TW201124533A - Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy - Google Patents

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TW201124533A TW099133632A TW99133632A TW201124533A TW 201124533 A TW201124533 A TW 201124533A TW 099133632 A TW099133632 A TW 099133632A TW 99133632 A TW99133632 A TW 99133632A TW 201124533 A TW201124533 A TW 201124533A
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Andreas Gschwind
Joachim Boucneau
Tavernier Evelyn De
Joost Kolkman
Pascal Merchiers
Hoorick Diane Van
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Boehringer Ingelheim Int
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201124533 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於人類·;台療，特定言之癌症治療之領域及適 用於此治療中之藥劑及組合物。 【先前技術】 如US 2008/0014196中所概述，血管生成牽涉包括實體 腫瘤及轉移之大量病症之發病中。 就腫瘤生長而言，血管生成似乎對於自增生轉變為瘤形 成及對於為腫瘤生長及轉移提供營養至關重要（F〇lkman等 人，Nature 339 -58 (1989))，此使腫瘤細胞相較於正常細胞 獲得生長優勢。因此’抗血管生成治療已成為若干類型腫 瘤之重要治療選擇。 最重要之促血管生成因子之一為血管内皮生長因子 (VEGF-A，以下稱為「VEGF」），其屬於包括胎盤生長因 子（P1GF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及 VEGF-E之基因 豕族且以由替代性拼接單一基因之mRNA產生的若干同功 異型物形式存在，VEGF 165為生物學上最相關之同功異型 物。因此，大多數依賴抗血管生成之抗癌治療已集中於阻 斷 VEGF路徑（Ferrara 等人，Nat Rev Drug Discov· 2004 年 5 月；3(5)··391-400)。 近來，D114(或Delta樣4或delta樣配位體4)已鑑別為癌症 治療之有希望標靶。D114為洛奇（Notch)配位體之Delta家族 成員。洛奇信號傳導在許多癌症中，例如在T細胞急性淋 巴母細胞白血病中及在實體Μ瘤中調控異常（Sharma等人 150860.doc 201124533 2007，Cell Cycle 6 (8): 927-30; Shih等人，Cancer Res. 2007 年 3 月 1 曰；67(5): 1879-82)。 D114之細胞外域由 N-末端域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL) 域、及一串八個表皮生長因子（EGF)樣重複構成。一般而 言，認為EGF域包含胺基酸殘基218-251(EGF-1 ;域1)、 252-282(EGF-2 ;域 2)、284-322(EGF-3 ;域 3)、324-360(EGF-4 ;域4)及 362-400(EGF-5 ;域 5)，同時DSL 域在 hD114之約胺基酸殘基173-217處且N-末端域在約胺基酸殘 基 27-172處（WO 2008/076379)。 已報導D114由血管内皮高度選擇性表現，特定言之在動 脈内皮中高度選擇性表現（Shutter等人 （2000) Genes Develop. 14: 1313-1318)。新近於小鼠中之研究已展示D114 由VEGF誘導且為限制血管發芽及分枝之負反饋調控劑。 與此作用一致，缺失或抑制D114會導致血管生成過度 (Scehnet 等人，Blood. 2007年 6 月 1 日；109 (11):4753-60)。此 不受限制之血管生成由於非生產性（non-productive)血管之 形成而反常地減緩腫瘤生長，即使在對抗VEGF治療具有 抗性之腫瘤中亦如此（Thurston等人，Nat Rev Cancer· 2007 年 5 月；7(5):327-31 ; WO 2007/070671 ; Noguera-Troise 等 人，Nature. 2006年12月21日；444(7122))。除對腫瘤血管生 成之效應外，抑制D114亦已顯示降低臨床前腫瘤模型中癌 幹細胞之頻率（Hoey等人，Cell Stem Cell. 2009年8月7曰； 5(2):168-77)。 已描述處於臨床（前）研發中之若干靶向D114之生物化合 lS0860.doc 201124533 物：REGN-421 ( = SAR153192 ； Regeneron ， Sanofi-
Aventis; WO 2008076379)及 OPM-21M18(OncoMed)(Hoey 等人，Cell Stem Cell. 2009年8月 7 曰；5(2):168-77)，兩者均 為完全人類D114抗體；YW152F(Genentech)，一種人類化 D114 抗體（Ridgway 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日； 444(7122):1083-7) ; D114-Fc(Regeneron，Sanofi-Aventis)， 一種由D114細胞外區域及人類IgG 1之Fc區域構成之重組融 合蛋白（Noguera-Troise 等人，Nature· 2006 年 12 月 21 曰；444(7122)) 〇 已顯示在多個腫瘤類型之異種移植模型中及在抗VEGF 抗性腫瘤模型中，相較於單獨抗VEGF，組合抑制VEGF及 D114會提供優越的抗腫瘤活性（Noguera-Troise等人， Nature. 2006 年 12 月 21 曰；444(7122):1032-7 ; Ridgway 等
人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444(7122):1083-7 ; US 2008175847)。 單株抗體（MAb)及融合蛋白鑒於其治療應用具有若干缺 點：為了防止其降解，其必須儲存在接近凍結溫度下。此 外，因為其在消化道中快速消化，所有其不適於口服投 藥。MAb用於癌症治療之另一主要限制為轉運不良，此導 致濃度較低及不能靶向腫瘤中之所有細胞。 此外，基於靶向VEGF及D114兩者之當前技術狀態之治 療表示涉及兩種個別抑制劑，亦即VEGF結合分子及各別 D114結合分子的組合治療。然而，此等治療具有以下缺 點：兩種各別藥物之研發及生產涉及高成本及許多資源、 150860.doc 201124533 兩種藥物可能具有不同藥物動力學性質及投與兩種藥物對 患者不便。 鑒於以上所述，本發明之一目標已在於提供用於人類抗 腫瘤治療之改良分子。 本發明係基於將一或多個VEGF結合分子與一或多個 D114結合分子合併在單一治療劑中之概念。 因此，本發明係關於包含一或多個D114結合分子及一或 多個VEGF結合分子之雙特異性結合分子。 在下文中，若未另有說明，則術語「結合分子」（或 「抗原結合分子」）係指D114結合分子（特定言之免疫球蛋 白單一可變域）或VEGF結合分子（特定言之免疫球蛋白單一 可變域）之任一者或兩者。術語「雙特異性結合分子」係 指包含至少一個D114結合分子（或「結合組分」）及至少一 個VEGF結合分子（或結合組分）之分子。雙特異性結合分子 在結合D114或VEGF之部分分子中，亦即分別在其「D114結 合組分」（或抗D114組分）或「VEGF結合組分」（或抗VEGF 組分）中可含有一個以上DIM結合分子及/或一個以上VEGF 結合分子，亦即在雙特異性結合分子含有雙互補位 (biparatopic，如下文所定義）D114結合分子及/或雙互補位 VEGF結合分子之情況下。 本發明雙特異性結合分子適用作預防、治療、減輕及/ 或診斷可藉由抑制D114而調節之疾病或病狀（諸如癌症）之 組合物中的藥理學活性劑。 本發明之另一目標已在於提供預防、治療、減輕及/或 150860.doc 201124533 診斷此等疾病、病症或病狀之方法，其涉及使用及/或投 與此等藥劑及組合物。 特定言之’本發明之一目標已在於提供相較於當前使用 及/或此項技術中已知之藥劑、組合物及/或方法可提供某 些優勢之此等藥理學活性劑、組合物及/或方法。 此等優勢包括尤其相較於如上所述之習知抗體或其片 段，經改良之治療性質及/或藥理學性質及/或其他例如對 Φ 於製造目的而言為有利的性質。 更特定言之，本發明之一目標已在於提供新穎分子，且 特定言之結合哺乳動物且尤其人類DU4及人類VEGF之分 子’其中此等分子適用於如本文所述之治療及診斷目的。 【發明内容】 根據第一態樣’提供雙特異性結合分子，其於單一分子 中包含D114結合組分及VEGF結合組分。 更特定言之，本發明雙特異性結合分子本質上包含⑴特 • 異性結合DU4之至少一個抗原決定基之D114結合組分及（ii) 特異性結合VEGF之至少一個抗原決定基之VEGF結合組 刀’其中該等組分以同時結合£)114及VEGF之方式或一次 僅結合DU4或VEGF之方式彼此連接。 根據本發明之較佳態樣，兩種組分包含一或多個可彼此 獨立地為VHH或域抗體之免疫球蛋白單一可變域、及/或 如本文所定義之任何其他種類之免疫球蛋白單一可變域， 諸如VL域’只要此等免疫球蛋白單一可變域各結合抗 原’亦即分別為D114或VEGF即可。 150860.doc 201124533 根據較佳實施例，免疫球蛋白單一可變域具有相同類 型’特定言之’所有免疫球蛋白單一可變域皆為VHH或域 抗體。 根據特定較佳實施例，所有免疫球蛋白單一可變域皆為 VHH ’較佳為人類化（或如本文定義之「序列最佳 化」）VHH。因此，本發明係關於包含（視情況人類化或序 列最佳化）抗D114 VHH及（視情況人類化或序列最佳化）抗 VEGF VHH之雙特異性結合分子。 然而’熟習此項技術者將瞭解本文的教示可以類似方式 應用於包括其他抗D114或抗VEGF免疫球蛋白單一可變域 (諸如域抗體）之雙特異性結合分子。 在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明雙特異性結合 分子之核酸以及含有該等核酸之宿主細胞。 本發明另外係關於一種產物或組合物，其含有或包含至 少一種本發明雙特異性結合分子及視情況可選之此等組合 物的一或多種其他組分。 本發明另外係關於製備或產生本文所述之雙特異性結合 分子的方法、本文所述之核酸、宿主細胞、產物及組合 物。 本發明另外係關於本文所述雙特異性結合分子、核酸、 宿主細胞、產物及組合物之應用及用途，以及預防及/或 治療可藉由抑制DU4而調節之疾病及病症之方法。 本發明之此等及其他態樣、實施例、優勢及應用將由下 文進一步描述而變得明確。 150860.doc 201124533 定義 除非另有指示或定義，否則所有所用術語皆具有此項技 術中之通常含義，該含義將為熟習此項技術者所瞭解。參 考例如標準手冊，如Sambro〇k等人，「Molecular Cloning: A Lab〇ratory Manual」（第 2版），第 i3 卷，c〇id 响叹
Harbor Laboratory Press (1989) ; w」，
Oxford University Press，New York，（1990);及 Roitt 等人, # Immunology」（第 2 版），Gower Medical Publishing,
London，New York (1989)’以及本文中引用之一般先前技 術，此外，除非另有指示，否則未特定詳述之所有方法、 步驟、技術及操作皆可以且已經以本身已知之方式執行， «玄方式將為熟習此項技術者所瞭解。亦參考例如標準手 冊、以上提及之一般先前技術及其中引用之其他參考文 獻。 除非另有指示，否則術語「龙瘦磺蛋白」及「兑疫磺蛋 • 白声办」在本文中無論用於指#鏈戎邀或指絜知4鐽犮邀 皆以一般術語用以包括完全尺寸抗體，其個別鏈，以及其 所有部分、域或片段（包括（但不限於）抗原結合域或片段， 諸如分別VHH域或VH/VL域）^此外，本文所用之術語 「序列」（例如在如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、 「（單一）可變域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」之 術語中）一般應理解為包括相關胺基酸序列以及編碼彼等 之核酸序列或核苷酸序列兩者，除非本文需要更限定之解 釋。 150860.doc 201124533 如本文所用之術語（多肽或蛋白皙夕、「u 貝i) 碱」係指摺疊蛋 白質結構，其能夠獨立於蛋白質之1、 八餘。p刀維持其三級結 構。-般而言，域負責蛋白質之個別功能性質且在許多情 況下可添加、移除或轉移至其他蛋白質而不損失蛋白質之 其餘部分及/或域的功能。 如本文所用之術語「龙瘦球蛋白域」係指抗體鍵（諸如 習知4鏈抗體之鏈或重鏈抗體之鍵）之球形區域或係指本質 上由此類球形區域組成之多肽。免疫球蛋白域之特徵在於 其維持抗體分子之免疫球蛋白摺叠特徵，其由安置在兩個 β片中視情況經由保守雙硫鍵穩定之約7個反平㈣股之2層 夾層（sandwich)組成》 如本文所用之術語「⑽.蛋…减」意謂本質上由 此項技術及下文中分別稱為「構架區i」或「〜 區2」或「FR2」；「構架區.nr 卞 々「 卞匕）」次FR3」，及「構架區4」 或 FR4」之四個「構牟區，知士、从立> 再永L」組成的免疫球蛋白域；該等 構架區由此項技術及下文中分別稱為「互補決定區L或 「CDR1」；「互補岐區2」或「咖2」；及「互補決定區 」或「CDR3」之三個「互補決定區」或「⑽」中斷。 因此’免疫球蛋白可變域之—般結構或序列可如下表示 為：fR1-CDR1.FR2_CDR2_FR3 cdr3 fr4。免疫球蛋白 °又域正疋因具有抗原結合位點而賦予抗體對抗原之特異 性。 如本文所用之術語「免疫球蛋白單一可變域」意謂能夠 不與另一免疫球蛋白可變域配對情況下特異性結合抗原 150860.doc 201124533 之抗原決定基的免疫球蛋白可變域。本發明含義中之免疫 球蛋白單一可變域之一實例為「域犮邀」，諸如免疫球蛋 白單一可變域VH及VL(VH域及VL域）。免疫球蛋白單一可 變域之另一貫例為如下文定義之路轮科的「丑誠」（或 簡稱為「VHH」）。 鑒於以上定義，習知4鏈抗體（諸如此項技術中已知之 IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子）或源自此習知4鏈抗體之 Fab片段、F(ab’）2片段、Fv片段（諸如二硫鍵連接之fv或 scFv片段）、或微型雙功能抗體（皆為此項技術中已知）的抗 原結合域將通常不視為免疫球蛋白單一可變域，因為在此 等情況下，通常不經由一個（單一）免疫球蛋白域而經由共 同結合各別抗原之抗原決定基的一對（締合）免疫球蛋白域 (諸如輕鏈及重鏈可變域），亦即經由免疫球蛋白域之VH_ VL對結合抗原之各別抗原決定基。 「K/Z/f域」’亦稱為Vhh、VhH域、VHH抗體片段、及 VHH抗體，已最初描述為「重鏈抗體」（亦即「缺乏輕鏈 之抗體」，Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.:「Naturally occurring antibodies devoid of light chains」；Nature 363, 446-448 (1993))之抗原結合免疫球蛋 白（可變）域。術語「VHH域」已經選擇以將此等可變域與 存在於習知4鏈抗體中之重鏈可變域（其在本文中稱為「Vh 域」或「VH域」）及存在於習知4鏈抗體中之輕鏈可變域 (其在本文中稱為「VL域」或「VL域」）進行區分。VHH域 150860.doc 201124533 可在無另一抗原結合域下特異性結合抗原決定基（此與習 知4鏈抗體中之VH或VL域相反，在彼情況下抗原決定基由 VL域連同VH域一起識別）^ VHH域為由單一免疫球蛋白域 形成之小型穩定及高效之抗原識別單元。 在本發明之情形下，術語VHH域、VHH、VhH域、VHH 抗體片段、VHH抗體以及「Nanobody®」及「Nanobody® 域 j (「Nanobody」為 Ablynx N.V.公司；Ghent; Belgium之 商標）可互換使用且表示免疫球蛋白單一可變域（具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4結構且無需第二免疫球蛋 白可變域存在即可特異性結合抗原決定基），且其經由如 例如WO 2009/109635圖1中定義之所謂「印記殘基 (hallmark residue)」與 VH域區分。 如例如於 Riechmann 及 Muyldermans，J. Immunol. Methods 231，25-38 (1999)之圖2中所示，如對駱駝科之 VHH域所應用，免疫球蛋白單一可變域（例如VHH)之胺基 酸殘基係根據 Kabat 等人（「Sequence of proteins of immunological interest」，US Public Health Services, NIH Bethesda，MD,公開案第91號）給出之VH域的一般編號法來 編號。根據此編號法， -FR1包含在位置1-30處之胺基酸殘基， -CDR1包含在位置31-35處之胺基酸殘基， -FR2包含在位置36-49處之胺基酸， -CDR2包含在位置50-65處之胺基酸殘基， -FR3包含在位置66-94處之胺基酸殘基， 150860.doc 201124533 -CDR3包含在位置95-102處之胺基酸殘基，且 -FR4包含在位置103-113處之胺基酸殘基。 然而’應注意-如此項技術中對於VH域及VHH域所熟知-各CDR中之胺基酸殘基之總數可能不同且可能不對應於由 Kabat編號指示之胺基酸殘基之總數（即根據Kabat編號之一 或多個位置可能未在實際序列中佔據，或實際序列可能含 有多於Kabat編號所允許之數目的胺基酸殘基）。此意謂一 般而§ ’根據Kabat之編號可能或可能不對應於實際序列 中胺基酸殘基的實際編號。 對VH域之胺基酸殘基進行編號且亦可以類似方式應用於 VHH域之替代方法在此項技術中為已知的。然而，除非另 有指示，否則在本描述 '申請專利範圍及圖式中，將遵循 如上所述根據Kabat且應用於VHH域之編號。 VHH域中之胺基酸殘基之總數將通常在11 〇至1 範圍 内’常常介於112與11 5之間。然而應注意較小及較長序列 亦可適於本文所述之目的。 免疫球蛋白單一可變域（例如VHH及域抗體）具有大量使 其極為有利作為功能性抗原結合分子用於治療中的獨特結 構特徵及功能性質。特定言之且不對其進行限制，Vhh域 (其已本質上經「設計」成在不與輕鏈可變域配對情況下 功能性結合抗原）可充當單一、相對較小、功能性抗原結 合結構單元。 由於其獨特性質’如本文定義之免疫球蛋白單一可變 域，如VHHs或VHs(或VLs)，單獨或作為較大多肽（例如雙 150860.doc 13 201124533 互補位分子或雙特異性結合分子）之一 著優點： 部分 提供許多顯 1里％女旱 円覜和力及高選擇性結合 無需存在兩個各別域 域亦無需保證此等兩個域係以正 確空間構形及相能左+ , 士 丨U场1乐W正 m態存在(亦即經由使用特別設計之連 接于，如同scFv之連接子）； 核酸分子表現且不需 免疫球蛋白單一可變域可自單一 要任何轉譯後修飾（如糖基化）； •免疫球蛋白單-可變域可輕易經工程改造成多價及多 特異性形式（如本文進一步論述）； •免疫球蛋白單-可變域對其縣具有高特異性及親和 力，具有低固有毒性，可經由輸注或注射以外之 途徑投與； •免疫球蛋白單一可變域對熱、pH、蛋白酶及其他變性 劑或條件高度穩定，因此可在不使用冷凍設備情況下 製備、儲存或運輸； •免疫球蛋白單一可變域以小規模及製造規模製備均容 易且相當廉價。舉例而言’免疫球蛋白單一可變域及 含有免疫球蛋白單一可變域之多肽可使用微生物醱酵 (例如下文進一步所述）產生’不需要使用哺乳動物表 現系統，例如習知抗體之情況； •相較於習知4鏈抗體及其抗原結合片段，免疫球蛋白 單一可變域相當小（約15 kDa，或為習知igG的1/1〇)， 因此顯示高（更高）穿透入組織（包括（但不限於）實體腫 130860.doc • 14· 201124533 瘤及其他緻密組織），且可以高於此等習知4鏈抗體及 其抗原結合片段之劑量投與； • VHH具有特定之所謂「空六結合性質」（尤其歸因於 相較於4鏈抗體之VH域，其CDR3環經延伸），因此亦 可進入習知4鏈抗體及其抗原結合片段不可進入之標 乾及抗原決定基； • VHH具有高度可溶及極其穩定且不具有凝集趨勢的特 疋優勢（正如由 Ward 等人，Nature 341: 544-546 (1989) 所述之小鼠源性抗原結合域的情況一樣）。 不在以下方面限制本發明雙特異性結合分子之組分中含 有之免疫球蛋白單一可變域：獲得該等免疫球蛋白單一可 變域之特定生物來源、或特定製備方法。舉例而言，獲得 VHH可包括以下步驟： (1) 分離天然存在之重鏈抗體之VHH域；或筛檢包含重 鏈抗體或VHH之文庫且自其分離VHH ; (2) 表現編碼具有天然存在序列之vhh的核酸分子； (3) 視情況在親和力成熟之後使具有天然存在序列之 VHH「人類化」（或序列最佳化），或表現編碼此等人類化 VHH之核酸； (4) 使動物物種（特定言之哺乳動物物種，諸如人類）之天 然存在抗體的免疫球蛋白單一可變重域「駱駝化」（如下 所述）’或表現編碼此等駱駝化域的核酸分子； (5 )使VH「路秘化」，或表現編瑪此類絡轮化的核酸 分子； 150860.doc 15 201124533 (6) 使用以合成方式或半合成方式製備蛋白質、多肽或 其他胺基酸序列之技術； (7) 使用核酸合成技術製備編碼vhh域之核酸分子，隨 後表現由此獲得之核酸； (8) 使重鏈抗體或Vhh經受親和力成熟、突變誘發（例如 隨機突變誘發或定點突變誘發）及/或任何其他技術以增加 VHH之親和力及/或特異性；及/或 (9) 組合或選擇上述步驟。 適於進行上述步驟之方法及技術在此項技術中為已知的 且將為熟習此項技術者所瞭解。 根據一特定實施例，存在於本發明雙特異性結合分子中 之免疫球蛋白單一可變域為胺基酸序列本質上對應於天然 存在VHH域之胺基酸序列之vhh，但其已經人類化（序列 最佳化，視情況在親和力成熟之後），亦即藉由以人類之 習知4鏈抗體可變重域中相應位置處存在的一或多個胺基 酸殘基置換該天然存在VHH序列之胺基酸序列中的一或多 個胺基酸殘基。此可使用此項技術中已知之方法進行，該 等方法可由熟習此項技術者以常規方式使用。 序列最佳化VHH可含有一或多個完全人類構架區序列， 且在一甚至更特定實施例中，可含有源自人類生殖系Vh3 序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分’或與此高度同源的 人類構架區序列。因此，人類化方案可包含單獨或組合使 用生殖系VH基因（諸如DP 47、DP 29及DP 51)之相應構架 1、2及3(FR1、FR2及FR3)殘基來置換任何VHH殘基。本 150860.doc •16· 201124533 發明免疫球蛋白單一可變域之適合構架區（FR)可選自彼等 如例如於WO 2006/004678中所述者且特定言之包括所謂 「KERE」及「GLEW」種類。在約位置44至47處具有胺基 酸序列G-L-E-W之免疫球蛋白單一可變域及其各別人類化 對應物特定較佳。 舉例而3，屬於103 P，R，S組及/或glew組（如下文所定 義）之VHH的人類化取代為108q至1〇8L。使免疫球蛋白單 φ 一可變域人類化之方法在此項技術中為已知的》 具有由治療應用看來改良之性質（例如增強之親和力或 減少之免疫原性）之結合免疫球蛋白單一可變域可經由此 項技術中已知之技術而自個別結合分子獲得，該等技術諸 如親和力成熟（例如自合成、隨機或天然存在免疫球蛋白 序列起始）、CDR接枝、人類化、合併源自不同免疫球蛋 白序列之片段、使用重疊引子之PCR組裝、及熟習此項技 術者熟知之用於工程改造免疫球蛋白序列的類似技術；或 • 任何上述者之任何適合組合，亦稱為如本文所述之「序列 最佳化」。例如參考標準手冊以及其他描述及實例。 適當時，親和力增加之結合分子可藉由使另一結合分子 親和力成熟來獲得，另一結合分子表示就親和力成熟分子 而言的「親本」結合分子。 獲得結合特定抗原或抗原決定基之VHH之方法早前已描 述於例如WO 2006/040153及WO 2006/122786中。如其中 亦詳述，源自駱駝科之VHH域可藉由以人類習知4鏈抗體 VH域中相應位置處存在的一或多個胺基酸殘基置換原始 150860.doc -17- 201124533 VHH序列之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基而經「人 類化」（本文中亦稱為「序列最佳化」，除人類化外，「序 列最佳化」亦可涵蓋經由提供VHH改良性質之一或多個突 變對序列進行的另一修飾，諸如移除潛在轉譯後修飾位 點）。人類化VHH域可含有一或多個完全人類構架區序 列，且在一甚至更特定實施例中，可含有源自DP-29、DP-47 、 DP-51或 其部分 ，視情況與JH序列 （諸如 JH5)合併的人 類構架區序列。 域抗體，布楱h「Dab」及「dAb」（術語「域抗體 (Domain Antibodies)」及「dAb」被GlaxoSmithKline 公司 集團用作商標），已描述於例如以下中：Ward, E.S.，等人： 「 Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli」；Nature 341: 544-546 (1989) ; Holt，L.J.等人： 「Domain antibodies: proteins for therapy」；TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003);及 WO 2003/002609。 域抗體本質上對應於非駱駝科哺乳動物之抗體（特定言 之人類4鏈抗體）之VH或VL域。為了以單一抗原結合域形 式，亦即在不分別與VL域或VH域配對的情況下結合抗原 決定基，需要例如藉由使用人類單一 VH或VL域序列之文 庫對此等抗原結合性質進行特定選擇。 如同VHH之域抗體之分子量為約13至約16 kDa，且若源 自完全人類序列，則不需要進行人類化以供例如人類治療 使用。如同在VHH域之情況下，域抗體亦在原核表現系統 150860.doc •18· 201124533 中良好表現，從而顯著降低總製造成本β 此外，熟習此項技術者亦將瞭解有可能將一或多個以上 提及之CDR「接枝」於其他「骨架」（包括（但不限於）人類 骨架或非免疫球蛋白骨架）上》適於此CDR接枝之骨架及 技術在此項技術中為已知的。
可互換使用之術語「Μ衫基」*「技㈣名子」係 指諸如多肽之巨分子之-部分，其由諸如習知抗體或本發 明多肽之抗原結合分子，且更特定言之由該等分子之抗原 結合位點識別。抗原決定基定義免疫球蛋白之最小結合位 點，因此表示免疫球蛋白之特異性的標靶。 可「.铉合」4 m昝合」某一抗原決定基抗原或 蛋白質(或其至少一部分、片段或抗原決定基)、對其「身 有巍和力」及/或「舁㈣居沒」之多肽(諸如免疫球蛋 白、抗體、本發明免疫球蛋白單一可變域、或一般… 合分子或其片段）據說係指「料」該抗原決定基、抗原 或蛋白質或為關於此抗原決定基、抗原或蛋白質之「紐 :」「:子。就此而言，鶴或顧結合分子亦可分別： 為VEGF中和」分子或「刪中和」分子。 —般而§ ’術語「存毒沒 ♦ 原結合蛋，…球蛋:;=:=抗 不同類型抗原或抗原決定基的數目。二二子之 :二力：結合性(，確定其特異性；:抗 ::二解:=(::τ-力-- 貝上抗原結合位點之間結合強度的量 150860.doc -19- 201124533 又KD值越小，抗原決定基與抗原結合分子之間的結合 強度越強(或者，親和力亦可表示為親和力常數(ka)，其 為1/KD)。如熟習此項技術者將瞭解（例如基於本文其他揭 示内谷）親和力可視相關特定抗原而定以本身已知方式 加X /則疋結合性為抗原結合分子（諸如免疫球蛋白、抗 體、免疫球蛋白單-可變域或含有其之多肽）與相關抗原 之間結合強度的量度。結合性與抗原決定基與抗原結合分 子上其抗原結合位點之間的親和力及存在於抗原結合分子 上之相關結合位點的數目兩者有關。 抗原結合分子識別抗原決定基之部分稱為互祷位。 除非另有指示，否則術語「D114結合分子」或「VEGF 結合分子」包括抗D114或抗VEGF抗體、抗〇114抗體或抗 VEGF抗體片段、如本文定義之「抗DU4抗體樣分子」或 「抗VEGF抗體樣分子」、及與任何此等者之接合物。抗體 包括（但不限於）單株抗體及嵌合單株抗體。術語「抗體」 涵蓋藉由於宿主細胞中重組表現產生之完全免疫球蛋白 (如單株抗體）、以及抗體片段或「抗體樣分子」，包括單鏈 抗體及線抗體’所謂例如描述於WO 02/056910中之 「SMIP」（「小模組免疫藥劑」）；抗體樣分子包括如本文 定義之免疫球蛋白單一可變域。抗體樣分子之其他實例為 免疫球蛋白超家族抗體（IgSF)或CDR接枝分子。 分別合分子」4「仞/#·结合分子」係指單價 靶結合分子（亦即結合各別標靶之一個抗原決定基之分子） 以及二價或多價結合分子（亦即結合一個以上抗原決定基 150860.doc •20· 201124533 之結合分子，例如如下文定義之「雙互補位」分子）兩 者。含有一個以上VEGF(或D114)結合免疫球蛋白單一可變 域之VEGF(或D114)結合分子亦稱為「形式化（f〇rmatted) ^ 結合分子，其在靶結合組分内除免疫球蛋白單一可變域外 亦可包含連接子及/或具有效應功能之部分，例如半衰期 延長部分（如白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域）、及/或融 合搭配物（如血清白蛋白）及/或連接聚合物（如pEG)。 φ 如本文所用之術語「雙互滅位结合分子」 或「髮互#位充遽破蛋白皐一 y變硪」將意謂包含如本文 定義之第一免疫球蛋白單一可變域及第二免疫球蛋白單一 可變域之結合分子，其中兩個分子結合各別抗原之兩個非 重豐杬原決定基。雙互補位結合分子由關於抗原決定基具 有不同特異性之免疫球蛋白單一可變域構成。識別抗原決 定基之抗原結合分子（諸如抗體或本發明免疫球蛋白單一 可變域）之部分稱為互镑·位。 • 形式化結合分子即使欠佳但亦可包含識別相同或重疊抗 原決定基或其各別抗原的兩個相同免疫球蛋白單一可變域 或兩個不同免疫球蛋白單一可變域。在此情況下，就 VEGF而。兩個免疫球蛋白單一可變域可結合形成vegf 二聚體之兩個單體中之每一者中的相同或重疊抗原決定 基。 通予，本發明結合分子將以如例如於Biacore或Kinexa檢 疋中量測之10E-5至10E-14莫耳/公升（M)或1〇E_14莫耳/公 升以下、且較佳10£_7至1〇^14莫耳/公升或1〇e_14莫耳/ I50860.doc -21 - 201124533 公升以下、更佳1吒-8至1(^_14莫耳/公升、且甚至更佳 赂11至服_13之解離常數（Kd)，及/或以至少削7 me_ 1、較佳至少10E8 ME_i、更佳至少1〇趵ME1，諸如至少 10E11 ME-1之締合常數（κΑ)結合。任何大於1〇E 4 M之Kd 值-般視為指示非特異性結合。較佳地，本發明多狀將以 小於500 nM、較佳小於200 nM、更佳小於l〇 nM，諸如小 於500 pM之KD結合所要抗原，亦即分別¥£(317或〇114。抗 原結合蛋白質對抗原或抗原決定基之特異性結合可以本身 已知之任何適合方式來測定，包括例如本文所述之檢定、 史卡查分析（Scatchard analysis)及/或競爭性結合檢定（諸如 放射免疫檢定（RIA)、酶免疫檢定（EIA)及夹心式競爭檢定） 及此項技術中本身已知之其不同變化形式。 胺基酸殘基將根據如此項技術中一般已知且達成一致之 標準三字母或一字母胺基酸碼加以指示。在比較兩個胺基 酸序列時，術語「蜃羞鑀差姜」係指相較於第二序列，在 參考序列某一位置處指定數目胺基酸殘基的插入、缺失或 取代。在取代情況下，此（此等）取代將較佳為保守胺基酸 取代，此意謂胺基酸殘基經化學結構類似之另一胺基酸殘 基置換且此對多肽之功能、活性或其他生物性質影響較小 或本質上無影響。此等保守胺基酸取代在此項技術中為熟 知的，例如根據w〇 98/49185 ’其中保守胺基酸取代較佳 為以下群組（i)_(v)内之一個胺基酸經同一群組内之另一胺 基酸殘基取代之取代：⑴較小脂族非極性或弱極性殘基： AU、Ser、Thr、Pro及Gly ; (ii)極性帶負電殘基及其（不帶 150860.doc 201124533 電）醯胺：Asp、Asn、Glu及Gin ; (iii)極性帶正電殘基： His、Arg及Lys ; (iv)較大脂族非極性殘基：Met、Leu、 lie、Val及Cys ;及（v)芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。特定較 佳保守胺基酸取代如下：Ala成為Gly或成為Ser ; Arg成為 Lys ; Asn成為 Gin或成為 His ; Asp成為 Glu ; Cys成為 Ser ; Gin成為Asn ; Glu成為Asp ; Gly成為Ala或成為Pro ; His成 為Asn或成為Gin ; lie成為Leu或成為Val ; Leu成為lie或成 為Val ; Lys成為Arg、成為Gin或成為Glu ; Met成為Leu、 成為Tyr或成為lie ; Phe成為Met、成為Leu或成為Tyr ; Ser 成為Thr ; Thr成為Ser ; Trp成為Tyr ; Tyr成為Trp或成為 Phe ; Val成為lie或成為Leu。 多肽或核酸分子視為「「至）苯貧經分離「形式」」-例 如’在比較其天然生物來源及/或獲得該多肽或核酸分子 之反應介質或培養基時-在其已與至少一種在該來源或介 質（培養基）中其通常與之相關的其他組分分離時，該其他 組分諸如另一蛋白質/多肽、另一核酸、另一生物組分或 巨分子或至少一種污染物、雜質或微量组分。特定言之， 多肽或核酸分子在其已純化至少2倍、特定言之至少1 〇 倍、更特定言之至少100倍且多達1〇〇〇倍或1〇〇〇倍以上時 被視為「本質上經分離」。「呈本質上經分離形式」之多肽 或核SiL刀子較佳在本邊上為均質的，此如使用適合技術’ 諸如適合層析技術’諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳所測定。 兩個VEGF結合分子序列之間的「茅勿一衮艋」指示序 列之間相同胺基酸的百分比。其可如W〇 08/020079第49及 150860.doc •23· 201124533 50頁段落f)中所述加以計算或測定。「序列類似性」指示相 同或表現保守胺基酸取代之胺基酸的百分比。 對V Η域之胺基酸殘基進行編號且亦可以類似方式應用於 VHH域之替代方法在此項技術中為已知的。然而除非另 有指示，否則在本描述、申請專利範圍及圖式中，將遵循 如上所述根據Kabat且應用於VHH域之編號。 「親和力成熟」結合分子，特定言之VHH或域抗體，在 一或多個CDR中具有一或多個變化，該等變化導致對其標 靶之親和力相較於各別親本結合分子經改良。親和力成熟 結合分子可經由例如由以下所述之此項技術中已知的方法 來製備：Marks等人，1992，Biotechnology 10:779-783 或 Barbas，等人，1994，Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91: 3809-3813. ; Shier等人，1995，Gene 169:147-155 ; Yelton等人， 1995，Immunol. 155: 1994-2004; Jackson 等人，1995，J. Immunol. 154(7):3310-9 ;及 Hawkins 等人，1992，J. Mol. Biol· 226(3): 889 896 ; KS Johnson 及 RE Hawkins, 「Affinity maturation of antibodies using phage display」， Oxford University Press 1996 o 對於本發明，若未另有說明，則「SEQ ID NO: x之胺基 酸序列」包括與各別SEQ ID NO: x中所展示之序列100% — 致的胺基酸序列； a) 與各別SEQ ID NO: X中所示序列具有至少80%胺基酸 一致性的胺基酸序列； b) 與各別SEQ ID NO: X中所示序列具有3個、2個或1個 150860.doc •24· 201124533 胺基酸差異的胺基酸序列。 術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常以 不受調控細胞生長/增殖為特徵之生理病狀。欲用本發明 又特異丨生結合分子治療之癌症之實例包括（但不限於）癌 瘤淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。如us 2008/ 0014196中表明用D114拮抗劑治療之此等癌症之更特定實 例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺 φ 癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺 癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌（Hver cancer)、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子 宮内膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、肝癌（Uver cancer)、則列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌（hepatic carcmoma)、胃癌、黑素瘤、及各種類型之頭頸癌。血管 生成之調控異常可導致許多彳由本發明組合物及方法治療 之病症。此等病症包括非贅生性及贅生性病狀兩者◊贅生 • 性病症包括（但不限於）上述彼等者。非贅生性病症包括（但 不限於）如US 2008/0014196中表明用DU4拮抗劑治療之不 合需要或異常肥大、關節炎 '類風濕性關節炎（ra)、牛皮 癖、牛皮癬斑塊、類肉瘤病（sarc〇id〇sis)、動脈粥樣硬 化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性及其他增生性視網膜病 (包括早產兒視網膜病、晶狀體後纖維組織增生紅etr〇丨eMd fibropUsia)、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑部變 性、糖尿病性黃斑部水腫、角膜新血管生成(corneal ne〇VaSCUlariZati〇n)、角膜移植新血管生成、角膜移植排 150860.doc •25· 201124533 斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、隅角新血管生成（虹膜紅 變（rubeosis))、眼新血管病（ocuiar neovascular disease))、 血管再狹窄（vascular restenosis)、動靜脈畸形（arteri〇venous malformations ’ AVM)、脊膜瘤（meningi〇ma)、血管瘤、血 管纖維瘤（angiofibroma)、甲狀腺增生（包括格雷氏病 (Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎症、肺 炎症、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺循環血壓過 咼（primary pulmonary hypertension)、惡性肺積液 (malignant pulmonary effusion)、腦水腫（例如與急性中風/ 閉鎖性頭部損傷（closed head injury)/外傷相關）、滑液炎 症、RA中之血管翳形成（pannus formati〇n)、骨化性肌炎 (myositis ossificans)、肥大性骨形成（hypertr〇pic b〇ne formation)、骨關節炎（〇A)、難治癒之腹水症、多囊性印 巢疾病（polycystic ovarian disease)、子宮内膜異位症 (endometriosis)、第 3 間隔體液疾病（3m spacillg 〇f fiuid disease)(騰腺炎、隔室症候群（compartrnent Syndr〇me)、灼 傷、腸病）、子宮纖維瘤、早產、諸如IBD(克羅恩氏病 (Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎）之慢性炎症、腎同種異 體移植排斥、發炎性腸病、腎病症候群、不合需要或異常 組織大量生長（非癌）、嗜血性關節（hemophilic joint)、肥 厚性瘢痕（hypertrophic scar)、頭髮生長抑制、奥斯勒-韋 伯症候群（Osier-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體後 纖維組織增生（pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、 硬皮病（scleroderma)、沙眼、血管黏附（vascuiar adhesion)、 -26- 150860.doc 201124533 滑膜炎（synovitis)、皮炎、子癇前症（preeclampsia)、腹水 症、心包積液（pericardial effusion)(諸如與心包炎 (pericarditis)相關者）、及肋膜積液（pleural effusion)。 【實施方式】 在第一態樣中，本發明係關於包含D114結合組分及 VEGF結合組分之雙特異性結合分子。 根據較佳實施例，該D114結合組分及該VEGF結合組分 | 分別包含至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域及至少 ~~個V E G F結合免疫球蛋白单· 可變域。 在一較佳態樣中，該D114結合組分及該VEGF結合組分 各分別包含至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域及 至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域，其中該等免疫 球蛋白單一可變域各具有四個構架區及三個分別為 CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區，其中 a)該至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域之CDR3具 φ 有選自以下之胺基酸序列： i) 如 SEQ ID NO: 1 中所示之 Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr Xaa Tyr Asp Xaa，其中 位置8處之Xaa為Arg、Ala或Glu ; 位置11處之Xaa為Leu或Glu;及 位置14處之Xaa為Tyr或His;及 ii) 如 SEQ ID NO: 2 中所示之 Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala Tyr Xaa Asp Tyr，其中 Xaa為Gin、Ala或Tyr ;且其中 150860.doc -27- 201124533 b)該至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域之CDR3具 有如SEQ ID NCh 3中所示之胺基酸序列Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Xaa Tyr > 其中Xaa為Asp或Glu， 其中該VEGF結合免疫球蛋白單一可變域能夠以260%之 抑制率阻斷人類重組VEGF165與人類重組VEGFR-2的相 互作用。 根據較佳實施例，免疫球蛋白單一可變域為VHH。 在較佳實施例中，本發明雙特異性結合分子含有已藉由 視情況在親本免疫球蛋白單一可變域之親和力成熟之後進 行序列最佳化獲得的免疫球蛋白單一可變域，特定言之 VHH。 舉例而言，雙特異性結合分子中含有之D114結合分子已 自係為具有表5及SEQ ID NO: 4-20中所示胺基酸序列之 VHH的親本D114結合分子獲得。 D114結合組分中含有之較佳免疫球蛋白單一可變域係源 自具有展示於SEQ ID NO: 10中之胺基酸序列的VHH。 在某些實施例中，該等較佳D114結合免疫球蛋白單一可 變域已藉由對源自序列展示於SEQ ID NO: 10中之VHH的 親和力成熟VHH進行序列最佳化而獲得，其中該等親和力 成熟VHH具有展示於SEQ ID NO: 21-27及表16中之胺基酸 序列。 在一較佳實施例中，該親和力成熟VHH具有選自展示於 SEQ ID NO: 22中之序列的胺基酸序列。 150860.doc -28- 201124533 在較佳實施例中，VHH已藉由對胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 22中之VHH進行序列最佳化而獲得。較佳序列最 佳化VHH具有選自展示於SEQ ID NO: 34及35及表23中之 序列的胺基酸序列。 D114結合組分中含有之另一組較佳免疫球蛋白單一可變 域源自具有展示於SEQ ID NO: 12中之胺基酸序列的 VHH。 在某些實施例中，該等較佳D114結合免疫球蛋白單一可 變域已藉由對源自序列展示於SEQ ID NO: 12中之VHH的 親和力成熟VHH進行序列最佳化而獲得，其中該等親和力 成熟VHH具有展示於SEQ ID NO: 28-33及表17中之胺基酸 序列。 在一較佳實施例中，該親和力成熟VHH具有選自展示於 SEQ ID NO: 30、32及33中之序列的胺基酸序列。 在一甚至更佳實施例中，VHH已藉由對胺基酸序列展示 於SEQ ID NO: 32中之VHH進行序列最佳化而獲得。序列 最佳化VHH之實例為具有展示於SEQ ID NO: 36-39及表24 中之序列者，且特定較佳為具有展示於表25中之SEQ ID NO: 40及 41 者。 能夠以260%之抑制率阻斷人類重組VEGF165與人類重 組VEGFR-2之相互作用的VEGF結合免疫球蛋白單一可變 域之實例為展示於SEQ ID NO: 42-44及表32中的VHH。 較佳地，VEGF結合組分中含有之VEGF結合免疫球蛋白 單一可變域已藉由對胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 43中 150860.doc -29· 201124533 的VHH進行序列最佳化而獲得。較佳VHH具有如SEQ ID NO: 54-62中所示之序列，特定較佳受體阻斷VHH具有展 示於SEQ ID NO: 63及64及表59中之序列。 在另一實施例中，本發明係關於雙特異性結合分子，其 中D114結合組分及/或VEGF結合組分包含兩個或兩個以上 呈免疫球蛋白單一可變域形式之結合分子，其在各別抗原 上之不同非重疊抗原決定基處分別結合抗原D114或 VEGF。本發明雙特異性結合分子中含有之此等結合分子 包含針對分別存在於D114或VEGF中之至少兩個非重疊抗 原決定基的免疫球蛋白單一可變域，其中該等個別免疫球 蛋白單一可變域以能夠同時結合其各別抗原決定基之方式 彼此連接。 因此，本發明雙特異性結合分子中含有之抗D114及/或抗 VEGF組分可包括兩個（或兩個以上）抗D114(或抗VEGF，分 別地）免疫球蛋白單一可變域，其中該等免疫球蛋白單一 可變域係針對D114(或VEGF)標靶内之不同抗原決定基。因 此，雙特異性結合分子中之兩個免疫球蛋白單一可變域將 具有不同抗原特異性及因此不同之CDR序列。 因為兩個免疫球蛋白單一可變域將包括兩個不同互補 位，所以此等二價結合分子亦分別稱為「雙互補位單域抗 體構築體」（若免疫球蛋白單一可變域由或本質上由單域 抗體組成）或「雙互補位VHH構築體」（若免疫球蛋白單一 可變域由或本質上由VHH組成）。 在本發明雙特異性結合分子中，結合分子之一或兩者可 150860.doc -30- 201124533 為二價；例如VEGF結合組分可為雙互補位且D114結合組 分可為一個免疫球蛋白單一可變域，或VEGF結合組分可 為一個免疫球蛋白單一可變域且D114結合組分可為雙互補 位。 在本發明雙特異性結合分子中，VEGF結合組分較佳含 有二價VEGF結合免疫球蛋白單一可變域，例如雙互補位 VHH。 此VEGF結合免疫球蛋白單一可變域可為兩個或兩個以 上VEGF結合VHH，其為 a. 能夠以260%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類 VEGFR-2之間相互作用的相同VHH或 b. 結合VEGF之非重疊抗原決定基之不同VHH，其中至少 一個VHH能夠以>60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重 組人類VEGFR-2之間的相互作用且其中至少一個VHH能 夠以$60%之抑制率阻斷該相互作用。 能夠以$60%之抑制率阻斷該相互作用之VHH(「非受體 阻斷」VHH)的實例列於SEQ ID No: 45-47及表33中；此類 型較佳VHH具有展示於SEQ ID NO: 45中之序列。適合作 為用於人類治療之雙特異性結合分子中之組分的此類型 VHH為具有SEQ ID NO: 45中所示序列之VHH，特定言之 具有SEQ ID No: 65及66及表61中所示序列之VHH的序列 最佳化變異體，二價VEGF結合VHH中之特定較佳結合搭 配物具有展示於SEQ ID NO: 67(表63)中之序列。 二價抗VEGF VHH構築體例示於SEQ ID NO: 48-53及表 150860.doc -31 - 201124533 45中；用於人類治療之雙特異性結合分子含有此等VHH之 各別序列最佳化變異體。雙特異性結合分子例示於SEQ ID NO: 68-73(亦參見表66及圖39)及SEQ ID NO: 74-80(亦參見 表68及圖40)中；所示實例含有作為構建區段（blocks)之親 本VHH及親和力成熟VHH ;用於人類治療之雙特異性結合 分子含有此等VHH之各別序列最佳化變異體（如SEQ ID NO: 8 1-89及圖48中所例示）。 較佳本發明雙特異性結合分子包含 a) 序列選自SEQ ID NO: 35或41中之序列的VHH作為D114 結合組分，及 b) 以下作為VEGF結合組分 i)具有展示於SEQIDNO:64中之序列之VHH或 Π)包含序列展示於SEQ ID NO: 64中之VHH及序列展示 於SEQ ID NO·· 67中之VHH的雙互補位VHH。 根據較佳實施例，VEGF結合組分位於N-末端。 在以EVQ起始之本發明雙特異性結合分子中，VHH之N-末端E可經D置換（此常為序列最佳化之結果）或其可缺失 (就大腸桿菌（E.coli)中之表現而言）。此通常僅適用於位於 N-末端之VHH。圖48中給出化合物Al、A2及A3(SEQ ID NO: 8 1-83)之N-末端E缺失之雙特異性結合分子的實例。 根據較佳實施例，存在於雙特異性結合分子中之結合分 子（D114結合組分内之D114結合分子或VEGF結合組分内之 VEGF結合分子或兩種鄰接D114及VEGF結合組分）可彼此直 接（亦即不使用連接子）或經由連接子連接。連接子較佳為 150860.doc -32- 201124533 連接肽且將經選擇以允許兩個不同結合分子結合同一個標 乾分子内或兩個不同分子内之標乾之非重疊抗原決定基中 的每一者。 在雙互補位結合分子之情況下，£)114或¥£〇卩結合組分 内之連接子之選擇將尤其取決於抗原決定基且特定言之免 疫球蛋白單一可變域所結合標靶上之抗原決定基之間的距 離，且熟習此項技術者基於本文揭示内容’視情況在某些 有限程度之常規實驗之後將瞭解此選擇。 兩個結合分子（兩個VHH或域抗體，或VHH及一個域抗 體）或兩個結合組分可經由分別另一 VHH或域抗體而彼此 連接（在此等結合分子中，兩個或兩個以上免疫球蛋白單 一可變域可直接或經由適合連接子連接至該另一免疫球蛋 白單一可變域）。此另一 VHH或域抗體可例如為提供增加 之半农期的VHH或域抗體。舉例而言，後一 vhh或域抗體 可為能夠結合（人類）血清蛋白（諸如（人類）血清白蛋白）或 (人類）轉鐵蛋白（transferrin)之VHH或域抗體。 或者，結合各別標靶之兩個或兩個以上免疫球蛋白單一 可變域可（直接或經由適合連接子）串聯連接且另_vhh或 域抗體（其可提供增加之半衰期）可直接或經由連接子連接 至此等兩個或兩個以上上述免疫球蛋白序列之一。 在本文中關聯本發明特定多肽來描述適合連接子且可舉 例而言且不加限制地包含-胺基酸序列，該胺基醆序列: 度較佳為9個或9個以上胺基酸、更佳為至少17個胺基酸， 諸如約20至40個胺基酸。然而，上限不關鍵但係^關於 150860.doc -33- 201124533 例如此等多肽之生物醫藥生產之便利性的原因加以選擇。 連接序列可為天然存在序列或非天然存在序列。若用於 治療目的，則連接子較佳在投與本發明雙特異性緒合分子 之個體中為非免疫原性的。 一組適用連接序列為如WO 96/34103及WO 94/04678中 所述源自重鏈抗體鉸鏈區之連接子。 其他實例為聚丙胺酸連接序列，諸如Ala-Ala-Ala ° 連接序列之其他較佳實例為不同長度之Gly/Ser連接子’ 諸如（glyxsery)z 連接子，包括（gly4ser)3、（gly4ser)4、 (gly4ser)、（gly3ser)、gly3及（gly3ser2)3。 連接子之一些非限制性實例展示於圖40及48中’例如以 下連接子： GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35 GS ； SEQ ID NO: 90)； GGGGSGGGS(9GS ； SEQ ID NO: 91)； GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGS(40GS ; SEQ ID NO: 92)。 若雙特異性結合分子係藉由連接聚合物，例如聚乙二醇 PEG(聚乙二醇）部分來修飾，則連接序列較佳包括允許連 接區域中之此修飾（例如聚乙二醇化）之胺基酸殘基，諸如 半胱胺酸或離胺酸。 適用於聚乙二醇化之連接子之實例為： GGGGCGGGS(「GS9，C5」，SEQ ID NO: 93); GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS( 「GS25,C5」， 150860.doc -34· 201124533 SEQ ID NO: 94) GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG(「GS27，C14」 ，SEQ ID NO: 95)， GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (「GS35，C15」，SEQ ID NO: 96)，及 GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (「GS35，C5」，SEQ ID NO: 97)。 此外，連接子亦可為例如於WO 04/08 1026中所示之聚 ^ (L· ^ ° 在另一實施例中，免疫球蛋白單一可變域經由另一部分 (視情況經由一或兩個連接子），諸如另一多肽來彼此連 接，該另一多肽在一較佳但非限制性實施例中可為如上所 述之另一免疫球蛋白單一可變域。此部分可為本質上非活 性的或可具有諸如改良多肽之所要性質之生物效應或可賦 予多肽一或多種其他所要性質。舉例而言且不加限制，該 ^ 部分可改良蛋白質或多肽之半衰期，及/或可降低其免疫 原性或改良任何其他所要性質。 根據一較佳實施例，本發明雙特異性結合分子，尤其在 意欲使用或用作治療劑時，包括延長本發明多肽在患者血 清或其他體液中之半衰期的部分。術語「半衰期」定義為 (經修飾）多肽之血清濃度例如由於天然機制所致之多肽降 解及/或清除及/或螯合而活體内降低50%所花費之時間。 更特定言之，此半衰期延長部分可共價連接至或融合至 免疫球蛋白單一可變域且可為（不加限制）Fc部分、白蛋白 150860.doc -35- 201124533 部分、白蛋白片段部分、白蛋白結合部分（諸如抗白蛋白 免疫球蛋白單一可變域）、轉鐵蛋白結合部分（諸如抗轉鐵 蛋白免疫球蛋白單一可變域）、聚氧烧（polyoxyalkylene)* 子（諸如聚乙二醇分子）、白蛋白結合肽或羥乙基澱粉 (HES)衍生物。 在另一實施例中，本發明雙特異性結合分子包含結合存 在於血液中之抗原的部分，諸如血清白蛋白、jk清免疫球 蛋白、甲狀腺素結合蛋白、血纖維蛋白原（fibrinogen)或轉 鐵蛋白，藉此賦予所得本發明多肽增加之活體内半衰期。 根據一特定較佳實施例，此部分為白蛋白結合免疫球蛋白 且尤其較佳為白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域，諸如白 蛋白結合VHH域。 若意欲在人類中使用，則此白蛋白結合免疫球蛋白單一 可變域較佳結合人類血清白蛋白且較佳為人類化白蛋白結 合VHH域。 結合人類血清白蛋白之免疫球蛋白單一可變域在此項技 術中為已知的且進一步詳述於例如WO 2006/122786中。特 定言之，適用白蛋白結合VHH為ALB 1及其人類化對應物 ALB 8(WO 2009/095489)。然而，亦可使用在以上專利公 開案中提及之其他白蛋白結合VHH域。 特定適用之白蛋白結合VHH域為由展示於SEQ ID NO: 98中之胺基酸序列組成或含有該胺基酸序列的ALB8。 根據本發明之另一實施例，較佳呈VHH形式之兩個免疫 球蛋白單一可變域可融合至諸如描述於例如WO 01/79271 150860.doc -36- 201124533 及WO 03/59934中之血清白蛋白分子。如例如於WO 01/79271中所述，融合蛋白可經由以下習知重組技術獲 得：將編碼血清白蛋白或其片段之DNA分子接合至編碼 VEGF結合分子之DNA，將所得構築體插入適於在所選宿 主.細胞（例如酵母細胞（如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)) 或細菌細胞）中表現之質體中，接著用融合核苷酸序列轉 染宿主細胞且在合適條件下培養。適用HS A之序列展示於 SEQ ID NO: 99 中。 根據另一實施例，本發明多肽之半衰期延長修飾（此修 飾亦降低多肽之免疫原性）包含連接適合藥理學上可接受 之聚合物，諸如直鏈或分支鏈聚（乙二醇）(PEG)或其衍生 物（諸如曱氧基聚（乙二醇）或mPEG)。一般而言，可使用任 何適合形式之聚乙二醇化，諸如此項技術中用於抗體及抗 體片段（包括（但不限於）域抗體及scFv片段）的聚乙二醇 化；參考例如：Chapman，Nat. Biotechnol.，54，531-545 (2002) ; Veronese及Harris, Adv. Drug Deliv. Rev· 54，453-456 (2003) ; Harris 及 Chess，Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003) ;及 WO 04/060965。 用於使多肽聚乙二醇化之各種試劑亦為市售的，例如自 Nektar Therapeutics, USA 或 NOF Corporation, Japan購得， 該等試劑諸如Sunbright® EA系列、SH系列、MA系列、 CA 系列及 ME 系列，諸如 Sunbright® ME-100MA、 Sunbright® ME-200MA及 Sunbright® ME-400MA。 較佳使用特定言之經由半胱胺酸殘基之定點聚乙二醇化 150860.doc •37· 201124533 (參見例如 Yang 等人，Protein Engineering 16，761-770 (2003))。舉例而言，出於此目的，PEG可連接至天然存在 於本發明多肽中之半胱胺酸殘基，本發明多肽可經修飾以 便適當引入一或多個用於連接peg之半胱胺酸殘基，或包 含一或多個用於連接pEG之半胱胺酸殘基之胺基酸序列可 融合至本發明多肽之N-末端及/或C-末端，均使用對熟習 此項技術者而言本身已知之蛋白質工程之技術。 較佳地’對於本發明多肽，使用分子量在5 kDa以上， 諸如10 kDa以上且小於2〇〇 kDa，諸如小於1〇〇 kDa，例如 20 kDa至80 kDa範圍内之PEG。 關於聚乙一醇化，應注意一般而言，本發明亦涵蓋較佳 以如下方式已在一或多個胺基酸位置處經聚乙二醇化之任 何雙特異性結合分子：該聚乙二醇化（1)增加活體内半衰 期；（2)降低免疫原性；（3)提供為聚乙二醇化本身已知之 一或多種其他有益性質；（4)不本質上影響多肽對其標靶之 親和力（例如不使該親和力降低5〇%以上、且更佳不降低 10%以上），如經由此項技術中所述之適合檢定所測定；及/ 或（5)不影響本發明雙特異性結合分子之任何其他所要性 質。適合PEG群組及用於特異性或非特異性連接其之方法 將為熟習此項技術者所瞭解。用於使多肽聚乙二醇化之各 種試劑亦為市售的，例如自Nektar Therapeutics，USA或 NOF Corporation，Japan購得，該等試劑諸如⑧ EA系列、SH系列、ΜΑ系列、CA系列及ME系列，諸如 Sunbright® ME-IOOMA、Sunbright® ΜΕ·2〇〇ΜΑ 及 150860.doc -38· 201124533
