MX2012003797A - Moleculas de union a dll-4. - Google Patents

Moleculas de union a dll-4.

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Eric Borges
Andreas Gschwind
Joachim Boucneau
Evelyn De Tavernier
Joost Kolkman
Diane Van Hoorick
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Abstract

Moléculas de unión a Dll4, preferiblemente dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a DII4 tal como VHH y VH, composiciones farmacéuticas que contienen a las mismas y su uso en el tratamiento de enfermedades que están asociadas con efectos mediados por DIl4 en angiogénesis. Moléculas de unión a DIl4 bioespecíficas que también se unen a VEGF-A. Ácidos nucleicos que codifican moléculas de unión a DlI4, células hospedadoras y métodos para preparar a los mismos.

Description

MOLÉCULAS DE UNIÓN A DLL-4 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de la terapia humana, en particular terapia de cáncer y agentes y composiciones útiles en dicha terapia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Como se resumen en el documento US 2008/0014196, la angiogénesis está implicada en la patogénesis de varios trastornos, incluyendo tumores sólidos y metástasis.
En el caso de crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia y para proporcionar alimento para el crecimiento y metástasis del tumor. Folkman et al., Nature 339 -58 (1989), que permite a las células tumorales adquirir una ventaja en el crecimiento en comparación con las células normales. Por lo tanto, las terapias anti-angiogénicas se han convertido en una importante opción de tratamiento para varios tipos de tumores. Estas terapias se han centrado en el bloqueo de la ruta VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May; 3(5): 391-400.
La ruta de señalización Notch es importante para la comunicación célula-célula, que implica mecanismos de regulación génica que controlan múltiples procesos de diferenciación celular durante el desarrollo embrionario y en organismos adultos. La señalización Notch se desregula en muchos cánceres, por ejemplo, en leucemia linfoblástica agua de células T y en tumores sólidos (Sharma et al. 2007, Cell Cycle 6 (8): 927-30; Shih et al., Cáncer Res. 2007 Mar 1 ; 67(5): 1879-82).
DII4 (o tipo Delta 4 o ligando tipo delta 4) es un miembro de la familia Delta de los ligandos Notch. El dominio extracelular de DI 14 está compuesto de un dominio N-terminal, un dominio Delta/Serrado/Lag-2 (DSL) y un tándem de ocho repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF). Generalmente se reconoce que los dominios EGF comprenden los restos de aminoácidos 218-251 (EGF-1 ; dominio 1 ), 252-282 (EGF-2; dominio 2), 284-322 (EGF-3; dominio 3), 324-360 (EGF-4; dominio 4) y 362-400 (EGF-5; dominio 5), con el dominio DSL en aproximadamente los restos de aminoácidos 173-217 y el dominio N-terminal en aproximadamente los restos de aminoácidos 27-172 de hDII4 (documento WO 2008/076379).
Se ha notificado que DI 14 muestra una expresión altamente selectiva en el endotelio vascular, en particular en el endotelio arterial (Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14: 1313-1318). Estudios recientes en ratones han mostrado que DII4 se induce por VEGF y es un regulador de retroalimentación negativa que impide el crecimiento y ramificación vasculares. Consecuentemente con este papel, la deleción o inhibición de DII4 da como resultado una angiogénesis excesiva (Scehnet et al., Blood. 2007 Jun 1 ; 109(1 1): 4753-60). Esta angiogénesis no impedida paradójicamente disminuye el crecimiento tumoral debido a la formación de vasculatura no productiva, incluso en tumores resistentes a terapias anti-VEGF (Thurston et al., Nat Rev Cáncer. 2007 May; 7(5): 327-31 ; documento WO 2007/070671 ; Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21 ; 444(7122)). Además, la inhibición combinada de VEGF y DII4 demuestra proporcionar una actividad antitumoral superior en comparación con anti-VEGF por sí solo en modelos de xenotrasplantes de tipos tumorales múltiples (Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21 ; 444(7122): 1032-7; Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21 ; 444(7122): 1083-7).
Debido a estos resultados, DII4 se está considerando como una diana prometedora para terapia de cáncer y se han descritos varios compuestos biológicos que se dirigen a DII4 que están en desarrollo (pre-)clínico: REGN-421 (= SAR153192; Regeneran, Sanofi-Aventis; documento WO2008076379) y OPM-21 M18 (OncoMed) (Hoey et al., Cell Stem Cell. 2009 Aug 7; 5(2): 168-77), ambos anticuerpos DII4 completamente humanos; YW152F (Genentech), un anticuerpo de DII4 humanizado (Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21 ; 444(7122): 1083-7); DII4 Fe (Regeneran, Sanofi-Aventis), una proteína de fusión recombinante compuesta de la región extracelular de DII4 y la región Fe de lgG1 humana (Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21 ; 444(7122)).
Sin embargo, los anticuerpos monoclonales (AcM) y proteínas de fusión de vanguardia tienen diversos inconvenientes a la vista de su aplicación terapéutica: Para prevenir su degradación deben almacenarse a temperaturas casi de congelación. También, puesto que se digieren rápidamente en el intestino, no son adecuadas para su administración oral. Otra restricción principal de los AcM para terapia de cáncer es su pobre transporte, que da como resultado bajas concentraciones y una falta de dirección a todas las células en un tumor.
A la vista de lo anterior, ha sido un objeto de la invención el proporcionar moléculas de unión mejorada a DII4 para terapia humana.
Dichas moléculas de unión a DII4 o antagonistas de DII4, son útiles como agentes farmacológicamente activos en composiciones en la prevención, tratamiento, mitigación y/o diagnóstico de enfermedades o afecciones asociadas con efectos mediados por DII4 en angiogénesis. Son ejemplos de dichas enfermedades cáncer y enfermedades oculares incluyendo Degeneración Macular Relacionada con la Edad (AMD) y Retinopatía Diabética (DR). Ha sido un objeto adicional de la invención proporcionar métodos para la prevención, tratamiento, mitigación y/o diagnóstico de dichas enfermedades, trastornos o afecciones, que implican el uso y/o administración de dichos agentes y composiciones.
En particular, ha sido un objeto de la invención proporcionar dichos agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o métodos que proporcionan ciertas ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o métodos usados actualmente y/o conocidos en la técnica. Estas ventajas incluyen propiedades terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas y/u otras propiedades ventajosas, por ejemplo, para propósitos de fabricación, especialmente en comparación con anticuerpos anti-DII4 convencionales y los descritos anteriormente o fragmentos de los mismos.
Más en particular, ha sido objeto de la invención proporcionar nuevas moléculas de unión a DII4 y/o polipéptidos que las contienen y, específicamente, moléculas de unión a DII4 que se unen a DII4 de mamíferos y, especialmente, de seres humanos, siendo dichas moléculas o polipéptidos adecuados para los propósitos terapéuticos y de diagnóstico como se ha descrito en la presente memoria. Ha sido un objeto adicional de la invención proporcionar dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen específicamente a DII4.
LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto se proporcionan moléculas de unión a DII4, preferiblemente dominios de variable sencilla de inmunoglobulina de unión a DII4 como VHH y VH.
En otro aspecto, la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican moléculas de unión a DII4 así como células hospedadoras que contienen a los mismos.
La invención se refiere adicionalmente a un producto o composición que contiene o comprende al menos una molécula de unión a DII4 de la invención y opcionalmente uno o más componentes adicionales de dichas composiciones.
La invención se refiere adicionalmente a métodos para preparar o generar las moléculas de unión a DII4, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en la presente memoria.
La invención se refiere adicionalmente a aplicaciones y usos de las moléculas de unión a DII4, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritos en la presente memoria, así como a métodos para la prevención y/o tratamientos de enfermedades y trastornos asociados con efectos mediados por DII4 en la angiogénesis. Éstos y otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la descripción adicional a continuación en la presente memoria.
DEFINICIONES A no ser que se indique o defina de otra manera, todos los términos y expresiones usados tienen su significado habitual en la técnica, que resultarán evidentes para el experto. Se hace referencia por ejemplo a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Ed.), Voís. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nueva York, (1990) y Roitt et al., "Immunology" (2a Ed.), Gower Medical Publishing, Londres, Nueva York (1989), así como a los antecedentes generales en la técnica citados en la presente memoria. Además, a no ser que se indique de otro modo, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocida de por sí, como resultará evidente para el experto. Se hace referencia por ejemplo de nuevo a los manuales convencionales, a los antecedentes generales de la técnica nombrados anteriormente y a las referencias adicionales citadas en ellos.
A no ser que se indique de otra manera, el término "inmunogiobulina" - tanto si se usa en la presente memoria para referirse a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo convencional de 4 cadenas - se usa como un término general para incluir tanto el anticuerpo de tamaño completo, las cadenas individuales del mismo, así como todas las partes, dominios o fragmentos del mismo.
A no ser que se indique de otra manera, la expresión "molécula de unión a DII4" incluye anticuerpos anti-DII4, fragmentos de anticuerpo anti-DII4, "moléculas de tipo anticuerpo anti-DII4" y conjugados con cualquiera de estos. Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales y monoclonales quimerizados. El término "anticuerpo" abarca inmunoglobulinas completas, como anticuerpos monoclonales producidos por expresión recombinante en células hospedadoras, así como fragmentos de anticuerpo de unión a DII4 o "moléculas de tipo anticuerpo", incluyendo anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos lineales, denominados "SMIP" ("Compuestos inmunofarmacéuticos modulares pequeños"), como se describen por ejemplo en el documento WO 02/056910. Las moléculas tipo anticuerpo anti-DII4 incluyen dominios variables sencillos de inmunogiobulina, según se define en la presente memoria. Otros ejemplos de moléculas tipo anticuerpo son anticuerpos de la superfamilia de la ¡nmunoglobulina (IgSF) o moléculas injertadas en CDR.
El término "secuencia" como se usa en la presente memoria (por ejemplo en expresiones como "secuencia de ¡nmunoglobulina", "secuencia de dominio variable (sencillo)", "secuencia VHH" o "secuencia proteínica"), debería entenderse generalmente que incluye tanto la secuencia de aminoácidos pertinente como las secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que codifican a la misma, a no ser que el contexto requiera una interpretación más limitada.
"Identidad de secuencia" entre dos secuencias de molécula de unión a DII4 indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. Puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento WO 08/020079. ("Similaridad de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o representan sustituciones de aminoácidos conservativas).
El término "dominio" (de una proteína o polipéptido) como se usa en la presente memoria se refiere a una estructura de proteína plegada que tiene la capacidad de mantener su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales discretas de las proteínas y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio.
La expresión "dominio de ¡nmunoglobulina" como se usa en la presente memoria se refiere a una región globular de una cadena de anticuerpo (tal como por ejemplo una cadena de un anticuerpo convencional de 4 cadenas o de un anticuerpo de cadena pesada) o a un polipéptido que consiste esencialmente en una región globular de ese tipo. Los dominios de inmunoglobulina se caracterizan por que conservan el pliegue de inmunoglobulina característico de moléculas de anticuerpos, que consiste en un intercalado de 2 capas de aproximadamente 7 cadenas beta antiparalelas dispuestas en dos láminas beta, estabilizadas opcionalmente por un enlace disulfuro conservado.
La expresión "dominio variable de inmunoglobulina" como se usa en la presente memoria se refiere a un dominio de inmunoglobulina que esencialmente consiste en cuatro "regiones flanqueantes" que se mencionan en la técnica y en la presente memoria más adelante como "región flanqueante 1 " o "FR1 "; como "región flanqueante 2" o "FR2"; como "región flanqueante 3" o "FR3"; y como "región flanqueante 4" o "FR4", respectivamente; estando interrumpidas dichas regiones flanqueantes por tres regiones "determinantes de complementariedad" o "CDR", que se mencionan en la técnica y en la presente memoria a continuación como "Región Determinante de Complementariedad 1" o "CDR1"; como "Región Determinante de Complementariedad 2" o "CDR2" y como "Región Determinante de Complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Así pues, la estructura general o secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede indicarse como sigue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 -CDR3 - FR4. Es el dominio o dominios variables de inmunoglobulina lo que confieren especificidad a un anticuerpo para el antígeno al portar el sitio de unión a antígeno.
La expresión "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" como se usa en la presente memoria se refiere a un dominio variable de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo del antígeno sin emparejarse con un dominio variable de inmunoglobulina adicional. Son ejemplos de dominios variables sencillos de inmunoglobulina en el sentido de la presente invención los dominios variables sencillos de inmunoglobulina VH y VL y (dominios VH y dominios VL) y "dominios VHH" (o simplemente "VHH") de camélidos, como se define en la presente memoria posteriormente.
A la vista de la definición anterior, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo convencional de 4 cadenas (tal como una molécula IgG, IgM, IgA, IgD o IgE; conocida en la técnica) o de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv tal como un Fv unido a disulfuro o un fragmento scFv o un di acuerpo (todos conocidos en la técnica) derivados de dicho anticuerpo convencional de 4 cadenas, normalmente no se consideraría como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, puesto que la unión al epítopo respectivo de un antígeno no se produciría normalmente por un dominio de inmunoglobulina (sencillo) sino por un par de dominios de inmunoglobulina (en asociación) tales como dominios variables de cadena ligera y pesada, es decir por un par VH-VL de dominios de inmunoglobulina, que se unen conjuntamente a un epítopo del antígeno respectivo.
Los "dominios VHH', también conocidos como VHH, dominios VHH, fragmentos de anticuerpo VHH y anticuerpos VHH, se han descrito originalmente como el dominio (variable) de inmunoglobulina de unión a antígeno de "anticuerpos de cadena pesada" (es decir, "anticuerpos desprovistos de cadenas ligeras"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). La expresión "dominio VHH" se ha seleccionado para distinguir estos dominios variables de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se denominan en la presente memoria como "dominios VH") y de dominios variables de cadena ligera que están presentes en anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se denominan en la presente memoria como "dominios VL"). A diferencia de los dominios VH o VL, que normalmente no se unirán a un epítopo como un dominio de unión a antígeno sencillo, los dominios de VHH pueden unirse específicamente a un epítopo sin un dominio de unión a antígeno adicional. Los dominios VHH son unidades de reconocimiento de antígenos pequeñas, robustas y eficaces formadas por un dominio de inmunoglobulina sencillo.
En el contexto de la presente invención, las expresiones de dominio VHH, VHH, dominio VHH, fragmento de anticuerpo VHH, anticuerpo VHH, así como "Nanobody®" y "dominio Nanobody®" (siendo "Nanobody" una marca comercial de la compañía Ablynx N.V.; Ghent; Bélgica) se usan de forma intercambiable y son representativos de dominios variables sencillos de inmunoglobulina (que tienen la estructura general: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y que se unen específicamente a un epítopo sin requerir la presencia de un segundo dominio variable de inmunoglobulina) y que se distinguen de los VH mediante los denominados "restos de contraste" como se define en, por ejemplo, el documento WO 2009/109635, Fig.1.
Los "dominios VH" y "dominios VL" (o simplemente "VH" o "VL"), respectivamente, que se derivan de anticuerpos de 4 cadenas, en particular de anticuerpos humanos son "anticuerpos de dominio sencillo", también conocidos como "anticuerpos de dominio", "Dab", "Anticuerpos de Dominio" y "dAb" (usándose las expresiones "Anticuerpos de Dominio" y "dAb" como marcas comerciales del grupo de compañías GlaxoSmithKIine) se han descrito por ejemplo Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escheríchia cotí'; Nature 341 : 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21 (1 1): 484-490 (2003); y el documento WO 2003/002609.
