JP2023523981A - ＴＧＦβＲ２細胞外ドメイン短縮分子、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメイン短縮分子と抗ＥＧＦＲ抗体との融合タンパク質、及び融合タンパク質の抗腫瘍使用 - Google Patents

ＴＧＦβＲ２細胞外ドメイン短縮分子、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメイン短縮分子と抗ＥＧＦＲ抗体との融合タンパク質、及び融合タンパク質の抗腫瘍使用 Download PDF

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Abstract

短縮形態にある複数のタイプのTGFβR2、並びにTGFβR2及びEGFR抗体HPA8によって構築された融合タンパク質が提供される;抗体をコードする核酸(重鎖/軽鎖可変領域を含む)、並びに核酸を含むベクター、医薬組成物、及びキットも提供される;TGFβR2受容体タンパク質の調製された短縮形態と、標的EGFR及び他の複数のタイプの腫瘍標的抗体との融合タンパク質が更に提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年4月28日に出願された中国特許出願202010351280.6の利益を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、腫瘍免疫療法剤の分野に関する。具体的には、本発明は、短縮(truncated)TGFβR2(免疫調節因子)細胞外ドメイン分子、短縮(truncated)TGFβR2細胞外ドメイン分子と標的化部分とを含む融合タンパク質に関する。本発明は、医薬組成物、及び抗腫瘍医薬としてのそれらの適用を含む。
トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)は、細胞成長及び分化を調節するTGF-βスーパーファミリーに属し、自己分泌又は傍分泌の様式で細胞表面受容体シグナル伝達経路を通じて細胞増殖、分化、及びアポトーシスを調節する多面的且つ多機能性のサイトカインであり、細胞外マトリックスの合成、外傷の修復、及び免疫機能等において重要な調節的役割を果たす。3種のアイソフォームTGF-β1、TGF-β2、及びTGF-β3が哺乳類に存在し、最も豊富で且つ発現されるアイソフォームはTGF-β1である。TGF-βは、細胞膜表面にあるTGFβR1及びTGFβR2セリン-トレオニンキナーゼ受容体に結合することによって、下流シグナル伝達に対する古典的Smad及び非Smad経路を始動する[1]。TGF-βシグナル伝達は、インビボでの正常な恒常性において、様々な組織の成長、再生、分化等の主要なプロセスを調節する。TGF-βは、免疫系において、寛容を誘発し、炎症を抑制する。遺伝子変異は、腫瘍始原細胞におけるTGF-βシグナル伝達を変更し得る。TGF-βは、腫瘍発生の初期の段階において、細胞増殖を阻害し且つアポトーシスプログラムを誘発することによって、主要な癌阻害的役割を果たす。しかしながら、腫瘍が進行するにつれて、選択圧が、種々のメカニズムを通じた腫瘍細胞によるTGF-βの腫瘍抑制機能の喪失につながる。TGF-βシグナル伝達経路における後天性の不活性化変異は、多様な悪性細胞が、TGF-βに富む環境において成長することを可能にする。加えて、腫瘍細胞は、TGF-βのアポトーシス促進能を、浸潤及び遊走能、並びに間葉移行の促進等の腫瘍発達促進機能に何らかの形で変換する[2～4]。TGF-βは、多様な免疫細胞タイプ及び機能を調節する。TGF-βは、Treg細胞の増殖を直接促進し、故に、エフェクターT細胞及び抗原提示樹状細胞の産生及び機能を阻害することによって、適応免疫を制御する。TGF-βは、NK細胞機能も阻害し、マクロファージ及び好中球を腫瘍成長促進サブタイプに変換し、負の腫瘍免疫調節を有する腫瘍微小環境の形成を促進する[4]。TGF-β1は、EGFR陽性結腸直腸癌、非小細胞肺癌、及び頭頸部扁平上皮細胞癌腫を含めた多様な固形腫瘍において、通常の傍新生物(paraneoplastic)組織よりも高いレベルで発現されることが多い。臨床データは、TGF-β経路だけを遮断することは、腫瘍発生を抑制するように免疫系を完全に回復させるには十分ではなく、それ故、TGF-β抗体はまだ利用可能でないことを示唆する。
上皮成長因子受容体(EGFR)は、癌原遺伝子C-ErbB1の発現産物であり、上皮成長因子(EGF)の細胞増殖及びシグナル伝達に対する受容体であり、上皮成長因子受容体(HER)ファミリーのメンバーであり、チロシンキナーゼ受容体であり、170kDaの分子量を有する[5]。EGFRは、細胞外リガンド結合領域、膜貫通領域、及び細胞内キナーゼ領域に分けられる。EGFRの細胞外ドメインは、リガンドに結合した後に単量体から二量体に転換され、細胞内キナーゼ領域及び複数の下流シグナル伝達経路を活性化し、細胞成長、増殖、及び分化に重要な役割を果たす[6]。EGFRの高発現は下流シグナル伝達の増強を引き起こし、変異体EGFR受容体又はリガンドの発現の増加は、EGFRの持続的活性化、分泌ループの活性の増強、及び受容体下方調節メカニズムの混乱等につながり、今度は腫瘍増殖及び分化に関係した遺伝子を活性化し、腫瘍形成及び発達に重要な役割を果たす[7]。EGFR過剰発現は、頭頸部癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、及び食道癌を含めた、いくつかの癌タイプにおける生存率の低下と関連付けられる。加えて、抗EGFR医薬は、全生存期間、無増悪生存期間、及び全奏効率を含めた、結腸直腸癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、及び膵臓癌等のいくつかのタイプの固形腫瘍の治療に有効であることが示されている[8]。それ故、腫瘍増殖と関連した明確な標的として、EGFR標的剤は、多様な悪性腫瘍の一次治療選択肢になっている。
TGF-βによって始動されるシグナルは、EGF/EGFR経路によって始動されるものとは異なるものの、2つの間のシグナル伝達経路は相互作用し得る。TGF-β及びEGFRシグナル伝達は相互作用し、多様な腫瘍における腫瘍進行を連帯して促進することが見出されている。TGF-βは、高度に細胞タイプ及び状況特異的な様態でEGFRトランス活性化を誘導し得る。例えば、TGF-βは、古典的Smad及びERK/Sp1シグナル伝達経路を通じてEGFRを上方調節することによって、乳癌細胞(MDA-MB-231、T47D、4T1)の遊走及び浸潤を促進する[9、10]。TGF-βは、扁平上皮細胞癌腫(A431、SCC13)において、H2O2依存的メカニズムを通じてEGFR経路を活性化して、Erk1/2リン酸化レベルを増加させる[11]。EGF及びその関連する下流シグナル伝達経路も、種々の細胞タイプにおいてTGF-βシグナル伝達を調節し得る。例えば、EGFは、ヒト原発性卵巣癌細胞において、TGF-β誘導性細胞周期調節因子p15INK4BのmRNA発現を減少させることによって、TGF-βの抗増殖効果に対する卵巣癌細胞の感受性を低下させる[12]。乳房細胞及び肺上皮細胞における発癌性Rasは、Smad2及びSmad3の負の調節を介してTGF-β媒介性シグナル伝達を阻害することによって、TGF-βの細胞成長阻害効果を低下させる[13、14]。EGFは、ERK経路を通じてSmad2リン酸化を増加させることによって、COS7細胞においてSmad2シグナル伝達を正に調節もする[15]。
TGF-β及びEGFは、腫瘍の悪性表現型を相乗的に促進し、種々の組織に関する調査は、TGF-βと組み合わせたEGFが、上皮間葉移行(epithelial to mesenchymal transition)(EMT)を増強することを示している。例えば、EGF及びTGF-β1は、ラミニン(laminin)-332(ラミニン(Laminin)-332)の発現を促進して、口腔上皮癌におけるEMTを相乗的に促進する[16]。EGF及びTGF-β1は、PI3K、p38MAPK、JNK、又はAP-1経路よりもむしろMAPK経路を介してE-カドヘリンを下方調節することによって、腸上皮細胞におけるEMTを促進する[17]。EGF及びTGF-β1は、Smad及びMEK1/2依存的シグナル伝達経路を介してSlug及びSnail発現を誘導し、E-カドヘリンを下方調節し、卵巣上皮細胞におけるEMTを促進する[18]。EGF及びTGF-β1は、ERK1/2シグナル伝達経路を活性化し、Snailタンパク質発現を相乗的に上方調節し、ヒト腎皮質近位尿細管上皮細胞(HK-2)におけるEMT及び遊走を促進する[19]。EGFは、GAB1へのSHP2の結合を促進することによって、肺癌(H322、H358)及び膵臓癌(HPAF-II、CAPAN-2)細胞におけるTGF-β誘導性EMTを増強する[20]。