Sunbright® ME-400MA ° 根據本發明之一尤其較佳實施例，本發明之聚乙二醇化 多肽包括一個具有40 kDa或60 kDa分子量之線性PEG的 PEG部分，其中該PEG部分在連接區域中，且特定言之在 如SEQ ID NO: 93中所示之GS9連接肽之位置5處、在如 SEQ ID NO: 95中所示之GS27連接肽之位置14處、或在如 SEQ ID NO: 96中所示之GS35連接肽之位置15處、或在如 SEQ ID NO: 97中所示之35GS連接肽之位置5處的Cys殘基 處連接至多肽。 如以下化學式中所示，本發明雙特異性結合分子可經如 上提及之PEG試劑之一，諸如「Sunbright® ME-400MA」 來聚乙二醇化：
CH^O—(CH2CH2qn—CH2CH2CH2NHC(CH2)2.N
含有連接子及/或半衰期延長官能基之雙特異性結合分 子展示於SEQIDNO:81及圖48中。 根據另一實施例，免疫球蛋白單一可變域為如本文所定 義之域抗體。 存在於本發明雙特異性結合分子中之免疫球蛋白單一可 變域的序列亦可對應於天然存在VH域已經「駱駝化」之 胺基酸序列，亦即藉由以一或多個存在於重鏈抗體VHH域 中相應位置處之胺基酸殘基置換習知4鏈抗體之天然存在 可變重鏈胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基。此可以熟 150860.doc •39· 201124533 習此項技術者所瞭解之本身已知的方式進行，且另外參考 WO 94/04678。此駱駝化可優先發生在存在於VH-VL界面 及所謂駱駝科印記殘基處的胺基酸位置處（亦例如參見W Ο 94/04678)。此等「人類化」及「駱駝化」技術及與此相符 之較佳構架區序列之詳述可另外自例如WO 2006/040153之 第46頁及第98頁及WO 2006/122786之第107頁獲得。 結合分子分別對D114或VEGF具有特異性，因為其包含 一或多個特異性結合分別D114分子内或VEGF分子内之一 或多個抗原決定基的免疫球蛋白單一可變域。 結合分子對其抗原D114或VEGF之特異性結合可以本身 已知之任何適合方式，包括例如本文所述之檢定、史卡查 分析及/或競爭性結合檢定（諸如放射免疫檢定（RIA)、酶免 疫檢定（EIA及ELISA)及夾心式競爭檢定）及此項技術中本 身已知之其不同變化形式來測定。 關於分別抗原D114或VEGF，免疫球蛋白單一可變域關 於物種不加限制。因此，若意欲用於人類中之治療目的， 則免疫球蛋白單一可變域較佳分別結合人類DU4或人類 VEGF。然而，分別結合另一哺乳動物物種之DU4或VEGF 之免疫球蛋白單一可變域、或含有其之多肽亦在本發明範 疇内。結合一個物種形式之D114或VEGF之免疫球蛋白單 一可變域可與一或多個其他物種之各別抗原交叉反應。舉 例而言，結合人類抗原之免疫球蛋白單一可變域可展現與 一或多個其他靈長類物種之各別抗原及/或與用於疾病動 物模型（且特定言之用於可藉由抑制D114而調節之疾病及病 150860.doc •40· 201124533 症之動物模型）中之一或多個動物物種（例如猴（特定言之獮 猴（Cynomolgus)或恆河猴（Rhesus))、小鼠、大鼠、兔、 豬、犬或）（諸如本文提及之物種及動物模型）之抗原的交又 反應性。展示此交叉反應性之本發明免疫球蛋白單一可變 域在研究及/或藥物研發中為有利的，因為其允許在公認 疾病模型（諸如猴（特定言之獼猴或恆河猴）、或小鼠及大 鼠）中對本發明免疫球蛋白單一可變域進行測試。 此外，結合分子不限於其所針對之抗原之特定域或抗原 決定子或不由其所針對之抗原之特定域或抗原決定子限 定。較佳地，鑒於與除人類以外之物種（其意欲在治療性 D114/VEGF拮抗劑之研發期間用作動物模型）之一或多種抗 原分子的交叉反應性，結合分子識別與人類抗原具有高度 一致性之各別抗原之區域中的抗原決定基。舉例而言，鑒 於使用小鼠模型’本發明雙特異性結合分子中含有之抗 D114免疫球蛋白單一可變域識別完全或部分位於DU4之 EGF-2域内的抗原決定基，該egF-2域在人類與小鼠之間 展示較高一致性。 因此’根據一較佳實施例，本發明雙特異性結合分子包 含D114結合分子，其為選自結合於在EGF-2域内完全或部 分含有之抗原決定基之群組的免疫球蛋白單一可變域，該 EGF-2域對應於SEQ ID NO: 101之胺基酸殘基252-282。 若本發明雙特異性結合分子含有包含一個以上免疫球蛋 白單一可變域之雙互補位D114結合分子，則至少一個免疫 球蛋白單一可變域組分結合如上文所定義之EGF-2域内的 150860.doc .41 - 201124533 抗原決定基。VEGF結合組分較佳結合VEGF同功異型物 VEGF165及/或 VEGF121。 較佳地，作為本發明雙特異性結合分子之組分之免疫球 蛋白單一可變域以小於500 nM、較佳小於2〇〇 nM、更佳小 於10 nM，諸如小於500 PM(如經由表面電漿子共振分析 (如實例5.7中所述）測定）之親和力分別結合DU4或VEGF。 較佳地，本發明雙特異性結合分子中含有之免疫球蛋白 單一可變域如競爭ELISA檢定（如實例5.丨中所述）中所測得 之ICw值在10-6至10七莫耳/公升或1〇·ιο莫耳/公升以下之範 圍内，更佳在10-8至ΙΟ」0莫耳/公升或1〇-ιο莫耳/公升以下之 範圍内、且甚至更佳在1〇-9至1〇-1〇莫耳/公升或1〇w莫耳/公 升以下之範圍内。 根據本發明之一非限制性但較佳實施例，本發明雙特異 性結合分子中含有之D114或VEGF結合免疫球蛋白單一可 變域以1(Τ5至10-丨2莫耳/公升（M)或1〇七莫耳/公升以下且 較佳1〇·7至10·12莫耳/公升（M)410w莫耳/公升以下且更 佳！0·8至10·12莫耳/公升（厘）或10-12莫耳/公升以下之解離常 數（KD)，及/或以至少1〇7 M•丨、較佳至少1〇8 M-1、更佳至 少109 M·1，諸如至少10丨2 Μ-ι之締合常數（Ka);且特定言 之以小於500 nM、較佳小於200 nM、更佳小於1〇 nM，諸 如小於500 pM之KD分別結合DII4或VEGF。可測定本發明 免疫球蛋白單一可變域針對DI14之KD及、值。 在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明雙特異性鲈八 分子之核酸分子。此等核酸分子在本文中亦將稱為「本發 I50860.doc -42· 201124533 明核酸」且亦可呈如本文定義之遺傳構築體形式。本發明 核酸可為基因feDNA、eDNA或合成dna(諸，如具有已特定 適於在預定宿主細胞或宿主有機體中表現之密碼子使用 (⑶d〇nusage)的DNA)。根據本發明之一實施例，本發明核 酉文呈如上定義之本質上經分離形式。 本發明核酸亦可呈載體形式、可存在於載體中及/或可 為載體之-部分，該載體諸如質體、黏質體或YAC。載體 • 可尤其為表現載體，亦即可提供D114結合分子活體外及/或 活體内（亦即在適合宿主細胞、宿主有機體及/或表現系統 中）表現之載體。此表現載體通常包含至少一種本發明核 酉文，其可操作地連接至一或多個適合調控元件（諸如啟動 子、增強子、終止子及其類似物）。此等元件及其鑒於特 疋序歹]在特疋伤主中之表現的選擇為熟習此項技術者之常 識。適用於表現本發明01丨4結合分子或為表現本發明DU4 L舍为子必需之調控元件及其他元件之特定實例諸如啟 鲁動子增強子、終止子、整合因子（integration factor)、選 擇標記物、前導序列、報導基因（reporter· gene)及其類似 物係揭示於例如WO 2006/040 153之第131至133頁。 本發明核酸可基於關於本文給出之本發明多肽之胺基酸 序列的資訊以本身已知之方式（例如經由自動DNA合成及/ 或重組DNA技術）製備或獲得’及/或可自適合天然來源加 以分離。 在另一態樣中’本發明係關於表現或能夠表現一或多種 本發明雙特異性結合分子及/或含有本發明核酸的宿主細 150860.doc • 43- 201124533 胞。根據一特定較佳實施例，該等宿主細胞為細菌細胞； 其他適用細胞為酵母細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。 適合細菌細胞包括革蘭氏陰性細菌菌株（諸如大腸桿菌 (五co/ί)菌株、變形桿菌屬（/Voiews)菌株及假單 胞菌屬（尸菌株）及革蘭氏陽性細菌菌株（諸如芽 抱桿菌屬菌株、鍵黴菌屬（iSirepiowyce·?)菌株、 葡萄球菌屬（57α尸菌株及乳球菌屬（Zacioeocrcws) 菌株）之細胞。適合真菌細胞包括木黴属（TWc/zoi/erma)、 紅黴菌屬（A^ewrc^pora)及麴菌屬之物種的細 胞。適合酵母細胞包括酵母屬（•SaceZ/aromyca)(例如酿酒酵 母(iSacc/zaromyce·? cereWhae))、裂殖酵母屬 (例如粟酒裂殖酵母（Sc/^zosizcc/zarow^yces _pow6e))、畢赤酵 母屬（Ρζ·<:/2ία)(例如巴斯德畢赤酵母/?<2ίίοΗ·5)及嗜甲 醇畢赤酵母（Pichia methanolica))反漢森酵母屬（ffansenuia) 之物種的細胞。 適合哺乳動物細胞包括例如CHO細胞、BHK細胞、海拉 細胞（HeLa cell)、COS細胞及其類似細胞。然而，亦可使 用兩栖類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及此項技術中用於表 現異源蛋白質之任何其他細胞。 本發明另外提供製造本發明雙特異性結合分子之方法， 此等方法通常包含以下步驟： -在允許表現本發明雙特異性結合分子之條件下培養包 含能夠編碼雙特異性結合分子之核酸的宿主細胞；及 -自培養物回收或分離由宿主細胞表現之多肽；及 201124533 _視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明雙特異性 結合分子。 對於工業規模生產而言，較佳宿主有機體包括適於大規 模表現、生產及醱酵，且特定言之適於大規模醫藥表現、 生產及醱酵之大腸桿菌菌株、巴斯德畢赤酵母菌株及釀酒 酵母菌株。 特定表現系統之選擇部分取決於某些轉譯後修飾，更特 定言之糖基化之要求。需要或要求糖基化之本發明雙特異 性結合分子的產生必需使用能夠使所表現蛋白質糖基化之 哺乳動物表現宿主。就此而言，熟習此項技術者將暸解所 獲得之糖基化樣式（亦即所連接殘基之種類、數目及位置） 將取決於用於表現之細胞或細胞株。 本發明雙特異性結合分子可在如上所述細胞中以細胞内 方式（例如在細胞溶質中、在胞外質（periplasma)中或在包 涵體（inclusion body)中）產生，接著自宿主細胞分離且視情 況進一步純化；或其可以細胞外方式（例如在培養宿主細 胞之培養基中）產生，接著自培養基分離且視情況進一步 純化。 用於重組產生多肽之方法及試劑，諸如特定適合表現載 體、轉型或轉染方法、選擇標記物、科蛋白質表現之方 法、培養條件及其類似物在此項技術中為已知的。類似 地’適用於製造本發明多肽之方法中之蛋白質分離及純化 技術為熟習此項技術者所熟知。 在另一態樣中，本發明係關於胺基酸序列選自分別展示 150860.doc •45- 201124533 於 SEQ ID NO: 1 至 166、SEQ ID NO: 333至 353、<SEq ID NO. 375至395中之胺基酸序列的狀，及編瑪該狀之核酸分 子。 此等肽對應於源自本發明VHH之CDR3。其，特定言之 編碼其之核酸分子’適用於CDR接枝以置換免疫球蛋白鍵 中之CDR3 ’或適用於插入非免疫球蛋白骨架，例如蛋白 酶抑制劑、DNA結合蛋白、細胞色素b562、螺旋束蛋白 質、一硫橋式狀（disulfide-bridged peptide)、脂質運載蛋 白（lipocalin)或抗運載蛋白（antiCalin)中，從而賦予此骨架 乾結合性質。CDR接枝方法在此項技術中為熟知的且已廣 泛使用’例如用於使抗體人類化（此通常包含將齧齒動物 抗體之CDR接枝在人類抗體之Fv構架上）。 為了獲得含有本發明CDR3之免疫球蛋白或非免疫球蛋 白骨架’可根據如例如由Daugherty等人，1991, Nucleic Acids Research，第19卷，9，2471-2476所述之分子生物學 標準方法，例如藉由基因合成、藉由寡核苷酸黏接或藉助 於重疊PCR片段來獲得編碼此分子之DNA。將VHH CDR3 插入非免疫球蛋白骨架t之方法已由Nicaise等人，2004,
Protein Science, 13，1882-1891描述。 本發明另外係關於一種產物或組合物，其含有或包含至 少一種本發明雙特異性結合分子及視情況可選的此等組合 物之本身已知的一或多種其他組分’亦即視組合物之預定 用途而定。 對於醫藥用途而言’本發明雙特異性結合分子或含有本 150860.doc -46· 201124533
=寺異性結合分子之多肽可調配成醫藥製劑或組合 醫華=含至少—種本發明雙特異性結合分子及至少一種 :、-可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及/或佐劑及視 ’月況可選之-或多種其他醫藥活性多肽及/或化合物。藉 助於^限制性實例，此類調配物可呈適於口服投藥、非經 腸投藥（諸如藉由靜脈内、⑽肉内或皮下注射或靜脈内輸 注：局部投藥、藉由吸入、皮膚貼片、植入物、栓劑等 技藥的形式。視投藥方式而定可為固體、半固體或液體之 此等適合投藥形式以及用於製備其之方法及載劑將為熟習 此項技術者所瞭解且進一步在本文中加以描述。 因此，在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物， 其含有至少一種雙特異性結合分子，特定言之一種本發明 免疫球蛋白單一可變域或含有該免疫球蛋白單一可變域之 多肽，及至少一種適合載劑、稀釋劑或賦形劑（亦即適於 醫樂用途）及視情況一或多種其他活性物質。 本發明雙特異性結合分子可以本身已知之任何適合方式 調配及投與·特定言之對於免疫球蛋白單一可變域，例如
參考 WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867及WO 08/020079，以及標準手冊，諸如 Remington's Pharmaceutical Sciences,第 18 版.，Mack
Publishing Company, USA (1990) ； Remington, the Science and Practice of Pharmacy,第 21 版，Lippincott Williams and
Wilkins (2005)；或 the Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel編），Wiley，Weinheim，2007(參見例如第 252-255 150860.doc •47- 201124533 頁）。 舉例而言’本發明免疫球蛋白單—可變域可以用於習知 抗體及抗體片段（包括SeFv片段及微型雙功能抗體）及其他 醫樂活性蛋白質之本身已知的任何方式調配及投與。此等 調配物及製備此等調配物之方法將為熟習此項技術者所瞭 解，且例如包括適於非經腸投藥（例如靜脈内、腹膜内、 皮下、肌肉内、腔内（intraluminal)、動脈内或鞘内 (intrathecal)投藥）或局部（亦即經皮或皮内）投藥之製劑。 用於非經腸投藥之製劑可例如為適於輸注或注射之滅菌 溶液、懸洋液、分散液或乳液。適用於此等製劑之載劑或 稀釋劑，例如包括（不加限制）滅菌水及醫藥學上可接受之 水性緩衝液及溶液，諸如生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶 液（Rmger’s solution)、右旋糖溶液及漢克氏溶液（Hank s solution);含水油；甘油；乙醇；諸如丙二醇之二醇或以 及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油，以及 其適合混合物。水性溶液或懸浮液通常將較佳。 因此，本發明雙特異性結合分子可組合醫藥學上可接受 之媒劑（諸如惰性稀釋劑或可吸收食用載劑）而全身投與（例 如經口投與）。對於口服治療性投藥而言，可將本發明雙 特異性結合分子與一或多種賦形劑組合且以可攝取錠劑、 口腔錠、片劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片及其 類似物之形式使用。此等組合物及製劑應含有至少〇1%之 本發明雙特異性結合分子。其在組合物及製劑中之百分比 當然可變化且宜介於既定單位劑型重量的約2%與約6〇%之 150860.doc •48· 201124533 間。本發明雙特異性結合分子在此等治療上㈣ 中之量為將獲得有效劑量濃度的量。 °物 錠劑、丸劑、膠囊劑及其類似物亦可含有黏合 劑、崩解劑1滑劑及甜味劑或調味劑，；
:謂9之第143·144頁上提及者。當單位劑型為膠^ 時’其m類型之物質外亦可含有液體載劑諸 油或聚乙二醇。可存在各種其他物f料包衣或另外 固體單位劑型之外形。舉例而言，錠劑、丸劑或膠囊劑 經明朦、壤、蟲膠（shellac)或糖及其類似物包覆。糖 配劑可含有本發明雙特異性結合分子、蔗糖或果糖作為二 味劑、對經基笨甲酸甲醋及對經基苯甲酸丙醋作為防腐 劑、色素及調味劑，諸如櫻桃或橙香料。當然，在製備任 何單位劑型中使用之任何物質皆應為醫藥學上可接受且在 所用量下實質上無毒。此外，本發明雙特異性結合分子可 併入持續釋放製劑及裝置中。 用於口服投藥之製劑及調配物亦可具有將使本發明構築 體抵抗胃環境且進入腸中的腸溶包衣。更一般而言，用於 口服技藥之製劑及調配物可經適當調配以傳遞進入胃腸道 之任何所要部分中。此外，適合栓劑可用於傳遞進入胃腸 道中。 如WO 〇8/020079第144及145頁上所進一步描述，本發明 雙特異性結合分子亦可藉由輸注或注射而經靜脈内或腹膜 内投與。
對於本發明雙特異性結合分子之局部投藥而言，如WO 150860.doc •49- 201124533 08/020079第145頁上所進一步描述，將一般需要將其與皮 膚學上可接受之載劑（其可為固體或液體）組合而以組合物 或調配物形式投與皮膚。 一般而言，本發明雙特異性結合分子在液體組合物（諸 如洗劑）中之濃度將為約〇·1-25重量％、較佳約0.5-10重量 %。在半固體或固體組合物（諸如凝膠或粉末）中之濃度將 為約0.1-5重量％、較佳約0 5-2.5重量0/〇。 本發明雙特異性結合分子的治療使用所需量將不僅隨所 選特定雙特異性結合分子，而且亦隨投藥途徑、所治療病 狀特性及患者年齡及狀況而變化且將最終任憑巡診醫師或 臨床醫師處理。此外，本發明雙特異性結合分子之劑量視 無細胞、腫瘤、組織、移植物或器官而變化。 所要劑量宜呈現為單次劑量或在適當間隔下投與之分次 劑里，例如呈母天兩次、三次、四次或四次以上之次劑量 /式人劑置自身可經進一步劃分，例如分成大量個別鬆 散間隔之投藥；諸如來自吹藥器（insufflat〇r)之多個吸入劑 或藉由對眼中施用複數個滴劑。 投藥方案可包括長期每曰治療。「長期」意謂持續時間 至少兩週且較佳數週、數月或數年。此劑量範圍之必要修 改可由一般技術者僅使用本文教示中給出之常規實驗來確 疋。參見 Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin E-w.第 4版），Mack Publishing Co” Easton，PA。倘若發生任 何併發症’則劑量亦可由個別醫師來調整。 根據另一實施例，本發明係關於雙特異性結合分子，例 150860.doc -50- 201124533 如免疫球蛋白單-可變域或含有其之多肽之用途，其用於 治療目的，諸如 、 用於預防、治療及/或減輕尤其人類中與训4對血管生成 之介導效應相關或可藉由以刪結合分子調節洛奇信號 傳導路徑來預防、治療或減輕之病症、疾病或病狀， -在-治療需要此治療之患者的方法中，此方法包含投與 =需要之個體醫藥活性量之至少—種本發明雙特異性結 • ♦分子（例如免疫球蛋白單一可變域）或含有該本發明雙 特異性結合分子之醫藥組合物； 用於製備預防、治療或減輕與DU4對血管生成之介導效 應相關之病症、疾病或病狀的藥劑； 作為用於以上目的之醫藥組合物或藥劑中之活性成分。 根據—特定態樣’該病症、疾病或病狀為如本文定義之 癌症或癌性疾病。 根據2—態樣，疾病為與D114對血管生成之介導效應相 鲁 Μ或可精由以D114結合分子調節洛奇信號傳導路徑來治療 或減輕的眼病。 。。見欲^療之癌性疾病而定，本發明雙特異性結合分子可 單獨或組合一或多種特定言之選自以下之其他治療劑加以 使用： 士化學治療劑（如DNA損傷劑）或抑制血管生成、癌細胞中 虎轉導路径或有絲分裂檢查點（mitotic checkpoint)之治 療活性化合物。 。療劑可視情況作為同一醫藥製劑之組分與雙特異 150860.doc 201124533 性結合分子之投藥同時投與、或在雙特異性結合分子之投 藥之前或之後投與。 在某些實施例中，另一治療劑可為（不加限制，且在包 括各別配位體之受體情況下）一或多種選自以下之抑制劑 之群的抑制劑：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、 AuroraA、AuroraB、PLK 及 PI3 激酶、FGFR、PDGFR、 Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或 IR。 其他治療劑之其他實例為CDK、Akt、src/bcr abl、 cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90之抑制劑；刺蜎拮 抗劑（hedgehog antagonist) ; JAK/STAT、Mek、mTor、 NFkappaB、蛋白酶體（proteasome)、Rho之抑制劑；wnt信 號傳導之抑制劑或泛素化（ubiquitination)路徑之抑制劑或 洛奇信號傳導路徑之另一抑制劑。 極光抑制劑之實例為（不加限制）PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX_680、VX-667、 MLN-8045、PF-3814735。 PLK抑制劑之一實例為GSK-461364。 raf抑制劑之實例為BAY-73-4506(亦為VEGFR抑制劑）、 PLX 4032、RAF-265(此外亦為VEGFR抑制劑）、索拉非尼 (sorafenib)(此外亦為VEGFR抑制劑）及XL 281。 KSP抑制劑之實例為伊斯平斯（ispinesib)、ARRY-520、 AZD-4877 ' CK-1122697 ' GSK 246053A、GSK-923295、 MK-0731 及 SB-743921。 src及/或bcr-abl抑制劑之實例為達沙替尼（dasatinib)、 150860.doc -52- 201124533 AZD-0530、博舒替尼（bosutinib)、XL 228(亦為 IGF-1R抑 制劑）、尼洛替尼（nilotinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑）、 伊馬替尼（imatinib)(亦為cKit抑制劑）及NS-187。 PDK1抑制劑之一實例為BX-5 1 7。
Rho抑制劑之一實例為BA-2 1 0。 PI3激酶抑制劑之實例為PX-866、BEZ-235(亦為mTor抑 制劑）、乂1^418(亦為八1^抑制劑）、又1^147及乂1^ 765(亦為 mTor抑制劑）。 cMet或HGF之抑制劑之實例為XL-1 84(亦為VEGFR、 cKit、Flt3 之抑制劑）、PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦 為 VEGFR之抑制劑）、MGCD-265(亦為 VEGFR、Ron、Tie2 之抑制劑）、SU-11274、PHA-665752、AMG-102 及 AV-299。 c-Myc抑制劑之一實例為CX-3543。
Flt3抑制劑之實例為AC-220(亦為cKit及PDGFR之抑制 劑）、KW 2449、來妥替尼（lestaurtinib)(亦為 VEGFR、 PDGFR、PKC之抑制劑）、TG-101348(亦為JAK2之抑制 劑）、XL-999(亦為 cKit、FGFR、PDGFR及 VEGFR之抑制 劑）、舒尼替尼（sunitinib)(亦為PDGFR、VEGFR及cKit之抑 制劑）及坦度替尼（tandutinib)(亦為PDGFR及cKit之抑制 劑）。 HSP90抑制劑之實例為坦螺旋黴素（tanespimycin)、阿螺 旋黴素（alvespimycin)、IPI-504 及 CNF 2024。 JAK/STAT抑制劑之實例為CYT-997(亦與微管蛋白相互 150860.doc -53- 201124533 作用）、丁〇 101348(亦為？^3之抑制劑）及又卜019»
Mek抑制劑之實例為 ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及 XL 518。 mTor抑制劑之實例為特癌適（temsirolimus)、AP-23573 (其亦充當VEGF抑制劑）、依維莫司（everolimus)(此外亦為 VEGF抑制劑）、XL-765(亦為PI3激酶抑制劑）及BEZ-235(亦 為PI3激酶抑制劑）。
Akt抑制劑之實例為派瑞福松（perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱（triciribine) 〇 cKit抑制劑之實例為AB-1010、OSI-930(亦充當VEGFR 抑制劑）、AO220(亦為Flt3及PDGFR之抑制劑）、坦度替尼 (亦為Flt3及PDGFR之抑制劑）、阿西替尼（亦為VEGFR及 PDGFR之私p 制劑）、XL-999(亦為 Flt3、PDGFR、VEGFR、 FGFR之抑制劑）、舒尼替尼（亦為Flt3、PDGFR、VEGFR之 抑制劑）、及XL-820(亦充當VEGFR及PDGFR抑制劑）、伊 馬替尼（亦為bcr-abl抑制劑）、尼洛替尼（亦為bcr-abl及 PDGFR之抑制劑）。 刺蜎拮抗劑之實例為IPI-609及CUR-61414。 CDK抑制劑之實例為塞來昔布（seliciclib)、AT-75 19、P-276、ZK-CDK(亦抑制 VEGFR2 APDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及 AG 024322 ° 蛋白酶體抑制劑之實例為删替佐米（bortezomib)、卡菲 佐米（carfilzomib)及 NPI-0052(亦為 NFkappaB之抑制劑）。 NFkappaB路徑抑制劑之一實例為NPI-0052。 150860.doc -54- 201124533 泛素化路徑抑制劑之一實例為HBX-41108。 在較佳實施例中，另一治療劑可為抗血管生成劑。 抗血管生成劑之實例為FGFR、PDGFR及VEGFR或各別 配位體之抑制劑（例如VEGF抑制劑，如略加他尼 (pegaptanib)或抗VEGF抗體貝伐單抗（bevacizumab))及沙立 度胺（thalidomide)，此等藥劑係選自（不加限制）貝伐單 抗、莫替沙尼（motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替 尼（telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(亦為 CDK之抑制劑）、 ABT-869 ' BMS-6905 14 ' RAF-265 ' IMC-KDR ' IMC-18F1、IMiD(免疫調節藥物）、沙立度胺衍生物CC-4047、 來那度胺（lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、布里瓦尼（brivanib)、西地尼布（cediranib)、XL-999(亦為 cKit 及 Flt3 之抑制劑）、1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-15 30(亦為Flt3之抑制劑）、舒尼替尼（亦為cKit及 Flt3之抑制劑）、阿西替尼（亦為cKit之抑制劑）、來妥替尼 (亦為Flt3及PKC之抑制劑）、凡塔藍尼（vatalanib)、坦度替 尼（亦為Flt3及cKit之抑制劑）、帕嗤帕尼（pazopanib) ' GW 786034 ' PF-337210 ' IMC-1121B ' AVE-0005 ' AG- 13736、E-7080、CHIR 258、曱笨磺酸索拉非尼（sorafenib tosylate)(亦為Raf之抑制劑）' RAF-265(亦為Raf之抑制 劑）、範得它尼（vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(亦為EGFR及Her2之抑制劑）、BAY-57-9352(亦為Raf之 抑制劑）、BAY-73-4506(亦為Raf之抑制劑）、XL 880(亦為 cMet之抑制劑）、XL-647(亦為EGFR及EphB4之抑制劑）、 150860.doc -55- 201124533 XL 820(亦為cKit之抑制劑）及尼洛替尼（亦為cKit及brc-abl 之抑制劑）。 另一治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR 抑制劑或抗EGFR抗體。抗EGFR抗體之實例（不加限制）為 西妥昔單抗（cetuximab)、帕尼單抗（panitumumab)、馬妥珠 單抗（matuzumab);小分子EGFR抑制劑之一實例為吉非替 尼（gefitinib)。EGFR調節劑之另一實例為EGF融合毒素。 尤其適用於與本發明雙特異性結合分子組合之EGFR及 Her2抑制劑為拉帕替尼（lapatinib)、吉非替尼、埃羅替尼 (erlotinib)、西妥昔單抗（cetuximab)、曲妥.珠單抗 (trastuzumab)、尼妥珠單抗（nimotuzumab)、紫魯木單抗 (zalutumumab)、範得它尼（亦為VEGFR之抑制劑）、帕妥珠 單抗（pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、 ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦為 VEGFR 之抑制劑）、人1^丫-333786、IMC-11F8、Zemab。 宜在治療中與本發明雙特異性結合分子組合之其他藥劑 為替坦托西莫單抗（tositumumab tiuxetan)及替坦異貝莫單 抗（ibritumomab tiuxetan)(兩種放射性標記抗CD20抗體）、 阿萊珠單抗（alemtuzumab)(—種抗CD52抗體）、狄諾塞單抗 (denosumab)(—種破骨細胞分化因子配位體抑制劑）、加利 昔單抗（galiximab)(—種CD80拮抗劑）、奥法木單抗 (ofatumumab)(—種 CD20抑制劑）、紫木單抗（zanolimumab) (一種CD4拮抗劑）、SGN40( —種CD40配位體受體調節 150860.doc -56- 201124533 劑）、利妥昔單抗（rituximab)(—種CD20抑制劑）或馬帕木單 抗（mapatumumab)(—種 TRAIL-1 受體促效劑）。 了與本發明雙特異性結合分子組合使用之其他化學治療 藥物選自（但不限於）激素、激素類似物及抗激素藥（例如他 莫昔务（tamoxifen)、托瑞米芬（t〇remifene)、雷謹昔紛 (raloxifene)、氟維司群（fuivestrant)、乙酸甲地孕酮 (megestrol acetate)、氟他胺（fiutamide)、尼魯胺（niiutamide)、
比卡魯胺（bicalutamide)、乙酸環妊酮（cyproterone acetate)、非那雄安（Hnasteride)、乙酸布舍瑞林（busereiin acetate)、氟氫可的松（fludrocortisone)、敗曱睾酮 (fluoxymesterone)、甲經助孕 _(medroxyprogesterone)、奥 曲肽（octreotide)、阿佐昔芬（arzoxifene)、帕瑞狀 (pasireotide)、伐普肽（vapreotide));芳香酶抑制劑（例如安 美達旋（anastrozole)、來曲口坐（letrozole)、利阿唾 (liarozole)、依西美坦（exemestane)、阿他美坦 (atamestane)、福美司坦（formestane)) ; LHRH促效劑及拮 抗劑（例如乙酸戈舍瑞林（goserelin acetate)、亮丙立德 (leuprolide)、阿巴瑞克（abarelix)、西曲瑞克（cetrorelix)、 地洛瑞林（deslorelin)、組胺瑞林（histrelin)、曲普瑞林 (triptorelin));抗代謝物（例如抗葉酸物（如曱胺喋呤 (methotrexate)、培美曲唾（pemetrexed))、癌咬類似物（如 5-氟尿D密咬、卡培他濱（capecitabine)、地西他濱 (decitabine)、奈拉濱（nelarabine)、及吉西他濱 (gemcitabine))、嘌吟及腺苷類似物（諸如疏基嘌呤、硫鳥 150860.doc -57- 201124533 11票吟、克拉屈濱（cladribine)及喷司他汀（pentostatin)、阿 糖胞苦（cytarabine)、敗達拉濱（fludarabine)));抗腫瘤抗 生素（例如蒽環黴素（anthracycline)(如小紅每 (doxorubicin)、道諾黴素（daunorubicin)、表柔比星 (epirubicin)及黃膽素（idarubicin))、絲裂黴素-C (mitomycin-C)、博萊黴素（bleomycin)、放線菌素 D(dactinomycin) ' 普卡黴素（plicamycin)、米托蒽醌 (mitoxantrone)、匹克生瓊（pixantrone)、鏈佐星 (streptozocin));鉑衍生物（例如順鉑（ciSplatin)、奥赛力鉑 (oxaliplatin)、卡鉑（carboplatin)、洛鉑（lobaplatin)、撒塔 鉑（satraplatin));烷基化劑（例如雌莫司汀（estramustine)、 氮芥（meclorethamine)、美法侖（melphalan)、苯丁 酸氮芬 (chlorambucil)、馬利蘭（busulphan)、達卡巴嗓 (dacarbazine)、環填酿胺（cyclophosphamide)、異環碳酿胺 (ifosfamide)、經基脲（hydroxyurea)、替莫 β坐胺 (temozolomide)、亞硝基脲（nitrosourea)(諸如卡莫司汀 (carmustine)及洛莫司汀（lomustine))、塞替派（thiotepa)); 抗有絲分裂劑（例如長春花驗（vinca alkaloids)，如長春驗 (vinblastine)、長春地辛（vindesine)、長春瑞賓 (vinorelbine)、長春氣寧（vinHunine)及長春新鹼 (vincristine)； 及紫杉烧（taxane)，如太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、歐洲紫杉醇（docetaxel)及其調配物、拉諾紫 杉醇（larotaxel)、司莫紫杉醇（simotaxel);及埃坡黴素 (epothilone)，如伊沙匹隆（ixabepilone)、帕 土匹隆 150860.doc • 58 - 201124533 (patupilone)、ΖΚ-ΕΡΟ);拓撲異構酶抑制劑（例如表鬼臼 素（epipodophyllotoxin)(如依託泊皆（et〇p〇side)及凡畢複 (etopophos)、替尼泊皆（teniposide))、安0丫咬（amsacrine)、 拓朴替康（topotecan)、伊立替康（irinotecan))及雜項化學治 療樂物’遠如胺碟〉丁（amifostine)、阿那格雷（anagrelide)、 干擾素α、丙卡巴肼（procarbazine)、米托坦（mitotane)、及 口卜吩姆（porfimer)、貝瑟羅ί丁（bexarotene)、塞内昔布 (celecoxib) ° 可視相關特定疾病或病症而定使用本身已知之任何適合 活體外檢定、基於細胞之檢定、活體内檢定及/或動物模 型或其任何組合來測試本發明雙特異性結合分子或含有其 之多肽、及包含本發明雙特異性結合分子之組合物的功 效。適合檢定及動物模型將為熟習此項技術者所瞭解且例 如包括本文所述且用於以下實例中之檢定，例如增殖檢 定。 材料及方法 a)過度表現人類、小鼠及獼猴D114之CHO及HEK293細胞株 之產生 使用按照相應序列之5'及3' UTR設計之寡核苷酸分別自 人類成人正常組織心臟cDNA文庫（BioChain, Hayward，CA， USA)及小鼠心臟組織cDNA文庫（分離自C57/B16品系）擴增 編碼人類（SEQ ID NO: 101 ； NM—019074.2)及小鼠 D114(NM_019454.3)之cDNA。將擴增子選殖入哺乳動物表 現載體pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA) 150860.doc •59- 201124533 中。 使用針對密切相關物種恆河猴（恆河獼猴（Macaca mulatta)D114，SEQ ID NO: 102 ; XM_001099250.1)之D114 編碼序列之5'及3' UTR設計的引子，自獼猴正常組織心臟 cDNA 文庫（BioChain，Hayward，CA，USA)擴增獼狼 D114 cDNA(參見圖1)〇最終擴增子選殖於哺乳動物表現載體 pCDNA3.1( + )-neo(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。顯 示獼猴D114之胺基酸序列與恆河猴100%—致且與人類99% 一致（參見圖1 ;與人類序列之差異經指示為粗體加下劃 線）。 為了產生過度表現人類D114、小鼠D114或獼猴DU4之中 國倉鼠卵巢（CHO)細胞，分別用pCDNA3.1(+)-neo-hD114、 pcDNA3.1(+)-neo-mD114 或 pcDNA3.1(+)-neo-cD114 對親本 CHO細胞進行電穿孔。過度表現人類D114及小鼠D114之人 類胎腎（HEK293)細胞係藉由分別使用pCDNA3.1(+)-neo-hD114質體或pCDNA3.1(+)-neo-mD114 質體之Fugene(Roche) 於HEK293親本細胞株中進行脂質介導之轉染來產生。對 於所有條件，轉染子皆係藉由添加1 mg/mL遺傳黴素 (geneticin)(Invitrogen，Carlsbad CA，USA)來選擇0 b)單株抗D114 IgG及Fab片段之產生 在US 2008/0014196(Genentech)中，描述 了人類/小鼠交 叉反應性D114 mAb，其由Ridgway等人（2006)使用以展示 大量異種移植模型中VEGF mAb及D114 mAb對腫瘤生長之 累加效應。將此抗D114 mAb及其相應Fab純化以在生物化 150860.doc -60· 201124533 學/細胞檢定及異種移植模型中針對噬菌體選擇期間之特 異性溶離來評估此抗體（片段）性質。將D114 mAb之公開之 可變重鏈及輕鏈序列選殖入hIgG2aK構架中，在HEK293細 胞中短暫表現且使用蛋白A層析法自上清液純化。純化 0114 111八1^在£[18入及[八€8(使用（：110-111〇114及(：110-11〇114細 胞）中展示對人類D114及小鼠D114之結合，在Biacore中展示 對兩種生長因子直系同源物（orthologue)之低於奈莫耳的親 和力。 相應D114 Fab片段係經由基於回轉譯（back-translation)及 使用Leto's基因最佳化軟體（www.entechelon.com)針對大腸 桿菌中之表現之密碼子最佳化的基因組裝來構築。設計用 於組裝可變輕鏈（VL)、可變重鏈（VH)、恆定輕鏈（CL)及重 鏈（CH1)之恆定域1之寡核苷酸引子且進行組裝PCR。分別 使用限制位點5力7及Ac/及限制位點尺;7«/及將編碼 VL+CL及VH+CHi之cDNA區段選殖入源自PUC119之載體 中，該載體含有LacZ啟動子、康黴素（kanamycin)抗性基 因、多重選殖位點及雜交glll-pelB前導序列。表現載體編 碼與Fab編碼序列同框之C-末端HA及His6標籤。Fab片段 在大腸桿菌中表現為標記His6之蛋白質，隨後經由固定金 屬親和力層析法（IMAC)及尺寸排阻層析法（SEC)自培養基 純化。描述了可變重鏈及可變輕鏈之相關胺基酸序列（分 別為 US 2008/0014196之 SEQ ID NO: 1 及 SEQ ID NO: 2); 完全重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO: 419 及420中。 150860.doc -61 - 201124533 C)用於抗原決定基定位之DU4突變體之產生 為了鑑別D114之細胞外域（ECD)中包含可由抗D114 VHH 識別之抗原決定基的區域，產生D114 ECD之漸進缺失突變 體。使用標準重組DNA技術產生包含CMV啟動子的哺乳動 物表現載體 pSecTag2/Hygro(Invitrogen ’ Carlsbad，CA， USA)，該啟動子位於編碼融合至聚His標籤之D114 ECD之 一系列巢式缺失片段的聚核苷酸上游（參見圖2 ;上標中為 胺基酸域邊界）。使用Freestyle 293表現系統（Invitrogen， Carlsbad，CA，US A)(可自其收集條件培養基）在經短暫轉染 之HEK293細胞中表現此等重組蛋白質且經由IMAC純化。 僅有缺乏EGF2樣域之D114突變體展示對上述人類化人類/ 小鼠交叉反應性抗DIM mAb(經由捕捉型抗人類IgG塗佈的 Biacore感測器晶片來固定）之減弱結合。已知此IgG在此 D114域中具有特異性結合抗原決定基（專利申請案 Genentech，US 2008/0014196A1)。 d)DU4報導檢定質體之產生 基本上如 Struhl 及 Adachi, Cell. 1998年 5 月 15;93(4):649-60所述，基於Notchl之γ分泌酵素介導之裂解及D114刺激後 Notchl細胞内域（NICD)之核易位來開發報導檢定。 Gal4/VP16編碼序列插入NICD編碼序列中。由融合至單純 疱疹病毒轉錄活化域VP16之酵母GAL4 DNA結合片段組成 之有效雜交轉錄活化劑GAL4-VP16插入Notchl跨膜域之羧 基末端。γ分泌酵素裂解此構築體會釋放Gal4/VP16 NICD 融合蛋白，其將易位至核，在核中該融合蛋白將結合至且 150860.doc -62- 201124533 以轉錄方式活化含有強力GAL4-UAS啟動子序列之共轉染 的螢光素酶報導質體（Struhl，G.及Adachi，A.，Cell,第93 卷，649-660，1998)。人類Notchl-Gal4/VP16表現卡匣選殖 於 pcDNA3 · 1 (+)-neo(Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)中。 pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]載體（Promega，Madison, WI, US A)用作螢光素酶報導質體。 e) VEGF109之產生及功能性測試 將編碼人類血管内皮生長因子同功異型物VEGF 165之受 體結合域之cDNA(GenBank: AAM03 108.1 ; AA 殘基 27-135)選殖入pET28a載體（Novagen，Madison, WI)中且在大腸 桿菌（BL21 Star DE3)中過度表現為標記His之不溶性蛋 白。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現且使其在37°C下繼續 4小時。離心收集細胞且藉由音波處理細胞集結粒使細胞 溶解。離心分離包涵體。在使用1%曲力通X l〇〇(Triton X 100)(Sigma-Aldrich)之洗務步驟之後，蛋白質使用7.5 Μ鹽 酸胍來溶解且使用自6 Μ遞減直至0 Μ尿素濃度之緩衝液藉 由連續多輪隔夜透析來再摺疊。藉由使用MonoQ5/50GL (Amersham BioSciences)管柱之離子交換層析，隨後以
Superdex75 10/300 GL管柱（Amersheim BioSciences)進行凝 膠過濾來純化再摺疊蛋白質。蛋白質純度及均質性由SDS-PAGE及西方墨點法（Westen blot)予以確認。此外’由 ELISA監測對VEGFR1、VEGFR2及貝伐單抗之結合活性。 為此，1 pg/mL重組人類\^〇卩109在4。(：下於96孔河3乂丨3〇卬 培養盤（Nunc，Wiesbaden，Germany)中固定隔夜。用酷蛋白 150860.doc -63- 201124533 溶液（1%)阻斷各孔。將VEGFRl、VEGFR2或貝伐單抗之 連續稀釋液添加至VEGF109塗佈培養盤中且使用鹼性磷酸 酯酶（AP)接合之山羊抗人類IgG(Fc特異性）(jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) 及隨後在受質PNPP(對硝苯磷酸）（Sigma-Aldrich)存在下之 酶促反應來偵測結合。VEGF109可結合VEGFRl、VEGFR2 及Bevacizumab，從而指示產生之VEGF 109具有活性。 f)VEGF165之KLH接合及KLH接合之VEGF165之功能性測試 根據製造商說明書，使用含有mcKLH之Imj ect免疫原 EDC 套組（Pierce，Rockford，IL，USA)將重組人類 VEGF165(R&D Systems，Minneapolis, MN, USA)接合至海 水養殖匙孔螺血氰蛋白（mariculture keyhole limpet hemocyanin，mcKLH)。經由 SDS-PAGE確認多肽對 mcKLH 之有效接合。接合蛋白質之功能性係由ELISA來檢查：將 2#§/111[10^接合之乂£0?165在4°(：下於96孔1^3乂丨8〇印培養 盤（Nunc, Wiesbaden，Germany)中固定隔夜。用赂蛋白溶液 (1%)阻斷各孔。添加VEGFRl或VEGFR2之連續稀釋液且 使用辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP)接合之山 羊抗人類 IgG(Fc 特異性）（Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove，PA, USA)及隨後在受質 ΤΜΒ(3,3·，5,5，-四甲基聯苯胺）(Pierce，Rockford，IL，USA) 存在下之酶促反應來偵測結合。KLH接合蛋白質仍與 VEGFRl、VEGFR2及貝伐單抗相互作用，從而證實 VEGF165上相關抗原決定基仍然可接近。 150860.doc -64- 201124533 實例1 用來自不同物種之D1丨4免疫來誘導美洲駝（丨丨aina)中之體液 免疫反應 1.1.免疫處理 在獸醫學學卩元之倫理委員會（the Ethical Committee of the faculty of Veterinary Medicine，University Ghent,
Belgium)核准之後，以6次肌肉内注射（在每週一次間隔下 • 每次給藥1〇〇或50 μβ)重組人類D114(R&D Systems,
Minneapolis，MN，US)來使4隻美洲駝（命名為第208、209、 23 0、231 遽）免疫。用 Stimune(Cedi Diagnostics BV, Lelystad，The Netherlands)調配D114抗原。根據標準方案以 4次交替皮下注射如上所述產生之過度表現人類Dii4之 CH〇細胞及過度表現小鼠D114之CHO細胞來使另外三隻美 洲駝（命名為第127b、260、261號）免疫。細胞再懸浮於D-PB S中且在注射之前保存在冰上。此外，根據標準方案以4 φ 次交替肌肉内注射（在兩週一次間隔下每次給藥1 00或50 Kg)重組人類 D114及小鼠 D114(R&D Systems, Minneapolis， MN, US)來使另外三隻美洲駝（命名為第282、283、284號） 免疫。第0天含有人類DIM之首次注射液係用完全弗氏佐 劑（Complete Freund’s Adjuvant ’ Difco，Detroit, Ml, USA) 調配，而隨後含有人類及小鼠D114之注射液係用不完全弗 氏佐劑（Incomplete Freund’s Adjuvant，Difco，Detroit, MI， USA)調配。 1.2.美洲駝中經誘導免疫反應之評估 150860.doc •65· 201124533 為了經由ELISA評估動物中對抗人類DU4之免疫反應的 誘導’在第0天（免疫前）、第21天及第43天（收集末梢血液 淋巴細胞[PBL]之時間）自美洲駝208、209、230及231 ;在 第0天及第51天自美洲駝lub、260及261 ;且在第0天、第 28天及第5〇天自美洲駝282、283及284收集血清。簡言 之，2 Kg/mL 重組人類 D114 或小鼠 D114(R&D Systems， Minneapolis，MN，1^八）在4。(：下於96孔1^&\丨8〇巧培養盤 (Nunc，Wiesbaden，Germany)中固定隔夜。用酪蛋白溶液 (1 %)阻斷各孔。在添加血清稀釋液之後，使用辣根過氧化 酶（HRP)接合之山羊抗美洲轮免疫球蛋白（Bethyl
