合性、更快速及/或具有更長的持續時間，則該抗體係「特異地結合」至標靶抗原。舉例來說，特異地(或優先地)結合至IgE表位的抗體為結合此IgE表位比結合至其他IgE表位或非-IgE表位具有更大的親和力、結合性、更快速及/或具有更長的持續時間的抗體。藉由閱讀此定義還應瞭解的是，例如特異地結合至第一標靶抗原的抗體可能會或可能不會特異地或優先地結合至第二標靶抗原。因此，「特異性結合」或「優先的結合」並不一定需要(雖然可以包括)排除性的結合。一般來說(但未必如此)，提及結合意指優先的結合。
本文中「個體」、「個人」及「患者」等詞可互換使用，並且是指被評估治療及/或正在接受治療的哺乳動物。個體可以是人，但也包括其他的哺乳動物，特別是可用作人類疾病實驗模型的那些哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔子，狗等。
「治療」乙詞是指動作、施加或療法，其中個體(包括人類)以改善個體情況的目的直接地或間接地接收醫療救助。具體而言，該詞是指減少發病率、或減輕症狀、消除復發、防止復發、防止發病、改善症狀、改善預後或在一些具體實施例中為上述之組合。熟悉本技藝者會明白的是，治療並不一定導致症狀完全不存在或去除。舉例來說，相對於癌症，「治療」可以指減緩腫瘤或惡性細胞生長、增生、或轉移、防止或延緩腫瘤或惡性細胞生長、增生或轉移的發展、或上述之某些組合。
如本文中所使用的，與藥劑的投予相關的「有效量」或「有效劑量」或「治療有效量」是指與未接收此量的對應個體相比，藥物或藥劑的量產生意圖的藥理結果、或治療、治癒、預防或改善疾病、失調或副作用的效果、或降低疾病或失調的進展速率。藥劑的有效量或劑量可能取決於採用的特定活性成分、投予的模式以及待治療個體的年齡、大小及狀況。藥劑的精確量需要取決於行醫者的判斷來投予並且是每個個體特有的。
「IL6相關的疾病或病症」是指其中IL6在導致該疾病或病症的訊息傳遞途徑中扮演調節的角色的任何疾病或病症。IL6是經由受體複合物啟動細胞反應的細胞介素家族之成員，該受體複合物係由訊息傳遞醣蛋白gp130和IL6受體(IL6R)之至少一子單元所組成。IL6結合至IL6R，然後二聚化gp130而觸發gp130之酪胺酸殘基的磷酸化。至少有三個主要的訊息傳遞途徑涉及IL6/IL6R/gp130複合物的形成：(1)磷脂醯肌醇-3'-激酶(PI3K)，(2)分裂素活化蛋白激酶(MAK)，以及(3)詹納斯氏酪胺酸激酶(JAK)訊息傳遞者和轉錄活化劑1和3(STAT1和STAT3)路徑。據信IL6在範圍廣泛的疾病或失調之發展中發揮作用，該等疾病或失調包括但不 限於炎症、自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏症、巨大淋巴結增生、多發性硬化症、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎和牛皮癬)、血管新生、癌症(例如多發性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉移，癌症相關的惡病質。
本文所使用的「類風濕性關節炎」是指一種類型的自體免疫疾病，其特徵為全身性的滑動關節發炎。此疾病的早期症狀是關節疼痛，進而演變成關節變形或損害身體器官，例如血管、心臟、肺、皮膚及肌肉。
本文所使用的「血管新生」一般是指形成新血管的基本過程。血管新生可以在組織生長的期間作為正常的生理過程發生，該組織生長例如肌肉增加、傷口修復和懷孕，但血管新生也會與血管生長不利病人健康的疾病狀況相關，例如癌症和糖尿病性視網膜病變。
本文所使用的「癌症」乙詞是指由腫瘤或惡性細胞群、增生或轉移調介的醫療狀況，包括實質癌和非實質癌。癌症的實例包括但不限於肺癌、腎癌、胃癌、乳癌、腦癌、前列腺癌、肝癌、胰臟癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、頭頸部癌、大腸癌、白血病、淋巴瘤及骨髓瘤。
「惡病質」乙詞是指一般健康狀況不佳和營養不良的狀態。其通常與惡性癌症相關並由惡性癌症所引起，而且特徵是嚴重的食慾不振、體重劇烈下降(尤其是精瘦的體重)及肌肉萎縮。
高親和力抗IL6抗體
本揭示是基於識別數種高親和力的抗IL6抗體，包括1-4-62、Ag1-4-6(亦習知為FB704)以及HAg1T-3-10。這些抗IL6抗體被發 現可以高結合親和力(例如具有小於10-8M的KD值，較佳為小於10-9M)和高特異性結合至人類IL-6，例如以與人類IL6相比遠較低的結合親合性結合至其他的IL6家族細胞介素，如圖3所圖示者。此外，這些抗體被發現可明顯地減少IL-6誘導的細胞增生和STAT3磷酸化、血管新生及血紅蛋白產生。此外，這些抗IL6抗體成功地抑制癌症引起的(例如前列腺癌引起的)惡病質、胰臟癌生長及癌症轉移，例如前列腺癌轉移；明顯地增強其它化療試劑的抗癌效用，其它化療試劑例如奧沙利鉑、吉西他濱和多西他賽；以及減少由HUVEC和PBMC細胞及/或滑液膜纖維母細胞產生的炎性細胞介素(例如MCP-1和sICAM)及/或VEGF，例如從RA患者取得者。
因此，本文所描述的是能夠結合(例如特異性結合至)人類IL6的高親和力抗體，包括1-4-62、Ag1-4-6和HAg1T-3-10及上述之功能性變體。將每個1-4-62、Ag1-4-6和HAg1T-3-10之重鏈變異區(VH)和輕鏈變異區(VL)的胺基酸序列顯示於下表1。這三個抗體中任何抗體的功能性變體所包含的VH鏈可以包含至少85%(例如90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)與1-4-62、Ag1-4-6或HAg1T-3-10(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18)的VH相同的胺基酸序列、所包含的VL鏈可以具有至少85%(例如90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)與1-4-62、Ag1-4-6或HAg1T-3-10(SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20)的VL相同的胺基酸序列或上述兩者皆有之。這些變體能夠結合至人類IL6。在一些實例中，相對於上述的參考抗體，該等變體具有相似的抗原結合親和力(例如Kd小於1×10-8M，較佳為小於1×10-9或1×10-10M)。
結合親和力係由ka(結合速率常數)、kd(解離速率常數) 或KD(平衡解離)等詞所定義。典型地，當相對於抗體使用時，特異地結合是指抗體特異地結合至(「識別」)其標靶的親和力(KD)值小於10-8M，例如小於10-9M或10-10M。較低的KD值表示較高的結合親和力(即較強的結合)，如此10-9的KD值表示的結合親和力比10-8的KD值更高。
兩個胺基酸序列的「識別百分比」係使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68,1990的演算法來決定，並如Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77,1993中所修正。這樣的演算法被併入Altschul等人在J.MolBiol.215：403-10,1990發表的NBLAST和XBLAST程式(版本2.0)。BLAST蛋白質研究可以使用XBLAST程式、得分=50、字長=3來進行，以獲得與感興趣的蛋白質分子同源的胺基酸序列。在兩個序列之間存在間隙之處可以使用Gapped BLAST，如Altschul等人在Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402,1997中所述。當使用BLAST和Gapped BLAST程式時，可以使用各個程式(例如XBLAST和NBLAST)的系統預設參數。
結合至相同表位的抗體如1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10也在本揭示之範圍內。
在一些具體實施例中，抗IL6抗體包含的重鏈變異區(VH)包含MHIDDSNGYXSDAF(SEQ ID NO：21)的HC CDR3，其中X為芳香胺基酸殘基，例如F、Y、H或W。在一些實例中，該HC CDR3為SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：16。這樣的抗體的VH鏈可以進一步包含SEQ ID NO：2的HC CDR1、SEQ ID NO：2的HC CDR2或上述兩者。
替代地或附加地，該抗IL6抗體包含的輕鏈變異區(VL)包 含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的LC CDR3。這樣的抗體的VL鏈可以進一步包含SEQ ID NO：9的LC CDR1、SEQ ID NO：11的LC CDR2或上述兩者。