いくつかの臨床調査は、TGF-βレベルの上昇が、医薬耐性の発症及び予後不良と密接に関連することを示している。骨肉腫癌幹様細胞におけるTGF-β1誘導性EMTはmiR-499a発現を減少させ、AKT活性化EGFR非依存的状態へのTGF-β1誘導性EMT関連キナーゼスイッチと付随して生じるSHKBP1発現の増加につながり、それによってEGFR活性を低下させ、EGFRキナーゼ阻害剤に対する骨肉腫耐性を誘導する(図5)[21]。Treg細胞は、TGF-βを産生する主な細胞の1つである。セツキシマブで治療された頭頸部扁平上皮癌腫を有する患者の腫瘍におけるTregの数の増加は、TGF-β含有量の増加を伴い、一方で、セツキシマブ効力が乏しい患者におけるTGF-β含有量は更に高い[22]。TGF-βの上昇は、エフェクター細胞媒介性細胞傷害の関連分子エフェクターの発現を阻害し、EGFR非依存的AKT経路を活性化し、EMT誘導を増強することによって、EGFR抗体療法に対する耐性を誘導し得る[23]。古典的TGF-β/Smadシグナル伝達経路は、EGFR変異体非小細胞肺癌において、EGFRキナーゼ阻害剤に対するPD-L1誘導性腫瘍耐性の発症に関与する[24]。TGF-β発現は、乳癌組織において、EGFR発現と正に相関し、TGF-β及びEGFRのレベルの上昇は、乳癌患者における予後不良と関連していた[9]。要するに、EGFR及びTGF-βは、腫瘍発症のプロセスにおいて比較的非依存的で且つ密接に関係した役割を果たす。加えて、TGF-βは、EGFR標的療法に対する腫瘍における獲得耐性の発症における主要な分子である。動物調査は、TGF-βの阻害が、頭頸部扁平上皮細胞腫瘍異種移植片に対するセツキシマブのインビボ抗腫瘍効果を向上させることを示している[23]。これらは、TGF-β標的化を組み合わせて、EGFR陽性腫瘍に対するEGFR抗体の治療効力を増強するための理論的基礎を提供する。
本発明は、2つとも比較的非依存的で且つ密接に関係したシグナル伝達経路であるEGFR及びTGF-βの両方を特異的に標的にし得る短縮TGFβR2を含む新規の融合タンパク質を提供する。それを使用して、胃癌を含むがそれに限定されない固形腫瘍が治療される。
米国特許第5,500,362号 米国特許第5,821,337号 米国特許第6,737,056号 米国特許第4,816,397号 中国特許出願200610012002.8
Kabatら: Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5編、米国保健福祉省、PHS、NIH、NIH刊行物第91-3242号、1991年 Sambrook、Fritsch、及びManiatis(編)、Molecular Cloning; A Laboratory Manual、第2編、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1989) Ausubel, F. M.ら(編)Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates、(1989) O'Brien, P. M., & Aitken, R.(編)、Springer Science & Business Media. 2002; ISBN: 9780896037113
1つの態様において、本発明は、その天然形態と比較して、
a)少なくともその6～16位におけるアミノ酸残基が欠失し、更に任意選択で、その17～17+n位、(式中、nは1～10の整数であり;好ましくは、nは2、4、8、9、若しくは10であり;最も好ましくは、nは9である)におけるアミノ酸残基が欠失している;又は
b)6～26位におけるそのアミノ酸残基の欠失に基づいて、更に、5、4～5、3～5、2～5、1、1～2、1～3、若しくは1～4位におけるそのアミノ酸残基が欠失している;又は
c)7～26位におけるアミノ酸残基が欠失している、
短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子を提供する。
1つの実施形態において、アミノ酸配列は配列番号48～62のいずれかを含む。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される分子を含む融合タンパク質を提供する。
1つの実施形態において、融合タンパク質は、
a)短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、及び
b)標的化部分
を含む。
1つの実施形態において、融合タンパク質標的化部分は、抗体又はその抗原結合フラグメント、機能的リガンド又はそのFc融合タンパク質、及び受容体タンパク質又はそのFc融合タンパク質から選択される癌細胞特異的標的化部分である。
1つの実施形態において、融合タンパク質標的化部分は、抗EGFR抗体又はその抗原結合フラグメントである。
1つの実施形態において、融合タンパク質における短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子のN末端は、任意選択でリンカーによって、標的化部分の重鎖のC末端に連結されている。
1つの実施形態において、リンカーは、好ましくはG4Sフレキシブルペプチド(peptied)リンカー、好ましくは(G4S)4ペプチドリンカーである。
更なる態様において、本発明は、
(a)それぞれ配列番号19、20、及び21を含む重鎖CDR1、重鎖CDR2、及び重鎖CDR3ドメインを含む重鎖可変領域、並びに/又は
(b)それぞれ配列番号16、17、及び18を含む軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、及び軽鎖CDR3ドメインを含む軽鎖可変領域
を含む、EGFRへの単離された結合抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
1つの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
a)配列番号28を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域;及び/或いは
b)配列番号29を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
1つの実施形態において、抗体は、
a)配列番号30を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む重鎖定常領域;及び/或いは
b)配列番号31を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖定常領域
を更に含む。
1つの実施形態において、融合タンパク質の標的化部分は、抗EGFR抗体、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、イピリムマブ、又はパニツムマブから選択される。
1つの実施形態において、融合タンパク質は、
a)配列番号141を含む重鎖のアミノ酸配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列;及び
b)配列番号23を含む軽鎖のアミノ酸配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列
を含み、
それは2本の重鎖及び2本の軽鎖を含み;ジスルフィド結合は、その第1の軽鎖と第1の重鎖との間で形成され、ジスルフィド結合は、その第2の軽鎖と第2の重鎖との間で形成され、ジスルフィド結合は、その第1の重鎖と第2の重鎖との間で形成される。
1つの実施形態において、融合タンパク質は、ヒトEGFRタンパク質への結合アフィニティーに関して、2.92pM～26.3pM、好ましくは7pM～9pM、最も好ましくは8.77pMのKD値を有し;
