KR20120101375A - 항-혈관형성 치료를 위한 이중 특이적 결합 분자 - Google Patents

항-혈관형성 치료를 위한 이중 특이적 결합 분자 Download PDF

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Abstract

단일 분자에 VEGF-결합 성분 및 DLL4-결합 성분을 포함하는 이중 특이적 결합 분자, 특히 VHH 및 도메인 항체와 같은 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인. 그를 포함하는 약학적 조성물 및, 혈관 형성에 대한 VEGF- 및 DLL4-매개된 효과와 관련된 질병의 치료에 있어서 이의 용도. 이중 특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산, 숙주 세포 및 그를 제조하기 위한 방법.

Description

항-혈관형성 치료를 위한 이중 특이적 결합 분자 {Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy}
본 발명은 인간 치료 분야, 특히 암 치료 및 치료에 유용한 에이전트(agent) 및 조성물에 관한 것이다.
US 2008/0014196호에 요약된 바와 같이, 혈관형성은 고형종양(solid tumor) 및 암의 전이(metastasis)를 포함하는 많은 장애의 발생에 연관되어 있다.
종양 성장의 경우, 혈관형성은 과잉형성(hyperplasia)에서 종양형성(neoplasia)으로의 전이, 및 종양의 성장 및 전이를 위한 양분의 제공에 결정적인 역할을 하는 것으로 보여지고(Folkman et al., Nature 339-58 (1989)), 이로 인해 종양 세포는 정상 세포에 비해 유리한 생장 조건을 획득하게 된다. 그러므로, 항-혈관형성 치료는 여러 유형의 종양에 대해 중요한 치료 옵션이 되었다.
가장 중요한 프로-혈관형성 인자(pro-angiogenic factor) 중 하나는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF-A, 이하 "VEGF"로 기재)인데, 이는 태반성장인자(placenta growth factor, PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 VEGF-E를 포함하고, 단일 유전자의 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)으로부터 유래하는 다양한 이소폼(isoform, 생물학적으로 가장 관련된 이소폼은 VEGF165임)으로 존재하는 유전자 패밀리(gene family)에 속한다. 그러므로, 항-혈관형성에 의존하는 대부분의 항암 치료는 VEGF 경로(pathway)를 차단하는데 초점을 맞추어왔다(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May; 3(5):391~400).
최근에는, DLL4 (또는 델타 유사 4 또는 델타-유사 리간드 4)가 암 치료를 위한 유력한 타겟임이 확인되었다. DLL4는 Notch(notch) 리간드의 델타 패밀리(family)의 구성원이다. 예를 들어, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-cell acute lymphoblastic leukemia) 및 고형 종양에서와 같은 많은 암들에서 Notch 시그널링(Notch signaling)의 조절장애가 일어난다(Sharma et al., 2007, Cell Cycle 6 (8): 927-39; shih et al., Cancer Res. 2007 Mar 1; 67 (5): 1879-82).
DLL4의 세포 외부 도메인은 N-말단 도메인, 델타/세레이트(Serrate)/라그-2(Lag-2) 도메인, 및 여덟 개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 반복(repeat)의 연쇄(tandem)로 구성되어 있다. 일반적으로, EGF 도메인은 218-251 (EGF-1: 도메인 1), 252-282 (EGF-2; 도메인 2), 284-322 (EGF-3; 도메인 3), 324-360 (EGF-4; 도메인 4), 및 362-400 (EGF-5; 도메인 5)번째 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 알려졌으며, DSL 도메인은 hDLL4의 약 173-217번째 아미노산 잔기를, N-말단 도메인은 hDLL4의 약 27-172번째 아미노산 잔기로 구성된다(WO 2008/076379).
DLL4는 혈관 내피(vascular endothelium), 특히 동맥 내피(arterial endothelium)에서 매우 선택적으로 발현된다는 것이 보고되었다(Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14: 1313-1318). 쥐에서의 최근 연구에 의하면, DLL4가 VEGF에 의해 유도되며, 혈관신생성 발아(sprouting) 및 분지화(branching)를 억제하는 음성 되먹임 조절인자(negative feedback regulator)라는 것이 밝혀졌다. 이런 역할과 일관되게, DLL4를 제거 또는 저해한 결과 과도한 혈관형성이 일어났다(Scehnet et al., Blood. 2007 Jun 1; 109(11): 4753-60). 이러한 제한되지 않은 혈관형성은 역설적이게도 비-생산적 혈관구조(non-productive vasculature)을 형성하므로 심지어 항-VEGF 치료에 내성을 지닌 종양에서도 종양 생장을 감소시킨다(Thurston et al., Nat Rev Cancer. 2007 May; 7(5):327-31; WO 2007/070671; Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21; 444(7122)). 종양 혈관형성에 대한 영향 외에도, DLL4의 저해는 임상 전(preclinical) 종양 모델에서 암 줄기 세포(cancer stem cell)의 빈도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Hoey et al., Cell Stem Cell. 2009 Aug 7; 5(2):168-77).
(전-)임상 개발 중에 있는, DLL4를 타겟으로 하는 여러 생물학적 화합물이 이미 개시되어 있다: 완전 인간 DLL4 항체인 REGN-421 (=SAR153192; Regeneron, Sanofi-Aventis; WO 20080706379) 및 OPM-21M18 (OncoMed) (Hoey et al., Cell Stem Cell. 2009 Aug　7; 5(2):168-77); 인간화된 DLL4 항체인 YW152F (Genentech), (Ridgway et al., Nature. 2006 Dec　21;444(7122):1083-7); DLL4의 세포 외부 부위로 구성된 재조합 융합 단백질 및 인간 IgG1의 Fc 부위인 DLL4-Fc (Regeneron, Sanofi-Aventis), (Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec　21;444(7122)).
VEGF 및 DLL4의 결합에 의한 저해는, 여러 종양 유형의 이종이식(xenograft) 모델 및 항-VEGF 내성 종양 모델에 있어서, 항-VEGF 단독의 항암 활성에 비해 더 우수한 항암 활성을 제공하는 것이 밝혀졌다(Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec　21; 444(7122):1032-7; Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21; 444(7122):1083-7; US 2008175847).
단일클론 항체(MABs) 및 융합 단백질을 치료에 적용하는 데에는 여러 단점이 있다: 이들의 분해를 방지하기 위하여, 반드시 동결 온도에서 보관되어야 한다. 또한, 소화기관에서 신속히 소화되므로, 경구 투여에 적합하지 않다. MABs의 암 치료상의 또 다른 주요 제약은 수송이 잘 되지 않는다는 것인데, 이는 낮은 농도 및 모든 종양 세포를 타겟화하지 못하는 결과를 초래한다.
또한, VEGF 및 DLL4 양자를 타겟화하는 것에 기반한 최신 치료법은 두 개의 개별 억제제(inhibitor), 즉 VEGF-결합 분자 및 분리된 DLL4-결합 분자를 포함하는 병용 요법(combination therapy)이다. 그러나, 이들 치료법은 두 개의 분리된 약의 개발 및 생산에 비용이 많이 들고 많은 재료가 필요하며, 두 개의 약이 서로 다른 약물동태학적(pharmacokinetic) 특성을 가질 수 있으며 두 개의 약의 투여가 환자에게 불편하다는 단점들을 갖는다.
상기한 바와 같은 측면에서, 인간 항암 치료를 위한 개선된 분자를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 단일 치료제에 하나 이상의 DLL4-결합 분자와 하나 이상의 VEGF-결합 분자를 결합시킨다는 생각에 기초하고 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 DLL4-결합 분자 및 하나 이상의 VEGF-결합 분자를 포함하는 이중 특이적 결합 분자에 관한 것이다.
이하에서, 달리 언급되지 않는다면, "결합 분자"(또는 "항원-결합 분자")는 DLL4-결합 분자, 특히 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 또는 VEGF-결합 분자, 특히 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 모두 또는 이중 하나를 의미한다. "이중 특이적 결합 분자"는 적어도 하나의 DLL4-결합 분자(또는 "결합 성분") 및 적어도 하나의 VEGF-결합 분자(또는 결합 성분)를 포함하는 분자를 의미한다. 이중 특이적 결합 분자는 하나 이상의 DLL4-결합 분자 및/또는 하나 이상의 VEGF-결합 분자를 포함할 수 있다. 이중 특이적 결합 분자는, 즉 이중 특이적 결합분자가 바이파라토프성(biparatopic, 아래 정의된 것과 같음) DLL4-결합 분자 및/또는 바이파라토프성 VEGF-결합 분자를 포함하는 경우, DLL4 또는 VEGF에 결합하는 분자의 일부, 즉 그것의 "DLL4-결합 성분"(또는 항-DLL4 성분) 또는 "VEGF-결합 성분"(또는 항-VEGF 성분) 각각에서 하나 이상의 DII4-결합 분자 및/또는 하나 이상의 VEGF-결합 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 암과 같이, DLL4의 저해에 의해 조절되는 질병 또는 상태의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단에 있어서 조성물의 약학적 활성제(active agent)로서 유용하다.
본 발명의 추가적인 목적은, 상기 에이전트 및 조성물의 사용 및/또는 투여를 포함하는, 질병, 장애 또는 상태의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단을 위한 방법을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명의 복적은 해당 기술분야에서 현재 사용되고 또는 (and/or) 알려진 에이전트, 조성물 및/또는 방법에 비해 일정한 이점을 제공하는 상기 약학적 활성제, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 바와 같은 통상적인 항원, 또는 그의 단편(fragment)과 비교할 때, 상기 이점에는 개선된 치료적 특성 및/또는 약학적 특성 및/또는 기타 유리한 특성들, 예를 들어, 제조 목적상의 특성들이 포함된다.
특히, 본 발명의 목적은 신규 분자, 특히 포유류, 그 중 특히 인간 DLL4 및 인간 VEGF에 결합하는 분자를 제공하는 것인바, 본 원에 설명된 바와 같이 이러한 분자는 치료 및 진단상 목적에 적합하다.
첫 번째 측면은, DLL4-결합 성분 및 VEGF-결합 성분을 단일 분자 내에 포함하는 이중 특이적 결합 분자를 제공하는 것이다.
더 구체적으로, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 (ⅰ) 적어도 하나의 DLL4의 에피토프(epitope)에 결합하는 DLL4-결합 성분 및 (ⅱ) 적어도 하나의 VEGF의 에피토프에 결합하는 VEGF-결합 성분을 필수적으로 포함하는데, 여기에서 상기 성분는 DLL4 및 VEGF에 동시에 결합하거나 둘 중 하나와 따로 결합하는 식으로 서로 연결되어 있다.
본 발명의 바람직한 측면에 의하면, 상기 두 개의 성분는, 서로 독립적으로 VHH 또는 도메인 항체(domain antibody), 및/또는 VL 도메인(본 원에서 정의된 바와 같음)과 같은, 다른 종류의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인일 수 있는 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는데, 이 경우, 이들 각각의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 항원, 즉 DLL4 또는 VEGF에 결합한다.
바람직한 구체예에 의하면, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 동일 유형인데, 특히 모든 이뮤노글로불린 도메인은 VHH 또는 도메인 항체이다.
특히 바람직한 구체예에 의하면, 모든 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 VHH, 바람직하게는 인간화된(또는 "서열-최적화된", 본 원에서 정의된 것과 같음)VHH이다. 따라서, 본 발명은 (선택적으로 인간화된 또는 서열-최적화된) 항-DLL4 VHH 및 (선택적으로 인간화된 또는 서열-최적화된) 항-VEGF VHH를 포함하는 이중 특이적 결합 분자에 관한 것이다.
그러나, 본 원의 교시가, 도메인 항체와 같은, 기타 항-DLL4 또는 항-VEGF 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중 특이적 결합 분자에 유사하게 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중 특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산뿐만 아니라 그를 함유하는 숙주(host) 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 이중 특이적 결합 분자를 함유 또는 포함하는 생성물 또는 조성물 및 상기 조성물의 선택적인 하나 이상의 추가 성분에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 원에서 설명된 이중 특이적 결합 분자, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물을 조제 또는 생성하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 원에서 설명된 이중 특이적 결합 분자, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 투여 및 사용뿐만 아니라 DLL4의 저해에 의해 조절될 수 있는 질병 및 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 특성, 구체예, 이점 및 적용예들은 이하 본 원의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
달리 지시 또는 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어는 기술 분야에서의 통상의 의미를 갖고, 당업자가 명확하게 이해할 수 있을 것이다. 표준적인 안내서, 예를 들어, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), 및 Roitt et al., "Immunology" (2nd　Ed.)를 참고문헌으로 하였고, 또한 본 원에서 인용된 일반적 배경기술도 이용되었다; 나아가, 달리 지시되지 않는 한, 상세하게 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 알려진 방식으로 그 자체로 실행될 수 있고 실행되어 왔으며, 당업자가 분명하게 이해할 수 있을 것이다. 참고문헌은 표준적인 안내서, 상기 언급된 일반적 배경 기술 및 거기에 인용된 추가의 참고자료가 이용되었다.
달리 지시되지 않는 한, "이뮤노글로불린" 및 "이뮤노글로불린 서열"-본 원에서 중연쇄 항체 또는 통상적인 4-연쇄 항체를 의미-은 풀 사이즈(full-size) 항체, 그의 개별 연쇄, 뿐만 아니라 모든 부분, 도메인 또는 이의 단편(비제한적인 예로, 각각 항원-결합 도메인 또는 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인과 같은 단편)을 포함하기 위하여 일반적인 용어로 사용되었다. 또한, 본 원에서 사용된 용어 "서열"은 (예를 들어, "이뮤노글로불린 서열", "항체 서열", "(단일) 가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에 있어서) 문맥상 제한하여 해석할 필요가 없는 한, 일반적으로 핵산 또는 그를 인코딩하는 핵산뿐만 아니라 관련된 아미노산 서열 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 원에서 사용된 용어 "도메인"은 단백질의 나머지 부분과 독립적으로 그의 3차 구조를 보유하는 능력을 갖는 접힌 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질 독자의 기능적 특성을 나타나게 하고, 많은 경우 그 단백질의 나머지 및/또는 그 도메인 기능의 손실 없이 첨가되거나 제거 또는 다른 단백질로 전이될 수 있다.
본 원에서 사용된 용어 "이뮤노글로불린 도메인"은 항체 사슬(예를 들어, 통상적인 4-쇄 항체 또는 중쇄 항체의 사슬과 같은)의 구형(globular) 부위를 의미하거나, 필수적으로 그러한 구형 부위로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 이뮤노글로불린 도메인은, 2개의 베타-쉬트(beta-sheet)로 배열된 약 7개의 역평행 베타-가닥(antiparallel beta-strand)의 2-겹 샌드위치(2-layer sandwich)로 구성되며, 보존된 이황화 결합에 의해 선택적으로 안정화되는 항체 분자 특유의 이뮤노글로불린 접힘(fold)을 보유한다는 점이 특징이다.
본 원에서 사용된 용어 "이뮤노글로불린 가변 도메인"은 필수적으로 네 개의 "골격 부위"(framework region)로 구성되는 이뮤노글로불린 도메인을 의미하는바, 이하 본 원에서는 "골격 부위 1" 또는 "FR1"; "골격 부위 2" 또는 "FR2"; "골격 부위 3" 또는 "FR3"; 및 "골격 부위 4" 또는 "FR4"로 구성되는 이뮤노글로불린 도메인을 각각 의미하며; 골격 부위는 세 개의 "상보적 결정 부위(complementary determining region)" 또는 "CDR"에 의해 중단되는바(interrupted), 이하 본 원에서는 "상보적 결정 부위 1" 또는 "CDR1"; "상보적 결정 부위 2" 또는 "CDR2"; "상보적 결정 부위 3" 또는 "CDR3"에 의해 각각 중단되는 경우를 의미한다. 그러므로, 이뮤노글로불린 가변 도메인의 일반적 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 항원-결합 자리를 수반하여 항원에 대한 특이성을 항체에 부여하는 것은 이뮤노글로불린 가변 도메인이다.
본 원에서 사용된 용어 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"은 추가적인 가변 이뮤노글로불린 도메인과 짝짓지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명에서 의미하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 일례는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL (VH 도메인 및 VL 도메인)과 같은 "도메인 항체"이다. 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 예는, 이하 본 원에서 정의된 카멜리드(camelid) "VHH 도메인" (또는 간단히 "VHH")이다.
상기 정의에 비추어, 통상적인 4-쇄 항체(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 해당 기술 분야에서 공지)의 항원-결합 도메인 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 상기 통상적인 4-쇄 항체 유래 이중항체(diabody, 해당 기술 분야에서 공지)의 항원-결합 도메인은 보통 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인으로 보지 않는데, 왜냐하면, 이들 경우에는, 항원의 각 에피토프에 대한 결합이 보통 하나의 (단일한) 이뮤노글로불린 도메인에 의해 일어나지 않고 한 쌍의 (결합한) 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인과 같은 이뮤노글로불린 도메인, 즉 이뮤노글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 일어나기 때문이며, 이는 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합한다.
VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 없는 항체")의 항원 결합 이뮤노글로불린 (가변) 도메인으로 설명되어왔다(Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "경쇄가 없는 자연 발생적 항체 (Naturally occurring antibodies devoid of light chains)"; Nature 363, 446-448 (1993)). 용어 "VHH 도메인"은 이들 가변 도메인을 통상적인 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(이는 본 원에서 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"으로 기재됨) 및 통상적인 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(이는 본 원에서 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"으로 기재됨)과 구별하기 위하여 선택되어왔다. VHH 도메인은 추가적인 항원 결합 도메인 없이 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다(통상적인 4-쇄 항체의 VH 또는 VL 도메인에서는 이와 반대로 에피토프가 VH 도메인과 VL 도메인에 의해 같이 인식된다). VHH 도메인은 단일 이뮤노글로불린 도메인에 의해 형성된 작고 강하며 효율적인 항원 인식 단위이다.
본 발명의 명세서에서, 용어 VHH 도메인, VHH 도메인, VHH 항체 단편, VHH항체, 뿐만 아니라 "Nanobody®" 및 "Nanobody® 도메인"(Nanobody는 Ablynx N. V.사; Ghent; Belgium의 상표)은 상호교환적으로 사용되고 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 대표하며, 예를 들어 WO 2009/109635, 도 1에서 정의된 소위 "인증 잔기(hallmark residue)"에 의해 VH 도메인과 구별된다.
이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 아미노산 잔기는, 예를 들어, 「Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999)」의 도 2에서의 카멜리드(camelid) 유래 VHH 도메인에 적용된, Kabat et al.의 VH 도메인에 대한 일반적 번호 붙이기("관심 면역 단백질의 서열 (Sequence of proteins of immunological interest)", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)에 따라 번호가 붙여졌다. 상기 번호 붙이기에 따라,
- FR1은 1-30 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR1은 31-35 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR2는 36-49 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR2는 50-65 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR3은 66-94 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR3은 95-102 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR4는 103-113 위치의 아미노산 잔기를 포함한다.
그러나, 각각의 CDR의 아미노산 잔기의 총 개수는 변할 수 있으며 Kabat의 번호 붙이기에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 개수에 대응하지 않을 수 있다(즉, 실제 서열이 Kabat에 따른 하나 이상의 위치를 차지하지 않을 수 있거나, 실제 서열이 Kabat의 번호붙이기에 의해 계산된 숫자보다 더 많은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다)는 것에 주목해야 한다. 이는, Kabat에 따른 번호 붙이기가 일반적으로 실제 서열에서 아미노산을 실제로 번호 붙이는 것에 대응할 수도, 대응하지 않을 수도 있다는 것을 의미한다.
VH 도메인의 아미노산 잔기의 번호를 붙이는 대체적인 방법이 해당 기술 분야에 공지되었으며, 이는 VHH 도메인에 대해서도 유사한 방식으로 적용될 수 있다. 그러나, 달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명의 상세한 설명, 청구항 및 도면에서는, VHH 도메인에 적용된, Kabat에 따른 번호 붙이기를 따랐다.
VHH 도메인의 아미노산의 총 개수는 보통 110 내지 120개 범위, 빈번하게는 112 내지 115 내에 있다. 그러나, 이보다 작거나 긴 서열도 본 원에서 설명된 목적에 적합할 수 있다는 점에 주목하여야 한다.
이뮤노글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, VHH 및 도메인 항체)은 고유의 많은 구조적, 기능적 특성으로 인해 기능성 항원-결합 분자로서 치료에 이용되는데 매우 큰 이점을 갖는다. 그것에만 제한되지 않고, 특히 VHH 도메인(경쇄 가변 도메인과 짝짓지 않고 항원에 기능적으로 결합하도록 자연적으로 디자인됨)은 단일한, 상대적으로 작은, 기능성 항원-결합 구조 단위로 기능할 수 있다.
그들의 고유한 특성으로 인해, 본 원에서 정의된, VHH 또는 VH(또는 VL)과 같은 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은, 단독으로 또는 더 큰 폴리펩티드, 예를 들어, 바이파라토프성(biparatopic) 분자 또는 이중 특이적 결합 분자로서, 많은 중요한 이점을 제공한다:
- 높은 친화력 및 높은 선택성으로 항원에 결합하는데 단일한 도메인만이 필요하여, 두 개의 분리된 도메인이 존재할 필요가 없고 이들 두 도메인이 올바른 공간 배치(conformation) 및 배열(configuration)로 (즉, scFv's와 같이 특별히 디자인된 링커의 사용을 통하여) 존재하는지 확인할 필요가 없다;
- 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 단일 핵산 분자로부터 발현될 수 있으며 글리코실화(glycosylation)과 같은 번역 후 변형(post-translational modification)이 전혀 필요하지 않다;
- 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 다가(multivalent) 및 다중특이(multispecfic) 포맷으로 쉽게 엔지니어링될 수 있다(본 원에서 추가로 논의되는 바와 같음);
- 이뮤노글로부린 단일 가변 도메인은 그들의 타겟에 대한 높은 특이성 및 친화력을 보유하고 내재 독성이 낮으며, 주입(infusion) 또는 주사(injection)가 아닌 대체 경로를 통하여 투여될 수 있다;
- 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 열, pH, 프로테아제(protease) 및 변성제 또는 변성 조건에 매우 안정하므로 냉장 장치를 사용하지 않고 제조, 저장 또는 수송될 수 있다;
- 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 소규모 및 제조 규모의 조제가 모두 용이하고 상대적으로 저비용이다. 예를 들어, 이뮤노글로부린 단일 가변 도메인 및 그것을 함유하는 폴리펩티드는 미생물 발효를 이용하여 생산될 수 있으며 (예를 들어, 하기 추가 설명된 바와 같이) 통상의 항체의 경우처럼 포유동물 발현 시스템(mammalian expression system)을 사용할 필요가 없다;
- 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 통상적인 4-쇄 항체 및 그의 항원-결합 단편에 비해 상대적으로 작고(대략 15 kDa, 또는 통상적인 IgG에 비해 10배 더 작음), 그리하여 (더) 우수한 조직(고형 종양 및 기타 치밀 조직) 침투력을 보여주며 통상적인 4-쇄 항체 및 그의 항원 결합 단편에 비해 더 높은 복용량으로 투여될 수 있다;
- VHH는 특이적 소위 "강-결합 특성(cavity-binding properties)" (4-쇄 항체의 VH 도메인과 비교할 때, VHH의 늘어난 CDR3 루프로 인한)을 갖고, 그리하여 통상적인 4-쇄 항체 및 그의 항원-결합 단편에 접근불가능한 타겟 및 에피토프에 결합할 수 있다;
- VHH는 특별한 이점, 즉 잘 용해되고 매우 안정적이며 침전되지 않는 경향을 갖는다(「Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)」에 기술된 마우스-유래 항원-결합 도메인의 경우에서와 같이).
본 발명에 따른 이중 특이적 결합 분자의 성분에 함유된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 그의 특정 생물학적 공급원 또는 특정 제조 방법으로만 얻을 수 있는 것은 아니다. 예를 들어, VHH는 하기 단계를 포함하여 수득할 수 있다:
(1) 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인 분리; 또는 중쇄 항체 또는 VHH를 포함하는 라이브러리(library)의 스크리닝(screening) 및 그것로부터 VHH 분리;
(2) 자연 발생 서열을 갖는 VHH를 인코딩하는 핵산 분자의 발현;
(3) 임의의 친화력 성숙(affinity maturation) 후, 자연발생 서열을 갖는 VHH의 "인간화(humanizing)"(또는 서열-최적화) 또는 상기 인간화된 VHH를 인코딩하는 핵산의 발현;
(4) 동물 종, 특히 인간 등 포유류 종 유래 자연 발생 항체의 이뮤노글로불린 단일 가변 헤비(heavy) 도메인의 "카멜화(camelizing, 하기 설명된 바와 같음)", 또는 상기 카멜화된 도메인을 인코딩하는 핵산 분자의 발현;
(5) VH의 카멜화, 또는 상기 카멜화된 VH를 인코딩하는 핵산 분자의 발현;
(6) 단백질, 폴리펩티드 또는 기타 아미노산 서열의 합성 또는 반-합성(semi-synthetically) 조제 기술의 이용;
(7) VHH 도메인을 인코딩하는 핵산 분자의 핵산 합성 기술을 이용한 조제, 이어서 그렇게 수득한 핵산의 발현;
(8) 중쇄 항체 또는 VHH의 친화력 성숙, 돌연 변이 및/또는 VHH의 친화력 및/또는 특이성을 향상시키기 위한 기타 기술의 적용; 및/또는
(9) 상기 언급된 단계들의 결합 또는 선택.
상기 설명된 단계를 실행하기 위한 적절한 방법 및 기술은 해당 기술 분야에 알려져 있고 당업자가 명확하게 이해할 수 있는 것이다.
특정 구체예에 따르면, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 존재하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 자연 발생 VHH 도메인의 아미노산 서열에 필수적으로 대응하는 아미노산 서열을 갖는 VHH이나, 임의의 친화력 성숙 후, 상기 자연 발생 VHH의 핵산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 통상적인 4-쇄 항체의 가변 헤비 도메인의 해당 위치에 존재하는, 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써, 인간화된(서열-최적화된) 것이다. 이는 해당 기술 분야에 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있고, 상기 방법은 당업자가 일상적으로 사용할 수 있는 것이다.
서열-최적화된 VHH는, 인간 생식세포계열(germline) Vh3 서열 DP-29, DP-47, DP-51, 또는 이들의 부분으로부터 유래된 하나 이상의 완전 인간 골격 부위 서열(fully human framework region sequence)을 포함하거나, 그에 매우 유사한 것일 수 있다. 그러므로, 인간화 프로토콜은 어떤 VHH 잔기를, 이에 대응하는, DP 47, DP 29 및 DP 51과 같은 생식세포계열 VH 유전자의 골격 부위 1, 2 및 3(FR1, FR2 및 FR3)의 잔기로 단독으로 또는 공동으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 적절한 골격 부위(FR)는, 예를 들어, WO 2006/004678에서 제시된 것들로부터 선택될 수 있으며, 구체적으로는 소위 "KERE" 및 "GLEW" 클래스를 포함한다. 특히 바람직한 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 약 44 내지 47 위치에서 아미노산 서열 G-L-E-W, 및 그들 각각의 인간화된 등가물(counterpart)을 갖는다.
예를 들어, 108Q를 108L로 치환하면 103 P,R,S-그룹 및/또는 GLEW-그룹(하기 정의됨)에 속한 VHH가 인간화된다. 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 인간화하는 방법은 해당 기술 분야에 알려져 있다.
이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 향상된 친화도 또는 감소된 면역원성(immunogenicity)과 같은, 치료에 있어서의 개선된 특성은 개별 결합 분자로부터 부여될 수 있는데, 이를 위해 해당 기술 분야에서 알려진 기술들, 예를 들어, 친화력 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 자연 발생 이뮤노글로불린 서열로부터 시작하는), CDR 이식(grafing), 인간화, 서로 다른 이뮤노글로불린 서열 유래 단편의 결합, 중첩하는 프라이머를 이용한 PCR 어셈블리(assembly), 및 당업자에게 잘 알려진 이뮤노글로불린 서열을 엔지니어링하는 유사한 기술들; 또는 이들의 적절한 조합, 또한 본 원에서 설명된 바와 같은 "서열 최적화"를 이용한다.
적절한 경우에는, 증가된 친화도를 갖는 결합 분자는, 또 다른 결합 분자의 친화력-성숙에 의해 얻어질 수 있는데, 이는 친화력이 성숙된 분자, "모체" 결합 분자와 관련하여, 이후에 설명된다.
특정 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH를 얻는 방법은, 예를 들어, WO 2006/040153 및 WO 2006/122786 등에서 설명되었다. 거기에서 상세히 설명된 바와 같이, 카멜리드(camelid) 유래 VHH 도메인은 본래의 VHH 서열 중 하나 이상의 아미노산을, 인간 유래의 통상적인 4-쇄 항체의 VH 도메인의 대응 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산으로 대체함으로써 "인간화"할 수 있다(본 원에서 "서열-최적화"로 기재될 수도 있다, "서열-최적화"는 인간화뿐만 아니라, VHH에 개선된 특성을 부여하는, 번역 후 변형 자리의 제거와 같은, 하나 이상의 돌연변이에 의한 추가적인 서열 변형을 포함한다). 인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 완전 인간 골격 부위 서열을 포함할 수 있으며, 훨씬 더 많은 특정 구체예에서는, 임의로 JH5와 같은 JH 서열과 결합하는, DP-29, DP-47, DP-51 또는 그의 부분 유래의 인간 골격 부위 서열을 포함할 수도 있다.
"Dab" 및 "dAbs"로도 알려진 도메인 항체는("도메인 항체" 및 "dAbs"는 GlaxoSmithKline 계열사의 상표로 사용됨), 예를 들어, Ward, E. S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); 및 WO 2003/002609에서 설명되었다.
도메인 항체는 기본적으로 비-카멜리드 포유동물, 특히 인간 4-쇄 항체로부터 유래된 항체의 VH 또는 VL 도메인에 대응한다. 단일 항원 결합 도메인으로서, 즉 VL 또는 VH 도메인과 각각 짝짓지 않고 에피토프에 결합하기 위하여는, 예를 들어 인간 단일 VH 또는 VL 도메인 서열의 라이브러리를 이용함으로써 이러한 항원 결합 특성에 대한 특이적 선발이 필요하다.
VHH와 같은 도메인 항체는 대략 13 내지 대략 16kDa의 분자량을 갖고, 완전 인간 서열로부터 유래한 경우에는, 인간의 치료 용도로 사용하기 위해 인간화가 필요하지 않다. VHH 도메인의 경우에서와 같이, 이들은 원핵세포 발현 시스템에서도 잘 발현되며, 이는 전체 제조비를 상당히 감소시킨다.
뿐만 아니라, 상기 하나 이상의 CDR을, 인간 스캐폴드(scaffold) 또는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 비제한적으로 포함하는 기타 "스캐폴드"로 이식(graft)할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. CDR 이식을 위한 적절한 스캐폴드 및 기술은 해당 기술 분야에 알려져 있다.
상호 교환적으로 사용될 수 있는 용어 "에피토프" 및 "항원 결정자(antigenic determinant)"는 통상적인 항체 또는 본 발명의 폴리펩티드와 같은 항원-결합 분자, 및 더 구체적으로는 상기 분자의 항원-결합 자리에 의해 인식되는, 폴리펩티드와 같은 거대분자의 일부를 의미한다. 에피토프는 이뮤노글로불린에 대한 최소 결합 자리로 정의되며, 그러므로 이뮤노글로불린의 특이성의 타겟을 나타낸다.
특정 에피토프, 항원 또는 단백질(또는 적어도 한 부분, 단편 또는 그의 에피토프)에 "결합(bind to)" 또는 "특이적으로 결합(specifically bind to)"할 수 있는, "친화력을 갖는(has affinity for)" 및/또는 "특이성을 갖는(has specificity for)" 폴리펩티드(이뮤노글로불린, 항체, 본 발명의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 또는 일반적으로 결합 분자 또는 그의 단편과 같은)는 상기 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대하여(against)" 또는 "직접 향해진(directed against)"으로 기재되거나, 그러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합(binding)" 분자이다. 본 명세서에서, VEGF- 또는 DLL4-결합 분자는 "VEGF-중화" 또는 "DLL4-중화"로도 각각 기재될 수 있다.