在一些具體實施例中，本文所述的抗IL6抗體包含與抗體1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10相同的重鏈和輕CDR，如下表1所示。在一些實例中，這些抗體包含與1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10相同的VH和VL鏈。該VH和VL鏈可以分別與重鏈CH1和CL融合而形成Fab、Fab’或F(ab')2片段。或者，該VH和VL鏈可以與重鏈恆定區(例如人類IgG恆定鏈)和輕鏈恆定區(κ鏈)融合而形成全長抗體。在其他的實例中，該VH和VL鏈可以直接或經由連接子被融合而形成單鏈抗體。
在其他的具體實施例中，與抗體1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10中的相比，本文所述的功能性變體可以在該VH、該VL或兩者的FR中含有一或多個突變(例如保守性取代)。較佳地，這樣的突變不會發生在預期會與一或多個CDR相互作用的殘基上。如本技術領域中習知的，FR區內的突變不太可能會影響抗體的抗原結合活性。在一些實例中，在抗體1-4-62、Ag1-4-6和HAg1T-3-10的一或多個CDR區中的變化是非實質性的，即大致上與參考序列相同。
「非實質性」或「大致上相同的」乙詞是指變體的相關胺基酸序列(例如在FR、CDR、VH或VL域中)與參考的抗體相比非實質性地不同(例如包括保守的胺基酸取代)，使得該變體相對於參考抗體具有大致上相似的結合活性(例如親和力、特異性或上述兩者)和生物活性。這樣的變體可以包括少數的胺基酸變化，例如在指定區的5胺基酸序列中的1或2個取代。一般來說，與CDR區相反的是，在FR區可以進行更多的取代，只要 該等取代不會對抗體的結合功能產生不利的影響(例如與原始的抗體相比減少超過50%的結合親和力)。在一些具體實施例中，序列同一性可以在原始的和經修飾的抗體之間為約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在一些具體實施例中，修飾後的抗體具有相同的結合特異性，並且具有至少50%原始抗體的親和力。在一些實例中，在抗體1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10之該VH、該VL或上述兩者的一或多個CDR區中，該變體包括多達5個胺基酸取代，例如保守性取代(例如1、2、3、4或5)。
保守性取代會產生功能和化學特性與進行這些修飾的分子相似的分子。例如，「保守性胺基酸取代」可能涉及天然胺基酸殘基與其他殘基的取代，使得對該位置上的胺基酸殘基的極性或電荷有很少或沒有影響。所需的胺基酸取代(不論是保守性的或非保守性的)可以由本技術領域中具有通常知識者決定。舉例來說，可以使用胺基酸取代來確認重要分子序列中的殘基，或提高或降低本文所述的分子之親合性。包含一或多個保守性胺基酸取代的變體可以根據本技術領域中具有通常知識者習知的改變多胜肽序列的方法來製備，例如在匯編這種方法的參考文獻中找到的，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,New York。保守性胺基酸取代包括在以下群組內的胺基酸之間進行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。
本揭示還提供了具有改良的抗體生物性質(例如更高的結合 親和力)的抗體變體。可以藉由將適當的核苷酸變化引入抗體的核酸中或經由胜肽合成來製備該抗體之胺基酸序列變體。這樣的修飾包括例如從該抗體的胺基酸序列內的殘基去除、及/或插入及/或取代該抗體的胺基酸序列內的殘基。進行去除、插入及取代的任何組合，以實現最終的構築體，其前提是最終的構築體具有所需的特性。編碼該抗體的胺基酸序列變體的核酸分子可以藉由本技術領域中習知的各種方法來製備。這些方法包括但不限於寡核苷酸調介的(或位點定向的)誘變、PCR誘變以及抗體的早期製備變體或非變體(天然的)形式的盒式誘變。在一個具體實施例中，本發明的抗IL6抗體之平衡解離常數(KD)值小於10-8M，特別是小於10-9M或10-10M。可以使用本技術領域中習知的技術測定結合親和力，例如ELISA或生物特異性相互作用分析、或本技術領域中習知的其他技術。
本文所述的示例性抗IL6抗體包括但不限於：(i)抗體，包含(a)VH，該VH包含HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，該HC CDR1包含SEQ ID NO：2中提出的胺基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO：4中提出的胺基酸序列，該HC CDR3包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：16中提出的胺基酸序列；或(b)VL，該VL包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，該LC CDR1包含SEQ ID NO：9中提出的胺基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO：11中提出的胺基酸序列，以及該LC CDR3包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15中提出的胺基酸序列；(ii)包含VH的抗體，該VH包含HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，該HC CDR1包含SEQ ID NO：2中提出的胺基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO：4中提出的胺基酸序列，該HC CDR3包含SEQ ID NO：6中提出的胺基 酸序列；(iii)包含VL的抗體，該VL包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，該LC CDR1包含SEQ ID NO：9中提出的胺基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO：11中提出的胺基酸序列，以及該LC CDR3包含SEQ ID NO：13中提出的胺基酸序列；(iv)抗體，包含(a)VH，該VH包含HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，該HC CDR1包含SEQ ID NO：2，該HC CDR2包含SEQ ID NO：4中提出的胺基酸序列，該HC CDR3包含SEQ ID NO：6中提出的胺基酸序列；或(b)VL，該VL包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，該LC CDR1包含SEQ ID NO：9中提出的胺基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO：11中提出的胺基酸序列，該LC CDR3包含SEQ ID NO：13中提出的胺基酸序列；(v)包含VL的抗體，該VL包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，該LC CDR1包含SEQ ID NO：9中提出的胺基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO：11中提出的胺基酸序列，以及該LC CDR3包含SEQ ID NO：15中提出的胺基酸序列；(vi)抗體，包含(a)VH，該VH包含HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，該HC CDR1包含SEQ ID NO：2中提出的胺基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO：4中提出的胺基酸序列，該HC CDR3包含SEQ ID NO：6中提出的胺基酸序列；或(b)VL，該VL包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，該LC CDR1包含SEQ ID NO：9中提出的胺基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO：11中提出的胺基酸序列，該LC CDR3包含SEQ ID NO：15中提出的胺基酸序列；(vii)包含VH的抗體，該VH包含HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3， 該HC CDR1包含SEQ ID NO：2中提出的胺基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO：4中提出的胺基酸序列，該HC CDR3包含SEQ ID NO：16中提出的胺基酸序列；(viii)包含VH的抗體，該VH包含(a)HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，該HC CDR1包含SEQ ID NO：2中提出的胺基酸序列，該HC CDR2包含SEQ ID NO：4中提出的胺基酸序列，該HC CDR3包含SEQ ID NO：16中提出的胺基酸序列；及(b)VL，該VL包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，該LC CDR1包含SEQ ID NO：9中提出的胺基酸序列，該LC CDR2包含SEQ ID NO：11中提出的胺基酸序列，該LC CDR3包含SEQ ID NO：15中提出的胺基酸序列。
