JP5833009B2 - 抗脈管形成療法のための二重特異性結合分子 - Google Patents
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Description
腫瘍増殖の場合、脈管形成は、過形成から新形成への移行に、さらに腫瘍の増殖および転移のための栄養提供に必須であるように思われる(Folkman et al., Nature 339-58, 1989)(脈管形成は正常細胞と比較して腫瘍細胞が有利な増殖を獲得することを可能にする)。したがって、抗脈管形成療法は、いくつかの腫瘍タイプにとって重要な治療選択肢となっている。
もっとも重要な前血管形成因子の1つは血管内皮増殖因子(VEGF-A、以下では“VEGF”と称する)であり、前記は、胎盤増殖因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-DおよびVEGF-Eを含む遺伝子ファミリーに属し、さらに前記は、単一遺伝子のmRNAのまた別のスプライシングから生じるいくつかのアイソフォームとして存在し、VEGF165は生物学的にもっとも関係が深いアイソフォームである。したがって、抗脈管形成に重点を置く大半の抗癌療法はVEGF経路の遮断に焦点を当てている(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400)。
最近、Dll4(またはデルタ様4またはデルタ様リガンド4)が癌療法の有望な標的として認定された。Dll4はNotchリガンドのデルタファミリーのメンバーである。Notchシグナリングは、多くの癌で(例えばT細胞急性リンパ芽球性白血病および固形腫瘍で)調節が障害される(Sharma et al. 2007, Cell Cycle 6 (8): 927-30;Shih et al., Cancer Res. 2007 Mar 1;67(5): 1879-82)。
Dll4の細胞外ドメインは、N-末端ドメイン、デルタ/セルレート/Lag-2(Delta/Serrate/Lag-2)(DSL)ドメインおよび縦並びの8つの表皮成長因子(EGF)様リピートを含む。一般的には、EGFドメインは、hDll4のアミノ酸残基218−251(EGF-1;ドメイン1)、252−282(EGF-2;ドメイン2)、284−322(EGF-3;ドメイン3)、324−360(EGF-4;ドメイン4)および362−400(EGF-5;ドメイン5)を、アミノ酸残基約173−217のDSLドメインおよびアミノ酸残基約27−172のN-末端ドメインとともに含むと理解されている(WO 2008/076379)。
Dll4を標的とし、(前)臨床開発中である、以下のいくつかの生物学的化合物が報告されている:REGN-421(=SAR153192;Regeneron, Sanofi-Aventis; WO2008076379)およびOPM-21M18(OncoMed)(Hoey et al., C ell Stem Cell. 2009 Aug 7; 5(2):168-77)、前記は両方とも完全にヒトのDll4抗体である;YW152F(Genentech)、ヒト化Dll4抗体(Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7);Dll4Fc(Regeneron, Sanofi-Aventis)、Dll4の細胞外領域およびヒトIgG1のFc領域を含む組換え融合タンパク質(Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21;444:7122)。
モノクローナル抗体(MAb)および融合タンパク質は、それらの治療的応用の観点からいくつかの欠点を有する。すなわち、分解を防ぐために、それらを凍結温度近傍で保存しなければならない。さらにまた、腸管で急速に消化されるのでそれらは経口投与に適していない。癌治療用MAbのまた別の主要な制限は移送が困難なことであり、その結果、腫瘍内の濃度が低く全細胞を標的とすることができない。
さらにまた、VEGFおよびDll4の両方を標的とすることを基本とする従来技術の治療法は併用療法の代表的なもので、2つの個々の阻害物質(すなわちVEGF結合分子および別個のDll4結合分子)を含む。しかしながら、これらの治療法は、2つの別個の薬剤の開発および生産は高コストおよび多くの資源を必要とし、2つの薬剤は異なる薬理動態特性を有し、さらに2つの薬剤の投与は患者にとって不便であるという短所を有する。
上記観点から、ヒトの抗腫瘍療法のために改善された分子を提供することが本発明の目的であった。
したがって、本発明は、1つまたは2つ以上のDll4結合分子および1つまたは2つ以上のVEGF結合分子を含む二重特異性結合分子に関する。
以下では、特段の指示がなければ、“結合分子”(または“抗原結合分子”)という用語は、Dll4結合分子(具体的には免疫グロブリン単一可変ドメイン)またはVEGF結合分子(具体的には免疫グロブリン単一可変ドメイン)の一方または両方を指す。“二重特異性結合分子”という用語は、少なくとも1つのDll4結合分子(または“結合要素”)および少なくとも1つのVEGF結合分子(または結合要素)を含む分子を指す。二重特異性結合分子は、2つ以上のDll4結合分子および/または2つ以上のVEGF結合分子を含むことができる。すなわち前記は、二重特異性分子が、二パラトープ性(下記で定義する)Dll4結合分子および/または二パラトープ性VEGF結合分子を、Dll4またはVEGFと結合する前記分子の部分に(すなわちそれぞれその“Dll4結合要素”(または抗Dll4要素)または“VEGF結合要素”(または抗VEGF要素)に)含む場合である。
本発明の二重特異性結合分子は、Dll4の阻害によって調節できる疾患または症状(例えば癌)の予防、治療、緩和および/または診断で組成物中の薬理学的に活性な薬剤として有用である。
特に、当分野で従来用いられているかおよび/または公知である薬剤、組成物および/または方法と比較して明白な利点を提供する薬理学的に活性な薬剤、組成物および/または方法を提供することが本発明の目的であった。
これらの利点は、特に上記で述べたような通常の抗体またはそのフラグメントと比較して改善された治療的および/または薬理学的特性および/または他の有利な特性(例えば製造結果について)を含む。
より具体的には、新規な分子、特に哺乳動物の(特にヒトの)Dll4およびVEGFと結合する分子を提供することが本発明の目的であり、そのような分子は本明細書で述べる治療および診断目的に適している。
より具体的には、本発明の二重特異性結合分子は、本質的にi)Dll4の少なくとも1つのエピトープと特異的に結合するDll4結合要素およびii)VEGFの少なくとも1つのエピトープと特異的に結合するVEGF結合要素を含み、それらの要素は同時にDll4およびVEGFと結合するか、またはそれらが一時にDll4またはVEGFのどちらかと結合できる態様で互いに連結される。
本発明の好ましい特徴にしたがえば、前記2つの要素は1つまたは2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、互いに別個にVHHまたはドメイン抗体、および/または免疫グロブリン単一可変ドメインの任意の他の部分、例えばVLドメイン(本明細書で定義される)であり得るが、ただしこれらの免疫グロブリン単一可変ドメインの各々が抗原(すなわちそれぞれDll4またはVEGF)と結合することを条件とする。
好ましい実施態様にしたがえば、免疫グロブリン単一可変ドメインは同じタイプであり、特に全ての免疫グロブリン単一可変ドメインはVHHまたはドメイン抗体である。
特に好ましい実施態様にしたがえば、全ての免疫グロブリン単一可変ドメインがVHH、好ましくはヒト化(または本明細書で定義する“配列最適化”)VHHである。したがって、本発明は、(場合によってヒト化または配列最適化)抗Dll4 VHHおよび(場合によってヒト化または配列最適化)抗VEGF VHHを含む二重特異性結合分子に関する。
しかしながら、本明細書の教示は、他の抗Dll4または抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン(例えばドメイン抗体)を含む二重特異性結合分子に同様に応用できることは当業者には明瞭であろう。
別の特徴では、本発明は、二重特異性結合分子をコードする核酸および前記を含む宿主細胞に関する。
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明の二重特異性結合分子および場合によってそのような組成物のさらに別の1つまたは2つ以上の要素を収納したまたはそれらを含む製品または組成物に関する。
本発明はさらに、本明細書に記載の二重特異性結合分子、核酸、宿主細胞、製品および組成物を調製または作出する方法に関する。
本発明はさらに、本明細書に記載の二重特異性結合分子、核酸、宿主細胞、製品および組成物の適用および使用、並びにDll4の阻害によって調節し得る疾患および異常を予防および/または治療する方法に関する。
本発明の前記および他の特徴、実施態様、利点並びに応用は以下の更なる記載から明瞭となろう。
特段に指示または規定されなければ、用いられる全ての用語は当分野でのそれらの通常の意味を有し、前記通常の意味は当業者には明白であろう。例えば標準的な手引書(例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990);およびRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York, 1989)の他に本明細書に引用した一般的な背景技術を参照することができる。さらにまた、特段の指示がなければ、具体的に詳しく記載されていない全ての方法、工程、技術および操作を実施することができ、それらは当業者には明白であるのでそれ自体公知の態様で実施されている。繰り返せば、例えば標準的な手引書、上記で言及した一般的な背景技術および本明細書で引用したさらに別の参考文献を参照できる。
特段の指示がなければ、“免疫グロブリン”および“免疫グロブリン配列”という用語(本明細書で重鎖抗体または通常の4鎖抗体のどちらを指すために用いられていようとも)は、完全なサイズの抗体、その個々の鎖だけでなく前記の部分、ドメインまたはフラグメントの全てを含む一般的な用語として用いられる(前記ドメインまたはフラグメントは、例えばそれぞれVHHドメインまたはVH/VLドメインを含むがただしこれらに限定されない)。さらにまた、本明細書で用いられる“配列”という用語(例えば“免疫グロブリン配列”、“抗体配列”、“(単一)可変ドメイン配列”、“VHH配列”または“タンパク質配列”のような用語として)は、文脈がより限定的な解釈を要求していないかぎり、対応するアミノ酸配列だけでなくそのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むと一般的的には理解されるべきである。
本明細書で用いられる“免疫グロブリンドメイン”という用語は、抗体鎖(例えば通常の4鎖抗体または重鎖抗体の鎖)の球形領域、または本質的にそのような球形領域から成るポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンの折り畳みを保持するという特徴を有する。前記折り畳みは、2つのベータシート内に編成された(場合によって保存ジスルフィド結合によって安定化されている)約7つのアンチパラレルベータ鎖をもつ2層のサンドイッチから成る。
本明細書で用いられる“免疫グロブリン可変ドメイン”という用語は、当分野および本明細書下記では“フレームワーク領域1”もしくは“FR1”、“フレームワーク領域2”もしくは“FR2”、“フレームワーク領域3”もしくは“FR3”、“フレームワーク領域4”もしくは“FR4”とそれぞれ称される、本質的に4つの“フレームワーク領域”から成る免疫グロブリンドメインを意味する。前記フレームワーク領域は、3つの“相補性決定領域”または“CDR”によって中断され、それらは、当分野および本明細書下記ではそれぞれ“相補性決定領域1”もしくは“CDR1”、“相補性決定領域2”もしくは“CDR2”、“相補性決定領域3”もしくは“CDR3”と称される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的構造または配列は以下のように示すことができる:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗原結合部位を保持することによって抗原に対する特異性を抗体に付与するのはこの免疫グロブリン可変ドメインである。
上記定義の観点から、通常の4鎖抗体(例えば当分野で公知のIgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE分子)の抗原結合ドメイン、またはFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント(例えばジスルフィド結合連結FvまたはscFvフラグメント)もしくは前記通常的4鎖抗体から誘導されるジアボディ(いずれも当分野では公知である)の抗原結合ドメインは、通常は免疫グロブリン単一可変ドメインとみなされないであろう。なぜならば、これらの事例では、抗原の対応するエピトープとの結合は通常単一免疫グロブリンドメインによって生じるのではなく、一対の(結合)免疫グロブリンドメイン(例えば軽鎖および重鎖可変ドメイン)によって、すなわち免疫グロブリンドメインのVH-VL対によって(前記は一緒になって対応する抗原のエピトープと結合する)生じるからである。
本発明の関係では、VHHドメイン、VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメント、VHH抗体、並びに“ナノボディ(Nanobody(商標))”および“ナノボディ(商標)ドメイン”(“ナノボディ(Nanobody)”はAblynx N.V.社(Ghent; Belgium)の商品名である)は相互に用いられ、免疫グロブリン単一可変ドメインの典型例(一般構造:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を有し、第二の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要としないでエピトープと特異的に結合する)であり、いわゆる“ホールマーク残基”(例えばWO 2009/109635、図1で定義される)によりVHドメインとは区別される。
−FR1は1−30位のアミノ酸残基を含み、
−CDR1は31−35位のアミノ酸残基を含み、
−FR2は36−49位のアミノ酸残基を含み、
−CDR2は50−65位のアミノ酸残基を含み、
−FR3は66−94位のアミノ酸残基を含み、
−CDR3は95−102位のアミノ酸残基を含み、
−FR4は103−113位のアミノ酸残基を含む。
しかしながら、VHドメインおよびVHHドメインについて当分野で周知のように、CDRの各々のアミノ酸残基の総数は変動可能であり、Kabatのナンバリングによって表されるアミノ酸残基の総数と一致しないことがあり得ることは認識されるべきである(すなわち、Kabatのナンバリングの1つまたは2つ以上の位置が実際の配列で塞がっていないか、または実際の配列がKabatのナンバリングで許容されているアミノ酸残基よりも多くのアミノ酸残基を含むことがある)。このことは、一般的には、Kabatのナンバリングは実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングと一致することもあり一致しないこともあることを意味している。
VHドメインのアミノ酸残基のまた別のナンバリング方法(この方法はまたVHHドメインに対しても類似の態様で適用することができる)が当分野で公知である。しかしながら、この詳細な説明、特許請求の範囲および図面では、特段の指示がなければ、Kabatのナンバリングであって上記でVHHドメインに適用したナンバリングが用いられるであろう。
VHHドメインのアミノ酸残基の総数は通常110から120、しばしば112から115の範囲であろう。しかしながら、本明細書に記載した目的のためにはもっと小さい配列ももっと長い配列も適切であり得ることは認識されるべきである。
それらの固有の特性により、免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書で定義するように、VHHまたはVH(またはVL)と同様に、単独でまたはより大きなポリペプチド(例えば二パラトープ性分子または二重特異性結合分子)の部分として以下の多数の重要な利点を提供する:
−高親和性および高選択性で抗原と結合するためにただ1つのドメインしか要求されず、したがって2つの別々のドメインを存在させることも、これら2つのドメインが正しい空間的配置及び構造で存在していることを確認する(すなわちscFVの場合のように特別に設計したリンカーの使用によって確認する)必要もない;
−免疫グロブリン単一可変ドメインは単一の核酸分子から発現させることができ、一切の翻訳後改変(例えばグリコシル化)を必要としない;
−免疫グロブリン単一可変ドメインは多価および多重特異性フォーマットへと容易に操作できる(本明細書でさらに考察する);
−免疫グロブリン単一可変ドメインはそれらの標的に対して高度な特異性および親和性、固有の低毒性を有し、輸液または注射以外の代替経路により投与できる;
−免疫グロブリン単一可変ドメインは、熱、pH、プロテアーゼおよび他の変性物質または変性条件に対して極めて安定であり、したがって冷蔵装置を用いることなく調製、保存または輸送することができる;
−免疫グロブリン単一可変ドメインは、小規模および機械的大規模の両方において容易におよび相対的に安価に調製できる。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび前記を含むポリペプチドは(例えば以下でさらに説明するように)微生物発酵を用いて生産でき、例えば通常の抗体の場合のように哺乳動物発現系の使用を必要としない;
−免疫グロブリン単一可変ドメインは、通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントと比較して相対的に小さく(約15kDa、すなわち通常のIgGの十分の一)、したがって組織(固形腫瘍および他の高密度組織を含むがただしこれらに限定されない)への高い貫通性を示し、該当する通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントより高い用量で投与できる;
−VHHは特殊ないわゆる“窩結合特性”を有し(4鎖抗体由来VHドメインと比較してとりわけVHHの伸長CDR3ループによるものである)、したがってまた通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントが近づくことができない標的およびエピトープにも近づくことができる;
−VHHは、高度に可溶性および非常に安定であり凝集傾向をもたない(Wardら(Nature 341: 544-546, 1989)が記載したマウス由来抗原結合ドメインの場合のように)という特異な利点を有する。
(1)天然に存在する重鎖抗体のVHHドメインを単離する工程;または重鎖抗体もしくはVHHを含むライブラリーをスクリーニングしてそれらからVHHを単離する工程;
(2)天然に存在する配列を有するVHHをコードする核酸分子を発現する工程;