일반적으로, 용어 "특이성"은 특정 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질(이뮤노글로불린 단일 가변 도메인과 같은) 분자에 결합할 수 있는 많은 다양한 유형의 항원 또는 에피토프를 의미한다. 항원-결합 분자의 특이성은 그의 친화력 및/또는 결합활성(avidity)에 기반하여 결정될 수 있다. 항원과 항원-결합 단백질의 해리 평형상수(KD)는 에피토프 및 항원-결합 단백질의 항원-결합 자리 간의 결합 강도에 대한 정도이다: KD 값이 작을수록, 에피토프 및 항원-결합 분자 간의 결합 강도는 더 강해진다(이와 대체 가능하게, 친화력은 친화 상수(KA), 즉 1/KD로도 표현될 수 있다). 당업자에게 자명한 바와 같이(예를 들어 본 원에서의 추가적인 개시에 기반하여), 특정 관심 항원에 따라, 그 자체로 알려진 방식으로 결정될 수 있다. 결합활성(avidity)은 항원-결합 분자(이뮤노글로불린, 항체, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 그것을 함유하는 폴리펩티드) 및 관련 항원 간의 결합 강도의 정도이다. 결합 활성은 에피토프 및 항원-결합 분자의 항원 결합 자리 간, 에피토프 및 항원-결합 분자에 존재하는 많은 관련 결합 자리 간의 친화도 모두에 관한 것이다.
에피토프를 인식하는 항원-결합 분자의 일부를 파라토프라고 한다.
달리 지시되지 않는 한, 용어 "DLL4-결합 분자" 또는 "VEGF-결합 분자"는 항-DLL4 또는 항-VEGF 항체, 항-DLL4 항체 또는 항-VEGF 항체 단편, 본 원에서 정의된 "항-DLL4 항체-유사 분자" 또는 "항-VEGF 항체-유사 분자", 및 이들 간의 콘쥬게이트(conjugate)를 포함한다. 항체는 모노클로날 및 키메라화(chimerized) 모노클로날 항체를 비제한적으로 포함한다. 용어 "항체"는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 생성된 모노클로날 항체와 같은 완전한 항체뿐만 아니라, WO 02/056910에서 설명된 것과 같이, 소위 "SMIPs(small Modular Immunopharmaceuticals)"로 불리는 단일-쇄 항체 및 선형 항체를 포함하는, 항체 단편 또는 "항체-유사 분자"를 포함한다. 항체-유사 분자는 본 원에서 정의된 것과 같은 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 항체-유사 분자에 대한 다른 예는 이뮤노글로불린 수퍼 패밀리 항체(IgSF), 또는 CDR-이식된 분자이다.
"VEGF-결합 분자" 또는 "DLL4-결합 분자"는 각각, 1가(monovalent) 타겟-결합 분자(즉, 각 타겟의 하나의 에피토프에 결합하는 분자)뿐만 아니라, 2가- 또는 다가 결합 분자(즉, 하나 이상의 에피토프에 결합하는 결합 분자, 예를 들어, 이하 본 원에서 정의된 것과 같은 "바이파라토프성" 분자) 모두를 의미한다. 하나 이상의 VEGF(또는 DLL4)-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 (또는 DLL4)-결합 분자는 "포맷된(formatted)" 결합 분자로도 칭해지는데, 이들은, 타겟-결합 성분 내에서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인뿐만 아니라, 링커 및/또는 이펙터(effector) 기능을 갖는 모이어티, 예를 들어, 알부민-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인과 같은 반감기-연장 모이어티, 및/또는 혈청 알부민과 같은 융합 파트너 및/또는 PEG 같은 부착된 폴리머를 포함할 수 있다.
본 원에서 사용된 용어 "바이파라토프성 VEGF(또는 DLL4)-결합 분자" 또는 "바이파라토프성 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"은 본 원에서 정의된 것과 같은 첫 번째 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 두 번째 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 결합 분자를 의미하는데, 여기에서 두 개의 분자는 두 개의 비-중첩하는, 각 항원의 에피토프에 결합한다. 바이파라토프성 결합 분자는, 에피토프에 대하여 다른 특이성을 갖는, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인으로 구성되어 있다. 상기 에피토프를 인식하는 항원-결합 분자(항체 또는 본 발명의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인)의 일부를 파라토프라고 한다.
또한, 비록 덜 바람직하더라도, 포맷된 결합 분자는 동일한 또는 중첩하는 에피토프 또는 그들 각각의 항원을 인식하는, 2개의 동일한 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 2개의 다른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 이 경우에, 두 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은, VEGF에 대하여 VEGF 다이머(dimer)를 형성하는 두 모노머 각각에서 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어, 비아코어(Biacore) 또는 키넥사(Kinexa) 분석법으로 측정할 때, 10E-5 내지 10E-14 몰/리터(M) 이하, 및 바람직하게는 10E-7 내지 10E-14 몰/리터(M) 이하, 더 바람직하게는 10E-8 내지 10E-14 몰/리터, 및 훨씬 더 바람직하게는 10E-11 내지 10E-13의 결합 상수(KD)로 결합하며 또는 (and/or) 적어도 10E7 ME-1, 바람직하게는 적어도 10E8 ME-1, 더 바람직하게는 적어도 10E11 ME-1과 같이 적어도 10E9 ME-1의 결합상수(KA)로 결합한다. KA 값이 10E-4이면 일반적으로 비-특이적 결합을 의미한다고 본다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 원하는 항원, 즉, VEGF 또는 DLL4 각각에 500 nM 이하, 바람직하게는 200 nM, 더 바람직하게는 500 pM 이하와 같이 10 nM 이하의 KD로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 대한 항원-결합 단백질의 특이적 결합은, 예를 들어, 본 원에서 설명된 분석법, 스캐차드 (Scatchard) 분석법, 방사선면역분석(RIA), 효소 면역분석(EIA) 및 샌드위치 경합 분석(sandwich competition assay), 및 해당 기술 분야에서 그 자체로 알려진 이들의 다른 변형된 분석법을 포함하는, 그 자체로 알려진 모든 적절한 방법으로 판정될 수 있다.
아미노산 잔기는 해당 기술 분야에서 일반적으로 알려지고 동의된, 표준적인 3-문자 또는 1-문자 부호에 따라 표기되었다. 두 개의 아미노산 서열을 비교할 때, 용어 "아미노산 차이"는, 두 번째 서열에 비해, 참조 서열의 위치에서 지정된 번호의 아미노산의 첨가, 삭제 또는 치환을 의미한다. 치환의 경우, 그러한 치환은 바람직하게는 아미노산의 보존적 치환이며, 이는 아미노산 잔기가, 유사한 화학 구조를 갖고, 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 기타 생물학적 특성에 근본적인 영향을 미치지 않는, 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있는데, 예를 들어, WO 98/49185에서는, 아미노산의 보존적 치환이 바람직하게는 하기 그룹 (ⅰ) - (ⅴ)의 하나의 아미노산이 동일 그룹 내의 다른 아미노산 잔기로 치환된다: (ⅰ) 작은 지방족, 비극성, 또는 약간의 극성을 띠는 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (ⅱ) 극성, 음전하의 잔기 및 그들의 (미-대전된(uncharged)) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (ⅲ) 극성, 양전하의 잔기: His, Arg 및 Lys; (ⅳ) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (ⅴ) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 아미노산의 보존적 치환은 다음과 같다: Ala을 GIy 또는 Ser로; Arg을 Lys로; Asn을 GIn 또는 His로; Asp를 GIu로; Cys를 Ser으로; GIn을 Asn으로; GIu를 Asp로; GIy을 Ala 또는 Pro으로; His을 Asn 또는 GIn으로; Ile을 Leu 또는 VaI으로; Leu을 Ile 또는 VaI으로; Lys을 Arg, GIn 또는 GIu으로; Met을 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe을 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser을 Thr으로; Thr을 Ser으로; Trp을 Tyr으로; Tyr을 Trp 또는 Phe으로; VaI을 Ile 또는 Leu으로 치환.
폴리펩티드 또는 핵산 분자는 - 예를 들어, 그것이 얻어진 생물학적 공급원 및/또는 반응 배지 또는 배양 배지와 비교할 때 - 상기 공급원 또는 배지에서 그와 결합된, 기타 단백질/폴리펩티드, 기타 핵산, 기타 생물학적 성분 또는 거대 분자와 같은, 적어도 하나의 기타 성분 또는 적어도 하나의 오염 물질, 불순물 또는 부(minor) 성분로부터 분리된 경우 "근본적으로 분리(형태)(로)"되었다고 본다. 특히, 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 적어도 2-배, 특히 적어도 10-배, 더욱 특히 적어도 100-배, 및 1000-배 이상까지 정제된 경우 "근본적으로 분리"되었다고 본다. "근본적으로 분리된 형태로" 존재하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 바람직하게는, 적절한 크로마토그래피 기술, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 적절한 기술을 사용하여 판정할 때, 근본적으로 동형(homogeneous)이다.
두 개의 VEGF-결합 분자 서열 간의 "서열 동일성(sequence identity)"은 그 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 의미한다. 이는 WO 08/020079의 49쪽 및 50쪽의 f) 단락에서 설명된 바와 같이 계산 또는 판정될 수 있다. "서열 유사성(sequence similarity)"은 동일하거나, 아니면 보존적으로 치환되는 아미노산의 백분율을 의미한다.
VHH 도메인에도 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기의 번호를 붙이는 대체적인 방법은 해당 기술 분야에 알려져 있다. 그러나, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 상세한 설명, 청구항 및 도면에서는, 상기 설명된 바와 같이 VHH 도메인에 적용된, Kabat에 따른 번호 붙이기를 따랐다.
"친화력-성숙된" 결합 분자, 특히 VHH 또는 도메인 항체는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변경을 포함하는데, 이는 각 모체 결합 분자에 비해, 타겟에 대한 친화도를 개선한다. 친화력-성숙된 결합 분자는 해당 기술 분야에서 알려진 방법에 의해 제조될 수 있는데, 이는 예를 들어, 「Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783」, 또는 「Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA　91: 3809-3813」; 「Shier et al., 1995, Gene 169:147-155」; 「Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004」; 「Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9」; 및 「Hawkins et al., 1992, J.　MoI. Biol. 226(3): 889 896」; 「KS　Johnson 및 RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996」에 설명되어 있다.
본 발명에서, "서열 번호: x의 아미노산 서열"은, 달리 언급되지 않는 한, 각 서열 번호: x에 나타난 서열과 100 퍼센트 동일한 아미노산 서열;
a) 각 서열 번호: x에 나타난 서열과 적어도 80 퍼센트의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
b) 각 서열 번호: x에 나타난 서열과 3, 2, 또는 1 개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "암" 및 "암성(cancerous)"은 제어되지 않은 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특성화되는 포유동물에서의 생리학적인 상태를 의미한다. 본 발명의 이중 특이적 결합 분자로 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는, 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 및 백혈병(leukemia)를 포함한다. US 2008/0014196에서 DLL4 길항제로 치료될 수 있다고 제안된, 이러한 암의 더 특수한 예는, 편평세포암종(squamous cell cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐 선암(adenocarcinoma of the lung), 폐 편평암종(squamous carcinoma of the lung), 복막 암(cancer of the peritoneum), 간세포 암(hepatocellular cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간세포암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 대장암(colorectal cancer), 자궁내막암종(endometrial carcinoma) 또는 자궁암종(uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 전입선암(prostate cancer), 음문암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 위암(gastric cancer), 흑색종(melanoma), 및 다양한 유형의 두경부 암(head and neck cancer)을 포함한다. 혈관형성의 조절장애는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 많은 장애를 일으킬 수 있다. 이들 장애는 비종양성(non-neoplastic) 상태 및 종양성(neoplastic) 상태 모두를 포함한다. 종양은 상기된 것들을 비제한적으로 포함한다. US 2008/0014196에서 DLL4 길항제로 치료될 수 있다고 제안된, 비종양성 장애의 비제한적인 예는, 원하지 않거나 비정상적인 비대증(hypertrophy), 관절염(arthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 건선(psoriasis), 건선판(psoriatic plaque), 사코이드증(sarcoidosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 죽상경화판(atherosclerotic plaque), 당뇨병(diabetic) 및 미숙아망막병증(retinopathy of prematurity)을 포함하는 기타 증식망막병증(proliferative retinopathy), 수정체뒤섬유증식(retrolental fibroplasia), 신생혈관녹내장(neovascular glaucoma), 연령관련황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨황반부종(diabetic macular edema), 각막혈관신생(corneal neovascularization), 각막이식혈관신생(corneal graft neovascularization), 각막이식거부(corneal graft rejection), 망막/맥락막혈관신생(retinal/choroidal neovascularization), 전방각혈관신생(피부홍조)(neovascularization of the angle(rubeosis)), 혈관신생성 안질환(ocular neovascular disease), 혈관 재협착(vascular retenosis), 뇌동정맥기형(arteriovenous malformations: AVM), 뇌수막종(meningioma), 혈관종(hemangioma), 혈관섬유종(angiofibroma), 갑상선 과형성증 (thyroid hyperplasias, 그레이브스 병(Grave's disease)을 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증(chronic inflammation), 폐 감염(lung inflammation), 급성 폐손상(acute lung injury), 패혈증(sepsis), 원발(성) 폐고혈압증(primary pulmonary hypertension), 악성 폐낭삼출증(malignant pulmonary effusion), 뇌부종(cerebral edema: 예를 들어, 급성 뇌졸중(acute stroke)/폐쇄성 뇌손상(closed head injury)/외상(trauma)), 활액막 감염(synovial inflammation), RA에서의 판누스 형성(pannus formation), 골화근염(myositis ossificans), 비대 골형성(hypertropic bone formation), 골관절염(osteoarthritis(OA)), 난치성 복수(refractory ascites), 다낭성 난소병(polycystic ovarian disease), 자궁내막증(endometriosis), 체액 질환의 3차 스페이싱(3rd spacing of fluid diseases; 췌장염(pancreatitis), 구획증후군(compartment syndrome), 화상(burs), 장질환(bowel disease)), 자궁종양(uterine fibroid), 조숙산통(premature labor), IBD와 같은 급성 감염(크론병(Crohn's disease) 및 궤양성대장염(ulcerative colitis)), 신동종이식거부반응(renal allograft rejection), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 신증후군(nephrotic syndrome), 원하지 않거나 비정상적인 조직 중량 증가(암이 아닌), 혈우병성 관절(hemophilic joint), 비후흉터(hypertrophic scar), 모발성장 저해(inhibition of hair growth), 오시어-웨버 증후군(Osier-Weber syndrome), 화농육아종(pyogenic granuloma), 수정체후부섬유증식증(retrolental fibroplasias), 공피증(scleroderma), 트라코마(trachoma), 혈관유착(vascular adhesion), 윤활막염(synovitis), 피부염(dermatitis), 전자간증(preeclampsia), 복수(ascites), 심낭삼출(pericardial effusion; 심장막염(pericarditis)와 결합된 것과 같은), 및 흉막삼출(pleural effusion)을 포함한다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 DLL4-결합 성분 및 VEGF-결합 성분을 포함하는 이중 특이적 결합 분자에 관한 것이다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 DLL4-결합 성분 및 상기 VEGF-결합 성분는 적어도 하나의 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 결합 도메인 및 적어도 하나의 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 결합 도메인을 각각 포함한다.
바람직한 측면에서, 각 상기 DLL4-결합 성분 및 상기 VEGF-결합 성분는 적어도 하나의 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 적어도 하나의 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 각각 포함하는데, 여기에서, 각각의 상기 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 네 개의 골격 부위 및 세 개의 상보성 결정 부위(complementarity determining region) CDR1, CDR2 및 CDR3를 각각 포함하며,
여기에서, a) 상기 적어도 하나의 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 CDR3은
ⅰ) 서열 번호: 1에 나타난 바와 같이, Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr Xaa Tyr Asp Xaa(여기에서
위치 8의 Xaa는 Arg Ala 또는 Glu이고;
위치 11의 Xaa는 Leu 또는 Glu이고;
위치 14의 Xaa는 Tyr 또는 His이다); 및
ⅱ) 서열 번호: 2에 나타난 바와 같이, Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala Tyr Xaa Asp Tyr(여기에서 Xaa는 Gln, Ala 또는 Tyr이다)으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;,
b) 상기 적어도 하나의 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 CDR3은 서열 번호: 3에 나타난 바와 같이, 아미노산 서열 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Xaa Tyr(여기에서 Xaa는 Asp 또는 Glu를 갖는다)을 갖고,
여기에서, 상기 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 인간 재조합 VEGF165와 인간 재조합 VEGFR-2의 상호작용을 60% 이상의 저해율로 차단할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 VHH이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 특히, 임의의 친화력 성숙 후, 모체 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 서열 최적화된 VHH를 함유한다.
예를 들어, 이중 특이적 결합 분자에 함유된 DLL4-결합 분자는 표 5에 나타난 아미노산 서열 및 서열 번호: 4 내지 20을 갖는 VHH인 모체 DLL4-결합 분자로부터 얻었다.
DLL4-결합 성분에 함유된 바람직한 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 번호: 10에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 상기 바람직한 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은, 서열번호: 10에 나타난 서열을 갖는 VHH로부터 유래된, 친화력-성숙된 VHH의 서열 최적화에 의해 얻었는데, 여기에서, 상기 친화력-성숙된 VHH는, 서열번호: 21 내지 27 및 표 16에 나타난 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 상기 친화력-성숙된 VHH는 서열 번호: 22에 나타난 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 구체예에서, VHH는 서열 번호: 22에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화에 의해 얻었다. 바람직한 서열-최적화된 VHH는 서열 번호: 34 및 35 및 표 23에 나타난 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
DLL4-결합 성분에 함유된 또 다른 그룹의 바람직한 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 번호: 12에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 상기 바람직한 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은, 서열 번호: 12에 나타난 서열을 갖는 VHH로부터 유래된, 친화력-성숙된 VHH의 서열 최적화에 의해 얻었는데, 여기에서 상기 친화력-성숙된 VHH는 서열 번호: 28 내지 33 및 표 17에 나타난 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 상기 친화력-성숙된 VHH는 서열 번호: 30, 32 및 33에 나타난 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
더 바람직한 구체예에서, VHH는 서열 번호: 32에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화에 의해 얻었다. 서열-최적화된 VHH의 예는, 서열 번호: 36 내지 39 및 표 24, 및, 특히 바람직하게는, 표 25에 나타난, 서열 번호: 40 및 41를 갖는다.
인간 재조합 VEGF165와 인간 재조합 VEGFR-2의 상호작용을 60% 이상의 저해율로 차단할 수 있는 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 예는 서열 번호 42 내지 44 및 표 32에 나타난 VHH이다.
바람직하게는, VEGF-결합 성분에 함유된 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 번호: 33에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화에 의해 얻었다. 바람직한 VHH는 서열 번호 54 내지 62에 나타난 서열을 갖는다. 특히 바람직한 수용체-차단 VHH는 서열 번호: 63 및 64 및 표 59에 나타난 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 이중 특이적 결합 분자에 관한 것인데, 여기에서 DLL4-결합 성분 및/또는 VEGF-결합 성분는, 각 항원 DLL4 또는 VEGF의 서로 다른 비-중첩 에피토프에서 이들과 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 형태의, 둘 이상의 결합 분자를 각각 포함한다. 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 함유된 이러한 결합 분자는, DLL4 또는 VEGF에 존재하는 적어도 두 개의 비-중첩 에피토프에 직접 향해진(directed against) 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 각각 포함하는데, 여기에서, 상기 개별 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 그들 각각의 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 방식으로 서로 연결되어 있다.
그러므로, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 함유된 항-DLL4 및/또는 항-VEGF 성분는 2개(또는 그 이상)의 항-DLL4 (또는 항-VEGF, 각각) 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있는데, 여기에서 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 DLL4(또는 VEGF) 타겟 내의 서로 다른 에피토프에 직접 향해 있다. 그러므로, 이중 특이적 결합 분자의 2개의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서로 다른 항원 특이성 및 그에 따른 서로 다른 CDR 서열을 가질 것이다.
이러한 2가(bivalent) 결합 분자는, 두 개의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 두 개의 서로 다른 파라토프를 포함할 것이므로, 각각 "바이파라토프성 단일 도메인 항체 컨스트럭트(construct)"(이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 단일 도메인 항체로 구성 또는 필수적으로 구성되는 경우), 또는 "바이파라토프성 VHH 컨스트럭트"(이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 VHH로 구성 또는 필수적으로 구성되는 경우)로도 기재될 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 있어서, 결합 분자 하나 또는 양자는 2가일 수 있다; 예를 들어, VEGF-결합 성분이 바이파라토프성이고 DLL4-결합 성분이 하나의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, VEGF-결합 성분이 하나의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이고 DLL4-결합 성분이 바이파라토프성일 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 있어서, 바람직한 것은, 2가의 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, 바이파라토프성 VHH를 함유하는 VEGF-결합 성분이다.
이러한 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 둘 이상의 VEGF-결합 VHH일 수 있는데, 이는
a. 재조합 인간 VEGF 및 재조합 인간 VEGFR-2의 상호작용을 60% 이상의 저해율로 차단할 수 있는 동일한 VHH, 또는
b. VEGF의 비-중첩 에피토프에 결합하는 서로 다른 VHH인데, 여기에서, 적어도 하나의 VHH는 재조합 인간 VEGF 및 재조합 인간 VEGFR-2의 상호작용을 60% 이상의 저해율로 차단할 수 있고, 적어도 하나의 VHH는 상기 상호작용을 60% 이하의 저해율로 차단할 수 있다.
60% 이하의 저해율로 상기 상호작용을 차단할 수 있는 VHH("비-수용체 차단" VHH)의 예는 서열 번호: 45 내지 47 및 표 33에 나열되어 있다; 이 유형의 바람직한 VHH는 서열 번호: 45에 나타난 서열을 갖는다. 인간 치료를 위한 이중 특이적 결합 분자의 성분으로서 바람직한 이 유형의 VHH는 서열 번호: 45, 특히 서열 번호: 65 및 66 및 표 61에 나타난 서열을 갖는 VHH의 서열-최적화된 변이체(variant)이고, 2가 VEGF-결합 VHH에서의 특히 바람직한 결합 파트너는 서열 번호: 67 (표 63)에 나타난 서열을 갖는다.
2가 항-VEGF VHH 컨스트럭트는 서열 번호: 48 내지 53 및 표 45에 예시되어 있다; 인간 치료를 위한 이중 특이적 결합 분자는 이들 VHH의 각 서열-최적화된 VHH를 함유할 것이다. 이중 특이적 결합 분자는 서열 번호: 68 내지 73 (표 66 및 도 39 참조) 및 서열 번호: 74 내지 80 (표 68 및 도 40 참조)에 예시되어 있다; 제시된 예들은 모체 및 친화력-성숙된 VHH를 빌딩 블록(building block)으로 함유한다; 인간 치료를 위한 이중 특이적 결합 분자는 이들 VHH의 각 서열-최적화된 변이를 함유할 것이다(서열 번호: 81 내지 89 및 도 48에 예시된 바와 같이).
본 발명의 바람직한 이중 특이적 결합 분자는
a) DLL4-결합 성분으로서 서열 번호: 35 또는 41의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 VHH, 및
b) VEGF-결합 성분으로서
ⅰ) 서열 번호: 64에 나타난 서열을 갖는 VHH 또는
ⅱ) 서열 번호: 64에 나타난 서열을 갖는 VHH 및 서열 번호: 67에 나타난 서열을 갖는 VHH를 포함하는 바이파라토프성 VHH를 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, VEGF-결합 성분는 N-말단에 위치한다.
EVQ로 시작하는 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 있어서, VHH의 N-말단 E는 D로 대체되거나(빈번하게는 서열-최적화의 결과) 누락될 수 있다(E. coli에서 발현되는 경우). 이는 보통 VHH가 N-말단에 위치하는 경우에만 해당된다. N-말단의 E가 누락된 이중 특이적 결합 분자의 예는 화합물 A1, A2 및 A3에 대한 도 48에 주어져 있다(서열 번호: 81 내지 83).
바람직한 구체예에 따라, 이중 특이적 결합 분자에 존재하는 결합 분자(DLL4-결합 성분 내의 DLL4-결합 분자 또는 VEGF-결합 성분 내의 VEGF-결합 분자 또는 두 개의 인접한 DLL4- 및 VEGF-결합 성분)는 서로 직접적으로(즉, 링커를 사용하지 않고) 또는 링커를 통하여 연결될 수 있다. 링커는 바람직하게는 링커 펩티드이고, 하나의 동일한 타겟 분자 또는 두 개의 서로 다른 타겟 내의 각각의 비-중첩 에피토프에 서로 다른 두 개의 결합 분자가 결합할 수 있도록 선택된다.
바이파라토프성 결합 분자의 경우, DLL4- 또는 VEGF-결합 성분 내의 링커는, 에피토프, 구체적으로는, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 결합하는 타겟의 에피토프간 거리에 따라 선택될 것이며, 이는 본 원의 개시에 기초하여, 몇 가지의 제한된 정도의 임의의 일상적 실험 이후에 당업자에게 명확해질 것이다.
두 결합 분자(두 VHH 또는 두 도메인 항체 또는 VHH 및 도메인 항체), 또는 두 결합 성분는 각각 추가의 VHH 또는 도메인 항체를 통하여 서로 연결될 수 있다(이러한 결합 분자에서, 둘 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 상기 추가의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 직접 또는 링커를 통하여 연결될 수 있다). 이러한 추가의 VHH 또는 도메인 항체는 예를 들어 증가된 반감기를 제공하는 VHH 또는 도메인 항체일 수 있다. (인간) 혈청 알부민 또는 (인간) 트랜스페린(transferrin)과 같은 (인간) 혈청 단백질에 결합할 수 있는, 이후 서술되는 VHH 또는 도메인 항체가 그 예이다.
또는, 각 타겟에 결합하는 2 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 연속하여(직접적으로, 아니면 적절한 링커를 통하여) 연결될 수 있고, 추가의 VHH 또는 도메인 항체(증가된 반감기를 제공할 수 있는)는, 이들 둘 이상의 상기 이뮤노글로불린 서열 중 하나에 직접 또는 링커를 통하여 연결될 수 있다.
적절한 링커는, 본 발명의 특정 폴리펩티드와 관련하여 본 원에서 설명되었으며, 비제한적인 예로는, 바람직하게는 9개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 약 20 내지 40 아미노산과 같이 적어도 17개의 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 상기 제한이 절대적이지는 않으며, 예를 들어 이러한 폴리펩티드의 생물약학적 생성물과 관련된 편의성을 고려하여 선택할 수 있다.
링커 서열은 자연 발생적인 서열 또는 비-자연발생적인 서열일 수 있다. 치료 목적으로 사용되는 경우, 링커는, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자가 투여되는 대상에 있어서 면역반응을 일으키지 않는 것이 바람직하다.
링커 서열 중 하나의 유용한 그룹은 WO 96/34103 및 WO 94/04678에서 설명된 바와 같은 중쇄 항체의 힌지(hinge) 부위로부터 유래된 링커들이다.
또 다른 예는 Ala-Ala-Ala와 같은 폴리-알라닌 링커 서열이다.
링커 서열의 바람직한 또 따른 예는 (Gly4Ser)3 , (Gly4Ger)4, (Gly4Ser), (Gly3Ser), Gly3, 및 (Gly3Ser2)3를 포함하는 (Glyxsery)z와 같은, 다른 길이의 Gly/Ser 링커이다.
링커의 몇 가지 비-제한적인 예는 도 40 및 48에 나타나 있으며, 예를 들어, 링커
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35 GS; 서열 번호: 90);
GGGGSGGGS (9 G; 서열 번호: 91);
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (40 GS; 서열 번호: 92) 등이다.
이중 특이적 결합 분자가 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티의 부착에 의해 변형되는 경우, 링커 서열은 바람직하게는 시스테인 또는 라이신과 같은 아미노산 잔기를 포함하는데, 이는 링커 부위에서, 예를 들어, 페길화(PEGylation)와 같은 변형을 가능하게 한다.
페길화에 유용한 링커의 예는 다음과 같다:
GGGGCGGGS ("GS9,C5", 서열 번호: 93)
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS25,C5", 서열 번호: 94)
GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG ("GS27,C14", 서열 번호: 95),
GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35,C15", 서열 번호: 96), 및
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35,C5", 서열 번호:97).
또한, 링커는, 예를 들어, WO 04/081026에 나타난 바와 같은 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티일 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은, 추가의 상기 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인일 수 있는 또 다른 폴리펩티드와 같은 모이어티(선택적으로 하나 또는 두 링커를 통해)를 통해 서로 연결되어 있다. 이러한 모이어티는 필수적으로 불활성이거나 아니면 폴리펩티드의 바람직한 특성을 개선하거나 폴리펩티드에 하나 이상의 추가의 바람직한 특성을 부여하는 등의 생물학적 효과를 보유할 수 있다. 비제한적인 예로, 모이어티는 단백질 또는 폴리펩티드의 반감기를 연장하고 또는 (and/or) 그것의 면역원성을 감소시키거나 기타 바람직한 특성을 개선할 수 있다.