可以按照例行方法，例如在以下的實例中描述的那些方法檢查本文所描述的任何抗IL6抗體，以決定它們的性質，例如抗原結合活性、抗原結合特異性及生物功能。
可以將本文所描述的任何抗IL6抗體修飾為含有額外的本技術領域中習知的且容易獲得的非蛋白質部分，例如藉由聚乙二醇化、高度醣基化及其類似物。可以提高血清半衰期的修飾是令人感興趣的。
本文還揭示了編碼本文所述的任何抗IL6抗體之核酸、諸如包含這些核酸的表現載體之載體、以及包含該等載體的宿主細胞。在一個實例中，編碼序列(例如編碼VH和VL、VH-CH1及VL-CL或全長重鏈和全長輕鏈的序列)的重鏈和輕鏈被包括在一個表現載體中。在另一個實例中，抗體的每個重鏈和輕鏈被選殖到單獨的載體中。在後者的情況下，編碼重鏈和輕鏈的表現載體可以被共同轉染到一個宿主細胞中用於表現兩個鏈， 該二鏈可以在體內或在體外進行組裝，以形成完整的抗體。或者，編碼重鏈和編碼輕鏈的表現載體可以被引入不同的宿主細胞中用於表現每個重鏈和輕鏈，然後該等重鏈和輕鏈可以被純化和組裝，以在活體外形成完整的抗體。
在本技術領域中具有通常知識者習知的許多方法可被用於獲得抗體或其抗原結合片段。例如，可以使用重組DNA的方法來生產抗體。還可以藉由產生融合瘤來生產單株抗體。然後使用標準方法例如酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)篩選以此方式形成的融合瘤，以識別一或多個產生與特定抗原特異性結合的抗體之融合瘤。此外，可以使用噬菌體顯示系統來篩選單鏈抗體。
或者，可以經由傳統的方法，例如重組技術來製備任何抗IL6抗體。例如，可以使用本文所提供的用於本文所述的示例性抗體的多胜肽序列(參見例如表1)來獲得適合的核酸序列編碼，而這樣的核酸序列可以經由傳統的重組技術被選殖到適當的表現載體，以藉由例行的方法在適當的宿主細胞(例如細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞，諸如CHO細胞)中生產抗體。可以將由此製備的抗體從細胞或培養上清液分離，並且也可以藉由例行技術檢查該抗體之結合特徵和生物活性。
在一個實例中，使用噬菌體顯示系統來選擇IL6單鏈抗體。一旦分離，可以將編碼特定IL6 scFvs的多核苷酸選殖到表現載體，該表現載體設以表現全長免疫球蛋白及其具有所需特異性的片段。簡單來說，單鏈抗體之VH和VL多核苷酸被選殖到免疫球蛋白支架(即IgG)載體、表現以及二聚化，以便將單鏈「轉換」成完整的抗體。該免疫球蛋白支架可以視 需要選自五大類免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)中的任何類別。將scFvs轉換成完整免疫球蛋白分子的方法是眾所周知的，例如如WO 94/11523、WO 97/9351或EP 0481790中所描述的。
本文所述用以表現抗體的重組載體通常含有編碼抗體胺基酸序列的核酸，該抗體胺基酸序列可操作地連接組成型或誘導型的啟動子。該載體可以適用於原核生物、真核生物或上述兩者的複製和整合。典型的載體含有轉錄和轉譯終止子、起始序列及可用於調節編碼抗體的核酸之表現的啟動子。該載體視情況地含有通用表現盒，該通用表現盒含有至少一個獨立的終止子序列、允許在真核生物和原核生物中複製盒的序列(即，穿梭載體)以及原核和真核系統的選擇標記。
本文所述的重組抗IL6抗體可以在原核或真核表現系統中生產，該表現系統例如細菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲以及哺乳動物細胞。在真核細胞中醣基化或表現本發明的重組抗體是沒有必要的；然而，在哺乳動物細胞中的表現通常是較佳的。有用的哺乳動物宿主細胞株之實例為人類胚腎細胞株(293細胞)、幼倉鼠腎細胞(BHK細胞)、中國倉鼠卵巢細胞/-或+ DHFR(CHO、CHO-S、CHO-DG44、Flp-in CHO細胞)、非洲綠猴腎細胞(VERO細胞)以及人類肝細胞(Hep G2細胞)。以載體轉化或轉染宿主細胞(例如藉由化學轉染或電穿孔法)並在傳統的營養培養基中培養(或適當地修改)，以誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列的基因。可以將所生產的抗體蛋白進一步分離或純化，以獲得大致上均勻的製劑，可用於進一步的試驗和應用。可以使用本技術領域中習知的標準蛋白質純化方法。例如，適當的純化程序可以包括免疫親和或離子交換管柱上的分餾、 乙醇沉澱、高性能液相層析(high-performance liquid chromatography，HPLC)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、硫酸銨沉澱以及凝膠過濾。
當需要全長抗體時，本文所述的任何抗IL6 VH和VL鏈之編碼序列可以被連接到人類免疫球蛋白之Fc區的編碼序列，並且所得到的編碼全長抗體重鏈和輕鏈的基因可以被表現和組裝在適當的宿主細胞中，該宿主細胞例如植物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞。
可以經由例行的方法製備抗原結合片段。例如，F(ab')2片段可以藉由全長抗體分子的胃蛋白酶消化來生產，而Fab片段可以藉由減少F(ab')2片段的二硫橋來生產。或者，這樣的片段可以經由重組技術、藉由在適合的宿主細胞(例如大腸桿菌、酵母、哺乳動物、植物或昆蟲細胞)中表現重鏈和輕鏈片段來製備，並在活體內或活體外讓該等片段被組裝形成所需的抗原結合片段。
可以經由重組技術、藉由連接編碼重鏈變異區的核苷酸序列和編碼輕鏈變異區的核苷酸序列來製備單鏈抗體。較佳地，將柔性連接子併入該兩個變異區之間。
抗IL6抗體的使用
發現到，本文所述的抗IL6抗體結合IL6並作為IL6的拮抗劑以及調節IL6依賴的訊息途徑。特別的是，發現到那些抗體明顯抑制IL6依賴的細胞增生(例如胰臟癌細胞生長)和磷酸化STAT訊息轉導、減少IL6誘導的血管新生在體內形成以及抑制人體腫瘤轉移(例如前列腺癌轉移)。此外，當與化療劑一起使用時，這些抗體在人類胰臟腫瘤的動物模型中表現 出協同療效，該化療試劑例如奧沙利鉑、吉西他濱(gemticibine)及多西他賽。
因此，本文所述的抗IL6抗體可被用於治療與IL6相關的疾病或病狀，包括但不限於炎症性失調、自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏症、巨大淋巴結增生、多發性硬化症、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎及牛皮癬)、血管新生、癌症例如實體瘤(例如多個多發性骨髓瘤、白血病、乳癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉移以及癌症相關的惡病質。
為了實施本文所述的治療方法，可以將編碼這種抗體的任何抗IL6抗體(例如具有與抗體1-4-62、Ag1-4-6或HAg1T-3-10相同的CDR或相同的VH和VL鏈的抗體)或核酸(例如表現載體)與一或多種醫藥上可接受的載劑配製成醫藥組合物。本文使用的「醫藥上可接受的」是指載劑與該組合物中含有的活性成分相容，較佳為能夠穩定活性成分，而且對待治療的個體不會有害。該載劑可以作為活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或培養基。適當載劑的一些實例包括生理上相容的緩衝液，例如漢克溶液(Hank's solution)、林格氏液(Ringer's solution)、生理鹽水緩衝液、乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、無菌水、糖漿及甲基纖維素。該醫藥組合物還另外包括潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，例如甲基-和丙基羥基-苯甲酸酯；增甜劑；以及調味劑。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Edition 16,Mack Publishing Co.,Easton,Pa(1980)；以及Goodman and Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics",Tenth Edition,Gilman,J.Hardman and L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,155-173,2001。
根據本發明的醫藥組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、錠劑、香囊劑、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液及包裝粉劑的形式。本發明的醫藥組合物可以經由任何生理上可接受的路徑傳遞。這些路徑可以包括但決不限於非口服投予、全身投予、口服投予、經鼻投予、直腸投予、腹膜內注射、血管內注射、皮下注射、經皮投予、吸入投予以及肌內注射。本文所使用的「非口服」乙詞包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、關節腔、胸骨內、脊髓內、病灶內及顱內注射或輸注技術。