(3)天然に存在する配列を有するVHHを(場合によって親和性増進の後で)“ヒト化”(または配列最適化)する工程、またはそのようなヒト化VHHをコードする核酸を発現する工程;
(4)ある動物種、特に哺乳動物種(例えばヒト)由来の天然に存在する抗体から免疫グロブリン一可変重鎖ドメインを“ラクダ化する”工程(下記で述べるように)またはそのようなラクダ化ドメインをコードする核酸分子を発現する工程;
(5)VHを“ラクダ化する”工程、またはそのようなラクダ化VHをコードする核酸分子を発現する工程;
(6)タンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を合成または半合成により調製する技術を用いる工程;
(7)核酸合成技術を用いてVHHドメインをコードする核酸分子を調製し、続いてそのようにして得られた核酸を発現させる工程;
(8)重鎖抗体またはVHHを親和性増進、変異導入(例えばランダム変異導入または部位特異的変異導入)および/または任意の他の技術に付し、VHHの親和性および/または特異性を増進させる工程;および/または
(9)上述の工程の組合せまたは選択。
上記記載の工程の実施に適した方法および技術は当分野で公知であり、当業者には明白であろう。
配列最適化VHHは1つまたは2つ以上の完全にヒトのフレームワーク領域配列を含むことができ、さらに具体的な実施態様では、前記は、ヒト生殖細胞系列Vh3配列DP-29、DP-47、DP-51に由来するヒトフレームワーク領域、またはその部分、または前記と高度に相同であるものを含むことができる。したがって、ヒト化プロトコルは、VHH残基のいずれかを生殖細胞系列VH遺伝子、例えばDP-47、DP-29およびDP51の対応するフレームワーク1、2および3(FR1、FR2およびFR3)の残基で単独にてまたは組み合せて置換する工程を含むことができる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの適切なフレームワーク領域(FR)は、例えばWO2006/004678に示されたものから選択でき、特にいわゆる“KERE”および“GLEW”クラスが含まれる。特に好ましいものは、約44から47位にアミノ酸配列G-L-E-Wを有する免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそれらの各々のヒト化対応物である。
治療的応用の観点から改善された特性(例えば親和性の強化または免疫原性の低下)を有する結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、当分野で公知の技術によって個々の結合分子から入手できる。前記技術は、例えば、親和性増進(例えば合成、任意抽出したまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から出発する)、CDR移植、ヒト化、異なる免疫グロブリン配列から誘導したフラグメントの結合、オーバーラッププライマーを用いるPCRアッセンブリー、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作する類似の技術、または本明細書に記載するように前述のいずれかの任意の適切な組み合わせ(“配列最適化”とも称される)である。例えば、更なる説明および実施例と同様に標準的な手引書を参照することができる。
適切な場合には、親和性増強結合分子は、別の結合分子の親和性増進によって入手できる。後者は、親和性増進分子の関係では“親”結合分子を表す。
特異的抗原またはエピトープと結合するVHHを得る方法は以前に、例えばWO 2006/040153およびWO 2006/122786記載されている。さらに前記にも詳細に記載されているように、ラクダ科の動物に由来するVHHドメインは、本来のVHH配列のアミノ酸配列中の1つまたは2つ以上のアミノ酸残基を、ヒトの通常の4鎖抗体のVHドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の1つまたは2つ以上と置換することによって“ヒト化する”ことができる。ヒト化は本明細書では“配列最適化”とも称され、“配列最適化”は、ヒト化に加えて、改善された特性(例えば翻訳後改変が生じる可能性がある部位の除去)をVHHに与える1つまたは2つ以上の変異導入によるさらに別の配列の改変を含む。ヒト化VHHドメインは1つまたは2つ以上の完全にヒトのフレームワーク領域配列を含むことができ、さらにより具体的な実施態様では、DP-29、DP-47、DP-51から誘導されるヒトフレームワーク領域、またはその部分、場合によってJH配列(例えばJH5)と結合したものを含むことができる。
ドメイン抗体は、本質的に非ラクダ科哺乳動物の抗体、特にヒト4鎖抗体のVHまたはVLドメインと一致する。一抗原結合ドメインとして(すなわちそれぞれVLまたはVHドメインと対を形成することなく)エピトープと結合するために、そのような抗原結合特性のための特別な選別(例えばヒト一VHまたはVLドメイン配列のライブラリーを用いることによる)が必要である。
ドメイン抗体は、VHHのように大まかに約13から約16 kDaの分子量を有し、さらに完全にヒト配列に由来する場合は、例えばヒトの治療薬としての使用にヒト化を必要としない。VHHドメインの場合のように、それらは原核細胞発現系でもまた良好に発現され、全体的な製造コストを大いに削減する。
さらにまた、上記記載のCDRの1つまたは2つ以上を他の“足場(scaffold)”(ヒトの足場または非免疫グロブリン系足場を含むがただしこれらに限定されない)に“移植”できることもまた当業者には明白であろう。そのようなCDR移植のための適切な足場および技術は当分野では公知である。
一定のエピトープ、抗原またはタンパク質(またはその少なくとも1つの部分、フラグメントまたはエピトープ)と“結合”または“特異的に結合する”ことができる、前記に“親和性を有する”、および/または前記に対して“特異性を有する”ポリペプチド(例えば免疫グロブリン、抗体、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは一般的に抗原結合分子もしくはそのフラグメント)は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質に“対する”であるか、もしくは前記に“向けられた”と称されるか、またはそのようなエピトープ、抗原またはタンパク質に対する“結合分子”である。この関係では、VEG結合分子-またはDll4結合分子はまた“VEGF中和性”または“Dll4中和性”とそれぞれ称され得る。
エピトープを認識する抗原結合分子の部分はパラトープと呼ばれる。
“VEGF結合分子”または“Dll4結合分子”はそれぞれ、一価の標的結合分子(すなわち対応する標的の1つのエピトープと結合する分子)および二価または多価結合分子(すなわち2つ以上のエピトープと結合する結合分子、例えば以下で定義する“二パラトープ性”分子)の両方を指す。2つ以上のVEGF(またはDll4)結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含むVEGF(またはDll4)結合分子はまた、“フォーマットされた”結合分子と称され、それらは、免疫グロブリン単一可変ドメインに加えて標的結合要素内に、リンカーおよび/またはエフェクター機能を有する要素(例えばアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインのような半減期延長要素)、および/または血清アルブミンのような融合パートナーおよび/またはPEGのような結合ポリマーを含む。
フォーマットされた結合分子もまた、同じもしくはオーバーラップするエピトープまたは対応する抗原を認識する、2つの同一免疫グロブリン単一可変ドメインまたは2つの異なる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むことができる(ただし好ましさは劣る)。この場合、VEGFに関しては、2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、VEGFダイマーを形成する2つのモノマーの各々の同じまたはオーバーラップするエピトープと結合し得る。
典型的には、本発明の結合分子は、例えばバイアコア(Biacore)アッセイまたはキネキサ(Kinexa)アッセイで測定したとき、10E-5から10E-14モル/リットル(M)以下、好ましくは10E-7から10E-14モル/リットル(M)以下、より好ましくは10E-8から10E-14モル/リットル(M)以下、さらに好ましくは10E-11から10E-13の解離定数(KD)で、および/または少なくとも10E7 ME-1、好ましくは少なくとも10E8 ME-1、より好ましくは少なくとも10E9 ME-1、例えば少なくとも10E11 ME-1の結合定数(KA)で結合するであろう。一般的には10E-4より大きいいずれのKD値も非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、所望の抗原、すなわちそれぞれVEGFまたはDll4と500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満のKDで結合するであろう。抗原結合タンパク質と抗原またはエピトープとの特異的な結合は、それ自体公知の任意の適切な態様で決定できる。前記適切な態様には、例えば本明細書に記載したアッセイ、スキャチャード解析および/または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫アッセイ(EIA)およびサンドイッチ競合アッセイ、並びに当分野でそれ自体公知である前記の種々の変型が含まれる。
2つのVEGF結合分子配列間の“配列同一性”は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。前記は、WO 08/020079の49ページおよび50ページのパラグラフf)に記載されているように計算または決定できる。“配列類似性”は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
VHドメインのアミノ酸残基のまた別のナンバリング方法(この方法はまたVHHドメインに対しても類似の態様で適用することができる)が当分野で公知である。しかしながら、本明細書の説明、特許請求の範囲および図面では、特段の指示がなければ、Kabatのナンバリングであって上記のようにVHHドメインに適用したナンバリングにしたがうであろう。
本発明のためには、“配列番号:xのアミノ酸配列”は、特段の記載がなければ、対応する配列番号:xに示される配列と100%同一の配列;
a)対応する配列番号:xに示される配列と少なくとも80%のアミノ酸同一を有するアミノ酸配列;
b)対応する配列番号:xに示される配列と3、2または1アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含む。
第一の特徴では、本発明は、Dll4結合要素およびVEGF結合要素を含む二重特異性結合分子に関する。
好ましい実施態様にしたがえば、前記Dll4結合要素および前記VEGF結合要素は、少なくとも1つのDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインおよび少なくとも1つのVEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインをそれぞれ含む。
好ましい特徴では、前記Dll4結合要素および前記VEGF結合要素は各々、少なくとも1つのVEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインおよび少なくとも1つのDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインをそれぞれ含み、前記免疫グロブリン単一可変ドメインの各々は4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3をそれぞれ含み、ここで、
a)前記少なくとも1つのDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインのCDR3は、
i)配列番号:1に示すようにArg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr Xaa Tyr Asp Xaaであって、8位のXaaはArg、AlaまたはGluであり、11位のXaaはLeuまたはGluであり、さらに14位のXaaはTyrまたはHisである、前記配列;および
ii)配列番号:2に示すようにAsp Arg Tyr Ile Trp Ala Arg Gln Gly Glu Tyr Trp Gly Ala Tyr Xaa Asp Tyrであって、XaaはGln、AlaまたはTyrである前記配列、
から選択されるアミノ酸配列を有し、さらに
b)前記少なくとも1つのVEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインのCDR3は、配列番号:3に示すアミノ酸配列Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Xaa Tyrを有し、ここでXaaはAspまたはGluであり、
前記VEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト組換えVEGF165とヒト組換えVEGFR-2との相互作用を60%以上の阻害率で遮断することができる。
好ましい実施態様では、本発明の二重特異性結合分子は、免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にVHHを含み、前記は、親免疫グロブリン単一可変ドメインの(場合によって親和性増進後の)配列最適化によって得られている。
例示すれば、二重特異性結合分子に含まれるDll4結合分子は、表5および配列番号:4−20に示すアミノ酸配列を有するVHHである親Dll4結合分子から得られている。
Dll4結合要素に含まれる好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号:10に示すアミノ酸配列を有するVHHから誘導される。
ある実施態様では、前記好ましいDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号:10に示す配列を有するVHHに由来する親和性増進VHHの配列最適化によって得られ、前記親和性増進VHHは配列番号:21−27および表16に示すアミノ酸配列を有する。
好ましい実施態様では、前記親和性増進VHHは、配列番号:22に示す配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましい実施態様では、VHHは、配列番号:22に示すアミノ酸配列を有するVHHの配列最適化によって得られている。
好ましい配列最適化VHHは、配列番号:34および35並びに表23に示す配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
Dll4結合要素に含まれる好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインの別のグループは、配列番号:12に示すアミノ酸配列を有するVHHから誘導される。
好ましい実施態様では、前記親和性増進VHHは、配列番号:30、32および33に示す配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
さらに好ましい実施態様では、VHHは、配列番号:32に示すアミノ酸配列を有するVHHの配列最適化によって得られている。配列最適化VHHの例は、配列番号:36−39および表24に示す配列を有するもの、および特に好ましくは表25に示す、配列番号:40および41を有するものである。
ヒト組換えVEGF165とヒト組換えVEGFR-2との相互作用を60%以上の阻害率で遮断することができるVEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインの例は、配列番号:42−44および表32に示すVHHである。
好ましくは、VEGF結合要素に含まれるVEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号:43に示すアミノ酸配列を有するVHHの配列最適化によって得られている。好ましいVHHは配列番号:54−62に示す配列を有し、特に好ましいレセプター遮断VHHは配列番号:63および64並びに表59に示す配列を有する。
したがって、本発明の二重特異性結合分子に含まれる抗Dll4および/または抗VEGF要素は、2つの(または3つ以上の)抗Dll4(または抗VEGF)免疫グロブリン単一可変ドメインを(それぞれ)含むことができ、ここで前記免疫グロブリン単一可変ドメインはDll4(またはVEGF)標的内の別個のエピトープに対する。したがって、二重特異性結合分子内の2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは別個の抗原特異性、したがって別個のCDR配列を有する。
そのような二価結合分子はまた、2つの免疫グロブリン単一可変ドメインが2つの別個のパラトープを含むので、“二パラトープ性一ドメイン抗体構築物”(免疫グロブリン単一可変ドメインが一ドメイン抗体から成るかまたは本発明質的に一ドメイン抗体から成る場合)、または“二パラトープ性VHH構築物”(免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHから成るかまたは本質的にVHHから成る場合)とそれぞれ称される。
本発明の二重特異性結合分子では、好ましくは、二価VEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば二パラトープ性VHHを含むのはVEGF結合要素である。
そのようなVEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインは2つまたは3つ以上のVEGF結合VHHを含むことができ、それらVHHは以下のとおりである:
a.組換えヒトVEGFと組換えヒトVEGFR-2との間の相互作用を60%以上の阻害率で遮断することができる同一のVHH;または
b.VEGFの非オーバーラップ性エピトープと結合する異なるVHHであって、少なくとも1つのVHHが組換えヒトVEGFと組換えヒトVEGFR-2との間の相互作用を60%以上の阻害率で遮断することができ、少なくとも1つのVHHが前記相互作用を60%以下の阻害列で遮断することができる、前記異なるVHH。
二価の抗VEGF VHH構築物は配列番号:48−53および表45として具体化される。ヒト療法用二重特異性結合分子はこれらVHHの対応する配列最適化変種を含み、二重特異性結合分子は、配列番号:68−73(表66および図39もまた参照されたい)および配列番号:74−80(表68および図40もまた参照されたい)として具体化され、提示した例は、構築ブロックとして親VHHおよび親和性増進VHHを含む。ヒト療法用二重特異性結合分子は、これらのVHHの対応する配列最適化変種を含むであろう(配列番号:81−89および図48に示す)。