바람직한 구체예에 따라, 특히 치료제로서 사용될 목적이거나 사용되는 경우, 본 발명의 이중 특이적 결합분자는, 환자의 혈청 또는 기타 체액에서 본 발명의 폴리펩티드의 반감기를 연장하는 모이어티를 포함한다. 용어 "반감기"는, 예를 들어, 자연적 기작에 의한 폴리펩티드의 분해 및/또는 제거 및/또는 격리로 인해 (변형된) 폴리펩티드의 혈청 농도가 생체 내에서 반으로 감소하는데 걸리는 시간으로 정의된다.
더 구체적으로, 이러한 반감기 연장 모이어티는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 공유결합 또는 융합될 수 있으며, 비제한적으로 Fc 부분, 알부민 모이어티, 알부민 모이어티의 단편, 항-알부민 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인과 같은 알부민 결합 모이어티, 항-트랜스페린 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인과 같은 트랜스페린 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자와 같은 폴리옥시알킬렌 분자, 알부민 결합 펩티드 또는 하이드록시에틸 전분 (HES) 유도체일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는, 혈청 알부민, 혈청 이뮤노글로불린, 티록신-결합 단백질, 피브리노겐 또는 트랜스페린과 같이 혈액 내에서 발견되는 항원에 결합하는 모이어티를 포함하여, 생체 내에서 본 발명의 결과로 생긴 폴리펩티드의 반감기를 연장시킨다. 특히 바람직한 구체예에 따라, 이러한 모이어티는 알부민-결합 이뮤노글로불린이며, 더 바람직하게는 알부민-결합 VHH 도메인과 같은 알부민-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이다.
인간에서 사용하려는 경우, 이러한 알부민-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게는 인간 혈청 알부민에 결합하고 바람직하게는 인간화된 알부민-결합 VHH 도메인이다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, WO 2006/122786에 더 상세하게 설명되어 있다. 특히, 유용한 알부민 결합 VHH는 ALB 1 및 그의 인간화된 등가물(counterpart), ALB 8(WO 2009/095489)이다. 그러나 상기 특허에서 언급된 기타 알부민 결합 VHH 도메인 역시 사용될 수 있다.
특히 유용한 알부민 결합 VHH 도메인은 서열 번호: 98에 나타난 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 ALB 8이다.
본 발명의 추가적인 구체예에 따라, 두 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 특히 VHH는, 예를 들어, WO 01/79271 및 WO 03/59934에서 설명된 바와 같이 혈청 알부민 분자에 융합될 수 있다. 예를 들어, WO 01/79271에서 설명된 바와 같이, 융합 단백질은 통상적인 재조합 기술에 의해 얻어질 수 있다: 혈청 알부민, 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 분자를 VEGF-결합 분자를 코딩하는 DNA에 결합시키고, 선택된 숙주 세포, 예를 들어 Pichia pastoris와 같은 효모 세포 또는 박테리아 세포에서 수득한 컨스트럭트를 발현에 적당한 플라스미드에 삽입하여, 융합된 뉴클레오티드 서열을 그 숙주 세포에 형질도입하고(transfect) 적당한 조건에서 배양한다. 유용한 HSA의 서열은 서열 번호: 99에 나타나 있다.
또 다른 구체예에 따라, 반감기를 연장하는 본 발명의 변형(이러한 변형은 또한 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킴)은 약물동태학적으로 수용가능한 적절한 폴리머, 예를 들어 선형 또는 분기형 사슬의 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 이의 유도체(예를 들어, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 해당 기술 분야에서 항체 및 항체 단편(비제한적인 예로 도메인 항체 및 scFv를 포함)에 대하여 사용되는 페길화와 같이, 모든 적절한 페길화 형태가 사용될 수 있다; 참고 문헌으로는, 예를 들어, 「Champman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002)」; 「Veronese 및 Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003)」; 「Harris 및 Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003)」; 및 WO 04/060965가 이용되었다.
폴리펩티드의 페길화를 위한 다양한 시약은 시판되고 있는데, Nektar Therapeutics, USA, 또는 NOF Corporation, Japan의 Sunbright® EA 시리즈, SH 시리즈, MA 시리즈, CA 시리즈, 및 Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, 및 Sunbright® ME-400MA와 같은 ME 시리즈가 그 예이다.
바람직하게는, 특히 시스테인 잔기를 통하여 특정 부위의(site-directed) 페길화가 사용된다(예를 들어, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003) 참조). 예를 들어, 이러한 목적 하에, PEG는 본 발명의 폴리펩티드의 자연 발생하는 시스테인 잔기에 부착되거나, 본 발명의 폴리펩티드가 PEG가 부착될 하나 이상의 시스테인 잔기를 적절히 도입하도록 변형되거나, 또는 PEG가 부착될 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 본 발명의 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다. 단백질을 엔지니어링 하기 위해 사용되는 모든 기술은 당업자에게 그 자체로 알려져 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 경우에 있어서, 10 kDa 이상과 같이 5 kDa 이상, 100 kDa 이하와 같이 200 kDa 이하; 예를 들어, 20 kDa 내지 80 kDa 범위의 분자량을 갖는 PEG가 사용된다.
페길화와 관련하여, 일반적으로 본 발명이 하나 이상의 아미노산 위치에서 페길화된 어떠한 이중 특이적 결합 분자도 포함한다는 점, 바람직하게는 (1) 생체 내에서 반감기를 연장하고; (2) 면역원성을 감소시키며; (3) 페길화 자체가 갖는 하나 이상의 추가의 이로운 특성을 제공하고; (4) 폴리펩티드의 타겟에 대한 친화력에 기본적으로 영향을 미치지 않으며; 및/또는 (4) 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 모든 기타 바람직한 특성에 영향을 미치지 않는 식으로 페길화된 분자를 포함한다는 점을 주목하여야 한다. 적절한 PEG 그룹 및 이를 특이적으로 또는 비-특이적으로 부착하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 폴리펩티드의 페길화를 위한 다양한 시약 역시 시판되고 있는데, Nektar Therapeutics, USA, 또는 NOF Corporation, Japan의 Sunbright® EA 시리즈, SH 시리즈, MA 시리즈, CA 시리즈, 및 Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, 및 Sunbright® ME-400MA와 같은 ME 시리즈가 그 예이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 페길화된 폴리펩티드는 40 kDa 또는 60 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEG의 PEG 모이어티 하나를 포함하는데, 여기에서, PEG 모이어티는 링커 부위, 특히, 서열 번호: 93에 나타난 GS9-링커 펩티드의 위치 5, 서열 번호: 95에 나타난 GS27-링커 펩티드의 위치 14, 서열 번호: 96에 나타난 GS35-링커 펩티드의 위치 15, 또는 서열 번호: 97에 나타난 35GS-링커 펩티드의 위치 5의 Cys 잔기에서 폴리펩티드에 부착된다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 상기된 바와 같은 하나의 PEG 시약, 예를 들어, 하기 화학식으로 표시되는 "Sunbright® ME-400MA"으로 페길화될 수 있다:
Figure pct00001
링커 및/또는 반감기를 연장하는 기능성 그룹은 서열 번호: 81 및 도 48에 나타나 있다.
또 다른 구체예에 따라, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은, 본 원에서 정의된 바와 같은 도메인 항체이다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 존재하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 또한 "카멜화된", 즉, 통상적인 4-쇄 항체 유래의 자연 발생적인 가변 중쇄의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인의 대응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 자연 발생적인 VH 도메인의 아미노산 서열에 대응하는 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 존재하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 "카멜화된", 자연 발생적인 VH 도메인의 아미노산 서열에 대응하는 서열을 가질 수 있는데, 상기 카멜화는 통상적인 4-쇄 항체의 자연 발생적인 가변 사슬의 아미노산 서열에 있어서의 하나 이상의 아미노산 잔기를, 중쇄 항체의 VHH 도메인의 대응 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 이루어진다. 이는 그 자체로 알려진 방식으로 수행될 수 있고, 당업자에게 자명할 것이며, WO 94/04678를 추가로 참고할 수 있다. 이러한 카멜화는 바람직하게는 VH-VL 인터페이스 및 소위 카멜리데 홀마크(Camelidae Hallmark) 잔기에 존재하는 아미노산 위치에서 일어난다(예를 들어, WO 94/04678 참조). 이러한 "인간화" 및 "카멜화" 기술 및 이에 상응하는 바람직한 골격 부위에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, WO 2006/040153의 46쪽 및 98쪽 및 WO 2006/122786의 107쪽로부터 추가로 얻을 수 있다.
결합 분자는 DLL4 또는 VEGF 각각에 대한 특이성을 갖는데, 여기에서 결합 분자는 각각의 DLL4 분자 또는 VEGF 분자 내에서 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다.
항원 DLL4 또는 VEGF에 대한 결합 분자의 특이적 결합은 그 자체로 알려진 어떠한 적절한 방식으로도 판정될 수 있는데, 예를 들어, 본 원에서 설명된 분석법인 스캐차드(Scatchard) 분석 및/또는 방사선면역분석(RIA), 효소 면역분석(EIA 및 ELISA) 및 샌드위치 경합 분석(sandwich competition assay)과 같은 경합적 결합 분석, 및 해당 기술 분야에서 그 자체로 알려진 이들의 다른 변형들을 포함한다.
항원 DLL4 또는 VEGF 각각에 관하여, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 종 특이적이지 않다. 그러므로, 인간의 치료 목적인 경우, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게는 인간 DLL4 또는 인간 VEGF 각각에 결합한다. 그러나, 기타 포유류 종에서 유래된 각각의 DLL4 또는 VEGF 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또한 본 발명의 범위 내에 있다. DLL4 또는 VEGF의 한 종의 형태에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 기타 종으로부터의 각각의 항원에 교차-반응할 수 있다. 예를 들어, 인간 항원에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 기타 영장류 종 유래의 각각의 항원 및/또는 질병에 대한 동물 모델, 예를 들어 원숭이(특히 사이몰구스(Cynomolgus) 또는 레서스(Rhesus)) 및 특히 DLL4의 저해에 의해 조절될 수 있는 질병 또는 장애에 대한 동물 모델(본 원에서 언급된 종 및 동물 모델과 같은)에서 사용되는 하나 이상의 동물 종 유래의 항원과 교차 반응성을 나타낸다. 이러한 교차-반응성을 나타내는 본 발명의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 연구 및/또는 약 개발에 유리한데, 왜냐하면 그것은 원숭이, 특히 사이몰구스 또는 레서스, 또는 마우스 및 쥐와 같이 승인된 질병 모델에서 본 발명의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인으로 테스트가 가능하기 때문이다.
또한, 결합 분자는 그들이 직접 향해진 항원의 특정 도메인 또는 항원 결정인자(antigenic determinant)에 제한되거나 이들에 의해 정의되지 않는다. 바람직하게는, 치료적 DLL4/VEGF 길항제의 개발 과정에서 동물 모델로서 사용되기 위한 인간 이외의 종에서 유래된 하나 이상의 항원 분자와의 교차-반응성의 관점에서, 결합 분자는, 인간 항원과 높은 정도의 동일성을 갖는 각 항원 부위의 에피토프를 인식한다. 예로써, 동물 모델의 관점에서, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 함유된 항-DLL4 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은, 전체적으로 또는 부분적으로 인간 및 마우스 간에 높은 동일성을 나타내는 DLL4의 EGF-2 도메인 내에 위치하는 에피토프를 인식한다.
그러므로, 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는, 서열 번호: 101의 아미노산 잔기 252-282에 대응하는 EGF-2 도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 함유된 에피토프에 결합하는 그룹으로부터 선택되는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인인 DLL4-결합 분자를 포함한다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자가, 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 바이파라토프성 DLL4-결합 분자를 포함하는 경우, 적어도 하나의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 성분는 상기 정의된 바와 같이 EGF-2 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, VEGF-결합 성분는 VEGF 이소폼인 VEGF165 및/또는 VEGF121에 결합한다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 성분인 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 500 nM 이하, 바람직하게는 200 nM 이하, 더 바람직하게는 500 pM 이하와 같이 10 nM 이하의 친화도로 DLL4 또는 VEGF에 각각 결합한다(시험예 5.7에 설명된 바와 같이 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 분석에 의해 판정).
바람직하게는, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 함유된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 실시예 5.1.에 설명된 바와 같이 경합적 ELISA (competition ELISA) 분석으로 측정된 IC50 값을, 10-6 내지 10-10 몰/리터 이하, 더 바람직하게는 10-8 내지 10-10 몰/리터 이하 및 훨씬 더 바람직하게는 10-9 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위에서 갖는다.
본 발명의 비제한적이나 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자에 함유된 DLL4- 또는 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 DLL4 또는 VEGF에 각각 10-5 내지 10-12 몰/리터 (M) 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 (M) 이하 및 더 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터 (M)의 해리 상수(KD), 및/또는 적어도 107 M-1, 바람직하게는 적어도 108 M-1, 더 바람직하게는 적어도 1012 M-1과 같이 적어도 109 M-1의 결합 상수(KA)로 결합하며; 특히 500 nM 이하, 바람직하게는 200 nM 이하, 더 바람직하게는 500 pM 이하와 같이 10 nM 이하의 KD로 결합한다. DLL4에 대한 본 발명의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 KD 및 KA는 측정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중 특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 또한 본 원에서 "본 발명의 핵산"으로 기재될 것이며 또한 본 원에서 정의된 바와 같은 유전자 컨스트럭트(genetic construct)의 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명의 핵산은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA (사용될 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현을 위해 특별히 개조된 코돈 사용빈도(codon usage)를 갖는 DNA와 같은)일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에 따라, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같이 특별히 분리된 형태로 존재한다.
또한 본 발명의 핵산은, 예를 들어 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 YAC과 같은 벡터의 형태, 벡터 내 및/또는 그 부분으로 존재할 수 있다. 벡터는 특히 발현 벡터, 즉, 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내에서 (즉, 적절한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서) DLL4-결합 분자를 발현할 수 있는 벡터일 수 있다. 일반적으로 이러한 발현 벡터는, 프로모터, 인핸서(enhancer), 터미네이터 등과 같은, 하나 이상의 적절한 조절 인자(regulatory element)에 작동가능하게 연결된(linked), 적어도 하나의 본 발명의 핵산을 포함한다. 특정 숙주에서 특정 서열을 발현시키는 것과 관련하여, 이러한 인자 및 그 선택은 당업자에게 상식적인 것이다. 본 발명의 DLL4-결합 분자의 발현에 유용하고도 필요한 조절 인자 및 기타 인자의 특정 예는, 예를 들어, WO 2006/040153의 131쪽 내지 133쪽에 개시되어 있다.
본 발명의 핵산은, 본 원에서 주어진 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여, 그 자체로 알려진 방법(예를 들어, 자동화된 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술)으로 제조 또는 얻을 수 있고 또는 (and/or) 적당한 자연적 공급원으로부터 분리될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 하나 이상의 이중 특이적 결합 분자를 발현하거나 발현할 수 있고; 또는 (and/or) 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에 따라, 상기 숙주 세포는 박테이아 세포이고; 기타 유용한 세포는 효소 세포, 진균 세포 또는 포유 동물 세포이다.
적절한 박세리아 세포는, Escherichia coli, Proteus, 및 Pseudomonas 균주와 같은 그람-음성 박테리아 균주(strain), 및 Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, 및 Lactococcus 균주와 같은 그람-양성 박테리아 균주 유래 세포를 포함한다. 적절한 진균 세포는 Trichoderma, Neurospora, 및 Aspergillus 종 유래 세포를 포함한다. 적절한 효모 세포는 Saccharomyces (예를 들어, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (예를 들어, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (예를 들어, Pichia pastoris 및 Pichia methanolica), 및 Hansenula 종 유래의 세포를 포함한다.
적절한 포유동물 세포는, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종유래(hetorologous) 단백질의 발현을 위해 해당 기술 분야에서 사용되는 기타 세포 역시 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 일반적으로
- 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 발현이 가능한 조건 하에 이중 특이적 결합 분자를 인코딩할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
- 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 배양액으로부터 회수 및 분리하는 단계; 및
- 선택적으로, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자를 추가로 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계를 포함한다.
산업적 규모의 생산을 위하여, 바람직한 숙주 유기체는, 대규모 발현, 생산 및 발효, 특히 대규모의 약학적 발현, 생산 및 발효에 적당한 E. coli, Pichia pastoris, 및 S. cerevisiase 균주를 포함한다.
특정 발현 시스템의 선택은 부분적으로는 특정 번역-후 변형, 더 구체적으로는 글리코실화(glycosylation)의 요구에 의존한다. 글리코실화가 바람직하거나 요구되는 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 생산은 발현 단백질을 글리코실화할 수 있는 포유동물 발현 숙주의 사용을 필요로 할 것이다. 이런 관점에서, 수득된 글리코실화 패턴(즉, 부착된 잔기의 종류, 수 및 위치)은 발현에 사용된 세포 또는 세포주(cell line)에 의존할 것이라는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 상기 제시된 세포 내에서 (예를 들어, 세포질, 주변세포질 또는 봉입체(inclusion body)에서) 생산되고 숙주세포로부터 분리한 후 임의로 추가 정제될 수 있거나; 아니면 세포 외에서 (예를 들어, 숙주 세포가 배양된 배지에서) 생산되고 배양 배지로부터 분리한 후 임의로 추가 정제될 수 있다.
적절한 특정 발현 벡터와 같은, 폴리펩티드의 재조합 생산에 사용되는 방법 및 시약, 형질 전환 또는 형질 도입 방법, 선발 마커(selection marker), 단백질 발현의 유도 방법, 배양 조건 등은 해당 기술 분야에 알려져 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 있어서 유용한 단백질 분리 및 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 내지 166, 서열 번호: 333 내지 353, 또는 서열 번호: 375 내지 395 각각에 나타난 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 및 그를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
상기 펩티드는 본 발명의 VHH로부터 유래된 CDR3에 해당한다. 이들, 특히 이들을 인코딩하는 핵산 분자는 이뮤노글로불린 사슬의 CDR3을 대체하기 위한 CDR 그래프팅에 유용하거나, 또는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드, 예를 들어, 프로테아제 저해제, DNA-결합 단백질, 시토크롬 b562, 나선-다발(helix-bundle) 단백질, 이황화-결합된 펩티드, 리포칼린 또는 안티칼린으로 삽입하는데 유용하므로, 이러한 스캐폴드에 타겟-결합 특성을 부여한다. CDR-그래프팅 방법은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, (보통 설치류 항체로부터 인간 항체의 Fv 골격 부위로의 CDR 그래프팅을 포함하는) 인간화 항체에 널리 사용되어 왔다.
본 발명의 CDR3을 포함하는 이뮤노글로불린 또는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드는, 이러한 분자를 인코딩하는 DNA를 분자생물학의 표준적인 방법, 예를 들어, 「Daugherty et al., 1991, Nucleic Acids Research, Vol. 19, 9, 2471 - 2476」에서 설명된 바와 같은, 유전자 합성, 올리고뉴클레오티드 어닐링(annealing) 또는 중첩(overlapping) PCR 단편에 의하여 얻을 수 있다. VHH CDR3을 비-이뮤노글로불린 스캐폴드로 삽입하는 방법은 「Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13, 1882 - 1891」에서 설명되었다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자를 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물, 및 조성물의 사용 목적에 따라 그 자체로 알려진 하나 이상의 임의적 추가 성분에 관한 것이다.
약학적 용도를 위해, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자 또는 그를 포함하는 폴리펩티드는, 본 발명의 적어도 하나의 이중 특이적 결합 분자 및 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 운반체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제(adjuvant), 및 임의적으로 하나 이상의 추가의 약학적 활성 플리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학적 조제물 또는 조성물로 제조될 수 있다. 비-제한적 예로써, 이러한 제제는 경구 투여, 비 경구 투여(parental administraion)(정맥, 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입과 같은), 국소 투여, 흡입에 의한 투여, 피부 패치(patch), 이식, 좌약에 의한 투여에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 적합한 형태-투여 방식에 따라 고체, 반-고체 또는 액체-뿐만 아니라 이의 제조에 사용되는 방법 및 운반체는 당업자에게 자명하며 본 원에서 추가로 설명되어 있다.
그러므로, 추가적인 측면에 있어서, 본 발명은, 적어도 하나의 이중 특이적 결합 분자, 특히 본 발명의 하나의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 그를 포함하는 폴리펩티드 및 적어도 하나의 적절한 운반체, 희석제, 또는 부형제(즉, 약학적 사용에 적합한), 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 그 자체로 알려진 어떠한 적절한 방법으로도 제조될 수 있으며 투여될 수 있다: 특히, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 경우, 예를 들어, WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 및 WO 08/020079뿐만 아니라, 「Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)」, 「Remington, the Science and Practice of Pharmarcy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)」와 같은 표준적인 안내서; 또는 「Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (예를 들어, 252-255 페이지 참조)」를 참고문헌으로 사용하였다.
예를 들어, 본 발명의 이뮤노글로불린단일 가변 도메인은 통상적인 항체 및 항체 단편(scFv 및 이중항체) 및 기타 약학적으로 활성인 단백질에 대해 그 자체로 알려진 방식으로 제조 및 투여될 수 있다. 동일한 것의 제조에 대한 이러한 제제 및 방법은 당업자에게 자명할 것이며, 예를 들어, 비 경구 투여(예를 들어, 정맥, 복강 내, 피하, 근육 내, 관내(intraluminal), 동맥 내(intra-arterial) 또는 경막내(intrathecal) 투여) 또는 국소 투여(즉, 경피(transdermal)에 적절한 제조를 포함한다.
비 경구 투여를 위한 제재는, 예를 들어, 주입 또는 주사에 적합한 살균 용액, 서스펜션, 분산액 또는 에멀전일 수 있다. 이러한 제재에 적합한 운반체 또는 희석제의 비제한적인 예는, 살균수 및 생리학적 인산완충식염수(phosphate-buffered saline)와 같은 약학적으로 수용가능한 수성 버퍼 및 용액, 링거액, 덱스트로즈 용액, 및 행크용액(Hank's solution); 수유(water oil); 글리세롤; 에탄올; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜 또는 그 뿐만 아니라 광유(mineral oil), 동물성 기름 및 식물성 기름, 예를 들어, 땅콩 기름, 콩기름, 뿐만 아니라 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 보통 수성 용액 또는 서스펜션이 바람직할 것이다.
그러므로, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 전신에 투여될 수 있는데, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화성 식용 운반체(assimilable edible carrier)와 같이 약학적으로 수용가능한 운반체와 함께 경구 투여될 수 있다. 치료적 경구 투여의 경우, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 하나 이상의 부형제와 결합하여 존재할 수 있으며 섭취가능한 정(tablet), 구강정(buccal tablet), 트로키제(troche), 캡슐, 엘릭시르제(elixir), 서스펜션, 시럽, 박판(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제재는 본 발명의 이중 특이적 결합 분자를 적어도 0.1% 함유하여야 한다. 물론 조성물 및 제재에서 이들의 백분율은 가변적이며 해당 단위 수량 형태 중량의 약 2 내지 60% 내로 적정하게 존재할 수 있다. 치료적으로 유용한 이러한 조성물에 있어서 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 양은 수득될 유효용량 수준이다.
정, 알약, 캡슐 등은 또한, 예를 들어 WO 08/020079의 143-144 쪽에 언급된 것과 같이, 결합제, 부형제, 붕괴제(disintegrating agent), 윤활제 및 감미제 또는 향미료를 포함할 수 있다. 단위수량 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에도 식물성 기름 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 운반체를 함유할 수 있다. 기타 다양한 물질이 피복 또는 이와 달리 고체 단위수량 형태의 물리적 상태를 변경하기 위하여 존재할 수 있다. 예를 들어, 정, 알약, 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락(shellac) 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르제는 본 발명의 이중 특이적 결합 분자, 감미제로 설탕 또는 과당, 보존제로 메틸 및 프로필파라벤(propylparaben), 색소 및 체리 또는 오렌지 맛과 같은 향료를 포함한다. 물론, 모든 단위 수량 형태의 제조에서 사용되는 어떠한 물질이건 약학적으로 수용가능한 것이어야 하고 이용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 지효성 제재 및 장치로 편입될 수 있다.
또한, 경구 투여를 위한 제제는 본 발명의 컨스트럭트가 위의 환경을 견디고 장으로 통과할 수 있게 하는 장용 피복(enteric coating)으로 제공될 수 있다. 더 일반적으로, 경구 투여를 위한 제제는 위장관(gastrointestinal tract)의 원하는 특정 부분으로 전달되기 위해 적절히 제조될 수 있다. 또한, 적당한 좌약이 위장관으로의 전달을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는, WO 08/020079의 144 및 145 쪽에 추가로 설명된 바와 같이, 주입 또는 주사에 의해 정맥 또는 복강내로 투여될 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 국부 투여의 경우, 일반적으로, WO 08/020079의 145 쪽에 추가로 설명된 바와 같이, 고체 또는 액체로 존재할 수 있는, 피부과적으로 수용가능한 운반체와 함께, 조성물 또는 제제로서 피부에 이들을 투여하는 것이 바람직할 것이다.
일반적으로, 로션과 같은 액체 조성물에서 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 농도는 약 0.1 내지 25 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 10 중량%로 존재할 것이다. 젤 또는 파우더와 같은 반고체 또는 고체 조성물에서의 농도는 약 0.1 내지 5 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5 중량%일 것이다.
치료용으로 요구되는 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 양은 선택된 특정 이중 특이적 결합 분자뿐만 아니라, 투여 경로, 치료 상태의 유형 및 환자의 나이 및 상태에 따라 가변적이며 최종적으로 수행 의사 또는 임상의의 재량에 의할 것이다. 또한, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 용량은 타겟 세포, 종양, 조직, 이식편(graft), 또는 기관에 따라 가변적이다.
원하는 용량은 일회량 또는 분복량(divided dose), 예를 들어, 하루에 두 번, 세 번, 네 번 또는 이상의 서브 용량(sub-dose)으로 적정 간격하에 편리하게 투여될 수 있다. 서브 용량 자체는, 예를 들어, 불연속적인 다수의 일정하지 않은 간격의 투여; 취입기(insufflator)로부터 중복 흡입 또는 눈으로의 다수의 점적에 의해 더 분할될 수 있다.
투여 계획(administration regimen)은 장기, 일일 처리를 포함한다. "장기"는 적어도 2주, 바람직하게는, 여러 주, 달, 또는 년의 지속기간을 의미한다. 이러한 용량의 필요한 변경은, 본 원에서 주어진 교시에 따른 일상적인 실험만으로 당업자에 의해 판정될 수 있다. 「Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA」를 참고할 수 있다. 또한 합병증의 경우 용량은 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
추가의 구체예에 따라, 본 발명은 이중 특이적 결합 분자, 예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드의,
- 혈관형성에 대한 DLL4-매개 효과와 관련되거나 DLL4-결합 분자로 Notch(Notch) 시그널링 경로를 조절함으로써 예방, 치료 또는 경감될 수 있는, 인간에서의 장애, 질병 또는 상태의 예방, 치료 및/또는 경감;
- 본 발명의 적어도 하나의 이중 특이적 결합 분자, 예를 들어 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 또는 그를 함유하는 약학적 조성물을, 약학적 유효량으로 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이러한 치료, 이러한 방법을 필요로 하는 환자의 치료 방법;
- 혈관 형성에 대한 DLL4-매개 효과와 관련된 장애, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 경감을 위한 약제의 제조;
- 상기 목적을 위해 사용되는, 약학적 조성물 또는 약제에서의 활성 성분과 같은, 치료 목적으로서의 용도에 관한 것이다.
특정 측면에 따라, 상기 장애, 질병 또는 상태는 본 원에서 정의된 바와 같은, 암 또는 암성 질병이다.
또 다른 측면에 따라, 질병은 혈관형성에 대한 DLL4-매개 효과와 관련되거나 DLL4-결합 분자로 Notch 시그널링 경로를 조절함으로써 치료 또는 경감될 수 있는 눈 질병이다.
치료되어야 할 암성 질병에 따라, 본 발명의 이중 특이적 결합 분자는 단독으로 또는, 특히 DNA 손상제와 같은 화학요법제(chemotherapeutic agent) 또는 혈관 형성, 신호전달경로 또는 암 세포에서의 유사분열의 점검점(mitotic checkpoint)을 저해하는 치료적으로 활성인 화합물로부터 선택되는, 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 사용될 수 있다.
추가적인 치료제는, 상기 약제의 임의적 성분으로서, 동시에, 또는 이중 특이적 결합 분자의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 추가적인 치료제는, 비제한적인(수용체의 경우, 각 리간드를 포함하여) 저해제 그룹인 EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK 및 PI3 키나아제, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R 또는 IR으로부터 선택된 하나 이상의 저해제일 수 있다.