可以藉由混合具有所需純度的試劑與視情況的醫藥上可接受載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))以凍乾製劑或水溶液的形式製備配製用於治療用途的醫藥組合物用於存儲。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在採用的劑量和濃度上對接受者是無毒的，並且包括緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；包括抗壞血酸和甲硫胺酸的抗氧化劑；防腐劑(例如十八碳基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苄烷銨、芐索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁基或芐醇；對羥苯甲酸烷酯，例如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多胜肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他的 碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖類，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如，鋅蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。
在一些具體實施例中，本文所述的方法目的在於治療癌症，例如前列腺癌。需要此治療的人類個體可以是患有或懷疑有癌症的患者。在一些實例中，本文所述的抗IL6抗體之量與空白對照相比可有效抑制至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%的IL6誘導的細胞增生。在其他的具體實施例中，本文所述的抗IL6抗體之量可有效抑制至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%的STAT3磷酸化。在一些實例中，本文所述的抗IL6抗體之量可有效抑制IL6誘導的血管新生、癌症引起的惡病質(例如前列腺癌引起的惡病質)、癌症轉移(前列腺癌轉移)或上述之組合。
在其他的具體實施例中，本文所述的方法係用於治療自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎。在另一個實例中，該個體為患有或被懷疑有類風濕性關節炎的人類類風濕性關節炎患者。在一些實例中，本文所述的抗IL6抗體之量足以減少例如至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%的炎症性細胞介素產生，該炎症性細胞介素例如MCP-1及/或sICAM。
為了治療目標疾病，例如癌症或類風濕性關節炎，可以將上述的有效量醫藥組合物經由適當的路徑投予需要該治療的個體(例如人類)。需要治療的人類個體可以是已處於患有IL6相關失調的風險或懷疑患 有IL6相關失調的人類患者。這樣的患者可以藉由例行體檢來確認。
可以將本文所述的任何抗IL6抗體與其他的治療劑組合使用。在此上下文中「組合」乙詞是指該抗體組合物和治療劑不是同時就是依序給出。例如，組合療法可以包括與至少一額外的治療劑共同配製及/或共同給藥的至少一抗IL6抗體。在一個具體實施例中，該額外的治療劑是一種癌症化療劑，例如奧沙利鉑、吉西他濱、多西他賽。在另一個具體實施例中，該額外的治療劑可以是疾病改善抗風濕藥物(disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs)，例如甲氨喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯喹(chloroquine)、羥氯喹、環孢素A、柳氮塞拉金(sulfasalazine)，用於治療類風濕性關節炎。這種組合療法可以有利地利用低劑量投予的治療劑，從而防止可能的毒性或伴隨各種單一療法的併發症。此外，本文所揭示的該額外的治療劑可以作用於除了或不同於IL6/I6R/gp130途徑的途徑，因此，預期該額外的治療劑可以增強及/或協同抗IL6抗體的效用。
當本文所述的抗體組合物與第二治療劑共同使用時，治療劑量不足的該組合物或第二劑、或治療劑量不足的該組合物與該第二劑兩者可被用於治療具有、或處於與IL6調介的細胞訊息傳遞相關的疾病或失調之發展風險的個體。本文中使用的「治療劑量不足」是指在沒有其他試劑存在下投予的劑量低於會在個體產生療效的劑量。因此，治療劑量不足的試劑在沒有投予本文所述的抗IL6抗體之下並不會在個體產生所需療效。許多臨床使用的試劑之治療劑量為醫藥領域中眾所周知的，並且本技術領域中具有通常知識者無需過多的實驗即可決定額外的治療劑量。治療劑量已被 廣泛描述於參考文獻中，該參考文獻例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,1990；以及許多其他被醫學界仰賴作為疾病和失調之治療指導的醫療參考文獻。
可以使用在醫學技術領域中具有通常知識者習知的傳統方法來將該醫藥組合物投予個體，這取決於待治療的疾病類型或疾病的部位。
可注射的組合物可以含有各種載劑，例如植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及類似物)。對於靜脈注射，可以藉由滴注法投予水溶性抗體，藉以注入含有該抗體和生理上可接受的賦形劑的醫藥製劑。生理上可接受的賦形劑可以包括例如5%右旋糖、0.9%生理鹽水、林格氏溶液或其他適合的賦形劑。肉內製劑，例如適當可溶性鹽形式抗體的無菌製劑可以被溶解並在醫藥賦形劑中投予，該醫藥賦形劑例如注射水、0.9%生理鹽水或5%葡萄糖溶液。
當本文所述的編碼抗IL6抗體的核酸被用作治療劑時，表現該抗體的核酸或載體可以被以例如Akhtar et al.,1992,Trends Cell Bio.2,139中描述的方法傳遞給個體。例如，可以使用脂質體、水凝膠、環糊精、生物可降解的奈米膠囊或生物黏附性微球將該核酸或載體引入細胞。或者，可以藉由直接注射或藉由使用輸液泵局部傳遞該核酸或載體。其他的方法包括採用各種輸送和載劑系統，例如經由使用共軛物和生物可降解的聚合物。
為了方便傳遞，任何的抗IL6抗體或其編碼核酸可以與伴護劑(chaperon agent)共軛。如本文所使用的，「共軛」是指兩個實體為結合 的，較佳為具有足夠的親和力，以實現兩個實體之間的結合之治療效益。共軛包括共價或非共價鍵結以及其他形式的結合，例如一個實體陷在另一實體上或內，或任一實體或兩個實體皆陷在第三實體(例如微胞)上或內。
該伴護劑可以是天然存在的物質，例如蛋白質(例如人類血清白蛋白、低密度脂蛋白或球蛋白)、碳水化合物(例如葡聚醣、普魯藍多醣(pullulan)、甲殼醣、聚殼醣、菊糖、環糊精或透明質酸)或脂質。該伴護劑也可以是重組或合成的分子，例如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚離胺酸(polylysine，PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物以及聚膦氮(polyphosphazine)。
在一個實例中，該伴護劑為微胞、脂質體、奈米顆粒或微球體，其中封裝寡核苷酸/干擾RNA。製備這種微胞、脂質體、奈米顆粒或微球體的方法為本技術領域中眾所周知的。參見例如美國專利5,108,921；5,354,844；5,416,016以及5,527,5285。
在另一個實例中，該伴護劑係作為附接膜融合劑或縮合劑中之一或多者的基質。
膜融合劑係響應於局部的pH值。舉例來說，在遇到核內體內的pH值時，其可以在其直接環境中引起物理變化，例如滲透性質的變化，這會破壞或增加核內體膜的通透性，從而便於釋放反義寡核苷酸進入宿主細胞的細胞質中。較佳的膜融合劑會改變電荷，例如在pH值低於生理範圍 (例如在pH為4.5-6.5)時變成質子化。膜融合劑可以是含有能夠在曝露於特定pH範圍時經歷電荷變化(例如質子化)的胺基的分子。這樣的膜融合劑包括具有聚胺鏈(例如聚乙烯亞胺)的聚合物和膜破壞劑(例如蜂毒素(mellittin))。其他的實例包括聚組胺酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亞胺以及聚縮醛物質(例如陽離子聚縮醛)。
縮合劑與反義寡核苷酸相互作用而使其縮合(例如縮小寡核苷酸的大小)，從而保護其對抗降解。較佳地，該縮合劑包括經由例如離子交互作用與寡核苷酸交互作用的部分(例如帶電的部分)。縮合劑之實例包括聚離胺酸、精胺、亞精胺、聚胺或其季鹽、假胜肽-聚胺、胜肽模擬聚胺、聚胺樹枝狀聚合物、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子性脂質、陽離子性卟啉以及α-螺旋胜肽。