ヒトTGF-β1タンパク質への結合アフィニティーに関して、23pM～288.3pM、好ましくは64pM～144pM、最も好ましくは96.1pMのKD値を有する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合フラグメント、及び付加的な治療剤を含むコンジュゲートであって、好ましくは抗体又はその抗原結合フラグメント及び付加的な治療剤はリンカーによって連結されている、コンジュゲートを提供する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸であって、それはmRNA及び/又はDNAである、核酸を提供する。
1つの実施形態において、核酸は、
配列番号32～39のいずれか1つ;
配列番号67～84のいずれか1つ;若しくは
配列番号148～163のいずれか1つ、又はその機能的バリアント
を含む。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される核酸を含む発現ベクターを提供する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される核酸又は本明細書に記載される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するための方法であって、前述のタンパク質分子の発現に適切な条件下で本明細書に記載される宿主細胞を培養する工程、及び培養培地から発現産物を回収する工程を含む、方法を提供する。
更なる態様において、本発明は、
a)本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載されるコンジュゲート、本明細書に記載される核酸、又は本明細書に記載される発現ベクター;及び
b)薬学的に許容される担体;任意選択で、
c)1種又は複数の他の治療剤
を含む医薬組成物を提供する。
更なる態様において、本発明は、癌の予防及び治療のための、好ましくは胃癌の治療のための、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載されるコンジュゲート、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載される発現ベクター、又は本明細書に記載される医薬組成物の使用を提供する。
更なる態様において、本発明は、癌の予防及び治療のための、好ましくは胃癌の治療のための医薬の調製のための、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載されるコンジュゲート、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載される発現ベクター、又は本明細書に記載される医薬組成物の使用を提供する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載されるコンジュゲート、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載される発現ベクター、又は本明細書に記載される医薬組成物と、1種又は複数の付加的な治療剤とを含む、薬学的組み合わせ物を提供する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載されるコンジュゲート、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載される発現ベクター、又は本明細書に記載される医薬組成物を含み;好ましくは、医薬を投与するためのデバイスを更に含む、キットを提供する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、本明細書に記載される融合タンパク質、本明細書に記載される抗体若しくはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載されるコンジュゲート、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載される発現ベクター、又は本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与する工程を含む、新生物疾患を予防する及び治療する方法を提供する。
組み換えヒトEGFR-Hisタンパク質へのマウス抗体EGFR-mhPA8の結合アッセイを示すグラフである。 マウス抗体EGFR-mhPA8による、EGFRへのEGF結合の遮断を示すグラフである。 マウス抗体EGFR-mhPA8による、MDA-MB-468細胞の増殖の阻害を示すグラフである。 組み換えヒトEGFR-Hisタンパク質へのヒト化抗体EGFR-HPA8の結合アッセイを示すグラフである。 ヒト化抗体EGFR-HPA8による、EGFRへのEGF結合の遮断を示すグラフである。 種々のリガンド条件下での、ヒト化抗体EGFR-HPA8による、MDA-MB-468細胞の増殖の阻害を示すグラフである。 種々のリガンド条件下での、ヒト化抗体EGFR-HPA8による、Fadu細胞の増殖の阻害を示すグラフである。 ヒト化抗体EGFR-HPA8によって媒介されるADCCの効果を示すグラフである。 胃癌細胞SNU-5皮下異種移植マウスの体重に対するEGFR-HPA8の効果を示すグラフである。 胃癌細胞SNU-5皮下異種移植マウスの腫瘍体積及びTGI結果に対するEGFR-HPA8の効果を示すグラフである。 非小細胞肺癌NCI-H1975細胞皮下異種移植マウスの体重に対するEGFR-HPA8の効果を示すグラフである。 非小細胞肺癌NCI-H1975細胞皮下異種移植マウスにおける腫瘍体積及びTGI結果に対するEGFR-HPA8の効果を示すグラフである。 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の概略的構造を示す図である。 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の分解の検出を示す図である。 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の分解傾向の検出を示す図である。 TGF-β1及びEGFRへの、EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の種々の短縮形態の結合能の検出を示すグラフである。 TGF-β1を中和する、EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質TGFβR2短縮EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の能力の検出を示すグラフである。 TGF-β3を中和する、EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質TGFβR2短縮EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の能力の検出を示すグラフである。 それぞれTGF-β1及びTGF-β3タンパク質に結合する融合タンパク質6の能力のアッセイを示すグラフである。 TGF-β1タンパク質又はTGF-β3タンパク質がそれぞれTGFβR2-Fcに結合するのを遮断する融合タンパク質6の能力のアッセイを示すグラフである。 融合タンパク質6の結合及び競合能のアッセイを示すグラフである。 組み換えヒトEGFRタンパク質に対する融合タンパク質6のアフィニティーアッセイを示すグラフである。 組み換えヒトTGF-β1タンパク質に対する融合タンパク質6のアフィニティーアッセイを示すグラフである。 Mv-1-lu細胞に対する融合タンパク質6によるTGF-β1の中和効果を示すグラフである。 レポーター遺伝子システムによってアッセイされた、融合タンパク質6によるTGF-β1の中和効果を示すグラフである。 融合タンパク質6によるMDA-MB-468細胞の増殖の阻害を示すグラフである。 ADCCの融合タンパク質6媒介性効果を示すグラフである。 非小細胞肺癌NCI-H1975細胞皮下異種移植マウスの体重に対する融合タンパク質6の効果を示すグラフである。 非小細胞肺癌NCI-H1975細胞皮下異種移植マウスにおける腫瘍体積に対する融合タンパク質6の効果を示すグラフである。 融合タンパク質6の限外濾過安定性アッセイを示すグラフである。 X/TGFβR2融合タンパク質の分解のアッセイを示す図である。 X/TGFβR2融合タンパク質の分解傾向のアッセイを示す図である。 TGF-β1へのX/TGFβR2融合タンパク質の結合能のアッセイを示すグラフである。 TGF-β1及びTGF-β3を中和するX/TGFβR2融合タンパク質の能力のアッセイを示すグラフである。 X部分標的へのX/TGFβR2融合タンパク質結合のアッセイを示すグラフである。