本発明の好ましい二重特異性結合分子は以下を含む:
a)Dll4結合要素として、配列番号:35または41の配列から選択される配列を有するVHH、および
b)VEGF結合要素として、
i)配列番号:64に示す配列を有するVHH、または
ii)配列番号:64に示す配列を有するVHHおよび配列番号:67に示す配列を有するVHHを含む二パラトープ性VHH。
EVQで始まる本発明の二重特異性結合分子では、VHHのN末端のEはDで置換されるか(前記はしばしば配列最適化の結果である)、またはEは失われることがある(大腸菌での発現の場合)。前記は通常N末端に位置するVHHにのみ適用される。N末端のEが失われる二重特異性結合分子の例は、化合物A1、A2およびA3(配列番号:81−83)のための図48で提供される。
好ましい実施態様にしたがえば、二重特異性結合分子に存在する結合分子(Dll4結合要素内のDll4結合分子またはVEGF結合要素内のVEGF結合分子または2つの隣接するDll4およびVEGF結合要素)は、互いに直接(すなわちリンカーを使用することなく)またはリンカーを介して結合され得る。前記リンカーは好ましくはリンカーペプチドであり、それらリンカーは、前記2つの別個の結合分子が標的の非オーバーラップ性エピトープの各々と1つの同一標的分子内でまたは2つの別個の分子内で結合できるように選択されるであろう。
二パラトープ性結合分子の場合には、Dll4またはVEGF結合要素内のリンカーの選択は、とりわけ当該エピトープに、特に免疫グロブリン単一可変ドメインが結合する標的上のエピトープ間の距離に左右されるであろう。前記選択は、当業者には本明細書の開示を基にすれば、場合によってある程度の日常的実験を実施した後で明らかとなろう。
或いは、それぞれの標的と結合する2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、連なって(直接または適切なリンカーを介して)連結され、追加されるVHHまたはドメイン抗体(それらは半減期延長を提供することができる)は、直接またはリンカーを介してこれら2つまたは3つ以上の前述の免疫グロブリン配列の1つと連結され得る。
適切なリンカーは本発明の具体的なポリペプチドと関連して本明細書で開示され、それらは、例えば、好ましくは長さが9または10以上のアミノ酸、より好ましくは少なくとも17アミノ酸(例えば約20から40アミノ酸)を有するアミノ酸配列を含むことができるが、ただしこれらに限定されない。しかしながら、上限は重大ではないが、例えばそのようなポリペプチドの生物医薬の製造に関する便宜性の理由のために選択される。
リンカー配列のある有用なグループは、WO 96/34103およびWO 94/04678に記載されている重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。
他の例はポリアラニンリンカー配列、例えばAla-Ala-Alaである。
リンカー配列のさらに好ましい例は、種々の長さのGly/Serリンカー、例えば(glyxsery)zリンカー((gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3および(gly3ser2)3を含む)である。
リンカーのいくつかの非限定的な例は図40および48に示され、例えば以下のリンカーである;
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS;配列番号:90);
GGGGSGGGS(9GS;配列番号:91);
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS;配列番号:92)。
二重特異性結合分子が、ポリマーの結合、例えばポリエチレングリコールPEG(ポリエチレングリコール)部分の結合によって改変される場合、リンカー配列は好ましくはアミノ酸残基、例えばシステインまたはリジンを含み、リンカー領域におけるそのような改変(例えばPEG化)を可能にする。
PEG化に有用なリンカーの例は以下である:
GGGGCGGGS(“GS9, C5“、配列番号:93);
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS25, C5”、配列番号:94);
GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG(“GS27, C14“、配列番号:95);
GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35, C15“、配列番号:96);および
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35, C5”、配列番号:97)。
さらにまた、リンカーは例えばWO 04/081026に示されるポリ(エチレングリコール)部分であってもよい。
好ましい実施態様にしたがえば、本発明の二重特異性結合分子は、特に治療薬剤としての使用が意図されているかまたは治療薬剤として使用されている場合は、患者の血清または他の体液中での本発明のポリペプチドの半減期を延長する要素部分を含む。“半減期”という用語は、当該(改変)ポリペプチドの血中濃度が、例えばポリペプチドの分解および/または除去および/または天然のメカニズムによる排除によってin vivoで50%低下するために要する時間と定義される。
より具体的には、そのような半減期延長要素部分は免疫グロブリン単一可変ドメインに共有結合させるか、または融合させることができ、前記要素部分は、Fc部分、アルブミン部分、アルブミン部分のフラグメント、アルブミン結合部分(例えば抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン)、トランスフェリン結合部分(例えば抗トランスフェリン免疫グロブリン単一可変ドメイン)、ポリオキシアルキレン分子(例えばポリエチレングリコール分子)、アルブミン結合ペプチドまたはヒドロキシエチルデンプン(HES)誘導体であり得る(ただし前記に限定されない)。
ヒトでの使用が意図される場合は、そのようなアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインは好ましくはヒト血清アルブミンと結合し、好ましくはヒト化アルブミン結合VHHドメインである。
ヒト血清アルブミンと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは当分野で公知であり、例えばWO 2006/122786にさらに詳細に記載されている。特に、有用なアルブミン結合VHHは、ALB1およびそのヒト化対応物、ALB8(WO 2009/095489)である。しかしながら、上記の特許公開公報に記載されている他のアルブミン結合VHHドメインも同様に用いることができる。
特に有用なアルブミン結合VHHドメインは、配列番号:98に示すアミノ酸配列から成るかまたは前記アミノ酸配列を含むALB8である。
別の実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドの半減期延長改変(そのような改変はまた前記ポリペプチドの免疫原性を低下させる)は、適切な薬理学的に許容可能なポリマー、例えば直鎖または分枝鎖ポリ(エチレングリコール)(PEG)またはその誘導体(例えばメトキシポリ(エチレングリコール)またはmPEG)の結合を含む。一般的には、PEG化の任意の適切な形態、例えば抗体および抗体フラグメント(ドメイン抗体およびscFv’sを含むが、ただしこれらに限定されない)のために当分野で利用されるPEG化を用いることができる。例えば以下を参照できる:Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002);Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003);Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003);およびWO04/060965。
好ましくは、位置特異的PEG化が、特にシステイン残基を介して用いられる(例えば以下を参照されたい:Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)。例えば、この目的のためにPEGは本発明のポリペプチドに天然に存在するシステイン残基に結合させることができる。PEGの結合のために1つまたは2つ以上のシステイン残基の適切な導入のために本発明のポリペプチドを改変してもよく、またはPEGの結合のために本発明のポリペプチドのNおよび/またはC末端に1つまたは2つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を融合させてもよく、いずれも当業者にはそれ自体公知であるタンパク質操作技術を用いる。
好ましくは、本発明のポリペプチドのためには、5kDaより大きく(例えば10kDaより大きく)さらに200kDaより小さい(例えば100kDaより小さい)、例えば20kDaから80kDaの範囲の分子量を有するPEGが用いられる。
本発明の二重特異性結合分子は上記に記載したPEG試薬の1つ、例えば以下の化学式で示される“サンブライト(商標) ME-400MA”を用いてPEG化することができる:
別の実施態様にしたがえば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書に定義するドメイン抗体である。
本発明の二重特異性結合分子に存在する免疫グロブリン単一可変ドメインはまた天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列と一致する配列を有することができる。前記可変ドメインは“ラクダ化”されてあり、すなわち通常の4鎖抗体の天然に存在する可変重鎖のアミノ酸配列中の1つまたは2つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のVHHドメイン中の対応する位置に存在する1つまたは2つ以上のアミノ酸残基によって置換することによってラクダ化されてある。前記はそれ自体公知の態様で実施することができ、当業者には明白で、さらに別にWO 94/04678を参照できる。そのようなラクダ化は、好ましくはVH-VLの接触面およびいわゆるラクダ科動物のホールマーク残基に存在するアミノ酸残基において実施することができる(例えばWO 94/04678もまた参照されたい)。そのような“ヒト化”および“ラクダ化”技術並びに前記と調和する好ましいフレームワーク領域配列はさらに別に例えば、WO 2006/040153のpp. 46およびpp. 98並びにWO 2006/122786のpp. 107から入手できる。
結合分子とその抗原Dll4またはVEGFとの特異的結合は、それ自体公知の任意の適切な態様で決定できる。前記態様には、例えば、本明細書に記載したアッセイ、スキャチャード解析および/または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫アッセイ(EIAおよびELISA)およびサンドイッチ競合アッセイ、並びに当分野でそれ自体公知である前記の種々の変型が含まれる。
それぞれ抗原Dll4またはVEGFに関して、免疫グロブリン単一可変ドメインは種に関して限定されない。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒトでの治療を目的とする場合は、好ましくはヒトDll4またはヒトVEGFとそれぞれと結合する。しかしながら、別の哺乳動物種由来のDll4またはVEGFとそれぞれ結合する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含むポリペプチドもまた本発明の範囲内である。1つの種のDll4またはVEGF型と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、1つまたは2つ以上の他の種のそれぞれの抗原と交差反応し得る。例えば、ヒトの抗原と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、1つまたは2つ以上の他の霊長類種のそれぞれの抗原、および/または疾患の動物モデル(例えばサル(特にカニクイザルまたはアカゲザル)、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ)、および特にDll4の阻害によって調節され得る疾患および異常の動物モデルで用いられる1つまたは2つ以上の動物種(例えば本明細書に記載する種および動物モデル)由来の抗原との交差反応性を示す。そのような交差反応性を示す免疫グロブリン単一可変ドメインは研究および/または薬剤開発において有益である。なぜならば、前記交差反応性は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを周知の疾患モデル、例えばサル(特にカニクイザルまたはアカゲザル)またはマウスおよびラットで試験することを可能にするからである。
したがって、好ましい実施態様にしたがえば、本発明の二重特異性結合分子はDll4結合分子を含み、前記Dll4結合分子は、配列番号:101のアミノ酸残基252-282に一致する、EGF-2ドメイン内に全部または部分が含まれるエピトープと結合するグループから選択される免疫グロブリン単一可変ドメインである。
本発明の二重特異性分子が二パラトープ性Dll4結合分子(前記は2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む)を含む場合、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン要素の少なくとも1つは、上記に規定したEGF-2ドメイン内のエピトープと結合する。好ましくは、VEGF結合要素は、VEGFアイソフォームVEGF165および/またはVEGF121と結合する。
好ましくは、本発明の二重特異性結合分子に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、実施例5.1に記載する競合ELISAアッセイで測定したとき、10-6から10-10モル/リットル以下の範囲、より好ましくは10-8から10-10モル/リットル以下の範囲、さらに好ましくは10-9から10-10モル/リットル以下の範囲のIC50値を有する。
本発明の好ましい実施態様(ただし前記に限定されないが)にしたがえば、本発明の二重特異性結合分子に含まれるDll4またはVEGF結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、10-5から10-12モル/リットル(M)以下、および好ましくは10-7から10-12モル/リットル(M)以下、およびより好ましくは10-8から10-12モル/リットル(M)以下の解離定数(KD)で、および/または少なくとも107 M-1、好ましくは少なくとも108 M-1、より好ましくは少なくとも109 M-1、例えば少なくとも1012 M-1の結合定数(KA)で、さらに具体的には500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満のKDでそれぞれDll4またはVEGFと結合する。Dll4に対する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのKDおよびKA値は測定することができる。
本発明の核酸はまた、ベクター(例えばプラスミド、コスミドまたはYAC)の形態であるか、前記内に存在するか、および/または前記の部分であり得る。ベクターは特に発現ベクター、すなわちin vitroおよび/またはin vivo(すなわち適切な宿主細胞、宿主生物および/または発現系)でDll4結合分子の発現を提供できるベクターであり得る。そのような発現ベクターは一般的に少なくとも1つの本発明の核酸を含み、前記核酸は1つまたは2つ以上の適切な調節エレメント(例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど)に作動できるように連結される。特定の宿主で特定の配列を発現させるという観点におけるそのようなエレメントおよびそれらの選択は当業者にとって通常的な知識である。本発明のDll4結合分子の発現に有用なまたは必要な調節エレメントおよび他のエレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組込み因子、選別マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子などの具体的な例は、例えばWO2006/040153のpp.131から133に開示されている。
別の特徴では、本発明は、本発明の1つまたは2つ以上の二重特異性結合分子を発現するかまたは前記を発現する能力を有するか、および/または本発明の核酸を含む宿主細胞に関する。特に好ましい実施態様にしたがえば、前記宿主細胞は細菌細胞であり、他の有用な細胞は酵母細胞、菌類細胞または哺乳動物細胞である。
適切な細菌細胞には、グラム陰性細菌株(例えば大腸菌(Escherichia coli)、プロテウス(Proteus)およびシュードモナス(Pseudomonas)の株)およびグラム陽性細菌株(例えばバシルス(Bacillus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、スタヒロコッカス(Staphylococcus)およびラクトコッカス(Lactococcus)の株)が含まれる。適切な菌類細胞には、トリコデルマ(Trichoderma)、ニューロスポラ(Neurospora)およびアスペルギルス(Aspergillus)の種に由来する細胞が含まれる。適切な酵母細胞には、サッカロミセス(Saccharomyces)(例えばサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae))、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)(例えばシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe))、ピキア(Pichia)(例えばピキア・パストリス(Pichia pastoris)およびピキア・メタノリカ(ichia methanolica))およびハンセヌラ(Hansenula)の種に由来する細胞が含まれる。
適切な哺乳動物細胞には、例えばCHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞などが含まれる。しかしながら、異種タンパク質の発現に当分野で用いられる両性動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および他の任意の細胞も同様に用いることができる。
−二重特異性結合分子をコードすることができる核酸を含む宿主細胞を、本発明の二重特異性結合分子の発現を可能にする条件下で培養する工程;および
−前記宿主細胞によって発現されたポリペプチドを前記培養から回収または単離する工程;および
−本発明の二重特異性結合分子を場合によってさらに精製するか、および/または改変するか、および/または処方化する工程。