本文所述的抗IL6抗體也可以用於在生物樣品中檢測IL6的存在。基於抗體的檢測方法是本技術領域中眾所周知的，並且包括例如ELISA、免疫印跡(immunoblots)、放射免疫試驗、免疫螢光法、免疫沉澱及其他相關的技術。可以在診斷套組中設置抗體，該診斷套組整合至少一個其他的組件來檢測蛋白質。該套組也可以含有包裝、說明書或其他的材料，以幫助蛋白質的檢測和套組的使用。
可以使用檢測標記修飾抗體，該檢測標記包括配體基團(例如生物素)、放射性同位素、螢光團或酶。酶係藉由其活性檢測。例如，山葵過氧化酶係檢測其將基質四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)轉換成藍色顏料的能力，其可使用分光光度計量化。抗體也可以被功能性地連接(例如藉由基因融合、化學耦合、非共價結合或以其他方式)至至少 一個其他的分子，例如另一種抗體(例如雙特異性和多特異性抗體)、細胞毒性或細胞生長抑制劑、毒素、放射性同位素及類似物。
套組
本揭示還提供了用於治療IL6相關疾病的套組。這樣的套組可以包括一或多個容器，該容器包含抗IL6抗體(例如1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10)或其編碼核酸。
在一些具體實施例中，該套組可以包含根據本文所述的任何方法使用的說明。包括的說明可以包含根據本文所述的任何方法投予抗IL6抗體來治療、延緩發病或減輕IL6相關疾病的描述，該IL6相關疾病例如癌症(例如前列腺癌)或自體免疫疾病(例如RA)。該套組可以進一步包含基於識別個人是否患有該疾病來選擇適用治療的個人的描述。在仍其他的具體實施例中，該說明包含向處於該疾病風險的個人投予抗IL6抗體的描述。
與抗IL6抗體的使用有關的說明通常包括有關劑量、給藥時間表及意圖治療的投予途徑之資訊。該容器可以是單位劑量、散包(例如多劑量包裝)或子單位劑量。在本發明的套組中提供的說明通常是寫在標籤或包裝說明書上的說明(例如該套組中包括的紙張)，但是機器可讀的說明(例如磁碟或光儲存碟上進行的說明)也是可以接受的。
標籤或包裝說明書表明，該組合物係用於治療、延緩發病及/或減輕肝纖維化或肝硬化。可以提供說明來實施本文所述的任何方法。
本發明的套組是在適合的包裝中。適合的包裝包括但不限於玻璃小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝(例如密封的聚酯膠膜或塑膠袋)及其類似物。還可以構思的是與特定的裝置結合使用的包裝，例如吸入器、經 鼻的投予裝置(例如霧化器)或輸液裝置，例如微型泵。套組可以具有無菌的接取端口(例如該容器可以是靜脈溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的栓塞的小瓶)。該容器也可以具有無菌的接取端口(例如該容器可以是靜脈溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的栓塞的小瓶)。該組合物中至少一活性劑為抗IL6抗體。
本文所述的任何套組還可以包括額外的治療劑，該治療劑例如抗癌藥物(例如奧沙利鉑、吉西他濱、多西他賽)或DMARD(例如甲氨喋呤、硫唑嘌呤、氯喹、羥氯喹、環孢素A或柳氮塞拉金)。
套組可以視情況地提供額外的組件，例如緩衝液和解釋性資訊。通常情況下，該套組包含容器及在容器上或與容器結合的標籤或包裝說明書。在一些具體實施例中，本發明提供的製造物件包含如上所述的套組內含物。
不需要進一步的闡述，據信本技術領域中具有通常知識者可以根據以上的描述來利用本發明到最完整的程度。因此，以下的特定具體實施例係被解讀為僅僅是說明性的，而不是以任何方式限制本揭示的其餘部分。本文中引用的所有出版物係為了本文中提及的目的或標的物以引用方式併入。
實施例1：高親和力抗體結合至人類IL6之鑑別
構建顯示噬菌體的人類原生scFv抗體庫如下，以用於鑑別能夠結合至人類IL6的高親和力人類抗體。
從151個健康捐贈者的周邊血管淋巴細胞中分離出mRNA，並藉由M-MuLV反轉錄酶(Fermentas公司)使用寡聚dT引子由此合成 cDNA。擴增VH和VL基因、組裝並藉由具有一些修改的標準流程接合到噬菌體載體。將接合的產物經由電穿孔引入TG1大腸桿菌細胞中。之後，回收大腸桿菌細胞並在含有100mg/ml的安比西林和2%葡萄糖的2YT培養基中培養。將M13KO7輔助噬菌體顆粒加入培養中，以產生scFv-噬菌體顆粒，從而產生單鏈抗體(scFv)庫。該抗體庫之多樣性係由超過1000個選殖定序來決定。
將scFv庫進行四輪的生物篩選如下。在4℃將培養孔塗佈在0.1M NaHCO3緩衝液中的重組IL6整夜，然後用300μl的磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)沖洗兩次。在37℃用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)在PBS中阻斷培養孔1小時；加入100μl在含1%BSA的PBS中的噬菌體顆粒(2×1011pfu)，並在室溫(room temperature，RT)搖動1小時。然後，用300μl 0.5%(重量/體積)的Tween 20/PBS將培養孔洗滌6次。洗提結合的噬菌體並藉由大腸桿菌TG1感染而放大。用M13KO7解救感染的細胞。將所得的噬菌體顆粒經由PEG沉澱濃縮並用於下一輪的生物篩選。
在第四輪和第五輪的生物篩選中，藉由酶連接的免疫吸附試驗(ELISA)檢查噬菌體殖株來篩選其抗原結合的特異性。在4℃用重組人類IL6或2μg/ml在0.1M NaHCO3緩衝液中的BSA塗佈ELISA盤整夜。用PBS洗滌過後，在室溫用在PBS中的1%(重量/體積)BSA阻斷培養孔1小時。將噬菌體殖株和scFv片段加入培養盤中在室溫培養1小時。用含有0.1%(體積/體積)Tween 20的PBS洗滌培養盤，然後在室溫以在1% BSA-PBS中稀釋為1：10,000的HRP標記山羊抗人類IgG(KPL)作為探針。再次洗滌培養盤並 加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)基質溶液來顯色。然後加入終止溶液(1M H2SO4)並使用自動盤光度計(Bio-Rad公司)定量在450nm的吸收。
四輪的生物篩選之後，由上述的ELISA試驗確認有超過八百個噬菌體植株能夠結合到rhIL6。選擇29個噬菌體植株進行序列分析，以確定編碼抗IL6抗體的VH和VL序列。鑑別數個獨特的植株；藉由比較的ELISA試驗測定其結合活性和特異性。
選擇由上述生物篩選程序鑑定的母代噬菌體植株，植株1-4-62，進行親和力熟化，以經由隨機化VL/VH CDR噬菌體抗體庫的位點定向誘變的建構產生高親和力抗IL6抗體，每個抗體庫含有超過0.9×109的變體抗體。使用在CDR區含有隨機序列的VL和VH前向引子基於植株1-4-62的VL和VH序列按照下面的標準流程建構該抗體庫。使該CDR隨機抗體庫在本文所述的高嚴格條件下進行生物篩選程序，並且確定至少兩個高親和力植株Ag1-4-6(FB704)和Hag1T-3-10相對於母代植株具有較高的結合活性。
下表1提供三個抗IL6抗體1-4-62、Ag1-4-6及Hag1T-3-10的VH和VL域之互補決定區1-3(CDR 1-3)和框架區1-4(FW1-4)：
實施例2：結合至人類IL6的高親和力抗體之特性化 材料和方法
(i)細胞株和抗體
將購自台灣生物資源保存和研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)的人類骨髓瘤細胞U266細胞株(BCRC 60437)培養在補充有10%胎牛血清的RPMI 1640(Biowet)中。
將IL6依賴的B細胞雜交瘤B9培養在補充有5%胎牛血清加上50pg/ml重組人類IL6的RPMI 1640中。
將購自Lonza的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在塗佈明膠的有蓋培養皿上生長在EGMTM-2 singleQuots®培養基(Lonza公司)中。
用8mM L-麩醯胺酸在FreeStyleTM CHO表現培養基(Invitrogen公司)中培養IgG生產細胞，FreeStyleTM CHO細胞株(Invitrogen公司)。
在Ham’s F12(Invitrogen)中用10%胎牛血清培養Flp-in CHO細胞株(Invitrogen)。
對照的抗IL6抗體BE8係購自Diaclone。由美國食品藥物管理局(FDA)批准用於治療類風濕性關節炎的抗體藥物(抗IL6抗體)Actemra係購自德國海德堡的Universitatsklinikum。人類IgG1核苷酸係購自Sigma。
(ii)完整人類抗IL6 IgG1抗體之生產
建構四種表現載體(pA01-κ、pA02-γ、p2CMV中間體及修飾的pcDNAFRT)用於在哺乳動物細胞中生產人類IgG。將編碼抗IL6候選抗體的全輕鏈基因(含有κ恆定區)和全重鏈基因(含有γ恆定區)從pcANTAB5E分別選殖到pA01-κ和pA02-γ用於短暫的抗體表現。藉由GenJetTM Plus試劑(SignalGen)將這些表現載體導入FreeStyleTM CHO-S細胞。