定義
別様に記述されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解される意味を有する。本発明の目的上、以下の用語が更に定義される。
本明細書において及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、「1つの」、「ある(a)」、「別の」、及び「前記」という単数形は、文脈上別様にはっきりと示されない限り、対象物の複数形の表示を含む。
タンパク質分子の「短縮」形態という用語は、タンパク質分子の天然形態と比較して改変された様式で、1つ又は複数のアミノ酸残基が欠けていることを意味する。
「融合タンパク質」という用語は、2種以上のタンパク質を組み合わせたタンパク質分子を指す。それは、通常、2種以上の遺伝子の配列を組み合わせたハイブリッド遺伝子を発現させ、それを発現フレームに従う形態で発現ベクターに挿入することによって獲得される。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指し、所望の生物学的活性を呈する任意の形態の抗体を指す。それは、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、及び多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、並びに更に抗体フラグメントを含むが、それらに限定されない。
「可変領域」という用語は、抗原への抗体結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖におけるドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域(それぞれ、VH及びVL)は、一般的に同様の構造を有し、より保存された領域(フレームワーク領域(FR)と呼ばれる)が散在した高度可変領域(相補性決定領域(CDR)と呼ばれる)に更に細分され得る。
所与の抗体の相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)は、Kabatシステム(Kabatら: Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5編、米国保健福祉省、PHS、NIH、NIH刊行物第91-3242号、1991年)を使用して特定され得る。
「定常領域」という用語は、抗体-抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害等の多様なエフェクター機能を呈する、抗体の軽鎖及び重鎖におけるそのようなアミノ酸配列を指す。
「抗体の抗原結合フラグメント」は、無傷抗体分子の一部分を含み、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持し、親抗体の抗原結合領域又は可変領域(例えば、1つ又は複数のCDR)の少なくとも一部分を典型的に含む。抗原結合フラグメントの例は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fdフラグメント、Fd'フラグメント、単鎖抗体分子(例えば、scFv、di-scFv、若しくはtri-scFv、2つの部分からなる(bipartite)抗体、又はscFab)、及び単一ドメイン抗体を含むが、それらに限定されない。
「コンジュゲート」という用語は、小分子でも生体分子でも、別の分子と共有結合性又は非共有結合性連結を形成する生物学的に活性のあるタンパク質又はペプチド分子を指す。
「モノクローナル抗体」という用語は、抗体の実質的に均一な集団、すなわち、ごく少量で存在し得る考え得る変異(例えば、天然変異)を除いて、互いに同一の均一な抗体を含む集団に由来する抗体を指す。故に、「モノクローナル」という用語は、抗体の性質、すなわち非関連抗体の混合物でないことを示す。異なる決定クラスター(エピトープ)に対して異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の別個の決定クラスターに向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらに通常他の抗体が混入していないという利点を有する。「モノクローナル」という用語は、抗体を産生する任意の特定の方法を要すると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体という用語は、具体的には、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を含む。
抗体は、腫瘍関連抗原タンパク質(本明細書では、EGFR)等の標的抗原に「特異的に結合する」、すなわち、抗体が治療剤として使用されることを可能にする十分なアフィニティーで抗原に結合し、抗原を発現する組織又は細胞を標的にし、且つ他のタンパク質との、又は上で言及される抗原標的のホモログ及びバリアント(例えば、変異体形態、スプライスバリアント、又はタンパク質加水分解短縮形態)以外のタンパク質との有意な交差反応性がない。
「結合アフィニティー」という用語は、分子の個々の結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。別様に指定されない限り、本明細書において使用される「結合アフィニティー」とは、結合ペアのメンバー(例えば、抗体及び抗原)間の1:1の相互作用を反映する固有の結合アフィニティーを指す。「KD」、「結合速度定数kon」、及び「解離速度定数koff」は、分子(例えば、抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)との間のアフィニティー、すなわちリガンドが特定のタンパク質にどれだけ強固に結合するかを記載するためによく使用される。結合アフィニティーは、2つの分子間の水素結合、静電相互作用、並びに疎水性及びファンデルワールス力等の非共有結合性分子間相互作用によって影響される。加えて、リガンドとその標的分子との間の結合アフィニティーは、他の分子の存在によって影響され得る。アフィニティーは、本明細書に記載されるELISAを含めた、当技術分野において公知の従来の方法によって分析され得る。
「標的化部分」という用語は、標的細胞への特異的結合の機能を有する、融合タンパク質の部分を指す。該用語は、標的細胞に特異的に結合する抗体及び他の天然(例えば、受容体、リガンド)又は合成(例えば、DARPin)分子を含む。本明細書において使用するとき、「標的細胞に特異的に結合する」とは、該部分が、複合混合物内の標的細胞に優先的に結合することを示す。
「単離された生体分子」とは、同定されており、該分子を天然に発現する細胞から単離されている生体分子である。単離された生体分子は、組み換え細胞におけるインサイチュ生体分子、並びに典型的には少なくとも1つの精製工程によって調製される生体分子を含む。
「受容体」という用語は、細胞外シグナル(すなわち、「リガンド」という用語)を特異的に認識し且つ結合し、細胞内に特異的効果をもたらす分子のクラスを指す生化学的概念である。細胞代謝又は細胞運動性を変更する等、もたらされる効果は、ほんの短期間続き得る。それは、1種又は複数の遺伝子の発現を上方又は下方調節する等、長続きする効果でもあり得る。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ADCC」とは、ある特定の細胞傷害性細胞(例えば、NK細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するFcγ受容体への分泌Ig結合により、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原担持標的細胞に特異的に結合し、その後、例えば細胞傷害性作用物質を使用して標的細胞を殺傷することが可能となる、細胞傷害の形態を指す。標的抗体のADCC活性を査定するために、米国特許第5,500,362号若しくは第5,821,337号、又は米国特許第6,737,056号(Presta)において実証されるインビトロADCCアッセイ、本出願の実施形態において実証される方法等、インビトロADCCアッセイが実施され得る。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、PBMC及びNK細胞を含む。