工業的スケールでの生産について好ましい宿主生物には大腸菌、ピキア・パストリスおよびS.セレビシアエの株が含まれ、前記は大規模な発現、生産および発酵に、特に大規模な医薬の発現、生産および発酵に適切である。
具体的な発現系の選択は、部分的にはある種の翻訳後改変(より具体的にはグリコシル化)の要求に左右される。グリコシル化が所望または要求される本発明の二重特異性結合分子の生産には、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物の発現宿主を使用することが必要であろう。これに関して、得られるグリコシル化パターン(すなわち結合される残基の種類、数および位置)は発現に使用される細胞または細胞株に左右されることは当業者には明白であろう。
本発明の二重特異性結合分子は、上記に示した細胞の細胞内で(例えばサイトゾルで、ペリプラズムで、または封入体で)産生され、続いて前記宿主細胞から単離され、場合によってさらに精製されるか、またはそれらは細胞外に(例えば宿主細胞が培養されている培養液中に)産生され、続いて培養液から単離され、場合によってさらに精製される。
さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:1から166、配列番号:333から353、または配列番号:375から395にそれぞれ示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび前記をコードする核酸分子に関する。
これらのペプチドは本発明のVHHから誘導されるCDR3に対応する。それら(特にそれらをコードする核酸分子)は、CDR移植を実施して免疫グロブリン鎖にCDR3を置換するために、または非免疫グロブリン系足場(例えばプロテアーゼ阻害物質、DNA結合タンパク質、チトクロームb562、ヘリックス束タンパク質、ジスルフィド架橋タンパク質、リポカリンまたはアンチカリン)に挿入してそのような足場に標的結合特性を付与するために有用である。CDR移植の方法は当分野では周知であり、例えばヒト化抗体のために広く用いられている(前記は通常ヒト抗体のFvフレームワークへのげっ歯類抗体由来のCDRの移植を含む)。
本発明はさらに、本発明の少なくとも1つの二重特異性結合分子を収納または含む製品または組成物に関し、場合によって前記はさらに、それ自体公知である(すなわち前記組成物の意図される使用に応じて)そのような組成物のさらに別の1つまたは2つ以上の要素を含む。
医薬としての使用のために、本発明の二重特異性結合分子または前記を含むポリペプチドは、少なくとも1つの本発明の二重特異性結合分子および少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤および/またはアジュバント、並びに場合によって1つまたは2つ以上のさらに別の医薬的に活性なポリペプチドおよび/または化合物を含む医薬調製物または組成物として処方することができる。非限定的に例示すれば、そのような処方物は経口投与に、非経口投与に(例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下注射または静脈内輸液による)、局所投与に、吸入、皮膚絆創膏、インプラント、座薬などによる投与に適した形態であり得る。そのような適切な投与形態(投与態様に応じてそれらは固体、半固体または液体であり得る)並びにその調製で使用される方法および担体は当業者には明白であり、本明細書でさらに開示される。
本発明の二重特異性結合分子はそれ自体公知の任意の適切な態様で処方および投与することができる。特に免疫グロブリン単一可変ドメインについては、例えば、WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079並びに標準的な手引書(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington;the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005);またはthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007(例えば252-255ページ参照))を参照できる。
例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、通常の抗体および抗体フラグメント(ScFvおよびジアボディを含む)および他の医薬的に活性なタンパク質のためのそれ自体公知の任意の態様で処方および投与することができる。そのような処方物および前記を調製する方法は当業者には明白で、例えば、非経口投与(例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管内、動脈内または脊髄内投与)または局所(すなわち経皮または皮内)投与に適した調製物を含む。
したがって、本発明の二重特異性結合分子は、医薬的に許容できるビヒクル(例えば不活性希釈剤)または消化吸収性食用担体と一緒にして全身的に、例えば経口的に投与できる。経口治療薬投与のためには、本発明の二重特異性結合分子は1つまたは2つ以上の賦形剤と一緒にして、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェファースなどの形態で用いることができる。そのような組成物および調製物は少なくとも0.1%の本発明の二重特異性結合分子を含むべきである。前記組成物または調製物中のそれらのパーセンテージはもちろん変動可能であり、便利にはあるユニット投薬形の重量の約2から約60%であり得る。そのような治療的に有用な組成物中の本発明の二重特異性結合分子の量は、有効投薬レベルが達成される量である。
本発明の二重特異性結合分子はまた、WO 08/020079の144および145ページにさらに記載されているように輸液または注射により静脈内または腹腔内に投与できる。
本発明の二重特異性結合分子の局所投与のためには、一般的には皮膚学的に許容できる担体と一緒にした組成物または処方物としてそれらを皮膚に投与することが所望され、それらはWO 08/020079の145ページにさらに記載されているように固体または液体であり得る。
一般的には、液体組成物(例えばローション)中の本発明の二重特異性結合分子の濃度は約0.1−25 wt%、好ましくは約0.5−10 wt%であろう。半固体または固体組成物(例えばゲルまたは散剤)中の濃度は約0.1−5 wt%、好ましくは約0.5−2.5 wt%であろう。治療での使用に要求される本発明の二重特異性結合分子の量は、選択される具体的な二重特異性結合分子だけでなく、投与経路、治療される症状の性質並びに患者の年齢および状態により変動し、最終的に主治医または医師の裁量であろう。さらにまた、本発明の二重特異性結合分子の投薬量は、標的の細胞、腫瘍、組織、移植片または器官にしたがって変動する。
便利には、所望の用量は1回の投与で提供するか、または適切な間隔で投与される分割投与として、例えば1日の用量より少ない2回、3回、4回または5回以上の分割投与として提供できる。サブ用量自体をさらに、例えば大雑把に間をあけて何回か別々の投与として、例えば散布器から多数回の吸引として、または眼に複数回点眼することによって分割してもよい。
投与処置スケジュールは長期の毎日の処置を含むことができる。“長期”とは、少なくとも2週間、好ましくは数週間、数カ月または数年の期間を意味する。この投薬範囲における必要な改変は、本明細書の教示により単なる日常的な実験を用いるだけで当業者が決定できる。以下の成書を参照された:Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA。投薬量はまた、何らかの合併症の発生時に個々の医師によって調整され得る。
−脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係するか、またはNotchシグナリング経路をDll4結合分子により調節することによって予防、治療または緩和できる(特にヒトの)異常、疾患または症状の予防、治療および/または緩和のため;
−そのような治療を必要とする患者の処置方法で(そのような方法は、その必要がある対象者に本発明の少なくとも1つの二重特異性結合分子(例えば免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記を含む医薬組成物)の医薬的に活性な量を投与する工程を含む);
−脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係する異常、疾患または症状の予防、治療および/または緩和のための医薬の調製のため;
−上記の目的のために使用される医薬組成物または医薬中の活性成分として。
具体的な特徴にしたがえば、前記異常、疾患または症状は本明細書で定義される癌または癌性疾患である。
別の特徴にしたがえば、前記疾患は脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係するか、またはNotchシグナリング経路をDll4結合分子により調節することによって治療または緩和できる眼の疾患である。
前記追加の治療薬剤は、同時に(場合によって同じ医薬調製物の成分として)、または二重特異性結合分子の投与の前もしくは後で投与できる。
ある種の実施態様では、前記追加の治療薬剤は、EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLKおよびPI3キナーゼ、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGFRまたはIRの阻害剤グループから選択される1つまたは2つ以上の阻害剤であり得るが、ただしこれらに限定されない(レセプターの場合にはそれぞれのリガンドを含む)。
追加の治療薬剤のさらに別の例は、CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90の阻害剤、ヘッジホッグアンタゴニスト、JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、、プロテアソーム、Rhoの阻害剤、wntシグナリングの阻害剤、またはユビキチン化経路の阻害剤またはNotchシグナリング経路の別の阻害剤である。
Aurora阻害剤の例は、PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735であるが、ただしこれらに限定されない。
PLK阻害剤の例はGSK-461364である。
raf阻害剤の例は、BAY-73-4506(VEGFR阻害剤でもある)、PLX 4032、RAF265(さらにまたVEGFR阻害剤である)、sorafenib(さらにまたVEGFR阻害剤である)およびXL 281である。
KSP阻害剤の例は、イスピネシブ(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731およびSB-743921である。
Srcおよび/またはbcr-abl阻害剤の例は、ダサチニブ(dasatinib)、AZD-0530、ボスチニブ(bosutinib)、XL 228(IGF-1R阻害剤でもある)、ニロチニブ(nilotinib)(PDGFRおよびcKit阻害剤でもある)、イマチニブ(imatinib)(cKit阻害剤でもある)およびNS-187である。
Rho阻害剤の例はBA-210である。
PI3キナーゼ阻害剤の例は、PX-866、BEZ-235(mTor阻害剤でもある)、XL 418(Akt阻害剤でもある)、XL-147およびXL 765(mTor阻害剤でもある)である。
cMetまたはHGFの阻害剤は、XL-184(VEGFR、cKit、Flt3の阻害剤でもある)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(VEGFRの阻害剤でもある)、MGCD-265(VEGFR、Ron、Tie2の阻害剤でもある)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102およびAV-299である。
c-Myc阻害剤の例はCX-3543である。
Flt3阻害剤の例は、AC-220(cKitおよびPDGFRの阻害剤でもある)、KW 2449、レスタウアーチニブ(lestaurtinib)(VEGFR、PDGFR、PKCの阻害剤でもある)、TG-101348(JAK2の阻害剤でもある)、XL-999(cKit、FGFR、PDGFRおよびVEGFRの阻害剤でもある)、スニチニブ(sunitinib)(PDGFR、VEGFRおよびcKitの阻害剤でもある)、タンズチニブ(tandutinib)(PDGFRおよびcKitの阻害剤でもある)である。
HSP90阻害剤の例は、タネスピマイシン(tanespimycin)、アルベスピマイシン(alvespimycin)、IPI-504およびCNF 2024である。
JAK/STAT阻害剤の例は、CYT-997(チューブリンとも相互作用する)、TG 101348(Flt3の阻害剤でもある)およびXL-019である。
Mek阻害剤の例は、ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330およびXL 518である。
mTor阻害剤の例は、テムシロリムス(temsirolimus)、AP-23573(VEGF阻害剤としても作用する)、エヴェロリムス(everolimus)(さらにまたVEGF阻害剤である)、XL-765(PI3キナーゼ阻害剤でもある)、およびBEZ-235(PI3キナーゼ阻害剤でもある)である。
Akt阻害剤の例は、ペリフォシン(perifosine)、GSK-690693、RX-0201およびトリシリビン(triciribine)である。
ヘッジホッグアンタゴニストの例はIPI-609およびCUR-61414である。
CDK阻害剤の例は、セリシクリブ(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(VEGFR2およびPDGFRも阻害する)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509およびAG 024322である。
プロテアソームの阻害剤の例は、ボルテゾミブ(bortezomib)、カルフィロゾニブ(carfilzomib)およびNPI-0052(NFkappaBの阻害剤でもある)である。
NFkappaB経路の阻害剤はNPI-0052である。
ユビキチン化経路の阻害剤の例はHBX-41108である。
好ましい実施態様では、追加の治療薬剤は抗血管形成剤である。
抗血管形成剤の例は、FGFR、PDGFRおよびVEGFRの阻害剤または対応するリガンド(例えばペガプタニブ(pegaptanib)のようなVEGF阻害剤または抗VEGF抗体ベヴァシズマブ(bevacizumab))、およびサリドマイド(例えば以下から選択される(ただしこれらに限定されない):ベヴァシズマブ、モテサニブ(motesanib)、CDP-791、SU-14813、テラチニブ(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(CDK阻害剤でもある)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD(免疫調節薬)、サリドマイド誘導体CC-4047、レナリドミド(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、ブリヴァニブ(brivanib)、セジラニブ(cediranib)、XL-999(cKitおよびFlt3の阻害剤でもある)、1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-1530(Flt3の阻害剤でもある)、スニチニブ(cKitおよびFlt3の阻害剤でもある)、アクシチニブ(cKitの阻害剤でもある)、レスタウアーチニブ(Flt3およびPKCの阻害剤でもある)、ヴァタラニブ(vatalanib)、タンズチニブ(Flt3およびcKitの阻害剤でもある)、パゾパニブ(pazopanib)、GW 786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、ソラフェニブトシレート(sorafenib tosylate)(Raf阻害剤でもある)、RAF-265(Raf阻害剤でもある)、ヴァンデタニブ(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(EGFRおよびHer2の阻害剤でもある)、BAY-57-9352(Rafの阻害剤でもある)、BAY-73-4506(Rafの阻害剤でもある)、XL 880(cMetの阻害剤でもある)、XL-647(EGFRおよびEphB4の阻害剤でもある)、XL 820(cKitの阻害剤でもある)、およびニロチニブ(nilotinib)(cKitおよびbrc-ablの阻害剤でもある)である。
本発明の二重特異性結合分子との組合せで有用なEGFRおよびHer2阻害剤はとりわけ、ラパチニブ(lapatinib)、ゲフィチニブ、エルロチニブ(erlotinib)、セツキシマブ、トラスツズマブ(trastuzumab)、ニモツズマブ(nimotuzumab)、ザルツムマブ(zalutumumab)、ヴァンデタニブ(vandetanib)(VEGFRの阻害剤でもある)、ペルツズマブ(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626 ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(VEGFRの阻害剤でもある)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemabである。
治療において本発明の二重特異性結合分子と有利に組み合わせることができる他の薬剤は、トリツムマブ(tositumumab)およびイブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan)(2つの放射能標識抗CD20抗体)、アレムツズマブ(alemtuzumab)(抗-CD52抗体)、デノスマブ(denosumab)(破骨細胞分化因子リガンド阻害剤)、ガリクシマブ(galiximab)(CD80アンタゴニスト)、オファツムマブ(ofatumumab)(CD20阻害剤)、ザノリムマブ(zanolimumab)(CD4アンタゴニスト)、SGN40(CD40リガンドレセプター調節物質)、リツキシマブ(rituximab)(CD20阻害物質)またはマパツムマブ(mapatumumab)(TRAIL-1レセプターアゴニスト)である。
本発明の二重特異性結合分子またはそれら含むポリペプチド、および前記を含む組成物の有効性は、任意の適切なin vitroアッセイ、細胞系アッセイ、in vivoアッセイおよび/またはそれ自体公知の動物モデルまたは前記の組合せを対象となる具体的な疾患または異常に応じて用いながら試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは当業者には明白で、例えば本明細書に記載し下記実施例で用いるアッセイ、例えば増殖アッセイが含まれる。
a)ヒト、マウスおよびカニクイザルDll4を過剰発現するCHOおよびHEK293細胞株の作製