Los anticuerpos de dominio sencillo corresponden a los dominios variables de las cadenas pesadas o ligeras de mamíferos no camélidos, en particular anticuerpos humanos. Para unir un epítopo como un dominio de unión a antigeno sencillo, es decir, sin emparejarse con un dominio VL o VH, respectivamente, se requiere una selección específica de propiedades de unión a dicho antígeno, por ejemplo mediante el uso de bibliotecas de secuencias de dominios VH o VL sencillos humanos.
Los anticuerpos de dominio sencillo tienen, como los VHH, un peso molecular de aproximadamente en torno a 13 a en torno a 16 kDa y, si derivan de secuencias completamente humanas, no requieren humanización para, por ejemplo, uso terapéutico en seres humanos. Como en el caso de los dominios VHH, también se expresan bien en sistemas de expresión procarióticos, proporcionando una reducción significativa en costes globales de fabricación.
Los restos de aminoácidos de un dominio pesado variable sencillo de inmunoglobulina se numeran de acuerdo con la numeración general de dominios VH dada por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", Servicios de Salud Pública de Estados Unidos, NIH Bethesda, MD, Publicación N° 91), como se aplica a dominios VHH de Camélidos, como se muestra por ejemplo en la Figura 2 de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol.
Methods 231 , 25-38 (1999). De acuerdo con esta numeración, como ejemplo - FR1 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 1-30, - CDR1 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 31-35, - FR2 comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, - CDR2 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 50-65, - FR3 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 66-94, - CDR3 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 95-102, y - FR4 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones103-113.
Como se describe con detalle en por ejemplo el documento WO 2006/040153 y el documento WO 2006/122786, los dominios VHH pueden clasificarse específicamente en tres grupos, dependiendo de ciertas combinaciones de aminoácidos dentro de las regiones flanqueantes, es decir, (a) el "grupo GLEW", que incluye también las secuencias "tipo GLEW'; (b) el "grupo KERE", que incluye también la secuencia KQRE; y (c) el "grupo 103 P, R, S" y que puede caracterizarse adicionalmente por "restos de Contraste" específicos.
Una "molécula de unión a DII4 madurada por afinidad" tiene una o más alteraciones en uno o más CDR que dan como resultado una afinidad mejorada para DII4, en comparación con la molécula de unión a DII4 parental respectiva. Las moléculas de unión a DII4 maduradas por afinidad de la invención pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, o Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91 : 3809 3813; Shier et al, 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al, 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al, 1995, J. Immunol. 154(7): 3310-9; y Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson y RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.
Para la presente invención, "secuencias de aminoácidos de SEC ID N°: x" incluye, si no se indica de otro modo, con respecto a la secuencia relevante, por ejemplo una secuencia de dominio variable sencillo de inmunoglobulina completa o una secuencia CDR, a) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100% a la secuencia mostrada en la SEC ID N°: x respectiva, b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80% de identidad de aminoácidos con la secuencia mostrada en la SEC ID N°: x respectiva, c) secuencias de aminoácidos que tienen diferencias de 3, 2 ó 1 aminoácidos con la secuencia mostrada en la SEC ID N°: x respectiva.
Las expresiones "epítopo" y "determinante antigénico", que pueden usarse de forma intercambiable, se refieren a la parte de una macromolécula, tal como un polipéptido, que se reconoce mediante moléculas de unión a antígeno, tal como anticuerpos convencionales o dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención y más particularmente mediante el sitio de unión a antígenos de dichas moléculas. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para una inmunoglobulina y transmiten así especificidad a una inmunoglobulina.
La expresión "molécula de unión a DII4 biparatópica" o "dominio variable sencillo de inmunoglobulina biparatópica" como se usa en la presente memoria se referirá a una molécula de unión a DII4 que comprende un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina y un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina como se definen en la presente memoria, en los que las moléculas son capaces de unirse a dos epítopos diferentes del antígeno de DII4. Los polipéptidos biparatópicos de acuerdo con la invención se componen de dominios variables sencillos de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades. La parte de una molécula de unión a antígeno (tal como un anticuerpo o un polipéptido de la invención) que reconoce al epítopo se llama un paratopo.
Un polipéptido (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención o un polipéptido que contiene al mismo o generalmente una molécula de unión a antígeno o un fragmento de la misma) que puede "unirse a" o "unirse específicamente a" que "tiene afinidad por" y/o que "tiene especificidad por" un cierto epítopo, antígeno o proteína (o por al menos una parte, fragmento o epítopo de los mismos) se dice que es "contra" o está "dirigido contra" dicho epítopo, antígeno o proteína o es una molécula "de unión" con respecto a dicho epítopo, antígeno o proteína.
Generalmente, el término "especificidad' se refiere al número de tipos diferentes de antígenos o epítopos a los que puede unirse una molécula de unión a antígeno particular o una molécula proteínica de unión a antígeno (tal como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención). La especificidad de una molécula de unión a antígeno puede determinarse basándose en su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (KD), es una medida de la fuerza de unión entre un epítopo y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno. Cuanto menor sea el valor de la KD, mayor será la fuerza de unión entre un epítopo y la molécula de unión a antígeno (como alternativa, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD). Como se pondrá de manifiesto para el experto (por ejemplo basándose en la descripción adicional de la presente memoria), la afinidad puede determinarse de una manera conocida de por sí, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es una medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o un polipéptido que lo contenga) y el antígeno pertinente. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígenos como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno.
Los restos de aminoácidos se indicarán de acuerdo con el código de aminoácidos convencional de tres letras o una letra, como se conoce y se acuerda generalmente en la técnica. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, la expresión "diferencia de aminoácidos" se refiere a inserciones, deleciones o sustituciones del número indicado de restos de aminoácidos en una posición de la secuencia de referencia, en comparación con una segunda secuencia. En el caso de sustitución o sustituciones, dicha sustitución o dichas sustituciones serán preferiblemente sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas, que se refiere a que un resto de aminoácidos se reemplaza por otro resto de aminoácidos de estructura química similar y que tiene una influencia pequeña o esencialmente nula en la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Dichas sustituciones de aminoácidos conservativas se conocen bien en la técnica, por ejemplo a partir del documento WO 98/49185, siendo las sustituciones de aminoácidos conservativas preferiblemente sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (i) - (v) se sustituye por otro resto de aminoácido dentro del mismo grupo: (i) restos alifáticos, no polares o ligeramente polares pequeños: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (ii) restos polares cargados negativamente y sus amidas (no cargadas): Asp, Asn, Glu y GIn; (iii) restos polares cargados positivamente: His, Arg y Lys; (iv) restos alifáticos no polares grandes: Met, Leu, lie, Val y Cys; y (v) restos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Las sustituciones de aminoácidos conservativas particularmente preferidas son como sigue: Ala a Gly o a Ser, Arg a Lys, Asn a GIn o a His, Asp a Glu, Cys a Ser, GIn a Asn, Glu a Asp, Gly a Ala o a Pro, His a Asn o a Gin, Me a Leu o a Val, Leu a lie o a Val, Lys a Arg, a GIn o a Glu, Met a Leu, a Tyr o a Me, Phe a Met, a Leu o a Tyr, Ser a Thr, Thr a Ser, Trp a Tyr, Tyr a Trp o a Phe, Val, a lie o a Leu.
Un ácido nucleico o molécula polipeptídica se considera que está "(en forma) esencialmente aislada" - por ejemplo, cuando se compara con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o el medio de cultivo del que se ha obtenido - cuando se ha separado de al menos un compuesto distinto con el que habitualmente está asociada en dicha fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente menor. En particular, un ácido nucleico o molécula polipeptídica se considera "esencialmente aislada" cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces y hasta 1000 veces o más. Un ácido nucleico o molécula polipeptídica que está "en forma esencialmente aislada", es preferiblemente esencialmente homogénea, como se determina usando una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como una electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento/proliferación celular no regulada. Los ejemplos de cáncer a tratar con una molécula de unión a DII4 de la invención, incluyen pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más ejemplos particulares de dichos cánceres, se sugieren para su tratamiento con antagonistas de DII4 en el documento US 2008/0014196, incluyen cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, cáncer gástrico, melanoma y diversos tipos de cánceres de cabeza y cuello. La desregulación de angiogénesis puede conducir a muchos trastornos que pueden tratarse mediante composiciones y métodos de la invención. Estos trastornos incluyen condiciones tanto neoplásicas como no neoplásicas. Las neoplasias incluyen pero no se limitan a las descritas anteriormente. Los trastornos no neoplásicos incluyen pero no se limitan a, como se sugiere para el tratamiento con antagonistas de DII4 en el documento US 2008/0014196, hipertrofia no deseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (RA), psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, ateroesclerosis, placas ateroescleróticas, retinopatías diabéticas y proliferativas de otro tipo incluyendo retinopatía del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización de injerto corneal, rechazo de injerto corneal, neovascularización retinal/coroidal, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, restenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas (incluyendo enfermedad de Grave), trasplantes corneales y de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/ARDS, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, derrames pulmonares malignos, edema cerebral (por ejemplo, asociado con accidente cerebro vascular agudo/lesión/traumatismo craneal cerrado), inflamación sinovial, formación de paño sinovial en RA, miositis osificante, formación de hueso hipertrópica, osteoartritis (OA), ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquístico, endometriosis, 3a separación de enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad intestinal), miomas uterinos, parto prematuro, inflamación crónica tal como BID (enfermedad de Crohn y colitis ulcerante), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome nefrótico, crecimiento de masa tisular no deseada o aberrante (no cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición de crecimiento de cabello, síndrome de Asier-Weber, fibroplasias retrolentales de granuloma piogénico, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, derrame pericárdico (tal como el asociado con pericarditis) y derrame pleural.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de unión a DII4 que comprende al menos un dominio variable con cuatro regiones flanqueantes y tres regiones determinantes de complementariedad CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, en las que dicha CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en a) SEC ID N°: 1 a 166 y 458, b) SEC ID N°: 333 a 353, o c) SEC ID N°: 375 a 395.
Una secuencia de aminoácidos a), seleccionada de un primer grupo de SEC ID N°: 1 a 166 y 458, está contenida como secuencia parcial en una secuencia de aminoácidos correspondiente seleccionada de un segundo grupo de secuencias mostrado en la Tabla 5 y en SEC ID N°: 167 a 332 y 459.
Una secuencia de aminoácidos b), seleccionada de un primer grupo de SEC ID N°: 333 a 353, está contenida como secuencia parcial en una secuencia correspondiente seleccionada de un segundo grupo de secuencias mostrado en la Tabla 16-A y en SEC ID N°: 354 a 374.
Una secuencia de aminoácidos c), seleccionada de un primer grupo de SEC ID N°: 375 a 395, está contenida como secuencia parcial en una secuencia correspondiente seleccionada de un segundo grupo de secuencias mostrado en la Tabla 16-B y en SEC ID N°: 396 a 416.
En un segundo aspecto, dicha molécula de unión a DII4 está en un dominio variable sencillo de inmunoglobulina aislado o un polipéptido que contiene uno o más de dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina, consistiendo dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina en cuatro regiones flanqueantes y tres regiones determinantes de complementariedad CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, y en las que dicha CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en a) SEC ID N°: 1 a 166 y 458, b) SEC ID N°: 333 a 353, o c) SEC ID N°: 375 a 395.
En un aspecto adicional, dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina contiene a) una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de un primer grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 1 a 166 y 458, b) una CDR1 y una CDR2 con una secuencia de aminoácidos que está contenida, como se indica en la Tabla 5, como secuencia parcial en una secuencia seleccionada de un segundo grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 167 a 332 y 459, en las que una SEC ID N°: x de dicho primer grupo, para SEC ID N°: 1- 166: corresponde a SEC ID N°: y de dicho segundo grupo en tanto que y = x +166.
En un aspecto adicional, dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina contiene a) una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de un primer grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 333 a 353; b) una CDR1 y una CDR2 con una secuencia de aminoácidos que está contenida, como se indica en la Tabla 16-A, como una secuencia parcial en una secuencia seleccionada de un segundo grupo de secuencias mostradas en SEC ID N°: 354 a 374, en las que una SEC ID N°: x de dicho primer grupo corresponde a SEC ID N°: y de dicho segundo grupo en tanto que y = x +21.
En un aspecto adicional, dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina tiene a) una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de dicho primer grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 375 a 395, b) una CDR1 y una CDR2 con una secuencia de aminoácidos que está contenida, como se indica en la Tabla 16-B, como una secuencia parcial en una secuencia seleccionada de un segundo grupo de secuencias mostradas en SEC ID N°: 396 a 416, en las que una SEC ID N°: x de dicho primer grupo corresponde a SEC ID N°: y de dicho segundo grupo en tanto que y = x +21 .
En una realización preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH.
En un aspecto adicional, el VHH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de secuencias de aminoácidos mostradas en la Tabla 5 y en SEC ID N°: 167 a 332 y 459.
Las moléculas de unión a DII4 con propiedades mejoradas a la vista de su aplicación terapéutica, por ejemplo, afinidad mejorada o inmunogenicidad disminuida, pueden obtenerse de moléculas de unión a DII4 individuales de la invención mediante técnicas tales como maduración por afinidad (por ejemplo, comenzando desde secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o de origen natural), injerto en CDR, humanización, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulinas, ensamblaje por PCR usando cebadores solapantes y técnicas similares para la obtención por ingeniería genética de secuencias de inmunoglobulina bien conocidas para el experto en la materia; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores. Se hace referencia, por ejemplo, a manuales convencionales, así como a la descripción adicional y los Ejemplos.
Preferiblemente, una molécula de unión a DII4 de la invención con afinidad aumentada se obtiene mediante maduración por afinidad de otra molécula de unión a DII4, representando la segunda, con respecto a la molécula madurada por afinidad, la molécula de unión a DII4 "parental".
Así pues, en otra realización preferida más, una molécula de unión a DII4 de la invención es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido por maduración por afinidad de un dominio variable sencillo de ¡nmunoglobulina parental definido anteriormente.
En otra realización preferida más, la invención se refiere a una variable sencilla de inmunoglobulina obtenida por maduración por afinidad de un VHH.
Son moléculas de unión a DII4 parentales adecuadas para maduración por afinidad, a modo de ejemplo, las VHH descritas anteriormente con secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 167 a 332 y 459.
En otra realización preferida más, la invención se refiere a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido por maduración por afinidad de un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 197.
En otra realización más, dicho dominio variable sencillo de ¡nmunoglobulina que se deriva de un VHH con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 197 se selecciona de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina con secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 354 a 374.
En una realización preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 358.
En una realización aún más preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se ha obtenido por humanización de un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 358.
En otra realización preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 356.
En una realización aun más preferida, la invención se refiere a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido por humanización de un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 356.
En otra realización preferida más, la invención se refiere a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido por maduración por afinidad de un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 224.
En otra realización más, dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina derivado de un VHH con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 224 se selecciona de dominios variables sencillos de inmunoglobulina con secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 396 a 416.
En otra realización preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 402.
En una realización aún más preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se ha obtenido por humanización del VHH con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 402.
En otra realización preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 416.
En una realización aún más preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se ha obtenido por humanización del dominio variable sencillo de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 416.
En otra realización preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un VHH con una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 407.
En una realización aún más preferida, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se ha obtenido por humanización del dominio variable sencillo de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N°: 413.
Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina, por ejemplo, VH y VHH, de acuerdo con las realizaciones preferidas de la invención, tienen varias características estructurales y propiedades funcionales únicas que les hace altamente ventajosos para su uso en terapia como moléculas de unión a antígeno funcionales. En particular, y sin limitarse a ello, los dominios VHH (que se han "diseñado" en la naturaleza para unirse funcionalmente a un antígeno sin emparejarse con un dominio variable de cadena ligera) pueden funcionar como unidades estructurales de unión a antígeno funcionales relativamente pequeñas sencillas.
Debido a sus propiedades únicas, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina como se definen en la presente memoria, como VHH o VH (o VL) - tanto solos como parte de un polipéptido mayor, por ejemplo una molécula biparatópica - ofrecen varias ventajas significativas: • sólo se requiere un dominio sencillo para unir a un antígeno con alta afinidad y con alta selectividad, de modo que no es necesario tener dos dominios separados presentes, ni asegurarse de que estos dos dominios están presentes en la conformación y configuración espaciales correctas (es decir, a través del uso de enlazadores especialmente diseñados, como con scFv), • los dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden expresarse a partir de una molécula de ácido nucleico sencilla y no requieren ninguna modificación postraduccional (como glicosilación); · los dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden obtenerse por ingeniería genética en formatos multivalentes y multiespecíficos (como se discute adicionalmente en la presenta memoria), • los dominios variables sencillos de inmunoglobulina tienen alta especificidad y afinidad por su diana, baja toxicidad inherente y pueden administrarse mediante rutas alternativas que no sean infusión o inyección, • los dominios variables sencillos de inmunoglobulina son altamente estables ante calor, pH, proteasas y otros agentes o condiciones de desnaturalizantes y, por lo tanto, pueden prepararse, almacenarse o transportarse sin el uso de equipamientos de refrigeración, · los dominios variables sencillos de inmunoglobulina son fáciles y relativamente baratos de preparar, tanto a pequeña escala como a escala de fabricación. Por ejemplo, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina y polipéptidos que contienen a los mismos pueden producirse usando fermentación microbiana (por ejemplo, como se describe adicionalmente posteriormente) y no requieren el uso de sistemas de expresión de mamíferos, como, por ejemplo, con los anticuerpos convencionales, • los dominios variables sencillos de inmunoglobulina son relativamente pequeños (aproximadamente 15 kDa o 10 veces más pequeños que una IgG convencional) comparados con anticuerpos convencionales de 4 cadenas y fragmentos de unión a antígeno de los mismos y por lo tanto muestran una penetración alta (o mayor) en los tejidos (incluyendo pero sin limitarse a tumores sólidos y otros tejidos densos) y pueden administrarse en dosis más altas que dichos anticuerpos convencionales de 4 cadenas y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, • los VHH tienen unas denominadas "propiedades de unión a cavidad" específicas (entre otros debido a su bucle CDR3 extendido, en comparación con dominios VH de anticuerpos de 4 cadenas) y pueden por lo tanto también acceder a dianas y epítopos no accesibles para anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, • los VHH tienen la ventaja particular de que son altamente solubles y muy estables y no tienen tendencia a agregarse (como con los dominios de unión a antígeno derivados de ratón descritos por Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989)).
Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención no están limitados con respecto a una fuente biológica específica de la que se han obtenido o a un método específico de preparación. Por ejemplo, obtener VHH puede incluir las siguientes etapas: (1) aislar el dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada de origen natural; o explorar una biblioteca que comprende anticuerpos de cadena pesada o VHH y aislar los VHH de ella, (2) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica un VHH con la secuencia de origen natural, (3) "humanizar" (como se describe en la presente memoria) un VHH, opcionalmente después de la maduración por afinidad, con una secuencia de origen natural o expresando un ácido nucleico que codifique dicha VHH humanizada, (4) "camelizar" (como se describe posteriormente) un dominio pesado variable sencillo de inmunoglobulina a partir de un anticuerpo de origen natural de una especie animal, en particular una especie de mamífero, tal como de un ser humano o expresando una molécula de ácido nucleico que codifique dicho dominio camelizado, (5) "camelizar" un VH, o expresar una molécula de ácido nucleico que codifica dicho VH camelizado, (6) usar técnicas para preparar sintéticamente o semisintéticamente proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos, (7) preparar una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio VHH usando técnicas para síntesis de ácidos nucleicos, seguidas de expresión del ácido nucleico obtenido de este modo, (8) someter anticuerpos de cadena pesada o VHH a maduración por afinidad, a mutagénesis (por ejemplo mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida) y/o cualquier otra técnica o técnicas para incrementar la afinidad y/o especificidad del VHH; y/o (9) combinaciones o selecciones de las etapas anteriores.
Los métodos y técnicas adecuadas para realizar las etapas anteriormente descritas se conocen en la técnica y resultarán evidentes para el experto.
De acuerdo con una realización específica, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención o presentes en los polipéptidos de la invención son dominios de VHH con una secuencia de aminoácidos que corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH de origen natural, pero que se ha "humanizado" (opcionalmente después de maduración por afinidad), es decir mediante el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia VHH de origen natural mediante uno o más de los restos de aminoácidos que se producen en la posición o posiciones correspondientes en un dominio pesado variable de un anticuerpo convencional de 4 cadenas de un ser humano. Esto puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica, que pueden usarse rutinariamente por el experto.
Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de región flanqueante completamente humanas y, en una realización aún más específica, puede contener secuencias de región flanqueante humanas derivadas de las secuencias de línea germinal Vh3 humana DP-29, DP-47, DP-51 o partes de las mismas o ser altamente homologas a las mismas. Así pues, un protocolo de humanización puede comprender el reemplazo de cualquiera de los restos VHH con los restos flanqueantes correspondientes 1, 2 y 3 (FR1 , FR2 y FR3) de los genes VH de línea germinal tales como DP 47, DP 29 y DP 51 tanto solo como en combinación. Las regiones flanqueantes adecuadas (FR) de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención pueden seleccionarse de los expuestos por ejemplo en el documento WO 2006/004678 y específicamente, incluir las clases denominadas "KERE" y "GLEW". Son particularmente preferidos los dominios variables sencillos de inmunoglobulina que tienen la secuencia de aminoácidos G-L-E-W aproximadamente en las posiciones 44 a 47 y sus homólogos humanizados respectivos.
Una sustitución humanizante preferida pero no limitante para dominios VHH, que pertenece al grupo 103 P,R,S y/o al grupo GLEW (como se define posteriormente) es 108Q a 108L. Los métodos para humanizar dominios variables sencillos de inmunoglobulina se conocen en la técnica.
De acuerdo con otra realización, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un dominio VH, como se define en la presente memoria.
En otra realización más, los representantes de la clase de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a DII4 de la invención o presentes en los polipéptidos de la invención tienen secuencias de aminoácidos que se corresponden con la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de origen natural que se ha "camelizado", es decir, mediante el reemplazo de uno o más restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable de origen natural de un anticuerpo convencional de 4 cadenas mediante uno o más restos de aminoácidos que aparecen en la posición o posiciones correspondientes en un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Esto puede realizarse de un modo conocido de por sí, que resultará evidente para el experto y adicionalmente se hace referencia al documento WO 94/04678. Dicha camelización puede producirse preferentemente en las posiciones de aminoácidos que están presentes en la inferíase VH-VL y en los denominados restos de contraste de Camelidae (véase, por ejemplo, también el documento WO 94/04678). Una descripción detallada de dichas técnicas de "humanización" y "camelización" y secuencias de región flanqueante preferidas coherentes con ellas puede tomarse adicionalmente de por ejemplo, la página 46 y la página 98 del documento WO 2006/040153 y la página 107 del documento WO 2006/122786.
Las moléculas de unión a DII4 de la invención, por ejemplo dominios variables sencillos de inmunoglobulina y/o polipéptidos que los contienen, tienen especificidad por DII4 en tanto que comprenden uno o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen específicamente a uno o más epítopos dentro de la molécula de DII4.
La unión específica de una molécula de unión a DII4 con su antígeno DII4 puede determinarse de cualquier modo conocido de por sí, incluyendo, por ejemplo, los ensayos descritos en la presente memoria, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), ¡nmunoensayos enzimáticos (EIA y ELISA) y ensayos de competición en sándwich y las diferentes variantes de los mismos conocidas de por sí en la técnica.
Con respecto al antígeno DII4, una molécula de unión a DII4 de la invención, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina no está limitado con respecto a la especie. Por lo tanto, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención o polipéptidos que los contienen preferiblemente se unen a DII4 humana, si se pretenden usar para propósitos terapéuticos en seres humanos.
Sin embargo, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen a DII4 de otras especies de mamíferos, o polipéptidos que los contienen, también están dentro del alcance de la invención. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención que se une a la forma de una especie de DII4 puede reaccionar de forma cruzada con DII4 de una o más de otras especies. Por ejemplo, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención que se unen a DII4 humana pueden mostrar reactividad cruzada con DII4 de una o más de otras especies de primates y/o con DII4 de una o más de otras especies de animales que se usan en modelos animales para enfermedades, por ejemplo mono (en particular Cynomolgus o Rhesus), ratón, rata, conejo, cerdo, perro y en particular en modelos animales para enfermedades y trastornos asociados con efectos mediados por DII4 en angiogénesis (tales como las especies y modelos animales mencionados en la presente memoria). Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención que muestran dicha reactividad cruzada son ventajosos en una investigación y/o desarrollo de fármacos, puesto que permiten que los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención se ensayen en modelos de enfermedad reconocidos tales como monos, en particular Cynomolgus o Rhesus, o en ratones y ratas.
Además, las moléculas de unión a DII4 de la invención no se limitan o definen por un dominio específico o un determinante antigénico de DII4 contra la que están dirigidas. Preferiblemente, a la vista de la reactividad cruzada con una o más moléculas de DII4 de especies distintas de ser humano que se pretende que se use o usen como un modelo animal durante el desarrollo de un antagonista de DII4 terapéutico, una molécula de unión a DII4 reconoce un epítopo en una región del DII4 de interés que tiene un alto grado de identidad con DII4 humana. A modo de ejemplo, a la vista del uso de un modelo de ratón, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención reconoce un epítopo que está, totalmente o en parte, localizado dentro del dominio EGF-2, que muestra una alta identidad entre ser humano y ratón.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida, la invención se refiere a una molécula de unión a DII4, en particular un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o un polipéptido que contiene al mismo, en el que dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina se selecciona del grupo que se une a un epítopo que está total o parcialmente contenido dentro del dominio EGF-2 que corresponde a los restos de aminoácidos 252-282 de SEC ID N°: 417.
Si un polipéptido de la invención es una molécula biparatópica como se define en la presente memoria, que contiene más de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención, al menos uno de los componentes del dominio variable sencillo de inmunoglobulina se une al epítopo dentro del dominio EGF-2, como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención se une a DII4 con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM (según se determina por análisis por Resonancia de Plasmón de Superficie, como se describe en el Ejemplo 5.7) Preferiblemente, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de la invención tienen valores de de CI50, como se midieron en un ensayo de ELISA por competición como se describe en el Ejemplo 5.1. En el intervalo de 10"6 a 10"10 moles/litro o menos, más preferiblemente en el intervalo de 10"8 a 10"10 moles/litros o menos e incluso más preferiblemente en el intervalo de 10"9 a 10"10 moles/litro o menos.
De acuerdo con una realización no limitante pero preferida de la invención, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a DII4 de la invención o polipéptidos que los contienen se unen a DII4 con una constante de disociación (KD) de 10"5 a 10'12 moles/litro (M) o menos y preferiblemente 10"7 a 10"12 moles/litro (M) o menos y más preferiblemente de 10"8 a 10"12 moles/litro (M) y/o con una constante de asociación (KA) de al menos 107 M"1, preferiblemente de al menos 108 M"1, más preferiblemente al menos 109 M"1, tal como al menos 1012 M"1; y en particular con una KD menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. Pueden determinarse los valores de KD y KA del dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la invención contra DII4.
En una realización adicional, la invención se refiere a moléculas de unión a DII4 que comprenden dos o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen al antígeno DII4 en diferentes epitopos no solapantes. Más específicamente, dicho polipéptido de la invención esencialmente consiste en o comprende (i) un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une específicamente a un primer epítopo de DII4 y (ii) un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une específicamente a un segundo epítopo de DII4, en los que el primer epítopo de DII4 y el segundo epítopo de DII4 no son epitopos idénticos. En otras palabras, dicho polipéptido de la invención comprende o esencialmente consiste en dos o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se dirigen contra al menos dos epitopos diferentes presentes en DII4, uniéndose dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina entre sí de modo que son capaces de unirse simultáneamente a DII4. En este sentido, el polipéptido de la invención también puede considerarse como una construcción de inmunoglobulina "bivalente" o "multivalente" y especialmente como una "construcción de dominio variable sencillo de inmunoglobulina multivalente", en tanto que el polipéptido contiene al menos dos sitios de unión para DII4.
Dicha molécula de unión a DII4 de la invención incluye (al menos) dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-DII4, dirigiéndose (los) dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina contra diferentes epitopos dentro de la molécula de DII4. Por lo tanto, estos dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina tendrán una especificidad de antígeno diferente y por lo tanto diferentes secuencias CDR. Por esta razón, dichos polipéptidos de la invención se denominarán también en la presente memoria "polipéptidos biparatópicos" o "construcciones de anticuerpos de dominio sencillo biparatópicos" (si los dominios variables sencillos de inmunoglobulina consisten o esencialmente consisten en anticuerpos de dominio sencillo) o "construcciones de VHH biparatópicas" (si los dominios variables sencillos de inmunoglobulina consisten o esencialmente consisten en VHH), respectivamente, puesto que los dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina incluirán dos paratopos diferentes.
De acuerdo con una realización específica de la invención, en el caso de que el polipéptido de la invención incluya más de dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-DII4, es decir, tres, cuatro o incluso más dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-DII4, al menos dos de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-DII4 se dirigen contra diferentes epítopos dentro de la molécula DII4, en los que cualquier dominio variable sencillo de inmunoglobulina adicional puede unirse a cualquiera de estos dos epítopos diferentes y/o un epítopo adicional presente en la molécula de DII4.
De acuerdo con la invención, los dos o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden ser, independientemente de cada uno, VH o VHH y/o cualquier otro tipo de dominios variables sencillos de inmunoglobulina, tal como dominios VL, como se definen en la presente memoria, con tal de que estos dominios variables sencillos de inmunoglobulina se unan al antígeno, es decir, DII4.
De acuerdo con una realización preferida, el primer y el segundo dominios variables sencillos de inmunoglobulina consisten esencialmente en secuencias VH o secuencias VHH, como se define en la presente memoria. De acuerdo con una realización particularmente preferida, el primer y el segundo dominios variables sencillos de inmunoglobulina consisten esencialmente en secuencias VHH.
De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, los al menos dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina presentes en una molécula de unión a DII4 de la invención pueden estar conectados entre sí directamente (es decir, sin el uso de un enlazador) o a través de un enlazador. El enlazador es preferiblemente un enlazador peptídico y se seleccionará de modo que permita la unión de al menos dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina diferentes a cada uno de sus al menos dos epítopos diferentes de DII4, dentro de la misma molécula de DII4 o dentro dos moléculas diferentes.