Laboratories Inc” Montgomery，TX，USA)及隨後在受質 丁]\^(3,3’，5,5'-四甲基聯苯胺）(？41»(：6，尺0(^£>〇犷(!，11^，1；8人) 存在下之酶促反應來偵測經特異性結合之免疫球蛋白，從 而顯示誘導對抗DU4之顯著抗體依賴性免疫反應。抗體反 應係由表現習知抗體之B細胞譜系及表現僅有重鏈之抗體 之B細胞譜系來發動’因為經特異性結合之免疫球蛋白可 用特異性識別習知美洲駝IgG1抗體或僅有重鏈之美洲騎 IgG2或IgG3抗體的抗體來偵測（表2·α)。在所有注射小氣 D114之美洲駝中，特異性針對小鼠DU4之抗體反應皆由表 現習知抗體及僅有重鏈之抗體的B細胞發動。另外，經細 胞免疫之動物的血清效價係經由對過度表現人類及小鼠 D114之HEK293細胞進行FACS分析來確認（表2-B)。各美洲 欺之D114jk清效價反應描述於表2中。 表2 :抗體介導之對抗DLL4之特異性血清反應 150860.doc •66- 201124533 A) ELISA(重組蛋白質，塗佈於固相上） ί組人類DLL4 fc組小鼠DLL4 美洲駝 免疫原 總IgG IgGl IgG2 IgG3 總IgG IgGl IgG2 IgG3 208 重組人類 DLL4 + + +/- +/_ n/d n/d n/d n/d 209 重組人類 DLL4 + + +/- +/_ n/d n/d n/d n/d 230 重組人類 DLL4 ++ ++ +/- +/- n/d n/d n/d n/d 231 重組人類 DLL4 ++ -Η- -Η- -Η- n/d n/d n/d n/d 127b CHO- hDLL4+ CHO- mDLL4 ++ ++ +/- +/- + +/- +/- 260 CHO- hDLL4+ CHO- mDLL4 ++ ++ + + ++ + ++ 261 CHO- hDLL4+ CHO- mDLL4 -Η- +/- +/- 十 + +/- +/- 282 重組人類 DLL4+小 鼠 DLL4 ++ ++ ++ ++ ++ + + 283 重組人類 DLL4+小 鼠 DLL4 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 284 重組人類 DLL4+小 鼠 DLL4 + + + + + ++ + ++
n/d，未測定 150860.doc 67· 201124533 B) FACS(HEK293細胞上之天然表現蛋白質） 人類DLL4 小鼠DLL4 美洲駝 免疫原 總IgG IgGl IgG2 IgG3 總IgG IgGl IgG2 IgG3 208 重組人類 DLL4 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d 209 重組人類 DLL4 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d 230 重組人類 DLL4 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d 231 重組人類 DLL4 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d 127b CHO- hDLL4+ CHO- mDLL4 + n/d n/d n/d + n/d n/d n/d 260 CHO- hDLL4+ CHO- mDLL4 -H- n/d n/d n/d -H- n/d n/d n/d 261 CHO- hDLL4+ CHO- mDLL4 + n/d n/d n/d + n/d n/d n/d 282 重組人類 DLL4+小 鼠 DLL4 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d 283 重組人類 DLL4+小 鼠 DLL4 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d 284 重組人類 DLL4+小 鼠 DLL4 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d，未測定 實例2 僅有重鏈之抗體片段譜系之選殖及噬菌體之製備 在末次免疫原注射之後，自經免疫美洲駝收集作為產生 重鏈抗體之B細胞之來源的免疫組織。通常，收集每隻動 -68- 150860.doc 201124533 物在末次抗原注射後4天及8天收集之兩個150 ml血液樣 品，及在末次抗原注射之後4天收集之一個淋巴結生檢。 根據製造商說明書（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ， USA) ’使用聚嚴糖-泛影葡胺（Fic〇ll-Hypaque)由血液樣品 製備末梢血液單核細胞（PBMC)。如W0 〇5/〇44858中所 述，自PBMC及淋巴結生檢提取總RNA，其用作擴增編碼 VHH之DNA區段之RT-PCR的起始物質。對於各經免疫美 洲駝，藉由匯合自彼動物收集之所有免疫組織分離的總 RNA來構築文庫。簡言之，經PCR擴增之VHH譜系經由特 定限制位點選殖入經設計以便於噬菌體呈現VHH文庫的載 體中。該載體源自pUC 119且含有LacZ啟動子、Ml 3噬菌體 gill蛋白編碼序列、安比西林（ampicillin)或卡本西林 (carbenicillin)抗性基因、多重選殖位點及雜交glll-pelB前 導序列（pAX050)。載體編碼與VHH編碼序列同框之C-末端 c-myc標籤及His6標籤。噬菌體係根據標準方案製備且在 過濾滅菌後儲存在4°C下以供進一步使用。 實例3
經由噬菌體呈現選擇D114特異性VHH 自所有美洲駝獲得且選殖為噬菌體文庫之VHH譜系用於 應用許多選擇條件之不同選擇策略中。變數包括0D114蛋 白質形式（人類 D114(Metl-Pro524)及小鼠 D114(Metl-Pro525) 之C末端標記His之重組表現細胞外域（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)、或存在於過度表現D114之CHO或 HEK293細胞上之全長人類D114及小鼠D114)，ii)抗原呈現 150860.doc -69· 201124533 方法（直接塗佈D114之培養盤或經由生物素標籤塗佈以丨斗之 中性鏈親和素（Neutravidin)培養盤，·溶液相··在溶液中培 育，隨後在中性鏈親和素塗佈培養盤上捕捉），iH)抗原濃 度及iv)不同溶離方法（經由胰蛋白酶之非特異性方法或經 由同源受體Notchl/Fc嵌合體或抗〇114 IgG/Fab之特異性方 法）。所有選擇皆在Maxisorp 96孔培養盤（Nunc， Wiesbaden，Germany)中進行。 如下進行選擇：用於固相及溶液相選擇形式之D1M抗原 製備物係如上所述以多個濃度呈現。在與噬菌體文庫一起 培育2 h、隨後澈底洗滌之後，用胰蛋白酶（1 mg/mL)溶離 結合噬菌體30分鐘。倘若胰蛋白酶用於噬菌體溶離，則施 用0.8 mM蛋白酶抑制劑ABSF即刻中和蛋白酶活性。同時 進行無抗原選擇作為對照。將展示超過背景值（無抗原對 照）之增濃的嗟菌體輸出（Phage 〇utpUt)用於感染大腸桿 菌。經感染大腸桿菌細胞用於製備下一輪選擇之噬菌體 (噬菌體補救）或塗佈於瓊脂培養盤（LB+amp+葡萄糖2。勺上 用於分析個別VHH純系。為了篩檢特異性結合物之選擇輸 出’自壤脂培養盤挑取單一群落且在1 mL 96深孔培養盤 中培養。藉由在葡萄糖存在下添加IPTG(終濃度為〇.1_1 mM)來誘導受LacZ控制之VHH表現。根據標準方案製備周 質（Periplasmic)提取物（體積約80 μί)。 實例4 D114-Notchl AlphaScreen及FMAT競爭檢定中周質提取物 之篩檢 150860.doc •70· 201124533 在人類DIM/人類Notch 1 AlphaScreen檢定中筛檢周質提 取物以評估表現之VHH的阻斷能力。使用生物素（Sigma， St Louis，MO，USA)及生物素醯胺基己酸3-硫代-N-經基破 珀酿亞胺酯納鹽（Sigma, St Louis, MO，USA)對人類D114進 行生物素標記。根據製造商說明書（Perkin Elmer，Waltham， MA，US)，使用偶合至受者珠粒之抗Fc VHH來捕捉 Notchl/Fc欲合體（R&D Systems，Minneapolis, MN，USA)。 為了評估VHH之中和能力，使一系列周質提取物稀釋液與 經生物素標記人類D114 —起預培育。將受者珠粒及抗生蛋 白鏈菌素（streptavidin)供者珠粒添加至此混合物中且進一 步在室溫下培育1小時。藉由使用680 nm激發波長及520 nm發射波長在Envision多標記培養盤讀取器（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)上讀取培養盤來量測螢光。螢光信號 減少指示經生物素標記人類D1I4對人類Notchl/Fc受體之結 合由表現於周質提取物中之VHH阻斷。 或者，在人類Notchl/Fc FMAT(螢光微量容量檢定技術） 競爭檢定中使用CHO-hD114及CHO-mD114細胞。用八4乂牡-647(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)隨機標記重組人類 Notchl/Fc 嵌合體（R&D Systems, Minneapolis, MN，USA)。 簡言之，將5 μί周質物質連同7,500個分別過度表現CHO-hD114或CH0-mD114之細胞一起添加至1〇〇 pM或175 pM經 標記人類Notch 1/Fc中，且在培育2小時後進行讀數。為了 設定無競爭基線，用人類Notchl/Fc〜Alexa647至少30次重 複測定細胞且由此基線計算抑制百分比。所有計算皆係基 150860.doc •71 · 201124533 於包含每孔螢光之平均值乘以每孔計數數目的FL1總信 號。 自此篩檢來選擇抑制性VHH且定序。序列分析揭示了屬 於40個不同B細胞系之166個獨特VHH。各B細胞系取得之 變異體的總數描述於表3中。周質篩檢資料之概述在表4中 給出。經選擇用於進一步表徵之獨特VHH之胺基酸序列展 示於序列表（SEQ ID NO: 4-20)及表5(指示了 CDR及構架區） 中 〇 表3:用於鑑別DLL4特異性VHHB細胞系之選擇參數 B細 胞系 VHHID 變異體 數目 文庫 選擇形式 噬菌體溶離 選擇 輪數 1 DLLBII8A09 31 231 rhDLL4 (3 nM) 肤蛋白酶 1 2 DLLBII5B11 1 231 rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 3 DLLBII7B05 21 231 RI ： biot-rhDLL4 (3 nM) RII ： biot-rhDLL4 (0.03 nM) 胰蛋白酶 2 4 DLLBII6B11 13 231 biot-rhDLL4 (3 M) 胰蛋白酶 1 5 DLLBII8C11 5 231 RI ： biot-rhDLL4 (3 nM) RII ： biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 2 6 DLLBII19D10 1 231 biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 7 DLLBII33C05 2 231 CHO-hDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 1 8 DLLBII28B06 2 231 rmDLL4 (0.5 pg/mL) 胰蛋白酶 1 9 DLLBII17G10 1 231 biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 10 DLLBII17C01 8 231 biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 11 DLLBII19F04 1 231 biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 12 DLLBII17F10 1 231 biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 13 DLLBII17B03 5 231 biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 14 DLLBII19F12 2 231 biot-rhDLL4 (3 nM) 胰蛋白酶 1 15 DLLBII42B07 1 231 RI ： biot-rhDLL4 (3 nM) RII ： biot-rhDLL4 (3 nM) rhNotchl/Fc 2 16 DLLBII47D01 1 230 RI ： biot-rhDLL4 (3 nM) RII ： biot-rhDLL4 (3 nM) rhNotchl/Fc 2 17 DLLBII56A09 15 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) rhNotchl/Fc 2 150860.doc -72· 201124533 18 DLLBII95F02 5 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 19 DLLBII96C03 20 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 20 DLLBII104G01 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (+rhDLL4) rhNotchl/Fc (RI-RII) 騰蛋白酶 (RIII) 3 21 DLLBII102F08 3 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (0.01 nM) rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (Rin) 3 22 DLLBII112A03 1 209 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 23 DLLBII102G04 2 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (0.01 nM) rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (Rin) 3 24 DLLBII101G08 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (0.1 nM) rhNotchl/Fc (RI-RII) 騰蛋白酶 (Rin) 3 25 DLLBII112A04 1 209 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 26 DLLBII101H09 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (0.1 nM) rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (RIII) 3 150860.doc -73- 201124533 27 DLLBII101H05 1 230 RI ： CH0-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CH0-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (1 nM) rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (Riii) 3 28 DLLBII112E07 1 209 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 29 DLLBII101F01 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (1 nM) rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (Riii) 3 30 DLLBII104A03 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (1 nM)+rhDLL4 rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (Riii) 3 31 DLLBII104C04 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (1 nM)+rhDLL4 rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (RIII) 3 32 DLLBII104B05 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (1 nM)+rhDLL4 rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (RIII) 3 33 DLLBII107C03 1 208 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) rhNotchl/Fc 2 34 DLLBII58A11 4 260 RI ： biot-rhDLL4 (3 nM) RII ： biot-rmDLL4 (3 nM) rhNotchl/Fc 2 35 DLLBII61F05 1 260 RI ： HEK293H-hDLL4 (2E6/mL) RII ： HEK293H-hDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 150860.doc • 74· 201124533 36 DLLBII61F07 1 260 RI ： HEK293H-hDLL4 (2E6/mL) RII ： HEK293H-hDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 37 DLLBII62C11 1 260 RI ： HEK293H-hDLL4 (2E6/mL) RII ： HEK293H-mDLL4 (2E6/mL) 胰蛋白酶 2 38 DLLBII115A05 1 230 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RII ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RIII ： biot-rhDLL4 (1 nM) RIV:CHO-mDLL4 (2E6/mL) rhNotchl/Fc (RI-RII) 胰蛋白酶 (RIII) 胰蛋白酶 (RIV) 4 39 DLLBII83G01 4 284 RI ： CHO-mDLL4 (2E6/mL) RI ： CHO-hDLL4 (2E6/mL) DLL4 IgG 2 40 DLLBII80E08 1 283 RI ： CHO-hDLL4 (2E6/mL) RI ： CHO-hDLL4 (2E6/mL) DLL4 IgG 2 表4 : 含有表現之抗DLL4 VHH之周質提取物的篩檢 B細 胞系 代表性 VHH ID 獨特序 列數目 ELISA AlphaS creen FMAT FMAT Biacore⑻ hDLL4 抑制％ hDLL4 抑制％ hDLL4 抑制％ mDLL4 抑制％ kd(s'') 1 DLLBII8A09 31 96 - - - {1.2^-2.4^4) 2 DLLBII5B11 1 98 - - 3 DLLBII7B05 21 84 - - - (2.严） 4 DLLBII6B11 13 98 - - _ (9 4b-U4-3 7^4) 5 DLLBII8C11 5 57 - _ _ (7 3^4-6 (f'U4) 6 DLLBII19D10 1 98 85 - _ 1.3^ 7 DLLBII33C05 2 86 75 - • 9.2匕·υ4 (2.严） 8 DLLBII28B06 2 23 54 - • 7.5^ (1.6^4) 9 ULLJtJlil /CilU 1 93 82 - 1.5b^ 10 DLLBII17C01 8 82 84 _ - 5.6^ {5.6^-5.3e'04) 11 DLLBII19F04 1 98 95 • 1.1^ j jt-U4(b) 1严/2.2卜U4W 12 DLLBII17F10 1 98 88 - ---- 13 DLLBII17B03 5 76 77 - --- 14 DLLBII19F12 2 98 98 - - 4.9fc'U4 {l.(f-Ui) 150860.doc •75· 201124533 15 DLLBII42B07 1 - - - - - 16 DLLBII47D01 1 - - 87 - - 17 DLLBII56A09 15 - - - - 1.1E-03) 18 DLLBII95F02 5 - - 81 71 6严 19 DLLBII96C03 20 - - 75 83 - 20 DLLBII104G01 1 - - 94 86 1严（人严 9.4e'04) 21 DLLBII102F08 3 - - 85 75 - 22 DLLBII112A03 1 - - 72 97 - 23 DLLBII102G04 2 - - 86 82 - 24 DLLBII101G08 1 - - 91 92 2.1^ 25 DLLBII112A04 1 - - 75 90 - 26 DLLBII101H09 1 - - 87 75 - 27 DLLBII101H05 1 - - 85 83 - 28 DLLBII112E07 1 - - 80 85 - 29 DLLBII101F01 1 - - 85 78 2·0_ 30 DLLBII104A03 1 - - 86 83 - 31 DLLBII104C04 1 - - 87 83 32 DLLBII104B05 1 - - 86 78 - 33 DLLBII107C03 1 - - 75 80 - 34 DLLBII58A11 4 - 95 73 1.6ε·03) 35 DLLBII61F05 1 - - 74 76 - 36 DLLBII61F07 1 - - 79 77 - 37 DLLBII62C11 1 _ - 74 71 歷 38 DLLBII115A05 1 - - 74 84 3.1_ 39 DLLBII83G01 4 - 87 93 4严 40 DLLBII80E08 1 - 71 82 -
(a) 若B細胞系内多個獨特變異體經鑑別，則細胞系成員之 解離速率範圍（最大值-最小值）或解離速率係在括號之間以 斜體字給出。 (b) 異質擬合：測出之快速及緩慢解離速率。 150860.doc •76· 201124533
(15|)矽丧莱Μ* Ήαυ:枨鹚 * Ή^ί-έ^νν^αι^^wffiffiA 寸^衅辨茫：的< 150860.doc 構架4 WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS TGQGTQVTVSS CDR 3 >H Q z o M e? u >H s in Q CU Q >Η ω > Q Εη α. >Η >Η >Η Ο >Η σ) Q >-· ω U4 > Q Eh Oj >-« >H CO o >-< C/D Q < >H CO 〇 〇 >H υ ω U >H 2 > o < βω Οι CU 3： CO Ο 2 > Ο υ ζ co >Η < >-< a CU >H < 01 cu Q 2 >-· 〇 u > hJ >H Q Q Q >H ω >H a cc H Q l 〇 > CO a >H CO co Q U < >H iD >H Q 〇 a CC et >-< (X Q M >H >h Cd CC >* Q C co ◦ Du 〇 E-* m Dj =c > >H a: M 〇 a: u M CD Qj 構架3 2 2 〇 H U 2 >H ^ >H < > 2 < Q H cc； a w ω Μ (X ㈠Z Ua ^ CC CO s S οι >Η >Η > U. Η U Ζ >Η ^ >Η < > 2 < Q Η CC Q (Ό ω Μ Οι Η ¥ Ij-> ι-^ a： co 2； s o >-· >H > tu Eh U 2 >H W >H < > Z < Q h Ct： Q co ω M CL| Eh ^ tu hJ Qi W 2 2 σ >H <C > < E- U Z >< 乂 >-< > 2 < Z H CC Q CO CJ E-π Oj E-< ^ Lu Di W z s H U 2 >H ^ >H < > 2 < Q H CC Q co ω hH Dj H ^ Pz-i i-^l a： co 2 2 Of £h u 2 >-* ^ >-* < > 2 < Q £h CO Q cn [J M CU Du DC： W 1 >H 2 > < E-· U Z >-My < > z c Q H a： a w ω M Du H ¥ Cz-I h-^ a： co S >H H > < HU 2 >H < > 2 < Q Sh C/5 Q W CJ M CU H W lu 1-^ cc in 2： 2 a HD 2 >H >H <c > 2 < Q Eh ff； Q CO t£3 Μ Oj Η β lu QC W s 口 co cn > X HD 2； >H ^ >H < > CC Q cn ω M Oi &H ^ Dm CC U1 2 2 〇i >-* H > < E-· U 2 >* ^ >-* < > 2 < Q Eh DC Q c/d ω M (Xi H 乂 Uj cc in CDR 2 CO 乂 ϋ > Q CO CO Q OD < CO >-t M U H U Η ο η ^ Ο > Ο Ζ 2 cn cu Μ >Η > S HU in Ni o > 〇 cn h Q co < [j-i >H < 2 co y： e) > O CO Qi Q W < W >h M (jj one) cn ^ O > Q co co Q co < 2 >H M >H u h e? H ¥ Pi > Q W DC Q CO < c/} > H >H U H ◦ E-< 〇i 〇 > O CO 03 Q IS忒 CC >* M >H < < o co U > Q C/) CO Q CO < CO >H H >H U Η O CO U > CJ 1¾ 〇 Q W < Z X M >H c〇 η a Eh 〇 CO Z O > Q CO Ct. ω co < M >H U X： 〇 > 〇 cn CO Q co < CO >h M >H U H ◦ 搆架2 cn > ω ω ¥ ο cu < ο tc yA < > ω CC a ⑦ 〇A < a cc >H < > ω Di o a u cu < o IX >H s CO > o ω cc ω 父 ο a, < σ CC [ί4 & in > s ω DC ω 〇 cu < cy u. h4 cn > 〇 ω a： CJ CD cu < o CC lu S < > Du ω PC ω u Qj < a Pt u> CO > 〇 ω Di ω 〇 a. < 〇 a： Du > ω Oj ID o cu cn DC CC > < > hJ ω a； O 〇 Qj < o a； >H s U) M 〇 ω 〇4 ω e? Oj < o CC lu s CDR 1 ϋ Μ > X t-q CD >H (Λ u >H cn Ο > < >-< 〇 H 2 >H >H O M < >H Q 1 >H co e> M < Q in 2 o >-« CO i >-< tH o M < >-· Q 構架1 Oj Η Ο U* > Ο ^ C0 Ο Μ Ο < ο υ cn cn ω ^ > CC Ο W > Ο Q ω ο ^ C H 〇i cn > O fj CO o ^ e) < ω u CO w ω j > cC 〇 CO > ◦ w ω o Uj sC H O U) > O hJ CO CD 4 O fi ϋ U c/D co ω hj > cc hj hj O CO >02 ω e) h < < 〇 Cu > Ο CO U f=C ϋ fi ο ο cn cn ω ij > Qi ο W > Ο Q ω ο β a. Eh 〇 t, > o ^ cn O p£ o fi o o cn co ω hJ > a o co > a a ω o .j < H 〇 Du > 〇 hJ CO CJ i O < C3 U c/) cn ω j > a： O co > CD Q ω 〇 tu < H a vc > 〇 hJ CO U rt； u < (J o W C/3 ω > cc 〇 CO > ◦ co ω O Ua 〇 Cu > 〇 i-^ m U ft o < o u co co ω ^ > a： 〇 co > O Q ω o c=u 〇4 Eh 〇 C*4 > 〇 h=\ W O sC o d 〇 u CO w ω hj > a； 闫e O co > 〇 o CJ 〇氏 < H 〇 W > ◦ J CO O <C 〇 < CD u co co ω hj > Q： O cn > (J) co ω ω Uj Du H 〇 Du > O ^ (/) cj? a： 〇 < a u m m ω j > cC 〇 cn > O Q ω e) tu VHH ID/ SEQ ID NO Μ Μ ιΗ CQ τΗ CQ 宮2 β M H CQ 1-H DQ ^ ^£> ID M M CM ω o .-q rt： vd Q〇 Μ Μ ΙΟ DQ Ο hJ QQ H M (T\ DQ O hJ < 00 0D Q O M M i-H CQ «Η J u hj co σ> Q O H 00 Μ O DQ O h-ί t-H J o o Q rH rH H rH HO CQ CD ^ r-l j 〇 rH Q i—i M LD Μ O PQ < LH CNJ β H Q i-i M M CQ O ti4 rn σ» rH Q rH M M (\1 CQ f-\ Θ Q吋 d LO rH Q m ·77· 201124533 cn CO > a w CO > H a w CO > 〇> CO w > 〇i CO CO > H a CO CO > H > a o a o H o o o s o 〇i Eh u 〇 o rr iD 〇i a ◦ PGIAACRGIHY PGIAACRGIHY PGIAACRGIHY GSGSWGV PRGWGPTGPHEYG Y PGIAACRGIHY § 2 2 a 2： S o H 2 〇 2 2 S a > < HU > < Eh U > < HD ^ < Eh u ^ < Eh U > < EH 〇 ^ >h < > ^ >H < > ¥ ：h < > < > ^ >H < >. < >: 2 C Q H VC Q CO < Q H a： Q 2 rt： Q H Pi Q z < O < CC Q 2 < Q Eh CC Q 2 < Q E-· CC Q CO ω Η Oj H ¥ Uj a： w CO CJ Eh Oj Η ^ 田》J CC CO CO CJ M Cu Eh W hi CC W W CJ M CO H ^ Cu J a： o co ω Μ Οι Eh 乂 Du CC CO w ω m a< H ^ tu hP a： co M ^ CD > 〇 w CO Q H ^ C/5 > O CO cn q M ^ O > a co C/) D 2 ^ CO > (3 Eh Q Q Q ^ UJ > U CO 〇 Q M ^ CO > C) co CO Q (n >-* M >H U Eh 〇 CO >-♦ M >-♦ U Η O CO >H M >H U (J) CO >h M >H > E-* 〇 Z >H M >h < Η O cn Q M >n u H 〇 CO M 〇 ω a. ω e? cu < 〇 a： CO M CD ω cu pa a 〇 Oi < a 〇c CO M ω ω Ο) u ο & C o a： CO > S ω o 〇 cu < a cc W > S U a* 〇 cu < 〇 a： C/} M o Oj u 〇 CU < a a： Dm S Ua Du S > 1 Du s o H 忒 Q o M < >* > o M >H Q CO S >H 2 CO 2 Q >· 2； o M < >H Q CU Η 〇4 E-* 〇4 H CU eh CU Η CU H 〇 tM > ◦ 〇 Cu > 〇 〇 Cu > O 〇 Cu > ^ 〇 Du > 〇 〇 Du > 〇 C/) O < ϋ < ID < O Eh O < o < 〇 ^ o > O ^ O < O <C O Eh C/} C/) ω > a； CO CO CJ hP > Di CO CO ω hj > a： CO U) ω hJ S oc； CO CO ω β > 〇C CO CO ω j > CC Ο co > 〇 Q CJ ϋ tu 〇 CO > O Q ω 〇 tu 〇 CO > O Q ω ◦ b 〇 CO > 〇 cn ω ϋ Cw 〇i CO > 〇 o ω 〇 Cn 〇 w > O Q ω o tu M μ CQ o M M DQ O ac ① in M M CQ M M rH DQ rH M Η ΓΟ 0Q O M M iH CQ tH 卜1 4 in β。H Q in Θ。H Q m 合§ — ^ Cv) H Q \D ♦-3 H Q σ> d r- cm Q m
150860.doc •78 201124533 實例5 純化抗D1丨4 VHH之表徵 對選自實例4中所述篩檢之抑制性抗D114 VHH進行進一 步純化且加以表徵。所選VHH在大腸桿菌TG1中表現為標 記c-myc、His6之蛋白質。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現 且使其在37°C下繼續4小時。在旋轉細胞培養物之後，藉 由凍融集結粒來製備周質提取物。此等提取物用作起始物 質且經由IMAC及尺寸排阻層析法（SEC)純化VHH，獲得如 經由SDS-PAGE評估為95%之純度。 5.1. ELISA中阻斷D114之VHH的評估 在人類D114-人類Notch 1/Fc阻斷ELISA中評估VHH之阻 斷能力。簡言之，將1 Kg/mL人類Notchl/Fc嵌合體（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)塗佈於 96 孔 MaxiSorp 培養 盤（Nunc, Wiesbaden, Germany)中。使 15 nM固定濃度之經 生物素標記人類D114與一系列VHH稀釋液一起預培育1小 時，此後將混合物在經塗佈Notchl受體上再培育1小時。 使用辣根過氧化酶（HRP)接合之extravidin(Sigma, St. Louis, MO, USA)偵測經生物素標記人類D114之剩餘結合 (圖3)。如上所述對人類D114進行生物素標記。阻斷人類 D114-人類Notchl/Fc相互作用之VHH的IC50值描述於表6 中〇 150860.doc -79- 201124533 表6 : hDLL4/hNotchl-Fc 競爭 ELISA 中 VHH 之 IC50(nM)值 VHHID ICs〇(nM) 6B11 1.5 55D12 12.3 56A09 4.9 56C04 33.9 56H08 6.9 57C11 17.3 62C11 72.0 96C03 38.4 101G08 9.5 104G01 1.1 115A05 9.1 抗 DLL4 Fab 0.7
5.2. AlphaScreen 中阻斷D114之 VHH的評估 簡言之，在抗生蛋白鏈菌素塗佈之供者珠粒(20 pg/mL) 上捕捉1 nM經生物素標記人類D114，而0.4 nM受體人類 Notchl (呈Fc融合蛋白形式）係在抗人類Fc VHH塗佈之受者 珠粒（20 pg/mL)上捕捉。兩種負載珠粒均與一定稀釋度範 圍之競爭VHH —起培育（圖4)。阻斷人類D114-人類 Notchl/Fc相互作用之VHH的IC50值描述於表7中。 表7 : hDLL4/hNotchl 競爭 AlphaScreen 中 VHH 之 IC50(nM)值 (a)部分抑制劑 VHHID ICs〇(nM) 5B11 0.7 6B11 0.3 7A02 0.4 7B05 1.1 8A09 0.4 8C11 0.7W 19F04 0.05(a, 55D12 2.3 56A09 1.2 56C04 5.4 56H08 1.6 57C11 2.2 62C11 24.1 115A05 5.0 抗 DLL4 Fab 0.3
150860.doc • 80 - 201124533 5.3.抗D114 VHH對人類Notchl/Fc結合表現在CHO細胞上之 人類或小鼠D114之抑制 在如實例4中概述之人類及小鼠D114-人類Notchl/Fc競爭 性FMAT檢定（圖5)中來評估VHH的阻斷能力。阻斷人類 Notchl/Fc與表現在CH0細胞上之人類或小鼠D114之相互作 用之VHH的IC50值描述於表8中。
表8 :阻斷人類Notchl/Fc與表現在CH0細胞上之人類或小 鼠DLL4之相互作用之純化VHH的（平均）IC50值（nM)(FMAT) hDLL4 mDLL4 VHHID ICso(nM) ICso(nM) 6B11 8.9 - 8A09 5.5 - 19F04 33.0 - 55D12 39.1 41.0 56A09 10.6 15.0 56C04 28.7 49.6 56H08 22.0 33.7 57C11 53.9 49.5 62C11 172.2 106.3 96C03 160.8 28.8 101G08 24.6 92.1 104G01 2.5 _ 115A05 22.0 43.0 抗DLL4 Fab 5.4 2.3 5.4.報導檢定中阻斷D114之VHH的評估 為了評估所選VHH之效能，建立基於Notchl之γ分泌酵 素介導之裂解及D114刺激後Notchl細胞内域（NICD)之釋放 的報導檢定。將Notchl-GAL4/VP16構築體與pGL4.31 Luc2P/Gal4UAS/Hygro]報導質體一起共轉染於HEK細胞 中，使融合蛋白短暫表現。藉由與HEK293-hD114穩定細胞 株共培養來刺激此等經短暫轉染細胞24小時。轉染後48小 150860.doc -81 - 201124533 時進行讀數。VHH在開始共培養之前與HEK293-hD114細胞 一起預培育1小時且包括在共培養期間（圖6)。阻斷Notchl 之D114介導之裂解及隨後其NICD易位至受體細胞核之VHH 的IC50值描述於表9中。 表9 : DLL4/Notchl報導檢定中純化VHH之（平均）IC50值 (nM) VHH ID ICso 56A09 540 62C11 4663 96C03 5156 101G08 2760 104G01 964 115A05 1740 抗 DLL4 Fab 133 5.5.抗原決定基重新分級
為了確定VHH在例如基準抗體經結合時是否可同時結合 D114，（經由Biacore T100儀器上之表面電漿子共振（SPR)) 進行抗原決定基重新分級實驗。抗-D114 Fab片段以不可逆 方式固定在CM5感測器晶片之參考及活性流量槽上。對於 各樣品（循環），將人類D114注射在活性及參考流量槽上且 由抗D114 Fab以可逆方式捕捉。另一 VHH結合係藉由注射 在固定表面上加以評估。所有VHH及抗DIM Fab皆以100 nM注射，表面接觸時間120秒，且流速10微升/分鐘。使用 10 mM甘胺酸（pH1.5)再生表面。用Biacore T100評估軟體 來評估經處理之曲線。表10-A表示所分析VHH及對照之依 序注射/再生路線。展示VHH DLLBII56A09(SEQ ID NO: 15) ' DLLBII96C03(SEQ ID NO: 19) ' DLLBII101 G08(SEQ 150860.doc -82- 201124533
ID NO: 10)及 DLLBII115A05(SEQ ID NO : 112)不另外結合 由D1I4 Fab捕捉到之人類D114。注射D114 Fab亦未能另外結 合人類D114，從而指示所有抗原決定基皆已飽和。因此， 可斷定此等VHH識別與用於結合人類D114之D114 Fab重疊 的抗原決定基。僅有人類VHH DLLBII6B11(SEQ ID NO: 5)及 DLLBII104G01(SEQ ID NO: 11)展示對捕捉 D114 Fab 之 人類D114的額外結合，從而指示對人類D114具有特異性之 此等VHH識別與人類/小鼠交又反應性VHH不同的抗原決 定基。 表10-A :抗DLL4 VHH之抗原決定基重新分級-同時以 DLL4 Fab進行結合 注射步驟 绪合丨再生 1樣品】 结合程度(RU) 1 hDLL4 100 nM 1727 2 DLL4 Fab 100 nM 無結合 3 59A9 100 nM 無結合 4 6B11 100 nM 405 5 甘胺酸(pH1.5) 10 mM 90 6 hDLL4 100 nM 1349 7 104G1 100 nM 276 8 甘胺酸(pH1.5) 10 mM 87 9 hDLL4 100 nM 1336 10 甘胺酸(pHl.5) lOmM 70 11 hDLL4 100 nM 1333 12 96C3 100 nM 無結合 13 101G8 100 nM 無結合 14 115A05 100 nM 無結合 15 甘胺酸(pHl.5) 10 mM 70 5.6.使用DU4缺失突變體之抗原決定基定位 在Biacore中評估VHH對此等D114突變體之結合。簡言 之，將VHH DLLBII101G08(SEQ ID NO: 10)及DLLBII115A5 SEQ ID NO: 12)塗佈於CM4感測器晶片上且橫跨晶片注射 150860.doc • 83 - 201124533 200 nM之各缺失突變體。對結合進行定性評估。未觀測到 DLLBII56A09(SEQ ID NO: 15)、DLLBII101G08(SEQ ID NO: 10)及 DLLBII115A05(SEQ ID NCh 12)分別對缺乏 EGF 樣2域之人類及小鼠D114突變體hD114.1及mD114.8的結合（表 10-B)。使用hD114/D114 IgG競爭性ELISA之間接證據已表 明了此觀測結果。簡言之，將1 gg/mL DIM IgG塗佈於96 孔 MaxiSorp 培養盤（Nunc，Wiesbaden, Germany)中。使 6 nM固定濃度之經生物素標記人類DU4與一系列VHH稀釋液 一起預培育1小時，此後將混合物在經塗佈IgG上再培育1 小時。使用辣根過氧化酶接合之extravidin(Sigma，St. Louis, MO，USA)偵測經生物素標記人類D114之剩餘結合 (資料未示）。如上所述對人類D114進行生物素標記。自專 利文獻得知單株抗 D114 IgG(Genentech, US 2008/ 0014196A1)結合D114之EGF樣2域内之抗原決定基。 表10-B :抗DLL4 VHH之抗原決定基定位-結合DLL4缺失 突變體 ' DLL] BII56A9 DLLI (II101G8 DLLI HI115A5 樣品 結合 (RU) kd(l/s) 結合 (RU) Kd(l/s) 結合 (RU) kd(l/s) hDLL4 281 9.5E-04 373 2.0E-03 324 3.5E-03 mDLL4 389 1.9E-03 502 6.0E-03 344 6.5E-03 hDLL4.1 無結合 無結合 無結合 hDLL4.3 125 7.4E-04 198 4.65E-03 137 3.5E-03 hDLL4.5 143 1.2E-03 266 2.19E-03 162 4.2E-03 hDLL4.6 136 1.1E-03 229 2.20E-03 152 4.1E-03 mDLL4.8 無結合 無結合 無結合 mDLL4.10 141 1.1E-03 189 5.14E-03 121 3.8E-03 mDLL4.11 132 1.6E-03 210 6.16E-03 121 6.6E-03 mDLL4.12 161 1.3E-03 244 4.52E-03 152 3.1E-03 5.7.測定hDU4-Vmi相互作用之親和力 I50860.doc • 84· 201124533 測定D114-VHH相互作用之親和力的動力學分析係經由 Biacore T100儀器上之表面電漿子共振（SPR)來進行。使用 EDC及NHS經由胺偶合將重組人類D114固定在CM5晶片上 或在SA晶片（抗生蛋白鏈菌素表面）上捕捉經生物素標記人 類D114。將純化VHH或Fab片段在不同濃度（介於10與3 00 nM之間）下注射2分鐘且使其在45 μΐ/min之流速下解離20分 鐘。在樣品注射之間，用10 mM甘胺酸（pH 1.5)及100 mM HC1再生表面。HBS-N(Hepes緩衝液，pH 7.4)用作操作緩 衝液。若有可能，則藉由將1:1相互作用模型（朗繆爾 (Langmuir)結合）擬合在結合曲線上來評估資料。親和力常 數KD係由所得締合及解離速率常數（ka)及（kd)來計算。抗 DIM VHH之親和力描述於表11中。 表11 :純化VHH對重組人類DLL4之親和力KD(nM) rhDLL4 VHH ID kdis1) K〇(nM) 56A09 1.7E+05 9.3E-04 5.6 56C04 1.1E+05 4.9E-03 45 56H08 1.2E+05 1.1E-03 9.4 62C11 1.2E+06 1.3E-01 120 96C03 1.6E+05 4.8E-02 310 101G08 4.3E+04 2.2E-03 52 104G01ta, 1.2E+05-1.5E+05 3E-03-6E-04 4-24 115A05 1.5E+05 3.9E-03 25 抗DLL4 Fab 2.3E+05 3.4E-04 1.5 (a)導致非1:1擬合之異質結合曲線 5.8.結合直系同源物（mDll4，CD114)及家族成員（hJagged-1，hDLLl) 為了測定對小鼠D114之交叉反應性，進行結合ELISA。 簡言之，重組小鼠 D114(R&D Systems, Minneapolis, MS, 150860.doc -85- 201124533 USA)在 4°C 下以 1 pg/mL 於 96 孔 MaxiSorp 培養盤（Nunc， Wiesbaden，Germany)中塗佈隔夜。用酷蛋白溶液（1%於 PBS中）阻斷各孔。VHH係以系列稀釋液形式加以施用且使 用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP接合物（Sigma，St Louis， MO，USA)來偵測結合（圖7)。量測對人類D114之結合作為 參考。EC50值概述於表12中。 表12 :重組人類DLL4及小鼠DLL4結合ELISA中VHH的 EC50(nM)值 rhDLL4 rmDLL4 VHH ID Ε〇5〇(ηΜ) ECs〇(nM) 5B11 1.8 - 6B11 1.4 - 7A02 1.4 - 7B05 7.2 - 8A09 0.9 8C11 1.1 - 17F10 0.9 - 19F04 0.9 0.8 55D12 13.1 30.0 56A09 3.6 6.3 56C04 44.3 244.0 56H08 4.1 8.7 57C11 7.9 83.4 62C11 137.0 13.1 96C03 86.5 8.7 101G08 8.9 53.9 104G01 8.4 - 115A05 5.0 33.4 抗DLL4 Fab 3.0 3.0 為了確定VHH之獼猴交叉反應性，進行FACS結合實 驗。將表現獼猴D114之HEK293細胞（短暫或穩定轉染）用於 VHH之滴定結合實驗。在冰上培育30分鐘後，洗滌所有樣 品且藉由施用抗 c-myc〜Alexa647(Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz, CA，USA)來進行偵測》過度表現人類及小鼠 150860.doc -86 · 201124533 D114之HEK293細胞被用作參考。在FACS陣列（FACS Array)上測定平均MCF值且用於計算EC50值（參見圖9)。 經由固相結合檢定（ELISA)評估不存在對同源配位體人 類DLL1及人類Jagged-Ι之結合。簡言之，人類DLL1 (Alexis, San Diego, CA，USA)及人類 Jagged-l(Alexis，San Diego, CA，USA)在 4°C 下以 1 pg/mL於 96孔 MaxiSorp培養盤 (Nunc，Wiesbaden, Germany)中塗佈隔夜。用赂蛋白溶液 (1%於PBS中）阻斷各孔。VHH係以系列稀釋液形式加以施 用且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP接合物（Sigma, St. Louis, MO, USA)來偵測結合。所有抗D114 VHH皆視為對 此等同源配位體無交叉反應性（圖8)。 5.9.抗DU4 VHH阻斷D114介導之HUVEC增殖之評估 在如 Ridgway 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122): 1083-7所述之增殖檢定（以經修改形式）中評估所選 VHH之效能。簡言之，96孔組織培養盤經塗佈緩衝液 (PBS，0.1% BSA)中之純化 DU4-His(RnD Systems ; C-末端 標記His之人類D114，胺基酸27-524，0.75毫升/孔，10 ng/ml)塗佈。用PBS洗滌各孔，隨後一式四份每孔接種 4000個HUVEC細胞。在第4天藉由併入[3H]-胸苷來量測細 胞增殖。圖15中所示之結果說明DLL4 VHH DLLBII101G08 、 DLLBII104G01 、 DLLBII115A05 、 DLLBII56A09及DLL4 Fab以劑量依賴性方式抑制對 HUVEC增殖之DLL4依賴性效應，IC5〇值概述於表13中。 所測試VHH在10 μΜ下完全抑制DLL4依賴性效應。 150860.doc •87· 201124533 表13 : DLL4增殖檢定中獲得之1(：50值 VHH/Fab Fab 56A9 104G1 101G8 115A5 ' IC5〇(nM)(實驗 1) 4.9 11.0 103 401 10002 IC50(nM)(實驗 2) 5.6 6.8 32 112 1------— η 2 2 2 2 〜 實例6 所選抗D114 VHH之親和力成熟 使 VHH DLLBII101G08 及 DLLBII115A05 經受兩個 <盾 親和力成熟。 在第一循環中，使用易出錯PCR方法在構架（FW)及互_ 決定區（CDR)兩者中隨機引入胺基酸取代。突變誘發係μ 兩輪基於卩〇11之方法（自8打&1&861^，1^>[〇11&，€八，118八獲得 之Genemorph II隨機突變誘發套組）來進行，該方法使用i ng DLLBII101G08 或 DLLBII115A05 cDNA 模板，隨後使用 0_1 ng之第1輪產物進行第二易出錯PCR。在精製步驟之 後，將PCR產物經由獨特限制位點插入經設計以便於噬菌 體呈現VHH文庫的載體中。使用遞減濃度之經生物素標記 重組人類DLL4(biot-rhDLL4)及胰蛋白酶溶離來進行連續 多輪之溶液中選擇（in-solution selection)。亦於第三輪中 使用冷rhDLL4(至少比biot-rhDLL4過量100倍）進行親和力 驅動選擇（affinity-driven selection)。關於鼠類 DLL4 之選 擇不包括在内，因為交叉反應性（之保留）係在篩檢層次上 加以評估。使用源自pUC 119之表現載體產生呈重組蛋白 質形式之個別突變體，該表現載體含有LacZ啟動子、安比 西林抗性基因、多重選殖位點及ompA前導序列（ρΑΧ50) ° 150860.doc -88 - 201124533 大腸桿菌TG1細胞經表現載體文庫轉型且塗佈於瓊脂培養 盤（LB+Amp+2%葡萄糖）上。自瓊脂培養盤挑取單一群落且 在1 mL 96深孔培養盤中培養。藉由添加IPtg(1 mM)來誘 導VHH表現。根據標準方法製備周質提取物（體積約8〇 pL) 且在 Prote〇n(BioRad，Hercules，CA，USA)解離速率檢定中 針對對重組人類及小鼠DIM之結合加以篩檢。簡言之， GLC ProteOn感測器晶片在「配位體通道」L2&L4(L1/L3 作為參考通道）上經重組人類D114塗佈，而「配位體通道」 L3及L6經小鼠DU4塗佈。將親和力成熟純系之周質提取物 稀釋10倍且橫跨「分析物通道」A1-A6加以注射。計算存 在於培養盤中之野生型純系之平均解離速率且充當計算解 離速率改良之參考。 在第二循環中，藉由同時隨機化在第一循環中鑑別之敏 感位置來產生組合文庫。為此，使用在隨機化位置處經簡 併（NNS)之寡核苷酸經由重疊PCR來合成全長 DLLBII101G8 或 DLLBII115A05 cDNA 且進行補救 PCR。如 上（實例2)所述，使用特定限制位點將隨機化VHH基因插 入噬菌體呈現載體（pAX5 0)中。如先前所述製備個別VHH 純系之周質提取物。