ヒト(配列番号:101;NM_019074.2)およびマウスDll4(NM_019454.3)をコードするcDNAを、ヒト成人正常心臓組織cDNAライブラリー(BioChain, Hayward, CA, USA)およびマウス心臓組織cDNAライブラリー(C57/Bl6株から単離)から、対応する配列の5’および3’UTRに対して設計したオリゴヌクレオチドを用いてそれぞれ増幅する。アンプリコンを哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)でクローニングする。
カニクイザルDll4 cDNAは、カニクイザル正常心臓組織cDNAライブラリー(BioChain, Hayward, CA, USA)から、近縁種アカゲザルのDll4コード配列の5’ および3’ UTRで設計したプライマーを用いて増幅する(マカカ・ムラタ(Macaca mulatta)Dll4、配列番号:102;XM_001099250.1)(図1参照)。最終的アンプリコンを哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)でクローニングする。カニクイザルDll4のアミノ酸配列はアカゲザルと100%同一であり、ヒトと99%同一であることが示された(図1参照;ヒト配列との相違は太字下線付きで示されている)。
ヒトDll4、マウスDll4またはカニクイザルDll4を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を樹立するために、親CHO細胞にpCDNA3.1(+)-neo-hDll4、pcDNA3.1(+)-neo-mDll4またはpcDNA3.1(+)-neo-cDll4をそれぞれエレクトロポレートする。ヒトDll4およびマウスDll4を過剰発現するヒト胎児腎(HEK293)細胞を、それぞれpCDNA3.1(+)-neo-hDll4またはmDll4プラスミドのFugene(Roche)を用い脂質媒介トランスフェクションによってHEK293親細胞株で作製する。全ての条件について、トランスフェクタントは1mg/mLのゲネチシン(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を添加することにより選別される。
US 2008/0014196(Genentech)で、ヒト/マウス交差反応性Dll4 mAbが記載されてあり、前記を用いてRiddwayら(2006)は、多数の異種移植モデルで腫瘍増殖におけるVEGF mAbおよびDll4 mAbの累積的作用を示した。この抗Dll4 mAbおよびその対応するFabを精製し、前記抗体(フラグメント)の生化学/細胞アッセイおよび異種移植モデルにおける特性およびファージ選別中の特異的溶出について評価する。Dll4 mAbの公表された可変重鎖および軽鎖配列をhIgG2akフレームワークにおいてクローニングし、HEK293細胞で一過性に発現させ、さらに上清からタンパク質Aクロマトグラフィーを用いて精製する。精製Dll4 mAbはELISAおよびFACSでヒトDll4およびマウスDll4との結合を示し(CHO-mDll4およびCHO-hDll4細胞を使用)、両増殖因子オルトローグに対して親和性はBiacoreでナノモル以下である。
対応するDll4 Fabフラグメントは、バックトランスレーションによる遺伝子アッセンブリーおよびLetoの遺伝子最適化ソフト(www.entechelon.com)を用いる大腸菌発現のためのコドン最適化により構築される。可変軽鎖(VL)、可変重鎖(VH)、定常軽鎖(CL)および重鎖の定常ドメイン1(CH1)のアッセンブリーのためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、アッセンブリーPCRを実施する。VL+CLおよびVH+CH1をコードするcDNAセグメントをpUC119から誘導したベクター(LacZプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびハイブリッドgIII-pelBリーダー配列を含む)で、それぞれ制限部位SfiIおよびAscI並びに制限部位KpnIおよびNotIを用いクローニングする。Fabコード配列に関してインフレームで、発現ベクターはC-末端HAおよびHis6-タグをコードする。FabフラグメントはHis6-タグ付きタンパク質として大腸菌で発現され、続いて金属固定アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により培養液から精製される。可変重鎖および可変軽鎖の関連するアミノ酸配列が示されている(US 2008/0014196のそれぞれ配列番号:1および配列番号:2)。完全な重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は配列番号:419および420に示されている。
抗Dll4 VHHによって認識されるエピトープを含むDll4の細胞外ドメイン(ECD)中の領域を同定すために、Dll4 ECDの進行的欠失変異体を作製する。ポリHis-タグを融合させたDll4 ECDの欠失フラグメントのネストシリーズをコードするポリヌクレオチドの上流にCMVプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターpSecTag2/Hygro(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を、標準的な組換えDNA技術を用いて作製する(図2参照;アミノ酸ドメインの境界はスーパースクリプト中に存在する)。これらの組換えタンパク質をフリースタイル293発現系(Freestyle 293 Expression System, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用い一過性にトランスフェクトしたHEK239細胞で発現させ、この系から条件付け培養液を収集してIMACにより精製する。EGF2様ドメインを欠くDll4変異体のみが、上記に記載したヒト化ヒト/マウス交差反応性抗Dll4 mAbとの結合障害を示した(前記抗体は捕捉性抗ヒトIgG被覆Biacoreセンサーチップにより固定)。このIgGはこのDll4ドメインに特異的な結合エピトープを有することが判明している(特許出願Genentech, US 2008/0014196A1)。
レポーターアッセイは、Notch1のγ-セクレターゼ媒介切断およびDll4刺激時のNotch1細胞内ドメイン(NICD)の核内移転に基づいて開発される(本質的に以下に記載されている:Struhl and Adachi, Cell. 1998 May 15, 93(4):649-60)。Gal4/VP16コード配列をNICD-コード配列に挿入する。強力なハイブリッド転写アクチベーターGAL4-VP16(前記は単純ヘルペスウイルス転写アクチベータードメインVP16と融合させた酵母GAL4のDNA結合フラグメントから成る)を、Notch1のトランスメンブレンドメインのカルボキシ末端側に挿入する。γ-セクレターゼによるこの構築物の切断はGal4/VP16 NICD融合タンパク質の遊離をもたらし、前記は核に移転し、そこで同時にトランスフェクトされたルシフェラーゼレポータープラスミドと結合してこれを活性化するであろう(前記は強力なGAL4-UASプロモーター配列を含む(Struhl, G. and Adachi, A., Cell, vol. 93, 649-660, 1998))。ヒトNotch1-Gal4/VP16発現カセットをpcDNA3.1(+)-neo(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)でクローニングする。pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]ベクター(Promega, Madison, WI, USA)をルシフェラーゼレポータープラスミドとして用いる。
ヒト血管内皮増殖因子アイソフォームVEGF165(GenBank:AAM03108.1;AA残基 27-135)のレセプター結合ドメインをコードするcDNAをpET28aベクター(Novagen, Madison, WI)でクローニングし、Hisタグ付き不溶性タンパク質として大腸菌(BL21 Star DE3)で過剰発現させる。発現は1mMのIPTGの添加によって誘発し、37℃で4時間持続させる。遠心により細胞を収集し、細胞ペレットの超音波処理により溶解する。遠心により封入体を単離する。1%のトリトンX100(Sigma-Aldrich)による洗浄工程の後、7.5Mの塩酸グアニジンを用いてタンパク質を可溶化し、さらに尿素濃度が6Mから0Mまで低下する緩衝液を用い一晩の連続的透析ラウンドによって再折り畳みを実施する。MonoQ5/50GL(Amersham BioSciences)カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーとそれに続くSuperdex75 10/300 GLカラム(Amersheim BioSciences)によるゲルろ過によって再折り畳みタンパク質を精製する。このタンパク質の純度および均質性はSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって確認する。さらにまた、VEGFR1、VEGFR2 およびベバシズマブ(Bevacizumab)との結合活性をELISAによってモニターする。この目的のために、1μg/mLの組換えヒトVEGF109を96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)に4℃で一晩固定する。ウェルをカゼイン溶液(1%)でブロッキングする。VEGFR1、VEGFR2 およびベバシズマブの連続希釈をVEGF109被覆プレートに添加し、アルカリ性ホスファターゼ連結ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)(Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)を用い、続いて基質PNPP(p-ニトロフェニルホスフェート)(Sigma-Aldrich)の存在下での酵素反応によって結合を検出する。VEGF109はVEGFR1、VEGFR2 およびベバシズマブと結合でき、精製されたVEGF109は活性を有することが示された。
海水養殖キーホールリンペットのヘモシアニン(mcKLH)とともにImject Immunogen EDCキット(Pierce, Rockford, IL, USA)を製造業者の指示に従って用いて、組換えヒトVEGF165(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)をmcKLHと連結する。前記ポリペプチドとmcKLHとの有効な連結はSDS-PAGEによって確認する。この連結タンパク質の機能性はELISAによってチェックする。すなわち、2μg/mLのKLH連結VEGF165を96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)に4℃で一晩固定する。ウェルをカゼイン溶液(1%)でブロッキングする。VEGFR1またはVEGFR2の連続希釈を添加し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ連結ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)(Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)を用い、続いて基質TMB(3,3’,5,5’テトラメンチルベンジジン)(Pierce, Rockford, IL, USA)の存在下での酵素反応によって結合を検出する。KLH連結タンパク質はVEGFR1、VEGFR2 およびベヴァシズマブとなお相互作用することができ、VEGF165上の対応するエピトープになお接近可能なことが確認された。
1.1 免疫
獣医学部(University Ghent, Belgium)倫理委員会の承認後、4頭のラマ(No. 208, 209, 230, 231と称する)に組換えヒトDll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)を6回の筋肉内注射(1週間間隔で100または50μg/用量)により免疫する。Dll4抗原はStimune(Cedi Diagnostics BV, Lelystad, The Netherlands)で処方される。さらに別の3頭のラマ(No. 127b, 260, 261と称する)を、標準的なプロトコルにしたがい、ヒトDll4およびマウスDll4過剰発現CHO細胞(上記のように樹立)を4回交互に皮下注射して免疫する。細胞はD-PBSに再懸濁し、注射前に氷上で維持する。さらにまた、別の3頭のラマ(No. 282, 283, 284と称する)を、標準的なプロトコルにしたがい、組換えヒトDll4およびマウスDll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)を4回交互に筋肉内注射(2週間間隔で100または50μg/用量)して免疫する。ヒトDll4による0日目の第1回の注射はフロイントの完全アジュバント(Difco, Detroit, MI, USA)で処方し、一方その後のヒトおよびマウスDll4による注射はフロイントの不完全アジュバント(Difco, Detroit, MI, USA)で処方される。
1.2 ラマで誘発された免疫応答の評価
ヒトDll4に対する免疫応答の動物での誘発をELISAにより評価するために、ラマ208、209、230および231から0日目(免疫前)、21日目および43日目(末梢血リンパ球(PBL)収集時)に、ラマ127b、260および261から0日目および51日目に、さらにラマ282、283および284から0日目、28日目および50日目に血清を収集する。略記すれば、2μg/mLの組換えヒトDll4またはマウスDll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)を4℃で一晩96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)に固定する。ウェルをカゼイン溶液(1%)でブロッキングする。血清希釈物を添加した後、特異的に結合する免疫グロブリンを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ラマ免疫グロブリン(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)およびそれに続く基質TMB(3,3’,5,5’-テトラメンチルベンジジン)(Pierce, Rockford, IL, USA)の存在下での酵素反応を用いて検出する(前記酵素反応はDll4に対する有意な抗体依存免疫反応が誘発されることを示す)。特異的に結合する免疫グロブリンは、通常のラマIgG1抗体または重鎖のみのラマIgG2もしくはIgG3抗体を特異的に認識する抗体により検出され得るので、抗体応答は、通常の抗体および重鎖のみの抗体発現B細胞レパートリーの両方によって生じる(表2-A)。マウスDll4を注射された全てのラマで、抗体応答は、通常抗体および重鎖のみの抗体発現B細胞によってマウスDll4に対して特異的に生じる。さらにまた、ヒトおよびマウスDll4過剰発現HEK293細胞でのFACS解析によって、細胞で免疫した動物の血清力価が確認される(表2-B)。各ラマのDll4血清力価応答は表2に示されている。
最後の免疫原注射に続いて、重鎖抗体を産生するB細胞の供給源として免疫組織を免疫ラマから収集する。典型的には、2つの150mL血液サンプル(最後の抗原注射から4日後および8日後に収集)、1つのリンパ節生検材料(最後の抗原注射から4日後に収集)を各動物につき収集する。前記血液サンプルから、Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)を製造業者の指示に従って用いて末梢血単核球(PBMC)を調製する。PBMCおよびリンパ節生検材料から全RNAを抽出し、前記をRT-PCRのための出発材料として用い、WO 05/044858に記載されているようにVHHコードDNAセグメントを増幅する。各免疫ラマについて、当該動物の全収集免疫組織から単離した全RNAをプールすることによってライブラリーを構築する。略記すれば、VHHライブラリーのファージディスプレーを促進するように設計したベクターで、PCR増幅VHHレパートリーを固有の制限部位を介してクローニングする。前記ベクターはpUC119から誘導され、LacZプロモーター、M13ファージgIIIタンパク質コード配列、アンピシリンまたはカルベニシリン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびハイブリッドgIII-pelBリーダー配列を含んでいる(pAX050)。VHHコード配列に関してインフレームで、前記ベクターはC末端c-mycタグおよびHis6タグをコードする。標準的プロトコルにしたがってファージを調製し、ろ過滅菌後4℃で更なる使用のために保存する。
全てのラマから入手しファージライブラリーとしてクローニングしたVHHレパートリーを、多数の選別条件を適用しながら種々の選別手段で用いる。可変事項には以下が含まれる:i)Dll4タンパク質フォーマット(ヒトDll4(Met1-Pro524)およびマウスDll4(Met1-Pro525)(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)のC末端Hisタグ付き組換え発現細胞外ドメイン、またはDll4過剰発現CHOまたはHEK293細胞上に存在する完全長ヒトDll4およびマウスDll4)、ii)抗原提示方法(Dll4を直接被覆したプレートまたはビオチンタグを介してDll4を被覆したニュートラビジン(Neutravidin)プレート;液相:溶液中でのインキュベーション後にニュートラビジン被覆プレート上で捕捉)、iii)抗原濃度、iv)種々の溶出方法(トリプシンによる非特異的方法または同族レセプターNotch1/Fcキメラまたは抗Dll4 IgG/Fabによる特異的方法)。全ての選別をMaxisorp 96-ウェルプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)で実施する。
選別は以下のように実施する:固相および液相選別フォーマット用Dll4抗原調製物を多数の濃度で上記のように提示する。2時間ファージライブラリーとインキュベートし、続いて十分に洗浄した後、結合ファージをトリプシン(1mg/mL)で30分間溶出させる。ファージ溶出にトリプシンを用いる場合、0.8mMのプロテアーゼ阻害剤ABSFを適用してプロテアーゼ活性を直ちに中和する。コントロールとして抗原不使用選別を並行して実施する。バックグラウンド(無抗原コントロール)を超える濃縮を示すファージアウトプットを大腸菌感染に用いる。感染大腸菌は、次の選別ラウンド(ファージレスキュー)用ファージの調製に用いるか、または個々のVHHクローンの解析のために寒天プレート(LB+amp+グルコース2%)にプレートする。選別アウトプットを特異的結合物についてスクリーニングするために、単一コロニーを寒天プレートから採取し、1mLの96-深ウェルプレートで増殖させる。グルコースの非存在下でIPTG(最終濃度0.1−1mM)を添加することによって、LacZ制御VHH発現を誘発する。標準的プロトコルにしたがってペリプラズム抽出物(約80μLの体積)を調製する。