La selección de enlazadores dependerá, entre otros, de los epítopos y, específicamente, de la distancia entre los epítopos en DII4 a los que se unen los dominios variables sencillos de inmunoglobulina y resultará evidente para el experto basándose en la descripción de la presente memoria, opcionalmente después de cierto grado limitado de experimentación rutinaria. Como punto de arranque para dicha experimentación, generalmente puede asumirse que la distancia entre el extremo N y C terminal de los dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina presentes en dicho polipéptido de la invención preferiblemente será de al menos 50 Angstroms y más preferiblemente en la región de 55-200 Angstroms y en particular en la región de 65-150 Angstroms, siendo el límite superior menos crítico y eligiéndose por razones de conveniencia, por ejemplo con vistas a la expresión/producción de la proteína.
Además, cuando los dos o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen a DII4 son VH o VHH, éstos pueden unirse entre sí mediante un tercer VH o VHH, respectivamente (en dichas moléculas de unión a DII4, los dos o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden unirse directamente a dicho tercer dominio variable sencillo de inmunoglobulina o mediante enlazadores adecuados). Dicho tercer VH o VHH puede por ejemplo ser un VH o VHH que posibilite una semivida mayor. Por ejemplo, el VH o VHH posterior puede ser un VH o VHH que es capaz de unirse a una proteína de suero (humana) tal como albúmina de suero (humana) o transferrina (humana).
Como alternativa, los dos o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen a DII4 pueden estar unidos en serie (tanto directamente como medíante un enlazador adecuado) y el tercer VH o VHH (que puede posibilitar una semivida aumentada) puede conectarse directamente o mediante un enlazador a una de estas dos o más secuencias de inmunoglobulina anteriormente mencionadas.
Los enlazadores adecuados pueden - por ejemplo y sin limitación -comprender una secuencia de aminoácidos, que preferiblemente tiene una longitud de nueve o más aminoácidos, más preferiblemente más de 17 aminoácidos, por ejemplo aproximadamente 20-40 restos de aminoácidos. Sin embargo, el límite superior no es crítico sino que se selecciona por razones de conveniencia con respecto a por ejemplo la producción biofarmacéutica de dichos polipéptidos.
La secuencia del enlazador puede ser una secuencia de origen natural o una secuencia de origen no natural. Si se usa para propósitos terapéuticos, el enlazador es preferiblemente no inmunogénico en el sujeto al que se administra el polipéptido de la invención.
Un grupo útil de secuencias enlazadores son enlazadores derivados de la región bisagra de anticuerpos de cadena pesada como se describe en el documento WO 96/34103 y WO 94/04678.
Otros ejemplos son secuencias del enlazador poli-alanina tal como Ala-Ala-Ala.
Si el polipéptido de la invención se modifica por la unión de un polímero, por ejemplo de un resto de polietilenglicol PEG (polietilenglicol), la secuencia enlazadora incluye preferiblemente un resto de aminoácido, tal como una cisteína o una lisina, permitiendo dicha modificación, por ejemplo PEGilación, en la región del enlazador.
Además, el enlazador también puede ser un resto de poli (etilenglicol), como se muestra en por ejemplo el documento WO 04/081026.
En otra realización, los al menos dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina de unión a DII4 del polipéptido de la invención se enlazan entre sí mediante otro resto (opcionalmente mediante uno o dos enlazadores), tal como otro polipéptido que, en una realización preferida pero no limitante, puede ser un dominio variable sencillo de inmunoglobulina adicional como se ha descrito anteriormente. Dicho resto puede estar esencialmente inactivo o puede tener un efecto biológico tal como mejorar las propiedades deseadas del polipéptido o puede conferir una o más propiedades deseadas adicionales al polipéptido. Por ejemplo, y sin limitación, el resto puede mejorar la semivida de la proteína o polipéptido y/o puede reducir su inmunogenicidad o mejorar cualquier otra propiedad deseada.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, una molécula de unión a DII4 de la invención incluye, a la vista de su uso como un agente terapéutico, un resto que prolongue la semivida del polipéptido de la invención en suero u otros fluidos corporales de un paciente. El término "semivida" se define como el tiempo que tarda la concentración de suero del polipéptido (modificado) en reducirse en un 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del polipéptido y/o aclaramiento y/o secuestro por mecanismos naturales.
Más específicamente, dicho resto de prolongación de semivida puede estar enlazado covalentemente o fusionado con dicho polipéptido y puede ser, sin limitación, una porción de Fe, un resto de albúmina, un fragmento de un resto de albúmina, un resto de unión a albúmina, tal como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-albúmina, un resto de unión a transferrina, tal como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-transferrina, una molécula de polioxialquileno, tal como una molécula de polietilenglicol, un péptido de unión a albúmina o un derivado de almidón de hidroxietilo (HES).
En otra realización preferida, el polipéptido de la invención comprende un resto que se une a un antígeno hallado en sangre, tal como albúmina de suero, inmunoglobulina de suero, proteína de unión a tiroxina, fibrinógeno o transferrina, confiriendo de este modo una semivida aumentada in vivo al polipéptido resultante de la invención. De acuerdo con una realización específicamente preferida, dicho resto es una inmunoglobulina de unión a albúmina y, especialmente preferida, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de unión a albúmina tal como un dominio VHH de unión a albúmina.
Si se pretende usar en seres humanos, dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina de unión a albúmina se unirá preferiblemente a albúmina de suero humano y será preferiblemente un dominio VHH de unión a albúmina humanizada.
Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina que se unen a albúmina de suero humano se conocen en la técnica y se describen con más detalle en por ejemplo el documento WO 2006/122786. Específicamente, son VHH de unión a albúmina útiles ALB 1 y su homólogo humanizado, ALB 8 (documento WO 2009/095489). Otros dominios VHH de unión a albúmina mencionada en la publicación de patente anterior pueden, sin embargo, usarse también.
De acuerdo con una realización adicional de la invención, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina puede fusionarse con una molécula de albúmina de suero, tal como se describe por ejemplo en los documentos WO 01/79271 y WO 03/59934. Como por ejemplo se describen en el documento WO 01/79271 , la proteína de fusión puede obtenerse por tecnología recombinante convencional: una molécula de ADN que codifica albúmina de suero, o un fragmento de la misma, se une al ADN que codifica la molécula de unión a DII4, la construcción obtenida se inserta en un plásmido adecuado para la expresión en la célula hospedadora seleccionada, por ejemplo una célula de levadura como Pichia pastoris o una célula bacteriana y la célula hospedadora se transfecta después con la secuencia de nucleótidos fusionados y se cultiva en condiciones adecuadas.
De acuerdo con otra realización, una modificación prolongadora de la semivida de un polipéptido de la invención (reduciendo dicha modificación también la inmunogenicidad del polipéptido) comprende la unión de un polímero adecuado farmacológicamente aceptable, tal como poli (etilenglicol) (PEG) de cadena recta o ramificada o derivados del mismo (tal como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, cualquier forma adecuada de PEGilación puede usarse, tal como la PEGilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, sin limitación, anticuerpos de dominio sencillo y scFv); se hace referencia a, por ejemplo, a: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); y el documento WO 04/060965. Diversos reactivos para PEGilación de polipéptidos también están disponibles en el mercado, por ejemplo de Nektar Therapeutics, Estados Unidos o NOF Corporation, Japón, tal como la Serie EA, Serie SH, Serie MA Serie CA y Serie ME de Sunbright® tal como Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA y Sunbright® ME-400MA.
Preferiblemente, se usa PEGilación dirigida, en particular mediante un resto de cisteína (véase por ejemplo Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). Por ejemplo, para este propósito, PEG puede estar unido a un resto de cisteína que aparece de forma natural en un polipéptido de la invención, un polipéptido de la invención puede modificarse de modo que se introduzcan adecuadamente uno o más restos de cisteína para unión de PEG o puede fusionarse una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más restos de cisteína para su unión a PEG con el extremo N y/o C terminal de un polipéptido de la invención, usando todos técnicas de ingeniería proteínica conocidas por sí mismas para los expertos.
Preferiblemente, para los polipéptidos de la invención, se usa un PEG con un peso molecular de más de 5 kDa, tal como más de 10 kDa y menos de 200 kDa, tal como menos de 100 kDa; por ejemplo en el intervalo de 20 kDa a 80 kDa.
Con respecto a PEGilación, debería observarse que generalmente, la invención también abarca cualquier molécula de unión a DII4 biparatópica que se ha PEGilado en una o más posiciones de aminoácidos, preferiblemente de modo que dicha PEGilación (1 ) aumenta la semivida in vivo; (2) reduce la inmunogenicidad; (3) proporciona una o más propiedades beneficiosas adicionales conocidas de por sí para PEGilación; (4) no afecta esencialmente a la afinidad del polipéptido por DII4 (por ejemplo no reduce dicha afinidad en más de un 50% y más preferiblemente no en más de un 10%, como se determinó por un ensayo adecuado descrito en la técnica); y/o (4) no afecta a cualquiera de las otras propiedades deseadas de las moléculas de unión a DII4 de la invención. Los grupos de PEG adecuados y métodos para unirlos, tanto específicamente como no específicamente, resultarán evidentes para el experto. Pueden obtenerse kits y reactivos adecuados para dicha pegilacion por ejemplo de Nektar (CA, Estados Unidos).
En otro aspecto, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de unión a DII4 de la invención. Dichas moléculas de ácido nucleico también se denominarán en la presente memoria como "ácidos nucleicos de la invención" y también pueden estar en forma de una construcción genética, como se define en la presente memoria. Un ácido nucleico de la invención puede ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con un uso de un codón que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula hospedadora u organismo hospedador pretendidos). De acuerdo con una realización de la invención, el ácido nucleico de la invención está en una forma esencialmente aislada, como se ha definido anteriormente en la presente memoria.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, puede estar presente en y/o puede formar parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido o YAC. El vector puede especialmente ser un vector de expresión, es decir un vector que puede posibilitar la expresión de la molécula de unión a DII4 in vitro y/o in vivo (es decir en una célula hospedadora adecuada, organismo hospedador y/o sistema de expresión). Dicho vector de expresión generalmente comprende al menos un ácido nucleico de la invención que está unido operativamente a uno o más elementos reguladores adecuados, tal como promotor o promotores, potenciador o potenciadores, terminador o terminadores y similares. Dichos elementos y su selección a la vista de la expresión de una secuencia específica en un hospedador específico son conocimiento común para el experto. Ejemplos específicos de elementos reguladores y otros elementos útiles o necesarios para la expresión de moléculas de unión a DII4 de la invención, tales como promotores, potenciadores, terminadores, factores de integración, marcadores de selección, secuencias líder, genes informadores y similares, se describen por ejemplo en las páginas 131 a 133 del documento WO 2006/040153.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse de un modo conocido de por sí (por ejemplo mediante síntesis de ADN automatizada y/o tecnología del ADN recombinante), basándose en la información de las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos de la invención dados en la presente memoria y/o pueden aislarse de una fuente natural adecuada.
En otro aspecto, la invención se refiere a células hospedadoras que expresan o son capaces de expresar una o más moléculas de unión a DII4 de la invención; y/o que contienen un ácido nucleico de la invención. De acuerdo con una realización particularmente preferida, dichas células hospedadoras son células bacterianas; otras células útiles son células de levadura, células fúngicas o células de mamífero.
Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas de gran negativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas y cepas bacterianas de gram positivas tales como cepas Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo Pichia pastoris y Pichia methanolica) Hansenula.
Las células adecuadas de mamíferos incluyen por ejemplo células CHO, células BHK, células HeLa, células COS y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibios, células de insectos, células vegetales y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas.
La invención proporciona adicionalmente métodos de fabricación de una molécula de unión a DII4 de la invención, comprendiendo generalmente dichos métodos las etapas de: - cultivar células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico capaz de codificar una molécula de unión a DII4 en condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión a DII4 de la invención; y - recuperar o aislar el polipéptido expresado por las células hospedadoras del cultivo; y - opcionalmente purificar y/o modificar y/o formular adicionalmente la molécula de unión a DII4 de la invención.
Para la producción a una escala industrial, los organismos hospedadores preferidos incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris y S. cerevisiae que son adecuadas para expresión, producción y fermentación a gran escala y en particular para expresión, producción y fermentación farmacéutica a gran escala.
La elección del sistema de expresión específico depende en parte de la necesidad de ciertas modificaciones postraduccionales, más específicamente glicosilación. La producción de una molécula de unión a DII4 de la invención para la que se desea o requiere glicosilación necesitaría el uso de hospedadores de expresión mamíferos que tengan la capacidad de glicosilar la proteína expresada. A este respecto, resultará evidente para el experto que el patrón de glicosilación obtenido (es decir, el tipo, número y posición de restos unidos) dependerá de la célula o línea celular que se usa para la expresión.
Las moléculas de unión a DII4 de la invención producidas en una célula como se ha expuesto anteriormente pueden producirse intracelularmente (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y después aislarse de las células hospedadoras y opcionalmente purificarse adicionalmente; o pueden producirse extracelularmente (por ejemplo en el medio en el que las células hospedadoras se cultivan) y después aislarse del medio de cultivo y/u opcionalmente purificarse adicionalmente.
Se conocen en la técnica los métodos y reactivos usados para la producción recombinante de polipéptidos, tal como vectores de expresión adecuados específicos, métodos de transformación o transfección, marcadores de selección, métodos de inducción de expresión de proteínas, condiciones de cultivo y similares. De manera similar, los expertos conocen bien las técnicas de aislamiento y purificación de proteínas útiles en un método de fabricación de un polipéptido de la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un péptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 1 a 166 y 458, SEC ID N°: 333 a 353 o SEC ID N°: 375 a 395, respectivamente y una molécula de ácido nucleico que codifica a los mismos.
Estos péptidos corresponden a CDR3 derivadas de los VHH de la invención. Estos, en particular las moléculas de ácido nucleico que los codifican, son útiles para injerto de CDR para reemplazar una CDR3 en una cadena de inmunoglobulina o para su inserción en un armazón que no sea de inmunoglobulina, por ejemplo un inhibidor de proteasa, proteína de unión a ADN, citocromo b562, una proteína con paquete de hélices, un péptido con puentes disulfuro, una lipocalina o una anticalina, confiriendo así propiedades de unión a diana a dicho armazón. El método de injerto de CDR se conoce bien en la técnica y se ha usado ampliamente, por ejemplo para humanizar anticuerpos (que habitualmente comprende el injerto de CDR de un anticuerpo de roedor en los marcos Fv de un anticuerpo humano).
Para obtener un armazón de inmunoglobulina o de no inmunoglobulina que contiene una CDR3 de la invención, el ADN que codifica dicha molécula puede obtenerse de acuerdo con métodos convencionales de biología molecular, por ejemplo, mediante síntesis génica, por hibridación de oligonucleótidos o por medio de fragmentos de PCR solapantes, como se describe por ejemplo en Daugherty et al., 1991 , Nucleic Acids Research, Vol. 19, 9, 2471 - 2476. Un método para insertar una CDR3 de VHH en un armazón no de inmunoglobulina se ha descrito en Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13, 1882 - 1891.
La invención se refiere adicionalmente a un producto o composición que contiene o comprende al menos una molécula de unión a DII4 de la invención y opcionalmente uno o más componentes adicionales de dichas composiciones conocidos de por sí, es decir dependiendo del uso pretendido de la composición.