首先將整個輕鏈和重鏈基因植株到p2CMV中間載體，然後植株到修飾的pcDNAFRT單一表現載體用於穩定的抗體表現。藉由GenJetTM Plus試劑將pcDNAFRT載體轉染到CHO細胞，並且用潮黴素B(Hygromycin B，Invitrogen)選擇陽性植株用於較長時間的表現。捕獲培養上清液並藉由 MabSelect SuRe和蛋白質A管柱(GE Healthcare)純化。
(iii)結合和競爭分析
進行ELISA和西方墨點轉漬法(Western blot)檢視抗IL6人類IgG抗體之結合活性。簡言之，使用重組人類IL6(R & D系統)以2μg/ml塗佈培養盤。用PBS洗滌後，在室溫用1%(重量/體積)在PBS的BSA阻斷培養孔1小時。將系列稀釋的純化抗IL6抗體(起始濃度為2μg/ml)放入培養孔中，並在室溫下培養1小時。以含有0.1%(重量/體積)Tween 20的PBS洗滌培養盤，然後用HRP標記的山羊抗人類IgG(KPL)作為探針，其係在1% BSA-PBS中以1：10,000稀釋，並在室溫下進行40分鐘。再次洗滌該培養盤，並加入TMB基質溶液來顯色。然後加入終止溶液(1M H2SO4)，並使用自動盤光度計(Bio-Rad)在450nm對吸收進行定量。
將重組IL6蛋白質在5倍還原樣品緩衝液(0.15M的Tris-HCl，pH為6.8，50%甘油，10% SDS，0.71M 2-巰基乙醇，0.095%溴酚藍)中煮沸10分鐘後，進行SDS-PAGE(Bio-Rad)。然後將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad)，並以本文所述的完整人類抗IL6抗體進行免疫印跡。用HRP標記的山羊抗兔(Thermo)或HRP標記的山羊抗鼠(KPL)抗體培養之後，藉由增強化學發光法(GE Healthcare)開發膜。
在4℃用在0.1M NaHCO3緩衝液中的2μg/ml重組人類IL6受體-α(R & D Systems)塗佈培養盤整夜。以PBS洗滌之後，在室溫用1%(重量/體積)在PBS中的BSA阻斷培養孔1小時。在室溫下以rhIL6(0.5μg/ml)預培養起始濃度為2μg/ml的2倍系列稀釋中的純化抗IL6抗體1小時。將混合物放入培養盤，並在室溫下培養1小時。用含有0.1%(體積/體積) Tween 20的PBS洗滌培養盤，然後在室溫以在1% BSA-PBS中稀釋為1：2,000的小鼠抗人類IL-6 IgG2a(Abcam)作為探針。洗滌培養盤，然後在室溫以在1% BSA-PBS中稀釋為1：10,000的HRP標記山羊抗鼠IgG(Thermo)作為探針40分鐘。再次洗滌培養盤並加入TMB基質溶液來顯色。然後加入終止溶液(1M H2SO4)並使用自動盤光度計定量在450nm的吸收。
(iv)細胞訊息傳遞試驗
用無血清的RPMI 1640洗滌U266細胞(1×106/ml)兩次，並在無胎牛血清和生長因子存在下培養2小時。在37℃用rhIL6(5ng/ml)刺激細胞30分鐘，然後用或不用抗IL6抗體處理。用冰冷的PBS洗滌細胞，然後在補充蛋白酶和磷酸酶抑製劑(Roche)的RIPA緩衝液(Thermo)中溶解。使用抗-pSTAT3和抗-STAT3(Cell Signaling Technology)抗體進行西方墨點轉漬法分析。用HRP標記的山羊抗兔(Thermo)或HRP標記的山羊抗鼠抗體(Thermo)培養之後，藉由增強的化學發光(GE Healthcare)開發膜。
(v)細胞增生試驗
將小鼠B9細胞(5×104/ml)種在96孔盤中，並用rhIL6(10pg/ml)培養。小鼠B9細胞的IL6受體可以被人類IL6刺激。將各種濃度的抗IL6抗體或對照IgG抗體放入孔中。然後在37℃下培養細胞72小時。根據製造商的指示藉由水溶性四氮唑(Water Soluble Tetrazolium，WST-1)試驗(Roche)檢測細胞存活率。所有的實驗都重複進行三次。
(vi)Biacore分析
在BIAcore T200系統(GE healthcare)中使用人類抗體捕獲 套組(GE healthcare)量測IgG結合親和力。經由胺偶合將小鼠抗人類IgG固定在CM5感測器晶片。將HBS-EP+緩衝液中約700RU的純化抗IL6 IgG捕獲到固定表面上。使用30μl/min的流速將HBS-EP+緩衝液中濃度範圍從25.6nM至0.4nM的重組人類IL6(R & D Systems)注射2分鐘。隨後HBS-EP+緩衝液中結合抗原的解離進行7分鐘。每個週期後使用再生溶液(3M MgCl2)再生表面IgG。計算解離常數(KD)為kd/ka。
(vii)特異性分析
在4℃用在0.1M NaHCO3緩衝液中2μg/ml的重組人類IL3、IL4、IL5、IL6、IL11、IL17A、CNTF、OSM、IGF-1(R & D Systems)、IL2、FGF(Prospec)、VEGF、TNF-α、EGF(Peprotech)塗佈培養盤整夜。以PBS洗滌之後，在室溫用1%(重量/體積)在PBS中的BSA阻斷培養孔1小時。將起始濃度為2μg/ml的4倍系列稀釋中的純化抗IL6抗體放入培養孔並在室溫下培養1小時。在含有0.1%(重量/體積)Tween 20的PBS中洗滌培養盤，然後在室溫以在1% BSA-PBS中稀釋為1：10,000的HRP標記山羊抗人類IgG(KPL)作為探針40分鐘。再次洗滌培養盤並加入TMB基質溶液來顯色。然後加入終止溶液(1M H2SO4)並使用VERSA max(Molecular Devices)定量在450nm的吸收。
結果
(a)抗IL6 IgG抗體之結合活性
為了探索抗IL6抗體之結合特異性，將編碼所選擇的scFv植株的VH和VL基因與κ和γ恆定區基因融合，以產生如本文所述的整個人類IgG1抗體。ELISA和西方墨點轉漬法試驗顯示，這些抗IL6抗體可以結合人 類重組IL6蛋白質並以劑量依賴的方式展現中和活性。
BIAcore分析顯示，植株AG1-4-6和Hag1T-3-10的平均結合速率常數(ka)與母代1-4-62植株相比從4.38 x 10-5M-1s-1增強到2.24 x 10-6M-1s-1。解離速率常數(kd)從1.66 x 10-3增強到6 x 10-4s-1。平衡解離常數(KD)從3.85提高到0.27nM。參見下表2。
(b)抗IL6抗體之結合特異性
進行本文所述的ELISA試驗，以確認本文所述的高親和力抗IL-6抗體之結合特異性。簡言之，培養盤塗佈有不同的細胞介素，如圖3A(IL6家族細胞介素)和圖3B(非IL6家族細胞介素)所指示，並檢視FB704抗體植株(即Ag1-4-6)對那些細胞介素的結合活性。FB704對人類IL6蛋白質表現出高的結合活性，但是對其他的細胞介素並沒有(圖3A和圖3B)，表示其對人類IL6有結合特異性。
(c)由抗IL6抗體抑制IL6依賴的訊息傳遞途徑和細胞增生
使用人類多發性骨髓瘤U266細胞來檢視抗IL6抗體對於IL6誘導的訊息傳遞級聯的效果。在抗體存在或不存在下與rhIL6一起培養U266細胞。30分鐘後，收集全細胞溶解物並進行西方墨點轉漬法分析，以檢視磷酸化STAT3蛋白質(P-STAT3)，其為涉及IL6訊息傳遞途徑的主要轉錄因 子。P-STAT3蛋白質的表現被高親和力抗IL6抗體、AG1-4-6及HAg1T-3-10以比Actemra更高的水平抑制，使用抗IL6受體人源化抗體Actemra作為對照(圖1A和圖1B)。抗體抑制STAT3磷酸化的水平顯示於下表3：
此外，為了檢視抗體對細胞增生的活性，在抗IL6或抗IL6R抗體存在下培養IL6依賴的B9鼠雜交瘤細胞以及各種濃度的同種型對照抗體。在72小時後以WST-1試驗(Roche)評估對細胞增生的影響。如圖1C所示，完整人類抗IL6抗體1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10以劑量依賴的方式抑制B9細胞增生，並且1-4-62、Ag1-4-6及HAg1T-3-10之IC50值分別為0.618、0.0468及0.00456μg/ml。
實施例3：高親和力抗IL6抗體在癌症治療中的有效性 材料和方法
(i)動物
將購自BioLASCO台灣有限公司(台灣台北)的雄性NOD/SCID小鼠(7-8週齡)用於所有實驗。將小鼠保持在20℃的無菌獨立通風籠(individually ventilated cage，IVC)中，並在實驗開始之前至少7天使該等小鼠適應住房設施。
(ii)基質膠血管新生試驗
將液體基質膠(BD Biosciences)保持在4℃。將hIL6重組蛋白(R&D Systems)加入基質膠中，使最終濃度為100ng/0.5ml。用Avertin(0.2ml/10g，腹腔注射)麻醉小鼠，並用0.5ml的基質膠在背側的兩個位點注入。然後，用抗IL6 IgG抗體或對照IgG抗體經由靜脈注射治療小鼠。在第6天，藉由CO2窒息將小鼠安樂死。取出基質膠栓塞、稱重和拍照。為了量測血紅素值，在4℃用溶解緩衝液(在PBS中的1% SDS，0.5% Triton)溶解基質膠栓塞整夜。使用德拉布坎試劑(Drabkin’s reagent，Sigma)定量栓塞的血紅素含量。使用牛血紅素的標準曲線(Sigma)來測定栓塞中的血紅素濃度。將血紅素含量表示為每克基質膠的微克血紅素。使用Student的未配對t檢測(Student’s unpaired t test)計算平均值+SD；P<0.05被認為具有統計學意義。