ヒトDll4/ヒトNotch1アルファスクリーン(AlphaScreen)アッセイでペリプラズム抽出物をスクリーニングし、発現されたVHHの遮断能力を評価する。ビオチン(Sigma, St Louis, MO, USA)およびビオチンアミドヘキサン酸3-スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルのナトリウム塩(Sigma, St Louis, MO, USA)を用いてヒトDll4をビオチン化する。Notch1/Fcキメラ(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)を抗Fc VHH(製造業者(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)の指示に従いアクセプタービーズと連結されている)を用いて捕捉する。VHHの中和能力を評価するために、ペリプラズム抽出物の希釈系列をビオチン化ヒトDll4とプレインキュベートする。この混合物に、アクセプタービーズおよびストレプトアビジンドナービーズを添加し、さらに1時間室温でインキュベートする。励起波長680nmおよび発光波長520nmを用いエンビジョンマルチラベルプレートリーダー(Envision Multilabel Plate reader, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)でプレートを読み取り蛍光を測定する。蛍光シグナルの減少は、ビオチン化ヒトDll4とヒトNotch1/Fcレセプターとの結合がペリプラズマ抽出物中の発現VHHによって遮断されたことを示す。
また別には、CHO-hDll4およびCHO-mDll4細胞をヒトNotch1/Fc FMAT(蛍光測定微小体積アッセイ技術(Fluorometric Microvolume Assay Technology))競合アッセイで用いる。組換えヒトNotch1/Fcキメラ(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)をランダムにAlexa-647(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)で標識する。略記すれば、5μLのペリプラズム材料を100pMまたは175pMの標識ヒトNotch1/Fcにそれぞれ7,500のCHO-hDll4またはCHOmDll4過剰発現細胞とともに添加し、2時間インキュベートした後で読み取りを実施する。無競合のベースラインを設定するために、ヒトNotch1/Fc〜Alexa647を有する細胞の少なくとも30組が含まれ、このベースラインから阻害パーセンテージを算出する。全ての計算はFL1_全シグナルを基準にする(前記はウェル当たりの蛍光の平均xウェル当たりのカウント数を含む)。
このスクリーニングから阻害性VHHを選別し配列を決定する。配列の解析によって、異なる40のB細胞系列に属する166の固有のVHHが明らかになった。各B細胞系列について見出された変種の総数は表3に示されている。ペリプラズムのスクリーニングデータの概覧は表4に提供されている。更なる性状決定のために選択した固有のVHHのアミノ酸配列は、配列リスト(配列番号:4−20)および表5(CDRおよびフレームワーク領域が指示されている)に示されている。
実施例4で述べたスクリーニングから選別した阻害性抗Dll4 VHHをさらに精製し、性状を決定する。選別したVHHを大腸菌TG1でc-myc、His6タグ付きタンパク質として発現させる。発現は1mMのIPTGの添加により誘発し、37℃で4時間持続させる。細胞培養の遠心後、ペレットの凍結溶解によりペリプラズム抽出物を調製する。これらの抽出物を出発材料として用い、VHHをIMACおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製し、SDS-PAGEで判定したとき純度95%が得られる。
5.1 ELISAによるDll4遮断VHHの評価
VHHの遮断能力をヒトDll4-ヒトNotch1/Fc遮断ELISAで評価する。略記すれば、1μg/mLのヒトNotch1/Fcキメラ(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を被覆する。15nMの固定濃度のビオチン化ヒトDll4を一連のVHH希釈物と1時間プレインキュベートし、その後この混合物を被覆Notch1レセプターとともにさらに1時間インキュベートする。ビオチン化ヒトDll4の残留結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)連結エキストラビジン(Sigma, St. Louis, MO, USA)を用いて検出する(図3)。ヒトDll4は上記に記載したようにビオチン化する。ヒトDll4-ヒトNotch1/Fc相互作用を遮断するVHHのIC50値は表6に示されている。
表6:hDLL4/hNotch1-Fc競合ELISAでのVHHのIC50値(nM)
略記すれば、1nMのビオチン化ヒトDll4をストレプトアビジン被覆ドナービーズ(20μg/mL)上で捕捉し、一方0.4nMのレセプターヒトNotch1(Fc融合タンパク質として)を抗ヒトFc VHH被覆アクセプタービーズ(20μg/mL)上で捕捉する。両方の装荷ビーズを一連の希釈の競合VHHとともにインキュベートする(図4)。ヒトDll4-ヒトNotch1/Fc相互作用を遮断するVHHのIC50値は表7に示されている。
表7:hDLL4/hNotch1競合アルファスクリーンでのVHHのIC50値(nM)
VHHの遮断能力を、実施例4で概略したようにヒトおよびマウスDll4-ヒトNotch1/Fc競合FMATアッセイで評価する(図5)。ヒトNotch1/FcとCHO細胞発現ヒトまたはマウスDll4との相互作用を遮断するVHHのIC50値は表8に示されている。
表8:ヒトNotch1/FcとCHO細胞で発現されたヒトまたはマウスDLL4との相互作用を遮断する精製VHHの(平均)IC50値(nM)
選別したVHHの能力を評価するために、Dll4による刺激時のNotch1のγ-セクレターゼ媒介切断およびNotch1細胞内ドメイン(NICD)の遊離を基にしたレポーターアッセイを準備する。pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]レポータープラスミドとともにNotch1-GAL4/VP16構築物でHEK細胞を同時トランスフェクトして、融合タンパク質の一過性発現を得る。これらの一過性にトランスフェクトした細胞をHEK293-hDll4安定細胞株とともに同時培養することによって24時間刺激する。トランスフェクションから48時間後に読み取りを実施する。同時培養の開始前にVHHを1時間HEK293-hDll4細胞とプレインキュベートし、さらに同時培養中にもVHHを加える(図6)。Notch1のDll4媒介切断およびその後のNICDのレセプター細胞の核への移転を遮断するVHHのIC50値は表9に示されている。
例えばベンチマーク抗体が結合するときにVHHが同時にDll4に結合できるか否かを決定するために、エピトープビンニング実験を実施する(Biacore T100装置を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)による)。抗Dll4 FabフラグメントをCM5センサーチップの参照および活動フローセルに不可逆的に固定する。各サンプル(周期)に対して、ヒトDll4を活動および参照フローセルに注入し、抗Dll4 Fabによって可逆的に捕捉する。追加されたVHHの結合を固定された表面上の注入によって評価する。全てのVHHおよび抗Dll4 Fabは、表面接触時間120秒、流速10μL/分、100nMで注入される。表面は10mMグリシン(pH1.5)を用いて再生する。処理曲線はBiacore T100評価ソフトにより評価する。表10-Aは解析したVHHおよびコントロールの連続的注入/再生経路を示す。VHH DLLBII56A09(配列番号:15)、DLLBII96C03(配列番号:19)、DLLBII101G08(配列番号:10)およびDLLBII115A05(配列番号:112)は、Dll4 Fabによって捕捉されたヒトDll4と新たに結合しないことを示している。Dll4 Fabの注入もまたヒトDll4との更なる結合をもたらさず、全てのエピトープが飽和していることを示唆する。したがって、これらのVHHは、ヒトDll4と結合するDll4 Fabとオーバーラップするエピトープを認識すると結論できる。ヒト専用VHH DLLBII6B11(配列番号:5)およびDLLBII104G01(配列番号:11)は、Dll4 Fab捕捉ヒトDll4と更なる結合を示し、ヒトDll4に特異的なこれらのVHHは、ヒト/マウス交差反応性VHHとは異なるエピトープを認識することを示唆する。
VHHとこれらのDll4変異体との結合をBiacoreで評価する。略記すれば、VHH DLLBII101G08(配列番号:10)およびDLLBII115A5(配列番号:12)でCM4センサーチップを被覆し、200nMの各欠失変異体をチップに注入する。結合を定量的に判定する。DLLBII56A09(配列番号:15)、DLLBII101G08(配列番号:10)およびDLLBII115A05(配列番号:12)の結合は、それぞれヒトおよびマウスDll4変異体hDll4.1およびmDll4.8(EGF様2ドメインを欠く)に対しては観察されない(図10-B)。hDll4/Dll4 IgG競合ELISAを用いた間接的証拠によれば前記の観察は既に指摘されていた。略記すれば、1μg/mLの Dll4 IgGで96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を被覆する。6nMの固定濃度のビオチン化ヒトDll4を一連の希釈のVHHと1時間プレインキュベートし、その後、前記混合物を前記被覆IgG上でさらに1時間インキュベートする。ビオチン化ヒトDll4の残留結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ連結エキストラビジン(Sigma, St. Louis, MO, USA)を用いて検出する(データは示されていない)。ヒトDll4は上記に記載したようにビオチン化する。モノクローナル抗Dll4 IgG(Genentech, US 2008/0014196A1)がDll4のEGF様2ドメイン内のエピトープと結合することは、特許文献から公知である。
Dll4-VHH相互作用の親和性を決定するための動力学的解析をBiacore T100装置により表面プラズモン共鳴(SPR)によって実施する。組換えヒトDll4をEDCおよびNHSを用いるアミンカップリングによってCM5チップに固定するか、またはビオチン化ヒトDll4をSAチップ(ストレプトアビジン表面)で捕捉する。精製VHHまたはFabフラグメントを種々の濃度(10から300nM)で2分間注入し、流速45μL/分で20分間解離させる。サンプル注入の間、10mMグリシン(pH1.5)および100mM HClにより表面を再生させる。HBS-N(Hepes緩衝液、pH7.4)を作動緩衝液として用いる。可能な場合には、結合曲線に1:1相互作用モデル(Langmuir結合)を合致させることによってデータを評価する。得られた結合および解離速度定数(ka)および(kd)から親和性定数KDを計算する。抗Dll4 VHHの親和性は表11に示されている。
マウスDll4との交差反応性を決定するために、結合ELISAを実施する。略記すれば、組換えマウスDll4(R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)で96ウェルMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を1μg/mL、4℃で一晩被覆する。ウェルをカゼイン溶液(PBSで1%)でブロッキングする。連続希釈としてVHHを適用し、マウス抗myc(Roche)および抗マウスAP連結物(Sigma, St Louis, MO, USA)を用いて結合を検出する(図7)。参照として、ヒトDll4との結合を測定する。EC50値は表12に要約されている。
表12:組換えヒトDLL4およびマウスDLL4結合ELISAでのVHHのEC50値(nM)
同種リガンドヒトDLL1およびヒトJagged-1との結合が存在しないことは固相結合アッセイ(ELISA)で判定する。略記すれば、ヒトDLL1(Alexis, San Diego, CA, USA)およびヒトJagged-1(Alexis, San Diego, CA, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を1μg/mL、4℃で一晩被覆する。ウェルをカゼイン溶液(PBSで1%)でブロッキングする。連続希釈としてVHHを適用し、マウス抗myc(Roche)および抗マウスAP連結物(Sigma, St Louis, MO, USA)を用いて結合を検出する。全ての抗Dll4 VHHは、これらの同種リガンドに対して交差反応性でないと考えられる(図8)。
選別VHHの能力をRidgwayらが記載した増殖アッセイの改変形で評価する(Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7)。略記すれば、96ウェルの組織培養プレートを被覆緩衝液(PBS、0.1%BSA)中の精製Dll4-His(RnD Systems;C末端Hisタグ付きヒトDll4、アミノ酸27-524、0.75ml/ウェル、10 ng/ml)で被覆する。ウェルをPBSで洗浄した後、4000 HUVE細胞/ウェルで4組ずつ播種する。4日目に細胞増殖を[3H]-チミジンの取り込みによって測定する。図15に示した結果は、DLL4 VHHのDLLBII101G08、DLLBII104G01、DLLBII115A05、DLLBII56A09およびDLL4 Fabは、HUVEC増殖におけるDLL4依存作用を用量依存態様で阻害することを明示している。IC50値は表13に要約されている。試験したVHHは、DLL4依存作用の完全な阻害を10μMで達成する。
VHH DLLBII101G08およびDLLBII115A05を2サイクルの親和性増進に付す。
最初のサイクルでは、アミノ酸置換は、変異性PCR方法を用いてフレームワーク(FW)および相補性決定領域(CDR)の両方にランダムに導入される。変異導入は、2ラウンドのPCR系アプローチ(Stratagene(La Jolla, CA, USA)から入手されるGenemorph II ランダム変異導入キット)で実施される。前記アプローチでは、1ngのDLLBII101G08またはDLLBII115A05 cDNA鋳型が用いられ、続いて2回目の変異性PCRが0.1ng の1回目の生成物を用いて実施される。精錬工程の後で、PCR生成物をVHHライブラリーのファージディスプレーを促進するように設計したベクターに固有の制限部位を介して挿入する。ビオチン化組換えヒトDLL4(biot-rhDLL4)の濃度下降およびトリプシン溶出を用いて溶液中での連続選別ラウンドを実施する。コールドのrhDLL4(biot-rhDLL4よりも少なくとも100x過剰)を用いた第3ラウンドの親和性駆動選別もまた実施する。ネズミDLL4についての選別は、交差反応性(の保存)をスクリーニングレベルで評価するので組み入れない。個々の変異体は、pUC119由来の発現ベクターを用いて組換えタンパク質として生成される。前記ベクターはLacZプロモーター、アンピシリン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびompAリーダー配列を含む(pAX50)。大腸菌TG1細胞を前記発現ベクターライブラリーで形質転換し、寒天プレート(LB+Amp+2%グルコース)にプレートする。寒天プレートから単一コロニーを採取し、1mL 96深ウェルプレートで増殖させる。VHH発現をIPTG(1mM)の添加により誘発する。標準的方法にしたがってペリプラズム抽出物(体積約80μL)を調製し、ProteOn(BioRad, Hercules, CA, USA)オフレートアッセイで組換えヒトおよびマウスDll4との結合についてスクリーニングする。略記すれば、GLC ProteOnセンサーチップの“リガンドチャネル”L2およびL4を組み換えヒトDll4で被覆し(L1/L3は参照チャネル)、一方、“リガンドチャネル”L3およびL6はマウスDll4で被覆する。親和性増進クローンのペリプラズム抽出物を1/10に希釈し、“分析物チャネル”A1−A6に注入する。プレートに存在する野生型クローンの平均オフレートを計算し、オフレート改善の計算の参照として供する。
第二のサイクルでは、最初のサイクルで同定した感受性を有する位置を同時ランダム化することによってコンビナトリアルライブラリーを作製する。このために、完全長DLLBII101G8またはDLLBII115A05 cDNAを、前記同時ランダム化位置において縮退オリゴヌクレオチド(NNS)を用いるオーバーラップPCRによって合成し、さらにレスキューPCRを実施する。上記(実施例2)に記載したように、特異的制限部位を用いて前記ランダム化VHH遺伝子をファージディスプレーベクター(pAX50)に挿入する。個々のVHHクローンのペリプラズム抽出物の調製は以前に記載したように実施する。
ProteOnオフレートアッセイでの組換えヒトDll4との結合についてのスクリーニングによって、38倍まで(DLLBII101G08)および11倍まで(DLLBII115A05)オフレートが改善されたクローンが同定される(表15)。
表16:101G08の親和性増進変種
VHH DLLBII101G08およびDLLBII115A05の親和性増進変種を上記(実施例5)に記載したように発現させ精製する。VHHの性状を、hDll4-hNotch1競合ELISA(実施例5.1;表17;図10)、CHO-hDll4/hNotch1-FcおよびCHO-mDll4/hNotch1-Fc競合FMAT(実施例5.3;表18;図11)、hDLL1およびhJAG1結合ELISAおよびhDll4/mDll4/cynoDll4 FACS(実施例5.8;表19;図13および14、表20)、BiacoreでのhDLL4およびmDLL4に対する結合親和性(実施例5.7;表19、図12)およびDLL4-媒介レセプターアッセイ(実施例5.4;表21;図16)で調べる。
性状決定のデータは表22に要約されている。全般的に、親和性増進VHHは親和性および効力に置いて明瞭な改善を示し、一方、それらとmDll4およびcynoDll4との結合は維持され、hDLL1またはhJAG1との結合は観察されない。
ヒト生殖細胞系列VH3/JHのコンセンサス配列に対してDLLBII129B05(図17-A)およびDLLBII136C07(図17-B)のアミノ酸配列のアラインメントを実施する。残基にはKabatにしたがって番号を付与し、CDRはAbMの定義にしたがって灰色で示されている(Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフト)。