Para su uso farmacéutico, una molécula de unión a DII4 de la invención o un polipéptido que contiene a la misma puede formularse como una preparación o composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de unión a DII4 de la invención y al menos un vehículo, diluyente o excipiente y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos adicionales farmacéuticamente activos. A modo de ejemplos no limitantes, dicha formulación puede estar en una forma adecuada para su administración oral, para administración parenteral (tal comó por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), por administración tópica, por administración por inhalación, mediante un parche cutáneo, mediante un implante, mediante un supositorio, etc. Dichas formas de administración adecuadas - que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas, dependiendo del modo de administración - así como métodos y vehículos para su uso en la preparación de los mismos, resultarán evidentes para el experto y se describen adicionalmente en la presente memoria.
Así pues, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión a DII4, en particular un dominio variable sencillo de ¡nmunoglobulina de la invención o un polipéptido que contiene al mismo y al menos un vehículo, diluyente o excipiente adecuados (es decir adecuado para su uso farmacéutico) y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales.
Las moléculas de unión a DII4 de la invención pueden formularse y administrarse en cualquier modo adecuado conocido de por sí: se hace referencia, en particular para los dominios variables sencillos de ¡nmunoglobulina, por ejemplo a los documentos WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 y WO 08/020079, así como los manuales convencionales, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Company, Estados Unidos (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, Vigésimo Primera Edición, Lippincott Williams y Wilkins (2005); o el Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (véase por ejemplo las páginas 252-255).
Por ejemplo, un dominio variable sencillo de ¡nmunoglobulina de la invención puede formularse y administrarse de cualquier modo conocido de por sí para anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpos (incluyendo ScFv y diacuerpos) y otras proteínas farmacéuticamente activas. Dichas formulaciones y métodos para preparar los mismos resultarán evidentes para el experto y por ejemplo incluyen preparaciones adecuadas para administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial o intratecal) o para administración tópica (es decir transdérmica o intradérmica).
Las preparaciones para administración parenteral pueden por ejemplo ser soluciones estériles, suspensiones, dispersiones o emulsiones que son adecuadas para su infusión o inyección. Los vehículos o diluyentes adecuados para dichas preparaciones incluyen por ejemplo, sin limitación, agua estéril y tampones acuosos farmacéuticamente aceptables y soluciones tales como solución salina fisiológica tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank; aceites acuosos; glicerol; etanol; glicoles tales como propilenglicol o así como aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja, así como mezclas adecuadas de los mismos. Habitualmente, se preferirán soluciones o suspensiones acuosas.
Así pues, la molécula de unión a DII4 de la invención puede administrarse sistémicamente, por ejemplo, vía oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Para la administración terapéutica oral, la molécula de unión a DII4 de la invención puede combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos consumibles, comprimidos bucales, comprimidos medicinales, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deberían contener al menos un 0,1% de la molécula de unión a DII4 de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y ser convenientemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 60% del peso de una forma farmacéutica unitaria dada. La cantidad de moléculas de unión a DII4 de la invención en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtiene un nivel de dosificación eficaz.
Los comprimidos, pildoras, cápsulas y similares también pueden contener agentes de unión, excipientes, agentes desintegrantes, lubricantes y endulzantes o agentes saporíferos, por ejemplo los mencionados en las páginas 143-144 del documento WO 08/020079. Cuando la forma farmacéutica unitaria es una cápsula, esta puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Diversos otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la forma farmacéutica unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, pildoras o cápsulas pueden estar recubiertos de gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener moléculas de unión a DII4 de la invención, sacarosa o fructosa como agente endulzante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saporífero tal como sabor a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma farmacéutica unitaria debería ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, las moléculas de unión a DII4 de la invención pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación prolongada.
Las preparaciones y formulaciones para administración oral pueden también proporcionarse con un recubrimiento entérico que permitirá a las construcciones de la invención resistir el ambiente gástrico y pasar a los intestinos. De manera más general, las preparaciones y formulaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para su suministro a cualquier parte deseada del tracto gastrointestinal. Además, pueden usarse supositorios adecuados para su suministro al tracto gastrointestinal.
Las moléculas de unión a DII4 de la invención también pueden administrarse por vía intravenosa o por vía intraperitoneal mediante infusión o inyección, como se describe adicionalmente en las páginas 144 y 145 del documento WO 08/020079.
Para administración tópica de las moléculas de unión a DII4 de la invención, generalmente será deseable administrarlas a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido, como se describe adicionalmente en la página 145 del documento WO 08/020079.
Generalmente, la concentración de moléculas de unión a DII4 de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente 0.1-25% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.5-10% en peso. La concentración en una composición semisólida o sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente 0.1 -5% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.5-2.5% en peso.
La cantidad de moléculas de unión a DII4 de la invención requeridas para su uso en tratamiento variarán no sólo con la molécula de unión a DII4 particular seleccionada, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección que se está tratando y la edad y condición del paciente y estará en última instancia a discreción del médico o especialista clínico encargado. Además, la dosificación de las moléculas de unión a DII4 de la invención varía dependiendo de la célula, tumor, tejido, injerto u órgano diana.
La dosis deseada puede convenientemente presentarse en una dosis única o en dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis por día. La subdosis en sí misma puede dividirse adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones ligeramente espaciadas discretas; tal como múltiples inhalaciones de un insuflador o por aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.
Un régimen de administración puede incluir tratamiento a largo plazo diario. Mediante "largo plazo" se entiende al menos dos semanas y preferiblemente, varias semanas, meses o años de duración. Un experto habitual en la materia puede determinar las modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación usando solamente experimentación rutinaria, dadas las enseñanzas de la presente memoria. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificación también puede ajustarse por el médico individual en caso de cualquier complicación.
De acuerdo con una realización adicional, la invención se refiere al uso de moléculas de unión a DII4 de la invención, por ejemplo dominios variables sencillos de ¡nmunoglobulina o polipéptidos que los contienen, para propósitos terapéuticos, tal como para la prevención, tratamiento y/o mitigación de un trastorno, enfermedad o afección, especialmente en un ser humano, que están asociados con efectos mediados por DII4 en angiogénesis o que pueden prevenirse, tratarse o aliviarse mediante la modulación de una ruta de señalización Notch con una molécula de unión a DII4, en un método de tratamiento de un paciente que necesite de dicha terapia, dicho método comprende la administración, a un sujeto que lo necesite, de una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una molécula de unión a DII4 de la invención, por ejemplo un dominio variable sencillo de ¡nmunoglobulina o una composición farmacéutica que contenga al mismo, para la preparación de un medicamento para la prevención, tratamiento o mitigación de trastornos, enfermedades o afecciones asociadas con efectos mediados por DII4 en angiogénesis, como un ingrediente activo en una composición farmacéutica o un medicamento usado para los propósitos anteriores.
De acuerdo con un aspecto específico, dicho trastorno, enfermedad o afección es un cáncer o enfermedad cancerosa, como se ha definido en la presente memoria.
De acuerdo con otro aspecto, la enfermedad es una enfermedad ocular asociada con efectos mediados por DM4 en angiogénesis o que pueden tratarse o aliviarse mediante la modulación de la ruta de señalización Notch con una molécula de unión a DII4.
Dependiendo de la enfermedad cancerosa a tratar, una molécula de unión a DII4 de la invención puede usarse por sí misma o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en particular seleccionados de agentes quimioterapéuticos tales como agentes que dañan a ADN o compuestos terapéuticamente activos que inhiben la angiogénesis, rutas de transducción de señal o puntos de control mitóticos en células cancerosas.
El agente terapéutico adicional puede administrarse simultáneamente con, opcionalmente como un componente de la misma preparación farmacéutica o antes o después de la administración de la molécula de unión a DII4.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser, sin limitación, uno o más inhibidores seleccionados del grupo de inhibidores de EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK y PI3 quinasa, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1 , PTK2, IGF-R o IR.
Son otros ejemplos de agentes terapéuticos adicionales los inhibidores de CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, antagonistas de hedgehog, inhibidores de JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, el proteasoma, Rho, un inhibidor de la señalización de wnt o un inhibidor de la ruta de ubiquitinación u otro inhibidor de la ruta de señalización Notch.
Son ejemplos de inhibidores Aurora, sin limitación, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.
Un ejemplo para un inhibidor PLK es GSK-461364.
Son ejemplos de inhibidores raf BAY-73-4506 (también un inhibidor de VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (también además un inhibidor de VEGFR), sorafenib (también además un inhibidor de VEGFR) y XL 281.
Son ejemplos de inhibidores KSP ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731 y SB-743921.
Son ejemplos de inhibidores src y/o bcr-abl el dasatinib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (también un inhibidor de IGF-1 R), nilotinib (también un inhibidor de PDGFR y cKit), imatinib (también un inhibidor de cKit) y NS-187.
Un ejemplo de inhibidor de PDK1 es BX-517.
Un ejemplo de inhibidor de Rho es BA-210.
Son ejemplos de inhibidores de PI3 quinasa PX-866, BEZ-235 (también un inhibidor de mTor), XL 418 (también un inhibidor de Akt), XL-147 y XL 765 (también un inhibidor de mTor).
Son ejemplos de inhibidores de cMet o HGF XL-184 (también un inhibidor de VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461 , XL-880 (también un inhibidor de VEGFR), MGCD-265 (también un inhibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 y AV-299.
Un ejemplo de un inhibidor es c-Myc CX-3543.
Son ejemplos de inhibidores de Flt3 AC-220 (también un inhibidor de cKit y PDGFR), KW 2449, lestaurtinib (también un inhibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (también un inhibidor de JAK2), XL-999 (también un inhibidor de cKit, FGFR, PDGFR y VEGFR), sunitinib (también un inhibidor de PDGFR, VEGFR y cKit) y tandutinib (también un inhibidor de PDGFR y cKit).
Son ejemplos de inhibidores de HSP90 tanespimicina, alvespimicina, IPI-504 y CNF 2024.
Son ejemplos de inhibidores de JAK/STAT CYT-997 (que también interactúa con tubulina), TG 101348 (también un inhibidor de Flt3) y XL-019.
Son ejemplos de inhibidores de Mek ARRY-142886, PD-325901 , AZD-8330 y XL 518.
Son ejemplos de inhibidores de mTor temsirolimus, AP-23573 (que también actúa como un inhibidor de VEGF), everolimus (un inhibidor además de VEGF), XL-765 (también un inhibidor de PI3 quinasa) y BEZ-235 (también un inhibidor de PI3 quinasa).
Son ejemplos de inhibidores de Akt perifosina, GSK-690693, RX-0201 y triciribina.
Son ejemplos de inhibidores de cKit AB-1010, OSI-930 (también actúa como un inhibidor de VEGFR), AC-220 (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), axitinib (también un inhibidor de VEGFR y PDGFR), XL-999 (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinib (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR) y XL-820 (también actúa como un inhibidor de VEGFR- y PDGFR), imatinib (también un inhibidor de bcr-abl), nilotinib (también un inhibidor de bcr-abl y PDGFR).
Son ejemplos de inhibidores de antagonistas de hedgehog IPI-609 y CUR-61414.
Son ejemplos de inhibidores de CDK seliciclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (que también inhibe VEGFR2 y PDGFR), PD-332991 , R-547, SNS-032, PHA-690509 y AG 024322.
Son ejemplos de inhibidores de proteasoma bortezomib, carfilzomib y NPI-0052 (también un inhibidor de NFkappaB).
Un ejemplo de un inhibidor de ruta NFkappaB es NPI-0052.
Un ejemplo para un inhibidor de ruta de ubiquitinación es HBX- 41108.
En realizaciones preferidas, el agente terapéutico adicional es un agente anti-angiogénico.
Son ejemplos de agentes anti-angiogénicos los inhibidores de FGFR, PDGFR y VEGFR o los ligandos respectivos (por ejemplo inhibidores de VEGF como pegaptanib o el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab) y talidomidas, seleccionándose dichos agentes de, sin limitación, bevacizumab, motesanib, CDP-791 , SU-14813, telatinib, KRN-951 , ZK-CDK (también un inhibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (fármacos inmunoduladores), derivado de talidomida CC-4047, lenalidomida, ENMD 0995, IMC-D11 , Ki 23057, brivanib, cediranib, XL-999 (también un inhibidor de cKit y Flt3), 1 B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (también un inhibidor de Flt3), sunitinib (también un inhibidor de cKit y Flt3), axitinib (también un inhibidor de cKit), lestaurtinib (también un inhibidor de Flt3 y PKC), vatalanib, tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y cKit), pazopanib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121 B, AVE- 0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, tosilato de sorafenib (también un inhibidor de Raf), RAF-265 (también un inhibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (también un inhibidor de EGFR y Her2), BAY-57-9352 (también un inhibidor de Raf), BAY-73-4506 (también un inhibidor de Raf), XL 880 (también un inhibidor de cMet), XL-647 (también un inhibidor de EGFR y EphB4), XL 820 (también un inhibidor de cKit) y nilotinib (también un inhibidor de cKit y brc-abl).
El agente terapéutico adicional también puede seleccionarse de inhibidores EGFR, puede ser un inhibidor de EGFR de molécula pequeña o un anticuerpo anti-EGFR. Son ejemplos de anticuerpos anti-EGFR, sin limitación, cetuximab, panitumumab, matuzumab; un ejemplo de un inhibidor de EGFR de molécula pequeña es gefitinib. Otro ejemplo de un modulador de EGFR es la toxina de fusión EGF.
Entre los inhibidores de EGFR y Her2 útiles para la combinación con la molécula de unión a DII4 de la invención están lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuximab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (también un inhibidor de VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (también un inhibidor de VEGFR), ARRY-333786, IMC-11 F8, Zemab.
Otros agentes que pueden combinarse ventajosamente en una terapia con la molécula de unión a DII4 de la invención son tiuxetano de tositumumab y ibritumomab (dos anticuerpos anti-CD20 radiomarcados), alemtuzumab (un anticuerpo anti-CD52), denosumab, (un inhibidor de ligando del factor de diferenciación de osteoclastos), galiximab (un antagonista de CD80), ofatumumab (un inhibidor de CD20), zanolimumab (un antagonista de CD4), SGN40 (un modulador de receptor de ligando de CD40), rituximab (un inhibidor de CD20) o mapatumumab (un agonista de receptor de TRAIL-1).
Otros fármacos quimioterapéuticos que pueden usarse en combinación las moléculas de unión a DII4 de la presente invención se seleccionan de, pero no se limitan a, hormonas, análogos hormonales y antihormonales (por ejemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreótido, arzoxifeno, pasireótido, vapreótido), inhibidores de aromatasa (por ejemplo anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas y antagonistas de LHRH (por ejemplo acetato de goserelina, leuprolide, abarelix, cetrorelix, deslorelin, histrelin, triptorelin), antimetabolitos (por ejemplo antifolatos como metotrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina como 5 fluorouracilo, capecitabina, decitabina, nelarabina y gemcitabina, análogos de purina y adenosina tales como mercaptopurina tioguanina, cladribina y pentostatina, citarabina, fludarabina); antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina, mitomicina-C, bleomicina dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados del platino (por ejemplo cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, lobaplatino, satraplatino); agentes alquilantes (por ejemplo estramustina, mecloretamina, melfalan, clorambucil, busulfan, dacarbacina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiurea, temozolomida, nitrosoureas tales como carmustina y lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina y vincristina; y taxanos tales como paclitaxel, docetaxel y sus formulaciones, larotaxel; simotaxel y epotilonas como ¡xabepilona, patupilona, ZK-EPO); inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo epipodofilotoxinas como etopósidos y etopofos, tenipósido, amsacrina, topotecan, irinotecan) y agentes quimioterapéuticos misceláneos tales como amifostina, anagrelide, interferón alfa, procarbacina, mitotano y porfímero, bexaroteno, celecoxib.