추가적인 치료제의 또 다른 예는 CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, 헷지혹(hedgehog) 길항제의 저해제, JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, 프로테오솜, Rho의 저해제, wnt 시그널링의 저해제 또는 유비퀴틴화(ubiquitination) 경로의 저해제 또는 기타 Notch 시그널링 경로의 저해제이다.
Aurora 저해제의 비제한적인 예는, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735이다.
PLK 저해제의 예는 GSK-461364이다.
raf 저해제의 예는 BAY-73-4506 (또한 VEGFR 저해제), PLX 4032, RAF-265 (또한 VEGFR 저해제), 소라페닙(sorafenib; 또한 VEGFR), 및 XL 281이다.
KSP 저해제의 예는 이스피네닙(ispinesib), ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, 및 SB-743921이다.
src 및/또는 bcr-abl 저해제의 예는 다사티닙(dasatinib), AZD-0530, 보수티닙(sutinib), XL 228 (또한 IGF-1R 저해제), 닐로티닙(nilotinib; 또한 PDGFR 및 cKit 저해제), 이마티닙(imatinib; 또한 cKit 저해제), 및 NS-187이다.
PDK1 저해제의 예는 BX-517이다.
Rho 저해제의 예는 BA-210이다.
PI3 키나아제 저해제의 예는 PX-866, BEZ-235 (또한 mTor 저해제), XL 418 (또한 Akt 저해제), XL-417, 및 XL 765 (또한 mTor 저해제)이다.
cMet 또는 HGF의 저해제에 대한 예는 XL-184 (또한 VEGFR, cKit, Flt3의 저해제), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (또한 VEGFR의 저해제), MGCD-265 (또한 VEGFR, Ron, Tie2의 저해제), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, 및 AV-299이다.
c-Myc 저해제에 대한 예는 CX-3543이다.
Flt3 저해제에 대한 예는 AC-220 (또한 cKit 및 PDGFR의 저해제), KW 2449, 레스타우르티닙(lestaurtinib; 또한 VEGFR, PDGFR, PKC의 저해제), TG-101348 (또한 JAK2의 저해제), XL-999 (또한 cKit, FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제), 수니티닙(sunitinib; 또한 PDGFR, VEGFR 및 cKit의 저해제), 및 탄두티닙(tandutinib; 또한 PDGFR, 및 cKit의 저해제)이다.
HSP 90 저해제의 예는 타네스피마이신(tanespimycin), 알베스피마이신(alvespimycin), IPI-504 및 CNF 2024이다.
JAK/STAT 저해제의 예는 CYT-997 (또한 튜불린과 상호작용), TG 101348 (또한 Flt3의 저해제), 및 XL-109이다.
Mek 저해제의 예는 ARRY-142866, PD-325901, AZD-8330, 및 XL 518이다.
mTor 저해제에 대한 예는 템시로리무스(temsirolimus), AP-23573 (또한 VEGF 저해제로서 작용), 에베롤리무스(everolimus; 또한 VEGF 저해제), XL-765 (또한 PI3 키나아제 저해제), 및 BEZ-235 (또한 PI3 키나아제 저해제)이다.
Akt 저해제에 대한 예는 페리포신(perifosine), GSK-690693, RX-0201, 및 트리시빈(tricibine)이다.
cKit 저해제에 대한 예는 AB-1010, OSI-930 (또한 VEGFR 저해제로서 작용), AC-220 (또한 Flt3 및 PDGFR의 저해제), 탄투티닙 (또한 Flt3 및 PDGFR의 저해제), 악시티닙(axitinib; VEGFR 및 PDGFR의 저해제), XL-999 (또한 Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR의 저해제), 수니티닙 (또한 Flt3, PDGFR, VEGFR의 저해제), 및 XL-820 (또한 VEGFR- 및 PDGFR 저해제로서 작용), 이마티닙 (또한 bcr-abl 저해제), 닐로티닙 (또한 bcr-abl 및 PDGFR의 저해제)이다.
헷지혹 길항제의 예는 IPI-609 및 CUR-61414이다.
CDK 저해제의 예는 셀리시슬립(seliciclib), AT-7519, P-276, ZK-CDK (또한 VEGFR2 및 PDGFR를 저해), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509, 및 AG 024322.
프로테오솜 저해제의 예는 보르테조밉(bortezomib), 카르필조밉(carfilzomib), 및 NPI-0052 (또한, NFkappaB의 저해제)이다.
NFkappaB 경로 저해제의 예는 NPI-0052이다.
유비퀴틴화 경로 저해제에 대한 예는 HBX-41108이다.
바람직한 구체예에서, 추가의 치료제는 항-혈관형성제이다.
항-혈관형성제에 대한 예는 FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제 또는 각각의 리간드 (예를 들어, 페갑타닙(pegaptanib) 또는 항-VEGF 항체 베바시주맵(bevacizumab)와 같은 VEGF 저해제), 및 베바시주맵, 모테사닙(motesanib), CDP-791, SU 14813, 텔라티닙(telatinib), KRN-951, ZK-CDK (또한 CDK의 저해제), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (면역조절약), 탈리도미드 유도체 CC-4047, 레날리도미드, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, 브리바닙(brivanib), 세디라닙(cediranib), XL-999 (또한 cKit 및 Flt3의 저해제), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (또한 Flt3의 저해제), 수니티닙 (또한 cKit 및 Flt3의 저해제), 악시티닙 (또한 cKit의 저해제), 레스타우르티닙 (또한 Flt3 및 PKC의 저해제), 바탈라닙(vatalanib), 탄두티닙 (또한 Flt3 및 cKit의 저해제), 파조파닙(pazopanib), GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, 소라페닙 토실레이트 (또한 Raf의 저해제), RAF-265 (또한 Raf의 저해제), 반데타닙(vandetanib), CP-547632, OSI-930, AEE-788 (또한 EGFR 및 Her2의 저해제), BAY-57-9352 (또한 Raf의 저해제), BAY-73-4506 (또한 Raf의 저해제), XL 880 (또한 cMet의 저해제), XL 647 (또한 EGFR 및 EphB4의 저해제), XL 820 (또한 cKit의 저해제), 및 닐로티닙 (또한 cKit 및 brc-abl의 저해제)으로부터 비제한적으로 선택되는 물질과 같은 탈리도미드(thalidomide)이다.
또한, 추가적인 치료제는 EGFR 저해제들로부터 선택될 수 있으며, 이는 작은 분자의 EGFR 저해제 또는 항-EGFR 항체일 수 있다. 항-EGFR 항체의 비제한적인 예는, 세툭시맵(cetuximab), 파니투무맵(panitumumab), 마투주맵(matuzumab)이고; 작은 분자의 EGFR 저해제에 대한 예는 게피티닙(gefitinib)이다. EGFR 조절인자에 대한 예는 EGF 융합 독소이다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자와의 조합에 유용한 EGFR 및 Her2 저해제중에는 라파티닙(lapatinib), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 세툭시맵(cetuximab), 트라스투주맵(trastuzumab), 니모투주맵(nimotuzumab), 잘루투무맵(zalutumumab), 반데타닙(vandetanib; 또한 VEGFR의 저해제), 페르투주맵(pertuzumab), XL 647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ 26483327, AEE-788 (또한 VEGFR의 저해제), ARRY-333786, IMC-11F8, 제맵(Zemab)이 있다.
치료에 있어서 본 발명의 이중 특이적 결합 분자와 결합될 수 있는 기타 물질은 토시투무맵(tositumumab) 및 이브리투모맵 티우제탄(ibritumomab tiuxetan; 두 개의 방사능 표지된 항-CD20 항체), 알렘투주맵(alemtuzumab; 항-CD52 항체), 데노수맵(denosumab; 파골세포 분화 인자 리간드 저해제), 갈릭시맵(galiximab; CD80 길항제), 오파투무맵(ofatumumab; CD20 저해제), 자놀리무맵(zanolimumab; CD4 길항제), SGN40 (CD40 리간드 수용체 조절자), 리툭시맵(rituximab; CD20 저해제) 또는 마파투무맵(mapatumumab; TRAIL-1 수용체 길항제).
본 발명의 이중 특이적 결합 분자와 공동으로 사용될 수 있는 기타 화학요법약제는, 비제한적으로, 호르몬, 호르몬 유사물질 및 항호르몬제 (예를 들어, 타목시펜(tamoxifen), 토레미펜(toremifene), 랄록시펜(raloxifene), 풀베스트란트(fulvestrant), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 시프로테론 아세테이트(cyproterone acetate), 피나스테라이드(finasteride), 부세렐린 아세테이트(buserelin acetate), 플루드로코르티손(fludrocortisone), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 옥트레오티드(octreotide), 아족시펜(arzoxifene), 파시레오티드(pasireotide), 바프레오티드(vapreotide)), 아로마타아제(aromatase) 저해제 (예를 들어, 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole), 리아로졸(liarozole), 엑세메스탄(exemestane), 아타메스탄(atamestane), 포메스탄(formestane)), LHRH 작용제 및 길항제 (예를 들어, 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 류프롤라이드(leuprolide), 아바렐릭스(abarelix), 세트로렐릭스(cetrorelix), 데스로렐린(deslorelin), 히스트렐린(histrelin), 트립토렐린(triptorelin)), 항대사물질( antimetabolites) (예를 들어, 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed)와 같은 항폴린산제(antifolate), 5 플루오로우라실(5 fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 데시타빈(decitabine), 넬라라빈(nelarabine), 및 젬시타빈(gemcitabine)과 같은 피리미딘 유사물질, 머캡토퓨린 티오구아닌(mercaptopurine thioguanine), 클라드리빈(cladribine) 및 펜토스타틴(pentostatin), 시타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine)과 같은 퓨린 및 아데노신 유사물질); 항암 항생제 (예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin), 미토마이신-C(mitomycin-C), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 픽산트론(pixantrone), 스트렙토조신(streptozocin)과 같은 안트라사이클린(anthracycline)); 플라티늄 유도체 (예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 카보플라틴(carboplatin), 로바플라티틴(lobaplatin), 사트라플라틴(satraplatin)); 알킬화제 (예를 들어, 에스트라무스틴(estramustine), 메클로레타민(meclorethamine), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 부술판(busulphan), 다카바진(dacarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 히드록시우레아(hydroxyurea), 테모졸로미디(temozolomide), 카무스틴(carmustine) 및 로무스틴(lomustine)과 같은 니트로소우레아(nitrosoureas), 티오테파(thiotepa)); 항유사분열제(antimitotic agents) (예를 들어, 빈블라스틴(vinblastine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈플루닌(vinflunine) 및 빈크리스틴(vincristine)과 같은 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids); 및 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 및 이들 제제, 라로탁셀(larotaxel)과 같은 탁산(taxane); 시모탁셀(simotaxel), 및 익사베필론(ixabepilone), 파투필론(patupilone), ZK-EPO과 같은 에포틸론(epothilone)); 토포이소머라아제 저해제(topoisomerase inhibitors) (예를 들어, 에포토시드(epotoside) 및 에토포포스(etopophos)와 같은 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan)) 및 아미포스틴(amifostine), 아나그렐리드(anagrelide), 인터페론 알파(interferone alpha), 프로카바진(procarbazine), 미토탄(mitotane), 및 포르피메르(porfimer), 벡사로텐(bexarotene), 셀레콕시브(celecoxib)와 같은 여러 종류의 화학요법제로부터 선택된다.
본 발명의 이중 특이적 결합 분자 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드, 및 그를 포함하는 조성물의 효능은, 관심 있는 특정 질병에 따라, 적절한 시험관 내 분석, 세포-기반 분석, 생체 내 분석 및/또는 그 자체로 알려진 동물 모델, 또는 이들의 조합 어떤 것에 의해서도 테스트될 수 있다. 적절한 분석 및 동물 모델은 당업자에게 자명할 것이며, 예를 들어, 본 원에서 설명된 분석법을 포함하며, 예를 들어, 세포증식 분석법(proliferation assay)이 하기 시험예들에서 사용되었다.
도 1: 인간, 레서스(rhesus) 및 사이노몰구스(cynomolgus) DLL4의 아미노산 서열 정렬(sequence alignment)
도 2: 인간 및 마우스 DLL4 결손 돌연변이 (위첨자로 된 아미노산 도메인 영역)
도 3: 정제된 VHH가 hDLL4/hNotch1-Fc의 상호작용을 차단한다(ELISA).
도 4: 정제된 VHH가 hDLL4/hNotch1-Fc의 상호작용을 차단한다(알파스크린).
도 5: 정제된 VHH가 CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL/hNotch1-Fc 상호작용을 차단한다(FMAT).
도 6: 정제된 VHH가 DLL4가 매개된 Notch1 절단을 차단한다(리포터 분석).
도 7: 정제된 VHH의 재조합 인간 및 마우스 DLL4에의 결합 (ELISA)
도 8: 정제된 VHH의 재조합 인간 DLL1 및 인간 Jagged-1에의 결합 (ELISA)
도 9: 정제된 VHH의 인간/마우스/사이노몰구스 DLL4에의 결합 (FACS)
도 10: 친화력-성숙된 VHH가 hDLL4/hNotch1-Fc의 상호작용을 차단한다(ELISA)
도 11: 친화력-성숙된 VHH가 CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc의 상호작용을 차단한다(FMAT)
도 12: 정제된 VHH의 인간/마우스 DLL4에의 결합(ELISA)
도 13: 친화력-성숙된 정제된 VHH의 재조합 인간 DLL1 및 인간 Jagged-1에의 결합(ELISA)
도 14: 정제된 VHH의 인간/마우스/사이노몰구스 DLL4에의 결합(FACS)
도 15: DLL4-매개 HUVEC 세포증식 저해에 대한 VHH의 영향의 평가
도 16: DLL4-매개 리포터 분석법에 있어서의 친화력-성숙된 VHH
도 17: A) VHH DLLBII129B05의 인간 VH3/JH 생식세포계열 서열로의 서열 정렬
B) VHH DLLBII136C07의 인간 VH3/JH5 생식세포계열 서열로의 서열 정렬
도 18: A) CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 DLLBII129B05의 서열 최적화된 정제 VHH 변이(FMAT)
B) CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 차단하는 DLLBII136C07의 서열 최적화된 정제 VHH 변이(FMAT)
도 19: DLL4 매개 Notch1 절단을 차단하는 서열 최적화된 정제 VHH (리포터 분석)
도 20: 정제된 단가(monovalent) VHH가 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단한다(ELISA)
도 21: 정제된 단가 VHH가 hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단한다(ELISA)
도 22: 정제된 단가 VHH가 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단한다(알파스크린)
도 23: 정제된 단가 VHH가 hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단한다(알파스크린)
도 24: 단가 VHH의 재조합 인간 및 마우스 VEGF에의 결합(ELISA)
도 25: 단가 VHH의 인간 VEGF121에의 결합
도 26: 정제된 VHH는 VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PIGF에 결합하지 않는다
도 27: 포맷된 VHH는 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단한다(ELISA)
도 28: 포맷된 VHH는 hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단한다(ELISA)
도 29: 포맷된 VHH는 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단한다(알파스크린)
도 30: 포맷된 VHH는 hVEGF165/hVEGFR1-Fc 상호작용을 차단한다(알파스크린)
도 31: 포맷된 VHH는 hVEGF164/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단한다(알파스크린)
도 32: 포맷된 VHH는 마우스 및 인간 VEGF에 결합한다.
도 33: 포맷된 VHH는 VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PIGF에 결합하지 않는다.
도 34: 포맷된 VHH는 VEGF121에 결합한다.
도 35: VHH VEGFBII23B04의 인간 VH3/JH 생식세포 계열 일치 서열(consensus sequence)과의 서열 정렬
도 36: VEGFBII23B4의 VHH 변이는 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단한다(알파스크린).
도 37: VEGFBII23B4의 서열-최적화된 클론은 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 상호작용을 차단한다(알파스크린).
도 38: VHH VEGFBII5B5의 인간 VH3/JH 생식세포 계열 일치 서열과의 서열 정렬
도 39: 사이클 1 이중 특이적 VEGF-DLL4 VHH의 포맷
도 40: 사이클 2 이중 특이적 VEGF-DLL4 VHH의 포맷
도 41: VEGF/VEGFR2 알파스크린 분석(5μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 1)
도 42: VEGF/VEGFR1 알파스크린 분석(5μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 1)
도 43: CHO-hDLL4/hNotch-Fc FMAT 분석(25μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 1)
도 44: VEGF/VEGFR2 알파스크린 분석(5μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 2)
도 45: VEGF/VEGFR1 알파스크린 분석(5μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 2)
도 46: CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc FMAT 분석(25μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 2)
도 47: DLL4 매개 리포터 분석(175μM HSA의 존부 하에서)에 있어서 이중 특이적 VHH (사이클 2)
도 48: 서열-최적화된 이중 특이적 VEGF-DLL4 VHH의 포맷
도 49: VEGF/VEGFR2 알파스크린 분석(5μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 3)
도 50: VEGF/VEGFR1 알파스크린 분석(5μM HSA 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 3)
도 51: CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc FMAT 분석(25μM HSA의 존부 하에서)에서의 이중 특이적 VHH (사이클 3)
도 52: 인간 대장암의 마우스 모델(SW620 모델)에서, 선택된 VHH의 효능
A: SW620 종양 성장 속도
B: 21일 째 시험의 마지막 시점에서의 종양의 절대 부피
C: 시간에 따른 체중의 변화
재료 및 방법
a) 인간, 마우스 및 사이몰구스 DLL4 를 과발현하는( overexpressing ) CHO 및 HEK293 세포주의 생성
인간(서열 번호: 101; NM_019074.2) 및 마우스 DLL4(NM_019454.3)를 인코딩하는 cDNA는, 상응하는 서열을 5' 및 3' UTR에 디자인한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 성인 인간 정상 심장 조직 cDNA 라이브러리(BioChain, Hayward, CA, USA) 및 마우스 심장 조직 cDNA 라이브러리(C57/BI6 균주로부터 분리)로부터 각각 증폭하였다. 앰플리콘(amplicon)을 포유동물 발현 벡터 pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 클로닝하였다.
사이몰구스 DLL4 cDNA는, 밀접하게 연관된 종 레서스의 DLL4(Macaca mulatta DLL4, 서열 번호:102; XM_001099250.1)(도 1 참조)를 인코딩하는 서열을 5' 및 3' UTR에 디자인한 프라이머를 이용하여, 사이몰구스 정상 심장 조직(BioChain, Hayward, CA, USA)으로부터 증폭하였다. 최종 앰플리콘은 포유동물 발현 벡터 pCDNA3.1(+)-neo에서 클로닝하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). 사이노몰구스 DLL4의 아미노산 서열은 레서스와 100%, 인간과는 99% 동일한 것으로 나타났다(도 1; 인간 서열과 차이 나는 것은 밑줄친 굵은 글씨로 표시하였다).
인간 DLL4, 마우스 DLL4 또는 사이몰구스 DLL4를 과발현하는 중국햄스터난소(Chinese Hamster Ovary; CHO)세포를 제조하기 위해, 모체 CHO 세포를 각각 pCDA3.1(+)-neo-hDLL4, pcDNA3.1(+)-neo-mDLL4 또는 pcDNA3.1(+)-neo-cDLL4로 전기천공(electroporation)하였다. 각각의 pCDNA3.1(+)-neo-hDLL4 또는 mDLL4 플라스미드의 퓨진(Fugene)(Roche)으로 지질-매개 형질도입함으로써 인간 DLL4 및 마우스 DLL4를 과발현하는 인간 배아 신장(HEK293)세포를, HEK293 모체 세포주로부터 생성시켰다. 모든 조건에 대해서, 1 mg/mL의 제네티신(geneticin)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가함으로써 형질도입체를 선발하였다.
b) 모노클로날 항- DLL4 IgG 및 Fab 단편의 생성
US2008/0014196에서, Ridgway et al. (2006)에 의해 사용된 인간/마우스 교차-반응 DLL4 mAb가 다수의 이종이식 모델에서의 종양 성장에 대한 VEGF mAb 및 DLL4 mAb의 가중 효과를 보여주기 위하여 설명되었다. 생화학적/세포적 분석 및 이종이식 모델에서의 이 항체(단편)의 특성을 평가하기 위하여, 상분리 중 특정 유출물에서 이러한 항-DLL4 mAb 및 그에 상응하는 Fab를 정제하였다. DLL4 mAb의 공지된 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 hIgG2ak 골격 부위로 클로닝하고, HEK293에서 일시적으로 발현시킨 후, 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 상청액(supernatant)로부터 분리하였다. 정제된 DLL4 mAb는 ELISA 및 FACS(CHO-mDLL4 및 CHO-hDLL4 세포 이용)에서 인간 DLL4 및 마우스 DLL4에 결합하고, 비아코어 분석에서 양 성장 인자의 오쏘로그(orthologue)에 나노몰 이하의 친화력을 갖는 것으로 나타났다.
상응하는 DLL4 Fab 단편은 역번역(back-translation)에 기초한 유전자 어셈블리(gene assembly) 및 Leto's Gene Optimization 소프트웨어(www. entechelon.com)을 이용하여 E. coli에서의 발현을 위한 코돈 최적화를 통해 제조하였다. 가변 경쇄(VL), 가변 중쇄(VH), 불변 경쇄(CL) 및 중쇄의 불변 도메인 1(CH1)의 어셈블리를 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였고 어셈블리 PCR를 수행하였다.
VL+CL 및 VH+CH1을 인코딩하는 cDNA 단편을, 제한 자리(restriction site) SfiⅠ 및 Asc Ⅰ 및 제한자리 Kpn Ⅰ 및 Not Ⅰ을 각각 이용하여, LacZ 프로모터, 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자, 복수의 클로닝 자리 및 하이브리드 gⅢ-pelB 선도 서열(leader sequence)를 포함하는 pUC119-유래 벡터에 클로닝하였다. Fab 코딩 서열을 갖는 프레임(frame)에서, 발현 벡터는 C-말단 HA 및 히스(His)6-태그(tag)를 인코딩한다. Fab 단편은 E. coli에서 His6-태깅된 단백질로 발현하였고 이어 배양 배지로부터 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography; IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC)에 의해 정제하였다. 관련된, 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 아미노산 서열은, US 2008/0014196의 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2에 각각 나타나 있으며; 중쇄 및 경쇄의 완전한 서열은 서열 번호: 419 및 420에 각각 나타나 있다.
c) 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 위한 DLL4 돌연변이의 생성
항-DLL4 VHH에 의해 인식되는 에피토프를 구성하는, DLL4의 세포 외 도메인(ECD) 부위를 확인하기 위하여, DLL4 ECD의 선행 부위 손실 돌연변이를 제조하였다. 폴리히스-태그에 융합된 DLL4 ECD의, 일련의 네스티드(nested) 손실 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림(upstream)에 CMV 프로모터를 포함하는, 포유동물 발현 벡터 pSecTag2/Hygro(Invitrogen, Carlsbad, USA)를 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조하였다(도 2 참조; 아미노산 도메인 영역은 위첨자로 되어 있음). 이들 재조합 단백질들은 일시적으로 형질도입된 HEK293 세포에서, 조건화된 배지가 수집된 프리스타일 293 발현 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 발현시켰으며 IMAC을 통해 정제하였다. EGF2-유사 도메인이 없는 DLL4 돌연변이만이, 상기 인간화된 인간/마우스에 교차-반응하는 항-DLL4 mAb(항-인간 IgG 코팅된 비아코어 센서 칩의 포획을 통해 고정된)에 대해 약화된 결합력을 보여주었다. 이러한 IgG는 상기 DLL4 도메인에 특정한 결합 에피토프를 갖는 것으로 알려져 있다(특허 출원 Genentech, US 2008/0014196A1).
d) DLL4 리포터 분석 플라스미드의 생성
리포터 분석은, 기본적으로 「Struhl 및 Adachi, Cell. 1998 May 15; 93(4): 649-60」에 설명된 바와 같이, Notch1의 γ-시크리타아제(γ-secretase) 매개 절단 및, DLL4의 자극에 의한 Notch1의 세포 내 도메인(NICD)의 핵으로의 이동(nuclear translocation)에 기초하여 개발되었다. Gal4/VP16 코딩 서열을 NICD-코딩 서열로 삽입하였다. 단순 포진 바이러스의 전사 활성 인자 도메인 VP16에 융합된 효모 GAL4의 DNA 결합 단편으로 구성된, 강력한 혼성체 전사 활성 인자인 GAL4-VP16을 Notch의 막관통 도메인(transmembrane domain)의 카복시-말단에 삽입하였다. γ-시크리타아제에 의한 이 컨스트럭트의 절단은 Gal4/VP16 NICD 융합 단백질을 방출시키고, 이는 핵으로 이동하여 공동으로 형질 도입된, 강력한 프로모터인 GAL4-UAS 프로모터 서열을 함유한 루시퍼라아제 리포터 플라스미드에 결합하여 그의 전사를 활성화할 것이다(Struhl, G. 및 Adachi, A., Cell, vol. 93, 649-660,1998). 인간 Notch1-Gal4/VP16 발현 카세트(casette)를 pcDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하였다. pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro] 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)를 루시퍼라아제 리포터 플라스미드로 사용하였다.
e) VEGF109 의 생산 및 기능-테스트
인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 이소폼인 VEGF165의 수용체 결합 도메인을 인코딩하는 cDNA(GenBank: AAM03108.1; 아미노산 잔기 27-135)를 pET28a 벡터(Novagen, Madison, WI)에 클로닝하였으며 E.coli(BL21 Star DE3)에서 His-태깅된 불용성 단백질로 과발현시켰다. 발현은 1 mM의 IPTG를 첨가하여 유도한 후, 37℃에서 4시간 동안 추가 배양하였다. 원심분리하여 세포를 회수하고 세포 펠렛(pellet)을 초음파 분해하여 용해시켰다. 봉입체(inclusion body)를 원심분리하여 분리하였으며 1% Trition X 100(Sigma-Aldrich)로 세척한 후, 단백질을 7.5 M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 이용하여 용해시키고, 버퍼의 우레아 농도를 6M에서 0M로 줄여가면서 하룻밤 동안 연이어 투석함으로써 리폴딩(refolding)시켰다. 리폴딩된 단백질을 MonoQ5/50GL(Amersham BioSciences) 컬럼을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)한 후, Superdex75 10/300 GL 컬럼(Amersham BioSciences)으로 겔 여과(gel filtration)하여 정제하였다. 단백질의 순도 및 균질성을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 확인하였다. 또한, VEGFR1, VEGFR2 및 베바시주맵에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 끝으로, 1㎍/mL의 재조합 인간 VEGF109를 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰(well) MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 고정시켰다. 웰들을 카세인 용액(1%)로 블로킹하였다. VEGFR1, VEGF2 또는 베바시주맵의 연속 희석액을 VEGF109로 코팅된 플레이트에 첨가하고 알칼라인 포스파타아제가 컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fc(Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) 및 기질 PNPP(p-니트로페닐포스페이트)(Sigma-Aldrich)의 존재하에서의 후속 효소 반응을 이용하여 결합을 검출하였다. VEGF109는 VEGFR1, VEGFR2 및 베바시주맵에 결합할 수 있을 것인 바, 이는 생산된 VEGF109에 활성이 있음을 의미한다.
f) VEGF165 의 KLH 컨쥬게이션 및 KLH - 컨쥬게이션된 VEGF165 의 기능 테스트
재조합 인간 VEGF165(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를, mcKLH를 갖는 Imject Immunogen EDC 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 해양생물 양식 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(mariculture keyhole limpet hemocyanin; mcKLH)에 컨쥬게이션하였다. 폴리펩티드의 mcKLH에 효율적인 컨쥬게이션 여부는 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 컨쥬게이션된 단백질의 기능은 ELISA로 체크하였다: 2㎍/mL의 KLH로 컨쥬게이션된 VEGF165를 4℃에서 하룻밤동안 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 고정시켰다. 웰들을 카세인 용액(1%)로 블로킹하였다. VEGFR1 또는 VEGFR2의 연속 희석액을 첨가하고 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fc(Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) 및 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘)(Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재하에서의 후속 효소 반응을 이용하여 결합을 검출하였다. KLH 컨쥬게이션된 단백질은 여전히 VEGFR1, VEGFR2 및 베바시주맵과 반응할 수 있으며, 이는 VEGF165의 각 에피토프가 여전히 접근가능함을 확인하여 준다.
실시예 1
서로 다른 종으로부터의 DLL4 에 의한 면역화( immunization )는 라마( llama )에서의 호르몬 면역 반응을 유도한다
1.1. 면역화
수의학부의 윤리위원회의 승인 후(겐트대, 벨기에), 재조합 인간 DLL4(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)를 4 마리의 라마(지정 번호. 208, 209, 230, 231)에 6회 근육 내 주사(주 간격으로 100 또는 50 ㎍/dose)하여 면역화하였다. DLL4 항원은 스티뮨(Stimune; Cedi Diagnostics BV, Lelystad, 네덜란드)에서 제조하였다. 상기 설명된 바와 같이 확립된, 인간 DLL4 및 마우스 DLL4 과발현 CHO 세포를 표준 프로토콜에 따라 교대로 4회 피하주사하여 세 마리의 라마(지정 번호. 127b, 260, 261)를 추가로 면역화하였다. 0일의 첫 번째 인간 DLL4 주사는 완전 프로인트 보조제(complete Freund's Adjuvant)(Difco, Detroit, MI, USA)에서 제조하였고, 반면에 후속된 인간 및 마우스 DLL4 주사는 불완전 프로인트 보조제(Incomplete Freund's Adjuvant)(Difco, Detroit, MI, USA)에서 제조하였다.
1.2. 라마에서 유도된 면역 반응의 평가
인간 DLL4에 대한 동물에서의 면역반응 유도를 ELISA에 의해 평가하기 위하여, 면역혈청을 라마 208, 209, 230 및 231로부터 0일 (면역-전), 21일 및 43일(말초혈액 림프루[PBL] 수집시기)째, 라마 127b, 260 및 261로부터 0일 및 51일째, 및 라마 282, 283 및 284로부터 0일, 28일 및 50일째 수집하였다. 요컨대, 2㎍/mL의 재조합 인간 DLL4 또는 마우스 DLL4(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 면역화하였다. 웰은 카세인 용액(1%)으로 블로킹하였다. 혈청 희석액의 첨가 후, 특이적으로 결합된 이뮤노글로불린을 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-라마 이뮤노글로불린(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) 및 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘)의 존재하에서의 후속 효소 반응을 이용하여 검출하였는데, 이는 DLL4에 대해 상당한 항체-의존적 면역 반응이 유도되었음을 보여주었다. 특이적으로 결합된 이뮤노글로불린은 특이적으로 인식하는 통상의 라마 IgG1 항체 또는 중쇄만의 라마 IgG2 또는 IgG3 항체로 검출될 수 있으므로(표 2-A), 항체 반응은 B-세포 레파토리를 발현하는 통상의, 그리고 중쇄만의(heavy-chain only) 항체 모두에 의해 시작된다. 마우스 DLL4로 주사된 모든 라마에 있어서, 항체 반응은, 마우스 DLL4에 대해 특이적으로 B-세포들을 발현하는 통상의 항체 및 중쇄만의 항체에 의해 시작된다. 뿐만 아니라, 세포 면역된 동물의 혈청 역가(titer)를 HEK293 세포를 과발현하는 인간 및 마우스 DLL4에 대한 FACS 분석에 의해 확인하였다(표 2-B). 각각의 라마에 대한 DLL4 혈청 역가 반응은 표 2에 나타냈다.
표 2: DLL4에 대한 항체-매개 특이적 혈청 반응
A) ELISA (고체상에 코팅된 재조합 단백질)
Figure pct00002