ProteOn解離速率檢定中針對結合於重組人類DU4進行的 篩檢鑑別出解離速率改良多達38倍（DLLBII101G08)及11倍 (DLLBII115A05)的純系（表 15)。 表15 : DLLBII101G0 8及DLLBII115A05親和力成熟純系的 解離速率篩檢 150860.doc -89· 201124533 hDLL4 kdis'1) 倍數 mDLL4 kdCs'1) 倍數 DLLBII101G08 2.2E-03 1 6.7E-03 1 DLLBII129D08 5.9E-05 38 1.9E-04 35 DLLBII129H04 6.8E-05 33 2.5E-04 27 DLLBII129G10 7.3E-05 31 2.6E-04 26 DLLBII129H07 7.4E-05 30 2.5E-04 27 DLLBII129B02 7.6E-05 30 2.6E-04 26 DLLBII129E11 8.0E-05 28 2.5E-04 26 DLLBII130F06 6.5E-05 27 2.6E-04 19 DLLBII130B03 6.7E-05 27 2.4E-04 20 DLLBII129D01 8.5E-05 26 2.6E-04 26 DLLBII130D06 6.9E-05 26 3.1E-04 16 DLLBII129G09 8.8E-05 26 3.4E-04 20 DLLBII129B05 9.3E-05 24 3.4E-04 20 DLLBII130E03 7.5E-05 24 2.7E-04 18 DLLBII129H05 9.4E-05 24 3.5E-04 19 DLLBII130A05 7.5E-05 24 3.0E-04 17 DLLBII130B02 7.8E-05 23 2.9E-04 17 DLLBII129H02 9.9E-05 23 3.4E-04 19 DLLBII130B04 8.3E-05 22 2.9E-04 17 DLLBII129E07 1.1E-04 21 2.8E-04 24 DLLBII129E03 1.1E-04 20 3.6E-04 18 DLLBII129A03 1.2E-04 19 3.8E-04 18 將DLLBII101G08及DLLBII115A05變異體中之最佳變異 體以與C-末端c-myc標籤及（His)6標籤同框之方式選殖入表 現載體ρΑΧΙΟΟ中。關於重組小鼠D114之解離速率亦得以改 良。VHH係以標記His6之蛋白質形式在大腸桿菌中產生且 經由IMAC及SEC來純化。所選用於進一步表徵之VHH之 序列分別呈現在表 16(DLLBII101G08)及表 17(DLLBII115A05) 中〇 150860.doc -90- 201124533
H畹翱淀噠 9^^'W809I0I :9K FR4 WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS CDR3 >-< cu DC CC Q cu a <C. >H cc ^ >H cu < a cC Eh Q X CU Q p£ >h lx ω >H 〇4 ω CC Eh Q >H 〇A Q «; >· a hJ >H 〇4 CC 口 CC Q >H cu 〇 ^ >-* c2 hJ >H Oj ω a： h Q >-* CU Q Λ； >-< a ω >H a, < cC a >h CU Q Λ； >H c2 j >-* CM < ff： Eh Q >H Oj Q fiC >H (X ω FR3 m 2 2 〇 >2 Eh < 2 U ^ >H <C >n 2 > Q < CC H C/5 Q μ ω H Cu Ρύ a： j cn 2 S a >H > 2 Eh < 2 U < >-< 2 > a < CC E-< CO Q M C£1 Eh Oj a： ^ CO 2 2 σ >* >2 < z u 乂 >H < >H z > Q < 〇ί E-1 CO Q 1—1 CJ Eh Oj Ui父 CC hJ CO 2 S >-< >2 2 U ^ >H < >H 2 > 9 << CC H W Q μ ω E-H CU OC： hJ CO z s o >H > z H < 2 O ^ >H <C >H 2 > 9 < CC H CO Q Hi W H CU CC hJ w z 2 〇 >H >2 曰c 2 L) ¥ >H < >H z > a c a： E-* W Q μ ω Eh CU Ua ^ a： hj CO 2 〇 ίΜ >2 E- < ZU ^ >H < >H 2 > a < a： Eh CO Q M Cx3 H CLj ct： t-q i CDR2 >H < Eh 〇 〇 o a C/) > S co a； a M rf； >H < H e) 〇 o a cn > SC/} QC q M < < >1 >H < Eh o a o o w > s w CC Q M < < >H >-· < H 〇 〇 ο o CO > S co VC D M < < >H < o e) o o C/D > Οί Q M < < >-· >H < 卜 o o ϋ o C〇 > S cn CC Q M <C < >H >H < ◦ 〇 o o CO > ：s的 CC Q M < <c >-· 1 ω a； ω cu < o CC < ^ > ω a ω CU < 〇i cc < >H > ω Pi ω 乂 cu < 〇t Di < >h > S >H ω a： ω o CL. <c o qC <C >-* > ω Cd ω 〇 CU < a a： < >H > ^ >H ω a： ω 〇 〇4 < 〇 Di < h > ω cc ω O cu c o DC： < >H > S >n i CDR1 1 >H CO < >> in 麵 >H U： < s c >H m 1 in 麵 >-« 1 >H C/D FR1 ◦ w < lu > VC ^ 〇 〇 w u < u < w u ω in > ^ O hJ > cn ω o O CO < Cu 〇 Eh > cC hJ a C5 CO o i o < u ω w > ^ e a： O > in ω 〇 Ο a) C Du O Eh > CC Θ 〇 O CO CD k. O < W CJ U3 (/) > Θ Pi O > co ω u O w < Cu O ^ > 0C ^ o a c〇 o <c o fi m u ω cn > j J a： O J > CO ω o O CD < Dm Ο Eh > νά ι-q 〇 〇 CO e) < CO 〇 ω c〇 > j j a： O J > w ω o ◦ CO < Du a H > VC q e? O C0 o o < CO 〇 ω w > θ ^ PC a ^ > CO ω 〇 〇 W < Pm OH > CC Θ U 〇 C〇 O < (J < cn a ω co > θ hJ cc： O hJ > (/) ω 〇 VHH ID SEQ ID NO i Μ Γ0 HO CQ f=C J⑦H ^ CN 04 m m M o OQ CQ t-ί cn pg 宮 CN CN M 00 Μ O OQ Q i-i (η ^ CNJ CNJ M 1—1 1—1 rH cq ω t-J <Τ» ^ ^ CNJ CM m r~ M 〇 m x θ⑦in g CM 〇vj Μ Γ0 Μ O CQ QQ J O H^l r〇 CSJ O t—H H M 〇 ω U4 g 00 cn 150860.doc -91 · 201124533 150860.doc FR4 i_ WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS WGQGTQVTVSS CDR3 _ DRYIWARQGEYWG AYQYDY 〇 >H 〇 a a： < S Q M >H >H < 〇C >h Q < 〇 >H lx] 〇 〇 cc < >H S Q M >H >-· < Q忒 o s >H 〇 〇 a： < >H S Q M >H >H < CC >* Q < u >H ω o o a： < >-· S Q M >H >h ω οί >-· Q < CJ S >-· CJ 〇 a cc S Q M >H >H < 〇i >H Q < FR3 >H 〇 Eh >h 2 > ^ a： < H 2 Q D CJ CC CU CO ¥ M E-* CO 2 CC s S含 hJ >-· gg q ω CC Oj co « M hJ H CO Du 2 〇i S >H U hJ ^ H >H <1； H 2 Q Q ω cc； cu CO M hJ Eh CO Z a： S >· u J >H H >-· a： H Z Q q ω a： cu co ^ HH hJ Eh CO Du Z as >< CJ hJ >H Eh >h < H Z Q Q Ci3 VC CL. CO ^ M Eh CO Uj 2 〇i S >H U >h Eh >h 2 > ^ < < Η 2 Q q ω cti Oy CO ^ M h cn Du 2 ai s CDR2 >H Pm H CO 〇 〇 〇 O W > Z >h M Q < H >H >H Eh CO 〇 ϋ 〇 ϋ ^ W > 2 >H M Q < »=C >H H w 〇 〇 w > 2 >· M Q < H >t Eh CO 〇 o o 〇 ^ CO > 2 h M Q W H >H Eh CO 〇 o e? ◦ β CO > 2 >H M Q w < >H >H fH 03 〇 e? e) ◦ 乂 C/D > 2 >H HQ < <c g Oj 〇 〇 Oi w a： co cC > > s ^ ω a. 〇 ¥ (J cu CO oi cn oi > > S s ω CU ◦ 〇 〇4 CO cC CO a： > > S 萁w Οι 〇 ◦ CU CO CC CO cc > CU 〇 〇4 CO a： co cc > > & s ω Qj o CJ} cu CO a： w a； > > S 萁ω 1 CDR1 ___ w s Q >H CO CO 2 Q >H co Σ Q >H CO CO 2 Q >H CO C/} Q >H CO co 2 Q >h CO FR1 U 〇 Οι Du 〇 Eh > U4 ^ 〇 ◦ CO O < 〇 < U) U CJ CO > J 〇 d > CO ω 〇 e> 〇 〇4 Du a h > tu J o o w O OL 〇 »i CO U ω w > ^ θ oi σ kJ > w ω 〇 〇 〇 〇4 U, OH J O e> w e? »5 W CJ ω w > ^ j a： O 口 > CO Ci] 〇 o 〇 i—i a Eh > U4 ^ e? c> w U sC o < CO u ω w > J h-q oi O > C/} ω cj O d a. i^. OH > hi C3 e? co ◦ < a < C/3 u ω w > d j cc a j > CO CJ o 〇 e? Οι H Ο H > Du ^ 〇 〇 CO e? < u < CO u ω w > e Θ cc； CX d > CO ω u VHH ID SEQ ID NO M IT) Μ O m < hJ 00 〇〇 ^ ro 〇j M <J\ Μ O CQ < ΓΟ CJV J ΓΟ m m HO CQ ID ►J ro 〇 ^ ro ro Μ O M iH PQ Q J守H ►J Γ0 (η O rH H卜 HO CQ U J CN ΓΟ r〇 Q rH M M 0Q m m ^ s n -92-
201124533 實例7 親和力成熟純化抗D114 VHH之表徵
如上（實例5)所述表現且純化VHH DLLBII101G08及 DLLBII115A05之親和力成熟變異體。在以下中對VHH進 行表徵：11〇114-1^〇“111競爭£[18八（實例5.1;表17;圖 10)、CHO-hD114/hNotchl-Fc及 CHO-mD114/hNotchl-Fc競爭 FMAT(實例 5.3 ;表 18 ;圖 11)、hDLLl 及 hJAGl 結合 ELISA 及 hD114/mD114/獼猴 D114 FACS(實例 5.8;表 19;圖 13 及 14，表20)、測定對hDLL4及mDLL4之結合親和力之 Biacore(實例5.7 ;表19，圖12)及DLL4介導之報導檢定（實 例 5.4 ;表 21 ;圖 16)。 表徵資料概述於表22中。總之，親和力成熟VHH展示親 和力及效能之明確改良，同時維持其對mD114及獼猴D114 之結合且未觀測到對hDLLl或hJAGl之結合。 表17 : hDLL4/hNotchl-Fc競爭ELISA中親和力成熟VHH的 IC50(nM)值 VHHID IC5〇(nM) 101G08 10.0 129A03 1.8 129B05 0.9 129D08 1.2 129E11 1.3 129H07 1.0 130B03 1.5 130F06 1.3 抗DLL4 Fab 1.5 150860.doc -93· 201124533 VHH ID IC5〇(nM) 115A05 7.5 133A05 2.1 133A09 1.5 133G05 2.0 134D10 1.3 136C07 1.4 015 0.9 抗 DLL4 Fab 1.2 表18 :阻斷人類Notchl/Fc與表現在CHO細胞上之人類或 小鼠DLL4之相互作用之親和力成熟純化VHH的IC50值
(nM)(FMAT) hDLL4 mDLL4 VHH ID ICs〇(nM) ICso(nM) 101G08 (wt) 69.3 140.5 129B05 7.4 14.4 129D08 7.8 11.0 129E11 8.1 12.3 DLL4 Fab 5.5 3.0 hDLL4 mDLL4 VHH ID ICso(nM) IC5〇(nM) 115A05 (wt) 106.7 348.9 133A09 6.6 18.6 133G05 5.9 12.0 136C07 8.0 31.2 015 5.7 21.2 DLL4 Fab 3.4 1.6
表19 :親和力成熟純化VHH對重組人類DLL4及小鼠DLL4 之親和力KD(nM) rhDLL4 rmDLL4 VHH ID 擊·、1) Ms·1) K〇(nM) ka(MV) kdis1) K〇(nM) 101G08(wt) 4.8E+04 2.3E-03 48.0 9.4E+04 5.6E-03 60.0 129A03 2.1E+05 1.2E-04 0.5 129B05 2.3E+05 7.9E-05 0.3 2.7E+05 3.1E-04 1.1 129D08 1.8E+05 6.4E-05 0.4 2.7E+05 2.0E-04 0.8 129E11 1.9E+05 9.0E-05 0.5 2.5E+05 2.9E-04 1.2 150860.doc •94- 201124533 129H07 1.6E+05 7.3E-05 0.5 130B03 2.2E+05 6.8E-05 0.3 130F06 2.0E+05 8.0E-05 0.4 抗 DLL4 Fab 2.3E+05 3.4E-04 1.5 rhDLL4 rmDLL4 VHH ID kaiM-'s'1) kdis'1) KD(nM) ka(MV) kdis'1) KD(nM) U5A05(wt) 2.5E+05 4.0E-03 16.0 1.7E+05 9. IE-03 53.0 133A09 4.4E+05 9.0E-04 2.1 3.5E+05 2.7E-03 7.8 133G05 5.9E+05 4.7E-04 0.8 4.7E+05 1.6E-03 3.4 136C07 6.2E+05 3.9E-04 0.6 5.0E+05 1.3E-03 2.6 015 4.5E+05 4.7E-04 1.0 3.5E+05 1.5E-03 4.3 抗 DLL4 Fab 2.3E+05 3.4E-04 1.5 表 20 :結合 CHO-hDLL4、CHO-mDLL4及 CHO-cDLL4 之親
和力成熟VHH的EC5〇(nM)值 hDLL4 mDLL4 cDLL4 VHH ID EC“nM) — ECso(nM) EC5〇(nM) 101G08(wt) 17.5 11.2 129B05 9.7 3.9 3.9 129D08 9.6 3.7 3.8 129E11 1.4 4.1 4.2 抗DLL4 Fab 5.6 2.1 2.5 hDLL4 mDLL4 cDLL4 VHH ID ECWnM) ECso(nM) EC5〇(nM) U5A05(wt) 11.3 13.8 133A09 7.2 1.7 2.3 133G05 8.5 2.8 2.7 136C07 10.9 8.3 3.5 015 14.8 7.0 5.1 抗 DLL4 Fab 5.6 2.1 2.5 表21 : DLL4介導之報導檢定中親和力成熟VHH之IC5〇(nM)值 VHH ID IC5〇(nM) 101G08 (wt) 1940 129B05 60 129D08 77 129E11 98 DLL4 Fab 16 150860.doc 95- 201124533 VHHID IC5〇(nM) 115A05 (wt) 1340 133A09 87 133G05 104 133H05 25 133H07 35 134D10 18 136C07 226 015 18 DLL4 Fab 16 表22 :源自DLLBII101G08及DLLBII115A05之親和力成熟 VHH的特徵 ELISA FMAT hDLL4 FMAT mDLL4 FACS FACS FACS ELISA ELISA KD(nM) hDLL4 KD(nM) mDLL4 ic5〇 (_ ic5〇 (nM) ic5〇 (nM) EC50 (nM) EC50 (nM) ec50 (nM) hDLLl hJag-1 101G08 48.0 60.0 10.0 69.3 140.5 17.5 NF 11.2 nb nb 129A03 0.5 1.8 129B05 0.3 1.1 0.9 7.4 14.4 9.7 3.9 3.9 nb nb 129D08 0.4 0.8 1.2 7.8 11.0 9.6 3.7 3.8 nb nb 129E11 0.5 1.2 1.3 8.1 12.3 10.4 4.1 4.2 nb nb 129H07 0.5 1.0 130B03 0.3 1.5 130F06 0.4 1.3 DLL4 Fab 1.5 1.5 5.5 3.0 5.6 2.1 2.5 ELISA FMAT hDLL4 FMAT mDLL4 FACS FACS FACS ELISA ELISA KD(nM) hDLL4 KD(nM) mDLL4 IC5〇 (nM) IC5〇 (nM) IC5〇 (nM) ec50 (nM) ec50 (nM) EC50 (nM) hDLLl hJag-1 H5A05 16.0 53.0 7.5 106.7 348.9 1L3 NF 13.8 nb nb 133A05 2.1 133A09 2.1 7.8 1.5 6.6 18.6 12 1.7 2.3 nb nb 133G05 0.8 3.4 2.0 5.9 12.0 8.5 2.8 2.7 nb nb 134D10 1.3 136C07 0.6 2.6 1.4 8.0 31.2 10.9 8.3 3.5 nb nb 015 1.0 4.3 0.9 5.7 21.2 14.8 7.0 5.1 nb nb DLL4 Fab 1.5 1.2 3.4 1.6 5.6 2.1 2.5 nb :無結合 -96- 150860.doc 201124533 實例8 VHH DLLBII129B05及 DLLBII136C07之序列最佳化 將 DLLBII129B05(圖 17-A)及 DLLBII136C07(圖 17-B)之胺 基酸序列與人類生殖系VH3/JH共同序列進行比對。根據 Kabat對殘基編號，根據AbM定義（Oxford Molecular之AbM 抗體模型化軟體）CDR以灰色顯示。 對欲突變成其人類對應物之殘基加下劃線。 ^ 比對顯示DLLBII129B05相對於參考生殖系序列含有4個 構架突變。選擇位置14、64、83及108處之非人類殘基經 其人類生殖系對應物取代。構築且產生一組在此等位置上 具有不同人類殘基組合的2個DLLBII129B05變異體 (DLLBII017及 DLLBII018)(實例6 ; AA序列列於表23中）。 對於DLLBII13 6C07，VHH相對於參考生殖系序列含有4 個構架突變。選擇位置39、40、83及108處之非人類殘基 經其人類生殖系對應物取代。產生一組在此等位置處具有 φ 不同人類殘基組合的4個DLLBII136C07變異體 (DLLBII019、DLLBII020 ' DLLBII021、DLLBII022)(實例 6 ; AA序列列於表24中）。同時，藉由引入N52S突變來移 除位置N52-S52a處之潛在Asn脫醯胺位點（CDR2區域，參 見圖17-B加框之殘基）。在第二循環中，組合人類化成果 之容許突變與N52S取代，從而產生序列最佳化變異體 DLLBII036。構築另一在CDR1中包括F29I突變之序歹ij最佳 化變異體（DLLBII039)，該突變證明在DLL4介導之報導檢 定中增加 DLLBII136C07效能（表 21 ;圖 16)。DLLBII136C07 150860.doc •97- 201124533 之兩個序列最佳化變異體之序列列於表25中。 所有此等變異體皆以純化蛋白質形式在以下中進行表 徵：CHO-hDLL4/hNotchl-Fc及 CHO-mDLL4/hNotchl-Fc競 爭性FMAT檢定（實例5.3 ;表26 ;圖18)、DLL4介導之報導 檢定（實例5.4 ;表27 ;圖19)、DLL4 HUVEC增殖檢定（實 例5.9 ;表28)及測定親和力之Biacore(實例5.7 ;表29)。另 外，在熱位移檢定（thermal shift assay)中測定各純系之溶 化溫度（Tm)，該檢定係基於螢光信號在併入寶石橙（Sypro Orange)(Invitrogen)後增加（Ericsson 等人，Anal. Biochem. 357 (2006)，第289-298頁）》所有變異體在與親本 DLLBII129B05進行比較時皆顯示類似Tm值。表30概述此 等純系在pH 7下之Tm值。 表23:親本DLLBII129B05之單價序列最佳化抗DLL4 VHH 之序列ID及AA序列（FR，構架；CDR，互補決定區）
VHH ID SEQ ID NO FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DLLBII 017 34 EVQLVES GGGLVQP GGSLRLS CAASGRT FS SYAMA WYRQA PGKER EYVA AIRWSGG TAYYADS VQG RFTISRDNA KNTVYLQMN SLRPEDTAV YYCAN RAPDTRLAP YEYDH WGQGTLVT VSS DLLBII 018 35 EVQLVES GGGLVQP GGSLRLS CAASGRT FS SYAMA WYRQA PGKER EYVA AIRWSGG TAYYADS VKG RFTISRDNA KNTVYLQMN SLRPEDTAV YYCAN RAPDTRLAP YEYDH WGQGTLVT VSS 表24:親本DLLBII136C07之單價序列最佳化抗DLL4 VHH 之序列ID及AA序列（第1循環）(FR，構架；CDR，互補決定 區） •98· 150860.doc 201124533
VHH ID SEQ ID NO FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DLLBII 019 36 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFG SYDMS WVRRSP GKGPEW VS SINSGGG STYYADY VKG RFTISRDNA KNTLYLQMN SLRPEDTAV YYCAA DRYIWARQG EYWGAYEYD Y WGQGTLVT VSS DLLBII 020 37 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFG SYDMS WVRQSP GKGPEW VS SINSGGG STYYADY VKG RFTISRDNA KNTLYLQMN SLRPEDTAV YYCAA DRYIWARQG EYWGAYEYD Y WGQGTLVT VSS DLLBII 021 38 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFG SYDMS WVRRAP GKGPEW VS SINSGGG STYYADY VKG RFTISRDNA KNTLYLQMN SLRPEDTAV YYCAA DRYIWARQG EYWGAYEYD Y WGQGTLVT VSS DLLBII 022 39 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFG SYDMS WVRQAP GKGPEW VS S]；NSGGG STYYADY VKG RFTISRDNA KNTLYLQMN SLRPEDTAV YYCAA DRYIWARQG EYWGAYEYD Y WGQGTLVT VSS 表25 :親本DLLBII13 6C0 7之單價序列最佳化抗DLL4 VHH 之序列ID及AA序列（第2循環）(FR，構架；CDR，互補決定 區）
VHH ID S£Q ID NO FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DLLBII 036 40 EVQLVESG GGLVQPGG SLRLSCAA SGFTFG SYDMS WVRRAPG KGPEWVS SISSG GGSTY YADYV KG RFTISRDN AKNTLYLQ MNSLRPED TAVYYCAA DRYIWAR QGEYWGA YEYDY WGQG TLVT VSS DLLBII 039 41 EVQLVESG GGLVQPGG SLRLSCAA SGFTIG SYDMS WVRRAPG KGPEWVS SISSG GGSTY YADYV KG RFTISRDN AKNTLYLQ MNSLRPED TAVYYCAA DRYIWAR QGEYWGA YEYDY WGQG TLVT VSS
表26 : CHO-hDLL4及CHO-mDLL4競爭FMAT中序列最佳化 VHHs 之 IC5〇(nM)值 hDLL4 mDLL4 VHH ID ICs〇(nM) IC5〇(nM) 129B05 8.2 15.9 017 12.1 n/d 018 11.0 15.4 DLL4 Fab 5.8 4.3 n/d，未測定 -99- 150860.doc 201124533 hDLL4 mDLL4 VHHID IC5〇(nM) IC5〇(nM) 136C07 11.4 50.8 019 3.0 n/d 020 44.6 n/d 021 2.1 n/d 022 95.4 n/d 036 9.7 44.7 039 6.2 43.8 DLL4 Fab 5.4 4.3 n/d，未測定 表27 : DLL4介導之報導檢定中序列最佳化VHH之IC5Q(nM)值 hDLL4 VHH ID IC5〇(nM) 129B05 108 017 126 018 136 DLL4 Fab 23 hDLL4 VHHID IC5〇(nM) 136C07 112 019 n/d 020 n/d 021 n/d 022 n/d 036 78 039 16 DLL4 Fab 24 n/d， 未測定
表28 : DLL4介導之HUVEC增殖檢定中序列最佳化VHH之 IC50(nM)值 VHHID IC5〇(nM) 抑制(％) 129B05 3.7 100 018 5.3 100 DLL4 Fab 4.7 100 150860.doc -100- 201124533 VHHID ICso(nM) 抑制(％) 136C07 14.5 100 036 7.6 100 039 14.4 100 DLL4 Fab 4.7 100 表29 :序列最佳化VHH之親和力（Biacore)(對於參考， DLL4 Fab具有1.5 nM之親和力） VHH ID kaiM's'1) kais1) K〇(nM) 129B05 3.4E+05 7.9E-05 0.2 017 3.7E+05 8.0E-05 0.2 018 4.5E+05 9.4E-05 0.2 VHH ID ka(M V) kdis1) K〇(nM) 136C07 5.5E+05 5.2E-04 1.0 019 5.7E+05 7.4E-04 1.3 020 3.4E+05 9.3E-03 27 021 5.6E+05 5.7E-04 1.0 022 4.7E+05 2.2E-02 46 036 6.6E+05 5.5E-04 0.8 039 4.5E+05 8.1E-04 1.8
表30 :序列最佳化VHH之pH 7下的1^值（°(：)
VHH ID Tm(°C) 129B05 67.3 017 68.1 018 71.0 VHH ID Tm(°C) 136C07 68.1 019 69.0 020 69.0 021 69.0 022 70.3 036 71.4 039 69.4 實例9 不同VEGF形式之免疫誘導美洲駝中之艎液免疫反應 9.1免疫處理 150860.doc -101 - 201124533 在獸醫學學院之倫理委員會（University Ghent，Belgium) 核准之後，根據標準方案以6次肌肉内注射（在每週一次間 隔下每次給藥100或50 pg)重組人類VEGF109來使4隻美洲 駝（命名為第264、265、266、267號）免疫。第0天之首次注 射液係用完全弗氏佐劑（Difco, Detroit，MI，USA)調配，而 隨後注射液係用不完全弗氏佐劑（Difco，Detroit, MI，USA) 調配。此外，根據以下方案使四隻美洲駝（命名為第234、 23 5、280及281號）免疫：5次肌肉内注射KLH接合之人類 VEGH165(在兩週一次間隔下每次給藥100或50 gg)，隨後4 次肌肉内注射人類VEGF109(首次給藥100 pg，2週後在每 週一次間隔下每次給藥50 pg，共給藥3次）。 9.2對美洲駝中經VEGF誘導之免疫反應之評估 為了監測VEGF特異性血清效價，建立ELISA檢定，其 中將2 pg/mL重組人類VEGF165或VEGF109在4°C下於96孔 MaxiSorp培養盤（Nunc，Wiesbaden, Germany)中固定隔夜。 用醋蛋白溶液（1 °/〇 )阻斷各孔。在添加血清稀釋液之後，使 用辣根過氧化酶（HRP)接合之山羊抗美洲駝免疫球蛋白 (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) > 隨後在 受質 TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺）(Pierce, Rockford，IL， USA)存在下進行酶促反應來偵測經合之總IgG。對於美洲 駝264、265、266及267，進行另一 ELISA，評估對抗 VEGF165及VEGF109之同型特異性反應。依次使用特異性 識別習知美洲駝IgGl及僅有重鏈之美洲駝IgG2及IgG3之小 鼠 mAb[Daley 等人（2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380- 150860.doc .102- 201124533 386]、兔抗小鼠HRP接合物（DAKO)來偵測同型特異性反 應。使用TMB作為顯色受質來開發ELISA且在450 nm下量 測吸光度。各美洲駝之血清效價描述於表3 1中。 表31 :對抗VEGF165及VEGF109之抗體介導之特異性血清 反應。ELISA(經重組蛋白質塗佈之固相） 重i a 人類 VEGF165 重组人败 VEGF10 9 美洲駝 免疫原 總IgG IgGl IgG2 IgG3 總IgG IgGl IgG2 IgG3 •___ 234 VEGF165- KLH+VEGF109 ++ n/d n/d n/d Ή* n/d n/d n/d 235 VEGF165- KLH+VEGF109 ++ n/d n/d n/d ++ n/d n/d n/d n/d n/d 280 VEGF165- KLH+VEGF109 + n/d n/d n/d n/d 281 VEGF165- KLH+VEGF109 + n/d n/d n/d + n/d n/d n/d 264 VEGF109 n/d -H* + + -Η- + + 265 VEGF109 n/d -H- + + + + + +/- 266 VEGF109 n/d ++ + +/- ++ 267 VEGF109 n/d +/- - tlz_____ +/- - - n/d，未測定 實例10
經由噬菌體呈現選擇VEGF特異性VHH 僅有重鏈之抗體片段譜系之選殖及噬菌體之製備係如實 例2中所述來進行。VHH噬菌體文庫用於應用許多選擇條 件之不同選擇策略中。變數包括i)VEGF受：白質形式 (rhVEGF165、rhVEGF109 或 rmVEGF164) ’ H)抗原呈現方 法（固相：直接塗佈或經由在中性鏈親和素塗佈之培養盤 上之生物素標籤；溶液相：在溶液中培育’隨後在中性鍵 親和素塗佈培養盤上捕捉），iii)抗原濃度及iv)溶離方法 (胰蛋白酶溶離或使用VEGFR2之競爭性溶離）°所有選擇 皆在 Maxisorp 96孔培養盤（Nunc，Wiesbaden，Germany)中 •103- 150860.doc 201124533 進行。 如下進行選擇：在室溫下將噬菌體文庫與可變濃度之 VEGF抗原（在溶液中或固定於固體支撐物上）一起培育。在 培育2小時且澈底洗滌之後，溶離經結合噬菌體。倘若胰 蛋白酶用於噬菌體溶離，則藉由添加0.8 mM蛋白酶抑制劑 AEBSF即刻中和蛋白酶活性。將展示超過背景值之增濃的 噬菌體輸出用於感染大腸桿菌。經感染大腸桿菌細胞用於 製備下一輪選擇之噬菌體（噬菌體補救）或塗佈於瓊脂培養 盤（LB+amp+葡萄糖2%)上用於分析個別VHH純系。為了篩 檢特異性結合物之選擇輸出，自瓊脂培養盤挑取單一群落 且在1 mL 96深孔培養盤中培養。藉由添加IPTG(終濃度為 0.1-1 mM)來誘導受LacZ控制之VHH表現。根據標準方法 製備周質提取物（體積約80 μι)。 實例11 VEGF結合（非受體阻斷）及VEGF阻斷（受體阻斷）VHH之鑑別 經由ELISA測試周質提取物對人類VEGF165之結合。簡 言之，2 pg/mL重組人類VEGF165在4°C下於96孔MaxiSorp 培養盤（Nunc, Wiesbaden, Germany)中固定隔夜。用酷蛋白 溶液（1%)阻斷各孔。在添加通常稀釋10倍之周質提取物之 後，使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP接合物（DAKO) 來偵測VHH結合。展示高於背景值3倍以上之ELISA信號 的純系視為VEGF結合VHH。 此外，在人類VEGF165/人類VEGFR2 AlphaScreen檢定 中篩檢周質提取物以評估VHH的阻斷能力。使用硫代- 150860.doc •104· 201124533 NHS-LC 生物素（Pierce, Rockford，IL，USA)對人類 VEGF165進行生物素標記。根據製造商說明書（Perkin Elmer, Waltham，MA，US)使用偶合至受者珠粒之抗人類Fc VHH來捕捉人類VEGFR2/Fc嵌合體（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。為了評估VHH之中和能力，用含 有 0.03% 吐溫 20(Tween 20，Sigma-Aldrich)之 PBS 緩衝液將 周質提取物稀釋25倍且在室溫（RT)下與0.4 nM經生物素標 記人類VEGF165 —起預培育15分鐘。將受者珠粒（10 pg/ml)及0.4 nM VEGFR2 huFc添加至此混合物中且在RT下 於黑暗中再培育1小時。隨後添加供者珠粒（10 pg/ml)，接 著在RT下於黑暗中培育1小時。藉由使用680 nm之激發波 長及介於520 nm與620 nm之間的發射波長在Envision多標 記培養盤讀取器（Perkin Elmer，Waltham, MA，USA)上讀取 培養盤來量測螢光。含有無關VHH之周質提取物用作陰性 對照組。含有能夠使螢光信號相對於陰性對照信號減少 60%以上之抗VEGF165 VHH的周質提取物鑑別為擊中物 (hit)。AlphaScreen中鑑別出之所有擊中物皆在競爭ELISA 中加以確認。為此，將1 pg/mL人類VEGFR2嵌合體（R&D Systems, Minneapolis, MN，USA)塗佈於 96 孔 MaxiSorp 培養 盤（Nunc，Wiesbaden, Germany)中。將稀釋5倍之周質提取 物於含有0.1 %路蛋白及〇·〇5%吐溫20(Sigma-Aldrich)之PBS 緩衝液中在固定濃度（4 nM)的經生物素標記人類VEGF165 存在下培育。使用辣根過氧化酶（HRP)接合之extravidin (Sigma, St Louis，MO, USA)來偵測此等 VHH/bio-VEGF165 150860.doc -105- 201124533 複合物對人類VEGFR2嵌合體塗佈之培養盤的結合。選擇 用於進一步表徵之抑制性（受體阻斷）VHH及VEGF結合（非 受體阻斷）VHH之VHH序列ID及相應AA序列分別列於表32 及表33中。 表32 :選擇用於進一步表徵之單價受體阻斷抗VEGF VHH 之序列ID及AA序列（FR，構架；CDR，互補決定區）
VHH ID/ SEQ ID NO: FRl CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 VEGFBI I 23A06 42 EVQLVES GGGLVQP GDSLKLS CAFSGRT FS SYSMG WFR QAQ GKE REF VV AISSG GFIYD AVSLE G RFTISRDN TKNTVYLQ TPSLKPED TAVYYCAA SRAYGSSR LRLADTYD Y WGQGT QVTVS S VEGFBI I 23B04 43 EVQLVES GGGLVQT GDSLRLS CEVSGRT FS SYSMG WFR QAQ GKE REF W AISKG GYKYD SVSLE G RFTISKDN AKNTVYLQ INSLKPED TAVYYCAS SRAYGSSR LRLADTYE Y WGQGT QVTVS S VEGFBI I 24C04 44 EVQLVES GGGLVQP GDSLKLS CVASGRT SS SYSMG WFR QAQ GKE REF W AISSG GYIYD SVSLQ G RFTISRDN TKNTVYLQ TPSLKPED TAVYYCAA SRAYGSSR LRLADTYD Y WGQGT QVTVS S
表33 :選擇用於進一步表徵之單價非受體阻斷抗VEGF VHH之序列ID及AA序列（FR，構架；CDR，互補決定區）
VHH ID/ SEQ ID NO: FRl CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 VEGFBII 05B05 45 EVQLVE SGGGLV QPGGSL RLSCVA SGIRFM SMA WYRQA PGKHR ELVA RISSGGT TAYVDSV KG RFTISRDNS KNTVYLQMN SLKAEDTAV YYCNT FSSRPNP WGAGT QVTVS S VEGFBII 10E07 46 EVQLVE SGGGLV QAGGSL RLSCAA SGRTFS NYAM G WFRQA PGKER VLVA DISSSGI NTYVADA VKG RFTISRDNA KNTVYLQMN SLKPEDTAV YYCAA SAWWYSQM ARDNYRY WGQGT QVTVS S VEGFBII 86H09 47 EVQLVE SGGGLV QAGGSL RLSCTA SGSAFK SYRM G WFRRT PGKED EFVA SISWTYG STFYADS VKG RFTMSRDKA KNAGYLQMN SLKPEDTAL YYCAA GAQSDRYN IRSYDY WGQGT QVTVS S __ · • 106· 150860.doc 201124533 在 Biacore(Biacore T100儀器，GE Healthcare)上分析受 體阻斷VHH之解離速率。HBS-EP+緩衝液用作操作緩衝液 且實驗在25。(：下進行。重組人類VEGF165藉由胺偶合（使 用EDC及NHS)以不可逆方式被捕捉在CM5感測器晶片上直 至+/-1500 RU之目標程度。在固定之後，注射10分鐘1 M 乙醇胺（pH8.5)來使表面失活。參考表面分別用EDC/NHS 及乙醇胺來活化及失活。VHH之周質提取物於操作緩衝液 中稀釋10倍以45 μΐ/min注射2 min且使其解離1〇或15 min。 在不同樣品之間，用再生緩衝液再生表面。藉由減去關於 參考通道之曲線及空白操作緩衝液注射而對資料進行雙重 參考處理。藉由在Biacore T100評估軟體v2.0.1中擬合兩階 段衰減模型（two phase decay model)來評估經處理曲線之 解離階段。快速kd、緩慢kd及快速％之值列於表34中。 表34:用Biacore對受體阻斷VHH解離速率的測定 VHHID Μ快速） kd(緩慢） 快速％ 結合程度(RU) VEGFBII23B04 8.80Ε-03 4.00E-05 12 768 VEGFBII24C04 1.30Ε-02 3.40E-05 17 456 VEGFBII23A06 1.70Ε-02 3.70E-05 13 1 547 實例12 純化抗D114 VEGF VHH之表徵 選擇以下三個抑制性抗VEGF VHH以純化蛋白質形式來 進一步表徵：VEGFBII23B04、VEGFBII24C04及VEGFBII23A06。 此等VHH在大腸桿菌TG1中表現為c-myc、標記His6之蛋白 質。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現且使其在37°C下繼續 4小時。在旋轉細胞培養物之後，藉由凍融集結粒來製備 150860.doc -107- 201124533 周質提取物。此等提取物用作起始物質經由IMAC及尺寸 排阻層析法（SEC)純化VHH。最終VHH製備物展示如經由 SDS-PAGE評估之95%純度。 12.1在人類VEGF165/人類VEGFR2-FC阻斷ELISA中對阻斷 人類VEGF165/VEGFR2之VHH的評估 在人類VEGF165/人類VEGFR2-FC阻斷ELISA中評估VHH 之阻斷能力。簡言之，將1 pg/mLVEGFR2-Fc嵌合體（R&d Systems, Minneapolis, MN，USA)塗佈於 96 孔 MaxiSorp 培養 盤（Nunc, Wiesbaden，Germany)中。將於含有0.1%路蛋白及 0.05%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中之一系列純化VHH稀 釋液（濃度範圍1 mM-64 pM)在4 nM經生物素標記VEGF165 存在下培育。使用辣根過氧化酶（HRP)接合之extravidin (Sigma，St Louis，MO，USA)及TMB作為受質來偵測bio-VEGF165對VEGFR2之剩餘結合。貝伐單抗（Avastin®)及雷 珠單抗（Ranibizumab，Lucentis®)作為對照一起進行處理。 圖20中展示劑量抑制曲線，表35中概述相應IC50值及抑制 % 〇 表 35 :單價 VHH 在 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 競爭 ELISA 中之 IC5〇(nM)值及抑制％ VHHID IC5〇(nM) 抑制％ VEGFBII23B04 2.1 100 VEGFBII23A06 3.0 100 VEGFBII24C04 2.5 100 雷珠單抗 1.6 100 貝伐單抗 1.7 100 12.2在人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc阻斷ELISA中對阻斷 150860.doc -108· 201124533 人類VEGF165/VEGFR2之VHH的評估 亦在人類VEGF165/人類VEGFRl-Fc阻斷ELISA中評估 VHH。簡言之 ’ 2 pg/mL VEGFRl-Fc嵌合體（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)塗佈於 96 孔 MaxiSorp 培養盤（Nunc, Wiesbaden, Germany)中。使於含有0.1%酷·蛋白及0.05%吐 溫20(Sigma)之PBS緩衝液中之一系列純化VHH稀釋液（濃 度範圍1 mM-64 pM)在0.5 nM經生物素標記VEGF165存在 下培育。使用辣根過氧化酶（HRP)接合之extravidin(Sigma, St Louis, MO, USA)及 TMB作為受質來偵測bio-VEGF165 對 VEGFR1之剩餘結合。貝伐單抗、雷珠單抗及無關VHH (2E6)作為對照一起進行處理。圖2 1中展示劑量抑制曲 線，表36中概述相應IC50值及抑制％。 表 36 :單價 VHH 在 hVEGF165/hVEGFRl-Fc 競爭 ELISA 中之 IC5G(nM)值及抑制％ VHH ID ICso(nM) 抑制％ VEGFBII23B04 0.5 64 VEGFBII23A06 0.9 55 VEGFBII24C04 0.8 71 雷珠單抗 1.2 91 貝伐單抗 1.5 96
12.3 在人類 VEGF165/人類 VEGFR2-Fc 阻斷AlphaScreen 中 評估抗 VEGF165 VHH 亦在人類 VEGF165 / 人類 VEGFR2-Fc 阻斷 AlphaScreen 中 評估VHH之阻斷能力。簡言之，將於含有0.03%吐溫20 (Sigma)之PBS緩衝液中之一系列純化VHH稀釋液（濃度範 圍：200 nM-0.7 pM)添加至 4 pM bio-VEGF165 中且培育 15 150860.doc -109- 201124533 min。隨後添加VEGFR2-Fc(0.4 nM)及抗Fc VHH塗佈之受 者珠粒（20 pg/ml)且在黑暗中培育此混合物1小時。最後， 添加抗生蛋白鏈菌素供者珠粒（20 gg/ml)且在黑暗中培育1 小時後在Envision微定量盤讀取器上量測登光。圖22中展 示劑量-反應曲線。表37中概述阻斷人類VEGF165·人類 VEGFR2-FC相互作用之VHH的IC50值。 表 37 : VHH 在 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 競爭 AlphaScreen 中之ICso(pM)值及抑制。/〇 VHHID ICs〇(pM) 抑制％ VEGFBII23B04 160 100 VEGFBII23A06 250 100 VEGFBII24C04 250 100 雷珠單抗 860 100
12.4 在人類 VEGF165/人類 VEGFRl-Fc 阻斷AlphaScreen 中 評估抗 VEGF165 VHH 亦在人類 VEGF165/人類 VEGFRl-Fc 阻斷 AlphaScreen 中 評估VHH之阻斷能力。簡言之，將於含有0.03%吐溫20 (Sigma)之PBS緩衝液中之一系列純化VHH稀釋液（濃度範 圍：500 ηΜ-1·8 pM)添加至 0·4 nM bio-VEGF165 中且培育 15 min。隨後添加VEGFR1-Fc(l nM)及抗Fc VHH塗佈之受 者珠粒（20 gg/ml)且在黑暗中培育此混合物1小時。最後， 添加抗生蛋白鍵菌素供者珠粒（20 pg/ml)且在黑暗中培育1 小時後在Envision微定量盤讀取器上量測螢光。圖23中展 示劑量-反應曲線。表38中概述阻斷人類VEGF165-人類 VEGFRl-Fc相互作用之VHH的IC50值及抑制％。 表 38 : VHH在 hVEGF165/hVEGFRl-Fc競爭 AlphaScreen 中 150860.doc -110- 201124533 之IC5〇(nM)值及抑制。/〇 VHHID ICso(nM) 抑制％ VEGFBII23B04 0.9 41 VEGFBII23A06 0.4 46 VEGFBII24C04 0.2 53 雷珠單抗 3.3 79 12.5人類VEGF165-VHH相互作用之親和力之測定 在 Biacore T100儀器上經由 SPR分析 VHH VEGFBII23B4 與hVEGF165之結合動力學。重組人類VEGF165藉由胺偶 合（使用EDC及NHS)直接固定在CM5晶片上。在介於1〇與 3 60 nM之間的不同濃度下分析VHH。樣品注射2 min且使 其在45 μΐ/min之流速下解離多達20 min。在樣品注射之 間，用100 mM HC1再生晶片表面。HBS-EP+(Hepes緩衝液 (pH 7.4)+EDTA)用作操作緩衝液。經由Biacore T100評估 軟體ν2·0.1使用兩態反應模型（Two State Reaction model)擬 合結合曲線。計算出之抗VEGF VHH的親和力列於表39 中。 表39 :純化VHH對重組人類VEGF165之親和力KD(nM) VEGF165 VHHID ka (MV) kal (MV) ka2 (mV1) kd (s1) kai (S·1) kd2 (s·1) KD (nM) VEGFBII23B04W - 2.1E+05 1.4E-02 - 8.6E-03 2.4E-04 0.7 VEGFBII23A06W - 4.2E+05 2.0E-02 - 5.7E-02 1.0E-04 0.7 VEGFBII24C04W - 3.2E+05 1.8E-02 - 2.6E-02 9.6E-05 0.4 ⑷導致非1:1擬合之異質結合曲線，經由Biacore T100評估 軟體v2.0.1使用兩態反應模型來擬合曲線 12.6對小鼠VEGF164之結合 使用結合ELISA來確定對小鼠VEGF164之交叉反應性。 150860.doc .111 - 201124533 簡言之’重組小鼠 VEGF164(R&D Systems, Minneapolis, MS，USA)在4°C下在1 pg/mL下於96孔MaxiSorp培養盤 (Nunc，Wiesbaden，Germany)中塗佈隔夜。用路蛋白溶液 (1 %於PBS中）阻斷各孔。VHH係以於含有0.1%酪蛋白及 0.05%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中之一系列稀釋液（濃度 範圍：500 nM-32 pM)形式加以施用，且使用小鼠抗myc (Roche)及抗小鼠HRP接合物（DAKO)隨後在受質 丁1^8(3,3，，5,5，-四甲基聯苯胺）(？161^6，11〇〇1^(^(1，1[，1；8八) 存在下進行酶促反應來偵測結合（圖24)。包括小鼠 VEGF164反應性mAb作為陽性對照。亦量測對人類 VEGF165之結合作為參考。EC50值概述於表40中。 表40 : VHH在重組人類VEGF165及小鼠164結合ELISA中 的 ECs〇(pM)值
rhVEGF165 rmVEGF164 VHHID ECso(pM) ECso(pM) VEGFBII23B04 297 NB VEGFBII24C04 453 NB VEGFBII23A06 531 NB NB，無結合 12.7對VEGF121之結合 經由固相結合ELISA評估對重組人類VEGF121之結合。 簡言之，重組人類 VEGF121(R&D Systems，Minneapolis, MS, USA)在4°C下在1 pg/mL下於96孔MaxiSorp培養盤 (Nunc, Wiesbaden, Germany)中塗佈隔夜。用酷蛋白溶液 (1%於PBS中）阻斷各孔。VHH係以於含有0.1%酪蛋白及 0.05%吐溫20(Sigma)之PBS緩衝液中之一系列稀釋液（濃度 150860.doc 112 201124533 範圍：500 nM-32 pM)形式加以施用，且使用小鼠抗myc (Roche)及抗小鼠HRP接合物（DAKO)隨後在受質TMB (3,3’，5,5'-四甲基聯笨胺）(Pierce，Rockford, IL, USA)存在 下進行酶促反應來偵測結合（圖25)。一系列VEGFR2稀釋 液作為陽性對照一起進行處理^ EC5G值概述於表41中。 表41 :單價VHH在重組人類VEGF121結合ELISA中的 EC50(pM)值 VHH ID ECsnipM) VEGFBII23B04 510 VEGFBII24C04 792 VEGFBII23A06 928 12.8 對 VEGF 家族成員 VEGFB、VEGFC、VEGFD 及 PIGF 之结合 P1GF 之結合。簡言之，VEGFB、VEGFC、VEGFD及 P1GF (R&D Systems, Minneapolis，MS, USA)在 4°C 下在 1 pg/mL 下於 96孔 MaxiSorp培養盤（Nunc, Wiesbaden, Germany)中塗 佈隔夜。用酪蛋白溶液（1 %於PBS中）阻斷各孔。VHH係以 一系列稀釋液（濃度範圍：500 nM-32 pM)形式加以施用且 使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP接合物（Sigma, St Louis，MO，USA)來偵測結合。一系列適當受體稀釋液作 為陽性對照一起進行操作，且用辣根過氧化酶（HRP)接合 之山羊抗人類IgG(Fc特異性抗體）（Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)隨後在受 質 TMB(3,3，，5,5，_ 四曱基聯苯胺）(Pierce，Rockford, IL, 150860.doc -113· 201124533 USA)存在下進行酶促反應來偵測。圖26中展示VHH及對 照之劑量-反應曲線。結果顯示未偵測到所選VHH對 VEGFB、VEGFC、VEGFD 或 P1GF 之結合。 U.9抗原決定基重新分級 進行基於Biacore之抗原決定基重新分級實驗以研究哪些 VEGF結合物結合與VEGFBII23B04類似或重疊之抗原決定 基。為此，將VEGFBII23B04固定在CM5感測器晶片上。 對於各樣品，人類VEGF165通過晶片表面且由VEGFBII23B4 以可逆方式捕捉。接著在240秒之表面接觸時間及10微升/ 分鐘之流速下來注射純化VHH( 100 nM)或周質提取物（稀釋 10倍在不同樣品之間，用再生緩衝液（100 mM HC1)使 晶片表面再生。用Biacore T100評估軟體來評估經處理之 曲線。VHH可劃分為兩組：對捕捉VEGFBII23B04之 VEGF165產生額外結合的第1組及不能同時結合捕捉 VEGFBII23B04 之 VEGF165 的第 2 組（所選 VHH 24C04、 23A06及23B04在此組中）° 相同檢定設置用於評估VEGFR1、VEGFR2、雷珠單抗 及貝伐單抗是否能夠與VEGFBII23B04同時結合人類 VEGF-165。表 42 呈現對捕捉 VEGFBII23B04 之 VEGF165 的 額外結合反應。僅有VEGFR2不能結合捕捉VEGFBII23B04 之 VEGF165，從而強調 VEGFBII23B04對 VEGF-VEGFR2相 互作用之阻斷能力。此外，此等資料顯示VEGFBII23B04 抗原決定基不對應於貝伐單抗及雷珠單抗抗原決定基。 表42 : VEGFBII23B04之抗原決定基結合-基準抑制劑或同 150860.doc •114· 201124533 源受體對捕捉VEGFBII23B04之VEGF165之結合 注射步驟 結合 [樣品】 結合程度(RU) 1 VEGF 165 100 nM 1727 2 VEGFBII23B04 100 nM - 3 雷珠單抗 100 nM 763 4 貝伐單抗 100 nM 1349 5 VEGFR1 100 nM 1011 6 VEGFR2 100 nM - 12.10 HUVEC增殖檢定中抗VEGF VHH之表徵