それらのヒト対応物へと変異させるべき残基には下線が付されている。
前記アラインメントは、DLLBII129B05が参照生殖細胞系列の配列と比較して4つのフレームワーク変異を含むことを示している。14、64、83および108位の非ヒト残基がヒト生殖細胞系列の対応物による置換のために選択される。これらの位置に種々の組合せのヒト残基を有する2つのDLLBII129B05変種のセット(DLLBII017およびDLLBII018)を構築し、これを生成する(実施例6;アミノ酸配列は表23に列挙)。
DLLBII136C07については、VHHは参照の生殖細胞系列配列に対して4つのフレームワーク変異を含んでいる。39、40、83および108位の非ヒト残基がヒト生殖細胞系列の対応物による置換のために選択される。これらの位置に種々のヒト残基の組合せを有する4つのDLLBII136C07変種のセット(DLLBII019、DLLBII020、DLLBII021、DLLBII022)を作製する(実施例6;アミノ酸配列は表24に示す)。並行して、N52-S52a位の潜在的なAsn脱アミド化部位(CDR2領域、図17-Bの枠で囲んだ残基)をN52S変異の導入によって除去する。第二のサイクルでは、ヒト化の結果に耐え得る変異およびN52S置換を組み合せて、配列最適化変種DLLBII036が得られる。CDR1にF29I変異を含むさらに別の配列最適化変種(DLLBII039)を構築し、前記はDLL4媒介レポーターアッセイでDLLBII136C07の能力を強化することが示された(表21;図16)。DLLBII136C07の両配列最適化変種の配列は表25に示されている。
これら変種の全てについて、精製タンパク質としてCHO-hDLL4/hNotch1-FcおよびCHO-mDLL4/hNotch1-Fc 競合FMATアッセイ(実施例5.3;表26;図18)、DLL4媒介レポーターアッセイ(実施例5.4;表27;図19)、DLL4 HUVEC増殖アッセイ(実施例5.9;表28)および親和性測定Biacore(実施例5.7;表29)で性状を調べる。さらにまた、各クローンの融解温度(Tm)を温度シフトアッセイで決定する(前記はシプロオレンジ(Sypro Orange, Invitrogen)の取り込み時の蛍光シグナルの増加を基準にする(Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), pp289-298))。全ての変種が、親DLLBII129B05と比較したとき同様なTm値を示す。表30はこれらのクローンのpH7におけるTm値の要約である。
9.1 免疫
獣医学部(University Ghent, Belgium)倫理委員会の承認後、4頭のラマ(No. 264、265、266、267と称する)を標準的プロトコルにしたがって組換えヒトVEGF10で6回の筋肉内注射(1週間間隔で100または50μg/用量)により免疫する。0日目の第1回の注射はフロイントの完全アジュバント(Difco, Detroit, MI, USA)で処方するが、その後の注射はフロイントの不完全アジュバント(Difco, Detroit, MI, USA)で処方する。さらにまた4頭のラマ(No. 234、235、280および281と称する)を以下のプロトコルにしたがって免疫する:KLH-連結ヒトVEGH165による5回の筋肉内注射(2週間間隔で100または50μg/用量)、続いてヒトVEGF109の4回の筋肉内注射(第1回の用量は100μg、2週間後に50μg/用量を1週間間隔で3回)。
9.2 ラマのVEGF誘発免疫応答の評価
VEGF特異的血清力価をモニターするために、ELISAアッセイを準備する。このアッセイでは、組換えヒトVEGF165またはVEGF109の2μg/mLを、96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)に4℃で一晩固定する。ウェルをカゼイン溶液(1%)でブロッキングする。血清希釈物を添加後、結合した全IgGを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)連結ヤギ抗ラマ免疫グロブリン(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)および前記に続く基質TMB(3,3’,5,5’-テトラメンチルベンジジン)(Pierce, Rockford, IL, USA)存在下での酵素反応を用いて検出する。ラマ264、265、266および267については、さらに追加のELISAを実施する。このELISAでは、VEGF165およびVEGF109に対するアイソタイプ特異的応答が評価される。アイソタイプ特異的応答は、通常のラマIgG1並びに重鎖のみのラマIgG2およびIgG3(Daley et al. (2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386)を特異的に認識するマウスmAbとその後のウサギ抗マウスHRP連結物(DAKO)を用いて検出する。ELISAではTMBを色素原基質として用いて発光させ、吸収を450nmで測定する。各ラマの血清力価は表31に記載されている。
重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニングおよびファージの調製は実施例2に記載したように実施する。VHHファージライブラリーを多様な選別条件をを適用する種々の選別手法で用いる。可変事項には以下が含まれる:i)VEGFタンパク質フォーマット(rhVEGF165、rhVEGF109またはrmVEGF164)、ii)抗原提示方法(固相:直接被覆またはニュートラビジン被覆プレートにビオチンタグを介して;液相:溶液中でのインキュベーションに続いてニュートラビジン被覆プレート上で捕捉)、iii)抗原濃度、iv)溶出方法(トリプシンまたはVEGFR2を用いる競合的溶出)。全ての選別をMaxisorp 96-ウェルプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)で実施する。
選別は以下のように実施する:溶液中のまたは固相上に固定した多様な濃度のVEGF抗原とともにRTでファージライブラリーをインキュベートする。2時間インキュベートし、十分に洗浄した後、結合ファージを溶出させる。トリプシンをファージ溶出に用いる場合は、0.8mMのプロテアーゼ阻害剤ABSFの添加によりプロテアーゼ活性を直ちに中和する。バックグラウンドを超える濃縮を示すファージアウトプットを大腸菌感染に用いる。感染大腸菌は、次の選別ラウンド(ファージレスキュー)用ファージの調製に用いるか、または個々のVHHクローンの解析のために寒天プレート(LB+amp+グルコース2%)にプレートする。選別アウトプットを特異的結合物についてスクリーニングするために、単一コロニーを寒天プレートから採取し、1mLの96-深ウェルプレートで増殖させる。IPTG(最終濃度0.1−1mM)を添加することによって、LacZ制御VHH発現を誘発する。標準的方法にしたがってペリプラズム抽出物(約80μLの体積)を調製する。
ヒトVEGF165との結合についてペリプラズム抽出物をELISAによって試験する。略記すれば、2μg/mLの組換えヒトVEGF165を一晩4℃で96ウェルのMaxiSorp プレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)に固定する。ウェルをカゼイン溶液(1%)でブロッキングする。典型的には10倍希釈のペリプラズム抽出物を添加した後、マウス抗myc(Roche)および抗マウス-HRP連結物(DAKO)を用いて VHH結合を検出する。バックグラウンドに対して3倍より高いELISAシグナルを示すクローンをVEGF結合VHHとみなす。
さらにまた、ヒトVEGF165/ヒトVEGFR2アルファスクリーン(AlphaScreen)アッセイでペリプラズム抽出物をスクリーニングし、VHHの遮断能力を評価する。スルホ-NHS-LC-ビオチン(Pierce, Rockford, IL, USA)を用いて、ヒトVEGF165をビオチン化する。ヒトVEGFR2/Fcキメラ(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)は、抗ヒトFc VHH(製造業者(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)の指示に従いアクセプタービーズと結合されている)を用いて捕捉する。VHHの中和能力を判定するために、0.03% Tween 20(Sigma-Aldrich)含有PBS緩衝液でペリプラズム抽出物を1/25に希釈し、0.4 nMのビオチン化ヒトVEGF165とともに15分間室温(RT)でプレインキュベートする。この混合物に、アクセプタービーズ(10μg/mL)および0.4 nMのVEGFR2-huFcを添加し、さらに1時間暗所にてRTでインキュベートする。続いてドナービーズ(10μg/mL)を添加し、その後暗所にて1時間RTでインキュベートする。励起波長680nmおよび520nmから620nmの発光波長を用いエンビジョンマルチラベルプレートリーダー(Envision Multilabel Plate reader, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)でプレートを読み取り蛍光を測定する。無関係のVHHを含むペリプラズム抽出物を陰性コントロールとして用いる。陰性コントロールのシグナルと比較して60%を超える蛍光シグナルの低下をもたらすことができる抗VEGF165 VHHを含むペリプラズマ抽出物をヒットと同定する。アルファスクリーンで同定された全てのヒットを強豪ELISAで確認する。この目的のために、1μg/mLのヒトVEGFR2キメラ(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を被覆する。5倍希釈のペリプラズム抽出物をPBS(0.1%カゼインおよび0.05%のTween 20(Sigma-Aldrich)を含む)中の固定濃度(4nM)のビオチン化ヒトVEGF165の存在下でインキュベートする。これらのVHH/bio-VEGF165複合体とヒトVEGFR2キメラ被覆プレートとの結合は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)連結エキストラビジン(Sigma, St. Louis, MO, USA)を用いて検出する。更なる性状決定のために選別した阻害性(レセプター遮断)VHHおよびVEGF結合(非レセプター遮断)VHHのVHH配列番号および対応するアミノ酸配列は、表32および表33にそれぞれ示されている。
以下の3つの阻害性抗VEGF VHHを精製タンパク質として更なる性状決定のために選択する:VEGFBII23B04、VEGFBII24C04およびVEGFBII23A06。これらのVHHをc-myc、His6タグ付きタンパク質として大腸菌TG1で発現させる。発現は1mMのIPTGの添加により誘発し、37℃で4時間持続させる。細胞培養を遠心後、ペリプラズム抽出物をペレットの凍結融解によって調製する。これらの抽出物をIMACおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるVHH精製のための出発材料として用いる。最終的VHH調製物はSDS-PAGEにより判定したとき95%の純度を示す。
12.1 ヒトVEGF165/ヒトVEGFR2-Fc遮断ELISAでのヒトVEGF165/VEGFR2遮断VHHの評価
VHHの遮断能力をヒトVEGF165/ヒトVEGFR2-Fc遮断ELISAで評価する。略記すれば、1μg/mLのVEGFR2-Fcキメラ(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を被覆する。PBS緩衝液(0.1%カゼインおよび0.05%のTween 20(Sigma)を含む)中の精製VHHの一連の希釈(1mMから64pMの濃度範囲)を4nMのビオチン化VEGF165の存在下でインキュベートする。Bio-VEGF165とVEGFR2との残留結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)連結エキストラビジン(Sigma, St. Louis, MO, USA)および基質としてTMBを用いて検出する。コントロールとしてベヴァシズマブ(Avastin(商標))およびラニビズマブ(Ranibizumab(Lucentis(商標))を一緒に使用する。用量阻害曲線は図20に示され、対応するIC50値および%阻害は表35に要約されている。
VHHはまたヒトVEGF165/ヒトVEGFR1-Fc遮断ELISAで評価される。略記すれば、2μg/mLのVEGFR1-Fcキメラ(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を被覆する。PBS緩衝液(0.1%カゼインおよび0.05%のTween 20(Sigma)を含む)中の精製VHHの一連の希釈(1mMから64pMの濃度範囲)を0.5nMのビオチン化VEGF165の存在下でインキュベートする。Bio-VEGF165とVEGFR1との残留結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)連結エキストラビジン(Sigma, St. Louis, MO, USA)および基質としてTMBを用いて検出する。コントロールとしてベヴァシズマブ、ラニビズマブおよび無関係のVHH(2E6)を一緒に使用する。用量阻害曲線は図21に示され、対応するIC50値および%阻害は表36に要約されている。
VHHの遮断能力はまたヒトVEGF165/ヒトVEGFR2-Fc遮断アルファスクリーンで評価される。略記すれば、0.03%のTween 20(Sigma)を含むPBS緩衝液中の精製VHHの一連の希釈(濃度範囲:200nMから0.7pM)を4pMのbio-VEGF165に添加し15分間インキュベートする。続いて、VEGFR2-Fc(0.4nM)および抗Fc VHH被覆アクセプタービーズ(20μg/mL)を添加し、この混合物を暗所で1時間インキュベートする。最後にストレプトアビジンドナービーズ(20μg/mL)を加え、暗所で1時間インキュベートした後、蛍光をエンビジョンマイクロプレートリーダーで測定する。用量応答曲線は図22に示される。ヒトVEGF165-ヒトVEGFR2-Fc相互作用を遮断するVHHのIC50値は表37に要約されている。
VHHの遮断能力はまたヒトVEGF165/ヒトVEGFR1-Fc遮断アルファスクリーンで評価される。略記すれば、0.03%のTween 20(Sigma)を含むPBS緩衝液中の精製VHHの一連の希釈(濃度範囲:500nMから1.8pM)を0.4nMのbio-VEGF165に添加し15分間インキュベートする。続いて、VEGFR1-Fc(1nM)および抗Fc VHH被覆アクセプタービーズ(20μg/mL)を添加し、この混合物を暗所で1時間インキュベートする。最後にストレプトアビジンドナービーズ(20μg/mL)を加え暗所で1時間インキュベートした後、蛍光をエンビジョンマイクロプレートリーダーで測定する。用量応答曲線は図23に示される。ヒトVEGF165-ヒトVEGFR1-Fc相互作用を遮断するVHHのIC50値および%阻害は表38に要約されている。
VHH VEGFBII23B4とhVEGF165との結合動態をBiacore T100装置でSPRにより解析する。組換えヒトVEGF165は、CM5チップにアミンカップリングにより直接固定する(EDCおよびNHSを用いる)。VHHは10から360nMの間の種々の濃度で解析する。サンプルを2分間注入し、45μL/分の流速で20分まで解離させる。サンプルとサンプルの間でチップ表面を100mMのHClで再生する。HBS-EP+(Hepes緩衝液(pH7.4)+EDTA)を作動緩衝液として用いる。結合曲線は、Biacore T100評価ソフトv2.0.1によって二状態反応モデルを用い合致させる。抗VEGF VHHの算出親和性は表39に示されている。
マウスVEGF164との交差反応性を結合ELISA を用いて決定する。略記すれば、組換えマウスVEGF164((R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を4℃、1μg/mLで一晩被覆する。ウェルをカゼイン溶液(PBSで1%)でブロッキングする。PBS緩衝液(0.1%カゼインおよび0.05%のTween 20(Sigma)を含む)中の一連の希釈(濃度範囲:500nM−32pM)としてVHHを適用し、マウス抗myc(Roche)および抗マウスHRP連結物(DAKO)を用い続いて基質TMB(3,3’,5,5’-テトラメンチルベンジジン)(Pierce, Rockford, IL, USA)存在下での酵素反応によって検出する(図24)。マウスVEGF164反応性mAbを陽性コントロールとして加える。参照として、ヒトVEGF165との結合もまた測定する。EC50値は表40に要約されている。
組換えヒトVEGF121との結合を固相結合ELISAにより判定する。略記すれば、組換えヒトVEGF121((R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を4℃、1μg/mLで一晩被覆する。ウェルをカゼイン溶液(PBSで1%)でブロッキングする。PBS緩衝液(0.1%カゼインおよび0.05%のTween 20(Sigma)を含む)中の一連の希釈(濃度範囲:500nM−32pM)としてVHHを適用し、マウス抗myc(Roche)および抗マウスHRP連結物(DAKO)を用い続いて基質TMB(3,3’,5,5’-テトラメンチルベンジジン)(Pierce, Rockford, IL, USA)存在下での酵素反応によって結合を検出する(図25)。陽性コントロールとして一連の希釈のVEGFR2を一緒に用いる。EC50値は表41に要約されている。
VEGFB、VEGFC、VEGFDおよびPIGFとの結合を固相結合ELISAにより判定する。略記すれば、VEGFB、VEGFC、VEGFDおよびPIGF(R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)で96ウェルのMaxiSorpプレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)を4℃、1μg/mLで一晩被覆する。ウェルをカゼイン溶液(PBSで1%)でブロッキングする。一連の希釈(濃度範囲:500nM−32pM)としてVHHを適用し、マウス抗myc(Roche)および抗マウスAP連結物(Sigma, St Louis, MO, USA)を用いて結合を検出する。陽性コントロールとして適切なレセプターの一連の希釈を一緒に用い、さらにセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)連結ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的抗体)(Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)を用い、続いて基質TMB(3,3’,5,5’-テトラメンチルベンジジン)(Pierce, Rockford, IL, USA)の存在下での酵素反応によって検出する。VHHおよびコントロールの用量応答曲線は図26に示されている。これらの結果は、選択したVHHとVEGFB、VEGFC、VEGFDまたはPIGFとの結合は検出し得ないことを示している。