本発明の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子と標的化部分とを含む融合タンパク質
全長TGFβR2細胞外ドメインのN末端部位7～15の間には、複数の感受性部位が存在する。融合タンパク質の構造的安定性を向上させるために、本発明者らは、種々の(deferent)数のアミノ酸の欠失によって、TGFβR2の細胞外ドメインのN末端アミノ酸配列を改変した。15種の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子を獲得した。
本発明者らは、融合タンパク質の標的化部分として、それらの新たに単離されたEGFR抗体であるEGFR-HPA8、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、イピリムマブ、又はパニツムマブ、及び融合タンパク質の免疫調節部分として短縮TGFβR2タンパク質細胞外ドメイン分子を使用した。短縮TGFβR2タンパク質細胞外ドメイン分子は、相同組み換え法によって、EGFR抗体の重鎖のC末端に連結され、2本の鎖、すなわちEGFR抗体の軽鎖及び重鎖と、TGFβR2細胞外ドメインとを含む融合タンパク質(EGFR/TGFβR2)が形成され、その構造は図13に示される。EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質において、EGFR抗体の重鎖C末端のアミノ酸は、(G4S)4リンカー(配列番号66)によって、種々のアミノ酸欠失形態のTGFβR2の細胞外ドメインに連結する。加えて、EGFR抗体の重鎖C末端のリジン残基を除去して、タンパク質分解のリスクを低下させる。
本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質6は、ヒトEGFRタンパク質に対する高い結合アフィニティーを保持し、ヒトEGFRタンパク質に対する結合アフィニティーに関して8.77pMのKD値、1.68E+06M-1s-1の結合定数kon値、及び1.47E-05s-1の解離定数kdisを有する。加えて、短縮TGFβR2を有する融合タンパク質6は、96.1pMのkD値、1.53E+06M-1s-1の結合定数kon値、及び1.47E-04s-1の解離定数kdisを有して、全長TGFβR2を有する融合タンパク質1とヒトTGF-β1タンパク質に対する同様のアフィニティーを有する。
本発明の核酸
本発明は、本発明の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、短縮分子と標的化部分とを含む融合タンパク質を含む分子、又はそれらの一部分をコードする核酸にも関する。これらの核酸分子の一部の例となる配列は、配列(sequential)表に示される。
本発明の核酸分子は、本明細書に開示される配列に限定されず、mRNA、cDNA、及びそのバリアント等、そのバリアント及び他の相当する核酸形態も含む。本発明のバリアントは、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性を参照して記載され得る。当業者であれば、核酸ハイブリダイゼーション技法を使用し、核酸を使用してそれらの相補体並びにそれらの等価物又は同族体を同定し得ることを認識するであろう。
組み換えベクター及び発現
本発明は、本発明の1種又は複数のヌクレオチド配列を含む組み換え構築物も提供する。本発明の組み換え構築物は、ベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、又はウイルスベクターとともに使用され得、本発明の抗体をコードする核酸分子はベクターに挿入される。
本短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、標的化部分、短縮分子と標的化部分とを含む融合タンパク質は、宿主細胞における該分子又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列の組み換え発現によって調製され得る。該分子又はタンパク質は、1種を上回るアミノ酸配列を含有し得、組み換え法によって複数のアミノ酸配列を発現させるために、コードヌクレオチド配列を運ぶ1種又は複数の組み換え発現ベクターを、複数のアミノ酸配列が宿主細胞において発現されるように、宿主細胞を用いてトランスフェクトし得る。標準的な組み換えDNA方法論を使用して、該分子又はタンパク質をコードする核酸を調製し且つ/又は獲得し、これらの核酸を組み換え発現ベクターに組み入れ、該ベクターを宿主細胞に導入する、例えばSambrook、Fritsch、及びManiatis(編)、Molecular Cloning; A Laboratory Manual、第2編、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1989)、Ausubel, F. M.ら(編)Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates、(1989)、並びにBossらによる米国特許第4,816,397号において実証されたもの。
原核宿主細胞の例は細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫、又は哺乳類細胞である。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル、及び発現が構成的又は誘導性であるかどうか等、多様な因子によって影響されることが理解されるべきである。
本発明の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、標的化部分、及び融合タンパク質は、周知の方法によって組み換え細胞培養物から回収され得且つ精製され得、該周知の方法は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、プロテインGアフィニティークロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含むが、それらに限定されない。高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)も精製に使用され得る。
使用
本発明の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、抗体、及び融合タンパク質を使用して、胃癌等の癌を治療し得る。
医薬組成物
本発明の短縮分子、融合タンパク質、抗体及び抗原結合フラグメント、短縮分子-医薬コンジュゲート、融合タンパク質-医薬コンジュゲート、コンジュゲート、核酸、並びに担体のうちの1種又は複数の種類を、少なくとも1種の他の化学的作用物質を用いて調製して、上で記載される前述の活性成分、及び1種又は複数の医薬に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む;任意選択で、1種又は複数の他の治療剤も含み得る、医薬組成物を形成し得る。
試薬キット
本発明は、1つ又は複数の容器を含む薬学的パッケージング及びキットであって、容器は、上で言及される本発明の医薬組成物を含有する、薬学的パッケージング及びキットにも関する。そのような容器と関連付けられるものは、医薬又は生物学的製品の製造、使用、又は流通を取り締まる政府機関によって指示された形態で助言され(tip)得、それは、該製品が製造される、使用される、又は流通する、機関によるヒト投与の承認を反映する。
調製及び保管
本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の様式で、例えば混合、溶解、顆粒化、粉砕、乳化、カプセル化、カプセル化、又は凍結乾燥の従来の方法によって調製され得る。
許容される担体において製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ得、適応される病状の治療に対してラベル付けされ得る。そのようなラベル付けは、医薬の量、頻度、及び投与の方法を含むであろう。
医薬組み合わせ物
上で記載される本発明の抗体を含む組み合わせ物は、1種又は複数の他の治療剤とも組み合わされ、結果として生じた組み合わせ物は、許容されない悪影響を引き起こさない。
以下の実施形態は、本発明を例示的に説明するために使用され、本発明を限定することを意図されるものではない。