La eficacia de las moléculas de unión a DII4 de la invención o polipéptidos que las contienen y de composiciones que comprenden las mismas, puede ensayarse usando cualquier ensayo adecuado ¡n vitro, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal conocido de por sí o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno especifico de interés. Los ensayos y modelos animales adecuados resultarán evidentes para el experto y por ejemplo incluyen los ensayos descritos en la presente memoria y usados en los Ejemplos posteriores, por ejemplo un ensayo de proliferación.
Los datos obtenidos en los experimentos de la invención confirman que las moléculas de unión a DII4 de la invención tienen propiedades que son superiores a las moléculas de unión a DII4 de la técnica antecedente, como puede por ejemplo tomarse de los datos de ELISA de las Figuras 10a, 10b, que muestran que los VHH madurados por afinidad bloquean la interacción hDLL4/hNotch1-Fc de una manera completa, así como los valores de CI50 (nM) para los VHH madurados por afinidad en ELISA de competición de hDLL4/hNotch1-Fc; y el KD por afinidad (nM) de VHH maduradas por afinidad purificadas en DII4 recombinante humana y DII4 de ratón. Esto indica que las moléculas de unión a DII4 de la invención son candidatos prometedores para tener eficacia terapéutica en enfermedades y trastornos asociados con efectos o mediados por DII4 en angiogénesis, tal como cáncer.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad mediante a) poner en contacto una muestra de una molécula de unión a DII4 de la invención como se ha definido anteriormente, y b) detectar la unión de dicha molécula de unión a DII4 con dicha muestra, y c) comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en unión relativa a dicha muestra es diagnóstica de una enfermedad o un trastorno asociado con efectos mediados por DII4 en angiogénesis.
Para éste y otros usos, puede ser útil modificar adicionalmente una molécula de unión a DII4 de la invención, tal como mediante la introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de unión específico, tal como el par de unión biotina-(estrept)avidina. Dicho grupo funcional puede usarse para enlazar la molécula de unión a DII4 de la invención con otra proteína, polipéptido o compuesto químico que está unido a la otra mitad del par de unión, es decir a través de la formación del par de unión. Por ejemplo, una molécula de unión a DII4 de la invención puede conjugarse con biotina y enlazarse a otra proteína, polipéptido, compuesto o vehículo conjugado con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, una molécula tal de unión a DII4 conjugada de la invención puede usarse como un informador, por ejemplo en un sistema de diagnóstico en el que se conjuga un agente productor de señal detectable con avidina o estreptavidina. Breve descripción de las Figuras: Figura 1 : Alineamiento de secuencia de aminoácidos de DII4 de seres humanos, rhesus y cynomolgus.
Figura 2: Mutantes con deleción de DII4 humana y de ratón (límites del dominio de los aminoácidos en superíndice).
Figuras 3a, 3b, 3c: VHH purificados que bloquean la interacción hDLL4/hNotch1-Fc (ELISA).
Figuras 4a-4e: VHH purificados que bloquean la interacción hDLL4/hNotch1-Fc (AlphaScreen) Figuras 5a-5j: VHH purificados que bloquean la interacción CHO-hDLL4/hNotch1 -Fe y CHO-rDLL4/hNotch1-Fc (FMAT) Figuras 6a-6d: VHH purificados que bloquean la escisión de Notchl mediada por DLL4 (informador).
Figuras 7a-7h: Unión de VHH purificados con DLL4 recombinante humano y de ratón (ELISA).
Figuras 8a-8f: Unión de VHH purificados con DLL1 humano recombinante y Jagged-1 humano (ELISA).
Figuras 9a-9e: Unión de VHH purificados con DLL4 humano/de ratón/de cynomolgus (FACS).
Figuras 10a, 10b: VHH madurados por afinidad que bloquean la interacción de hDLL4/hNotch1 -Fe (ELISA).
Figuras 11 a-11d: VHH madurados por afinidad purificados que bloquean la interacción de CHO-hDLL4/hNotch- Fc y CHO-rDLL4/hNotch1-Fc (FMAT).
Figuras 12a-12d: Unión de VHH purificados con DLL4 humano/de ratón (ELISA).
Figuras 13a-13d: Unión de VHH madurados por afinidad purificados con DLL1 humano recombinante y Jagged-1 humano (ELISA).
Figuras 14a-14f: Unión de VHH purificados con DLL4 humano/de ratón/de cynomolgus (FACS).
Figura 15: Evaluación de los efectos de VHH en la inhibición mediada por DII4 de la proliferación HUVEC.
Materiales y Métodos a) Generación de líneas celulares CHO y HEK293 que sobreexpresan DII4 de seres humanos, ratones y cynomolgus Los ADNc que codifican DII4 humano (SEC ID N°: 417; NM_019074.2) y de ratón (NM_019454.3) se amplifican a partir de una Biblioteca de ADNc de Corazón con Tejido Normal de Adulto Humano (BioChain, Hayward, CA, Estados Unidos) y una Biblioteca de ADNc de Tejido de Corazón de Ratón (aislado de la cepa C57/BI6), respectivamente, usando oligonucleótidos diseñados en el 5' y 3' UTR de la secuencia correspondiente (véase Tabla 1 ; SEC ID N°: 421 a 426). Los amplicones se clonan en el vector de expresión de mamíferos pCDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos).
Tabla 1 : Secuencias de oligonucleótidos usadas para la amplificación de ortólogos de longitud completa del gen DLL4 El ADNc de DII4 de cynomolgus se amplifica a partir de una biblioteca de ADNc de Corazón de Tejido Normal de Cynomolgus (BioChain, Hayward, CA, Estados Unidos), usando cebadores diseñados en el 5' y 3' UTR de la secuencia de codificación de DII4 de la especie estrechamente relacionada rhesus (DII4 Macaca mulatta, SEC ID N°: 418; XM_001099250.1) (véase la Tabla 1). El amplicón final se clona en el vector de expresión de mamíferos pCDNA3.1 (+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Se demostró que la secuencia de aminoácidos de DII4 de cynomolgus era idéntica en un 100% a rhesus, e idéntica en un 99% a seres humanos (véase Figura 1 ; las diferencias de la secuencia humana se indican en negrita subrayadas).
Para establecer células de Ovario de Hámster Chino (CHO) que sobre expresan DII4 humano, DII4 de ratón o DII4 de cynomolgus, las células CHO parentales se electroporan con pCDNA3.1 (+)-neo-hDII4, pcDNA3.1(+)-neo-rDII4 o pcDNA3.1 (+)-neo-cDII4, respectivamente. Las células de Riñon Embrionario Humano (HEK293) que sobre expresan DII4 humano y DII4 de ratón se generan mediante transfección mediada por lípidos con Fugene (Roche) de pCDNA3.1 (+)-neo-hDII4 o plásmidos de rDII4, respectivamente, en la línea celular parental HEK293. Para todas las condiciones, los transfectantes se seleccionan añadiendo 1 mg/ml de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). b) Generación de IgG monoclonal anti-DII4 y fragmento de Fab En el documento US 2008/0014196 (Genentech) se describe un Acm de DII4 con reacción cruzada ser humano/ratón que se usó por Ridgway er al. (2006) para mostrar los efectos aditivos del Acm de VEGF y el Acm de DII4 en crecimiento tumoral en varios modelos de xenotrasplante. Este Acm anti-DII4 y su Fab correspondiente se purifican para evaluar las propiedades de este anticuerpo (fragmento) en ensayos bioquímicos/celulares y modelos de xenotrasplante y para eluciones específicas durante las selecciones de fago. Las secuencias de cadena pesada y ligera variables publicadas de Acm de DII4 se clonan en un marco de hlgG2ak, expresado de forma transitoria en células HEK293 y purificado de sobrenadantes usando cromatografía de proteína A. El Acm de DII4 purificado muestra unión a DII4 humano y DII4 de ratón en ELISA y FACS (usando células CHO-rDII4 y CHO-hDII4), afinidades sub-nanomolares para ambos ortólogos del factor de crecimiento en Biacore.
El fragmento Fab DII4 correspondiente se construye mediante ensamblaje génico basándose en la traducción inversa y optimización de codones para la expresión en E. coli usando el Software de Optimización Génica de Leto (www.entechelon.com). Los cebadores de oligonucleótidos para el ensamblaje de la cadena ligera variable (VL), la cadena pesada variable (VH), la cadena ligera constante (CL) y el dominio constante 1 de la cadena pesada (Cm) se diseñan y se realiza una PCR de ensamblaje. Los fragmentos de ADNc que codifican VL+Ci_ y VH+Cm se clonan en un vector derivado de pUC199, que contienen el promotor LacZ, un gen de resistencia a kanamicina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder híbrida glll-pelB, usando los sitios de restricción, Sfil y AscI y los sitios de restricción Kpnl y Notl, respectivamente. En fase con la secuencia codificante de Fab, el vector de expresión codifica un HA C terminal y un marcador His6. El fragmento Fab se expresa en E. coli como proteína marcada con His6 y purificada posteriormente del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC) y cromatografía de exclusión de tamaños (SEC). Las secuencias de aminoácidos relevantes de la cadena variable pesada y variable ligera se representan (SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 2; respectivamente del documento US 2008/0014196); las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera completas se muestran en SEC ID N°: 419 y 420, respectivamente. c) Generación de mutantes de DII4 para mapeo de epítopos Para identificar la región en el dominio extracelular (ECD) de DII4 que comprende al epítopo reconocido por los VHH anti-DII4, se generan mutantes con deleción progresiva del ECD de DII4. El vector de expresión de mamíferos pSecTag2/Hygro (Invitrogen, Carisbad, CA, Estados Unidos) que comprende un promotor CMV corriente arriba de polinucleótidos que codifican una serie anidada de fragmentos de deleción del ECD del DII4 fusionado con un marcador de polyHis se generan usando tecnología de ADN recombinante convencional (véase Figura 2; límites del dominio de los aminoácidos en superíndice). Estas proteínas recombinantes se expresan en células HEK293 transfectadas transitoriamente usando el Sistema de Expresión Freestyle 293 (Invitrogen, Carisbad, CA, Estados Unidos) del que el medio condicionado se recoge y purifica mediante IMAC. Sólo los mutantes de DII4 que carecen del dominio tipo EGF2 mostraron unión alterada con el Acm anti-DII4 de reacción cruzada ser humano/ratón humanizado descrito anteriormente (inmovilizado mediante captura en una microplaca sensora Biacore recubierta de IgG anti-humano). Se sabe que esta IgG tiene un epítopo de unión específica en este dominio de DII4 (solicitud de patente de Genentech, US 2008/00 4 96A1). d) Generación de plásmidos de ensayo informadores de DII4 Se desarrolla un ensayo informador basándose en la escisión de Notchl mediada por ?-secretasa y translocación nuclear del dominio intracelular de Notchl (NICD) tras la estimulación con DII4, esencialmente como se ha descrito (Struhl y Adachi, Cell. 1998 May 15; 93(4): 649-60). Las secuencias que codifican Gal4/VP16 se insertan en la secuencia que codifica NICD. El potente activador transcripcional híbrido GAL4-VP16, que consiste en un fragmento de unión a ADN de GAL4 de levadura fusionado con un dominio activador transcripcional viral de Herpes simplex VP16, se inserta en dirección carboxi-terminal del dominio transmembrana de Notchl. La escisión de esta construcción mediante ?-secretasa da como resultado la liberación de la proteína de fusión Gal4A/P16 NICD que se translocará al núcleo en el que se unirá a y activará transcripcionalmente un plásmido informador de luciferasa co-transfectado, que contiene una secuencia promotora GAL4-UAS fuerte (Struhl, G. y Adachi, A., Cell, vol. 93, 649-660, 1998). El cásete de expresión humano Notch1-Gal4/VP16 se clona en pcDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El vector pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro] (Promega, Madison, Wl, Estados Unidos) se usa como un plásmido informador de luciferasa.
Ejemplo 1 Inmunización con DII4 de diferentes especies induce una respuesta inmune humoral en llama 1.1. Inmunizaciones Después de la aprobación por parte del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Veterinaria (Universidad Ghent, Bélgica), se inmunizaron 4 llamas (designadas con los N° 208, 209, 230, 231) con 6 inyecciones intramusculares ( 00 ó 50 µg/dosis a intervalos semanales) de DII4 humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos). El antígeno de DII4 se formula en Stimune (Cedi Diagnostics BV, Lelystad, Países Bajos). Se inmunizan tres llamas adicionales (designadas con los N° 127b, 260, 261 ) de acuerdo con protocolos convencionales con 4 inyecciones subcutáneas de células CHO que sobre expresan DII4 humano y DII4 de ratón de forma alternante que se establecen como se ha descrito anteriormente. Las células se re suspenden en D-PBS y se mantienen en hielo antes de la inyección. Además, tres llamas adicionales (designadas con los N° 282, 283, 284) se inmunizan de acuerdo con protocolos convencionales con 4 inyecciones intramusculares (100 ó 50 µ9^?e?5 a intervalos bisemanales) de DII4 humano y DII4 de ratón recombinantes de manera alternante (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos). La primera inyección en el día 0 con DII4 humano se formula en Adyuvante Completo de Freund (Difco, Detroit, MI, Estados Unidos), mientras que las inyecciones posteriores con DII4 humano y de ratón se formulan en Adyuvante Incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI, Estados Unidos). 1.2. Evaluación de respuestas inmunes inducidas en llama Para evaluar la inducción de una respuesta inmune en los animales contra DII4 humano por ELISA, se recogieron sueros de las llamas 208, 209, 230 y 231 en el día 0 (pre-inmune), día 21 y día 43 (tiempo de recogida de linfocito de sangre periférica [PBL]), de las llamas 127b, 260 y 261 en el día 0 y el día 51 y de las llamas 282, 283 y 284 en el día 0, día 28 y día 50. En resumen, se inmovilizan 2 µg/ml de DII4 humano o DII4 de ratón recombinantes (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) durante una noche a 4°C en una placa de 96 pocilios MaxiSorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocilios se bloquean con una solución de caseína (1%). Después de la adición de diluciones de suero, se detectan inmunoglobulinas unidas específicamente usando una inmunoglobulina de cabra anti-llama conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, Estados Unidos) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (S.S'.S.S'-tetrametilbencidina) (Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos), demostrándose que se induce una respuesta inmune significativa dependiente de anticuerpo contra DII4. La respuesta de anticuerpo se genera tanto mediante repertorios de células B que expresan anticuerpos sólo de cadena pesada y convencional puesto que pueden detectarse inmunoglobulinas unidas específicamente con anticuerpos que reconocen específicamente los anticuerpos de lgG1 convencionales de llama o los anticuerpos de lgG2 o lgG3 de llama solo de cadena pesada (Tabla 2-A). En todas las llamas inyectadas con DII4 de ratón, se genera una respuesta de anticuerpos mediante células B que expresan anticuerpo sólo de cadena pesada y convencional específicamente contra DII4 de ratón. Adicionalmente, se confirman los títulos de suero de animales inmunizados por células mediante análisis de FACS en células HEK293 que sobre expresan DII4 humano y de ratón (Tabla 2-B). Las respuestas de títulos de suero de DII4 para cada llama se representan en la Tabla 2.
Tabla 2: Respuesta de suero específico mediada por anticuerpo contra DII4.