どのVEGF結合物がVEGFBII23B04と類似するかまたはオーバーラップするエピトープと結合するかを調べるために、Biacore系エピトープビンニング実験を実施する。この目的のために、VEGFBII23B04をCM5センサーチップに固定する。各サンプルについて、ヒトVEGF165をチップ表面上に通し、可逆的にVEGFBII23B4によって捕捉させる。続いて、精製VHH(100nM)またはペリプラズム抽出物(1/10希釈)を240秒の表面接触時間および10μL/分の流速で注入する。サンプルとサンプルの間で表面を再生緩衝液(100mMのHCl)により再生する。処理曲線はBiacore T100評価ソフトで評価する。VHHは以下の2つのグループに分けることができる:VEGFBII23B04捕捉VEGF165との更なる結合を生じるグループ1およびVEGFBII23B04捕捉VEGF165と同時に結合できない第二のグループ(選別したVHH 24C04、23A06および23B04はこのグループである)。
同じ設定のアッセイを用いて、VEGFR1、VEGFR2、ラニビズマブおよびベヴァシズマブがヒトVEGF165にVEGFBII23B04と同時に結合できるか否かを判定する。表42は、VEGFBII23B04捕捉VEGF165との更なる結合応答を提示する。VEGFR2だけがVEGFBII23B04捕捉VEGF165と結合できず、VEGF-VEGFR2相互作用に対するVEGFBII23B04の遮断能力を強調している。さらにまた、これらのデータは、VEGFBII23B04エピトープがベヴァシズマブおよびラニビズマブエピトープと一致しないことを示している。
選択したVHHの能力を増殖アッセイで評価する。略記すれば、初代HUVEC細胞(Technoclone)を一晩サプリメント枯渇させ、続いて96ウェルの組織培養プレートに4組ずつ4000細胞/ウェルで播種する。細胞をVHHの存在下または非存在下で33ng/mLのVEGFで刺激する。4日目に[3H]チミジンの取り込みにより増殖速度を測定する。表43に示すHUVEC増殖アッセイの結果は、VEGFBII23B04およびベヴァシズマブは、VEGF誘発HUVEC増殖を1nM未満のIC50で90%を超えて阻害することを示している。
選択したVHHの能力をHUVEC Erkリン酸化アッセイで評価する。略記すれば、初代HUVEC細胞(Technoclone)を一晩血清飢餓させ、続いてVHHの存在下または非存在下で10ng/mLのVEGFで5分間刺激する。細胞をPBS中の4%ホルムアルデヒドで固定し、ホスホERK特異抗体(抗ホスホMAPキナーゼpERK1&2, M8159, Sigma)およびポリクローナルウサギ抗マウス免疫グロブリン-HRP連結物(PO161, Dako)を用いてERKリン酸化レベルを測定する。表44に示すように、VEGFBII23B4およびベヴァシズマブは、VEGF誘発Erkリン酸化を1nM未満のIC50で少なくとも90%阻害する。
VHH VEGFBII23B04をVEGFBII23B04と遺伝的に融合させるか(ホモダイマーVHHを生じる)、または異なるVEGF結合VHHと遺伝的に融合させる(ヘテロダイマー(二価)VHHを生じる)。二価VHHを作製するために、10個の固有のVEGF結合VHHの組を9または40のGly-Ser可撓性リンカーにより2つの異なる向きでVEGFBII23B04と連結させる。ホモダイマーのVEGFBII23B04(VEGFBII010)および40個のヘテロダイマー二価VHHを大腸菌TG1でc-myc、His6-タグ付きタンパク質として発現させる。発現は1mMのIPTGの添加により誘発し、37℃で4時間持続させる。細胞培養を遠心した後、ペレットの凍結融解によりペリプラズム抽出物を調製する。これらの抽出物を出発材料として用い、VHHをIMACおよび脱塩により精製し、SDS-PAGEで判定したとき純度90%が得られる。ホモダイマーVHHおよび選別二価VEGF結合VHHのアミノ酸配列は配列番号:48−53および表45に示されている。
実施例12.1、12.2、12.3および12.4にそれぞれ記載されているように、VEGFR2およびVEGFR1遮断ELISA(それぞれ図27および28、表47および48)、並びにアルファスクリーンアッセイ(図29および30、表49および50)でVHH VEGFBII10、VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBI023、VEGFBI024およびVEGFBII025を並べて比較する。
(b) Biacore T100評価ソフトv2.0.1によって二状態反応モデルを用い曲線を合致させる。
選択したフォーマットVHHの能力を増殖アッセイで評価する。略記すれば、初代HUVEC細胞(Technoclone)を一晩サプリメント枯渇させ、続いて96ウェルの組織培養プレートに4組ずつ4000細胞/ウェルで播種する。細胞をVHHの存在下または非存在下で33ng/mLのVEGFで刺激する。4日目に[3H]チミジンの取り込みにより増殖速度を測定する。表55に示す結果は、フォーマットしたVHHおよびベヴァシズマブは、VEGF誘発HUVEC増殖を1nM未満のIC50で90%を超えて阻害することを示している。
15.1 VEGFBII23B04の配列最適化
VEGFBII23B04のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列配列VH3-23(DP-47)およびJH5に対してアラインメントを実施する(図35配列番号:100を参照)。このアラインメントは、VEGFBII23B04が参照の生殖細胞系列配列と比較して19のフレームワーク変異を含むことを示している。ヒト生殖細胞系列の対応物による置換のために14、16、23、24、41、71、82、83および108位の非ヒト残基を選択する。これらの位置でヒト残基の種々の組合せを有する8つのVEGFBII23B04変種を含むセットを作製する(アミノ酸配列は表57に示されている)。D59S60位の潜在的異性化部位(CDR2領域、太字の斜字体で示されている図35を参照されたい)がS60A変異によって除去されているもう1つの別の変種が構築される。
VEGFBII5B05のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列配列VH3-23/JH5に対してアラインメントを実施する(図38および配列番号:100を参照)。このアラインメントは、VEGFBII5B05が参照の生殖細胞系列配列と比較して15のフレームワーク変異を含むことを示している。23、60、83、105、108位の非ヒト残基をそれらのヒト生殖細胞系列対応物による置換のために選択し、一方、44位のヒスチジンはグルタミンによる置換のために選択する。6つの記載変異を有する1つのヒト化変種を構築する(アミノ酸配列は表61に示されている)。
最初のサイクルでは、二重特異性VHH VEGFDLLBII001−006の作製のために構築ブロックとしてVEGFBII23B04およびDLLBII101G08を用いる。以下の2つの半減期延長方法を適用する:i)PEG化またはii)血清アルブミン結合VHHの遺伝的融合。構築ブロックを9 Gly-Ser、35 Gly-Serまたは35 Gly-Ser(15位のCys)可撓性リンカーを介して連結する。6つの全ての二重特異性VHHのフォーマットおよび配列の概覧は表66-A(リンカー配列には下線が付されている)、配列番号:68−73および図39に示されている。
一価の構築ブロックVEGFBII23B04と比較した抗VEGF遮断特性を調べるため、7つのVHH全てをVEGF/VEGFR2-Fc(実施例12.3;図44)およびVEGF/VEGFR1-Fc(実施例12.4;図45)競合アルファスクリーンで性状を決定する。これら2つの競合アッセイはまた、VHHを5μMのヒト血清アルブミンとプレインキュベートした後にも実施する。IC50値は表68-Bに要約されている。
一価の配列最適化構築ブロックVEGFBII038または二重特異性配列最適化構築ブロックVEGFBII022と比較した抗VEGF遮断特性を調べるため、7つのVHH全てをVEGF/VEGFR2-Fc(実施例12.3;図49)およびVEGF/VEGFR1-Fc(実施例12.4;図50)競合アルファスクリーンで性状決定する。これら2つの競合アッセイはまた、VHHを5μMのヒト血清アルブミンとプレインキュベートした後にも実施する。IC50値は表70-Bに要約されている。
二重特異性VHHの有効性をVEGF HUVEC Erkリン酸化アッセイで評価する。略記すれば、初代HUVEC細胞を一晩血清飢餓させ、続いてVHHの存在下または非存在下で10ng/mLのVEGFで5分間刺激する。このアッセイは、提示のとおり250nMのヒト血清アルブミンとVHHをプレインキュベートした後にも実施する。細胞をPBS中の4%ホルムアルデヒドで固定し、ホスホERK特異抗体(抗ホスホMAPキナーゼpERK1&2, M8159, Sigma)およびポリクローナルウサギ抗マウス免疫グロブリン-HRP連結物(PO161, Dako)を用いてERKリン酸化レベルをELISAにより測定する。表73に示すように、二重特異性VHHおよびベヴァシズマブは、VEGF誘発Erkリン酸化を1nM未満のIC50で90%を超えて阻害する。
表74:Dll4媒介HUVEC増殖アッセイにおける二重特異性VHHのIC50値(nM)および阻害
3つの選択VHH、VEGFDLLBII010、VEGFDLLBII013およびVEGFDLLBII015の有効性をヒト直腸癌(細胞株SW620)マウスモデルによりヌードマウスで評価する。
SW620細胞はATCC(CCL-227)から入手する。細胞を37℃、0%CO2でT175組織培養フラスコにて培養する。使用培養液は、Leibovitz’s L-15培養液(Gibco Cat. 11415)および10%ウシ胎児血清(JRH Cat. 12103-1000ml)である。培養は準コンフルエンシーで1:10または1:20の分割比で分割する。マウスは7週齢の無胸腺の雌BomTac:NMRI-Foxn1nuで、タコニック(Taconic, Denmark)から購入する。皮下腫瘍を形成させるために、SW620細胞をトリプシン処理し、洗浄し、PBS+5%FCS中に5x107/mLで再懸濁する。続いて5x106細胞を含む100μLの細胞懸濁液をマウスの右わき腹の皮下に注射する(1側/マウス)。腫瘍が十分に樹立され47から93mm3の体積に達したとき(細胞注射後10日)、マウスを処置とビヒクルコントロールとにランダムに分ける。
VHHをPBSで希釈する。
それぞれ7.5 mg/kg、2.5 mg/kgおよび15 mg/kgのアヴァスチン(Avastin)(ベヴァシズマブ)と等価な用量を計算する(表75)。全ての用量は、0日目の全マウスの平均体重(27.7g)にしたがって計算し、マウス当たり100μLの体積で投与する。VHHは毎日または1日おきに腹腔内に投与する。Day 1が処置の最初の日で、Day 21が処置の最後の日である。
腫瘍の直径をノギスで週に3回測定する(月曜、水曜および金曜日)。各腫瘍の体積(mm3)を以下の式で計算する:腫瘍体積=(長さ)x(直径)2xπ/6。処置の副作用をモニターするために、異常についてマウスを毎日検査し、さらに週に3回体重を測定する(月曜、水曜および金曜日)。コントロール腫瘍が平均してほぼ1000mm3に達したとき動物を殺す。
統計評価は、Day 21の実験終了時のパラメーター、腫瘍体積および体重について実施する。腫瘍体積については絶対値および体重についてはDay 1の最初の体重に対する変化パーセンテージが用いられる。観察される変動のために非パラメーター法(nonparametric method)が適用される。
観察数を記述的に考察するために、中央値、最小値および最大値を計算する。処置に対する起こり得る効果の迅速な概覧のために、各治療グループTの腫瘍体積の中央値をコントロールCの中央値と照らし合わせる。
−相対的腫瘍体積(T/C)
T/C=100xTd/Cd
−Day 1からDay dまでの腫瘍増殖阻害(TGI)
TGI=100x[(Cd−C1)−(Td−T1)/(Cd−C1)]
式中、
C1、T1は、Day 1の実験開始時のコントロールグループおよび処置グループの腫瘍体積中央値であり、
Cd、Tdは、Day dの実験終了時のコントロールグループおよび処置グループの腫瘍体積中央値である。
3つのVHHの投薬グループとコントロールとの比較に一面減少(one-sided decreasing)ウィルコクソン検定を適用し、効果として腫瘍体積の減少および副作用として体重増加の減少を探索する。
腫瘍体積のためのp値(有効性パラメーター)はBonferroni-Holmにしたがって多重比較のために調整し、一方、体重のp値(許容性パラメーター)は起こり得る副作用を見落とさないように未調整のままにする。
有意レベルはα=5%に固定する。0.05未満の(調整済み)p値は治療グループ間の相違を示すとみなされ、p値が0.05以上0.10未満のときはいつでも相違は指標と認められる。
統計評価はソフトウェアパッケージSASバージョン9.2(SAS Institute Inc., Cary NC, USA)およびProc StatXact(Cytel Software Corporation, Cambridge MA, USA)を用いて実施する。
図52並びに表75および76に示すように、VEGFDLLBII013、VEGFDLLBII010およびVEGFDLLBII015はSW620大腸癌モデルにおいて有意な有効性を示し、さらに良好に許容される。
図52AはSW620腫瘍増殖動態を示す。すなわち、SW620担癌マウスは毎日(白記号)VEGFDLLBII013(VHH 1)、VEGFDLLBII010(VHH 2)またはVEGFDLLBII015(VHH 3)で処置される。腫瘍体積中央値が時間の経過とともにプロットされている。Day 1は実験の最初の日で、Day 21は最後の日である。グラフの一番上の三角は処置日を示している。
図52Bは、Day 21の実験終了時の絶対腫瘍体積を示す。すなわち、SW620担癌マウスは毎日(白記号)VEGFDLLBII013(VHH 1)、VEGFDLLBII010(VHH 2)またはVEGFDLLBII015(VHH 3)で処置されるか、または1日おきに(黒記号)VEGFDLLBII013(VHH 1)またはVEGFDLLBII010(VHH 2)で処置される。Day 21の個々の絶対腫瘍体積がプロットされている。各記号は個々の腫瘍を表している。横線は腫瘍体積中央値を表す。
図52Cは時間経過における体重の変化を示す。すなわち、SW620担癌マウスは毎日(白記号)VEGFDLLBII013(VHH 1)、VEGFDLLBII010(VHH 2)またはVEGFDLLBII015(VHH 3)で処置されるか、または1日おきに(黒記号)VEGFDLLBII013(VHH 1)またはVEGFDLLBII010(VHH 2)で処置される。Day 1は処置の最初の日で、Day 21は最後の日である。グラフの一番上の三角は処置日を示している。
選択したVHHのマウスにおける薬理学的動態を決定するために、1グループにつき6匹の動物(雌のBomTac:NMRI-Foxn1nuマウス(6−7週齢))の腹腔に0.1mL中の33nmol/kgの用量を1回投与する。種々の時点(各時点で3匹のマウス)で、イソフルラン麻酔下での後眼窩採血により約50μLの血液を入手する。前記サンプルを30分後に遠心し、得られた20μLの血清を解析まで-20℃で保存する。サンドイッチELISAによりVHH濃度を測定する。
炭酸緩衝液(pH9.6)で0.5μg/mLに希釈したヒトVEGF(R&D Systems 293-VE/CF)の100μL/ウェルで、マイクロタイタープレート(Medisorp Nunc)を一晩+4℃にて被覆する。300μLの脱イオン水で洗浄後、残留結合部位を200μLのブロッキング緩衝液(PBS/0.5%ウシ血清アルブミン/0.05%Tween20)の0.5時間の添加によってブロッキングする。
更なる洗浄工程の後で、血清希釈媒体(SDM、ブロッキング緩衝液+2%マウス血清プール、PAA Labor GmbH)で希釈した標準物またはサンプルをELISAプレートのウェル当たり100μL添加し、プレートシェーカーにて室温で1時間インキュベートする。標準曲線の作成のために、VHHを血清希釈媒体で100(VEGFDLLBII013)または10(VEGFDLLBII010およびVEGFDLLBII015)ng/mlに希釈し、SDM中の8段階2倍希釈としてELISAプレートに2組ずつ添加する。マウス血清をブロッキング緩衝液で最低濃度1:50に希釈し、更なる希釈はSDMで実施する。血清サンプルをELISAプレートに8段階の2倍希釈として2組ずつ添加する。
プレートをもう1回洗浄し、結合VHHの検出のために、ブロッキング緩衝液で0.2μg/mLに希釈したヒトDll4-His(R&D Systems 1506-D4/CF)をウェル当たり100μL添加し、以前のようにシェーカーで1時間インキュベートする。再度プレートを洗浄した後、ブロッキング緩衝液で1:5000に希釈した抗-6Xポリヒスチジ-HRPO(R&D Systems MAB050H)をウェル当たり100μL添加し、以前のようにプレートを1時間インキュベートする。それぞれ300μLの脱イオン水による3回の最終洗浄の後、結合VHHを以下のように検出する:ウェル当たり100μLのTMB染色溶液(Bender MedSystems BMS406.1000)を添加し、シェーカー上で室温にて約10分インキュベートした後で1Mのリン酸をウェル当たり100μL添加することによって発色を停止させる。個々のウェルの光学密度をマイクロプレート用分光光度計(ThermoMax, Molecular Devices)およびELISAソフトウェアSoftMax Pro(Molecular Devices)により定量化する。サンプルの結果は4パラメーターロジスティック曲線合致による標準曲線合致から誘導する。
Claims (9)
- Dll4結合要素およびVEGF結合要素を含む二重特異性結合分子であって、配列番号:82に示すアミノ酸配列を有する、前記二重特異性結合分子。
- 請求項1記載の二重特異性結合分子をコードする核酸分子または前記核酸分子を含むベクター。
- 請求項2に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 活性成分として、請求項1記載の二重特異性結合分子を含む医薬組成物。
- 脈管形成におけるVEGF媒介作用と関係する疾患の治療のための請求項4に記載の医薬組成物。
- 癌および癌性疾患の治療のための請求項4に記載の医薬組成物。
- 眼の疾患の治療のための請求項4に記載の医薬組成物。
- 以下を含む請求項1記載の二重特異性結合分子の作製方法:
請求項3記載の宿主細胞を前記二重特異性結合分子の発現を可能とする条件下で培養する工程;
前記宿主細胞によって発現された前記二重特異性結合分子を培養物から回収または単離する工程。 - さらに二重特異性結合分子を精製する工程を含む、請求項8記載の方法。
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