Figure pct00003
n/d, 미판정
B) FACS (HEK293 세포에서 자연 발현된 단백질)
Figure pct00004

Figure pct00005
n/d, 미판정
실시예 2
중쇄만의 항체 단편 레퍼토리의 클로닝 및 파지( phage )의 제조
최종 항원 주사에 이어, 중쇄 항체를 생산하는 B-세포의 공급원으로서의 면역 조직을 면역화된 라마로부터 수집하였다. 전형적으로, 마지막 항원 주사 이후 4일 및 8일에 수집된 두 개의 150-ml 혈액 샘플, 및 마지막 항원 주사 이후 4일 후 수집된 1 개의 림프절 생검을 각 동물로부터 수집하였다. 혈액 샘플로부터, 제조자의 안내(Amersham BioSciences, Picataway, NJ, USA)에 따라 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 이용하여 말초혈 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 제조하였다. PBMC 및 림프절 생검으로부터 전체 RNA를 추출하였으며, WO 05/044858에 설명된 바와 같이 VHH를 인코딩하는 DNA 절편을 증폭하기 위한 RT-PCR의 출발 물질로 이를 이용하였다. 각각의 면역화된 라마에 대해, 상기 동물의 수집된 모든 면역 세포로부터 분리된 전체 RNA를 풀링(pooling)하여 라이브러리를 제조하였다. 요컨대, 특정 제한 자리를 통해, 파이지의 VHH 라이브러리 디스플레이(display)가 용이하도록 디자인된 벡터로 PCR 증폭된 VHH 레퍼토리를 클로닝하였다. 벡터는 pUC119에서 유래하였으며 LacZ 프로모터, M13 파지 gⅢ 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카베니실린 내성 유전자, 다양한 클로닝 자리 및 하이브리드 gⅢ-pelB 선도 서열을 포함한다(pAX050). VHH 코딩 서열을 갖는 프레임에서, 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 His6 태크를 인코딩한다. 표준적인 프로토콜에 따라 파지를 제조하였으며 이후 사용을 위해 제균 필터 후 4℃에서 보관하였다.
실시예 3
파지 디스플레이를 통한 DLL4 -특이적 VHH 의 선발
모든 라마로부터 수득되고 파지 라이브러리로 클로닝된 WHH 레퍼토리를, 다양한 선발 조건을 적용하여 서로 다른 선발 계획 하에서 사용하였다. 변수는 ⅰ) DLL4 단백질 포맷 (인간 DLL4 및 마우스 DLL4의 C-말단 His-태깅된 재조합 발현 세포 외 도메인 (각각 Met1-Pro524 및 Met1-Pro525)) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 또는 DLL4-과발현 CHO 또는 HEK293 세포에 존재하는 전장(full length) 인간 DLL4 및 마우스 DLL4, ⅱ) 항원 제시 방법 (직접 DLL4로 코팅된 플레이트 또는 비오틴-태그를 통해 DLL4로 코팅된 뉴트라비딘 플레이트; 용액 상; 용액에서의 인큐베이션에 이은 뉴트라비딘-코팅된 플레이트에의 포획), ⅲ) 항원 농도 및 ⅳ) 서로 다른 용출(elution) 방법 (트립신을 통한 비-특이적 또는 동족 수용체 Notch1/Fc 키메라 또는 항-DLL4 IgG/Fab를 통한 특이적)를 포함한다. 모든 선발은 MaxiSorp 96-웰 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 수행하였다.
선발은 다음과 같이 수행하였다: 고체 및 용액 상 선발 포맷을 위한 DLL4 항원 제조물을 다양한 농도로 상기된 바와 같이 준비하였다. 2시간 동안 파지 라이브러리로 배양하고 세척한 이후, 결합한 파지를 30분간 트립신 (1mg/mL)로 용출하였다. 파지 용출에 트립신이 사용된 경우, 0.8 mM의 프로테아제 저해제 ABSF를 처리하여 프로테아제의 활성을 즉시 중성화하였다. 항원이 없는 선발을 대조군으로 병행하여 수행하였다. 배경에 대해 부화(enrichment)를 보여주는 파지 용출물을 E. coli를 감염시키기 위하여 사용하였다. 감염된 E. coli 세포는 다음 라운드에 대한 파지를 제조하기 위하여 사용되거나, 아니면 개별 VHH 클론의 분석을 위해 아가(agar) 플레이트(LB + 암피실린 + 글루코오스2 %)에 플레이팅하였다.
특정 바인더에 대한 선발 용출물을 스크린하기 위하여, 아가 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 1 mL 96-딥-웰 플레이트에서 배양하였다. 글루코스가 없는 상태에서 IPTG(최종 0.1 내지 1 mM)를 첨가하여 LacZ로 컨트롤되는 VHH 발현을 유도하였다. 표준 프로토콜에 따라 주변 세포질 추출물(~80㎕의 부피)을 준비하였다.
실시예 4
DLL4 -Notch 1 알파스크린 및 FMAT 경합 분석에서의 주변세포질 추출물의 스크니링( screening )
발현된 VHH의 차단 능력을 평가하기 위하여 인간 DLL4/인간 Notch1 알파스크린 분석에서 주변세포질 추출물을 스크린하였다. 인간 DLL4는 비오틴(Sigma, St Louis, MO, USA) 및 비오틴아미도헥산 산 3-설포-N-하이드록시석신이미드 에스테르 소듐 염(Sigma, St Louis, MO, USA)을 이용하여 비오틴화하였다. Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)는 제조자의 안내에 따라(Perkin Elmer, Waltham, MA, US) 수용체 비드에 커플링된 항-Fc VHH를 이용하여 포획하였다. VHH의 중성화 능력을 평가하기 위하여, 주변세포질 추출물의 연속 희석액을 비오틴화된 인간 DLL4로 미리 인큐베이션하였다. 이 혼합물에, 수용체 비드 및 스트렙트아비딘 공여체 비드를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 더 인큐베이션하였다. 형광은 680nm의 여기파장(excitation wavelength) 및 520nm의 발광파장(emission wavelength)을 이용하여 Envision Multilabel Plate 리더기(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)에서 리딩 플레이트로 측정하였다. 형광 신호의 약화는 비오틴화된 인간 DLL4의 인간 Notch1/Fc 수용체에 대한 결합이 주변세포질 추출물에서 발현된 VHH에 의해 차단된다는 것을 의미한다.
이와 달리, 인간 Notch1/Fc 형광미량측정기술 (FMAT; Fluorometric Microvolume Assay Technology) 경합 분석에서 CHO-hDLL4 및 CHO-mDLL4 세포를 사용하였다. 재조합 인간 Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)는 Alexa-647(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 무작위 표지하였다. 요컨대, 5㎕의 주변세포질 물질을 각각 7,500 개의 CHO-hDLL4 또는 CHO-nDLL4 과발현 세포와 함께 100pM 또는 175pM의, 표지된 인간 Notch1/Fc에 첨가하고, 2시간의 인큐베이션 후 판독하였다. 비-경합 기준치 값을 설정하기 위하여, 인간 Notch1/Fc~Alexa647을 갖는 세포로 적어도 30회 반복시험하였으며 저해 백분율은 이 기준치 값으로부터 계산하였다. 모든 계산은 웰 당 형광에 웰 당 카운트의 수를 곱한 값의 평균을 포함하는 FL1_전체 신호에 기초하였다.
상기 스크린으로부터, 저해 VHH를 선발하여 시퀀싱하였다. 서열 분석에 의해 40 개의 서로 다른 B-세포 계열에 속하는 166개의 특유의 VHH을 밝혀냈다. 각 B-세포 계열에 대해 발견된 변이의 전체 수는 표 3에 나타나 있다. 주변세포질의 스크린 데이타의 개요는 표 4에 나타나 있다. 추가적인 특성화를 위해 선발된 고유 VHH의 아미노산 서열은 서열 리스트(서열 번호: 4 ~ 20) 및 표 5(CDR 및 골격 부위가 표시됨)에 나타나 있다.
표 3: DLL4-특이적 VHH B-세포 계열의 식별에 사용된 선발 매개변수
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009

표 4: 발현된 항-DLL4 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물의 스크린
Figure pct00010
Figure pct00011
(a) B-세포 계열 내에서 복수의 고유한 변이체를 확인한 경우, 오프율 (최대-최소) 범위 또는 계열 구성원의 오프율은 괄호 내에 이탤릭체로 나타냈다.
(b) 이종의 피팅(heterogeneous fit): 판정된 빠른 오프율 및 느린 오프율.
표 5: 선발된 단가 항-DLL4 VHH의 서열 번호 및 아미노산 서열 (FR, 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014

시험예 5
정제된 항- DLL4 VHH 의 특성 분석
시험예 4에 설명된 스크린으로부터 선발된 저해성 항-DLL4 VHH를 추가 정제 및 특성 분석을 수행하였다. 선발된 VHH는 E. coli TG1에서 c-myc, His6-태깅된 단백질로 발현시켰다. 발현은 1mM IPTG를 첨가하여 유도하였으며 37℃에서 4시간 동안 유지하였다. 세포 배양액을 원심분리한 후, 펠렛을 동결-융해(freeze-thawing)하여 주변세포질 추출물을 제조하였다. 이들 추출물을 출발 물질로 사용하였으며 VHH는 IMAC 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하였으며, SDS-PAGE를 통해 판정한 결과 순도가 95%였다.
5.1. ELISA 에서의 VHH 의 DLL4 차단 평가
VHH의 차단 능력을 인간 DLL4-인간 Notch1/Fc 차단 ELISA에서 평가하였다. 요컨대, 1 ㎍/mL의 Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 고정 농도의 15nM의 비오틴화된 인간 DLL4를 VHH의 연속 희석액으로 1시간 동안 미리 인큐베이션하였으며, 그 후 혼합물을 코팅된 Notch1 수용체에서 추가로 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 비오틴화된 인간 DLL4의 잔류 결합을 호스라디시 퍼옥시다아제(HRP) 컨쥬게이션된 엑스트라비딘(extravidin) (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 검출하였다(도 3). 인간 DLL4는 상기 설명된 바와 같이 비오틴화하였다. 인간 DLL4-인간 Notch1/Fc 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC50 값을 표 6에 나타냈다.
표 6: hDLL4/hNotch1-Fc 경합 ELISA에서의 IC50 값 (nM)
Figure pct00015

5.2. 알파스크린에서의 VHH 의 DLL4 -차단 평가
요컨대, 1 nM의 비오틴화된 인간 DLL4를 스트렙트아비딘-코팅된 공여체 비드(20㎍/mL)에서 포획하였고, 반면 0.4 nM의 수용체 인간 Notch1(Fc 융합 단백질)은 항-인간 Fc VHH-코팅된 수용체 비드(20㎍/mL)에서 포획하였다. 충전된 양 비드를 희석 범위의 경합하는 VHH와 함께 인큐베이션하였다(도 4). 인간 DLL4-인간 Notch1/Fc의 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC50 값은 표 7에 나타나 있다.
표 7: hDLL4/hNotch1 경합 알파스크린에 있어서 VHH에 대한 IC50 (nM) 값
Figure pct00016
(a) 부분적 저해제
5.3. CHO 세포에서 발현된 인간 또는 마우스 DLL4 에 대한 인간 Notch1 / Fc 결합의 항- DLL4 VHH 에 의한 저해
실시예 4에서 개괄적으로 설명된 인간 또는 마우스 DLL4-인간 Notch1/Fc 경합 FMAT 분석에 의해 VHH의 결합 능력을 평가하였다. CHO 세포에서 발현된 인간 또는 마우스 DLL4에 대한 인간 Notch1/Fc의 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC50 값은 표 8에 나타나 있다.
표 8: CHO 세포에서 발현된 인간 또는 마우스 DLL4에 대한 인간 Notch1/Fc의 상호작용을 차단하는 정제된 VHH의 (평균) IC50 값(nM) (FMAT)
Figure pct00017

5.4. 리포터 분석에 의한 VHH 의 DLL4 차단 능력 평가
선발된 VHH의 능력을 평가하기 위하여, 리보터 분석을 셋업하였는데, 이는 γ-시크리타아제 매개 Notch1의 절단 및 DLL4의 자극에 의한 Notch1의 세포 내 도메인(NICD)의 방출에 기초한다. Notch1-GAL4/VP16 컨스트럭트를 HEK 세포에서 pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro] 리포터 플라스미드와 함께 공동형질도입하여 융합 단백질을 일시적으로 발현시켰다. 일시적으로 형질도입된 세포를 HEK293-hDLL4 안정화된 세포주와 24시간 동안 공동 배양함으로써 자극을 주었다. 형질 도입 후 48시간 후에 판독을 수행하였다. VHH는 공동 배양 시작 1시간 전에 HEK293-hDLL4 세포와 함께 미리 인큐베이션하였으며 공동 배양중에도 포함시켰다(표 6). DLL4-매개 Notch1의 절단을 차단하는 VHH의 IC50 값 및 뒤이은 Notch1 NICD의 수용체 세포 핵으로의 전위(translocation)는 표 9에 나타나 있다.
표 9: DLL4/Notch1 리포터 분석에 의한 정제 VHH의 (평균) IC50 값 (nM)
Figure pct00018

5.5. 에피토프 비닝( binning )
예를 들어, 벤치마크 항체가 결합된 경우, VHH가 자발적으로 DLL4에 결합할 수 있는지를 판단하기 위하여, 에피토프 비닝 시험을 수행하였다(비아코어 T100에서의 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통하여). 항-DLL4 Fab 단편을 CM5 센서칩의 레퍼런스 및 활성 플로우 셀(active flow cell)에 비가역적으로 고정시켰다. 각 샘플(사이클)에 대하여, 인간 DLL4를 활성 및 레퍼런스 플로우 플로우 셀에 주입하고 항-DLL4 Fab에 의해 가역적으로 포획하였다. VHH의 추가적인 결합을 고정된 표면에 대하여 주입함으로써 평가하였다. 모든 VHH 및 항-DLL4 Fab는 120초의 표면 접촉 시간 및 10㎕/분의 유속으로 10nM가 되도록 주입하였다. 표면은 10mM의 글리신(pH 1.5)을 이용하여 재생시켰다. 처리된 커브를 비아코어 T100 이벨류에이션(Biacore T100 Evaluation) 소프트웨어로 평가하였다. 표 10-A는 분석된 VHH 및 컨트롤의 연속적인 주입/재생 경로를 나타낸다. VHH DLLBⅡ56A09 (서열 번호: 15), DLLBⅡ96C03(서열 번호: 19), DLLBⅡ101G08(서열 번호: 10) 및 DLLBⅡ115A05(서열 번호: 112)는 DLL4 Fab에 포획된 인간 DLL4에 추가적으로 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한, DLL4 Fab의 주입도 인간 DLL4에 추가적으로 결합하는데 실패하였는데, 이는 모든 에피토프가 포화되었음을 의미한다. 그러므로, 이들 VHH가 인간 DLL4에 결합함에 있어 DLL4 Fab와 중첩하여 에피토프를 인식한다고 결론내릴 수 있다. 인간만의(human-only) VHH DLLBⅡ6B11 (서열 번호: 5) 및 DLLBⅡ104G01 (서열 번호: 11)은 DLL4 Fab에 결합된 인간 DLL4에 추가적으로 결합하며, 이는 인간 DLL4에 대해 특이적인 이들 VHH가 인간/마우스 교차-반응하는 VHH보다는 다른 에피토프를 인식한다는 것을 의미한다.
표 10-A: 항-DLL4 VHH의 에피토프-비닝(epitope-binning) - DLL4 Fab와의 자발적인 결합
Figure pct00019

5.6. DLL4 결손 돌연변이를 이용한 에피토프 맵핑( Epitope mapping )
이들 DLL4 돌연변이에 대한 VHH의 결합을 비아코어에서 평가하였다. 요컨대, VHH DLLBⅡ101G08 (서열 번호: 10) 및 DLLBⅡ115A5 (서열 번호: 12)를 CM4 센서칩에 코팅하였으며 각각의 결손 돌연변이를 칩 전체에 걸쳐 주입하였다. 결합은 질적으로 평가하였다. DLLBⅡ56A09 (서열 번호: 15), DLLBⅡ101G08 (서열 번호: 10) 및 DLLBⅡ115A05 (서열 번호: 12)는 EGF-유사 2 도메인이 없는 인간 및 마우스 DLL4 각각의 돌연변이 hDLL4.1 및 mDLL4.8에 결합하지 않는 것으로 관찰되었다(표 10-B). hDLL4/DLL4 IgG 결합 ELISA를 이용한 간접적인 증거도 이러한 관찰을 뒷받침한다. 요컨대, 1㎍/mL의 DLL4 IgG를 96-웰 MaXiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 고정된 농도 6nM의 비오틴화된 인간 DLL4를VHH의 연속 희석액과 1시간 동안 미리 인큐베이션한 후, 그 혼합물을 코팅된 IgG에서 1시간 동안 추가 인큐베이션하였다. 비오틴화된 인간 DLL4의 잔류 결합을 호스라디시 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 엑스트라비딘 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검출하였다(데이타 표시되지 않음). 인간 DLL4는 상기 설명된 바와 같이 비오틴화하였다. 모노클로날 항-DLL4 IgG(Genentech, US 2008/0014196A1)가 DLL4의 EGF-유사 2 도메인 내의 에피토프에 결합한다는 것은 특허 문헌으로부터 알려져 있다.
표 10-B: DLL4 결손 돌연변이에 대한 항-DLL4 VHH 결합의 에피토프 맵핑
Figure pct00020
5.7. hDLL4 - VHH 상호작용의 친화력 판정
DLL4 - VHH 상호작용의 친화력을 판정하기 위한 동역학적 분석(kinetic analysis)은 비아코어 T100 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 수행하였다. 재조합 인간 DLL4를 EDC 및 NHS의 아민 커플링을 통해 CM5 칩에 고정시키거나 비오틴화된 인간 DLL4를 SA 칩(스트렙타비딘 표면)에 포획시켰다. 정제된 VHH 또는 Fab 단편을 서로 다른 농도(10 내지 300nM 내)로 2분간 주입하였으며 45㎕/분의 유속으로 20분 동안 분리되도록 하였다. 샘플 주입 중간에, 표면을 10mM의 글리신 pH1.5 및 100mM HCl로 재생시켰다. HBS-N(Hepes 버퍼 pH7.4)을 러닝 버퍼(running 버퍼)로 사용하였다. 가능한 경우, 데이터는 1:1 상호작용 모델(랑뮈에(Langmuir) 결합)을 결합 곡선으로 피팅(fitting)하여 평가하였다. 친화력 상수 KD는 결합 및 해리 속도 상수인 (Ka) 및 (Kd)로부터 계산하였다. 항-DLL4 VHH의 친화력은 표 11에 나타나 있다.
표 11: 재조합 인간 DLL4에 대한 정제 VHH의 친화력 KD (nM)
Figure pct00021
(a) 1:1 피팅되지 않은 이종(heterogeneous) 결합 곡선
5.8. 오쏘로그 ( mDLL4 , cDLL4 ) 및 패밀리 구성원( hJagged -1, hDLL1 )의 결합
마우스 DLL4에 대한 교차-반응성을 판정하기 위하여 결합 ELISA를 수행하였다. 요컨대, 4℃에서 하룻밤동안 재조합 마우스 DLL4(R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 1㎍/mL로 코팅하였다. 웰은 카세인 용액으로 블로킹하였다(PBS 중에 1%). VHH를 연속 희석액으로 적용하였으며 결합은 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-AP 컨쥬게이트(Sigma, St Louis, MO, USA)를 이용하여 검출하였다(도 7). 인간 DLL4에 대한 결합을 레퍼런스로 측정하였다. EC50 값은 표 12에 요약하였다.
표 12: 인간 재조합 DLL4- 및 마우스 DLL4-결합 ELISA에 있어서 EC50 값 (nM)
Figure pct00022
VHH의 사이몰구스 교차-반응성을 판정하기 위하여, FACS 결합 시험을 수행하였다. 사이몰구스 DLL4를 발현하는 HEK293 세포(일시적 또는 안정적인 형질도입)를 VHH의 적정 결합 시험(titration binding experiment)을 위해 사용하였다. 얼음에서 30분간 인큐베이션한 후, 모든 샘플을 세척하고 항-c-myc-Alexa647(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA, USA)를 적용함으로써 수행하였다. 인간 및 마우스 DLL4를 과발현하는 HEK293 세포를 레퍼런스로 사용하였다. 평균 MCF 값은 FACS 배열(array)에서 판정하였으며 EC50 값의 계산을 위해 사용하였다(도 9 참조).
고체상 결합 분석(ELISA)를 통해 상동성 리간드인 인간 DLL1 및 인간 Jagged-1에 대한 결합 부재를 판정하였다. 요컨대, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 인간 DLL1(Alexis, San Diego, CA, USA) 및 인간 Jagged-1(Alexis, San Diego, CA, USA)을 하룻밤 동안 4℃에서 1㎍/mL로 코팅하였다. 웰들은 카세인 용액(PBS 중 1%)로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석액으로 적용하였으며 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-AP 컨쥬게이트(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검출하였다. 모든 항-DLL4 VHH가 이들 상동성 리간드에 대해 비-교차 반응하는 것으로 판단된다(도 8).
5.9. DLL4 -매개 HUVEC 증식의 차단에 있어서 항- DLL4 VHH 의 평가
「Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21; 444(7122):1083-7」에서 설명된 바를 변형한 형태로, 선발된 VHH의 능력을 증식 분석으로 평가하였다. 요컨대, 96-웰 조직 배양 플레이트를 코팅 버퍼(PBS, 0.1% BSA)에서 정제 DLL4-히스(His)(R&D Systems; C-말단 His-태깅된 인간 DLL4, 아미노산 27-524, 0.75ml/웰, 10ng/ml)로 코팅하였다. 4000개의 HUVEC 세포/웰을 4중으로 시드(seed)하기 전에 웰을 PBS에서 세척하였다. 세포 증식은 4일 째 3H-티미딘(thymidine) 혼합(incorporation)에 의해 측정하였다. 도 15에 나타난 결과는 DLL VHH DLLBⅡ101G08, DLLBⅡ104G01, DLLBⅡ115A05, DLLBⅡ56A09 및 DLL4 Fab가 HUVEC 증식에 대한 DLL4-의존적 효과를 투여-의존적 방식으로 저해한다는 것을 증명한다. IC50 값은 표 13에 요약되어 있다. 테스트된 VHH는 10μM에서 DLL4-의존적 영향을 완전히 저해한다.
표 13: DLL4 증식 분석에서 얻어진 IC50 값
Figure pct00023

실시예 6
선발된 항- DLL4 VHH 의 친화력 성숙
VHH DLLBⅡ101G08 및 DLLBⅡ115A05에 대해 두 사이클의 친화력 성숙을 수행하였다.
첫 번째 사이클에서, 구조(FW) 및 상보성 결정 부위(CDR) 양자에서 에러-유발 PCR법(error-prone PCR method)를 이용하여 무작위로 아미노산 치환을 도입하였다. 돌연변이 유발은 1ng의 DLLBⅡ101G08 또는 DLLBⅡ115A05 cDNA 템플릿, 그 후 0.1ng의 1회의 생성물을 이용한 두 번째 에러-유발 PCR을 이용하여, 2회의 PCR-기반 접근법으로 수행하였다(Stratagene, La Jolla, CA, USA의 Genemorph Ⅱ Random Mutagenesis kit). 세척 단계 후, 파지의 VHH 라이브러리 디스플레이를 쉽게 할 수 있도록 디자인된 벡터로 PCR 생성물을 특유의 제한자리를 통해 삽입하였다. 연속된 회수의 용액 내 선발은, 감소하는 농도의 비오틴화된 재조합 인간 DLL4(biot-rhDLL4) 및 트립신 유출을 이용하여 수행하였다. 또한 세 번째 회수에서의 친화력-중심(affinity-driven)의 선발은 비기능 rhDLL4(biot-rhDLL4보다 적어도 100배 과량)를 이용하여 수행하였다. 교차-반응성(의 보존)은 스크린 수준에서 평가되었으므로 쥐과(murine) DLL4에 대한 선발은 포함되지 않았다. 개별 변이들은, LacZ 프로모터, 암피실린 내성 유전자, 복수의 클로닝 자리 및 ompA 선도 서열을 포함하는 pUC19 유래 발현 벡터(pAX50)를 이용하여 재조합 단백질로 생산하였다. E. coli TG1 세포를 발현 벡터 라이브러리로 형질전환시키고 아가 플레이트(LB + Amp + 2% 글루코스)에 플레이팅하였다. 단일 콜로니를 아가 플레이트로부터 골라 1mL의 96-딥-웰 플레이트에서 배양하였다. VHH의 발현은 IPTG를 첨가(1mM)하여 유도하였다. 주변세포질 추출물을 표준적인 방법에 따라 준비하고(~80㎕의 부피로) 재조합 인간 및 마우스 DLL4에 대한 결합에 대해 프로테온(ProteOn; Biorad, Hercules, CA, USA) 오프율(off-rate) 분석으로 스크린하였다. 요컨대, GLC 프로테온 센서칩을 "리간드 채널" L2 및 L4 (L1/L3을 레퍼런스 채널로 갖는)에서 재조합 인간 DLL4로 코팅하였으며, 반면에 "리간드 채널" L3 및 L6는 마우스 DLL4로 코팅하였다. 친화력-성숙된 클론의 주변세포질 추출물을 1/10으로 희석하고 "분석물 채널" A1-A6에 걸쳐 주입하였다. 평균 오프율은 플레이트에 존재하는 야생형 클론에 대해 계산하였으며 오프율 개선을 계산하기 위한 레퍼런스로 사용하였다.
두 번째 사이클에서, 첫 번째 사이클에서 확인된 감수성 위치(susceptible position)를 동시적으로 무작위화함으로써 조합(combinatorial) 라이브러리를 생성하였다. 이를 위해, 전장 DLLBⅡ101G8 또는 DLLBⅡ115A05 cDNA를 무작위 위치에서 축퇴된(degenerated) 올리고뉴클레오티드(NNS)를 이용하여 오버랩 PCR에 의해 합성하였으며 레스큐(rescue) PCR을 수행하였다. 무작위화된 VHH 유전자는 상기된 바와 같이(실시예 2) 특정 제한 자리를 이용하여 파지 디스플레이 벡터(pAX50)로 삽입시켰다. 각 VHH 클론의 주변세포질 추출물은 상기된 바와 같이 준비하였다.
프로테온 오프율 분석에서의 재조합 인간 DLL4에의 결합에 대한 스크리닝은 38배 (DLLBⅡ101G08) 및 11배 (DLLBⅡ115A05)까지 개선된 오프율을 갖는 클론을 확인하였다(표 15).
표 15: DLLBⅡ101G08 및 DLLBⅡ115A05의 친화력-성숙된 클론의 오프율 스크리닝
Figure pct00024
DLLBⅡ101G08 및 DLLBⅡ115A05 변이 중 가장 우수한 변이를 골격 부위에 C-말단 c-myc 태그 및 (히스)6 태그를 갖는 발현 벡터 pAX100으로 클로닝하였다. 재조합 마우스 DLL4에 대한 오프율 또한 개선되었다. VHH는 E. coli에서 히스6-태깅된 단백질로 생산하였고 IMAC 및 SEC에 의해 정제하였다. 추가의 특성화를 위해 선발된 VHH의 서열은 표 16 (DLLBⅡ101G08) 및 17 (DLLBⅡ115A05)에 각각 나타나 있다.
표 16: 101G08의 친화력-성숙된 변이
Figure pct00025

표 17: 115A05의 친화력-성숙된 변이
Figure pct00026

실시예7
친화력-성숙된 정제 항- DLL4 VHH 의 특성화
VHH DLLBⅡ101G08 및 DLLBⅡ115A05의 친화력-성숙된 변이를 상기 설명된 바와 같이 발현 및 정제하였다(실시예 5). VHH는 hDLL4-hNotch1 경합 ELISA (실시예5.1; 표 17; 도 10), CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 경합 FMAT (실시예 5.3; 표 18; 도 11), hDLL1 및 hJAG1 결합 ELISA 및 hDLL4/mDLL4/시아노DLL4 FACS (실시예 5.8; 표 19; 도 13 및 14, 표 20), 비아코어에서의 hDLL4 및 mDLL4 결합 친화력의 판정 (실시예 5.7; 표 19, 도 12) 및 DLL4-매개 리포터 분석 (실시예 5.4; 표 21; 도 16)으로 특성화하였다.
특성화 데이터는 표 22에 요약하였다. 전체적으로, 친화력-성숙된 VHH는 친화력 및 효능에 있어서 분명한 개선을 보여준 반면, 그들의 mDLL4 및 시아노 DLL4에 대한 결합력은 유지되었고 hDLL1 또는 hJAG1에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
표 17: hDLL4/hNotch1-Fc 경합 ELISA에서의 친화력-성숙된 VHH에 대한 IC50 (nM) 값
Figure pct00027
Figure pct00028

표 18: CHO세포에서 발현된 인간 또는 마우스 DLL4에 대한 인간 Notch1/Fc의 상호작용을 차단하는, 정제된 친화력-성숙된 VHH의 IC50 (nM) 값 (FMAT)
Figure pct00029
Figure pct00030

표 19: 재조합 인간 DLL4 및 마우스 DLL4에 대한 정제된 친화력-성숙된 VHH의 친화력 KD (nM)
Figure pct00031
Figure pct00032

표 20: CHO-hDLL4, CHO-mDLL4 및 CHO-cDLL4에의 결합에 대한 친화력-성숙된 EC50 (nM) 값 (FACS)
Figure pct00033
Figure pct00034

표 21: DLL4-매개 리포터 분석에 있어서 친화력-성숙된 VHH의 IC50 (nM) 값
Figure pct00035
Figure pct00036

표 22: DLLBⅡ101G08 및 DLLBⅡ115A05로부터 유래된 친화력-성숙된 VHH의 특성화
Figure pct00037
Figure pct00038
nb, 결합하지 않음
실시예 8
VHH DLLB Ⅱ129B05 및 DLLB Ⅱ136 C07 의 서열 최적화
DLLBⅡ129B05 (도 17-A) 및 DLLBⅡ136C07 (도 17-B)의 아미노산 서열을 인간 생식세포 계열 VH3/JH 공통 서열(consensus sequence)과 정렬하였다. 잔기들은 Kabat에 따라 번호를 붙였고, CDR은 AbM 정의에 따라 회색으로 나타냈다(Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어).
인간의 대응 잔기로 돌연변이된 것들에는 밑줄로 표시했다.
정렬은 DLLBⅡ129B05가 레퍼런스 생식세포 계열 서열과 관련된 4개의 골격 부위 변이를 포함한다는 것을 보여준다. 14,64, 83 및 108 위치에서의 비-인간 잔기를 그들의 인간 생식세포의 대응 잔기로 치환하기 위해 선발하였다. 이들 위치에서 서로 다른 조합의 인간 잔기를 갖는, 2개의 일련의 DLL4129BⅡ05 변이(DLLBⅡ017 및 DLLBⅡ018)를 컨스트럭션하여 생산하였다 (실시예 6; 아미노산 서열은 표 23에 나열하였다).
DLLBⅡ136C07의 경우, VHH는 레퍼런스 생식세포계열 서열과 관련된 4개의 골격 부위 돌연변이를 포함한다. 39, 40, 83 및 108 위치에서의 비-인간 잔기를 그들의 인간 생식세포계열 대응 잔기로 치환하기 위하여 선발하였다. 이들 위치에서 서로 다른 조합의 인간 생식세포계열 잔기를 갖는 4개의 일련의 DLLBⅡ136C07 변이(DLLBⅡ019, DLLBⅡ020, DLLBⅡ021, DLLBⅡ022)를 생성하였다 (표 6; 아미노산 서열은 표 24에 나열하였다). 이와 병행하여, N52-S52a 위치(CDR2 부위, 도 17-B에서 박스표시된 잔기들)의 잠재적인 Asn 탈아미노화 위치를 N52S 돌연변이를 도입하여 제거하였다. 2 번째 사이클에서, 인간화를 위한 내성 돌연변이(tolerated mutation) 및 N52S 치환을 결합하여 서열-최적화된 변이 DLLBⅡ036를 생산하였다. CDR1에서 F29I 돌연변이를 포함하는, 또 하나의 서열 최적화된 변이(DLLBⅡ039)를 컨스트럭션하였는데, 이는 DLL4-매개 리포터 분석에서 DLLBⅡ137C07의 효능을 증가시키는 것으로 나타났다(표 21; 도 16). DLLBⅡ136C07의 양 서열-최적화된 변이를 표 25에 나열하였다.
이들 모든 변이들은 CHO-hDLL4/hshcl1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 경합 FMAT 분석(실시예 5.3; 표 26; 도 18), DLL4 매개 리포터 분석(실시예 5.4; 표 27; 도 19), DLL4 HUVEC 증식 분석(실시예 5.9; 표 28) 및 친화력 판정을 위한 비아코어(실시예 5.7; 표 29)에서 정제된 단백질로 특성화하였다. 추가적으로, 각 클론의 녹는 온도(Tm)를 열 변화 분석(thermal shift assay)으로 결정하였는데, 이는 사이프로 오렌지(Sypro Orange)(Invitrogen)의 도입에 따른 형광신호의 증가에 기초하고 있다(Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), 289-298쪽). 모든 변이들은 모체 DLLBⅡ129B05와 비교하여 유사한 Tm을 나타냈다. 표 30은 pH 7에서 이들 클론에 대한 Tm 값를 요약한 것이다.
표 23: 모체 DLLⅡ129B05의 단가 서열-최적화된 항-DLL4 VHH의 서열 번호 및 아미노산 서열 (FR; 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00039