在增殖檢定中評估所選VHH之效能。簡言之，使初級 HUVEC細胞（Technoclone)經受補充物饑餓隔夜，接著每孔 4000個細胞一式四份接種於96孔組織培養盤中。用33 ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激細胞。在第4天藉 由併入[3H]-胸苷來量測增殖速率。展示於表43中之 HUVEC增殖檢定結果說明VEGFBII23B04及貝伐單抗以 IC5〇<l nM抑制VEGF誘導之HUVEC增殖超過90%。 表 43 : VEGF HUVEC 增殖檢定中單價 VEGFBII23B04、 VEGFBII23A06及 VEGFBII24C04之 IC50(nM)值及抑制0/〇 VHH ID ICs〇(nM) 抑制〇/〇 VEGFBII 23B04 0.36 91 貝伐單抗 0.21 92 VHHID ICs〇(nM) 抑m〇 VEGFBII 23A06 4.29 73 VEGFBII 24C04 3.8 79 貝伐單抗 0.78 78 12.11 HUVEC Erk磷酸化檢定中抗VEGF VHH之表徵 在HUVEC Erk磷酸化檢定中評估所選VHH之效能。簡言 150860.doc 115· 201124533 之，使初級HUVEC細胞經受血清饑餓隔夜，接著用10 ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激5 min。用於PBS 中之4%曱醛固定細胞且使用磷酸ERK特異性抗體（抗磷酸 MAP激酶pERKl及pERK2，M8159, Sigma)及多株兔抗小鼠 免疫球蛋白-HRP接合物（P0161，Dako)經由ELISA來量測 ERK磷酸化程度。如表44中所示，VEGFBII23B4及貝伐單 抗以IC5〇<l nM抑制VEGF誘導之Erk磷酸化至少90%。 表44 : VEGF HUVEC Erk磷酸化檢定中單價VEGFBII23B04之 IC5G(nM)值及抑制％ VHHID ICsofnM) 抑制％ VEGFBII 23B04 0.37 90 貝伐單抗 0.63 98 實例13 多價抗VEGF阻斷VHH之產生 VHH VEGFBII23B04以基因改造方式融合至 VEGFBII23B04中以產生同源二聚VHH或融合至不同VEGF 結合VHH中以產生異源二聚（二價）VHH。為了產生二價 VHH，一組10個獨特VEGF結合VHH經由長度為9或40之 Gly-Ser可撓性連接子以兩種不同定向連接至 VEGFBII23B04。同源二聚 VEGFBII23B04(VEGFBII010)及 40個異源二聚二價VHH在大腸桿菌TG1中表現為標記c-myc、His6之蛋白質。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現且 使其在37°C下繼續4小時。在旋轉細胞培養物之後，藉由 凍融集結粒來製備周質提取物。此等提取物用作起始物質 150860.doc -116- 201124533 且經由IMAC及脫鹽來純化VHH，獲得如經由SDS-PAGE評 估為90%之純度。同源二聚及所選二價VEGF結合VHH之 AA序列展示於SEQ ID NO: 48-53及表45中。 表45 :所選二價抗VEGF VHH之序列ID、VHH ID及AA序 列
VHH ID/ SEQ ID NO: VHH ID AA^·列 VEGFB工I23B04 -35GS-23B04 48 VEGFBII010 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKG GYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRL ADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEV QLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKGGY KYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLAD TYEYWGQGTQVTVSS VEGFBII23B04 -9GS-5B05 49 VEGFBII022 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKG GYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRL ADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIR FMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNS LKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSS VEGFBII23B04 -40GS-5B05 50 VEGFBII021 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKG GYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRL ADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISS GGTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGA GTQVTVSS VEGFBII23B04 -40GS-10E07 51 VEGFBII023 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKG GYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRL ADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADI SSSGINTYVADAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQ MARDNYRYWGQGTQVTV S S VEGFBII23B04 -40GS-86H09 52 VEGFBII024 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKG GYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRL ADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASI SWTYGSTFYADSVKGRFTMSRDKAKNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRY NIRSYDYWGQGTQVTVSS VEGFBII10E07 -40GS-23B04 53 VEGFBII025 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSS GINTYVADAVKGRmSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMAR DNYRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAIS KGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRL RLADTYEYWGQGTQVTVSS 分別如實例12.3及12.4中所述在VEGFR2及VEGFR1阻斷 AlphaScreen檢定中測試40個二價VHH之組《基於抑制之 效能及最大程度選擇5個最佳二價VHH(VEGFBII021、 VEGFBII022、VEGFBI023、VEGFBI024及 VEGFBII025-參 見表45)用於進一步表徵。所選5個二價VHH在競爭性 -117· 150860.doc 201124533 VEGFR2及VEGFRl AlphaScreen中之篩檢結果的概述展示 於表46中。 表46 : 5個所選雙特異性二價VHH在VEGF/VEGFR1及 VEGF/VEGFR2競爭AlphaScreen檢定中之效能及功效 VHHID VEGFR2 VEGFRl ICso(pM) ICs〇(pM) 抑制％ VEGFBII021 9 16 100 VEGFBII022 7 8 100 VEGFBII023 38 44 91 VEGFBII024 12 46 100 VEGFBII025 51 39 82 實例14 形式化抗VEGF VHH之表徵 分別如實例12.1、12.2、12·3及12.4中所述在VEGFR2及 VEGFR1阻斷ELISA(分別參見圖27及圖28、表47及表48)及 AlphaScreen檢定（圖29及30、表49及50)中並排比較VHH VEGFBII010、VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBII023、 VEGFBII024及 VEGFBII025 » 表 47 :形式化VHH 在 hVEGF165/hVEGFR2-Fc 競爭 ELISA 中 之IC5G(pM)值及抑制％ VHHID ICso(pM) 抑制％ VEGFBII010 49 100 VEGFBII021 204 100 VEGFBII022 164 100 VEGFBII023 213 100 VEGFBII024 292 100 VEGFBII025 577 100 貝伐單抗 315 100 雷珠單抗 349 100 表 48 :形式化VHH 在 VEGF165/hVEGFRl-Fc 競爭 ELISA 中 之IC5G(pM)值及抑制％ 150860.doc •118, 201124533 VHH ID ICso(pM) 抑制％ VEGFBII010 73.5 67 VEGFBII021 254 97 VEGFBII022 225 89 VEGFBII023 279 91 VEGFBII024 326 92 VEGFBII025 735 91 貝伐單抗 484 91 雷珠單抗 594 96 表49 :形式化VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc競爭AlphaScreen 中之IC50(pM)值及抑制％ VHHID ICs〇(pM) 抑制％ VEGFBII010 16 100 VEGFBII021 7 100 VEGFBII022 7 100 VEGFBII023 46 100 VEGFBII024 50 100 VEGFBII025 51 100 雷珠單抗 600 100
表50 :形式化VHH 在 VEGF165/hVEGFRl-Fc 競爭AlphaScreen 中之IC50(pM)值及抑制％ VHHID IC5〇(pM) 抑制％ VEGFBII010 21 70 VEGFBII021 12 100 VEGFBII022 9 98 VEGFBII023 48 87 VEGFBII024 69 98 VEGFBII025 71 82 雷珠單抗 1300 87 此外，亦測試形式化VHH阻斷mVEGFbWmVEGFR^-huFc相互 作用之 能力。 簡言之 ，將 於含有 0.03% 吐溫 20(Sigma)之PBS緩衝液中之一系列純化VHH稀釋液（濃度 範圍：4 μΜ-14·5 pM)添加至0·1 nM經生物素標記 mVEGF164中且培育15 min。隨後，添加小鼠VEGFR2-huFc(0.1 nM)及抗huFc VHH塗佈之受者珠粒（20 pg/ml)且 150860.doc •119· 201124533 培育此混合物1小時。最後，添加抗生蛋白鏈菌素供者珠 粒（20 pg/ml)且在培育1小時之後在Envision微定量盤讀取 器上量測螢光。圖31中展示劑量-反應曲線。表51中概述 阻斷小鼠VEGF164/VEGFR2-huFC相互作用之VHH的IC50 值。 表 51 :形式 4匕抗 VEGF VHH在 mVEGF164/mVEGFR2-hFc競 爭AlphaScreen中之IC50(pM)值及抑制％ VHHID ICso(nM) 抑制％ VEGFBII022 108 100 VEGFBII024 - - mVEGF164 0.05 100 雷珠單抗 - - 亦在ELISA中測試形式化VHH結合mVEGF164及 rhVEGF165(實例 12.6 ;圖 32 ;表 52)、VEGF121(實例 12.7 ;圖 34 ;表 53)及 VEGF 家族成員 VEGFB、VEGFC、 VEGFD及P1GF(實例12.8 ;圖33)之能力。如實例12.5中所 述分析人類VEGF165之結合動力學。KD值列於表54中》 表52 :形式化VHH在重組人類VEGF165及小鼠VEGF164結 合 ELISA 中的 EC50(pM)值 rhVEGF165 rmVEGF164 VHHID ECso(pM) EC5«ipM) VEGFBII010 428 VEGFBII021 334 502 VEGFBII022 224 464 VEGFBII023 221 - VEGFBII024 320 - VEGFBII025 668 - 表53 :形式化VHH在重組人類VEGF121結合ELISA中的 EC50(pM)值 150860.doc -120· 201124533 rhVEGF121 VHHID ECso(pM) VEGFBII010 920 VEGFBII022 540 VEGFBII024 325 VEGFBII025 475 表54 :形式化純化VHH對重組人類VEGF165之親和力 KD(nM) VHH ID kai(l/Ms) k<n(l/s) ka2(l/s) kd2(l/s) K〇(nM)(a, VEGFBII010W 4.5E+05 1.7E-02 2.9E-02 1.3E-04 0.16 VEGFBII021W 1.2E+06 1.1E-02 2.3E-02 1.9E-04 0.07 VEGFBII022W 1.2E+06 9.1E-03 1.4E-02 2.6E-04 0.14 VEGFBII023W 3.0E+05 1.8E-02 2.4E-02 2.7E-04 0.69 VEGFBII024W 3.0E+05 1.3E-02 2.6E-02 2.8E-04 0.47 VEGFBII025W 3.3E+05 1.7E-02 1.8E-02 3.7E-04 1.1
(a) KD=kdl/kal*(kd2/(kd2+ka2)) (b) 經由Biacore 丁100評估軟體乂2.0.1使用兩態反應模型擬合 曲線 亦在VEGF介導之HUVEC增殖及Erk磷酸化檢定中測試 VHH VEGFBII010 、 VEGFBII022 、 VEGFBII024 及 VEGFBII025。 在增殖檢定中評估所選形式化VHH之效能。簡言之’使 初級HUVEC細胞（Technoclone)經受補充物鐵餓隔夜，接著 每孔4000個細胞一式四份接種於96孔組織培養盤中。用33 ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激細胞。在第4天藉 由併入[3H]·胸苷來量測增殖速率。展示於表55中之結果說 明形式化VHH及貝伐單抗以IC5Q<1 nM抑制VEGF誘導之 HUVEC增殖超過90〇/〇。 表55 :形式化VHH在VEGF HUVEC增殖檢定中之IC50(nM) 值及抑制％ 150860.doc -121 - 201124533 VHHID IC5〇(nM) 抑制％ VEGFBII010 0.22 95 VEGFBII021 0.40 98 —~ VEGFBII022 0.34 100 VEGFBII023 0.52 98 ~ VEGFBII024 0.38 96~ VEGFBII025 0.41 104 貝伐單抗 0.21 92~ 亦在HUVEC Erk磷酸化檢定中評估所選形式化VHH之效 能。簡言之，使初級HUVEC細胞經受血清饑餓隔夜，接 著用1 0 ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激5 min。用 於PBS中之4%曱醛固定細胞且使用磷酸ERK特異性抗體 (抗磷酸MAP激酶pERKl及2，M8159，Sigma)及多株兔抗小 鼠免疫球蛋白-1111?接合物（？0161，〇3让〇)經由£1^18八來量測 ERK磷酸化程度。如表56中所示，形式化VHH及貝伐單抗 以IC5〇〈l nM抑制VEGF誘導之Erk破酸化超過90%。 表56 :形式化VHH在VEGF HUVEC Erk磷酸化檢定中之 IC5G(nM)值及抑制°/〇 VHHID ICso(nM) 抑制％ VEGFBII010 0.19 92 VEGFBII021 0.21 103 VEGFBII022 0.18 94 VEGFBII023 0.25 100 VEGFBII024 0.23 94 VEGFBII025 0.23 99 貝伐單抗 0.63 98 實例15 序列最佳化 15.1 VEGFBII23B04之序列最佳化 將VEGFBII23B04之胺基酸序列與人類生殖系序列VH3-23(DP-47)及JH5進行比對，參見圖35 SEQ ID NO: 100。比 150860.doc -122- 201124533 對顯示VEGFBII23B04相對於參考生殖系序列含 架突變。選擇位置14、16、23、24、41、71、 108處之非人類殘基經其人類生殖系對應物取代 組在此等位置上具有不同組合之人類殘 VEGFBII23B04變異體（AA序列歹ij於表57中）。構 入S60A突變來移除位置D59S60處之潛在異； (CDR2區域，參見圖35，指示為粗斜體殘基）的 體。 有19個構 82 ' 83 及 。產生一 基的8個 築藉由引 虜化位點 另一變異
150860.doc -123- 201124533 (一一^戏辉·5" * Ήαυί 枨弊 * ή5f-i^vv W 鹩畹翱与举皭瓦^》寸ogsISfeopqA ffiffiA :卜S 啭 150860.doc WGQGTLVTVS S WGQGTLVTVS s WGQGTLVTVS S WGQGTLVTVS S WGQGTLVTVS S WGQGTLVTVS S WGQGTLVTVS S WGQGTLVTVS S WGQGTQVTVS S Γ0 Λ Q Ο CO H CO Q a c >H 1-q f=C ff： >-* a ι-q ω co a： >h W H O) Q LD < >H ^ Oi >· a ω co a: >« co H CO Q O C >H Θ $ a： >h a »-q ω ω a： >h CO H Q O C >H Θ $江>H (x ^ ω CO 江 in W Eh CO Q a < cc a ^ ω CO oi cn η CO Q Ο < >Η ^ ρί α： >η α μϊ ω W江>Η CO H CO Q O < >< ^ ^ a： >H o2 hJ ω CO OC； >H CO H c/} Q O < >h nq p£ OC； >h a ^ ω CO ff： (η H cn Q 〇 < >H ^ rt； ff： >H c2 ^ ω CO D2 >H cn 〇 cn c >h 〇 > >H H >h Z > ^ < C H Z Q q ω CC CLj CO PC M ^ H CO (jy Z a： m O cn ^ < >H 〇 > >H H >H 2 > M < < H 2 Q Q ω D： 〇j CO C£： M 1-^ H CO h 2 0ί S O CO ^ C w u > ^ H >n Z > ^ < < H Z Q q ω a； 〇4 cn ff； M H cn h z a： m 〇 CO ^ < >H U > >· H >H z > ^ < C Eh 2 Q q ω ^ cu O) oi M Η CO Cu 2 CC M 〇 CO »-q c >H U > >H H >h 2 > ^ < β H 2 Q Q ω ¥ cu co a： M ^ Eh cn t, 2 a： s Ο C0 < >Η 〇 > >-· Η >-· 2 > ^ < < Η Ζ Q α ω Cu CO οί Μ »-q Η CO h 2 ff： Μ 〇 CO C >n U > >H H >♦ 2 > ¥ c < H 2 Q q ω (X CU CO oc； M H CO 氏2 Q： M 〇 w J c iH 〇 > X EH z > ^ < f< eh 2 Q Q ω 〇4 co a： Η Θ η co U4 2 Di M O cn J < >* (J > >H H >· Z > ^ < ί< H 2 Q Q ω ^ CL( CO ^ M hP H c〇 iu 2 Di M Q U >H >-· a ο ω 〇 ^ CO CO > M CO < Q >H >H O ο ω O CO CO > M CO < 〇 >H >H 〇 ο ω ϋ hq ¥ w cn > M CO < Q >H >h a ο ω O 乂 C/D CO > M CO < a >H >· 〇 ο ω ϋ ^ ^ cn CO > M CO rt： Q ¥ >π O ο ω a ni CO CO > m cn r=C Q >-t >H 〇 ο ω 〇 ^ ^ CO w > M CO < a >H >H O ο ω O fcd CO C/5 > M CO C Q >H >H 〇 ο ω o ^ 乂 CO CO > M < C a g ω a： ω o a< < a a > h > S tu ω a： ω 乂 ο 〇4 rt： Ο (X > h > ω 乂 o 〇4 < 〇 a： > 匕> S Clj ω cc ω 〇 〇4 C 〇 CC > ^ > PO ω 乂 ο ο < ο 0ί > Ρμ > ^ Hi ω 江 ω ο a. C o a： > ^ > ω 0： ω 父 ο Oj < 〇t a： > ω Ct： ω ◦ a < o cc： > h > ω QC ω o o < cy cc > s & tH O u W 〇 >-· co ο I CO 〇 W ϋ >Η C0 Ο >H cn a CO o w 〇 赛 ίΗ co ID rH O t-q CO G江h O h-q H W CO ct ω ο 〇 > o W ^ H C a ο ω > > u ω ^ c〇 O cn G (X h Ο H CO CO Pi ω ο 〇 > O co ^ 〇M < o 〇 < > > u ω e cn ϋ ^ co 〇 a； &u e> β h CO CO ff： ω u o > O CO ι-q CU < ο ο ω > > u ω h-5 c〇 O )-^ CO O PC O Eh CO CO 江 MOO > 〇 co θ H > ο σ ω > > u ω j c〇 ο ^ ω Ο CX； Ρμ Ο ^ Η CO CO DC； ω Q ο > ο ω hP Η > ο ο ω > > ο ω ^ co Ο hP CO ◦ Di h O J eh w co a： ω p e? > e? c〇 ^ > a ο ω > > u pa ^ cn o )-^ c〇 o a： (¾ a ^ h c〇 c〇 ai w e? o > o w β h > ο ο ω > > u ω hP w a cn ϋ ct (¾ O hq H ω co dc： ω a e? > e> w ^ H > o a < > > a ω hP cn O c〇 O (X O Eh CO CO oi W Q 〇 > ϋ co hP H > ο» οι ω > > u ω ^ cn d ·. » o CO % «、 X Q Q > Η H M M L〇 CQ O Cu Q 〇 ^ ώ ϊ—t in M M VD CQ 〇 Cu 〇 〇 rH l〇 M rH 1/) M H rH CQ tH Cu Q ◦ CsJ VD W I—1 1/) M M 00 CQ O h4 C 〇 〇〇 U t—f |〇 Μ Μ Γ0 CQ Ο h ω Ο 00 00 U ϊ—* ι〇 M μ OQ o U O ^ W t-H l〇 M M CNJ D3 O py Q 0^0 U3 t—l V〇 > t~H t-H M M CQ ro b O O Q H ω ^ \o > rH rH H M CQ 〇 Ci4 rH ο ω cm ω 00 VO > *—< -124-
201124533 此等變異體係以純化蛋白質形式在VEGF165/VEGFR2 AlphaScreen中進行表徵（實例12.3，圖36)。在熱位移檢定 中測定各純系之熔化溫度（Tm)，該檢定基於螢光信號在併 入寶石橙（Invitrogen)後增加（Ericsson等人，Anal· Biochem. 357 (2006)，第289-298頁）。所有變異體顯示與 VEGFBII23B04比較時相當之IC5。及與親本VEGFBII23B04 比較時類似或較高之T m值。表5 8概述所測試9個純系之 IC5〇值、抑制7下的1^值。 表58 : VEGFBII23B04之序列最佳化變異體之iC5〇(pM) 值、抑制％及熔化溫度（在pH 7下） VHHID ICso(pM) 抑制％ pH7T2Tm(°C) VEGFBII23B04 (wt) 169 100 63 VEGFBII111D05 209 100 68 VEGFBII111G06 366 100 71 VEGFBII112D11 221 100 70 VEGFBII113A08 253 100 69 VEGFBII113E03 290 100 68 VEGFBII114C09 215 100 71 VEGFBII114D02 199 100 74 VEGFBII114D03 227 100 64 VEGFBII118E10 189 100 62 在第二循環中，組合人類化成果（VEGFBII111G06)之容 許突變與避免所選位點處之潛在轉譯後修飾之突變 (D16G、S60A取代及E1D突變），從而產生源自 VEGFBII23B04之序列最佳化純系：VEGFBII0037。預期 了一個含有除I82M突變外與VEGFBII0037相同之所有取代 的額外序列最佳化變異體（VEGFBII038)，因為此突變可能 與效能之微小降低相關。兩個序列最佳化純系之序列列於 表 59 中。在 VEGF165/VEGFR2 阻斷 AlphaScreen(實例 150860.doc -125- 201124533 13.3，圖 37)中對 VEGFBII0037及 VEGFBII0038 進行表徵， 在如上所述之熱位移檢定中測定溶化溫度且在Biacore(實 例13.5)中測定結合VEGF165之親和力。2個序列最佳化 VHH之特徵之概述呈現於表60中。 表59 : VHH VEGFBII23B04之序列最佳化變異體之AA序列
VHH ID/ SEQ ID NO: FR 1 CDR 1 FR2 CDR 2 FR3 CDR 3 FR 4 VEGFBII 037 63 DVQLV ESGGG LVQPG GSLRL SCAAS GRTFS SYS MG WFRQ APGK EREF VV AISKGG YKYDAV SLEG RFTISRDNAK NTVYLQMNSL RPEDTAVYYC AS SRAYGSS RLRLADT YEY WGQGT LVTVS S VEGFBII 038 64 DVQLV ESGGG LVQPG GSLRL SCAAS GRTFS SYS MG WFRQ APGK EREF VV AISKGG YKYDAV SLEG RFTISRDNAK NTVYLQINSL RPEDTAVYYC AS SRAYGSS RLRLADT YEY WGQGT LVTVS S 表60 :序列最佳化純系VEGFBII037及VEGFBII038之 IC5〇(pM)值、抑制％、熔化溫度（在pH 7下）及親和力（pM) VHHID ICs〇(pM) 抑制％ pHTTiTmfC) Κ〇(ρΜ) VEGFBII23B04 152 100 63 560 VEGFBII037 300 100 72 270 VEGFBII038 143 100 71 360 • 15.2 VEGFBII5B05之序列最佳化 將VEGFBII5B05之胺基酸序列與人類生殖系序列VH3-23/JH5進行比對；參見圖38及SEQ ID NO: 100。比對顯示 VEGFBII5B05相對於參考生殖系序列含有15個構架突變。 選擇位置23、60、83、105、108處之非人類殘基經其人類 生殖系對應物取代而選擇位置44處之組胺酸由麩醯胺酸取 代。構築具有6個所述突變之一個人類化變異體（AA序列列 -126- 150860.doc 201124533 於表61中）。 表61 : VHH VEGFBII5B05之序列最佳化變異體之AA序列 (FR，構架；CDR，互補決定區）
VHH ID/ SE〇 ID NO: FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 VEGFBII 119GU 65 EVQLVESGG GLVQPGGSL RLSCAASGI RFM SMA WYRQAPGK QRELVA RISSGGT TAYADS VKG RFT1SRDNSKNT VYLQMNSLRAE DTAVYYCNT FSSRP NP WGQGTLV TVSS VEGFBII 120H10 66 EVQLVESGG GLVQPGGSL RLSCVASGI RFI SMA WYRQAPGK HRELVA RISSGGT TAYVDS VKG RFTISRDNSKNT VYLQMNSLKAE DTAVYYCNT FSSRP NP WGAGTQV TVSS 構築藉由引入M301突變來移除位置M30處之潛在氧化位 點（CDR1區域，參見圖38，指示為粗斜體殘基）的另一變異 體。使用ProteOn測試兩個變異體結合hVEGF 1 65之能力。 簡言之，GLC ProteOn感測器晶片經人類VEGF165塗佈。 將變異體之周質提取物稀釋10倍且橫跨塗佈有人類 VEGF165之晶片加以注射。計算解離速率且與親本 VEGFBII5B05之解離速率相比較。2個變異體之解離速率 與親本VEGFBII5B05之解離速率在相同範圍内，從而指示 所有突變皆可容許（表62)。 表62 :序列最佳化變異體VEGFBII5B05之解離速率 VHH ID 結合程度(RU) k<,(l/s0 VEGFBII5B05 242 6.15E-02 VEGFBII 119G11 234 7.75E-02 VEGFBII 120E10 257 4.68E-02 在第二循環中，組合人類化成果之突變與M301取代，從 而產生VEGFBII5B05之序列最佳化純系，命名為 VEGFBII03 2。序列歹於表63中。經由Biacore測定 VEGFBII032之親和力（參見實例12_5)且在如上所述之熱位 移檢定中測定熔化溫度。序列最佳化VHH VEGFBII032之 150860.doc •127- 201124533 特徵之概述呈現於表64中。 表63 :序列最佳化純系VEGFBII032之AA序列（FR，構 架；CDR，互補決定區）
VHH ID/ SEQIDNO: FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 VEGFBII 032 67 EVQLVESGG GLVQPGGSL RLSCAASGI RFI SMA WYRQAPGK QRELVA RISSGG TTAYAD SVKG RFT1SRDNSKNT VYLQMNSLRAH DTAVYYCNT FSSRP NP WGQGTLV TVSS 表64 :序列最佳化純系VEGFBII032之熔化溫度（在pH 7下） 及親和力（nM) VHH ID pH 7 下之!\„(°〇 K0(nM) VEGFBII5B05(wt) 69 32 VEGFBII0032 71 44 在增殖檢定中評估序列最佳化純系VEGFBII037及 VEGFBII038之效能。簡言之，使初級HUVEC細胞 (Technoclone)經受補充物饑餓隔夜，接著每孔4000個細胞 一式四份接種於96孔組織培養盤中。用33 ng/mL VEGF在 不存在或存在VHH下刺激細胞。在第4天藉由併入[3H]-胸 苷來量測增殖速率。表65中展示之結果說明親本VHH VEGFBII23B04之活性（效能及抑制度）保存於序列最佳化純 系 VEGFBII038 中。 表65 :序列最佳化純系VEGFBII037及VEGFBII038在VEGF HUVEC增殖檢定中之IC50(nM)值及抑制％ VHH ID ICs〇(nM) 抑制％ VEGFBII23B04 0.68 92 VEGFBII037 1.54 78 VEGFBII038 0.60 92 貝伐單抗 0.29 94 實例16 150860.doc •128· 201124533 使用聚乙二醇化或抗血清白蛋白結合物作為半衰期延長部 分之靶向VEGF及DLL4之雙特異性VHH的構築及表徵 在第一循環中，VEGFBII23B04及DLLBII101G08用作產 生雙特異性VHH VEGFDLLBII001-006之構建區段。應用 兩種半衰期延長方法：i)聚乙二醇化或Π)與血清白蛋白結 合VHH遺傳融合。構建區段係經由長度為9之Gly-Ser、長 度為35之01丫-861'或長度為35之017-861'(〇)^在位置15處）可 撓性連接子連接。所有6個雙特異性VHH之形式及序列之 概述描述於表66-A(連接序列加下劃線）、SEQ ID No: 68-73及圖39中。 表66-A:靶向VEGF及DLL4之雙特異性VHH之序列
VHH ID/ SEQ ID NO: 列 VEGFDLLBII001 68 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGKEREFVAAIRWSGGTAYYADSVQGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAADTRLGPYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKGGYKYDSV SLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII002 69 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDN AKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGCGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGKEREFVAAIRWSGGTAY YADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAADTRLGPYEYDYWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII003 70 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDN AKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGKEREFVAAIRWSGGTAYYADSV QGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAADTRLGPYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLV ESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTT LYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS VEGFDLLBII004 71 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDN AKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV QPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNS LRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAM AWFRQAPGKEREFVAAIRWSGGTAYYADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAADTRLGP YEYDYWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII005 72 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGKEREFVAAIRWSGGTAYYADSVQGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAADTRLGPYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKGGYKYDSVSLEGR FTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLV ESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTT LYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS VEGFDLLBII006 73 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGKEREFVAAIRWSGGTAYYADSVQGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAADTRLGPYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQP GNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLR PEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGW FRQAQGKEREFWAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLA DTYEYWGQGTQVTVSS
為了研究抗VEGF相較於單價構建區段VEGFBII23B04之 阻斷性質，在VEGF/VEGFR2-FC(實例12.3 ;圖41)及 -129- 150860.doc 201124533 VEGF/VEGFRl-Fc(實例 12.4 ;圖 42)競爭 AlphaScreen 中分 析所有6個VHH。此等2個競爭檢定亦在將VHH與5 μΜ人類 血清白蛋白一起預培育之後進行。IC5〇值之概述展示於表 66-B 中。 表 66-B : VEGF/VEGFR1 及 VEGF/VEGFR2 競爭 AlphaScreen 中之IC50值（nM)及抑制°/〇(VHH形式之描述參見圖39) VEGFR1 VEGFR2 VHH ID 形式 -HSA +HSA -HSA +HSA IC50 (nM) 抑制 % IC5〇 (nM) 抑制 % ic5〇 (nM) 抑制 % IC50 (nM) 抑制 % VEGFBII23B04 〇 0.45 48 n/d n/d 0.22 100 0.30 100 VEGFDLLBII001 1.58 69 n/d n/d 0.64 100 0.64 100 VEGFDLLBII002 0.36 64 n/d n/d 0.20 100 0.24 100 VEGFDLLBII003 Cl^ro 0.37 57 1.63 66 0.20 100 0.77 100 VEGFDLLBI1004 〇〇· 0.47 57 0.56 70 0.20 100 0.37 100 VEGFDLLBII005 #\〇π〇 1.44 62 1.82 75 0.84 100 1.42 100 VEGFDLLBI1006 9rCTO 2.07 67 2.41 75 1.16 100 2.22 100 雷珠單抗 5.88 70 n/d n/d 0.90 100 n/d n/d n/d，未測定 為了研究抗DLL4相較於單價構建區段DLLBII101G08之 阻斷性質，在CHO-hDLL4/hNotchl-Fc競爭性FMAT檢定 (實例4 ;圖43)中測試所有6個VHH。此檢定亦在將VHH與 25 μΜ人類血清白蛋白一起預培育之後進行。1(：50值之概 述展示於表67中。 表 67: CHO-hDLL4 競爭 FMAT 中之 IC50 值（nM)。VHH 形式 之描述參見圖39。 -130- 150860.doc 201124533 CHO-hDLL4 IC5〇(nM) VHH ID 形式 -HSA +HSA DLLBII101G08 • 31.0 30.1 VEGFDLLBII001 128.5 121.6 VEGFDLLBII002 105.9 119.9 VEGFDLLBII003 Qr^mrO 61.8 45.1 VEGFDLLBII004 βΟ· 43.0 23.1 VEGFDLLBII005 181.2 60.7 VEGFDLLBII006 9rCr〇 54.9 47.6 DLL4 Fab 2.0 n/d n/d，未測定
在第二循環中，構築7個靶向VEGF及DLL4之雙特異性 VHH(VEGFDLLBII010、VEGFDLLBII011、VEGFDLLBII012、 VEGFDLLBII013、VEGFDLLBII014、VEGFDLLBII015、 VEGFDLLBII016)。在此等構築體中，包括DLLBII101G08 親和力成熟VHH DLLBII129B05或DLLBII115A05親和力成 熟VHH DLLBII136C07。另外，在2個構築體中包括包含 VEGFBII23B04 及 VEGFBII5B05之二價抗 VEGF VHH。應 用兩種半衰期延長方法：i)聚乙二醇化或ii)與血清白蛋白 結合VHH遺傳融合。構建區段係經由長度為9之Gly-Ser、 長度為35之Gly-Ser或長度為35之Gly-Ser(Cys在位置15處） 可撓性連接子連接。所有7個雙特異性VHH之形式及序列 之概述描述於表68-A(連接序列加下劃線）、SEq id No: 74-80及圖40中。 為了研究抗VEGF相較於單價構建區段vegfBII23B04之 阻斷性質，在 VEGF/VEGFR2-Fc(實例 12_3 ;圖 44)及 VEGF/ VEGFRl-Fc(實例12.4 ;圖45)競爭AlphaScreen中表徵所有 150860.doc -131- 201124533 7個VHH。此等2個競爭檢定亦在將VHH與5 μΜ人類血清白 蛋白一起預培育之後進行。IC5G值之概述展示於表68-Β 中。 表68-A:靶向VEGF及DLL4之雙特異性VHH之序列
VHH ID/ SE〇 ID HO： 列 VEGFDLLBII010 74 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFWAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDN ftKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTyEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV QPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNS LRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAM ftWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAPDTRLAP yEYDHWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII011 75 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQTVQGKEREFWAISKGGYKyDSVSLEGRFTISKDN AKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV QPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNS LRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYDM SWVRRSPGKGPEWVSSINSGGGSTYYADYVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAADRYIWARQG EYWGAYEYDYWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII012 76 AKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGCGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYDMSWVRRSPGKGPEWVSSINSGGGSTY yADYVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAADRYIWARQGEyWGAYEyDYWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII013 77 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDN AKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGCGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAY YADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII014 78 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDN AKNTVYLOINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGOGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKA EDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGG LVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQM NSLKPEDTAVYYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII015 79 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDN RKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEyWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGCGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVD SVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGT ftYYADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYVCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTQVTVSS VEGFDLLBII016 80 AKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSKAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAY VADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRD NAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
表 68-B : VEGF/VEGFR1 及 VEGF/VEGFR2競爭 AlphaScreen -132* 150860.doc 201124533 中之IC5〇值（nM)及抑制％(VHH形式之描述參見圖40;連接 序列加下劃線）SEQ ID NO: 74-80 VEGFR1 VEGFR2 -HSA +HSA -HSA +HSA VHHID 形式 IC50 (nM) 抑制 % IC50 (nM) 抑制 % IC50 (nM) 抑制 % IC50 (nM) 抑制 % VEGFBII23B04 @ 0.43 44 n/d n/d 0.19 100 0.20 100 VEGFBII022 n/d n/d n/d n/d 0.017 100 n/d n/d VEGFDLLBII010 arcym 0.27 49 0.61 64 0.12 100 0.21 100 VEGFDLLBII011 QnOnA 0.60 65 0.36 68 0.17 100 0.25 100 VEGFDLLBII012 0.27 60 n/d n/d 0.19 100 0.22 100 VEGFDLLBII013 0.24 62 n/d n/d 0.18 100 0.17 100 VEGFDLLBII014 0.080 94 n/d n/d 0.026 100 0.024 100 VEGFDLLBII015 0.040 96 n/d n/d 0.016 100 0.015 100 VEGFDLLBII016 0.32 59 0.85 65 0.16 100 0.47 100 雷珠單抗 0.43 n/d n/d n/d 0.19 100 0.20 100
n/d，未測定 為了研究抗DLL4相較於單價親和力成熟構建區段 DLLBII129B05 及 DLLBII136C07 之阻斷性質，在 CHO-hDLL4/hNotchl-Fc及 CHO-mDLL4/hNotchl-Fc競爭性 FMAT 檢定（實例4 ;圖46)及DLL4介導之報導檢定（實例12.5 ;圖 47)中評估所有7個VHH。此等檢定亦在將VHH與25 pM(FMAT檢定）或175 μΜ(報導檢定）人類血清白蛋白一起 預培育之後進行。IC5Q值之概述展示於表69中。 表 69 : CHO-hDLL4/CHO-mDLL4 競爭 FMAT及 DLL4介導之 報導檢定中之IC50值（nM)(VHH形式之描述參見圖40)。 (*，無完全劑量反應曲線） •133- 150860.doc 201124533 CH0-KDLL4 CHO-mDLL4 報導體 VHHID 形式 -HSA +HSA •HSA +HSA +HSA IC5〇 (nM) 抑制 % ic5〇 (nM) 抑制 % IC5〇 (nM) 抑制 % IC5〇 (nM) 抑制 % DLLBII129B05 __ 3.2 90 4.3 90 3.0 100 3.7 100 88.0 DLLBII136C07 ▲ 6.8 94 7.1 94 16.4 100 17.6 100 103.0 VEGFDLLBII010 〇〇 4.9 90 5.3 100 5.4 95 3.9 100 209.1 VEGFDLLBII011 00^4 12.6 83 11.4 100 24.1 本 33.9 100 589.9 VEGFDLLBII012 44.9 100 41.5 100 95.3 100 102.7 100 582.2 VEGFDLLBII013 〇 12.2 100 12.4 100 19.3 100 23.8 100 98.5 VEGFDLLBII014 O'爛 9.9 100 12.3 100 15.4 100 15.4 100 122.5 VEGFDLLBII015 OT~\· 9.5 100 10.0 100 12.2 100 11.2 100 134.3 VEGFDLLBII016 5.2 90 5.8 100 4.5 95 4.9 100 257.7 DLL4 Fab 2.4 100 2.1 100 1.0 100 1.1 100 16.4 最後，在第三循環中，構築雙特異性VHH A1、A2、A3 及HSA1-6。以下構建區段用於產生此等構築體：VEGFBII038 (VEGFBII23B04之序歹ij最佳化變異體）、VEGFBII032 (VEGFBII5B05之序歹ij最佳化變異體）、DLLBII018 (DLLBII129B05之序列最佳化變異體）及DLLBII039 (DLLBII136C7之序列最佳化變異體）。應用三個半衰期延 長方法：i)聚乙二醇化，ii)與血清白蛋白結合VHH遺傳融 合及iii)與人類血清白蛋白遺傳融合。構建區段係經由長 度為9之Gly-Ser、長度為35之Gly-Ser或長度為35之Gly-Ser(Cys在位置15處）可撓性連接子連接。所有3個雙特異性 VHH之形式及序列之概述描述於表70-A、SEQ ID No: 81-8 9及圖4 8中。 為了研究抗VEGF相較於單價序列最佳化構建區段 VEGFBII038或雙互補位序列最佳化構建區段VEGFBII022 之阻斷性質，在VEGF/VEGFR2-FC(實例12·3 ;圖49)及 VEGF/VEGFRl-Fc(實例 12.4 ;圖 50)競爭 AlphaScreen 中表 -134· 150860.doc 201124533 徵所有7個VHH。此等2個競爭檢定亦在將VHH與5 μΜ人類 血清白蛋白一起預培育之後進行。IC50值之概述展示於表 70-B 中。 表70-A:靶向VEGF及DLL4之雙特異性VHH之序列