A) ELISA (recubierto con fase sólida de proteína recombinante).
ND: no determinado B) FACS (proteína expresada en forma nativa en células HEK293) ND: no determinado Ejemplo 2 Clonación de repertorios de fragmento de anticuerpo de solo cadena pesada y preparación de fago Tras la inyección de inmunógeno final, se recogen de las llamas inmunizadas tejidos inmunes como la fuente de células B que producen los anticuerpos de cadena pesada. Típicamente, se recogen dos muestras de sangre de 150 mi recogidas 4 y 8 días después de la última inyección de antígeno y una biopsia de ganglio linfático, recogida 4 días después de la última inyección de antígeno por animal. A partir de las muestras de sangre, se preparan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Ficoll-Hypaque de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados Unidos). A partir de las PBMC y de la biopsia de ganglio linfático, se extrae el ARN total, que se usa como material de partida para RT-PCR para amplificar los segmentos de ADN que codifican VHH, como se describe en el documento WO 05/044858. Para cada llama inmunizada, se construye una biblioteca mediante la agrupación del ARN total aislado de todos los tejidos inmunes recogidos de ese animal. Brevemente, el repertorio de VHH amplificado por PCR se clona mediante sitios de restricción específicos en un vector diseñado para facilitar la presentación del fago de la biblioteca de VHH. El vector deriva de pUC119 y contiene el promotor LacZ, una secuencia codificante de proteína glll de fago M13, un gen de resistencia a ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder híbrida glll-pelB (pAX050). En fase con la secuencia codificante de VHH, el vector codifica un marcador c-myc C terminal y un marcador His6. Se preparan los fagos de acuerdo con protocolos convencionales y se almacenan después de su esterilización por filtrado a 4°C para su uso posterior.
Ejemplo 3 Selección de VHH específicos de DII4 mediante presentación de fago Los repertorios de VHH obtenidos de todas las llamas y clonados como una biblioteca de fago se usan en diferentes estrategias de selección, aplicando una multiplicidad de condiciones de selección. Las variables incluyen i) el formato de proteína de DII4 (dominio extracelular expresado de forma recombinante marcado con His en C terminal de DII4 humano (Met1-Pro524) y DII4 de ratón (Met1-Pro525) (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) o DII4 humano y DII4 de ratón de tamaño completo presentes en células CHO o HEK293 que sobre expresan DII4, ii) el método de presentación de antígenos (placas recubiertas directamente con DII4 o placas de Neutravidina recubiertas con DII4 mediante un marcador de biotina; fase de solución: incubación en una solución seguida de captura en placas recubiertas con Neutravidina), iii) la concentración de antígeno y iv) diferentes métodos de elución (no específicos mediante tripsina o específicos mediante quimera de receptor afín Notch1/Fc o IgG/Fab anti-DII4). Todas las selecciones se realizan en placas de 96 pocilios Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania).
Las selecciones se realizan como sigue: las preparaciones de antígeno de DII4 para formatos de selección de fase sólida y solución se presentan como se ha descrito anteriormente a concentraciones múltiples. Después de 2 h de incubación con las bibliotecas del fago seguida de lavado exhaustivo, los fagos unidos se eluyen con tripsina (1 mg/ml) durante 30 minutos. En caso de que la tripsina se use para la elución de fagos, la actividad proteasa se neutraliza inmediatamente aplicando inhibidor de proteasa ABSF 0.8 mM.
Como control, se realizan selecciones sin antígeno en paralelo. Las producciones de fagos que muestran enriquecimiento sobre el fondo (control sin antígeno) se usan para infectar E. coli. Las células de E. coli infectadas se usan para preparar fagos para el siguiente ciclo de selección (rescate de fagos) o se siembran en placas de agar (LB+amp+glucosa2%) para análisis de clones de VHH individuales. Para explorar una producción de selección para enlazadores específicos, se toman colonias sencillas de las placas de agar y se dejan crecer en placas de 96 pocilios profundos de 1 mi. La expresión de VHH controlada por LacZ se induce mediante la adición de IPTG (0.1-1 mM final) en ausencia de glucosa. Se preparan extractos periplásmicos (en un volumen de -80 µ?) de acuerdo con protocolos convencionales.
Ejemplo 4 Exploración de extractos periplásmicos en AlphaScreen de DII4-Notch1 y ensayo por competición de FMAT Los extractos periplásmicos se exploran en un ensayo de AlphaScreen de DII4/Notch1 humano para evaluar la capacidad de bloqueo de los VHH expresados. El DII4 humano se biotinila usando biotina (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos) y sal de sodio de ácido biotinamidohexanoico 3-sulfo-N-hidroxisuccinimida éster (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos). Se captura la quimera de Notch1/Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) usando un VHH anti-Fc que está acoplado a perlas aceptoras de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos). Para evaluar la capacidad neutralizadora de los VHH, se preincuban series de diluciones de los extractos periplásmicos con DII4 humano biotinilado. A esta mezcla, se añaden las perlas aceptoras y las perlas donantes de estreptavidina y se incuban adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente. Se mide la fluorescencia mediante la lectura de placas en el lector de Placas Multimarcador Envision (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos) usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. Una disminución de la señal de fluorescencia indica que la unión de DII4 humano biotinilado al receptor NotcM humano/Fc está bloqueado por el VHH expresado en extracto periplásmico.
Como alternativa, se usan células CHO-hDII4 y CHO-rDII4 en un ensayo de competición de FMAT NotcM humano/Fc (Tecnología de Ensayo de Microvolumen Fluorométrico). Se marca aleatoriamente la quimera de NotcM humano/Fc recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) con Alexa-647 (Invitrogen, Carisbad, CA, Estados Unidos). Brevemente, se añaden 5 µ? de material periplásmico a NotcM humano/Fc marcado 100 pM o 175 p junto con 7.500 células que sobre expresan CHO-hDII4 o CHO-rDII4, respectivamente, y se realiza una lectura después de 2 horas de incubación. Para ajustar la línea basal no competitiva, se incluyen al menos 30 replicaciones de células con NotcM humano/Fc~Alexa647 y se calcula el porcentaje de inhibición a partir de esta línea basal. Todos los cálculos se basan en la señal de FL1_total que comprende la media de la fluorescencia por pocilio frente al número de conteos por pocilio.
A partir de esta exploración, los VHH inhibidores se seleccionan y se secuencian. El análisis de secuencia reveló 167 VHH únicos que pertenecen a 40 linajes de células B diferentes. El número total de variantes hallados para cada linaje de células B se representa en la Tabla 3. Se da una perspectiva general de los datos de exploración periplásmica en la Tabla 4. Las secuencias de aminoácidos de todos los VHH únicos obtenidos se muestran la Lista de Secuencias (SEC ID N°: 167 - 332 y 459) y en la Tabla 5 (CDR y regiones flanqueantes están indicados).
Tabla 3: Parámetros de selección usados para la identificación de linajes de células B VHH específicos de DII4 Tabla 4: Exploración de extractos periplásmicos que contienen VHH anti-DII4 expresado si se identifican múltiples variantes únicas dentro de un linaje de células B, se da el intervalo (máx-min) en constante de disociación o la constante disociación de un miembro de un linaje entre paréntesis en cursiva). (b)ajuste heterogéneo: constante de disociación rápida y lenta determinadas.
Tabla 5 Ejemplo 5 Caracterización de VHH purificados Los VHH anti-DII4 inhibidores seleccionados de la exploración descrita en el Ejemplo 4 se purifican y caracterizan adicionalmente. Los VHH seleccionados se expresan en TG1 de E. coli como proteínas c-myc, marcadas con His6. Se induce la expresión mediante adición de IPTG 1 mM y se permite que continúe durante 4 horas a 37°C. Después de centrifugar los cultivos celulares, se preparan los extractos periplásmicos mediante congelación-descongelación de los sedimentos. Estos extractos se usan como material de partida y los VHH se purifican mediante IMAC y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) dando como resultado un 95% de pureza según se evaluó mediante SDS-PAGE. 5.1. Evaluación de VHH que bloquean DII4 en ELISA La capacidad de bloqueo de los VHH se evalúa en un ELISA de bloqueo de DII4 humano - Notchl humano/Fc. Brevemente, una placa de 96 pocilios MaxiSorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania) se recubre con 1 µg/ml de quimera de Notchl humano/Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos). Una concentración fija de DII4 humano biotinilado 15 nM se preincuba con una serie de diluciones del VHH durante 1 hora, después de lo cual la mezcla se incuba en el receptor de Notchl recubierto durante 1 hora adicional. Se detecta la unión residual de DII4 humano biotinilado usando extravidina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) (Figuras 3a-3c). El DII4 humano se biotinila como se ha descrito anteriormente. Los valores de CI5o para VHH que bloquean la interacción de DII4 - Notchl humano/Fc se representan en la Tabla 6.
Tabla 6: Valores de CI5o (nM) para VHH en ELISA de competición de hDLL4/hNotch1-Fc 5.2. Evaluación de VHH que bloquean DII4 en AlphaScreen Brevemente, el DII4 humano biotinilado 1 nM se captura en perlas donantes recubiertas de estreptavidina (20 µ9/???), mientras que el receptor humano Notchl 0.4 nM (como una proteína de fusión Fe) se captura en perlas aceptoras recubiertas de VHH anti-Fc humano (20 µg/ml). Ambas perlas cargadas se incuban junto con un intervalo de dilución del VHH competidor (Figuras 4a-4e). Los valores de Cl50 para los VHH que bloquean la interacción de DII4 - Notchl humano/Fc se representan en la Tabla 7.
Tabla 7: Valores de Cl50 (nM) para VHH en AlphaScreen de competición de hDLL4/hNotch1 a) inhibidor parcial 5.3. Inhibición mediante VHH anti-DII4 de unión Noten 1 humano/Fc con DII4 humano o de ratón expresado en las células CHO La capacidad de bloqueo de los VHH se evalúa en un ensayo FMAT competitivo de DII4 humano y de ratón - Notchl humano/Fc (Figuras 5a-5j) como se resume en el Ejemplo 4. Los valores de CI50 para VHH que bloquean la interacción de Notchl humano/Fc con DII4 humano o de ratón expresado en células CHO se representan en la Tabla 8.
Tabla 8: Valores de CI50 (media) (nM) de VHH purificados que bloquean la interacción de Notchl humano/Fc con DLL4 humano o de ratón expresado en células CHO (FMAT) 5.4. Evaluación de VHH que bloquean a DII4 en ensayo informador Para evaluar la potencia de los VHH seleccionados, se preparó un ensayo informador que está basado en la escisión mediada por ?-secretasa de Notchl y la liberación del dominio intracelular de Notchl (NICD) tras la estimulación con DII4. La construcción Notch1-GAL4/VP16 está cotransfectada con el plásmido informador pGL4.31 [Luc2P/Gal4UAS/Hygro] en células HEK dando como resultado una expresión transitoria de la proteína de fusión. Estas células transfectadas transitoriamente se estimulan durante 24 horas mediante co-cultivo con una línea celular estable HEK293-hDII4. Cuarenta y ochos horas después de la transfeccion se realizan la lectura. Los VHH se preincuban con las células HEK293-hDII4 1 hora antes del comienzo del co-cultivo y se incluyen durante el co-cultivo (Figuras 6a-6d). Los valores de Cl50 de los VHH para bloquear la escisión mediada por DII4 Notchl y la translocación posterior de su NICD al núcleo de la célula receptora se representan en la Tabla 9.
Tabla 9: Valores de Cl50 (medios) (nM) de VHH purificados en un ensayo informador de DLL4/Notch1 5.5. Unión de epítopos Para determinar si los VHH pueden unirse simultáneamente a DII4 cuando por ejemplo se une un anticuerpo de referencia, se llevan a cabo experimentos de unión de epítopos (mediante Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) en un instrumento Biacore T100). El fragmento Fab anti-DII4 se inmoviliza irreversiblemente en la célula de referencia y de flujo activo de una microplaca sensora CM5. Para cada muestra (ciclo), se inyecta DII4 humano en la célula de flujo activo y de referencia y se captura reversiblemente mediante Fab anti-DII4. Se evalúa la unión adicional de VHH mediante inyección sobre la superficie inmovilizada. Todos los VHH y Fab anti-DII4 se inyectan a 100 nM con un tiempo de contacto de superficie de 120 segundos y un caudal de 10 µ?/minuto. La superficie se regenera usando glicina 10 mM (pH 1.5). Las curvas procesadas se evalúan con software de evaluación Biacore T 00. La Tabla 10-A representa la ruta de inyección/regeneración secuencial de los VHH analizados y los controles. Se demuestra que los VHH DLLBII56A09 (SEC ID N°: 300), DLLBII96C03 (SEC ID N°: 326), DLLBII101G08 (SEC ID N°: 197) y DLLBII115A05 (SEC ID N°: 224) no se unen adicionalmente a DII4 humano capturado por Fab de DII4. La inyección de Fab de DII4 tampoco pudo unir adicionalmente DII4 humano lo que indica que todos los epítopos están saturados. Por lo tanto, puede concluirse que estos VHH reconocen un epítopo que solapa con Fab de DII4 para la unión de DII4 humano. Los VHH exclusivos de seres humanos DLLBII6B11 (SEC ID N°: 174) y DLLBII104G01 (SEC ID N°: 215) muestran unión adicional en DII4 humano capturado por Fab de DII4, lo que indica que estos VHH que son específicos para DII4 humano reconocen un epítopo diferente que los VHH con reacción cruzada de ser humano/ratón.
Tabla 10-A: Unión de epítopo de VHH anti-DLL4 VHH - unión simultánea con Fab de DLL4 5.6. Mapeo de epítopos usando mutantes de deleción de DII4 La unión de los VHH a estos mutantes de DII4 se evalúa en Biacore. Brevemente, los VHH DLLBII101G08 (SEC ID N°:197) y DLLBII115A5 (SEC ID N°: 224) se usan para recubrir una placa Sensora CM4 y se inyectan 200 nM de cada mutante de deleción a lo largo de la microplaca. La unión se ensaya cualitativamente. No se observa unión de DLLBII56A09 (SEC ID N°: 300), DLLBII101G08 (SEC ID N°: 197) y DLLBII115A05 (SEC ID N°: 224) a los mutantes de DII4 humano y de ratón hDII4.1 y rDII4.8, respectivamente, carentes de dominio de tipo EGF 2 (Tabla 10-B). Pruebas indirectas usando un ELISA competitivo de hDII4/ IgG de DII4 ya apuntaban a esta observación. Brevemente, se recubre una placa de 96 pocilios de MaxiSorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con 1 µg/ml de IgG de DII4. Se preincuba DII4 humano biotinilado a una concentración fija de 6 nM con una serie de diluciones del VHH durante 1 hora, después de lo cual la mezcla se incuba en el IgG aplicado durante una hora adicional. La unión residual de DII4 humano biotinilado se detecta usando extravidina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) (datos no mostrados). El DII4 humano se biotinila como se ha descrito anteriormente. Se sabe a partir de la bibliografía de patentes que el IgG anti-DII4 monoclonal (Genentech, documento US 2008/0014196A1) se une a un epítopo dentro del dominio de tipo EGF 2 de DII4.