표 24: 모체 DLLⅡ136C07의 단가 서열-최적화된 항-DLL4 VHH의 서열 번호 및 아미노산 서열 (사이클 1)(FR; 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00040

표 25: 모체 DLLⅡ136C07의 단가 서열-최적화된 항-DLL4 VHH의 서열 번호 및 아미노산 서열 (사이클 2)(FR; 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00041

표 26: 서열-최적화된 VHH CHO-hDLL4 및 CHIO-mDLL4 경합 FMAT의 IC50 (nM) 값
Figure pct00042
Figure pct00043
n/d, 미판정
표 27: DLL4-매개 리포터 분석에서 서열-최적화된 VHH의 IC50 (nM) 값
Figure pct00044
n/d, 미판정
표 28: DLL4-매개 HUVEC 증식 분석에서 서열-최적화된 VHH의 IC50 (nM) 값
Figure pct00046
Figure pct00047
표 29: 서열-최적화된 VHH의 친화력 (비아코어)(레퍼런스용, DLL4 Fab는 1.5nM의 친화력을 보유)
Figure pct00048
Figure pct00049

표 30: pH 7에서 서열-최적화된 VHH의 Tm 값(℃)
Figure pct00050
Figure pct00051
실시예 9
다른 VEGF 포맷을 갖는 면역화가 라마에서 호르몬 면역 반응을 유도한다
9.1. 면역화
수의학부 윤리위원회의 승인 후(겐트대, 벨기에), 표준 프로토콜에 따라 재조합 인간 VEGF109를 6회 근육 내 주사(주간격으로 100 또는 50 ㎍/dose)하여 4 마리의 라마(지정 번호. 264, 265, 266, 267)를 면역화하였다. 0일 째 첫 번째 주사는 완전 프로인트 보조제(Complete Freund's Adjuvant)(Difco, Detroit, MI, USA)에서 제조한 반면, 후속 주사는 불완전 프로인트 보조제(Incomplete Freund's Adjuvant)(Difco, Detroit, MI, USA)에서 제조하였다. 또한, 4마리의 라마(지정 번호. 234, 235, 280 및 281)를 다음의 프로토콜에 따라 면역화하였다: KLH-컨쥬게이션된 인간 VEGF165로 5회 근육 내 주사(격주로 100 또는 50㎍/dose)한 후, 인간 VEGF109를 4회 근육 내 주사(100㎍의 첫 투여, 2주 후 매주 3회 50㎍/dose).
9.2. 라마에서 VEGF -유도된 면역 반응의 평가
VEGF 특이적 혈청 역가를 모니터하기 위하여, 2㎍/mL의 재조합 인간 VEGF165 또는 VEGF109를 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 고정시켜 ELISA 분석을 셋업하였다. 웰들은 카세인 용액(1%)로 블로킹하였다. 혈청 희석액의 추가 후, 호스라디시 퍼옥시다아제(HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-라마 이뮤노글로불린(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) 및 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라메멘틸벤지딘)(Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재 하에서의 후속 효소 반응을 이용하여 결합된 전체 IgG를 검출하였다. 라마 264, 265, 266 및 267의 경우, 추가의 ELISA를 수행하였는데, 여기서 VEGF165 및 VEGF109에 대한 이소타입의 특이적 반응을 평가하였다. 이소타입의 특이적 반응은, 통상의 라마 IgG1 및 중쇄만의 라마 IgG2 및 IgG3를 특이적으로 인식하는 마우스 mAb[Daley et al. (2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386] 및 이후 토끼의 항-마우스-HRP 컨쥬게이트(DAKO)를 이용하여 검출하였다. ELISA는 TMB를 발색성(chromogenic) 기질로 사용하여 현상하였으며 450nm에서 흡광을 측정하였다. 각 라마에 대한 혈청 역가는 표 31에 나타나 있다.
표 31: VEGF165 및 VEGF109에 대한 항체-매개 특이적 혈청 반응. ELISA(제조합 단백질로 코팅된 고체상)
Figure pct00052
n/d, 미판정
실시예 10
파지 디스플레이를 통한 VEGF -특이적 VHH 의 선발
중쇄만의 항체 단편 레퍼토리의 클로닝 및 파지의 준비는 실시예 2에서 설명한 바와 같이 수행하였다. VHH 파지 라이브러리를 다양한 선발 조건을 적용하여 서로 다른 선발 계획 하에서 사용하였다. 변수는 ⅰ) VEGF 단백질 포맷(rhVEGF165, rhVEGF109 또는 rmVEGF164), ⅱ) 항원 제시 방법 (고체상: 직접 코팅되거나 비오틴-태그를 통해 뉴트라비딘-코팅된 플레이트; 용액상; 용액에서의 인큐베이션에 이은 뉴트라비딘-코팅된 플레이트에의 포획), ⅲ) 항원 농도 및 ⅳ) 용출 방법(VEGFR2를 이용한 트립신 또는 경합적 용출)을 포함한다. 모든 선발은 모든 선발은 MaxiSorp 96-웰 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 수행하였다.
선발은 다음과 같이 수행하였다: 파지 라이브러리를 실온에서 가변적인 농도의 VEGF 항원과 함께, 용액 아니면 고체 서포트에 고정시켜 인큐베이션하였다. 2시간의 인큐베이션 및 세척 후, 결합된 파지를 용출시켰다. 파지 용출에 트립신이 사용된 경우, 0.8mM의 프로테아제 저해제 AEBSF를 첨가하여 프로테아제의 활성을 즉시 중성화하였다. 배경에 대해 부화(enrichment)를 보여주는 파지 용출물을 E. coli를 감염시키기 위하여 사용하였다. 감염된 E. coli 세포는 다음 라운드에 대한 파지를 제조하기 위하여 사용하거나, 아니면 개별 VHH 클론의 분석을 위해 아가(agar) 플레이트(LB + 암피실린 + 글루코오스2 %)에 플레이팅하였다. 특정 바인더에 대한 선발 용출물을 스크린하기 위하여, 아가 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 1 mL 96-딥-웰 플레이트에서 배양하였다. lacZ-컨트롤 VHH 발현은 IPTG(최종 0.1 내지 1 mM)를 첨가하여 유도하였다. 표준 프로토콜에 따라 주변 세포질 추출물(~80㎕의 부피)을 준비하였다.
실시예 11
VEGF -결합(비-수용체 블로킹) 및 VEGF -블로킹(수용체-블로킹) VHH 의 확인
ELISA에 의해 주변세포질 추출물의 인간 VEGF165에 대한 결합을 테스트하였다. 요컨대, 2㎍/mL의 재조합 인간 VEGF165를 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 고정시켰다. 웰들은 카세인 용액(1%)으로 블로킹하였다. 전형적으로 주변세포질 추출물의 10배 희석액을 처첨가한 후, 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-HRP 컨쥬게이트(DAKO)를 이용하여 VHH 비닝을 검출하였다. 배경보다 3배 이상의 ELISA 신호를 나타내는 클론은 VEGF에 결합하는 VHH라고 보았다.
또한, VHH의 차단 능력을 판정하기 위하여 인간 VEGF165/인간 VEGFR2 알파스크린 분석에서 주변세포질 추출물을 스크린하였다. 인간 VEGF165를 설포-NHS-LC-비오틴(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 비오틴화하였다. 인간 VEGFR2/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)는 제조자(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)의 안내에 따라 수용체 비드에 커플링된 항-인간Fc VHH를 이용하여 포획하였다. VHH의 중성화 능력을 평가하기 위하여, 주변세포질 추출물을 0.03% Tween 20(Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS에서 1/25로 희석하고 실온(RT)에서 15분간 0.4nM의 비오틴화된 인간 VEGF165와 함께 미리 인큐베이션하였다. 이 혼합물에 수용체 비드(10㎍/ml) 및 0.4nM VEGFR2-huFc를 첨가하고 암실에서 1시간동안 추가로 실온에서 인큐베이션하였다. 이어 공여체 비드(10㎍/ml)를 첨가하고 암실에서 1시간 동안 실온 인큐베이션하였다. 형광은 680nm의 여기파장 및 520nm 내지 620nm 내의 발광파장을 이용하여 Envision Multi label Plate 리더기(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)에서 리딩 플레이트로 측정하였다. 무관한 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 음성 제어로 사용하였다. 음성 제어의 신호에 비해 60% 이상의 형광 신호를 감소시킬 수 있는 항-VEGF165 VHH를 함유하는 주변세포질 추출물을 히트(hit)로 확인하였다. 알파스크린에서 확인된 모든 히트들은 경합적 ELISA에서 확인되었다. 마지막으로, 1㎍/mL의 인간 VEGFR2 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 주변세포질 추출물의 5배 희석액을, 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS 버퍼 중의, 고정된 농도(4nM)의 비오틴화된 인간 VEGF165의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 이들 VHH/bio-VEGF165 복합체의 인간 VEGFR2 키메라에 대한 결합은 호스라디시 퍼옥시다아제(HRP) 컨쥬게이션된 엑스트라비딘(Sigma, St Louis, MO, USA)을 이용하여 검출하였다. 저해성(수용체-블로킹) VHH의 VHH 서열 번호 및 상응하는 아미노산 서열, 및 추가의 특성화에 의해 선발된 VEGF-결합 (비-수용체-블로킹) VHH는 표 32 및 표 33에 각각 나열하였다.
표 32: 추가 특성화에 의해 선발된 단가 수용체-블로킹 항-VEGF VHH의 서열 번호 및 아미노산 서열 (FR, 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00053

표 33: 추가 특성화에 의해 선발된 단가 비-수용체-블로킹 항-VEGF VHH의 서열 번호 및 아미노산 서열 (FR, 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00054
수용체-블로킹 VHH의 해리 속도를 비아코어(비아코어 T100 기기, GE Healthcare)에서 분석하였다. HBS-EP + 버퍼를 러닝 버퍼(running buffer)로 사용하였으며 시험은 25℃에서 수행하였다. 재조합 인간 VEGF165을 아민 커플링을 통해 +/- 1500RU의 타겟 수준까지 CM5 센서칩에 비가역적으로 포획시켰다. 고정화 후, 1M의 에탄올아민 pH 8.5를 10분간 주입하여 불활성화시켰다. 레퍼런스 표면은 각각 EDC/NHS 및 에탄올아민으로 활성화 및 불활성화시켰다. VHH의 주변세포질 추출물은 2분간 러닝 버퍼로 10배 희석하여 45㎕/분으로 주입하였다. 다른 샘플들 중간에, 표면을 재생 버퍼로 재생시켰다. 데이터는 레퍼런스 채널 및 블랭크 러닝 버퍼 주입에 대한 커브의 공제에 의해 이중 표준화하였다. 처리된 곡선의 해리상은 비아코어 T100 이벨류에이션 소프트웨어 ㅍ2.0.2에서 2 개의 상 감쇄 모델을 피팅(fitting)함으로써 평가하였다. KD-빠름, KD-느림 및 % 빠름에 대한 값을 표 34에 나열하였다.
표 34: 비아코어에서 수용체-차단 VHH의 오프율 판정
Figure pct00055

실시예 12
정제된 항- VEGF VHH 의 특성화
추가 특성화를 위해 정제된 단백질로 세 개의 저해성 항-VEGF VHH를 선발하였다: VEGFBⅡ23B04, VEGFBⅡ24C04 및 VEGFBⅡ23A06. 이들 VHH는 E. coli TG1에서 c-myc, His6-태깅된 단백질로 발현하였다. 발현은 1mM의 IPTG를 첨가하여 유도하였으며 37℃에서 4시간 동안 유지시켰다. 세포 배양액을 원심분리한 후, 펠렛을 동결-융해(freeze-thawing)하여 주변세포질 추출물을 준비하였다. 이들 추출물을 IMAC 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 VHH 정제의 출발 물질로 사용하였다. 최종 VHH 제조물은 SDS-PAGE를 통해 판정한 바와 같이 95%의 순도를 보였다.
12.1. 인간 VEGF165 /인간 VEGFR2 - Fc 차단 ELISA 에서의 인간 VEGF165 / VEGFR2 차단 VHH 의 평가
인간 VEGF165/인간 VEGFR2-Fc 차단 ELISA에서 VHH의 차단 능력을 평가하였다. 요컨대, 1㎍/mL의 VEGFR2-Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 코팅하였다. 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma)을 함유하는 PBS 버퍼 중의, 일련의 VHH 희석액(농도 범위 1mM - 64pM)을 4nM의 비오틴화된 VEGF165의 존재 하에서 인큐베이션하였다. VEGFR2에 대한 bio-VEGF165의 잔류 결합을 호스라디시 퍼옥시다아제(HRP) 컨쥬게이션된 엑스트라비딘(Sigma, St Louis, MO, USA) 및 기질 TMB를 이용하여 검출하였다. 대조군은 베바시주맵(Avastin®) 및 라니비주맵(Lucentis®)으로 하였다. 투여 저해 곡선은 도 20에 나타나 있으며, 상응하는 IC50 값 및 % 저해는 표 35에 요약하였다.
표 35: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 경합 ELISA에서의 단가 VHH에 대한 IC50 (nM) 값 및 % 저해
Figure pct00056

12.2. 인간 VEGF165 /인간 VEGFR1 - Fc 차단 ELISA 에서의 인간 VEGF165 / VEGFR2 차단 VHH 의 평가
인간 VEGF165/인간 VEGFR1-Fc 차단 ELISA에서 VHH의 차단 능력을 평가하였다. 요컨대, 1㎍/mL의 VEGFR1-Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 코팅하였다. 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma)을 함유하는 PBS 버퍼 중의, 일련의 VHH 희석액(농도 범위 1mM - 64pM)을 0.5nM의 비오틴화된 VEGF165의 존재 하에서 인큐베이션하였다. VEGFR1에 대한 bio-VEGF165의 잔류 결합을 호스라디시 퍼옥시다아제(HRP) 컨쥬게이션된 엑스트라비딘(Sigma, St Louis, MO, USA) 및 기질 TMB를 이용하여 검출하였다. 대조군은 베바시주맵(Avastin®) 및 무관한 VHH(2E6)로 하였다. 투여 저해 곡선은 도 21에 나타나 있으며, 상응하는 IC50 값 및 % 저해는 표 36에 요약하였다.
표 36: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 경합 ELISA에서의 단가 VHH의 IC50 (nM) 값 및 % 저해
Figure pct00057

12.3. 인간 VEGF165 /인간 VEGFR2 - Fc 차단 알파스크린에서의 항- VEGF165 VHH 의 평가
인간 VEGF165/인간 VEGFR2-Fc 차단 알파스크린에서 VHH의 차단 능력도 평가하였다. 요컨대, 0.03%의 Tween 20(Sigma)을 함유하는 PBS 버퍼 중의 일련의 정제된 VHH 희석액(농도 범위: 200nM - 0.7 pM)을 4 pM의 bio-VEGF165에 첨가하고 15분간 인큐베이션하였다. 이어서 VEGFR2-Fc(0.4nM) 및 항-Fc VHH 코팅된 수용체 비드(20㎍/ml)을 첨가하고 이 혼합물을 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하고, Envison 마이크로플레이트 리더기에서 형광을 측정하였다. 투여-반응 곡선은 도 22에 나타나 있다. 인간 VEGF165 - 인간 VEGFR2-Fc의 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC50 값은 표 37에 요약하였다.
표 37: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 경합 알파스크린에서의 VHH에 대한 IC50 (pM) 값 및 % 저해
Figure pct00058

12.4. 인간 VEGF165 /인간 VEGFR1 - Fc 차단 알파스크린에서의 항- VEGF165 VHH 의 평가
인간 VEGF165/인간 VEGFR1-Fc 차단 알파스크린에서 VHH의 차단 능력도 평가하였다. 요컨대, 0.03%의 Tween 20(Sigma)을 함유하는 PBS 버퍼 중의 일련의 정제된 VHH 희석액(농도 범위: 500nM - 1.8 pM)을 0.4 nM의 bio-VEGF165에 첨가하고 15분간 인큐베이션하였다. 이어서 VEGFR1-Fc(1 nM) 및 항-Fc VHH 코팅된 수용체 비드(20㎍/ml)를 첨가하고 이 혼합물을 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하고, Envison 마이크로플레이트 리더기에서 형광을 측정하였다. 투여-반응 곡선은 도 23에 나타나 있다. 인간 VEGF165 - 인간 VEGFR1-Fc의 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC50 값은 표 38에 요약하였다.
표 38: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 경합 알파스크린에서의 VHH에 대한 IC50 (pM) 값 및 % 저해
Figure pct00059

12.5. 인간 VEGF165 - VHH 상호작용의 친화력 판정
비아코어 T100 기기에서의 SPR에 의해 hVEGF165를 갖는 VHH VEGFⅡ23B4의 결합 동역학을 분석하였다. 제조합 인간 VEGF165를 아민 커플링(EDC 및 NHS를 이용하여)을 통해 CM5 칩에 직접 고정하였다. VHH는 10 내지 360nM 내의 서로 다른 농도에서 분석하였다. 샘플들을 2분간 주입하고 45㎕/분의 유속으로 20분까지 분리되도록 하였다. 샘플 주입 중간에, 칩 표면을 100mM HCl로 재생시켰다. HBS-EP+ (Hepes 버퍼 pH7.4 + EDTA)를 러닝 버퍼로 사용하였다. 결합 곡선은 2 상 반응 모델(Two State Reaction model)을 이용하여 비아코어 T100 이벨류에이션 소프트웨어 v2.0.1에 의해 피팅하였다. 항-VEGF VHH의 계산된 친화력은 표 39에 나열하였다.
표 39: 재조합 인간 VEGF165에 대한 정제된 VHH의 친화력 KD (nM)
Figure pct00060
(a) 1:1 피팅되지 않은 이종 결합 곡선, 곡선은 2상 반응 모델(Two State Reaction model)을 이용하여 비아코어 T100 이벨류에이션 소프트웨어에 의해 피팅하였다.
12.6. 마우스 VEGF164 에 대한 결합
마우스 VEGF164에 대한 교차-결합반응성을 결합 ELISA를 이용하여 판정하였다. 요컨대, 재조합 마우스 VEGF164(R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 하룻밤 동안 4℃에서 1㎍/mL로 코팅하였다. 웰을 카세인 용액(PBS 중 1%)으로 블로킹하였다. 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma)을 함유하는 PBS 버퍼 중의 일련의 희석액(농도 범위: 500nM - 32pM)으로 VHH를 적용하였으며 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-HRP 컨쥬게이트(DAKO), 및 기질 TMB(3,3'5,5'-테트라멘틸벤지딘)(Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재 하에서의 후속 효소반응을 이용하여 검출하였다(도 24). 마우스 VEGF164에 반응하는 mAb를 양성 제어로 포함시켰다. 또한 레퍼런스로서 인간 VEGF165에 대한 결합을 측정하였다. EC50 값은 표 40에 요약하였다.
표 40: 재조합 인간 VEGF165 및 마우스 164 결합 ELISA에서의 VHH에 대한 EC50 (pM) 값
Figure pct00061
NB, 결합하지 않음
12.7. VEGF121 에 대한 결합
고체상 결합 ELISA를 통해 재조합 인간 VEGF121에 대한 결합을 평가하였다. 요컨대, 재조합 인간 VEGF121(R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)을 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 하룻밤 동안 4℃에서 1㎍/mL로 코팅하였다. 웰들을 카세인 용액(PBS 중에 1%)으로 블로킹하였다. 0.1% 카세인 및 0.05% Tween 20(Sigma)을 함유하는 PBS 버퍼 중의 일련의 희석액(농도 범위: 500nM - 32pM)으로 VHH를 적용하였으며 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-HRP 컨쥬게이트(DAKO), 및 기질 TMB(3,3'5,5'-테트라멘틸벤지딘)(Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재 하에서의 후속 효소반응을 이용하여 검출하였다(도 25). VEGFR2의 연속 희석액을 양성제어로 사용하였다. EC50 값은 표 41에 요약하였다.
표 41: 재조합 인간 VEGF121 결합 ELISA에 있어서의 단가 VHH에 대한 EC50 (pM) 값
Figure pct00062

12.8. VEGF 패밀리 구성원 VEGFB , VEGFC , VEGFD 및 PIGF 에 대한 결합
고체상 결합 ELISA를 통해 VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PIGF에 대한 결합을 평가하였다. 요컨대, VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PIGF(R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 하룻밤 동안 4℃에서 1㎍/mL로 코팅하였다. 웰들을 카세인 용액(PBS 중에 1%)으로 블로킹하였다. VHH를 일련의 희석액(농도 범위: 500nM - 32pM)으로 적용하였으며 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-AP 컨쥬게이트(Sigma, St Louis, MO, USA)를 이용하여 검출하였다. 적절한 수용체의 일련의 희석액을 양성 제어로 사용하였으며 호스라디시 퍼옥시다아제(HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 항체(Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA), 및 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘)(Pierce, Rockford, IL, USA)의 존재 하에서의 후속 효소 반응으로 검출하였다. VHH 및 대조군의 투여-반응 곡선은 도 26에 나타냈다. 그 결과는 선발된 VHH가 VEGFB, VEGFC, VEGFD 또는 PIGF에 대해 검출가능한 결합을 하지 않는다는 것을 보여준다.
12.9. 에피토프 비닝( binning )
어떤 VEGF 바인더가 유사 또는 중첩하는 에피토프에 VEGFBⅡ23B04로서 결합하는지를 조사하기 위하여 비아코어-기반 에피토프 비닝 시험을 수행하였다. 이를 위해, VEGFBⅡ04를 CM5 센서칩에 고정시켰다. 각 샘플에 대하여, 인간 VEGF165를 칩 표면에 통과시키고 가역적으로 VEGFBⅡ23B4에 의해 포획하였다. 그리고 나서 정제된 VHH(100nM) 또는 주변세포질 추출물(1/10 희석)을, 240초의 표면 접촉 시간 및 10㎕/분의 유속으로 주입하였다. 서로 다른 샘플들 중간에, 표면을 재생 버퍼(100mM HCl)로 재생시켰다. VHH는 두 개의 그룹으로 나눌 수 있다; VEGFBⅡ23B04 포획된 VEGF에 추가적으로 결합하는 첫 번째 그룹 및 VEGFBⅡ23B04 포획된 VEGF에 동시에 결합할 수 없는 두 번째 그룹(이 그룹에는 선발된 VHH 24C04, 23A06 및 23B04가 존재한다).
VEGFR1, VEGF2, 라니비주맵 및 베바시주맵이 VEGFBⅡ23B04와 동시에 인간 VEGF-165에 결합할 수 있는지를 평가하기 위하여 동일한 분석 셋업을 사용하였다. 표 42는 VEGFBⅡ23B04 포획된 VEGF165에 대한 추가적인 결합반응을 나타낸다. VEGFR2만이 VEGFBⅡ23B04 포획된 VEGF165에 결합할 수 없었는데, 이는 VEGF-VEGFR2의 상호작용에 대한 VEGFBⅡ23B04의 차단 능력이 중요함을 보여주는 것이다. 또한, 이들 데이터는 VEGFBⅡB04 에피토프가 베바시주맵 및 라니비주맵 에피토프에 대응하지 않는다는 것을 보여준다.
표 42: VEGFBⅡ23B04의 에피토프 결합 - VEGFBⅡ23B04-포획된 VEGF165에 대한 기준(benchmark) 저해제 또는 유사 수용체의 결합
Figure pct00063

12.10. HUVEC 증식 분석에 있어서 항- VEGF VHH 의 특성화
선발된 VHH의 효능을 증식 분석에서 평가하였다. 요컨대, 최초의 HUVEC 세포(Technoclone)를 96-웰 조직 배양 플레이트에서 보충제 없이 하룻밤 동안 두고 난 후, 4000개의 세포/웰을 4중으로 시드(seed)하였다. VHH의 존부하에서 33ng/mL의 VEGF로 세포에 자극을 주었다. 증식율은 4일 째 [3H] 티미딘 결합에 의해 측정하였다. 표 43에 나타나 있는 HUVEC 증식 분석의 결과는 VEGFBⅡ23B04 및 베바시주맵이, VEGF-유도된 HUVEC 증식을 90% 이상, 1nM 미만으로 저해한다는 것을 보여준다.
표 43: VEGF HUVEC 증식 분석에 있어서 단가 VEGFBⅡ23B04, VEGFBⅡ23A06 및 VEGFBⅡ24C04의 IC50 (nM) 값 및 % 저해
Figure pct00064
Figure pct00065

12.11. HUVEC Erk 인산화 분석에 있어서의 항-VEGF VHH의 특성화
선발된 VHH의 효능을 HUVEC Erk 인산화 분석에서 평가하였다. 요컨대, 최초의 HUVEC 세포를 혈청을 공급하지 않고 하룻밤 동안 두고 난 후, 10ng/mL VEGF로 5분간 VHH의 존부하에서 자극을 주었다. 세포를 PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정시키고, ERK 인산화 수준을 인산ERK-특이적 항체(항-인산MAP 키나아제 pERK1&2, M8159, Sigma) 및 폴리클로날 래빗 항-마우스-이뮤노글로불린-HRP 컨쥬게이트(PO161, Dako)를 이용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 표 44에 나타난 바와 같이, VEGFBⅡ23B4 및 베바시주맵은 VEGF 유도 Erk 인산화를 적어도 90%까지, 1nM 미만의 IC50으로 저해한다.
표 44: VEGF HUVEC Erk 인산화 분석에서의 단가 VEGFBⅡ23B04의 IC50 (nM) 값 및 % 저해
Figure pct00066

실시예13
VHH 를 차단하는 다가 항- VEGF 의 생성
VHH VEGFBⅡ23B04를 VEGFBⅡ23B04와 유전적으로 융합하여 동종이합체 VHH를 제조하거나 아니면 서로 다른 VEGF-결합 VHH와 융합하여 이종이합체 (2가) VHH를 제조하였다. 2가 VHH를 생성하기 위하여, 9 또는 40개의 Gly-Ser 플렉서블 링커(flexible linker)를 통하여 10개의 고유 VEGF-결합 VHH 집단을 2개의 다른 방향으로 VEGFBⅡ23B04에 연결하였다. 동종이합체 VEGFBⅡ23B04(VEGFBⅡ010) 및 40개의 이종이합체 2가 VVHH를 E. coli TG1에서 c-myc, His6-태깅된 단백질로 발현하였다. 1mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 37℃에서 4시간 동안 계속 배양하였다. 세포 배양액을 원심분리한 후, 펠렛을 동결-융해(freeze-thawing)하여 주변세포질 추출물을 준비하였다. 이들 추출물을 출발 물질로 사용하여 IMAC 및 탈 염화로 정제한 후 SDS-PAGE를 통해 판정한 결과 90%의 순도의 VHH를 수득하였다. 동종이합체 및 선발된 이가 VEGF-결합 VHH의 아미노산 서열은 서열번호: 48-53 및 표 45에 나타나 있다.
표 45: 선발된 2가 항-VEGF VHH의 서열 번호, VHH 번호 및 아미노산 서열
Figure pct00067
40개의 VHH 집단을, 실시예 12.3 및 12.4에서 설명한 바와 같이 VEGFR2 및 VEGFR1 차단 알파스크린 분석으로 각각 테스트하였다. 저해효능 및 최대저해수준을 기준으로, 가장 우수한 5개의 VHH(VEGFBⅡ021, VEGFBⅡ022, VEGFBⅠ023, VEGFBⅠ024 및 VEGFBⅡ025 - 표 45 참조)를 추가 특성화하기 위해 선발하였다. 경합적 VEGFR2 및 VEGFR1 알파스크린에서 선발된 5개의 2가 VHH에 대한 스크린 결과의 개요는 표 46에 나타나있다.
표 46: VEGF/VEGFR1 및 VEGF/VEGFR2 경합적 알파스크린 분석에서 선발된 5개의 이중 특이적 이가 VHH의 효능 및 유효성
Figure pct00068

실시예14
포맷된 항- VEGF VHH 의 특성화
VHH VEGFBⅡ010, VEGFBⅡ021, VEGFBⅡ022, VEGFBⅡ023, VEGFBⅡ024 및 VEGFBⅡ025를 실시예 12.1, 12.2, 12.3 및 12.4에서 설명한 바와 같이 VEGFR2 및 VEGFR1 차단 ELISA(각각 도 27 및 28, 표 47 및 표 48), 및 알파스크린 분석(도 29 및 30, 표 49 및 50)으로 각각 비교하였다.
표 47: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 경합적 ELISA에서 포맷된 VHH의 IC50(pM) 값 및 % 저해
Figure pct00069

표 48: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 경합적 ELISA에서 포맷된 VHH의 IC50(pM) 값 및 % 저해
Figure pct00070