(実施例1)
ファージ抗体ディスプレイライブラリーを使用した、EGFRへのEGFの結合を遮断するマウス抗体についてのスクリーニング
1.1 マウス免疫付与及びファージ抗体ライブラリースクリーニング
マウスに、核酸プラスミドpCMV3-mFlt3L(Sinocelltech Limited社によって構築されたG12FE5S01-D、配列番号142)及びpCMV3-mCSF2(Sinocelltech Limited社によって構築されたG12FE5S02-D、配列番号143)を用いて免疫付与した。具体的な方法は以下のとおりである:最初の免疫付与の2日前に、マウスに、筋肉内へのカルディオトキシン10Mを用いて免疫付与した。1:1の質量比を有する20g/脚のpCMV3-mFlt3L及びpCMV3-mCSF2混合物を筋肉内に注射し、各免疫付与に対して3日後に30g/脚のpGS6-EGFR-TT-WPRE(Sinocelltech Limited社によって構築された、配列番号144)を筋肉内に注射した(第4及び第5の免疫付与に関しては、順番に2週間、2週間、2週間、及び2週間の免疫付与間隔で、EGFRを過剰発現する5×106個の昆虫細胞の腹腔内注射)。第3の免疫付与以降、各免疫付与の7日後に、目の内眼角神経叢(medial canthal plexus)を介して血液を収集した。組み換えヒトEGFRタンパク質(供給元:Sino Biological, Inc.社、Cat. 10001-H08B、以後同じ)をコートして、マウスにおける抗EGFRの血清力価を検出した。第5の免疫付与(immzation)血清は、免疫血清力価が8000倍且つ血清力価OD>1に到達する基準を達成し、次いで、5×106個のMDA-MB468細胞を使用した腹腔内ブースター注射を20日間の間隔で実施し、7日後にマウスを屠殺し、脾臓組織を液体窒素中で凍結した。
RNA抽出のために、マウス脾臓組織を、TriPure Isolation Reagent(供給元:Roche社 Cat. No. 11 667 165 001)を用いて抽出し、逆転写キットTriPure Isolation Reagent(供給元: Invitrogen社 Cat. No. 18080-051)を用いた逆転写によってcDNAを獲得し、PCR増幅を実施して、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を獲得し、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、オーバーラップ伸長スプライシングPCRによって、scFvをコードするヌクレオチド配列にスプライスし、軽鎖及び重鎖可変領域をリンカー:
TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(配列番号2)
によって連結し[25]、次いで、制限エンドヌクレアーゼSfi I(供給元:Fermentas社)によってファージベクターpComb3x(供給元:Sino Biological, Inc.社)にライゲートし、X-Blueコンピテント細胞を電気的に形質転換する(electrotransforming)ことによって、免疫付与マウスに対するファージディスプレイscFv抗体ライブラリーを構築した。組み換えヒトEGFRタンパク質をELISAプレートにコートし、抗EGFR陽性抗体富化ファージライブラリーを、ファージ抗体パンニングプロセスによって獲得した。その後、上記ライブラリーをMDA-MB-468細胞(供給元:Cell Resource Center、中国科学院上海生命科学研究院)と混合し、MDA-MB-468細胞に対する陽性抗体について富化されたファージライブラリーを、ファージ抗体パンニングプロセスに従って上記ライブラリーからスクリーニングした(O'Brien, P. M., & Aitken, R.(編)、Springer Science & Business Media. 2002; ISBN: 9780896037113)。ファージのコロニーを富化ライブラリーから選択し、発現させ、組み換えヒトEGFRタンパク質への結合をELISAによって検出し、組み換えヒトEGFRへの特異的結合を有する高結合性抗体EGFR-mhPA8 scFv抗体クローンをスクリーニングし、シーケンシングのためにシーケンシング企業に送って、EGFR-mhPA8 scFv抗体のヌクレオチド配列(配列番号3)を獲得した。
1.2 EGFRを標的にするマウス抗体の機能的アッセイ
1.2.1 マウス抗体結合及びリガンド競合機能
ELISAを使用して、組み換えヒトEGFRタンパク質へのマウス抗体の結合能を検出した。種々の濃度(1.37ng/mL、4.12ng/mL、12.35ng/mL、37.04ng/mL、111.11ng/mL、333.33ng/mL、1000ng/mL、及び3000ng/mL)で組み換えヒトEGFR-Hisタンパク質(供給元:Sino Biological, Inc.社、以後同じ)を96ウェルプレートにコートし、ウェルあたり100Lを4℃で一晩コートした。プレートを翌日洗浄し、室温で1時間ブロッキングした。EGFR-mhPA8及び陰性対照抗体H7N9-R1(供給元:Sinocelltech Limited社、以下同じ)を13.89nMで添加し、1時間インキュベートし、その後にプレートを洗浄して、結合していない抗体を除去した。二次抗体ヤギ抗hIgG F(ab)2/HRP(供給元:Jackson ImmunoResearch社、Cat. 109-036-006、以下と同じ)を添加し、1時間インキュベートし、プレートを繰り返し洗浄し、発色現像のために基質発色溶液を添加し、停止後にOD450をマイクロプレートリーダーによって読み取る。水平座標として組み換えヒトEGFR-Hisタンパク質濃度、及び垂直座標としてOD450読み取りを使用して、S曲線をフィットさせ、組み換えヒトEGFR-Hisタンパク質への抗体結合のEC50を、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して分析した。結果は図1に示される。ヒト-マウスキメラ抗体EGFR-mhPA8は、128.7ng/mLのEC50及びR2=1.000を有して、組み換えヒトEGFR-Hisに有効に結合し得る。陰性対照H7N9-R1は、組み換えヒトEGFR-Hisタンパク質に結合しなかった。
本実施例は、EGFRリガンド-受容体結合を遮断するEGFR-mhPA8の能力をFACSによって更に分析した。3×105個のMDA-MB-468細胞を、217.1nMの最終濃度の10μLのビオチン標識EGF-Fcタンパク質(供給元:Sino Biological, Inc.社)とともに添加した。2～8℃で30分間のインキュベーションの後に、306.74nM、102.25nM、34.08nM、及び11.36nMの最終濃度でEGFR-mhPA8抗体を添加し、H7N9-R1を陰性対照抗体として使用した。混合し、2～8℃で20分間インキュベートし、次いでPBSで洗浄し、遠心分離して、結合していない抗体及びリガンドを除去する。ストレプトアビジン-488-FITC二次抗体(供給元:Sino Biological, Inc.社、以下同じ)を添加し、2～8℃で1時間インキュベートする。洗浄及び遠心分離を繰り返して、コンジュゲートしていない二次抗体を除去する。最後に、200μL PBSを添加して細胞を再懸濁し、フロースルー検出のための流管に400メッシュフィルターを通して濾過した。結果は図2に示され、EGFR-mhPA8は、濃度勾配で、MDA-MB-468細胞上のEGFRへのEGF-Fcタンパク質の結合を有効に遮断し得る。
1.2.2 マウス抗体による、MDA-MB-468細胞の増殖の阻害
乳癌MDA-MB-468細胞は、EGFRを高発現し、EGFRの多様なリガンド因子も自己分泌する。本実施例では、MDA-MB-468細胞に対するマウス抗体の成長阻害機能をWST-8アッセイによって判定した。