VHH ID/SEQ ID NO: AA序列 Al/81 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLE GRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFS SYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAV YYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTLVTVSS A2/82 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLE GRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSS工SGSGS DTLYADSVKGRFTISRDMAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGG SGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTA YYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTLVTV SS A3/83 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLE GRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIRFI SMAWYRQAPGKQRELVARISSGGTTAYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYC NTFSSRPNPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG GGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTLVTVSS HSAl/84 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSL EGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTF SSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTA VYYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTLVTVSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQ QCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQE PERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFA KRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLL EKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLL RLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVR YTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRV TKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHK PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL HSA2/85 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSL EGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSPAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIRFISMAWYRQAPGKQRELVARISSGGTT AYADSVKGRFTISRDMSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYOnTSSRPNPWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYA MAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYC ANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTLVTVSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPF EDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERN ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYK ?^AFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPK ^EFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSH CIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAK TYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKK VPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL -135· 150860.doc 201124533
HSA3/86 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIGSYDMSWVRRAPGKGPEWVSSISSGGGSTYYADY VKGRFTISRDNAKNTLYLQMMSLRPEDTAVYYCAADRYIVJARQGEYWGAYEYDYWGQGTLVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG RTFSSYSMGWFRQAPGKEREFWAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPED TAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGIRFISMAWYRQAPGKQRELVARISSGGTTAYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMN SLRAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGQGTLVTVSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYL QQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFF AKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLL LRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLV RYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDR VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKH KPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL HSA4/87 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSL EGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTF SSYAMAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTA VYYCANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVM CTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELR DEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVES KDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCC7VAADPHECYAKVFD EFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKE FNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDK ETCFAEEGKKLVAASQAALGL HSA5/88 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFWAISKGGYKYDAVSL EGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIRFISMAWYRQAPGKQRELVARISSGGTT AYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYA MAWYRQAPGKEREYVAAIRWSGGTAYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYC ANRAPDTRLAPYEYDHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSD AHKSEVAHRF'KDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPE'EDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAF HDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVC KNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP LVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE AKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCF AEEGKKLVAASQAALGL HSA6/89 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIGSYDMSWVRRAPGKGPEWVSSISSGGGSTYYADY VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRYIWARQGEYWGAYEYDYWGQGTLVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG RTFSSYSMGWFRQAPGKEREFWAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPED TAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGIRFISMAWYRQAPGKQRELVARISSGGTTAYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMN SLRAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESA ENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV MCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHG DLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVF DEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC CKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADD KETCFAEEGKKLVAASQAALGL •136- 150860.doc 201124533 表 70-B : VEGF/VEGFR1 及 VEGF/VEGFR2 競爭 AlphaScreen 中之ICso值（nM)及抑制％(VHH形式之描述參見圖48)。所 有分子皆在VEGF/VEGFR2 AlphaScreen檢定中展示1 〇〇〇/〇抑 制。 VEGFR1 VEGFR2 -HSA +HSA •HSA +HSA~~~ VHHID 形式 IC5〇 抑 IC5〇 抑 IC5〇 抑 ICso 抑 (nM) 制％ (nM) 制％ (nM) 制％ (nM) 制％ VEGFBII038 0.2 50 n/d n/d 0.2 100 0.1 100 VEGFBII022 0.07 87 n/d n/d 0.05 100 0.03 100 A1 0.1 80 n/d n/d 0.07 100 n/d n/d A2 &cyu 0.3 71 0.3 63 0.2 100 0.2 100 A3 0.02 97 n/d n/d 0.01 100 n/d n/d HSA1 Gratae ) 0.7 63 n/d n/d 0.4 100 n/d n/d HSA2 0.09 93 n/d n/d 0.01 100 n/d n/d HSA3 0.1 93 n/d n/d 0.01 100 n/d n/d HSA4 0.5 66 n/d n/d 0.3 100 n/d n/d n/d，未測定 圖例： 奪考-抗趙、連接子或HSA 描述 一一 — DLLBII018 餐_ DLLBII039 VEGFBII038 , -- VEGFBII032 - HSA ο ~~~~~~ — ALB8 A 9识連接子 "λ； 連接子 〜 聚乙二醇化連接子 為了研究抗DLL4相較於單價序列最佳化構建區段 DLLBII01 8 及 DLLBII039 之阻斷性質’在 CHO-hDLL4/ hNotchl-Fc 及 CHO-mDLL4/hNotchl-Fc 競爭性 FMAT 檢定 150860.doc -137- 201124533 (實例4 ;圖5 1)中評估所有7個VHH。此等檢定亦在將VHH 與25 pM(FMAT檢定）人類血清白蛋白一起預培育之後進 行。IC5〇值之概述展示於表71中。 表 71 : CHO-hDLL4/CHO-mDLL4 競爭 FMAT及 DLL4 介導之 報導檢定中之ICso值（nM)(形式之描述參見表70-A、圖48及 SEQ ID No: 81-89) » CHO-hDLL4 CH〇-mDLL4 -HSA +HSA -HSA +HSA VHHID 形式 IC5〇 抑制 IC5〇 抑制 IC5〇 抑制 IC5〇 抑制 (nM) % (nM) % nM) % (nM) 0/ DLLBII018 _ 5.5 87 7.1 100 2.4 99 2.8 /〇 lOn DLLBII039 ▲ 3.6 102 n/d n/d 6.7 100 n/d n/d A1 om 6.7 102 n/d n/d 3.4 100 n/d n/d A2 cycyu 9.9 73 17.9 100 5.2 91 5.7 lOn A3 οπ\β 16.1 97 n/d n/d 7.9 95 n/d n/ri HSA1 8.1 96 n/d n/d 4.8 100 — Π/d HSA2 cyi— 17.3 87 n/d n/d 7.4 100 n/d n/d HSA3 iiO 11.5 100 n/d n/d 28.7 100 n/d n/d HSA4 9.3 93 n/d n/d 5.3 100 n/d n/(j DLL4 Fab 7.7 100 7.5 100 1.9 100 2.4 1~〇〇~ n/d，未測定 圖例： 奈米抗體、連接子或HSA 描述 DLLBII018 ▲ DLLBII039 Ο VEGFBII038 VEGFBII032 c ^ HSA C) ALB8 r\ 連接子 連接子 聚乙二醇化連接子 150860.doc -138- 201124533
在VEGF增殖檢定中評估雙特異性VHH之效能。簡言 之，使初級HUVEC細胞（Technoclone)經受補充物鐵餓隔 夜，接著每孔4000個細胞一式四份接種於96孔組織培養盤 中。用33 ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激細胞。 如所指示，此檢定係在將VHH與520 nM人類血清白蛋白一 起預培育之後進行。在第4天藉由併入[3H]-胸苷來量測增 殖速率。展示於表72中之結果說明雙特異性VHH及貝伐單 抗以IC5〇<l nM抑制VEGF誘導之HUVEC增殖超過90%。 表72 : VEGF HUVEC增殖檢定中雙特異性VHH之IC50(nM) 值及抑制％ -HSA +HSA VHHID 形式 Ι〇5〇(πΜ) 抑制％ IC5〇(nM) 抑制％ VEGFBII23B04 0.78 87 0.69 95 VEGFDLLBII010 crcyu n/d π/d 0.60 94 VEGFDLLBII013 0.73 92 n/d n/d VEGFDLLBII014 0.49 98 n/d n/d VEGFDLLBII015 m 0.49 109 n/d n/d VEGFDLLBII016 n/d n/d 0.72 95 貝伐單抗 0.22 92 0.26 96 圖例： 奈米抗體或連接子 描述 M__ DLLBII129B05 VEGFBII23B04 km 5B05 Ο ALB8 ί\ 連接子 〜 35识連接子 聚乙二醇化35识，連接子 n/d，未測定 在VEGF HUVEC Erk填酸化檢定中評估雙特異性VHH之 150860.doc -139- 201124533 效能。簡言之，使初級huvec細胞經受血清饑餓隔夜’ 接著用10 ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激5 min。 如所指示，此檢定係在將VHH與250 nM人類jk清白蛋白一 起預培育之後進行。用於PBS中之4%曱醛固定細胞，且使 用磷酸ERK特異性抗體（抗磷酸MAP激酶pERKl及2, M8159，Sigma)及多株兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP接合物 (P0161，Dako)經由ELISA來量測ERK磷酸化程度。如表73 中所示，雙特異性VHH及貝伐單抗以IC50<1 nM抑制VEGF 誘導之Erk磷酸化超過90%。 表73:雙特異性VHH在VEGF HUVEC Erk磷酸化檢定中之 IC5Q(nM)值及抑制。/〇 -HSA +HSA VHHID 形式 IC5〇(nM) 抑制％ IC5〇(nM) 抑制％ VEGFBII23B04 〇 0.69 91 0.60 93 VEGFDLLBII010 GrCrU n/d n/d 0.74 94 VEGFDLLBII013 〇 0.89 95 n/d n/d VEGFDLLBII014 0.53 101 n/d n/d VEGFDLLBII015 0.40 106 n/d n/d VEGFDLLBII016 〇\*〇 n/d n/d 1.03 93 貝伐單抗 0.68 99 0.83 98 n/d，未測定 圖例： 奈米抗體或連接子 描述 Ji__ DLLBII129B05 C) VEGFBII23B04 5B05 () ALB8 A 連接子 〜 3·5供連接子 聚乙二醇化35识連接子 150860.doc •140· 201124533 在如 Ridgwthey 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122):1083-7所述之〇114 111^£(：增殖檢定（以經修改形式） 中評估雙特異性VHH之效能。簡言之，96孔組織培養盤於 塗佈緩衝液（PBS，0.1% BSA)中塗有純化D114-His(RnD Systems ; C-末端標記His之人類D114，胺基酸27-524， 0.75毫升/孔，10 ng/ml)。用PBS洗滌各孔，隨後一式四份 每孔接種4000個HUVEC細胞。如所指示，此檢定係在將 VHH與50 μΜ人類血清白蛋白一起預培育之後進行。在第4 天藉由併入[3Η]-胸苷來量測細胞增殖。雙特異性VHH及 DLL4Fab之IC50值概述於表74中。 表74 :雙特異性VHH在D114介導之HUVEC增殖檢定中之 IC5〇(nM)值及抑制 -HSA +HSA VHHID 形式 ICs〇(nM) 抑制 Ι〇5〇(ηΜ) 抑制 VEGFBII129B05 2.32 完全 3.52 完全 VEGFDLLBII010 n/d 完全 3.39 完全 VEGFDLLBII013 ς^Μ 2.06 完全 n/d 完全 VEGFDLLBII014 0.53 完全 n/d 完全 VEGFDLLBII015 0.28 完全 n/d 完全 VEGFDLLBII016 n/d 完全 35.22 完全 DLL4 Fab 7.85 完全 2.79 完全 圖例： 奈米抗體或連接子 描述 ___—— DLLBII129B05 6s) VEGFBII23B04 5B05 () ALB8 r\ 連接子 連接子 聚乙二醇化連接子 150860.doc • 141 · 201124533 實例17 : 所選結合分子在人類結腸癌之小鼠模型中之功效 在裸小鼠人類結腸癌（細胞株SW620)之小鼠模型中評估 三個所選 VHH VEGFDLLBII010、VEGFDLLBII013 及 VEGFDLLBII015 之功效。 SW620細胞係得自 ATCC(CCL-227)。在 37°C 及 〇% C02 下 於T175組織培養燒瓶中培養細胞。所用培養基為萊伯維茲 氏 L-1 5 培養基（Leibovitz's L-1 5 Medium，Gibco 目錄號 11415)及10%胎牛血清（JRH目錄號12103-1000 ml)。培養 物在分流比（split ratio)為1:10或1:20之次融合性 (subconfluency)下進行分流。小鼠為7週齡無胸腺雌性 BomTac: ，購自 Taconic，Denmark。為了產 生皮下腫瘤，SW620細胞經胰蛋白酶化、洗滌、以每毫升 5 X 107個細胞再懸浮於PBS+5% FCS中。接著將含有5 X 106個細胞之100 μΐ細胞懸浮液皮下注射至小鼠右側腋下 (每隻小鼠一個部位）。當腫瘤確實產生且已達到47至93 mm3之體積時（注射細胞後10天），將小鼠隨機分配於處理 組與媒劑對照組之間。 用PBS稀釋VHH。 劑量經計算分別為7.5 mg/kg、2.5 mg/kg及15 mg/kg之 Avastin(貝伐單抗）等效劑量（表75)〇所有劑量皆係根據第0 天所有小鼠之平均體重（27.7 g)來計算且以每隻小鼠100 μΐ 之體積來投與。VHH係每日或每隔一天腹膜内投與。第1 天為處理第一天，第21天為處理最後一天。 150860.doc •142- 201124533 腫瘤直徑係一週=g e u 迥一-人（星期一、星期三及星期五）用測押 規加以量測。各腫瘤體積（以_3計）係根據式「腫瘤二 長度*直徑2* Μ」來計算。為了監測處理副作用，每曰格 查小鼠之異常且—週三次（星期一、星期三及星期五）測定 體重。在對照腫瘤達到平均約蘭_3之尺寸時處死動 物0
在第21天實驗結束時對腫瘤體積及體重之參數進行統 學評估。對於_體積，使賴對值，且對於體重，使用 參考第1天初始體重之變化百分比。由於觀測偏差， 非參數法。 〜 出於描述性考慮，計算觀測結果中值、最小值及最大值 的數量。為快速概述可能處理效果，各處理組了之腫瘤體 積之中值係參考對照組C之中值。 •相對腫瘤體積（T/c) T/C = i〇〇*I±.
Cd •自第1天至第J天之腫瘤生長抑制（TGI) TGI = inn*iCrf ~c\)~iTd ~^1) (Q-c,) 其中C i、T〗=在第丨天實驗開始時對照組及處理組中之 中值腫瘤體積， cd、Td=在第d天實驗結束時對照組及處理組中之 中值腫瘤體積。
早側遞減威爾卡避（Wilcoxon)試驗法用於比較三種VHH 150860.doc •143· 201124533 之劑量組與對照組，期望腫瘤體積降低作為效果及增重降 低作為不良事件。 調整腫瘤體積（功效參數）之P值以用於根據邦弗朗尼-荷 姆（Bonferroni-Holm)進行多重比較，而保持體重（可对受性 參數）之p值不調整以便不致忽略可能的反效應。 顯著水準固定在α=5%。小於0.05之（經調整）p值視為處 理組之間具有差異；只要0.05分值<0.10，則差異視為指 示性差異。 使用套裝軟體SAS 9.2 版（SAS Institute Inc.，Cary NC， USA)及 Proc StatXact(Cytel Software Corporation, Cambridge MA，USA)來制定統計學評估。 如圖52及表75及76中所示，VEGFDLLBII013、 VEGFDLLBII010 及 VEGFDLLBII015 在 SW620 結腸癌模型 中展示顯著功效且耐受良好。 圖52A展示SW620腫瘤生長動力學：具有SW620腫瘤之 小鼠每曰（開符號）經VEGFDLLBII013(VHH 1)、 VEGFDLLBII010(VHH 2)或 VEGFDLLBII015(VHH 3)或每 隔一天（關閉符號）經VEGFDLLBII013(VHH 1)或 VEGFDLLBII010(VHH 2)處理。將中值腫瘤體積隨時間繪 圖。第1天為實驗第一天，第21天為實驗最後一天。圖上 方上之三角指示處理天數。 圖52B展示第21天研究結束時之絕對腫瘤體積：具有 SW620腫瘤之小鼠每日（開符號）經VEGFDLLBII013(VHH 1)、VEGFDLLBII010(VHH 2)或 VEGFDLLBII015(VHH 3) 150860.doc 201124533 或每隔一天（關閉符號）經VEGFDLLBII013(VHH 1)或 VEGFDLLBII010(VHH 2)處理。對第21天個別絕對腫瘤體 積繪圖。每個符號表示一個別腫瘤。水平線表示中值腫瘤 體積。 圖52C展示體重隨時間之變化；具有SW620腫瘤之小鼠 每日（開符號）經 VEGFDLLBII013(VHH 1)、 VEGFDLLBII010(VHH 2)或 VEGFDLLBII015(VHH 3)或每 隔一天（關閉符號）經VEGFDLLBII013(VHH 1)或 VEGFDLLBII010(VHH 2)處理。第1天為處理第一天，第 21天為處理最後一天。圖上方上之三角指示處理天數。 表75 :腫瘤體積：處理組相對於對照組（第21天結果） 作合物 劑量 img/kgl 時程 TGI f%l p值 媒劑 - qdx21 - VEGFDLLBII013 7 qdx21 92.2 0.0004 2.33 qdx21 87.6 0.0004 14 q2dxll 93.1 0.0004 VEGFDLLBII010 4.05 qdx21 97.1 0.0004 1.35 qdx21 93.4 0.0004 8.1 q2dxll 94.9 0.0004 VEGFDLLBII015 8.43 qdx21 91.6 0.0004 2.81 qdx21 90.1 0.0004 表76 :體重：處理組相對於對照組（第2 1天結果） 化合物 ·· ·· 、劑量 fmg/kgV .時程 • ..... 增重丨％] P值 媒劑 - qdx21 8.85 - VEGFDLLBII013 7 qdx21 7.97 0.3177 2.33 qd><21 8.63 0.3698 14 q2dxll 8.15 0.2681 VEGFDLLBII010 4.05 qd><21 6.61 0.3004 1.35 qdx21 9.05 0.4811 8.1 q2dxll 9.50 0.5937 VEGFDLLBII015 8.43 qdx21 10.9 0.6655 2.81 qdx21 6.56 0.6655 150860.doc •145- 201124533 實例18 形式化VHH於小鼠中之藥物動力學 為了測定所選VHH在小鼠中之藥物動力學，將0.1 mL 33 nmol/kg之單次劑量腹膜内投與每組6隻動物 (BomTac:NMRI-Foxnl nu雌性小鼠（6-7週齡））。在不同時間 點（每個時間點3隻小鼠）藉由在異氟烷麻醉下眼球後放血獲 得約50 μΐ血液。在30 min之後離心樣品且所得20 pL血清 儲存在-20°C下直至分析。經由夹心式ELISA量測VHH濃 度。 在+4°C下，微量滴定盤（Medisorp Nunc)每孔塗有1 〇〇 W 於碳酸鹽緩衝液（pH 9.6)中稀釋至0.5 pg/ml的人類 VEGF(R&D Systems 293-VE/CF)隔夜》在用 300 μΐ去離子 水洗滌之後，藉由添加200 μΐ阻斷緩衝液（PBS/0.5%牛血清 白蛋白/0.05%吐溫20)來阻斷剩餘結合位點0.5小時。 在另一洗滌步驟之後，將每孔100 μΐ於血清稀釋培養基 (SDM，阻斷緩衝液+2%小鼠血清池（mouse serum pool)， PAA Labor GmbH)中之標準物或樣品的稀釋液添加至 ELIS A培養盤中且在室溫下在培養盤振盪器上培育1小時。 為產生標準曲線，用血清稀釋培養基將VHH稀釋成100 (VEGFDLLBII013)或 10(VEGFDLLBII010 及 VEGFDLLBII015) ng/mL且一式兩份以於SDM _之8個兩倍稀釋液添加至 ELISA培養盤中。小鼠血清樣品經阻斷緩衝液稀釋最少50 倍且進一步用SDM進行稀釋。亦以8個兩倍稀釋液一式兩 份將血清樣品添加至ELISA培養盤中。 150860.doc -146- 201124533 再次洗滌培養盤，且每孔添加100 μΐ於阻斷緩衝液中稀 釋至 0.2 pg/mL 的人類 D114-HIS(R&D Systems 1506-D4/CF) 且如前所述在振盪器上培育1小時以偵測所結合的VHH。 在再次洗滌培養盤之後，每孔添加100 μΐ於阻斷缓衝液中 稀釋5000倍的抗6χ聚組胺酸-HRPO(R&D Systems MAB050H)且如前所述培育培養盤1小時。在每次用300 μΐ 去離子水最終洗滌3次之後，藉由每孔添加100 μΐ ΤΜΒ染 色溶液（Bender MedSystems BMS406.1000)且在室溫下在振 蘆器上培育約10分鐘之後藉由每孔添加100 μΐ 1M磷酸終 止顯色來偵測所結合的VHH。使用微量滴定盤分光光度計 (ThermoMax，Molecular Devices)及 ELISA 軟體 SoftMax Pro(Molecular Devices)對個別孔之光學密度進行定量。樣 品結果係源自使用四參數對數曲線擬合法擬合的標準曲 線。 表77 : 時間(h) VHH血清濃度(nM VEGFDLLBII013 [) VEGFDLLBII010 VEGFDLLBII015 0,0833 2,49 4,85 0,88 0,5 69,8 60,5 40,7 1 230 264 113 4 376 335 308 24 151 184 160 72 15,2 48,7 26,8 168 <0,86 0,88 1,71 240 <0,78 <0,14 <0,21 VHH之血清半衰期經測定分別為15 h (VEGFDLLBII013) 、 17 h(VEGFDLLBIIOlO)及 24 h (VEGFDLLBII015)。（半衰期係藉由用 WinNonLin V6將平 150860.doc -147- 201124533 均必裝滚度曲線之最後3個資料點擬合成指數斜率來測 定。） 【圖式簡單說明】 圖1 :人類、恆河猴及镧猴DLL4之胺基酸序列比對。 圖2 :人類及小鼠DLL4缺失突變體（上標中為胺基酸域 邊界）。 圖3-1〜3-3 :純化VHH阻斷hDLL4/hNotchl-Fc相互作用 (ELISA)。 圖4-1〜4-5 :純化VHH阻斷hDLL4/hNotchl-Fc相互作用 (AlphaScreen)。 圖 5-1~5-10 :純化 VHH 阻斷 CHO-hDLL4/hNotch卜Fc 及 CHO-mDLL4/hNotchl-Fc相互作用（FMAT)。 圖6-1~6-4 :純化VHH阻斷DLL4介導之Notchl裂解（報導 體）。 圖7-1~7-4 ··純化VHH對重組人類及小鼠DLL4之結合 (ELISA) » 圖8-1〜8-3 :純化VHH對重組人類DLL1及人類Jagged-1 之結合（ELISA)。 圖9-1~9-4 :純化VHH對人類/小鼠/獼猴DLL4之結合 (FACS)。 圖 10-1~10-2 :親和力成熟 VHH 阻斷 hDLL4/hNotchl-Fc 相互作用（ELISA)。 圖11-1~11-4 :親和力成熟VHH阻斷CHO-hDLL4/ hNotchl-Fc及 CHO-mDLL4/hNotchl-Fc相互作·用（FMAT)。 150860.doc •148· 201124533 圖12-1〜12-4 :純化VHH對人類/小鼠DLL4之結合 (ELISA)。 圖13-1~13-4 :純化之親和力成熟VHH對重組人類DLL1 及人類Jagged-1之結合（ELISA)。 圖14-1〜14-6 :純化VHH對人類/小鼠/獼猴DLL4之結合 (FACS)。 圖15 : VHH對D114介導之HUVEC增殖抑制效應的評估。 圖16-1~16-2 : DLL4介導之報導體檢定中之親和力成熟 VHH。 圖17 : A)VHH DLLBII129B05與人類VH3/JH生殖系序列 之序列比對。 B)VHH DLLBII136C07與人類VH3/JH5生殖系序列之序 列比對。 圖 18-1 〜18-2 : A)阻斷 CHO-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CHO-mDLL4/hNotchl-Fc相互作用之DLLBII129B05之純化序歹ij 最佳化VHH變異體（FMAT)。 B)阻斷 CHO-hDLL4/hNotchl-Fc及 CHO-mDLL4/hNotchl_ Fc相互作用之DLLBII136C07之純化序列最佳化VHH變異 體（FMAT) 〇 圖19 :阻斷DLL4介導之Notchl裂解之純化序列最佳化 VHH(報導檢定）。 圖20 :純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互 作用（ELISA)。 圖21 :純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFRl-Fc相互 150860.doc •149- 201124533 作用（ELISA)。 圖22 :純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互 作用（AlphaScreen)。 圖23 :純化單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFRl-Fc相互 作用（AlphaScreen)。 圖24 :單價VHH結合於重組人類及小鼠VEGF(ELISA)。 圖25 :單價VHH結合於人類VEGF121。 圖 26-1 〜26-4 :純化 VHH 不結合 VEGFB、VEGFC、 VEGFD及 P1GF。 圖27 :形式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作 用（ELISA)。 圖28 :形式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFRl-Fc相互作 用（ELISA)。 圖29 :形式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作 用（AlphaScreen)。 圖30 :形式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFRl-Fc相互作 用（AlphaScreen) 〇 圖31 :形式化VHH阻斷mVEGF164/mVEGFR2-Fc相互作 用（AlphaScreen)。 圖32 ··形式化VHH結合小鼠及人類VEGF。 圖 33-1~33-4 :形式化 VHH 不結合 VEGFB、VEGFC、 VEGFD及 P1GF。 圖34 :形式化VHH結合VEGF121。 圖35 : VHH VEGFBII23B04與人類VH3/JH生殖系共同序 150860.doc -150- 201124533 列之序列比對。 圖 36 : VEGFBII23B4 之 VHH 變異體阻斷 hVEGF165/ hVEGFR2-Fc相互作用（AlphaScreen)。 圖37 : VEGFBII23B4之序列最佳化純系阻斷hVEGF165/ hVEGFR2-Fc相互作用（AlphaScreen) ° 圖38 : VHH VEGFBII5B5與人類VH3/JH生殖系共同序列 之序列比對。 圖39 :循環1雙特異性VEGF-DLL4 VHH之形式。 圖40 :循環2雙特異性VEGF-DLL4 VHH之形式。 圖 41-1〜41-4: VEGF/VEGFR2 AlphaScreen檢定（在 5 μΜ HS Α存在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環1)。 圖 42-1 〜42-2 : VEGF/VEGFR1 AlphaScreen檢定（在 5 μΜ HS Α存在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環1)。 圖 43-1〜43-4 : CHO-hDLL4/hNotchl-Fc FMAT檢定（在 25 μΜ HSA存在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環1)。 圖 44-1-44-4 : VEGF/VEGFR2 AlphaScreen檢定（在 5 μΜ HSA存在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環2)。 圖 45-1〜45_2 : VEGF/VEGFR1 AlphaScreen檢定（在 5 μΜ HSA存在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環2)。 圖 46-1 〜46-10 : CHO-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CHO-mDLL4/ hNotchlFc FMAT檢定（在25 μΜ HSA存在或不存在下）中之 雙特異性VHH(循環2)。 圖47-1〜47-2 : DLL4介導之報導檢定（在175 μΜ HSA存 在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環2)。 150860.doc -151 - 201124533 圖48 :序列最佳化雙特異性VEGF-DLL4 VHH之形式。 圖 49-1〜49-3 : VEGF/VEGFR2 AlphaScreen檢定（在 5 μΜ HSA存在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環3)。 圖 50-1 〜50-2 : VEGF/VEGFR1 AlphaScreen檢定（在 5 μΜ HSA存在或不存在下）中之雙特異性VHH(循環3)。 圖 51-1~51-3 ： CHO-hDLL4/hNotchl-Fc 及 CHO-mDLL4/ hNotchl-Fc FMAT檢定（在25 μΜ HSA存在或不存在下）中之 雙特異性VHH(循環3)。 圖52 :所選VHH在人類結腸癌之小鼠模型（SW620模型） 中之功效： A : S W620腫瘤生長動力學； B :第21天研究結束時之絕對腫瘤體積； C :體重隨時間之變化。 150860.doc •152- 201124533 序列表 <11〇>德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 <120>用於抗血管生成治療之雙特異性結合分子 <130> 12-0308-prio-2 <140〉 099133632 <141> 2010-10-01 <150> 09172137.3 ; 10175316.8 <151> 2009-10-02 ; 2010-09-03 <160> 102 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (8)•⑻ <223> xaa可為Arg、Ala或Glu <220> <221> MISC一FEATURE <222> (11)..(11) <乏 2 3 > Saa 计為 lieu 成 Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa 可為 Tyr 或 His <400> 1
Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr Xaa Tyr Asp Xaa 1 5 10
<210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 美洲駝之突變序列 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa可為Gin、Ala或Tyr <400> 2
Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala Tyr Xaa 15 10 15
Asp Tyr <210> 3 <211> 17
<212> PRT 150860-序列表.doc 201124533 <213> 美洲駝 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa 可為 Asp 或 Glu <400> 3
Ser Arg Ala Tyr Gly Ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Xaa 15 10 15
Tyr <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 4
Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Glv Glv 1 5 10 15 ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala lie ser Gly Phe Thr Leu Asp Leu His 20 25 3〇 val lie Gly Trp Leu Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp val 35 40 45
Ser cys lie ser Ser Ser Asp Gly ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tvr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 85 90 g5 y
Ala Ala Pro yp Asp ser Trp Tyr cys Gly lie Gly Asn Asp Tyr asd 100 105 no
Tyr Trp Gly Gin Cly Thr Cln Val Thr Val Ser ser <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 5
Glu val Gin Leu val Glu ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 1 5 10 1C7 y ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr • 2·
150860·序列表.doc 201124533 20 25
BO
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu val 35 40 45
Ala Val lie ser Asn Gly Gly lie Thr Asn Tyr Pro Asn Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie ser Arq Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Phe 85 90 95
Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp val His Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr Val ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 123 <212> PRT <213>美洲駝 <400> 6
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala ser Gly Ser Thr Phe Asn ser Tyr 20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ala Phe Ser Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp ser val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Phe 85 90 95
Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val Phe Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 130
<212> PRT 150860-序列表.doc 201124533 <213>美洲駝 <400> 7
Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Glv riw 1 5 10 is y
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Leu Asp Tvr t»,. 20 -an 1 'yr 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arq Glu Glv 35 40 45
Ser Cys lie Ser Ser Arg Gly Gly ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser vai 50 55 60 val
Lys Gly A「g Phe Thr Thr Ser Arg Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val τ'/" 65 70 75
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr rwe 85 90 95 ^ys
Ala Ala His Pro Leu Gin Asn Cys Cys Gly Gly Ser Ala Tyr Ala <;»r 100 105 110 e「
Pro Glu Ala Val Tyr Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr wai 115 120 125 Val
Ser ser 130 <210> 8 <211> 125 <212> PRT <213>美洲駝 <400> 8
Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
Ser Leu
Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
Asn lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tro Val 35 40 45
Ser Cys lie Asn Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp ser 50 55 6δ
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 65 70 75
IV
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cvs 85 90 95 7 -4- 150860·序列表.doc 201124533
Ala Ala Pro Phe Ala Tyr Tyr Ser Asn Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr 100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser ser 115 120 125 <210> 9 <211> 124 <212> PRT <213>美洲駝 <400> 9
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45
Ser Cys lie ser Ser His Asp Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie ser ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <2U> 123 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 10
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe val 35 40 45
Ala Ala lie Arg Trp ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser val 150860-序列表.d〇c 201124533 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr \/=η ι· 65 70 75 8〇Γ
Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tvr Twr·广、 85 90 g|r cys
Ala Asn Arg Ala Ala Asp Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Glu Tvr Acn t、,- 100 105 110 P yr
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 123 <212> PRT <213> 美洲駝
<400> 11
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser 20 25
Gly Phe Thr Phe
Asp Asp Typ
Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro G"*y Lys Glu 今「9 Glu Gly Val 35 40 45
Ser Cys lie Ser Ser ser Asp Gly ser Thr Tyr Tyr Ala Asp ser val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ser Asp Asn ya Lys Asn Thr* val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Thr Ala Trp cys Asp ser Ser Trp 丁Arg Ser phe Val Gly Tyr
100 105 HO
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213>美洲駝 <400> 12
Glu val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly ^ Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 l〇 IS 150860·序列表,doc -6 - 201124533
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly pro Glu Trp val 35 40 45
Ser Ser lie Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Phe Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Arg Ala Arg Gin Gly Asp Tyr Trp Gly Ala 100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 13
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Glu Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly ser Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val 35 40 45
Ala Gly lie Ser Phe Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Glu Ser val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val ser Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr 85 90 95
Ser Val His Pro Ser Thr Gly Phe Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin 100 105 110
Val Thr Val Ser ser 115 <210> 14 <211> 120 150860-序列表.doc 201124533 <212> PRT <213>美洲駝 <400> 14
Glu Val Gin Leu VaT Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 i5 y ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tvr
20 25 3〇 J
Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly He 35 40 45
Ser Cys lie ser Ser Ser Gly Gly lie Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 L^s Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tyr 70 75 80 95
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Thr Pro gy lie Ala Ala cys Gly ile His Tyr !hr Gly 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 15
Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro cly cly 25 ser Leu Arg Leu 20
Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly ile ser cys He Ser ser Ser Gly Gly He Thr Tyr Tyr Ala Asp ser val
Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tvr 65 70 7S έδ
Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 95
Ala Thr pro Gly lie Ala Ala cys Arg Gly ne His Tyr Thr Gly Gln 150860-序列表.doc 201124533 100 105 110
Gly Thr Gin val Thr val ser ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 16
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp val Tyr 20 25 30
Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly lie 35 40 45
Ser Cys lie Ser Ser Ser Gly ser lie Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Pro Gly lie Ala Ala Cys Arg Gly lie His Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213>美洲駝 <400> 17
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Glu lie 35 40 45
Ser cys lie ser ser ser Gly Gly lie Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 •9- 150860-序列表.doc 201124533
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tvr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tvr Tvr Cvs 85 90 95 y
Ala Thr Pro Gly lie Ala Ala Cys Arg Gly lie His Tyr Thr Glv Gin 100 105 110 ^
Gly Thr Gin Val Thr Val ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 116 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 18
Glu Val Gin Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Glv Glv 1 5 10 15 y
Ser Leu Arg Leu Ser Cys val Ala Ala Gly Phe Thr Phe ser Asn Tvr 20 25 30 y
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tro val 35 40 45 μ
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Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Leu Php 65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Gly Leu Lys Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tvr rv/c 85 90 95 ys
Ala Arg Gly ser Gly ser Trp Gly Val His Gly Gin Gly Thr Gin Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 123 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 19
Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Glv f：i\/ 1 5 10 IS y
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Tyr -10- 150860-序列表.doc 201124533
Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Asn Ser Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val Ser Ser 115 120
<210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 20
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly lie 35 40 45
Ser Cys lie Ser Ser Ser Gly Ser lie Thr Tyr Asp Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Pro Gly lie Ala Ala cys Arg Gly lie His Tyr Trp Gly Gin 100 10 S 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 -11 - 150860·序列表.doc 201124533 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 21
Glu Val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Glv gIv 1 5 10 15 乂
Ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe ser Ser τνη 20 25 3〇 Iy「
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr val
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Gin Gly Arg Phe Th「lie Ser Arg Asp Asn Ala Lvs Asn Thr x/ai 65 70 75
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 95
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Arg Pr〇 Tyr Leu Asp Tyr 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val Ser ser 115 120 <210> 22 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 22
Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Ala Gly Glv i 5 i〇 y
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser ser Tyr
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr val
Ala Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser val
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tvr Tvr 85 90 上之「 tys -12-
150860-序列表.doc 201124533
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 23
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45
Ala Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Glu Pro Tyr Leu Tyr Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser ser 115 120 <210> 24 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 24
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 -13· 150860-序列表.doc 201124533
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tvr vai 35 40 45 3
Ala Ala lie Arg Trp ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser val
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val τν/r 65 7Π 7C 1 75 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr rvc 85 on 90 95
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Arg Pro Tyr Leu Tyr Asp Tyr
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 <220> <22 3>美洲駝之突變序列 <400> 25 15
Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
Ser Leu
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Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg g!u Tyr val
Ala Ala lie Arg Trp ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser 55 60
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Gin Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr χ^Γ Cys 95
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 123 150860-序列表doc •14- 201124533 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 26
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr val 35 40 45
Ala Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Leu Tyr Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27
<211> 12B <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 27
Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 35 40 45
Ala Ala lie Arg Trp ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 •15· 150860·序列表.doc 201124533
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val 85 90
Tyr Cys
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tvr Glu Tvr 100 105 xi〇
Asp Tyr
Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 28
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala riw 产ί i5 i〇 iiy G|y 15 ser
Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser ser Tvr 2〇 1 y"
25 30
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Ala Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser val
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val τ«η 65 7Π 7C ' LJr 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tvr rvc 85 90 95 y
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asd Tvr 100 105 110 μ y
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 29
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Glv 1 5 10 15 •16·
150860·序列表.doc 201124533
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe .Gly ser ΤΥ「 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly pro Glu T「P Val 35 40 45
Ser Ala lie Asn ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110
Tyr Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val Ser Ser 115 120 125 <210> 30 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 30
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Glv Glv 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Gly ser Tvr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu TrD Val 35 40 45
Ser lie Asn Ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Tyr val kys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu T\/r 65 7Λ 7C ! y1 70 75 80
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tvr rwc «ς 〇n J Li1
Ala Ala Asp Arg Tyr He Trp Ala Arg Gin Gly clu Tyr Trp Gly Ala
Tyr Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val ser <；ργ 115 120 125 150860-序列表.doc •17· 201124533 <210> 31 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <2 2 3>美洲駝之突變序列 <400> 31
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro civ Glv 1 S l〇 if
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr lie Gly ser Tyr
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu TrD val
35 40 45 K ser ser lie Asn ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Tvr Val
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Lys Gly Arg phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tvr 65 70 75 gj
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tvr Tvr rvc 85 90 3
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala
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Tyr Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val 115 120 125 <210> 32 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <2 2 3>美洲駝之突變序列 <400> 32
Glu val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Gly ser Tvr 20 25 3〇 y
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Tro val 35 40 45
Ser Ser lie Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr val -18· 150860-序列表.doc 201124533
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 128 <212> PRT <213>人工 <220>
<223>美洲駝之突變序列 <400> 33
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr lie Gly Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp val 35 40 45
Ser Ala lie Asn ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110
Tyr Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 34 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 美洲駝之突變序列 <400> 34
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly -19· 150860-序列表.doc 15201124533 5 10 ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe ser ser Tyr 〇 30 y
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 40 45
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Ala Ala He Arg Trp ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser val
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tyr b 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tvr Tvr rvc 85 90 丨 9考「 tys
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tvr Acn u-：^ 110 100 i〇5 J w Asp ms
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 123 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 35
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Glv gIv i s 10 is
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe ser ser Tvr 20 25 30 y
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr val 35 40 45
Ala Ala lie Arg Trp ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp ser val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tvr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cvs 85 90 95
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asd His 100 105 110 -20- 150860-序列表.doc 201124533
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 36
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp val 35 40 45
Ser Ser lie Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 37 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 37
Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gin ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val -21 · 150860·序列表.doc 201124533 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu tv 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr rvc 85 90 95 y
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Glv Ala 100 105 110 y
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val ser ser 115 120 125 <210> 38 <211> 128 <212> PRT <213> 人工
<220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 38
Glu val Gin Leu Val
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro 10 ΪΊ5Υ
Gly
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tvr 20 25 B〇 y
Asp Met ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Tr〇 val 35 40 45
Ser Ser He Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tvr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tvr TrD Glv Ala 100 105 no y
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ser 115 120 125 <210> 39 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <22 3>美洲駝之突變序列 -22-
】50860·序列表.doc 201124533 <400> 39
Glu val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly ser Tyr 20 25 3〇 ’
Asp Met ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 4 ^
Ser Ser He Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 5ϋ bb 60 J
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tvr 〇5 7Ω 7 C _ ? 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Glv Ala 100 105 y
Tyr Glu 迅 Asp Tyr Trp Gly Gjj Gly Thr Leu val Thr val ser ser <210> 40 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 40
Glu val Gin Leu Val GTu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly ser Tyr
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu TrD val 3 S ΑΠ λ r h _ ser ser lie ser ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr val
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys
Ala Ala Asp Arg Tyr lie T「p Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala -23- 150860-序列表.doc 201124533 100 105 no
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val ser ser 115 120 125 <210> 41 <211> 128 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 41
Glu Val Gin Leu val Glu ser Gly Gly
Gly Leu Val Gin Pro Glv Glv
10 15 Y
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr lie Gly ser Tyr
Asp Met Ser Trp Val A「g Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu t「d val 35 40 45
Ser Ser lie ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tvr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cvs 85 90 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 no
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val ser Ser 115 120 125
<210> 42 <211> 125 <212> PRT <213>美洲轮 <400> 42
Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly cly Leu Val Gin Pro civ Asp 15 l〇 15
Ser Leu Lys gu Ser Cys Ala Phe Gly Arg Thr Phe Se「ser 丁
^ 25 an J ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe val
Ac val Ala lie Ser Ser Gly Gly Phe ile Tyr Asp Ala val ser Leu Glu 24· 150860·序列表.doc 201124533 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Thr Pro Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Ala Ser Arg Ala Tyr Gly ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val Ser Ser 115 120 125 <210> 43 <211> 125 <212> PRT <213> 美洲駝 <400> 43 Glu Val ! Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe val 35 40 45
Val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser val Ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 44 <211> 125 <212> PRT <213> 美洲駝 <4〇〇> 44
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asp 1 5 10 15 25- 150860-序列表.doc 201124533 ser Leu Lys Leu ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ser Tvr 20 25 30 y
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 val Ala lie Ser Ser Gly Gly Tyr lie Tyr Asp Ser val Ser Leu Gin 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Thr Pro ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 85 90 95
Ala Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tvr 100 105 110 y
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr Val ser Ser 115 120 125 <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213>美洲駝 <400> 45
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Glv 1 5 l〇 y ser Leu Arg Leu ser Cys Val Ala Ser Gly lie Arg Phe Met Ser Met 20 25 3〇
Ala Trp 这r Arg Gin Ala Pro gy Lys His Arg Glu LeU val Ala Arg
He ser ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr val Asp ser val Lys Gly Arg 川 60
PheThr xle SerArgAspAsn Ser Lys Asn Val Jyr Leu Gln
Asn ser Leu Lys Ala clu Asp Thr Ala v〇al Tyr Tyr Cys Asn Phe ser ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly Thr Gin val Thr val ser 丄υυ 105 ±10
Ser <210> 46 <211> 124 -26 -
150860·序列表.doc 201124533 <212> PRT <213>美洲·§£ <400> 46 Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val 15 10
Gin Ala
Gly Gly ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tvr 20 25 3〇 y
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg val Leu val 35 40 45
Ala Asp He ser Ser Ser Gly lie Asn Thr Tyr Val Ala Asp Ala val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tyr
Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr rvc 85 90 95 y Ala Ala Ser Ala Trp Trp Tyr Ser Gin Met Ala Arg Asp Asn Tvr Ara 100 105 110 9 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 123 <212> PRT <213> 美洲聪 <400> 47
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Ala Gly cly
ser Leu Arg Leu Ser cys Thr Ala ser cly ser Ala Phe Lys Ser Tyr
Arg Met Gly Trp Phe Arg Arg Thr Pro Gly Lys Glu Asp Glu Phe val 35 40 45 vai Ala ser lie ser Trp Thr Tyr Gly ser Thr Phe Tyr Ala Asp ser val 50 55 60 vai gs Gly Arg Phe Thr Mgt Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Ala Gly Tyr 65 70 75 8〇 Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr cvs 85 90 95 Ala Ala Gly Ala Gin Ser Asp Arg Tyr Asn lie Arg Ser Tyr Asp Tyr 150860-序列表.doc -27- 110 201124533 100 105 Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val ser ser 115 120 5er <210> 48 <211> 285 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 包含美洲駝序列之人工多肽 <400> 48
Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Thr Gly Asp
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu val ser Gly Arg Thr Phe sen ser Tyr ^ 30 ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg clu Phe Val val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp ser Val ser Leu Glu 50 55
Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tvr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 85 90 95
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala asd Thr Tvr 100 105 no y
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val Ser Ser Gly Glv Glv 115 120 125
Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Glv Glv 130 135 140 J y y
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Thr Gly Asp 165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser cys Glu val ser Gly Arg Thr Phe ser ser Tyr 180 185 190
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 195 200 205 -28-
150860-序列表.doc 201124533
Val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val c 210 215 220 al Ser Leu Glu
Gly A「g Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr \/，ί 225 230 235 Val Tyr Leu 240
Gin lie Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tvr τ' 245 250 2ΪΙ Ala
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Act 260 265 27〇 Tflr TV^
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 275 280 28S <210> 49 <211> 247
<212> PRT <213> 人工 <220> <223> 包含美洲乾序列之人工多肽 <400> 49
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Thr 1 5 l〇 Gly 15^
Asp ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe s^r c 20 25 3〇Γ Ser Tyr
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arq gIii 、， 35 40 val val Ala He ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp ser Val ser Leu Glu
Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tvr i 65 70 75 y g^u
Gin lie Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys Ala 85 90 gj
Ser ser Arg Ala Tyr Gly ser ser Arg Leu Arg Leu Ala asd Thr τνη 100 105 ll8 y
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val ser ser Glv Glv civ 115 120 125 y y
Gly ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Glv Glv Glv 130 135 140 y y
Leu Val Gin Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu ser Cys Val Ala Ser Glv 145 ISO 155 160 -29· 150860-序列表.doc 201124533 lie Arg Phe Met Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys His 165 170 175
Arg Glu Leu val Ala Arg lie Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr val 180 185 190 A'sp ser v.al Lys Gly Arg phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205
Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala val 21〇 215 220
Tyr Tyr Cys Asn Thr phe Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Ala Gly 225 230 235 240
Thr Gin val Thr Val ser ser 245
<210> 50 <211> 278 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>包含美洲駝序列之人工多肽 <400> 50
Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Thr Glv Asd 1 5 10 is H
Ser Leu Arg Leu ser Cys Glu Val 20
Ser Gly Arg Thr Phe Ser ser 25 30
Tyr
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe val 35 40 45
Val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu rIu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tvr i 65 7n -re y * *-cu
75 80
Gin lie Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 85 90 gr Ser Ser Arg Ala Tyr Gly ser ser Arg Leu Arg Leu Ala asd Thr Twr 100 105 liH y
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val Ser Ser Glv Glv riw 115 120 125 y Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly cly Gly 150860-序列表.doc -30- 201124533
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly 160 145 150 155
Gly Gly Gly Gly Ser Glu val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly ^75 L6U 165 170
Val Gin Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu ser cys Val A*ia G"*y "e 180 185 19ϋ
Arg Phe Met Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys H1S Ar9 195 200 2〇5
Glu Leu Val Ala Arg lie ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val Asp 210 215 220 ser vaT Lys Gly Arg Phe Thr He ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr
Val Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 245 2S0
Ala 盔 Ty「
Gly Ala Gly Thr 270
Tyr Cys Asn Thr Phe Ser ser Arg pro Asn Pro Trp 260 265
Gin val Thr val ser ser 275 <210> 51 <211> 289 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 包含美洲駝序列之人工多肽 <400> 51
Glu Val Gin Leu Val Glu ser
Gly Gly Gly Leu val 10
Gin Thr Gly Asp 15
Ser Leu Arg Leu ser cys Glu Val ser Gly Arg Thr Phe Ser ser Tyr 20 25 30 ser Met Gly Trp phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 val Ala lie ser Lys Gly Gly Tyr lvs Tvr Asp ser val ser Leu Glu 50 55 ^ 60
Cly Arg Phe Thr He Ser Lys Asp Asn Ala Lf Asn Thr Val Tyr Leu
Gin lie Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys Ala 150860-序列表.doc 201124533 85 90 95
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 165 170 175
Val Gin Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg 180 185 190
Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys 195 200 205
Glu Arg Val Leu Val Ala Asp lie Ser Ser Ser Gly lie Asn Thr Tyr 210 215 220
Val Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 225 230 235 240
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 245 250 255
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Trp Trp Tyr Ser Gin Met Ala 260 265 270
Arg Asp Asn Tyr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser 275 280 285
Ser <210> 52 <211> 288 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 包含美洲駝序列之人工多肽 <400> 52
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Thr Gly Asp 15 10 15 -32- 150860·序列表.doc 201124533 30 ser Leu A「g ser cys Glu val s!r Gly A「g Thr Phe §?r se「Ty「 ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys clu Arg clu Phe Val val Ala He Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Sen Val ser Leu Glu
Leu 80
Gly Arg Phe Thr He ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tyr
Gin lie Asn Ser gu Lys Pro Glu Asp Ala val Tyr Tyr Ala 110
Ser ser Arg Ala Tyr Gly ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin val Thr val ser Ser Gly Gly Gly 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly IB 5 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 150 155 160
Gly Gly Gly Gly ser Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 165 170 175 val Gin Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala ser Glv Ser 180 185 190 Ala Phe Lys Ser Tyr Arg Met Gly Trp Phe Arg Arg Thr Pro Gly Lys 200 205
Glu Asp Glu Phe Val Ala ser lie ser Trp Thr Tyr Gly ser Thr Phe 210 215 220 Ala Asp se「val Gly Arg Phe Thr ser Arg Asp Lys Ala 230 235 240
Lys Asn Ala Gly Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Lys Pro Glu asd Thr 245 250 255
Ala Leu Tyr Tyr cys Ala Ala Gly Ala Gin Ser Asp Arg Tyr Asn lie 260 265 270
Arg Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr val ser ser 2?5 280 285 <210> 53 150860-序列表.d〇c -33- L：l 201124533 <211> 289 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 包含美洲駝序列之人工多肽 <400> 53
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala pro Gly Lys Glu Arg Val Leu Val 35 40 45
Ala Asp lie Ser Ser Ser Gly lie Asn Thr Tyr val Ala Asp Ala Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Ser Ala Trp Trp Tyr ser Gin Met Ala Arg Asp Asn Tyr Arq 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Glv 115 120 125 J
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser 130 135 140
Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Glv 145 150 155 160
Gly Gly Gly ser Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val 165 170 175
Gin Thr Gly Asp ser Leu Arg Leu ser cys Glu Val Ser Gly αγο Thr 180 185 190 .