(iii)使用脾內植入模型的前列腺PC3腫瘤轉移試驗
用Avertin(0.2ml/10g)麻醉小鼠並剃光左側。然後將他們放在右側臥側位，用75%酒精擦洗左側。縱向切開1cm腹壁的皮膚(與脊椎平行)。從腹部取出脾臟並和緩地穩定。將胰島素注射器上的30號針頭插入脾實質內3-4mm。將50μl的PC-3細胞懸浮液緩慢注入。可見的蒼白傷痕表示成功的注射。然後將針縮回並放置小棉球覆蓋注射部位30秒，以防止出血和細胞懸浮液溢出。將脾臟放回腹膜。用6-0尼龍線縫合腹壁，並用4-0尼龍線縫合皮膚。
植入後，將小鼠隨機分配到不同的治療組(多西他賽組、多西他賽加抗IL6抗體組以及PBS對照組)，並經由尾靜脈或藉由腹腔注射使用 多種劑量的抗IL6抗體(每次20mg/kg，每週兩次)、多西他賽(每次3mg/kg，每週一次)治療。量測這些小鼠的體重每週兩次。
然後，藉由二氧化碳窒息將所有的小鼠安樂死並進行體重測定。切除脾臟和肝臟中的原發腫瘤、拍照以及稱重。將器官指數表示為每克小鼠的器官毫克數。使用Student的t檢測計算平均值+SD。使用Kaplan-Meier分析進行存活試驗。製備腫塊的石蠟包埋或冰凍切片，並以抗CD31和Ki-67加蘇木素染色劑染色用於分析。
(iv)異種移植人類胰臟腫瘤模型
將人類胰臟腫瘤細胞BxPC-3和MiaPaCa細胞再次懸浮於PBS中，並皮下注射(s.c.)(5×106個細胞，總體積0.15ml)到小鼠的右側。經過10天，將小鼠隨機分配到不同的治療組(抗體FB704、奧沙利鉑、FB704加奧沙利鉑、吉西他濱以及PBS對照組)，並用多劑量的FB704(每次20mg/kg，一周兩次)或奧沙利鉑(每次3mg/kg，一周一次)或吉西他濱(每次80mg/kg，每周兩次)經由尾靜脈或i.p.注射治療。每週兩次量測小鼠體重和腫瘤大小。腫瘤大小係使用卡尺量測，而將腫瘤體積計算為長度×寬度2×0.52。實驗後，犧牲全部的小鼠、收集小鼠血液樣本以及移除腫塊並秤重。藉由Student's t-test評估平均腫瘤體積和腫瘤重量的差異。製備石蠟包埋或冰凍切片的腫塊並以抗CD31、Ki67或TUNEL加H & E染色劑染色進行分析。
結果
(i)FB704在基質膠試驗中抑制體內血管新生
以本文所述的體內基質膠模型檢視FB704的抗血管新生能 力。治療6天後，輕微劃破小鼠並量測血紅素的濃度。在FB704治療組(圖4A)切除的基質膠栓塞中可觀察到顏色和血管密度的差異，表示抗體的抗血管新生活性。與hIL6(圖4B)相比，FB704治療也明顯降低血紅素的濃度。
(ii)FB704抑制人類前列腺癌細胞PC-3引發的惡病質和轉移
為了驗證FB704對癌症引起的惡病質和轉移的功效，以脾內注射對小鼠植入人類前列腺癌PC-3細胞(每隻小鼠1.0×106)。第1天，將小鼠隨機分為4組(n=12-15)。每週兩次經由i.v.(靜脈內)注射投予高(20mg/kg)和低(5mg/kg)劑量的FB704、陽性對照的Actemra(20mg/kg)及PBS。PC-3細胞植入後第31天，以PBS治療的小鼠之總體重減少了約19%。與此相反，高劑量FB704和Actemra治療組的總體重保持穩定，這與對照組相比明顯不同(圖5A；P<0.01)。
此外，幾天的潛伏期之後，PC3腫瘤小鼠發展出腫瘤散播蔓延的後腿癱瘓或其他症狀。重複血管內注射FB704(P=0.0001)和Actemra(P=0.024)明顯延長了PC3腫瘤小鼠的無症狀存活，其中FB704比Actemra(P=0.03)呈現明顯更好的療效(圖5B)。PBS治療組的總剖檢顯示在肝臟有嚴重的腫大和腫瘤細胞浸潤。與此相反，FB704治療組表現出中度的腫瘤細胞浸潤並且在和肝臟的左葉和中葉中有超過50%的正常肝細胞(圖5C)。
血管新生在腫瘤轉移中表現出重要的規則。進行免疫組織化學法來驗證腫瘤切片的血管密度。CD31染色(血管新生的標記)顯示在FB704治療組的血管新生與PBS對照組(圖5D和圖5E)相比明顯減少。
此外，FB704和化療藥物多西他賽的組合治療提供了更好的整體存活率(圖5F)。
(iii)FB704在胰臟癌異種移植模型中增強奧沙利鉑或吉西他濱的抗腫瘤活性
FB704在人類胰臟癌模型中增強奧沙利鉑或吉西他濱的抗腫瘤活性。用20mg/kg FB704每週兩次加上奧沙利鉑(3mg/kg)每週一次和吉西他濱(80mg/kg)每週兩次治療BxPC-3腫瘤小鼠產生統計學上分別為49%和60%(P<0.01)明顯抑制腫瘤生長的結果(圖6A和圖6G)。小鼠體重正常增加(圖6B)。治療後腫塊重量明顯減少(圖6C和圖6D)。
使用具有抗體特異性的Ki-67(其為一種細胞增生標記)來檢視各組的腫瘤組織之腫瘤細胞增生速率。在PBS、奧沙利鉑、FB704及FB704加上奧沙利鉑治療組的Ki-67陽性細胞百分比分別為26%、14%、16%及7.5%(圖6E和圖6F)，表示FB704和奧沙利鉑或吉西他濱的組合治療在體內提供了更好的胰臟腫瘤細胞增生的抑制。
FB704還在胰臟癌模型中表現出與吉西他濱的協同效益。每週兩次用20mg/kg的FB704和80mg/kg的吉西他濱治療BxPC-3腫瘤小鼠產生了統計學上明顯腫瘤生長抑制的結果(P<0.01)(圖6G)。
實例4：高親和力抗IL6抗體對治療類風濕性關節炎的有效性
在RA患者中，已觀察到在關節有產生較多的趨化素，例如MCP-1，暗示趨化素參與RA的發病機制。黏附分子sICAM-1也在發炎細胞浸潤到受傷的組織中扮演重要的角色。HUVEC在細胞表面上自然表現sICAM-1。IL6加上sIL6R的治療誘導sICAM-1的表現。
(i)抗IL6抗體在HUVEC細胞中抑制MCP-1和sICAM-1產生 為了檢視本文所述的抗IL6抗體在治療類風濕性關節炎(RA)的有效性，在抗體治療後量測人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)的單核細胞趨化蛋白質-1(MCP-1)及sICAM-1分泌如下。將HUVEC細胞以2×105細胞/ml的密度種在48孔盤中。在37℃以重組人類IL6、IL6受體-α(R & D系統)的組合、帶或不帶各種濃度的抗IL6抗體或對照的IgG抗體治療細胞24小時。收集無細胞的培養上清液，並以ELISA(RayBiotech)分析MCP-1和sICAM-1。
此活體外試驗指出，IL6加sIL6Rα誘導HUVEC的MCP-1和sICAM-1表現。抗體Ag1-4-6和HAg1T-3-10以劑量依賴的方式抑制IL6加sIL6Rα誘導的MCP-1(圖2A)和sICAM-1(圖2B)。抑制效果高於Actemra。
(ii)抗IL6抗體在U937細胞和人類周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中皆抑制MCP-1產生
MCP-1是屬於CC趨化素家族的小細胞介素，其誘集單核細胞、記憶T細胞及樹突狀細胞至發炎部位。在免疫細胞中，已知單核細胞是MCP-1的主要生產者。MCP-1在炎症和關節炎中扮演主要的角色。此外，IL6顯示可在人類單核細胞中誘導MCP-1。因此，測試本文所述的抗IL6抗體在IL6刺激的早期單核細胞株U937細胞中抑制MCP-1表現的有效性。
在含有RPMI1640的48平底培養盤(紐約州康寧市的Corning公司)中在不同濃度的抗IL6抗體存在下用IL6(100ng/ml)培養U937(2×106細胞/孔)24小時。以MCP-1 ELISA套組(e Bioscience)量測上清液中的MCP-1水平。所有的體外實驗皆重複進行三次。
在IL6刺激之後觀察到U937細胞產生MCP-1並且以劑量依 賴的方式，而且抗IL6抗體抑制U937細胞中由IL6誘導產生的MCP-1(圖7A)。
此外，從5個健康捐血者分離出PBMC。在含有RPMI 1640的96孔U底培養盤(紐約州康寧市的Corning公司)中在不同濃度的抗IL6抗體存在下用IL6(100ng/ml)培養細胞(5×105細胞/250μl/孔)24小時。以MCP-1 ELISA套組(e Bioscience)量測上清液中的MCP-1水平。
IL6刺激後觀察到PBMC細胞產生MCP-1。抗體Ag1-4-6和HAg1T-3-10的存在以劑量依賴的方式抑制MCP-1產生，而對照的同型IgG1沒有表現出這種抑制效果(圖7B)。
(iii)抗IL6抗體在來自類風濕性關節炎患者的滑液膜纖維母細胞中抑制MCP-1和VEGF產生
將新鮮的滑液膜組織剁碎並在膠原酶和去氧核糖核酸水解酶(DNase)溶液中消化。經由70-mm的尼龍過濾器過濾分離的纖維母細胞。在補充有20mM HEPES和10%熱去活化FBS、2mM麩醯胺酸、100U/ml青黴素及100mg/ml鏈黴素(pH調至7.6)的RPMI 1640(Life Technologies)中，在95%空氣/5% CO2中在塑膠細胞培養皿上生長細胞。超過95%的細胞是纖維母細胞，如利用對纖維母細胞蛋白質標記波形蛋白有特異性的抗體由免疫螢光染色所特性化的。將來自通道四至九的纖維母細胞用於實驗。
將如上所述衍生自人類RA患者的類纖維母細胞滑膜細胞(RA-FLS細胞)培養在6孔平底培養盤(紐約州康寧市的Corning公司；2×105細胞/2ml/孔)中2天並以IL6和sIL6R刺激。將不同濃度的抗體加入孔中並且培養細胞24小時。然後以MCP-1 ELISA套組(e Bioscience)量測MCP-1水平。