MDA-MB-468細胞を、96ウェルプレートに5×103個/ウェルで均一に接種した。細胞をCO2インキュベーターにおいて3時間インキュベートし、種々の濃度のマウス抗体EGFR-mhPA8(66.7nM、22.2nM、7.4nM、2.5nM、0.82nM、0.27nM、0.093nM、0.033nM、及び0.013nM)を添加した。陰性対照M群(細胞を含有する)及びブランク対照B群(培地のみ、細胞なし)も使用した。細胞を37℃及び5% CO2でCO2インキュベーターにおいて5日間インキュベートし、次いでWST-8を15μL/ウェルで添加した。240分間のインキュベーションの後、OD450～OD630をマイクロプレートリーダーによって測定し、検出ブランクウェルBの読み取り値を差し引くことによって、マウス由来抗体の阻害率を算出した。阻害率=(M群のOD-サンプルのOD)/(M群のOD)×100%、定量的な効力曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して分析し且つプロットし、水平座標は抗体濃度であり、垂直座標は阻害率である。図3に示されるように、EGFR-mhPA8は、MDA-MB-468の増殖を有効に阻害し、阻害率は、「S」曲線で、増加する医薬濃度とともに増加した。EGFR-mhPA8は、2.78nMのEC50及びR2=0.991を有して、MDA-MB-468細胞を阻害した。
(実施例2)
マウス抗体EGFR-mhPA8のヒト化、及びヒト化抗体のエクスビボ特徴付け
2.1 マウス抗体mhPA8のヒト化及び産生
EGFR-mhPA8抗体のヌクレオチド配列を推測して、EGFR-mhPA8 scFv抗体の重鎖(配列番号8)及び軽鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号9)を獲得した。それぞれEGFR-mhPA8 scFv軽鎖及び重鎖に対する3つのCDRのアミノ酸配列を、Kabat[26]及びIMGT番号付け手法を参照して判定した、配列番号10～15を参照されたい。Kabat番号付けに従って、LCDR2における52位でのNのDへの変異を除いて、上で言及される軽鎖及び重鎖のそれぞれ3つのCDRを、後続のヒト化工程において移植し、最終ヒト化抗体EGFR-HPA8 scFvにおいて保持した。
Figure 2023523981000002
マウス抗体のヒト化を、古典的CDRグラフト法を使用して実施した[27、28]。マウス抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の両方と50%超のアミノ酸配列類似性である抗体、並びにそれぞれ改変されるマウス抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のフレームワーク領域と50%超のアミノ酸配列同一性である抗体を、ヒト化鋳型ライブラリーとして選択した。改変される抗体の可変領域と最も高い空間的類似性を有するヒト抗体を、ヒト化鋳型として選択した。マウス抗体の軽鎖又は重鎖の3つのCDR配列を、ヒト化鋳型における相当するCDRアミノ酸配列で置換し、変異配列において脱アミドのリスクが高いアミノ酸NG、NS、NA、及びNTを、抗体の化学的安定性を向上させ且つ生物学的機能を維持するために変異に供した。ヒト化抗体のアフィニティーをELISAによってアッセイし、アフィニティーを維持するヒト化抗体を選択する。本実施例においてEGFR-mhPA8のグラフトされた軽鎖可変領域に使用されたヒト化鋳型は、EGFR-mhPA8の軽鎖と68.4%の相同性を有するIGKV1-NL1*01であり、重鎖可変領域に対するヒト化鋳型は、EGFR-mhPA8の重鎖と64.9%の相同性を有するIGHV1-69-2*01である。脱アミドしやすいヒト化抗体EGFR-HPA8可変領域LCDR2のN52をDに変異させる。
マウスフレームワーク領域の主要な部位は、CDR空間的構造の安定性を維持するために必須であることから、主要な部位は、マウス抗体の相当するアミノ酸に復帰変異(reverse mutate)されるべきである。Kabat番号付けに従って、軽鎖を、45位でQ、48位でI、74位でK、及び76位でDに復帰変異させ、重鎖を、38位でK、48位でI、及び70位でLに復帰変異させた。ヒト化抗体EGFR-HPA8を、CDRヒト化グラフト及びフレーム領域復帰変異によって獲得し、その重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号22/23に示され;シグナルペプチドを含有するその重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号24/25に示され、逐次的に連結された重鎖/軽鎖シグナルペプチド(配列番号26/27)、そのヒト化抗体の重鎖/軽鎖の可変領域(配列番号28/29)、及びそのヒト化抗体の定常領域、つまりIgG1重鎖定常領域/ヒトカッパ軽鎖定常領域(配列番号30/31)のアミノ酸配列;並びにTable 2(表2)に詳述されるそのヒト化CDRの配列を含有する。
Figure 2023523981000003
逐次的に連結された軽鎖シグナルペプチドヌクレオチド配列(配列番号35)、ヒト化抗体軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(配列番号37)、及びヒトカッパ軽鎖定常領域ヌクレオチド配列(配列番号39)を含有する、シグナルペプチド含有EGFR-HPA8抗体軽鎖ヌクレオチド配列(配列番号33)を、スプライシングPCRによって増幅した。上記PCR産物を、インフュージョン法によってpSTEP2ベクター(供給元:Sinocelltech Limited社によって構築された、以下同じ)(Hind III+Xba Iによって二重消化された)に挿入し、正しいプラスミドをシーケンシングによって検証した。EGFR-HPA8抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号36)を全遺伝子合成によって獲得し、重鎖シグナルペプチドのヌクレオチド配列(配列番号34)及びヒトIgG1の重鎖定常領域のヌクレオチド配列(配列番号38)を含有するpSTEP2ベクター(Sca I+Nhe I二重消化後)にインフュージョン法によって挿入し、正しいEGFR-HPA8軽鎖-重鎖発現ベクターをシーケンシングによって検証した。プラスミド抽出及びHEK-293細胞(fut8ノックアウト)のトランスフェクションの後、細胞を培養し、7日間発現させ、細胞上清を遠心分離後にアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、クロマトグラフィー媒体は、Fcと相互作用するプロテインA充填であった。プロテインAクロマトグラフィーカラムを、カラム体積の5～10倍の50mM Tris、10mM NaCl、及びpH8.0バッファーで平衡化した後、濾過された培養上清を、結合のためにクロマトグラフィーカラムに添加し、カラムを、カラム体積の5～10倍の20mM Tris、0.3M Arg、pH6.5バッファーで浸し、次いでカラムを、0.1M Gly、10mM NaCl、pH3.5溶出バッファーでリンスし、収集されたサンプルを2M Tris(pH8.0)で中和して、高純度且つ高品質のADCC増強EGFR-HPA8抗体を獲得した。
シグナルペプチドを含有するEGFR-HPA8抗体軽鎖のスプライシングPCR増幅のためのプライマー配列
Figure 2023523981000004
EGFR-HPA8抗体重鎖可変領域の全遺伝子合成のためのプライマー配列
Figure 2023523981000005
2.2 ヒト化EGFR-HPA8抗体のインビトロ特徴付け
2.2.1 ヒト化抗体特異的結合及びリガンド競合アッセイ
実施例1.2.1を参照して、組み換えヒトEGFRタンパク質へのヒト抗体の結合能を、ELISAを適用することによって検出し、同時にSCT200(中国特許出願200610012002.8において実証された、以下同じ)、アービタックス(Erbitux)(MERCK、201621、以下同じ)、及び陰性対照を設定した。図4に示されるように、組み換えヒトEGFR-Hisに特異的に結合するヒト化EGFR-HPA8抗体に対するEC50は116.6ng/mL、R2=1.000;SCT200に対するEC50は166.5ng/mL、R2=1.000;アービタックスに対するEC50は253.6ng/mL、R2=1.000であり;陰性対照H7N9-R1は結合しなかった。結果は、EGFR-HPA8が、SCT200及びアービタックスよりも、組み換えヒトEGFR-hisに結合するより優れた能力を有することを示した。
その一方で、EGFRリガンド-受容体結合を遮断するヒト化抗体EGFR-HPA8の能力を、実施例1.2.1を参照してFACSによって分析し、SCT200、アービタックス、及び陰性対照を設定した。結果は図5に示され、MDA-MB-468細胞上のEGFRへのEGF-Fcタンパク質の結合を遮断するEGFR-HPA8の能力は、SCT200及びアービタックスよりも強い。