Phe ser ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly lvs Glu 195 200 205
Arg Glu Phe Val val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr asd Ser 210 215 220
Val Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala lvs Asn 225 230 235 240 -34- 150860-序列表.doc 201124533
Thr Val Tyr Leu Gin lie Asn ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 245 250 255
Tyr Tyr cys Ala Ser ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu 260 265 270
Ala Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser 275 280 285
Ser <210> 54 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220>
<223>美洲駝之突變序列 <400> 54
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Thr Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala ser Gly Arg Th「Phe ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45
Val Ala lie ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ser 115 120 125 <210> 55 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 55
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly -35- 150860-序列表.doc 201124533 15 10 15 ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe ser ser Tyr 20 25 3〇
Ser Met Gjy Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe val ϋ 40 45 val Ma lie ser Lys Gly gy Tyr Lys Tyr Asp Ser Val ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tvr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 no
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ser 115 120 125 <210> 56 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 56
Pro Gly Gly 15
Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 15 10
Ser Leu Arg Leu ser Cys Glu Ala Ser Gly Arg Thr Phe ser ser Tyr 20 25 3〇
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg gIu Phe Val
35 40 val Ala lie ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tyr Leu 65 70 75 8〇
Gin lie Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 gj
Ser ser Arg Ala Tyr Gly Ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 11。 150860·序列表.doc -36- 201124533
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ser 115 120 125 <210> 57 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 57
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Thr Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45
Val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 58 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 58
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Thr Gly Asp IS 10 15
Ser Leu Arg Leu ser Cys Glu val ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val Ser Leu Glu •37- 150860-序列表.doc 201124533 50 55 60
Tyr Leu 80
Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr val 65 70 75
Gin Met Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 90 95
Ser ser Arg Ala Tyr Gly ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala 100 105
Asg Thr Tyr
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 115 120 125 <210> 59 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <2 2 3>美洲駝之突變序列 <400> 59
Glu Val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Glv 15 l〇 Λ：>μ 30
Ser Leu Arg Leu ser cys Glu Val ser Gly Arg Thr Phe ser Ser Tyr
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe val val Ala He Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser Val ser Leu Glu jU bb 60
Gly Arg Phe Thr He ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu ϋ 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys Ala 110 ser ser Arg Ala Tyr Gly Ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp xhr Tyr
Thr Val Ser Ser 125
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 <210> 60 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 美洲駝之突變序列 -38- 150860-序列表.doc 201124533 <400> 60
Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Thr Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu ser Cys Glu Val ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 3〇 ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu jrg Glu Phe Val val Ala lie ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser val Ser Leu Glu
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 ser ser Arg Ala Tyr Gly ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 115 120 125 <210> 61 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 61
Glu val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Thr Glv asd 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala val Ser Gly Arg Thr Phe Ser ser Tvr 20 25 30 ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Ara Glu Phe Val 35 40 45
Val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ser val ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tvr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr Cvs Ala 85 90 95 ser ser Arg Ala Tyr Gly ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr -39- 150860-序列表.doc 201124533 100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 115 120 125 <210> 62 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 62
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Thr Gly Asp 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45
Val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr 100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 63 <211> 125 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 63
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe val 35 40 45 -40· 150860-序列表.doc 201124533
Val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala val ser Leu Glu 50 55 60
Cly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tyr Leu
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 85 90 95 ser ser Arg Ala Tyr Gly Ser sen Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 64 <211> 125
<212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 64
Asp Val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe Ser ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe val 35 40 45 val Ala lie Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val Ser Leu Glu 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tvr Leu 65 70 75 80
Gin lie Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cvs Ala 85 90 95
Thr Tyr
Ser ser Arg Ala Tyr Gly ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala 100 105
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ser 115 120 125 <210> 65 <211> 113 <212> PRT <213> 人工 150860-序列表.doc -41 - 201124533 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 65
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly IS 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly lie Arg Phe Met Ser Met 20 25 30
Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala Arg 35 40 45 lie Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met 65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Phe 85 90 95
Ser Ser Arg Pro Asn Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val ser 100 105 110
Ser <210> 66 <211> 113 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>美洲駝之突變序列 <400> 66
Glu VaT Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys val Ala ser Gly lie Arg Phe lie Ser Met 20 25 30
Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys His Arg Glu Leu Val Ala Arg 35 40 45 lie Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met 65 70 75 80
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150860-序列表.d〇c 201124533
Thr Gin Val Thr val Ser Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser 260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu val Glu 275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 290 295 300
Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg 305 310 315 320
Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val Ala Ala lie Arg Trp Ser 325 330 335
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Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 355 360 365
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Val Ala lie ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp ser Val Ser Leu Glu -59- 150860-序列表,doc 201124533 50 55 60
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Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser A「g Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tvr 100 105 no
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Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Glv Glv 165 170 i75 ser Leu Arg Leu Ser cys Val Ala Ser Gly He Arg Phe Met ser Met 180 185 i9〇 Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys His Arg Glu Leu Val Ala Arg 205
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Ser ser Arg g卬 Asn Pro Trp Gly Giy Thr Gln val val ser 260 265 270 285 ser Gly % Gly Gly se「 Gly G坧 Gly Gly ser Gly 处 Gly Gly ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Glu Val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val 315 320
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Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu 340 345 350
Arg Glu Tyr Val Ala Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr 355 360 365
Ala Asp Ser Val Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys 370 375 380
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Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr 405 410 415
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<210> 80 <211> 407
<212> PRT <21B> 人工 <220> <223> 包含美洲駝序列之人工多肽 <400> 80
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Thr Gly Asp 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Gin Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly _61 - 150860·序列表.doc 201124533 130 135 140 ser 160 ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly cly cly Gly
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Gly Gly Gly ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Glv Glv i 〇u val 290 295 300 y ai
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Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Glv Lvs Glv 325 330 y 335
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Thr Leu val Thr Val Ser Ser 405 -62- 150860-序列表.doc 395 201124533 <210> 81 <211> 282 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 包含源自美洲駝之序列之人工多肽 <400> 81
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe ser Ser Tyr Ser 20 25 30
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Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Glu 100 105 110
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Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser 165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe ser Ser Tyr Ala 180 185 190
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val Ala 195 200 205
Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser val Lys 210 215 220 -63· 150860-序列表.doc 201124533
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr val Tvr Leu 225 230 235 240
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr cvs Ala 245 250 y「沒 Aia
Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His TrD 260 265 270
Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val ser ser 275 280 <210> 82 <211> 380 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 包含源自美洲駝之序列之人工多肽
<400> 82
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Gly Leu Glu Trp Val ser Ser lie Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu 180 185 190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 195 200 205
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Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 245 250 255
Ser Glu Val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 260 265 270
Gly ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser 275 280 285
Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr 290 295 300
Val Ala Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 305 BIO 315 320
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Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 340 345 350
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Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser 15 10 15 -65- 150860-序列表.doc 201124533
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285
Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly cly Gly Gly Ser Gly Gly 150860·序列表.doc -66- 201124533 290 295 300
Gly Gly ser Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin 305 310 315 320
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Tyr Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu 405 410 415
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Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Glv Glv Gly Leu Val Gln Pr〇 Gly Gly 1 5 10 15
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Gin lie Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys Ala 85 9〇 95 •67· 150860·序列表.doc 201124533
Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tvr 100 105 no 7
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Ala Ala lie Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala asd <；ργ val 210 215 220 μ
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tvr Tvr cvs 245 250 y 255
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr asd His 260 265 270
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Leu Val Leu lie Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu 305 310 315 320
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150860-序列表.d〇c 201124533
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Asp val Cln Leu vaT du Ser cly Gly Gly Leu Va! Gln Pro ^ dy
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Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tvr 100 105 110 7
Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser ser Gly Glv Glv 115 120 125 y
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Glv Glv 130 135 140 y y
Leu val Gin Pro dy Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser G}y 145 155 160 lie Arg Phe lie ser Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin 165 170 175
Arg Glu Leu val Ala Arg lie ser ser Gly Gly Thr Thr Ala Tvr Ala 180 185 190
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Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val 210 215 220
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser cly Gly Gly Gly Ser Gly Gly ^ Gly $ep •71 150860-序列表.doc 201124533
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Val Thr val ser Ser Asp Ala His Lys ser Glu Val Ala His Arg Phe 405 410 415
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Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr lie Gly ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp val 35 40 45
Ser Ser lie Ser Ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Tyr Val 50 55 60 .74·
150860-序列表.doc 201124533
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala 100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser Ser 115 120 125
Cly Cly Gly Gly Ser cly Cly cly cly ser Gly cly Gly cly Ser Cly
Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160
Gly Gly Ser Asp val Gin Leu val Glu se「 Gly Gly Gly Leu val Gin 165 170 175
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Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Ser Glu val Gin Leu Val Glu ser 290 295 300
Gly Gly Cly Leu Val Cln Pro Cly Cly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
Ala ser Gly lie Arg Phe He ser Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala pro 325 330 335
Gly Lys Gin Arg Glu Leu val Ala Arg lie ser Ser Gly Gly Thr Thr -75- 150860-序列表.doc 201124533 340 345 350
Ala Tyr Ala Asp ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn 355 360 365 ser Lys Asn Thr val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
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Ala Asp Glu ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys ser Leu His Thr Leu Phe
Gly Asp Lys Leu cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu 485 490 495
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Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr 565 570 575
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Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala ser ser Ala Lys Gin Arg Leu 595 600 605
Lys Cys Ala ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 610 615 620 150860·序列表.doc -76-
201124533
Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu 625 630 635 640 val ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 645 650 655
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Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys ser His cys He Ala Glu val Glu 690 695 700
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Glu ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lvs Asd Val Phe 725 730 735
Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr ser 740 745 750 val val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu 755 760 765
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Asp Glu Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin 785 790 795 800
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Lys Glu Arg Gin lie Lys Lys Gin Thr Ala Leu val Glu Leu Val Lys 930 935 940
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Phe Ala Ala Phe val Glu Lys cys cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr 965 970 975 cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Ala Ala Ser Gin Ala Ala 980 985 990
Leu Gly Leu 995 <210> 87 <211> 903 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>包含源自美洲駝之序列之人工多肽 <400> 87
Asp Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Glv Glv 15 10 is’ y
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe Ser Tvr 20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe ser ser Tyr 180 185 190
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Val 195 200 205
Ala Ala lie Arg Trp ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser val 210 215 220
Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 225 230 2B5 240
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 245 250 255
Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr Glu Tyr Asp His 260 265 270
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 290 295 300
Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala 305 310 315 320
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Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala 500 505 510
Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arq Ala 515 520 525
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Leu Lys Glu cys cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His cys lie 595 600 605
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Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arq 645 650
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Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu cys Tyr 675 680 685
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Leu lie Lys Gin Asn cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys 705 710 715 720
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Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 900 <210> 88 <211> 1025 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>包含源自美洲駝之序列之人工多狀 -81 - 150860-序列表.doc 201124533 <400> 88
Asp Val Gin Leu Val
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Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Cys Ala Ala …τL — Ser Leu Arg Leu 20
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150860-序列表.doc 201124533
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Ala Ala ser Gly Arg Thr Phe ser ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Gin Ala Pro Glyg! Glu Arg G1U Tyr % AU Ala Ile Arg Μ se「 330 335
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Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr cys Val Ala Asp 485 490 495
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 500 505 510
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 515 520 525
Asp Cys cys Ala Lys Gin Glu pro Glu Arg Asn Glu cys Phe Leu Gin 530 535 540 -83- 150860·序列表.d〇c 201124533
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro Glu val 545 550 555 560
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 565 570 575
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Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 595 600 605
Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 610 615 620
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys 625 630 635 640
Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 645 650 655
Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val ser 660 665 670
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150860-序列表.doc 201124533
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cvs 820 825 830
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Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gly ser Lys Cys cys Lys His 865 870 875 880
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Leu Asn Gin Leu cys val Leu His Glu Lys Thr Pro val ser Asp Ara 900 905 910
Val Thr Lys Cys cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro cys Phe 915 920 925
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Ser
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Tyr Cys Ala ser ser Ara Ala Tvr Gly Ser ser Arg Leu Arg Leu Ala 260 265 270
Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ser 275 280 285 -86 - 150860-序列表.d〇c 201124533
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295
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Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu b4b 550 555 560 •87· 150860-序列表.doc 201124533 val Arg Pro Glu val Asp Val Met cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu 565 570 575
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Gin Arg Leu Lys Cys Ala ser Leu Cln Phe Cly Clu Arg Ala Phe
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Leu Ala Lys Tyr lie Cys Glu Asn Gin Asp Ser lie Ser Ser Lvs Leu 70S 710 715 720
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Arg Arg His Pro
Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala 770 775 780
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Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tvr Ala 805 810 815
Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu 820 825 830 lie Lys Gin Asn cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe -88 ·
150860-序列表.doc 201124533 835 840 845
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ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 1025 1030 <210> 90 <211> 35 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>合成連接子 <400> 90
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Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly IS 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser -90-
150860-序列表.doc 201124533 25 20 <210> 95 <211> 27 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>合成連接子 <400> 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly 15 10 15
Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 <210> 96 <211> 35
<212> PRT <213> 人工 <220> <223> 合成連接子 <400> 96
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30
Gly Gly Ser 35 <210> 97 <2U> 35
<212> PRT <213> 人工 <223> 合成連接子 <400> 97
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30
Gly Gly ser 35 <210> 98 <2U> 115 <212> PRT <213> 人工 •91 - 150860-序列表.doc 201124533 <220> <2 2 3>美洲駝之突變序列 <400> 98
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Asn 1 5 10 15 ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe ser ser Phe 20 25 30
Gly Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp ser val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tvr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr lie Gly Gly Ser Leu Ser Arg ser ser Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 val Ser ser 115 <210> 99 <211> 585 <212> PRT <213> 智人 <400> 99
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu IS 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu lie Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin 20 25 30
Gin cys Pro Phe Glu Asp His val Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp cys cys Ala Lys Gin Glu Pro 85 90 95 -92-
150860·序列表.doc 201124533
Glu Arg Asn Glu cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu lie Ala Arg 13〇 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190
Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu 195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro 210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie cys Glu Asn Gin Asp Ser lie Ser 260 265 270 ser Lys Leu Lys Glu Cys cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285
Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro •93· 150860-序列表.doc 201124533 370 375 380
Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu 385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415
Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro cys 435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys val Leu His 450 455 460
Glu Lys Thr Pro val ser Asp Arg Val Thr Lys cys Cys Thr Glu ser 465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 lie Cys Thr Leu ser Glu Lys Glu Arg Gin lie Lys Lys Gin Thr Ala 515 520 525
Leu val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu 530 535 540
Lys Ala val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575
Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 100 <211> 109 <212> PRT <213> 智人 <400> 100
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser Ser Tyr 20 25 30 -94-
150860-序列表.doc 201124533
Ala Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys G"*y Glu Trp Val 35 40 4b
Ser Ala lie ser Gly ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp ser Val 50 55 b0
Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn ||「 Lys Asn Thr Leu Jyr 65 70 0 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASP 丁hr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9〇 95
Ala Lys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser ser 100 105 <210> 101 <211> 687
<212> PRT <213> 智人 <400> 101
His Met Met Ala 言la Ala Ser Arg ser ser G"*y T「p A"*a t|u Leu
Leu Leu val Ala Leu Trp Gin Gin Arg Ala A"*a G"*y Ser Val phe 20 25 30
Gin Leu Gin Leu Gin Glu Phe lie Asn Glu Arg Gly Leu Ala ser 35 40 45
Gly Arg Pro Cys Glu Pro Gly cys Arg 丁hr phe Α「9 Val cys Leu
50 55 bU
Lys Hi's Phe Gin Ala Val Val ser Pro Gly cys Thr Phe Gly pr 65 70 75 8〇 val Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp 85 9〇 95
Ser ser Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gin Leu Pro Phe Asn Phe Thr 100 i〇5 110
Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu lie lie Glu Ala Trp His Ala Pro Gly 115 120 125
Asp Asp Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu lie Ser Lys 130 135 140 lie Ala lie Gin Gly ser Leu Ala val Gly Gin Asn Ttd Leu Leu Asp 145 150 155 160
Glu Gin Thr Se「 Th「 Leu Thr Arg Leu Arg Tyr ser Tyr A「g Val lie 150860-序列表.doc -95- 201124533 165 170 175
Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn cys ser Arg Leu Cys Lys Lys 1δϋ 185 190
Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gin Pro Asp Gly Asn Leu 200 205
Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr cys Gin Gin Pro lie Cys 215 220
Ser Gly Cys His Gin Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240
Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gin Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys lie 245 255
Pro His Asn Cly cys Arg His Gly Thr cys ser Thr Pro Trp Gin Cys
Thr Cys 今Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gin Asp Leu Asn 275 280 285 丁yr Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr cys ser Asn 290 295 ^ 300
Gly Gin Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly 305 310 315 320 val Asp Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp ser Asn Pro Cys Arg 325 330 B35
Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys 340 345 350
Pro Pro Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His ser Thr Leu Ser Cys 355 360 365
Ala Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly ser Cys Arg Glu Arg Asn Gin 370 375 380
Gly Ala Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn 385 390 395 400
Cys Glu Lys Lys val Asp Arg Cys Thr ser Asn Pro cys Ala Asn Gly 405 410 415
Gly Gin Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met cys Arg cys Arg Pro 420 425 430
Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys GTu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg 435 440 445 -96- 150860-序列表.doc 201124533
Asn Pro cys Ala His Cly cly Thr Cys His Asp Leu Clu Asn Cly Leu
Met cys Thr Cys Pro Ala cly Phe ser Gly Arg Arg cys Glu val Arg
Thr ser lie Asp Ala cys Ala Ser Ser Pro cys Phe Asn Arg Ala Thr 485 490 495
Cys Tyr Thr Asp Leu ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn cys Pro Tyr 500 505 510
Gly Phe val Gly Ser Arg cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser
Phe Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Cly Leu Ala Val Leu Leu
Val Leu Leu GTy Met Val Ala Val Ala Val Arg Gin Leu Arq Leu Arq 545 550 555 560
Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe 565 570 575
Gin Lys Asp Asn Leu lie Pro Ala Ala Gin Leu Lys Asn Thr Asn Gin 580 585 590
LyS Lys Glu Leu Clu Val Asp Cys cly LeU Asp Lys Ser Asn cys cly
Lys Gin Gin Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu 610 615 620
Gly Arg Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His ser asd lvs ser Leu 625 630 635 640
Gly Glu Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cvs Ara 645 650 655 lie ser Ala lie Cys ser Pro Arg Asp ser Met Tyr Gin Ser Val Cys 660 665 670
Leu lie Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val lie Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 102 <211> 707 <212> PRT <213> 恆河獼猴 <400> 102 -97- 150860-序列表.doc 201124533
Met Ala Cys Ala Cys Ala Met Leu Ala Thr Thr Ala Arg His Glu ser 15 10 15
Ser Met Asn Lys Glu Tyr Met Ala Ala Ala Ser Trp Ser Ala Ser Gly 20 25 30
Trp Ala Leu Leu Leu Leu val Ala Leu Trp Gin Gin Arg Ala Ala Gly 35 40 45
Ser Gly Val Phe Gin Leu Gin Leu Gin Glu Phe Val Asn Glu Arg Gly 50 55 60 val Leu Ala Ser Gly Arg Pro cys Glu Pro Gly cys Arg Thr Phe Phe 65 70 75 80
Arg Val Cys Leu Lys His Phe Gin Ala Val val Ser Pro Gly Pro Cys 85 90 95
Thr Phe Gly ser Val Ser Thr Pro VaT Leu Gly Thr Asn ser Phe Ala 100 105 110 val Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gin Leu Pro 115 120 125
Phe Asn Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu lie lie Glu Ala Trp 130 135 140
His Ala Pro Gly Asp Asp Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala 145 150 155 160
Leu lie Ser Lys lie Ala lie Gin Gly Ser Leu Ala Val Gly Gin Asn 165 170 175
Trp Leu Leu Asp Glu Gin Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arq Tyr Ser 180 185 190
Tyr Arg val lie Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn cys Ser Arg 195 200 205
Leu cys Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gin Pro 210 215 220
Asp Gly Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr cys Gin 225 230 2B5 240
Gin Pro lie Cys Leu Ser Gly Cys His Glu Gin Asn Gly Tyr cys ser 245 250 255
Lys Pro Ala Glu Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gin Gly Arg Leu Cys 260 265 270
Asn Glu Cys lie Pro His Asn Gly cys Arg His Gly Thr cys ser Thr -98-
150860-序列表.doc 201124533 275 280 285
Pro Trp Gin Cys Thr cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp 290 295 300
Gin Asp Leu Asn Tyr cys Thr His His ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala 305 310 315 320
Thr Cys Ser Asn ser Gly Gin Arg ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro 325 BBO B35
Gly Tyr Thr Gly val Asp cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp ser 340 345 350
Asn Pro cys Arg Asn Gly Gly Ser cys Lys Asp Gin Glu Asp Gly Tyr 355 360 365
His cys Leu cys Pro Pro cly Tyr Tyr Gly Leu His cys Glu His Ser
Thr Leu ser Cys Ala Asp Ser Pro cys Phe Asn Cly Gly ser Cys Arg
Glu Arg Asn Gin Gly Ala Ser Tyr Ala cys Glu Cys Pro pro Asn Phe 405 410 415
Thr Gly ser Asn cys Glu Lys Lys Val Asp Arg cys Thr ser Asn Pro 420 425 430
Cys Ala Asn Gly Gly Gin Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met cys 435 440 445
Arg Cys Arg Pro Gly Phe Thr Gly Thr Tyr cys Glu Arq His val Ser 450 455 460
Asp Cys Ala Arg Asn Pro cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu 465 470 475 480
Glu Ser Gly Leu Met cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg 485 490 495
Cys Glu Val Arg Thr Ser lie Asp Ala Cys Ala ser Ser Pro Cys Phe 500 505 510
Asn Arg Ala Thr Cys Tyr Thr Asp Leu ser Thr Asp Thr Phe val cys 515 520 525
Asn cys Pro Tyr Gly Phe val Gly ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly 530 535 540
Leu Pro Pro Ser Phe Pro Trp Val Ala Val ser Leu Gly val Gly Leu 545 550 555 560 -99- 150860-序列表.doc 201124533 Ala val Leu
Leu Val Leu Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gin 565 570 575
Leu Arg Leu
Arg Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn 580 585 590
Leu Ser Asp 595
Phe Gin Lys Asp Asn Leu lie Pro Ala Ala Gin Leu Lys 600 605
Asn Thr Asn 610
Gin Lys Lys Glu Leu Glu val Asp Cys Gly Leu Asp Lys 615 620 ser Asn Cys 625
Gly Lys Gin Gin Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala 630 635 640
Pro Gly Pro
Leu Gly Arg Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His ser 645 650 655
Asp Lys Ser
Leu Gly Glu Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys 660 665 670
Pro Glu cys 675
Gin Ser Val 690
Arg lie ser Ala lie Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr 680 685
Cys Leu lie Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val lie Ala 695 700
Thr Glu Val 705
150860·序列表.doc -100-

Claims (1)

  1. 201124533 七、申請專利範圍： 1. 一種雙特異性結合分子，其包含D114結合組分及VEGF結 合組分。 2. 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該D114結合組分及 該VEGF結合組分分別包含至少一個D114結合免疫球蛋白 單一可變域及至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變 域。 3. 如請求項2之雙特異性結合分子，其中該等免疫球蛋白 • 單一可變域為VHHs。 4. 如請求項2或3之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合 組分位於N端。 5. 如請求項2或3之雙特異性結合分子，其中該D114結合組 分及該VEGF結合組分分別包含至少一個VEGF結合免疫 球蛋白單一可變域及至少一個D114結合免疫球蛋白單一 可變域，其中該等免疫球蛋白單一可變域各具有四個構 ^ 架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區， 其中 a)該至少一個D114結合免疫球蛋白單一可變域之CDR3具 有選自以下之胺基酸序列： i.如 SEQ ID NO: 1 中所.示之 Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro Tyr Xaa Tyr Asp Xaa，其中 位置8之Xaa為Arg、Ala或Glu ; 位置11之Xaa為Leu或Glu;及 位置14之Xaa為Tyr或His;及 150860.doc 201124533 ii.如 SEQ ID NO: 2 中戶斤示之 Asp Arg Tyr lie Trp Ala Arg Gin Gly Glu Tyr Trp Gly Ala Tyr Xaa Asp Tyr > 其中 Xaa為Gin、Ala或Tyr ;及其中 b)該至少一個VEGF結合免疫球蛋白單一可變域之CDR3 具有如SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala Asp Thr Tyr Xaa Tyr，其中 Xaa為 Asp 或 Glu， 其中該VEGF結合免疫球蛋白單一可變域能夠以260% 之抑制率阻斷人類重組VEGF 1 65與人類重組VEGFR-2 的相互作用。 6. 如請求項5之雙特異性結合分子，其中該免疫球蛋白單 一可變域為VHH，其已由親本免疫球蛋白單一可變域 VHH之親和力成熟後視情況進行序列最佳化而獲得。 7. 如請求項6之雙特異性結合分子，其中該D114結合之VHH 已自具有胺基酸序列選自SEQ ID NO: 4-20及表5中所示 序列的親本VHH獲得。 8. 如請求項7之雙特異性結合分子，其中該親本VHH具有 SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列。 9. 如請求項8之雙特異性結合分子，其中該D114結合之VHH 已由具有SEQ ID NO: 10中所示序列之VHH衍生的親和 力成熟VHH進行序列最佳化而獲得，其中該親和力成熟 VHH係選自具有SEQ ID NO: 21-27及表16中所示之胺基 酸序列的VHHs。 150860.doc 201124533 1 〇·如請求項9之雙特異性結合分子，其中該親和力成熟 VHH具有SEQ ID NO: 22中所示之胺基酸序列，且其中 該序列最佳化VHH具有選自SEQ ID NO: 34及3 5及表23 中所示序列的胺基酸序列。 11.如請求項7之雙特異性結合分子，其中該親本VHH具有 SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列。 1 2.如請求項11之雙特異性結合分子，其中該D114結合之 ^ VHH已由具有SEQ ID NO: 12中所示序列之VHH衍生的 親和力成熟VHH進行序列最佳化而獲得，其中該親和力 成熟VHH係選自具有SEQ ID NO: 28-33及表17中所示之 胺基酸序列的VHHs。 13.如請求項12之雙特異性結合分子，其中該親和力成熟 VHH具有SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列，且其中 該序列最佳化VHH具有選自SEQ ID NO: 40及41中所示 序列的胺基酸序列。 φ 1 4.如請求項6之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合之 VHH係源自具有序列選自SEQ ID NO: 42-44及表32中所 示序列之VHH。 15. 如請求項14之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合之 VHH已由具有SEQ ID NO: 43中所示胺基酸序列之VHH 進行序列最佳化而獲得。 16. 如請求項1 5之雙特異性結合分子，其中該序列最佳化 VHH具有胺基酸序列選自SEQ ID NO: 63及64及表59中 所示之序列。 150860.doc 201124533 17. 如請求項3之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分 為雙互補位（biparatopic) VHH，其中形成該雙互補位 VHH之構建區段（blocks)之VHHs結合非重疊抗原決定 基。 18. 如請求項17之雙特異性結合分子，其中至少一個VHH能 夠以仝60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類 VEGFR-2之間的相互作用，且其中至少一個VHH能夠以 £60%之抑制率阻斷該相互作用。 19. 如請求項1 8之雙特異性結合分子，其中具有抑制率£60% 之該VHH為具有SEQ ID NO: 45中所示序列之VHH的序 列最佳化變異體。 20. 如請求項19之雙特異性結合分子，其中該VHH具有SEQ ID NO: 65及66及表中所示之序列或SEQ ID NO: 67中所 示之序列（表63)。 21. 如請求項5之雙特異性結合分子，其包含 a) 具有序列選自SEQ ID NO: 35或41中之序列的VHH作 為該D114結合組分，及 b) 以下作為該VEGF結合組分 i) 具有SEQ ID NO: 64中所示序列之VHH或 ii) 包含具有SEQ ID NO: 64中所示序列之VHH及具有 SEQ ID NO: 67中所示序列之VHH的雙互補位 VHH。 22. 如請求項1至3及17至20中任一項之雙特異性結合分子， 其包含一或多個連接子分子及/或半衰期延長部分。 150860.doc 201124533 23. 如請求項22之雙特異性結合分子，其中該半衰期延長部 分共價連接至或融合至免疫球蛋白單一可變域，且係選 自Fc部分、白蛋白、白蛋白結合免疫球蛋白單一可變 域、或聚氧烧（polyoxyalkylene)分子。 24. 如請求項21之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 81 中所示之胺基酸序列。 25. 如請求項22之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 81 中所示之胺基酸序列。 26. 如請求項21之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 82 中所示之胺基酸序列。 27. 如請求項22之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 82 中所示之胺基酸序列。 28. 如請求項21之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 83 中所示之胺基酸序列。 29. 如請求項22之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 83 中所示之胺基酸序列。 3 0.如請求項21之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 84 中所示之胺基酸序列。 31. 如請求項21之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 85 中所示之胺基酸序列。 32. 如請求項22之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 85 中所示之胺基酸序列。 3 3.如請求項21之雙特異性結合分子，其具有SEQ ID NO: 86 中所示之胺基酸序列。 150860.doc 201124533 34.如請求項22之雙特異性結合分子，其具有SEq ID Nc> % 中所示之胺基酸序列。 3 5 · —種核酸分子’其編碼如請求項1至3 4中任一項 α <雙特 異性結合分子，或一種含有該核酸分子的載體。 36. —種宿主細胞，其含有如請求項35之核酸分子。 37· -種醫藥組合物’其含有至少一種如請求们至 一項之VEGF結合分子作為活性成分。 38. 如請求項37之醫藥組合 物其用於治療與VEGF介導血 管生成作用相關的疾病。 39. 如請求項37之醫藥組合 '、用於治療癌症及癌性疾 病0 40. 如請求項37之醫藥組合物 丹用於治療眼病。 150860.doc
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