표 49: hVEGF165/hVEGFR2-Fc 경합적 알파스크린에서 포맷된 VHH의 IC50(pM) 값 및 % 저해
Figure pct00071

표 50: hVEGF165/hVEGFR1-Fc 경합적 알파스크린에서 포맷된 VHH의 IC50(pM) 값 및 % 저해
Figure pct00072

또한, 포맷된 VHH의 mVEGF164/mVEGFR2-huFc 상호작용 차단 능력을 테스트하였다. 요컨대, 0.03% Tween 20(Sigma)을 포함하는 PBS 버퍼 중의, 일련의 정제 VHH 희석액을 0.1nM 비오틴화된 mVEGF164에 첨가하고 15분간 인큐베이션하였다. 이어서 마우스 VEGFR2-huFc(0.1nM) 및 항-huFc VHH-코팅된 수용체 비드(20㎍/ml)을 첨가한 후, 이 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 스트렙타비딘 공여체 비드(20㎍/ml)를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션한 후, Envision 마이크로플레이트 리더기에서 형광을 측정하였다. 도 31은 투여-반응 곡선을 나타낸 것이다. 마우스 VEGF164/VEGFR2-huFc 상호작용을 차단하는 VHH에 대한 IC50 값은 표 51에 요약하였다.
표 51: mVEGF164/mVEGFR2-hFc 경합적 알파스크린에서 포맷된 항-VEGF VHH의 IC50 (pM) 값 및 % 저해
Figure pct00073
또한, ELISA로 mVEGF164 및 rhVEGF165(실시예 12.6; 도 32; 표 52), VEGF121(실시예 12.7; 도 34; 표 53) 및 VEGF 패밀리 구성원 VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PIGF(실시예 12.8; 도 33)에 대한 포맷된 VHH의 결합 능력을 테스트하였다. 인간 VEGF165에 대한 결합 동역학을 실시예 12.5에서 설명한 바와 같이 분석하였다. KD 값은 표 54에 나열하였다.
표 52: 재조합 인간 VEGF165 및 마우스 VEGF164 결합 ELISA에서 포맷된 VHH의 EC50(pM) 값
Figure pct00074

표 53: 재조합 인간 VEGF121 결합 ELISA에서 포맷된 VHH의 EC50(pM) 값
Figure pct00075

표 54: 재조합 인간 VEGF165에 대한 포맷된 정제 VHH의 친화력 KD(nM)
Figure pct00076
(a) KD=kd1/ka1×(kd2/(kd2+ka2))
(b) 곡선은 2 상 반응 모델을 이용하여 비아코어 T100 이벨류에이션 소프트웨어 v2.0.1에 의해 피팅하였다
또한, VHH VEGFBⅡ010, VEGFBⅡ022, VEGFBⅡ024, 및 VEGFBⅡ025를 VEGF 매개 HUVEC 증식 및 Erk 인산화 분석으로 테스트하였다.
포맷된 선발 VHH의 효능을 증식 분석에 의해 평가하였다. 요컨대, 최초의 HUVEC 세포(Technoclone)를 보충제 없이 하룻밤 동안 두고 난 후, 4000개의 세포/웰을 4중으로 96-웰 조직 배양 플레이트에 시드(seed)하였다. VHH의 존부하에서 330ng/mL의 VEGF로 세포를 자극하였다. 증식율은 4일 째 [3H] 티미딘 결합에 의해 측정하였다. 표 55에 나타나 있는 결과는 포맷된 VHH 및 베바시주맵이 VEGF 유도된 HUVEC 증식을 90% 이상, 1nM 미만의 IC50으로 저해한다는 것을 보여준다.
표 55: VEGF HUVEC 증식 분석에서 포맷된 VHH의 IC50(nM) 값 및 % 저해
Figure pct00077
또한, 포맷된 선발 VHH의 효능을 HUVEC Erk 인산화 분석으로 평가하였다. 요컨대, 최초의 HUVEC 세포를 혈청을 공급하지 않고 하룻밤 동안 두고 난 후, 10ng/mL VEGF로 5분간 VHH의 존부 하에서 자극을 주었다. 세포를 PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정시키고, ERK 인산화 수준을 인산ERK-특이적 항체(항-인산MAP 키나아제 pERK1&2, M8159, Sigma) 및 폴리클로날 래빗 항-마우스-이뮤노글로불린-HRP 컨쥬게이트(PO161, Dako)를 이용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 표 56에 나타난 바와 같이, 포맷된 VHH 및 베바시주맵은 VEGF 유도 Erk 인산화를 적어도 90%까지, 1nM 미만의 IC50으로 저해한다.
표 56: VEGF HUVEC Erk 인산화 분석에서 포맷된 VHH의 IC50(nM) 값 및 % 저해
Figure pct00078

실시예15
서열 최적화
15.1. VEGFB Ⅱ23B04의 서열 최적화
VEGFBⅡ23B04의 아미노산 서열을 인간 생식세포 계열 서열 VH3-23(DP-47) 및 JH5와 정렬하였다; 도 35 및 서열 번호: 100 참조. 서열 정렬은 VEGFBⅡ23B04가 생식세포 계열 서열 레퍼런스에 비교하여 19개의 골격 부위 변이를 포함한다는 것을 보여주었다. 14, 16, 23, 24, 41,71, 82, 83 및 108 위치에서의 비-인간 잔기를 인간 생식세포 계열의 대응 잔기로 치환하기 위해 선택했다. 이들 위치에서 서로 다른 조합의 인간 잔기를 포함하는 8개의 일련의 VEGFBⅡ23B04 변이를 제조하였다(아미노산 서열은 표 57에 나열함). 잠재적인 이성화(isomerization) 자리인 D59S60(CDR2 부위, 도 35에 볼드 이탤릭체로 표시된 잔기)에 S60A 변이를 도입하여 제거한 1개의 변이체를 추가로 컨스트럭션하였다.
표 57: VHH VEGFBⅡ23B04의 서열-최적화된 변이의 아미노산 서열 (FR, 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00079

Figure pct00080
이들 변이체의 정제된 단백질을 VEGF165/VEGFR2 알파스크린으로 특성화하였다(실시예 12.3, 도 36). 각 클론의 녹는 온도(Tm)를 열 전이 분석(thermal shift assay)으로 결정하였는데, 이는 Sypro Orange(Invitrogen)의 결합에 따른 형광 신호의 증가에 기초한다(Ericssion et al., Anal. Biochem. 357 (2006), 289-298쪽). 모든 변이들은 VEGFBⅡB04와 비슷한 IC50 값 및, 모체 VEGFBⅡ23B04에 비해 유사하거나 더 높은 Tm 값을 보였다. 표 58은 9개의 테스트된 클론들에 대한 IC50 값, % 저해 및 pH 7에서의 Tm 값을 요약한 것이다.
표 58: VEGFBⅡB04의 서열-최적화된 변이의 IC50(pM) 값, % 저해 및 녹는 온도(pH 7에서)
Figure pct00081
2번째 사이클에서, 인간화 시도로부터 허용되는 변이(tolerated mutation)(VEGFBⅡ111G06) 및 잠재적 번역 후 변형 자리(D16G, S60A 치환 및 E1D 변이)에 대한 변이를 결합하여 VEGFBⅡ23B04 유래 서열-최적화된 클론인 VEGFBⅡ0037을 얻었다. I82M 변이를 제외한 VEGFBⅡ0037의 모든 치환을 포함하는, 서열-최적화된 하나의 추가 변이(VEGFBⅡ038)도 함께 시험하였는데, 이러한 변이는 효능의 저하가 거의 없기 때문이다. 양 서열-최적화된 클론의 서열은 표 59에 나열하였다. VEGFBⅡ0037 및 VEGFBⅡ0038은 VEGF165/VEGFR2 차단 알파스크린으로 특성화하였고(실시예 13.3, 도 37), 녹는 온도는 상기된 바와 같이 열 전이 분석으로 결정하였으며 VEGF165에 대한 결합 친화력은 비아코아로 판정하였다(실시예 13.5). 2개의 서열-최적화된 VHH의 특성에 대한 개요는 표 60에 나타냈다.
표 59: VHH VEGFBⅡ23B04의 서열-최적화된 변이의 아미노산 서열
Figure pct00082

표 60: 서열-최적화된 클론 VEGFBⅡ037 및 VEGFBⅡ038의 IC50(pM) 값, % 저해, 녹는 온도(pH 7에서) 및 친화력(pM)
Figure pct00083

15.2. VEGFB Ⅱ5B05의 서열 최적화
VEGFBⅡ5B05의 아미노산을 인간 생식세포 계열 서열 VH3-23/JH5와 정렬하였다; 도 38 및 서열 번호: 100 참조. 서열 정렬 결과 VEGFBⅡ5B05는 생식세포 계열 서열 레퍼런스에 대해 15개의 골격 부위 변이를 포함하였다. 23, 60, 83, 105, 108 위치에서의 비-인간화 잔기를 이들의 인간 생식세포 계열 대응 잔기로 치환하기 위하여, 반면 44 위치의 히스티딘은 글루타민으로 치환하기 위해 선택하였다. 6개의 상기 변이를 포함하는, 1개의 인간화 변이체를 컨스트럭션하였다(아미노산 서열은 표 61에 나열).
표 61: VHH VEGFBⅡ5B05의 서열-최적화된 변이체의 아미노산 서열(FR, 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00084
잠재적 산화 자리인 M30(CDR1 부위, 도 38에서 볼드 이탤릭 표시된 잔기 참조)에 M30I 변이를 도입함으로써 1개의 추가 변이체를 컨스트럭션하였다. ProteOn을 이용하여 이들의 hVEGF165 결합 능력을 테스트하였다. 요컨대, GLC ProteOn 센서칩을 인간 VEGF165로 코팅하였다. 변이체의 주변세포질 추출물을 1/10로 희석하고 인간 VEGF165로 코팅된 칩 전체에 주입하였다. 오프율을 계산하고 모체 VEGFBⅡ5B05의 오프율과 비교하였다. 2개의 변이체의 오프율은 모체 VEGFBⅡ5B05의 오프율과 동일 범위인데, 이는 모든 변이들이 허용됨을 의미한다(표 62).
표 62: 서열-최적화된 변이체 VEGFBⅡ5B05의 오프율
Figure pct00085
2번째 사이클에서, 인간화 시도에 의한 변이 및 M30I 치환을 결합하여 VEGFBⅡ5B05의 서열-최적화된 클론, VEGFBⅡ032를 얻었다. 서열은 표 63에 나열하였다. VEGFBⅡ032의 친화력을 비아코어로 결정하였고(실시예 12.5 참고), 녹는 온도는 상기 열 전이 분석에 의하여 결정하였다. 서열-최적화된 VHH VEGFBⅡ032의 특성에 대한 개요는 표 64에 나타냈다.
표 63: 서열-최적화된 클론 VEGFBⅡ의 아미노산 서열(FR, 골격 부위; CDR, 상보성 결정 부위)
Figure pct00086

표 64: 서열-최적화된 클론 VEGFBⅡ032의 녹는 온도(pH 7에서) 및 친화력(nM)
Figure pct00087

서열-최적화된 클론 VEGFBⅡ037 및 VEGFBⅡ038의 효능을 증식 분석으로 평가하였다. 요컨대, 최초 HUVEC 세포(Technoclone)를 보충제 없이 하룻밤 동안 두고 난 후, 4000개의 세포/웰을 4중으로 96-웰 조직 배양 플레이트에 시드하였다. VHH의 존부 하에서, 33ng/mL의 VGF로 세포를 자극하였다. 증식율은 4일 째 [3H] 티미딘 결합에 의해 측정하였다. 표 65에 나타난 결과는 모체 VHH VEGFBⅡ23B04의 활성(효능 및 저해 정도)이 서열-최적화된 클론인 VEGFBⅡ038에서 유지된다는 것을 보여준다.
표 65: VEGF HUVEC 증식 분석에서 서열-최적화된 클론 VEGFBⅡ037 및 VEGFBⅡ038의 IC50(nM) 값 및 % 저해
Figure pct00088

실시예16
페길화 또는 항-혈청 알부민 결합을 이용하여 반감기가 연장되는, VEGF 및 DLL4를 타겟으로 하는 이중 특이적 VHH 의 컨스트럭션 및 특성화
1번째 사이클에서, 이중 특이적 VHH인 VEGFDLLBⅡ001-006을 제조하기 위한 빌딩 블록으로 VEGFBⅡ23B04 및 DLLBⅡ101G08를 사용하였다. 반감기 연장 방법으로는 ⅰ) 페길화 또는 ⅱ) 혈청 알부민 결합 VHH로의 유전적 융합을 시도하였다. 빌딩 블록들은, 플렉서블 링커인 9 Gly-Ser, 35 Gly-Ser 또는 35 Gly-Ser(15 위치에 Cys)을 통하여 연결하였다. 6개의 모든 이중 특이적 VHH의 포맷 및 서열의 개요는 표 66-A(링커 서열은 밑줄), 서열 번호: 68-73 및 도 39에 나타나 있다.
표 66-A: VEGF 및 DLL4를 타겟으로 하는 이중 특이적 VHH의 서열
Figure pct00089
항-VEGF 차단 특성을 단가 빌딩 블록 VEGFBⅡ23B04와 비교하여 알아보기 위하여, 6개의 모든 VHH를 VEGF/VEGFR2-Fc(실시예 12.3; 도 41) 및 VEGF/VEGFR1-Fc(실시예 12.4; 도 42) 경합적 알파스크린으로 분석하였다. 이들 2가지 경합적 분석은 5μM의 인간 혈청 알부민과 함께 VHH를 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. IC50 값은 표 66-B에 요약하였다.
표 66-B: VEGF/VEGFR1 및 VEGF/VEGFR2 경합적 알파스크린에서 IC50 (nM) 값 및 % 저해(VHH 포맷에 대한 설명은 도 39 참조)
Figure pct00090
n/d, 미판정
단가 빌딩 블록 DLLBⅡ101G08과 비교하여 항-DLL4 차단 특성을 알아보기 위하여, 6개의 모든 VHH를 CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 경합적 FMAT 분석으로 테스트하였다(실시예 4; 도 43). 이 분석은 VHH를 25μM 인간 혈청 알부민과 함께 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. IC50 값은 표 67에 요약하였다.
표 67: CHO-hDLL4 경합적 FMAT에서의 IC50(nM) 값. VHH 포맷에 대한 설명은 표 39 참조.
Figure pct00091
n/d, 미판정
2번째 사이클에서, VEGF 및 DLL4를 타겟으로 하는 7개의 이중 특이적 VHH를 컨스트럭션하였다(VEGFDLLBⅡ010, VEGFDLLBⅡ011, VEGFDLLBⅡ012, VEGFDLLBⅡ013, VEGFDLLBⅡ014, VEGFDLLBⅡ015, VEGFDLLBⅡ016)). 이들 컨스트럭트에는, DLLBⅡ101G08 친화력 성숙된 VHH DLLBⅡ129B05 또는 DLLBⅡ115A05 친화력 성숙된 VHH DLLBⅡ136C07가 포함되었다. 또한, 2개의 컨스트럭트에는 VEGFBⅡ23B04 및 VEGFBⅡ5B05를 포함하는 이가 항-VEGF VHH가 포함되었다. 반감기 연장 방법으로 ⅰ) 페길화 또는 ⅱ) 혈청 알부민 결합 VHH로의 유전적 융합을 시도하였다. 빌딩 블록들은 9 Gly-Ser, 35 Gly-Ser 또는 35 Gly-Ser(15 위치에 Cys) 플렉서블 링커를 통하여 연결하였다. 7가지 모든 이중 특이적 VHH의 포맷 및 서열에 대한 개요는 표 68-A(밑줄은 링커 서열), 서열 번호: 74-80 및 도 40에 나타나 있다.
단가 빌딩 블록 VEGFBⅡ23B04와 비교하여 항-VEGF의 차단 특성을 알아보기 위하여, 7가지 모든 VHH를 VEGF/vEGFR2-Fc(실시예 12.3; 도 44) 및 VEGF/VEGFR1-Fc(실시예 12.4; 도 45) 경합 알파스크린으로 특성화하였다. 이들 2가지 경합적 분석은 VHH를 5μM 인간 혈청 알부민과 함께 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. IC50 값은 표 68-B에 요약하였다.
표 68-A: VEGF 및 DLL4를 타겟으로 하는 이중 특이적 VHH의 서열
Figure pct00092
Figure pct00093

표 68-B: VEGF/VEGFR1 및 VEGF/VEGFR2 경합적 알파스크린에서 IC50 값(nM) 및 % 저해 (VHH 포맷에 대한 설명은 도 40 참조; 밑줄은 링커 서열) 서열 번호: 74-80
Figure pct00094
n/d, 미판정
단가의 친화력-성숙된 빌딩 블록 DLLBⅡ129B05 및 DLLBⅡ136C07과 비교하여 항-DLL4의 차단 특성을 알아보기 위하여, 7가지의 모든 VHH를 CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 경합적 FMAT 분석(실시예 4; 도 46) 및 DLL4-매개 리포터 분석(실시예12.5; 도 47)으로 평가하였다. 또한 이들 분석은 25μM(FMAT 분석) 또는 175μM(리포터 분석)의 인간 혈청 알부민과 함께 VHH를 미리 인큐베이션하여 수행하였다. IC50 값은 표 69에 요약하였다.
표 69: CHO-hDLL4/CHO-mDLL4 경합적 FMAT 및 DLL4 매개 리포터 분석에서의 IC50 값 (nM) (VHH 포맷에 대한 설명은 도 40 참조). (*, 전체 투여 반응 곡선이 없음)
Figure pct00095

마지막으로, 3번째 사이클에서, 이중 특이적 VHH A1, A2, A3 및 HSA1-6을 컨스트럭션하였다. 이들 컨스트럭트를 제조하기 위하여 다음의 빌딩 블록들을 사용하였다: VEGFⅡ038(VEGFBⅡ23B04의 서열-최적화된 변이체), VEGFBⅡ032(VEGFBⅡ5B05의 서열-최적화된 변이체), DLLBⅡ018(DLLBⅡ129B05의 서열-최적화된 변이체) 및 DLLBⅡ039(DLLBⅡ136C7의 서열-최적화된 변이체). 반감기 연장 방법으로 ⅰ) 페길화, ⅱ) 혈청 알부민 결합 VHH와 유전적 융합 및 ⅲ) 인간 혈청 알부민과 유전적 융합을 시도하였다. 빌딩 블록들은 9 Gly-Ser, 35 Gly-Ser 또는 35 Gly-Ser(위치 15는 Cys) 플렉서블 링커를 통하여 연결하였다. 3개의 모든 이중 특이적 VHH의 포맷 및 서열에 대한 개요는 표 70-A, 서열 번호: 81-89 및 도 48에 나타나 있다.
단가의 서열 최적화된 빌딩 블록 VEGFBⅡ038 또는 서열 최적화된 바이파라토프성 빌딩 블록 VEGFBⅡ022와 비교하여 항-VEGF 차단 특성을 알아보기 위하여, 7개의 모든 VHH를 VEGF/VEGFR2-Fc(실시예 12.3; 도 49) 및 VEGF/VEGFR1-Fc(실시예 12.4; 도 50) 경합적 알파스크린으로 특성화하였다. 또한 이들 2가지 경합적 분석은 5μM의 인간 혈청 알부민과 함께 VHH를 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. IC50 값은 표 70-B에 요약하였다.
표 70-A: VEGF 및 DLL4를 타겟으로 하는 이중 특이적 VHH의 서열
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098

Figure pct00100

표 70-B: VEGF/VEGFR1 및 VEGF/VEGFR2 경합적 알파스크린에서의 IC50 값(nM) 및 % 저해(VHH 포맷에 대한 설명은 도 48 참조). 모든 분자는 VEGF/VEGFR2 알파스크린 분석에서 100% 저해를 나타냈다.
Figure pct00101
n/d, 미판정
범례
Figure pct00102
단가의 서열-최적화된 빌딩 블록 DLLBⅡ018 및 DLLBⅡ039와 비교하여 항-DLL4의 차단 특성을 알아보기 위하여, 7개의 모든 VHH를 CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 경합적 FMAT 분석으로 평가하였다(실시예 4; 도 51). 이들 분석은 25μM의 (FMAT 분석) 인간 혈청 알부민과 함께 VHH를 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. IC50 값은 표 71에 요약하였다.
표 71: CHO-hDLL4/CHO-mDLL4 경합적 FMAT에서의 IC50 값(nM), 및 DLL4 매개 리포터 분석 (포맷에 대한 설명은 표 70-A, 도 48 및 서열 번호: 81-89 참조)
Figure pct00103
n/d, 미판정
범례
Figure pct00104

이중 특이적 VHH의 효능을 VEGF 증식 분석으로 평가하였다. 요컨대, 최초 HUVEC 세포 (Technoclone)를 보충제 없이 하룻밤 동안 두고 난 후, 4000개의 세포/웰을 4중으로 96-웰 조직 배양 플레이트에 시드하였다. VHH의 존부 하에서, 33ng/mL의 VGF로 세포를 자극하였다. 이 분석은 520nM 인간 혈청 알부민과 함께 VHH를 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. 증식율은 4일 째 [3H] 티미딘 결합에 의해 측정하였다. 표 72에 나타난 결과는 이중 특이적 VHH 및 베바시주맵이 VEGF 유도된 HUVEC 증식을 90% 이상, 1nM 미만의 IC50으로 저해한다는 것을 보여준다.
표 72: VEGF HUVEC 증식 분석에서 이중 특이적 VHH의 IC50 (nM) 값 및 % 저해
Figure pct00105
n/d, 미판정
범례:
Figure pct00106

이중 특이적 VHH의 효능은 VEGF HUVEC Erk 인산화 분석으로 평가하였다. 요컨대, 최초 HUVEC 세포를 혈청이 없이 하룻밤 동안 두고 난 후, VHH의 존부 하에서 10ng/mL의 VEGF로 5분간 자극하였다. 이 분석은 지시된 대로, 250nM의 인간 혈청 알부민으로 VHH를 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. 세포를, PBS 중의 4% 포름알데하이드로 고정시키고 ERK 인산화 수준을 인산ERK-특이적 항체(항-인산MAP 키나아제 pERK1&2, M8159, Sigma) 및 폴리클로날 래빗 항-마우스-이뮤노글로불린-HRP 컨쥬게이트(PO161, Dako)를 이용하여 ELISA로 측정하였다. 표 73에 나타난 대로, 이중 특이적 VHH 및 베바시주맵은 VEGF 유도된 Erk 인산화를 90%, 1nM 미만의 IC50으로 저해한다.
표 73: VEGF HUVEC Erk 인산화 분석에서 이중 특이적 VHH의 IC50 (nM) 값 및 % 저해
Figure pct00107
n/d, 미판정
범례
Figure pct00108

「Ridgeway et al., Nature. 2006 Dec 21; 333(7122): 1083-7」의 설명을 변형한 형태로 DLL4 HUVEC 증식 분석하여 이중 특이적 VHH의 효능을 평가하였다. 요컨대, 96-웰 조직 배양 플레이트를, 코팅 버퍼(PBS, 0.1% BSA) 중의 정제된 DLL4-His(R&D Systems; C-말단 His-태깅된 인간 DLL4, 아미노산 27-524, 0.75ml/웰, 10ng/ml)로 코팅하였다. 4000개의 HUVEC 세포/웰을 4중으로 시드하기 전에 웰을 PBS에서 세척하였다. 이 분석은 지시된 대로, 50nM의 인간 혈청 알부민으로 VHH를 미리 인큐베이션한 후 수행하였다. 세포 증식은 4일 째 [3H]-티미딘 결합에 의해 측정하였다. 이중 특이적 VHH 및 DLL4 Fab의 IC50 값를 표 74에 요하였다.
표 74: DLL4-매개 HUVEC 증식 분석에서의 이중 특이적 VHH의 IC50(nM) 값 및 저해
Figure pct00109
n/d, 미판정
범례:
Figure pct00110

실시예 17:
선발된 결합 분자의 인간 대장암 마우스 모델에서의 효능
선발된 3개의 VHH VEGFDLLBⅡ010, VEGFDLLBⅡ013 및 VEGFDLLBⅡ015를 누드 마이스(nude mice)에서의 인간 대장암(세포주 SW620) 마우스 모델로 평가하였다.
SW620은 ATCC(CCL-227)에서 얻었다. 세포를 37℃ 및 0% CO2에서 T175 조직 배양 플라스크를 이용하여 배양하였다. 사용된 배지는 레이보비츠(Leibovitz's) L-15 배지(Gibco Cat. 11415) 및 10%의 신생 우아 혈청(fetal calf serum)(JRH Cat. 12103-1000ml)이다. 배양액을 대략 80% 증식정도(subconflency)에서 1:10 또는 1:20의 분율(split ratio)로 나누었다. 마이스는 Taconic사(Denmark)의 7주된 무흉선(athymic) 자성(female) BomTac:NMRI-Foxn1 nu 이다. 피하 종양을 확립하기 위하여, SW620 세포를 트립신화(trypsinize), 세척 및 PBS + 5% FCS에서 5×107/ml로 재현탁하였다(resuspend). 5×106개의 세포를 포함하는 100㎕의 세포 현탁액을 마이스의 오른쪽 옆구리로 피하 주입하였다. 종양이 잘 확립되고 부피가 47 내지 93mm3가 되면(세포 주입 후 10일), 마이스를 처리군 및 대조군으로 무작위 배분하였다.
VHH를 PBS로 희석하였다.
투여량은 Avastin(베바시주맵)과 동등하게 각각, 7.5mg/kg, 2.5mg/kg 및 15mg/kg이 되도록 하였다(표 75). 모든 투여량은 0일째 모든 마이스의 평균 체중(27.7g)에 따라 계산하였으며 마우스 당 100㎕의 부피로 투여하였다. VHH는 매일 또는 이틀마다 복강 내로 투여하였다. 최초 처리는 1일째, 최후 처리는 21일째 하였다.
종양 직경은 주당 3회(월요일, 수요일 및 금요일) 캘리퍼(caliper)로 측정하였다. 각각의 종양 부피[mm3 단위]는 식 "종양 부피 = 길이 × 직경2 × π/6"에 따라 계산하였다. 처리의 부작용을 모니터하기 위하여, 마이스의 이상 여부를 매일 점검하였으며 체중은 주당 3회(월요일, 수요일 및 금요일) 측정하였다. 동물들은 컨트롤 종양의 크기가 대략 평균 1000mm3가 되면 희생시켰다.
시험 마지막 날인 21일째 종양 부피 및 체중 매개변수에 대한 통계적 평가를 수행하였다. 종양 부피는 절대값이, 체중에 대해서는 1일째 최초 중량에 대한 변화 백분율을 사용하였다. 관찰된 변화(variation) 때문에, 비모수적(nonparametric) 방법을 적용하였다.
설명적 고려를 위해, 중간, 최소 및 최대 관찰 값을 계산하였다. 있을 수 있는 처리 효과를 신속히 개괄하기 위해서, 각각의 처리 그룹 T의 종량 부피의 중간값을 대조군 C의 중간값과 비교하였다.
● 상대 종양 부피 (T/C)
Figure pct00111
● 1일부터 d일째까지의 종양 성장 저해 (TGI)
Figure pct00112
여기에서, C1, T1 = 1일째 대조군 및 처리군에 있어서 종양 부피의 중간값
Cd, Td = d일째 대조군 및 처리군에 있어서 종양 부피의 중간값
세 가지 VHH의 투여 그룹을 대조군과 비교하기 위하여 한쪽 감소(one-sided decreasing) 윌콕슨(Wilcoxon) 테스트를 거쳤으며, 투여의 효과인 종양 부피의 감소 및 그 부작용인 체중 증가의 감소를 조사하였다.
다양한 비교를 위하여 종양 부피에 대한 p값(효능 매개변수)은 본페로니-홀름(Bonferroni-Holm)에 따라 조정했지만, 체중(내약성(tolerability) 매개변수)은 가능한 부작용을 간과하지 않기 위하여 조정하지 않은 상태를 유지하였다.
유의 수준(level of significance)은 α=5%에 고정하였다. (조정된) p-값이 0.05보다 작은 경우, 처리군 간에 차이가 있는 것으로 간주하였다; 0.05≤p-값＜0.10인 경우, 차이를 나타내는 것으로 보았다.
통계적 평가는 소프트웨어 패키지 SAS 9.2 버전(SAS Institute Inc., Cary NC, USA) 및 Proc StatXact(Crytel Software Corporation, Cambridge MA, USA)를이용하여 이루어졌다.
도 52 및 표 75 및 76에 나타난 바와 같이, VEGFDLLBⅡ013, VEGFDLLBⅡ010 및 VEGFDLLBⅡ015은 SW620 대장암 모델에서 유의성을 갖는 효능을 나타냈으며, 우수한 내약성을 갖는다.
도 52A는 SW620 종양 성장 동역학을 나타낸 것이다: SW620 종양을 갖는(tumor-bearing) 마이스를 VEGFDLLBⅡ013(VHH1), VEGFDLLBⅡ010(VHH2) 또는 VEGFDLLBⅡ015(VHH3)로 매일 처리하거나(열린 기호) VEGFDLLBⅡ013(VHH1) 또는 VEGFDLLBⅡ010(VHH2)로 이틀마다 처리하였다(닫힌 기호). 종양 부피 중간값을 시간에 따라 플롯팅하였다. 1일이 첫 번째 날이고, 21일이 시험의 마지막 날이다. 그래프 위에 있는 삼각형은 처리일자를 나타낸다.
도 52B는 21일의 시험 마지막에 있어서의 절대 종양 부피를 나타낸다: SW620 종양을 갖는(tumor-bearing) 마이스를 VEGFDLLBⅡ013(VHH1), VEGFDLLBⅡ010(VHH2) 또는 VEGFDLLBⅡ015(VHH3)로 매일 처리하거나(열린 기호) VEGFDLLBⅡ013(VHH1) 또는 VEGFDLLBⅡ010(VHH2)로 이틀마다 처리하였다(닫힌 기호). 21일째의 각각의 절대 종양 부피를 플롯팅하였다. 각각의 기호는 개별 종양을 나타낸다. 가로선은 종양 부피 중간값을 나타낸다.
도 52C는 시간에 따른 체중 변화를 나타낸다; SW620 종양을 갖는(tumor-bearing) 마이스를 VEGFDLLBⅡ013(VHH1), VEGFDLLBⅡ010(VHH2) 또는 VEGFDLLBⅡ015(VHH3)로 매일 처리하거나(열린 기호) VEGFDLLBⅡ013(VHH1) 또는 VEGFDLLBⅡ010(VHH2)로 이틀마다 처리하였다(닫힌 기호). 1일이 첫 번째 날이고, 21일이 시험의 마지막 날이다. 그래프 위의 삼각형은 처리일자를 나타낸다.
표 75: 종양 부피: 처리군 대 대조군 (21일째 결과)
Figure pct00113