Tabla 10-B: Mapeo de epítopo de VHH anti-DLL4 - unión a mutantes de deleción de DLL4 5.7. Determinación de la afinidad de la interacción hDII4 - VHH Los análisis cinéticos para determinar la afinidad de la interacción de DII4 - VHH se realizan mediante Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) en un instrumento Biacore T100. El DII4 humano recombinante se inmoviliza en una microplaca CM5 mediante acoplamiento de aminas usando EDC y NHS o se captura DII4 humano biotinilado en una microplaca SA (superficie de estreptavidina). Se inyectan VHH purificados o fragmento Fab durante 2 minutos a diferentes concentraciones (entre 10 y 300 nM) y se permite que se disocien durante 20 minutos a un caudal de 45 µ?/min. Entre inyecciones de la muestra, las superficies se regeneran con glicina 10 mM pH 1.5 y HCI 100 mM. Se usa HBS-N (tampón Hepes pH 7.4) como tampón de funcionamiento. Si es posible, se evalúan los datos mediante el ajuste de un modelo de interacción 1 :1 (unión Langmuir) en las curvas de unión. La constante de afinidad KD se calcula a partir de las constantes de las tasas de asociación y de disociación resultantes (ka) y (kd). Las afinidades de los VHH anti-DII4 se representan en la Tabla 1 1.
Tabla 11 : KD de afinidad (nM) de VHH purificados para DLL4 humano recombinante (a) la curva de unión heterogénea no da como resultado un ajuste 1 :1 5.8. Unión a ortólogos (rDII4, cDII4) y miembros de la familia (hJagged-1, hDLL1) Para determinar la reactividad cruzada con DII4 de ratón se realiza un ELISA de unión. Brevemente, se recubre una placa de 96 pocilios MaxiSorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con DM4 de ratón recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MS, Estados Unidos) durante una noche a 4°C a 1 µg/ml. Los pocilios se bloquean con una solución de caseína (1 % en PBS). Se aplican VHH como una serie de diluciones y se detecta la unión usando un conjugado anti-myc de ratón (Roche) y un conjugado anti-AP de ratón (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos) (Figuras 7a-7h). Como referencia, se mide la unión a DII4 humano. Los valores de CE50 se resumen en la Tabla 12.
Tabla 12: Valores de CE5o (nM) para VHH en un ELISA de unión de DLL4 humano y DLL4 de ratón recombinantes Para determinar la reactividad cruzada de los VHH con cynomolgus, se realiza un experimento de unión FACS. Se usan células HEK293 que expresan DII4 de cynomolgus (transfección transitoria o estable) para un experimento de unión mediante valoración de los VHH. Después de una incubación de 30 minutos en hielo, todas las muestras se lavan y se realiza una detección mediante la aplicación de anti-c-myc~Alexa647 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Estados Unidos). Se toman como referencias las células HEK293 que sobreexpresan DII4 humano y de ratón. El valor de MCF medio se determina en la Matriz FACS y se usa para calcular el valor de CE50 (véase Figuras 9a-9e).
La ausencia de unión a los ligandos homólogos de DLL1 y Jagged-1 humano se evalúa mediante ensayo de unión en fase sólida (ELISA). Brevemente, se recubre una placa de 96 pocilios MaxiSorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con DLL1 humano (Alexis, San Diego, CA, Estados Unidos) y Jagged-1 humano (Alexis, San Diego, CA, Estados Unidos) durante una noche a 4°C a 1 µg/ml. Los pocilios se bloquean con una solución de caseína (1 % en PBS). Se aplican los VHH como una serie de diluciones y se detecta la unión usando un conjugado anti-myc de ratón (Roche) y un conjugado anti-AP de ratón (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos). Se considera que ninguno de los VHH anti-DII4 tienen reactividad cruzada con estos ligandos homólogos (Figuras 8a-8f). 5.9. Evaluación de VHH en el bloqueo de la proliferación de HUVEC mediada por DII4 La potencia de los VHH seleccionados se evalúa en un ensayo de proliferación, como se describe en Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21 ; 444(7122): 1083-7), en forma modificada. Brevemente, se recubren placas de cultivo tisular de 96 pocilios con DII4-His purificado (RnD Systems; DII4 humano marcado con His C terminal, aminoácidos 27-524, 0.75ml/pocillo, 10 ng/ml) en tampón de recubrimiento (PBS, BSA 0.1 %). Los pocilios se lavan en PBS antes de sembrar 4000 células HUVE/pocillo por cuadriplicado. La proliferación celular se mide mediante incorporación de [3H]-Timidina en el día 4. Los resultados, mostrados en la Figura 15, demuestran que los VHH de DLL4 DLLBII101 G08, DLLBII104G01 , DLLBII115A05, DLLBII56A09 y el Fab de DLL4 inhiben el efecto dependiente de DLL4 en la proliferación de HUVEC de una manera dependiente de la dosis, los valores de CI5o se resumen en la Tabla 13. Los VHH ensayados consiguen una inhibición completa del efecto dependiente de DLL4 a 10 µ?.
Tabla 13: Valores de CI5o obtenidos en el ensayo de proliferación de DLL4 Ejemplo 6 Maduración por afinidad de VHH seleccionados Los VHH DLLBII101G08 y DLLBII115A05 se someten a dos ciclos de maduración por afinidad.
En un primer ciclo, se introducen sustituciones de aminoácidos aleatoriamente en regiones flanqueantes (FW) y determinantes de complementariedad (CDR) usando el método de PCR propensa a errores. La mutagénesis se realiza un enfoque basado en PCR de dos ciclos (kit de Mutagénesis Aleatoria Genemorph II obtenido de Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos) usando 1 ng de molde de ADNc de DLLBII101 G08 o DLLBII115A05, seguido de una segunda PCR propensa a errores que usa 0.1 ng de producto del ciclo 1. Después de una etapa de perfeccionamiento, los productos de PCR se insertan mediante sitios de restricción únicos en un vector diseñado para facilitar la presentación de fagos de la biblioteca VHH. Se realizan ciclos consecutivos de selecciones en la solución usando concentraciones decrecientes de DLL4 humano recombinante biotinilado (biot-rhDLL4) y eluciones de tripsina. También se realizan selecciones conducidas por afinidad en un tercer ciclo que usa rhDLL4 frío (en un exceso al menos de 100 veces sobre biot- rhDLL4). No se incluyen selecciones en DLL4 murino debido a que (la conservación de) la reactividad cruzada se evalúa al nivel de exploración. Los mutantes individuales se producen como proteína recombinante que usa un vector de expresión de pUC119, que contiene el promotor LacZ, un gen de resistencia para ampicilina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder ompA (pAX50). Las células TG1 de E. coli se transforman con la biblioteca del vector de expresión y se siembran en placas de agar (LB + Amp + glucosa 2%). Se toman colonias sencillas de las placas de agar y se dejan crecer en placas de 96 pocilios profundos de 1 mi. La expresión de VHH se induce mediante la adición de IPTG (1 mM). Los extractos periplásmicos (en un volumen de ~ 80 µ?) se preparan de acuerdo con métodos convencionales y se exploran con respecto a la unión con DII4 humano y de ratón recombinante en un ensayo de constante de disociación ProteOn (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos). Brevemente, una microplaca Sensora de GLC ProteOn se recubre con DII4 humano recombinante en los "canales de ligando" L2 y L4 (con L1/L3 como canal de referencia), mientras que los "canales de ligando" L3 y L6 se recubren con DII4 de ratón. El extracto periplásmico de clones madurados por afinidad se diluye a 1/10 y se inyecta a lo largo de los "canales de analito" A1-A6. Se calcula una constante de disociación media de los clones de tipo silvestre presentes en la placa y sirven como referencia para calcular las mejoras en la constante de disociación.
En un segundo ciclo, se crea una biblioteca combinatoria mediante la selección aleatoria simultánea de posiciones susceptibles identificadas en el ciclo uno. Para esto, se sintetiza ADNc de DLLBII101 G8 o DLLBII115A05 de tamaño completo mediante PCR de solapamiento usando oligonucleótidos degenerados (NNS) en las posiciones seleccionadas al azar y se realiza una PCR de rescate. Una lista de los cebadores usados para generar la biblioteca combinatoria puede encontrarse en la Tabla 14 y las SEC ID N°: 427 a 457. Los genes de VHH seleccionados al azar se insertan en un vector de presentación de fago (pAX50) usando sitios de restricción específicos como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 2). La preparación de extractos periplásmicos de clones individuales se realiza como se ha descrito anteriormente.
Tabla 14: Bibliotecas de maduración por afinidad de oligonucleótidos La exploración para unión con DII4 humano recombinante en un ensayo de constante de disociación ProteOn identifica clones con constantes de disociación mejoradas hasta 38 veces (DLLBII101 G08) y 1 1 veces (DLLBII115A05) (Tabla 15).
Tabla 15: Exploración de constante de disociación de clones madurados por afinidad de DLLBII101G08 y DLLBII115A05.
Las mejores variantes superiores de DLLBII101G08 y variantes de DLLBII115A05 se clonan en el vector de expresión pAX100 en fase con un marcador c-myc C terminal y un marcador (His)6. Las constantes de disociación de DM4 de ratón recombinante también se mejoran. Los VHH se producen en E. coli como proteínas marcadas con His6 y se purifican mediante IMAC y SEC. Las secuencias se representan en las tablas 16-A (LLBII101G08) y 16-B (DLLBII11A05), respectivamente.
Tabla 16-A Ejemplo 7 Caracterización de VHH purificados madurados por afinidad Las variantes maduradas por afinidad de los VHH DLLBII101G08 y DLLBII115A05 se expresan y purifican como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 6). Los VHH se caracterizan en el ELISA de unión de rhDLL1/rhJAG1 y FACS de hDII4/ rDII4/ cynoDII4 FACS (Ejemplo 5.8; Tabla 20; Figuras 12a -12d y 13a-13d), el ELISA de competición rhDII4 - rhNotcM (Ejemplo 5.1 ; Tabla 17; Figuras 10a-10b), el FMAT de competición de rhNotchl - CHO-hDII4 (Ejemplo 5.3; Tabla 18; Figuras 1 1 a-1 1 d).
Los datos de caracterización se resumen en la Tabla 21. En total, los VHH madurados por afinidad muestran claras mejoras en afinidad y potencia, mientras que su unión a rDII4 y cynoDIW se mantiene y no se observa unión a hDLL1 o hJAG1.
Tabla 17: Valores de CI5o (nM) para VHH madurados por afinidad en ELISA de competición hDLL4/hNotch1-Fc Tabla 18: Valores de CI5o (nM) de VHH madurados por afinidad purificados que bloquean la interacción de Notchl humano /Fe con DLL4 humano o de ratón expresado en células CHO (FMAT) Tabla 19: KD de afinidad (nM) de VHH madurados por afinidad purificados DLL4 humano y DLL4 de ratón recombinantes Tabla 20: Valores de CE50 (nM) de VHH madurados por afinidad con respecto a unión en CHO-hDLL4, CHO-rDLL4 y CHO-cDLL4 (FACS) Tabla 21: Características de VHH madurados por afinidad derivados DLLBII101G08 y DLLBII115A05 nu: no hay unión

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. - Una molécula de unión a DII4 que comprende al menos un dominio variable con cuatro regiones flanqueantes y tres regiones determinantes de complementariedad CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, en la que dicha CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en a. SEC ID N°: 1 a 166 y 458, b. SEC ID N°: 333 a 353, o c. SEC ID N°: 375 a 395.
2. - Una molécula de unión a DII4 de la reivindicación 1 , que es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina aislado o un polipéptido que contiene uno o más de dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina, en la que dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina consiste en cuatro regiones flanqueantes y tres regiones determinantes de complementariedad CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente y en la que dicho CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en a. SEC ID N°: 1 a 166 y 458, b. SEC ID N°: 333 a 353, o c. SEC ID N°: 375 a 395.
3. - Una molécula de unión a DII4 de la reivindicación 2, en la que dicho o dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina contienen, a. una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de un primer grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N°: 1 a 166, b. una CDR1 y una CDR2 con una secuencia de aminoácidos que está contenida, como se indica en la Tabla 5, como secuencia parcial en una secuencia seleccionada de un segundo grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 167 a 332 y 459, en la que una SEC ID N°: x de dicho primer grupo, para SEC ID N°: 1 - 166: corresponde a SEC ID N°: y de dicho segundo grupo en tanto que y = x +166.
4. - Una molécula de unión a DM4 de la reivindicación 2, en la que dicho o dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina contienen, a. una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de dicho primer grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 333 a 353, b. una CDR1 y una CDR2 con una secuencia de aminoácidos que está contenida, como se indica en la Tabla 16-A, como una secuencia parcial en una secuencia seleccionada de un segundo grupo de secuencias mostradas en SEC ID N°: 354 a 374, en la que una SEC ID N°: x de dicho primer grupo corresponde con SEC ID N°: y de dicho segundo grupo en tanto que y = x +2 .
5. - Una molécula de unión a DII4 de la reivindicación 2, en la que dicho o dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina contienen, a. una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de dicho primer grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 375 a 395, b.- una CDR1 y una CDR2 con una secuencia de aminoácidos que está contenida, como se indica en la Tabla 16-B, como una secuencia parcial en una secuencia seleccionada de un segundo grupo de secuencias mostradas en SEC ID N°: 396 a 416, en la que una SEC ID N°: x de dicho primer grupo corresponde a SEC ID N°: y de dicho segundo grupo en tanto que y = x +21.
6. - Una molécula de unión a DII4 de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que dicho o dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina son VHH.
7. - Una molécula de unión a DII4 de la reivindicación 6, en la que dicho o dichos VHH tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N° 167 a 332 y 459.
8.- Una molécula de unión a DII4 de la reivindicación 6, en la que dicho o dichos VHH tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N° 354 a 374.
9.- Una molécula de unión a DII4 de la reivindicación 6, en la que dicho o dichos VHH tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N° 396 a 416.
10. - Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido por maduración por afinidad de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina como se define en la reivindicación 3.
11. - Un VHH que se ha obtenido por maduración por afinidad de un VHH como se define en la reivindicación 7.
12. - Un VHH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N°: 356 y 358.
13.- Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido mediante humanización de un VHH definido en la reivindicación 12.
14. - Un VHH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias mostradas en SEC ID N°: 402, 407 y 416.
15. - Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido mediante humanización de un VHH definido en la reivindicación 14.
16. - Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido mediante humanización de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina como se define en la reivindicación 3.
17. - Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se ha obtenido mediante humanización de un dominio variable sencillo de inmuno-globulina como se define en la reivindicación 10.
18. - Una molécula de unión a DII4 de la reivindicación 1 , que se une a un epítopo de DII4 que está total o parcialmente contenido dentro del dominio EGF-2 que corresponde a los restos de aminoácidos 252-282 de SEC ID N°: 417.
19. - La molécula de unión a DII4 de la reivindicación 18, que es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o un polipéptido que contiene al mismo.
20. - Una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de unión a DII4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o un vector que contiene la misma.
21. - Una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 20.
22. - Una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión a DII4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 como el principio activo.
23. - La composición farmacéutica de la reivindicación 22 para el tratamiento de una enfermedad que está asociada con efectos mediados por DII4 en angiogénesis.
24. - La composición farmacéutica de la reivindicación 22 para el tratamiento de cáncer y enfermedades cancerosas.
25. - La composición farmacéutica de la reivindicación 22 para el tratamiento de enfermedades oculares.
26. - Un péptido que comprende una secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos mostradas en a. SEC ID N°: 1 a 166 y 458, b. SEC ID N°: 333 a 353, o c. SEC ID N°: 375 a 395.
27.- Una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de la reivindicación 26.
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