RA-FLS細胞以低水平自然表現MCP-1，並且以IL6和sIL6R預處理可以刺激高水平的MCP-1產生。本文所述的抗IL6抗體在市售的RA-FLS細胞(圖8A)和如上所述取自RA患者的RA-FLS細胞(圖8B)中顯示明顯抑制MCP-1產生。
血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在RA的發病機制中扮演重要的角色。來自RA患者的滑膜液中有明顯較高的VEGF水平。此也誘發血管滲透性以及調介炎症。為了檢視抗IL6抗體對RA-FLS細胞中VEGF生成的影響，在IL6(100ng/ml)、sIL6R(100ng/ml)及IL1β(5ng/ml)存在下以本文所述的抗IL6抗體處理這些細胞如下。
在48孔平底培養盤(紐約州康寧市的Corning公司)中培養RA-FLS細胞(2×104細胞/500μl孔)24小時，然後用IL6和sIL6R兩者以及IL-1β刺激。將各種濃度的抗體加入孔中並且培養細胞48小時。收集上清液，並以人類VEGF ELISA套組(PreproTech)量測VEGF的水平。
以IL6、IL6R及L1β的組合刺激的RA-FLS細胞之培養上清液中的VEGF為來自未被細胞介素刺激的細胞之上清液中的VEGF之3-5倍。抗IL6抗體在市售的RA-FLS細胞(圖9A)和如本文所述製備自RA患者的RA-FLS細胞(圖9B)中皆明顯減少VEGF產生。
其他的具體實施例
可以將本說明書中揭示的所有特徵組合成任意的組合。在本說明書中揭示的每個特徵皆可被提供相同、等效或類似目的的替代特徵取代。因此，除非另有明確說明，否則所揭示的每個特徵僅是通用系列的等同或相似特徵之實例。
從上面的描述，本技術領域中具有通常知識之人士可以很容易地確定本發明的本質特性，並且在不脫離其精神和範圍的情況下，本技術領域中具有通常知識之人士可以作出本發明的各種變化和修改，以使其適應各種用途和條件。因此，其他的具體實施例也是在申請專利範圍內。
<110> 泉盛生物科技股份有限公司
<120> 介白素-6抗體及其用途
<130> FB0001CN
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<212> PRT
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<223> 合成肽
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<221> 其他特徵
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是芳族胺基酸
<400> 21

Claims (13)

  1. 一種結合至人類介白素6(IL-6)的分離抗體，包含：(a)重鏈變異區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、SEQ ID NO：4之重鏈互補決定區2(HC CDR2)以及SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：16之重鏈互補決定區3(HC CDR3)；或(b)輕鏈變異區(VL)，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、SEQ ID NO：11之輕鏈互補決定區2(LC CDR2)以及SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15之輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
  2. 如請求項1的分離抗體，包含：(i)包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：6之HC CDR3的VH；或(ii)包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：16之HC CDR3的VH；其中VH可視需要為包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的胺基酸序列；及/或(i)包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：13之LC CDR3的VL；或(ii)包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：15之LC CDR3的VL；其中VL可視需要為包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
  3. 如請求項1的分離抗體，其是選自由下列所組成的群組：(i)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：6之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：13之CDR3；(ii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：16之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：13之CDR3；(iii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：6之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：15之CDR3；(iv)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：2之HC CDR1、SEQ ID NO：4之HC CDR2及SEQ ID NO：16之HC CDR3，該VL包含SEQ ID NO：9之LC CDR1、SEQ ID NO：11之LC CDR2及SEQ ID NO：15之CDR3；(v)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；(vi)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(vii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；以及(viii)包含VH和VL的抗體，該VH包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
  4. 如請求項1的分離抗體，其是全長抗體或其抗原結合片段，該抗原結合片段可以是Fab或(Fab’)2。
  5. 如請求項1的分離抗體，其是單鏈抗體、人源化抗體或人類抗體。
  6. 一種醫藥組合物，其包括請求項1-5中任一項的抗體及醫藥上可接受的載體。
  7. 如請求項6的醫藥組合物，其進一步包含另一種抗癌試劑或疾病修飾 抗風濕藥物(disease modifying antirheumatic drug，DMARD)。
  8. 如請求項7的醫藥組合物，其中該抗癌試劑是選自以下所組成的群組：多西他賽(docetaxel)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及吉西他濱(gemcitabine)，及/或該疾病修飾抗風濕藥物是選自以下所組成的群組：甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯奎寧羥氯奎寧(chloroquine hydroxychloroquine)、環孢靈(cyclosporin A)以及磺胺塞拉金(sulfasalazine)。
  9. 一種請求項1-5中任一項所述的抗體用於製備在治療IL6相關疾病的藥劑的用途。
  10. 如請求項9的用途，其中該IL6相關疾病是選自以下所組成的群組：炎症性失調、自體免疫疾病(可視需要地選自類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏症、巨大淋巴結增生、多發性硬化症、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎或牛皮癬)、血管新生、癌症(可視需要地多發性骨髓瘤、白血病、乳癌，胰臟癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌及前列腺癌)、腫瘤轉移、癌症相關的惡病質。
  11. 一種包括編碼請求項1-5中任一項所述的重鏈變異區(VH)、輕鏈變異區(VL)或兩者的核苷酸序列的核酸，其中該核酸可視需要併入載體(vector)，該載體可視需要為表現載體(expression vector)。
  12. 一種包括請求項11所述的核酸的宿主細胞。
  13. 一種製備結合至人類介白素6(IL-6)的抗體的方法，包含：將請求項12所述的宿主細胞培養於容許表現該抗體的條件下：以及可視需要地收集該抗體。
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