표 76: 체중: 처리군 대 대조군 (21일째 결과)
Figure pct00114

실시예 18
마이스에서 포맷된 VHH 의 약물동태학
선발된 VHH의 마이스에서의 약물동태학을 판정하기 위하여, 33nmol/kg을 0.1mL로 여섯 동물/그룹의 BomTac:NMR-Fox1nu 자성 마이스(생후 6-7주)에 1회 투여하였다. 서로 다른 시점에(시점당 3마리 마이스), 이소플루란 마취 상태에서 대략 50㎕의 혈액을 레트로오비탈 출혈(retroorbital bleeding)에 의해 획득하였다. 샘플을 30분간 원심분리하고 20㎕의 혈청을 얻어 투석할 때까지 -20℃에 보관하였다. VHH 농도는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다.
4℃에서 하룻밤 동안 카보네이트 버퍼(pH 9.6)에서 0.5㎍/ml로 희석된 인간 VEGF(R&D Systems 293-VE/CF)를 미량 역가(microtiter) 플레이트(Medisorp Nunc)의 웰(well)마다 코팅하였다. 300㎕의 탈이온수로 세척한 후, 나머지 결합 자리를 200㎕의 블로킹 버퍼(PBS/0.5% 소혈청 알부민)/0.05% Tween 20)를 첨가하여 0.5시간 동안 블로킹하였다.
추가의 세척 단계 후, 웰당 100㎕의, 혈청 희석 배지(SDM, 블로킹 버퍼 + 2% 마우스 혈청 풀(pool), PAA Labor GmbH) 중의 기준(standard) 또는 샘플의 희석액을 ELISA 플레이트에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 플레이트 셰이커(shaker)에서 인큐베이션하였다. 표준 곡선을 생성하기 위하여, VHH를, 혈청 희석 배지 중에 100(VEGFDLLBⅡ013) 또는 10(VEGFDLLBⅡ015)ng/ml으로 희석하고, SDM 중의 2배 희석액 8개를 이중으로(in duplicate) ELISA 플레이트에 첨가하였다. 마우스 혈청 샘플을, 블로킹 버퍼로 최소 1:50 희석하고 SDM으로 추가 희석하였다. 또한 8개의 2배 희석된 혈청 샘플을 이중으로 첨가하였다.
플레이트를 한번 더 세척하고, 결합된 VHH를 검출하기 위하여 웰당, 블로킹 버퍼 중에 0.2㎍/ml로 희석된 인간 DLL4-HIS(R&D Systems 1506-D4/CF) 100㎕를 첨가하였으며 상기한 바와 같이 1시간 동안 셰이커에서 인큐베이션하였다. 다시 플레이트를 세척한 후, 웰당, 블로킹 버퍼 중에 1:5000으로 희석된 항-6XpolyHistidine-HRPO(R&D Systems MAB050H) 100㎕를 첨가하고 상기한 바와 같이 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각 300㎕ 탈이온수로 3회 최종 세척한 후, 웰당 100㎕의 TMB 결합된 VHH를 염색(staining) 용액(Bender MedSystems BMS406.1000)을 첨가하여 검출하였으며, 셰이커에서 웰당 100㎕의 1M 인산을 첨가하여 실온에서 약 10분간 인큐베이션하여 발색(color development)을 중지시켰다. 개별 웰들의 광학적 밀도(optical density)를 미량 역가 플레이트 분광광도계(spectrophotometer)(ThermoMax, Molecular Devices) 및 ELISA 소프트웨어인 SoftMax Pro(Molecular Devices)를 이용하여 정량하였다. 샘플의 결과는 네 매개변수의 로지스틱 곡선 맞춤(logistic curve fit)을 이용하여 피팅된 표준 곡선으로부터 산출되었다.
표 77:
Figure pct00115

VHH의 혈청 반감기는 각각 15시간(VEGFDLLBⅡ013), 17시간(VEGFDLLBⅡ010) 및 24시간(VEGFDLLBⅡ015)으로 판정되었다(반감기 판정은, 평균 혈장 농도 곡선으로부터 최종 3개의 데이터 지점을 WinNonLin V6와 지수 곡선으로 피팅하여 수행하였다).
SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> BISPECIFIC BINDING MOLECULES FOR ANTI-ANGIOGENESIS THERAPY <130> 12-0308-PCT <160> 102 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be Arg, Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be Leu or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa may be Tyr or His <400> 1 Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr Xaa Tyr Asp Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be Gln, Ala or Tyr <400> 2 Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala Tyr Xaa 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be Asp or Glu <400> 3 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Xaa 1 5 10 15 Tyr <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Leu Asp Leu His 20 25 30 Val Ile Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Pro Trp Asp Ser Trp Tyr Cys Gly Ile Gly Asn Asp Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Asn Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Pro Asn Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr 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PRT <213> Lama glama <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly Ile 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ile Thr Tyr Asp Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe 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sequence from lama glama. <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Glu Pro Tyr Leu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 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<223> Mutated sequence from lama glama. <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Leu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 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Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 30 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser 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Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 32 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 34 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 37 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 38 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 39 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 40 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 41 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 42 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Phe Ile Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 43 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 44 <211> 125 <212> PRT <213> Lama glama <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Tyr Asp Ser Val Ser Leu Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213> Lama glama <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Arg Phe Met Ser Met 20 25 30 Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Arg Glu Leu Val Ala Arg 35 40 45 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe 85 90 95 Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 46 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ile Asn Thr Tyr Val Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Ala Trp Trp Tyr Ser Gln Met Ala Arg Asp Asn Tyr Arg 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ala Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Phe Arg Arg Thr Pro Gly Lys Glu Asp Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Trp Thr Tyr Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Ala Gly Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ala Gln Ser Asp Arg Tyr Asn Ile Arg Ser Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 165 170 175 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 180 185 190 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 195 200 205 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 260 265 270 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 285 <210> 49 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 145 150 155 160 Ile Arg Phe Met Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His 165 170 175 Arg Glu Leu Val Ala Arg Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly 225 230 235 240 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 50 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 165 170 175 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile 180 185 190 Arg Phe Met Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Arg 195 200 205 Glu Leu Val Ala Arg Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val Asp 210 215 220 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 225 230 235 240 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 245 250 255 Tyr Cys Asn Thr Phe Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly Thr 260 265 270 Gln Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 51 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 165 170 175 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg 180 185 190 Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 195 200 205 Glu Arg Val Leu Val Ala Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ile Asn Thr Tyr 210 215 220 Val Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 225 230 235 240 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 245 250 255 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Trp Trp Tyr Ser Gln Met Ala 260 265 270 Arg Asp Asn Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 275 280 285 Ser <210> 52 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 165 170 175 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser 180 185 190 Ala Phe Lys Ser Tyr Arg Met Gly Trp Phe Arg Arg Thr Pro Gly Lys 195 200 205 Glu Asp Glu Phe Val Ala Ser Ile Ser Trp Thr Tyr Gly Ser Thr Phe 210 215 220 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Lys Ala 225 230 235 240 Lys Asn Ala Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 245 250 255 Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ala Gln Ser Asp Arg Tyr Asn Ile 260 265 270 Arg Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 285 <210> 53 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ile Asn Thr Tyr Val Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Ala Trp Trp Tyr Ser Gln Met Ala Arg Asp Asn Tyr Arg 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 165 170 175 Gln Thr Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr 180 185 190 Phe Ser Ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu 195 200 205 Arg Glu Phe Val Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser 210 215 220 Val Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn 225 230 235 240 Thr Val Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 245 250 255 Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu 260 265 270 Ala Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 275 280 285 Ser <210> 54 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 55 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 56 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 57 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 58 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 59 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 60 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 61 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 62 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 63 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 63 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 64 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 64 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 65 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Arg Phe Met Ser Met 20 25 30 Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Arg 35 40 45 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe 85 90 95 Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 66 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Arg Phe Ile Ser Met 20 25 30 Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Arg Glu Leu Val Ala Arg 35 40 45 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe 85 90 95 Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 67 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Arg Phe Ile Ser Met 20 25 30 Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Arg 35 40 45 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe 85 90 95 Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 68 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Ala Ala Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 145 150 155 160 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp Ser Leu 165 170 175 Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met 180 185 190 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val Ala 195 200 205 Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu Gly Arg 210 215 220 Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Ile 225 230 235 240 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser 245 250 255 Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu Tyr 260 265 270 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 69 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 165 170 175 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 180 185 190 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 195 200 205 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 210 215 220 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ala Asn Arg Ala Ala Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr 260 265 270 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 70 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp Phe 180 185 190 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp 195 200 205 Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr 210 215 220 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Ala 245 250 255 Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 260 265 270 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 275 280 285 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser 290 295 300 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly 305 310 315 320 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 325 330 335 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 340 345 350 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu 355 360 365 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 370 375 380 Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 385 390 395 400 Ser Ser <210> 71 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 180 185 190 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 195 200 205 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 260 265 270 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 275 280 285 Ser Tyr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 290 295 300 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 325 330 335 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Ala Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tyr 355 360 365 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 370 375 380 <210> 72 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Ala Ala Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu 165 170 175 Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln 180 185 190 Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly 195 200 205 Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser 245 250 255 Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 260 265 270 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 275 280 285 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser 290 295 300 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly 305 310 315 320 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 325 330 335 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 340 345 350 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu 355 360 365 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 370 375 380 Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 385 390 395 400 Ser Ser <210> 73 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Ala Ala Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr 180 185 190 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 195 200 205 Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 260 265 270 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 275 280 285 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 290 295 300 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 305 310 315 320 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 325 330 335 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 355 360 365 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 370 375 380 <210> 74 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 180 185 190 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 195 200 205 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 260 265 270 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 275 280 285 Ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 290 295 300 Tyr Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 325 330 335 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr 355 360 365 Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 370 375 380 <210> 75 <211> 386 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 180 185 190 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 195 200 205 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 260 265 270 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly 275 280 285 Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu 290 295 300 Trp Val Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Tyr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 325 330 335 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp 355 360 365 Gly Ala Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 370 375 380 Ser Ser 385 <210> 76 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 165 170 175 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 180 185 190 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 195 200 205 Ser Ser Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 210 215 220 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 260 265 270 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 285 <210> 77 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 165 170 175 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 180 185 190 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 195 200 205 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 210 215 220 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His 260 265 270 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 78 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 145 150 155 160 Ile Arg Phe Met Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His 165 170 175 Arg Glu Leu Val Ala Arg Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly 225 230 235 240 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 290 295 300 Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg 305 310 315 320 Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser 325 330 335 Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile 340 345 350 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 355 360 365 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp 370 375 380 Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln 385 390 395 400 Val Thr Val Ser Ser 405 <210> 79 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 165 170 175 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Arg Phe Met Ser Met 180 185 190 Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Arg Glu Leu Val Ala Arg 195 200 205 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg 210 215 220 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 225 230 235 240 Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe 245 250 255 Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 260 265 270 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 305 310 315 320 Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr 325 330 335 Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu 340 345 350 Arg Glu Tyr Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr 355 360 365 Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 370 375 380 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 385 390 395 400 Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr 405 410 415 Glu Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 420 425 430 <210> 80 <211> 407 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising lama glama sequences. <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 165 170 175 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 180 185 190 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 195 200 205 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 210 215 220 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His 260 265 270 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 290 295 300 Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 305 310 315 320 Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 325 330 335 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr 340 345 350 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 355 360 365 Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 370 375 380 Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly 385 390 395 400 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 405 <210> 81 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising sequences derived from lama glama. <400> 81 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ser 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val 35 40 45 Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 85 90 95 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 180 185 190 Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val Ala 195 200 205 Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His Trp 260 265 270 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 82 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising sequences derived from lama glama. <400> 82 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ser 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val 35 40 45 Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 85 90 95 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 145 150 155 160 Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu 180 185 190 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 195 200 205 Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln 225 230 235 240 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 260 265 270 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser 275 280 285 Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr 290 295 300 Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 305 310 315 320 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 325 330 335 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 340 345 350 Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp 355 360 365 His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 370 375 380 <210> 83 <211> 430 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising sequences derived from lama glama. <400> 83 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ser 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val 35 40 45 Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 85 90 95 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Arg Phe Ile Ser Met Ala 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Arg Ile 195 200 205 Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe Ser 245 250 255 Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 305 310 315 320 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe 325 330 335 Ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg 340 345 350 Glu Tyr Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala 355 360 365 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 370 375 380 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 385 390 395 400 Tyr Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu 405 410 415 Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 420 425 430 <210> 84 <211> 868 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial polypeptide comprising sequences derived from lama glama. <400> 84 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu 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Gly Gly Ser Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 435 440 445 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 450 455 460 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 465 470 475 480 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 485 490 495 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 500 505 510 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 515 520 525 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 530 535 540 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 545 550 555 560 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 565 570 575 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 580 585 590 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 595 600 605 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 610 615 620 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln 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from lama glama. <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 165 170 175 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe 180 185 190 Ser Ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg 195 200 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linker. <400> 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 <210> 96 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker. <400> 96 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 97 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic linker. <400> 97 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 98 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated sequence from lama glama. <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu 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Val Arg 465 470 475 480 Thr Ser Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr 485 490 495 Cys Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr 500 505 510 Gly Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser 515 520 525 Phe Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu 530 535 540 Val Leu Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg 545 550 555 560 Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe 565 570 575 Gln Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln 580 585 590 Lys Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly 595 600 605 Lys Gln Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu 610 615 620 Gly Arg Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu 625 630 635 640 Gly Glu Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg 645 650 655 Ile Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys 660 665 670 Leu Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 102 <211> 707 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 102 Met Ala Cys Ala Cys Ala Met Leu Ala Thr Thr Ala Arg His Glu Ser 1 5 10 15 Ser Met Asn Lys Glu Tyr Met Ala Ala Ala Ser Trp Ser Ala Ser Gly 20 25 30 Trp Ala Leu Leu Leu Leu Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly 35 40 45 Ser Gly Val Phe Gln Leu Gln Leu Gln Glu Phe Val Asn Glu Arg Gly 50 55 60 Val Leu Ala Ser Gly Arg Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe 65 70 75 80 Arg Val Cys Leu Lys His Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Val Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala 100 105 110 Val Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro 115 120 125 Phe Asn Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp 130 135 140 His Ala Pro Gly Asp Asp Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala 145 150 155 160 Leu Ile Ser Lys Ile Ala Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn 165 170 175 Trp Leu Leu Asp Glu Gln Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser 180 185 190 Tyr Arg Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg 195 200 205 Leu Cys Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro 210 215 220 Asp Gly Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln 225 230 235 240 Gln Pro Ile Cys Leu Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser 245 250 255 Lys Pro Ala Glu Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys 260 265 270 Asn Glu Cys Ile Pro His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr 275 280 285 Pro Trp Gln Cys Thr Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp 290 295 300 Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala 305 310 315 320 Thr Cys Ser Asn Ser Gly Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro 325 330 335 Gly Tyr Thr Gly Val Asp Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser 340 345 350 Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr 355 360 365 His Cys Leu Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser 370 375 380 Thr Leu Ser Cys Ala Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg 385 390 395 400 Glu Arg Asn Gln Gly Ala Ser Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe 405 410 415 Thr Gly Ser Asn Cys Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro 420 425 430 Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys 435 440 445 Arg Cys Arg Pro Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Arg His Val Ser 450 455 460 Asp Cys Ala Arg Asn Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu 465 470 475 480 Glu Ser Gly Leu Met Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg 485 490 495 Cys Glu Val Arg Thr Ser Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe 500 505 510 Asn Arg Ala Thr Cys Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys 515 520 525 Asn Cys Pro Tyr Gly Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly 530 535 540 Leu Pro Pro Ser Phe Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu 545 550 555 560 Ala Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln 565 570 575 Leu Arg Leu Arg Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn 580 585 590 Leu Ser Asp Phe Gln Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys 595 600 605 Asn Thr Asn Gln Lys Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys 610 615 620 Ser Asn Cys Gly Lys Gln Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala 625 630 635 640 Pro Gly Pro Leu Gly Arg Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser 645 650 655 Asp Lys Ser Leu Gly Glu Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys 660 665 670 Pro Glu Cys Arg Ile Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr 675 680 685 Gln Ser Val Cys Leu Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala 690 695 700 Thr Glu Val 705

Claims (35)

  1. DLL4-결합 성분 및 VEGF-결합 성분을 포함하는 이중 특이적(bispecific) 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, DLL4-결합 성분 및 VEGF-결합 성분이 각각 적어도 하나의 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인(immunoglobulin single variable domain) 및 적어도 하나의 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중 특이적 결합 분자.
  3. 제2항에 있어서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 VHH인 이중 특이적 결합 분자.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, VEGF-결합 성분이 N-말단에 위치하는 이중 특이적 결합 분자.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, DLL4-결합 성분 및 VEGF-결합 성분이 각각 적어도 하나의 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 적어도 하나의 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 각각의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 네 개의 골격 부위(framework region) 및 세 개의 상보성 결정 부위(complementary determining region) CDR1, CDR2 및 CDR3을 가지며,
    여기에서, a) 적어도 하나의 DLL4-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 CDR3은
    ⅰ. 서열 번호: 1에 나타난 아미노산 서열 Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr Xaa Tyr Asp Xaa(여기에서 위치 8에서의 Xaa는 Arg, Ala 또는 Glu이고; 위치 11에서 Xaa는 Leu 또는 Glu이고; 위치 14에서 Xaa는 Tyr 또는 His이다); 및
    ⅱ. 서열 번호: 2에 나타난 아미노산 서열 Asp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala Tyr Xaa Asp Tyr(여기에서 Xaa는 Gln, Ala 또는 Tyr이다)으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    b) 적어도 하나의 VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 CDR3은 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Xaa Tyr(여기에서, Xaa는 Asp 또는 Glu이고, VEGF-결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 인간 재조합 VEGF165와 인간 재조합 VEGFR-2의 상호작용을 60% 이상의 저해율로 차단할 수 있다)을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 임의의 친화력 성숙(affinity maturation) 후에 모체 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 VHH의 서열 최적화(sequence optimization)에 의해 얻어진 VHH인 이중 특이적 결합 분자.
  7. 제6항에 있어서, DLL4-결합 VHH가 서열 번호: 4 내지 20 및 표 5에 나타난 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 모체 VHH로부터 얻어진 이중 특이적 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서, 모체 VHH가 서열 번호: 10에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, DLL4-결합 VHH가 서열 번호: 10에 나타난 서열을 갖는 VHH로부터 유래된, 친화력 성숙된(affinity-matured) VHH의 서열 최적화에 의하여 얻어지고, 상기 친화력 성숙된 VHH는 서열 번호: 21 내지 27 및 표 16에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH로부터 선택되는 이중 특이적 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 친화력 성숙된 VHH가 서열 번호: 22에 나타난 아미노산 서열을 갖고 서열 최적화된 VHH가 서열 번호: 34 및 35 및 표 23에 나타난 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  11. 제7항에 있어서, 모체 VHH가 서열 번호: 12에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서, DLL4-결합 VHH가 서열 번호: 12에 나타난 서열을 갖는 VHH에서 유래된, 친화력 성숙된 VHH의 서열 최적화에 의해 얻어지고, 상기 친화력 성숙된 VHH는 서열 번호: 28 내지 33 및 표 17에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH로부터 선택되는 이중 특이적 결합 분자.
  13. 제12항에 있어서, 친화력 성숙된 VHH가 서열 번호: 32에 나타난 아미노산 서열을 갖고 서열 최적화된 VHH가 서열 번호: 40 및 41에 나타난 서열로부터 선택되는 이중 특이적 결합 분자.
  14. 제6항에 있어서, VEGF-결합 VHH가 서열 번호:42 내지 44 및 표 32에 나타난 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 VHH로부터 유래된 것인 이중 특이적 결합 분자.
  15. 제14항에 있어서, VEGF-결합 VHH가 서열 번호: 43에 나타난 아미노산 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화에 의하여 얻어진 이중 특이적 결합 분자.
  16. 제15항에 있어서, 서열 최적화된 VHH가 서열 번호: 63 및 64 및 표 59에 나타난 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  17. 제3항에 있어서, VEGF-결합 성분이 바이파라토프성(biparatopic) VHH이고, 상기 바이파이토프성 VHH의 빌딩 블록(building block)을 형성하는 VHH는 비-중첩(non-overlapping) 에피토프에 결합하는 이중 특이적 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 VHH가 재조합 인간 VEGF 및 재조합 인간 VEGFR-2 간의 상호작용을 60% 이상의 저해율로 차단할 수 있고 적어도 하나의 VHH가 60% 이하의 저해율로 상기 상호작용을 차단할 수 있는 이중 특이적 결합 분자.
  19. 제18항에 있어서, 60% 이하의 저해율을 갖는 VHH가 서열 번호: 45에 나타난 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화된 변이체인 이중 특이적 결합 분자.
  20. 제19항에 있어서, VHH가 서열 번호: 65 및 66 및 표 또는 서열 번호: 67 (표 63)에 나타난 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  21. 제5항에 있어서,
    a) DLL4-결합 성분으로서 서열 번호: 35 또는 41의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 VHH 및
    b) VEGF-결합 성분으로서
    i. 서열 번호: 64에 나타난 서열을 갖는 VHH 또는
    ⅱ. 서열 번호: 64에 나타난 서열을 갖는 VHH 및 서열 번호: 67에 나타난 서열을 갖는 VHH를 포함하는 바이파라토프성 VHH을 포함하는 이중 특이적 결합 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 링커 분자 및/또는 반감기-연장 모이어티(half-life-extending moieties)를 포함하는 이중 특이적 결합 분자.
  23. 제22항에 있어서, 반감기-연장 모이어티가 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 공유결합되거나 융합되고(fused), Fc 부분, 알부민, 알부민 결합 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 또는 폴리옥시알킬렌 분자로부터 선택되는 이중 특이적 결합 분자.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 서열 번호: 81에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, 서열 번호: 82에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  26. 제21항 또는 제22항에 있어서, 서열 번호: 83에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  27. 제21항에 있어서, 서열 번호: 84에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  28. 제21항 또는 제22항에 있어서, 서열 번호: 85에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  29. 제21항 또는 제22항에 있어서, 서열 번호: 86에 나타난 아미노산 서열을 갖는 이중 특이적 결합 분자.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 이중 특이적 결합 분자 또는 그를 포함하는 벡터를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자.
  31. 제30항의 핵산 분자를 포함하는 숙주(host) 세포.
  32. 적어도 하나의, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 VEGF-결합 분자를 활성 성분(active ingredient)으로 포함하는 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 혈관형성(angiogenesis)에 대한 VEGF-매개 효과와 관련된 질병의 치료를 위한 약학적 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 암 및 암성 질병(cancerous disease)의 치료를 위한 약학적 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 안질환의 치료를 위한 약학적 조성물.
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2009003229A (es) 2006-09-29 2009-06-18 Oncomed Pharm Inc Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer.
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
PE20100092A1 (es) 2008-06-03 2010-03-12 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
PE20100054A1 (es) 2008-06-03 2010-03-03 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
US9493545B2 (en) 2009-02-11 2016-11-15 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
US20110172398A1 (en) * 2009-10-02 2011-07-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
US8748380B2 (en) 2009-10-30 2014-06-10 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
MY160628A (en) 2010-03-02 2017-03-15 Abbvie Inc Therapeutic DLL4 Binding Proteins
US9428583B2 (en) 2010-05-06 2016-08-30 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
BR112012028326A2 (pt) 2010-05-06 2017-03-21 Novartis Ag anticorpo multivalente isolado, anticorpos biparatópicos isolados, ácido nucleico, vetor, composição farmacêutica, método de obtenção dos referidos anticorpos, bem como uso do dos mesmos
EP2824457A1 (en) 2010-07-19 2015-01-14 F. Hoffmann-La Roche AG Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
MX2013000667A (es) 2010-07-19 2013-02-27 Hoffmann La Roche Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anticancer.
MY160445A (en) 2010-08-03 2017-03-15 Abbvie Inc Dual Variable Domain Immunoglobulins And Uses Thereof
JP2013539364A (ja) 2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
US20120225081A1 (en) * 2010-09-03 2012-09-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Vegf-binding molecules
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
US20130323265A1 (en) * 2010-11-15 2013-12-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with dll4 antagonists
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US20130078247A1 (en) 2011-04-01 2013-03-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2
AU2015268749B2 (en) * 2011-09-23 2017-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
BR112014007035B1 (pt) 2011-09-23 2021-05-04 Oncomed Pharmaceuticals, Inc anticorpos biespecíficos que se ligam a vegf/dll4, composição farmacêutica e célula procariótica, fúngica ou de levedura que compreende os mesmos, moléculas de polinucleotídeo, vetor, usos terapêuticos e método para a produção de um anticorpo
TW201323442A (zh) 2011-11-04 2013-06-16 Novartis Ag 低密度脂蛋白相關蛋白６（ｌｒｐ６）－半衰期延長構築體
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
AU2013234299B2 (en) 2012-03-16 2017-06-22 Albumedix Ltd. Albumin variants
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
EA201500370A1 (ru) * 2012-09-28 2015-08-31 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМБИНАЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДВОЙНЫЕ АНГИОПОЭТИН-2/Dll4 СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ И АНТИ-VEGF-R АГЕНТЫ
US20140093499A1 (en) * 2012-09-28 2014-04-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical combinations comprising dual angiopoietin-2 / dll4 binders and anti-vegf agents
US20150368329A1 (en) * 2012-10-15 2015-12-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of Treating Ocular Diseases
EP2914961A4 (en) 2012-10-31 2016-04-20 Oncomed Pharm Inc METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4
KR20210111353A (ko) * 2012-11-01 2021-09-10 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
BR112015009924A2 (pt) * 2012-11-01 2017-12-05 Abbvie Inc formulações de proteína imunoglobulina de domínio variável duplo estáveis
MX2015005363A (es) 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
EP2970459A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-1beta and il-17
EP3020731B1 (en) * 2013-07-09 2019-06-12 ABLBio Novel dual-targeted protein specifically binding to dll4 and vegf, and use thereof
US11185583B2 (en) * 2014-02-11 2021-11-30 Albany Medical College Multi-functional mucosal vaccine platform
EP3125937A4 (en) * 2014-04-04 2017-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of gastric cancer
US20170267784A1 (en) 2014-10-23 2017-09-21 Singh Molecular Medicine, Llc Single domain antibodies directed against intracellular antigens
DK3212233T3 (da) 2014-10-31 2020-07-27 Oncomed Pharm Inc Kombinationsterapi til behandling af sygdom
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
WO2016192613A1 (zh) * 2015-06-01 2016-12-08 中山大学 具有融合至常规Fab片段的单域抗原结合片段的二价抗体
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CA2989966C (en) 2015-08-20 2024-04-30 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
AU2016326609B2 (en) 2015-09-23 2023-03-09 Mereo Biopharma 5, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
TWI746473B (zh) * 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
CA3009644A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 The Regents Of The University Of California Novel antibodies for the treatment of cancers
JP6879511B2 (ja) * 2016-01-29 2021-06-02 国立大学法人京都大学 血小板産生促進剤及びそれを用いた血小板の製造方法
CN110831626B (zh) * 2017-01-30 2024-04-19 亚力兄制药公司 单价抗备解素抗体及抗体片段
CA3090321A1 (en) * 2018-02-05 2019-08-08 Stichting Vu Inverse agonistic anti-us28 antibodies
CN111995686B (zh) * 2019-05-27 2022-06-14 兰州大学 一种具有抗血管生成活性的药物及其制备方法
KR20220031044A (ko) * 2019-07-31 2022-03-11 일라이 릴리 앤드 캄파니 릴랙신 유사체 및 이를 사용하는 방법
CN110452297B (zh) * 2019-09-03 2020-04-14 上海洛启生物医药技术有限公司 抗vegf单域抗体及其应用
CN116234574A (zh) * 2020-09-17 2023-06-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合vegf和ang-2的双特异性抗原结合分子
CN112535738B (zh) * 2020-12-04 2022-09-09 中国科学技术大学 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用
CN115724968B (zh) * 2021-08-27 2023-08-08 三优生物医药(上海)有限公司 Vegf结合分子及其用途
CN116063469B (zh) * 2022-08-29 2023-09-22 中山大学 一种寨卡病毒中和性纳米抗体及其制备方法与应用
WO2024055996A1 (zh) * 2022-09-14 2024-03-21 寻济生物科技（北京）有限公司 一种抗vegfa抗体或其抗原结合片段及其应用
CN117860786B (zh) * 2024-03-12 2024-06-04 北京贝来药业有限公司 基因修饰间充质干细胞在多种疾病中的制药用途和诊断用途

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994004678A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2433877C (en) 2001-01-17 2014-11-18 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
AU2003286004A1 (en) 2002-11-08 2004-06-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
WO2004060965A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
CA2512545C (en) * 2003-01-10 2015-06-30 Karen Silence Recombinant vhh single domain antibody from camelidae against von willebrand factor (vwf)
JP5087274B2 (ja) 2003-06-30 2012-12-05 ドマンティス リミテッド ポリペプチド
JP2007534631A (ja) * 2003-10-28 2007-11-29 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ラミニン−５γ２結合性ペプチド、その関連組成物およびその使用
EP2251357A1 (en) 2003-11-07 2010-11-17 Ablynx N.V. Camelidae single domain antibodies VHH directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
US20050284249A1 (en) 2004-06-29 2005-12-29 Arnone David F Worm type gear mover assembly
CA2583017A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease
US8048418B2 (en) * 2004-10-29 2011-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with combination of Dll4 antagonists and VEGF antagonists
EP2365000A3 (en) 2005-05-18 2013-01-16 Ablynx N.V. Improved nanobodiesTM against tumor necrosis factor-alpha
PL3415535T3 (pl) * 2005-05-20 2021-06-14 Ablynx N.V. Ulepszone Nanociała TM do leczenia zaburzeń, w których pośredniczy agregacja
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2006326417B2 (en) 2005-12-16 2012-05-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with Dll4 antagonists
WO2007143689A2 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
ZA200809100B (en) * 2006-06-06 2009-12-30 Genentech Inc Anti-DLL4 antibodies and methods using same
KR20090027227A (ko) 2006-06-06 2009-03-16 제넨테크, 인크. 항-ｄｌｌ4 항체 및 이의 사용 방법
WO2008019144A2 (en) * 2006-08-07 2008-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Threapeutic methods for treating vascular eye disorders with dll4 antagonists
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
WO2008070513A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-12 Alcon Research, Ltd. Modulation of polysialylated neural adhesion molecules (psa-ncam) as a regulator of ocular disease
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
AU2008219216A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization
GB0709333D0 (en) * 2007-05-15 2007-06-20 Smart Targeting Ltd Binding protein
WO2009095489A2 (en) 2008-02-01 2009-08-06 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
DE112009000507T5 (de) 2008-03-05 2011-02-10 Ablynx Nv Neue Antigen-bindende Dimerkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
EP2947097A1 (en) * 2008-04-07 2015-11-25 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against the Notch pathways and uses thereof
US9029508B2 (en) * 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CN102459346B (zh) * 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
US20110172398A1 (en) * 2009-10-02 2011-07-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy

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