2.2.2 ヒト化抗体による種々の腫瘍細胞増殖の阻害
2.2.2.1 MDA-MB-468細胞の増殖を阻害するヒト化抗体の能力
MDA-MB-468細胞を、96ウェルプレートに5×103個/ウェルで均一に接種した。細胞をCO2インキュベーターにおいて3時間インキュベートし、種々の濃度のヒト化抗体EGFR-HPA8(666.7nM、222.2nM、74.1nM、24.7nM、8.23nM、2.74nM、0.91nM、0.31nM、及び0.1nM)を添加し、SCT200及びアービタックスを対照として使用した。次いで、リガンド、8ng/mLの最終濃度のHB-EGF(供給元:Sino Biological, Inc社.、以下同じ)、200ng/mLの最終濃度のBTC-Fc(供給元:Sino Biological, Inc.社、以下同じ)、又は1μg/mLの最終濃度のFc-EREG(供給元:Sino Biological, Inc.社、以下同じ)をそれぞれ添加した。細胞を37℃及び5% CO2でCO2インキュベーターにおいて5日間インキュベートし、次いでWST-8を15μL/ウェルで添加した。240分間のインキュベーションの後、OD450～OD630をマイクロプレートリーダーによって測定し、抗体による細胞の成長阻害率を算出した。抗体なしのリガンドの添加をM群として使用した。阻害率=(M群のOD-サンプルのOD)/(M群のOD)×100%、定量的な効力曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して分析し且つプロットし、水平座標は抗体濃度であり、垂直座標は阻害率である。結果は図6A及びTable 3(表5)に示される。EGFR-HPA8は、リガンドなしの条件下で、SCT200及びセツキシマブ対照抗体よりもMDA-MB-468細胞の優れた成長阻害を示した。EGFR-HPA8は、SCT200と同様の最大阻害率を有したが、より低い成長阻害EC50を有した。実施例2.2.1の結果は、MDA-MB-468細胞上のEGFRへのEGF-Fcタンパク質の結合を遮断するEGFR-HPA8の能力が、SCT200及びアービタックスよりも強かったことを示す。本実施例では、MDA-MB-468細胞成長阻害アッセイにおいてEGFRの種々のリガンドを添加して、細胞の機能的レベルでEGFRリガンド-受容体結合を遮断するEGFR-HPA8の能力を更に検証した。結果は図6B～図6D及びTable 3(表5)に示される。EGFR-HPA8は、種々のリガンド条件下で、SCT200及びセツキシマブよりも優れてMDA-MB-468細胞の増殖を阻害した。
Figure 2023523981000006
2.2.2.2 Fadu細胞増殖を阻害するヒト化抗体の能力
Faduは、EGFRを高発現し、EGFRの多様なリガンド因子も自己分泌する、ヒト咽頭扁平上皮癌腫細胞系統である。実施例2.2.2.1を参照して、種々のリガンド条件下での、EGFR-HPA8抗体によるFadu細胞(供給元:Cell Resource Center、中国科学院上海生命科学研究院)の増殖の阻害を、WST-8アッセイによって測定した。結果は図7及びTable 4(表6)に示される。Fadu細胞に対するEGFR-HPA8の成長阻害能は、リガンドなしの条件下で、SCT200のものと同様であり、セツキシマブのものよりも優れており、一方でFadu細胞に対するEGFR-HPA8の成長阻害能は、種々のリガンド条件下で、SCT200及びセツキシマブのものよりも有意に優れていた。結果は、EGFR-HPA8抗体が、SCT200及びセツキシマブと比較して、EGFRリガンド-受容体結合を遮断するより優れた能力を有することを示した。
Figure 2023523981000007
2.2.3 ヒト化抗体ADCC効果
本実施例は、組み換えCD16aレポーター遺伝子システムを使用して、ヒト化抗体EGFR-HPA8媒介性ADCC効果を検出する。組み換えCD16aレポーター遺伝子システムは、エフェクター細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A、及びEGFRを発現する標的細胞を含む。2種の細胞を共培養し、EGFR抗体を同時に添加した場合、EGFR抗体のFabフラグメント(fragement)は、標的細胞の表面に発現したEGFRに結合し、そのFcフラグメントは、Fcγ受容体CD16aを過剰発現するエフェクター細胞に結合し得、それによってエフェクター細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16Aを活性化し、NFAT-RE媒介性生物発光を促進する。
標的細胞A431細胞(供給元:Cell Resource Center、中国科学院上海生命科学研究院)を、96ウェルプレートに1×104個/ウェルで均一に接種した。一晩のインキュベーションの後、種々の濃度の抗体(2.67nM、0.53nM、0.11nM、0.021nM、0.0043nM、0.00085nM、0.00017nM、及び0.000034nM)を40μL/ウェルで添加し、その後に1×105個のエフェクター細胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A(供給元:Sinocelltech Limited社、以下と同じ)40μL/ウェルが続き、3つの複製ウェルを各アッセイに使用した。標的細胞、エフェクター細胞、及び陰性抗体対照ウェルも使用した。細胞を37℃及び5% CO2でCO2インキュベーターにおいて4時間インキュベートし、Passive Lysis 5×バッファー20μL/ウェルを添加した。細胞を1回凍結融解し、プレートを振とうし且つ混合した後に、ウェルあたり20μLの上清を96ウェル白色底プレートに移し、発光検出をLB960-マイクロプレートルミノール検出器によって実施した。定量的な効力曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して分析し且つプロットし、水平座標はサンプルの濃度であり、垂直座標はRLU値であった。生物発光強度誘導乗数=サンプルRLU/陰性対照RLU。結果は図8に示される。EGFR-HPA8、陽性対照アービタックス及びSCT200は、EGFR発現A431腫瘍細胞に対して有効なADCC効果を媒介し得る。それらの中でも、EGFR-HPA8は、ADCCの誘導に関して0.008nMのEC50及びR2=0.999を有して、効果の半有効濃度及び誘導倍率において利点を有した。
2.3 マウスにおける、ヒト胃癌細胞株SNU-5及びヒト非小細胞肺癌株NCI-H1975皮下異種移植腫瘍に対するEGFR-HPA-8の効力
対数成長期のSNU-5細胞(ATCC細胞バンク)をPBSで洗浄し、0.25%トリプシンで消化し、消化物を収集し、その後に800r/分で5分間の遠心分離が続いた。細胞をPBSに再懸濁し、細胞濃度を5.0×107個の細胞/mLに調整した(50%のマトリックスゲルによる)。Balb/cヌードマウス(Beijing Viton Lever Laboratory Animal Technology Co.社)に、5.0×106個のSNU-5細胞懸濁液100μL/マウスを右背に皮下接種した。腫瘍体積が約170mm3に到達した後、各群において5匹のマウスで、マウスを腫瘍体積に従って7つの群に無作為に分けた。医薬を、グループ分けの日に腹腔内注射(I.P.)によって投与し、1週間に2回で連続7投薬与えた。具体的な投薬レジメンは、下のTable 5(表7)に示される。
Figure 2023523981000008
注記:投与体積は、マウスの体重に基づいて10mL/kgで算出された。
腫瘍成長阻害値(TGI)を、以下のように算出した:T/C(%)=TRTV/CRTV×100%(TRTVは処理群のRTVであり;CRTVは陰性対照群のRTVである)、相対的腫瘍体積RTV=VT/V0、V0はグループ分け、及び開始投薬日であるD0に測定された腫瘍体積であり、VTは毎回測定された腫瘍体積である。TGI(%)=1-T/C(%)。
すべての実験動物は良好な状態にあり、投与のコースを通じて体重のいくらかの増加を示した。溶媒対照と比較して、各投薬群におけるマウスの体重に有意な差はなかった(P>0.05)。すべての動物の体重の変化は、図9及びTable 6(表8)に示される。
Figure 2023523981000009
試行における各群に対する腫瘍体積及びTGI結果は、Table 7(表9)及び図10に示される。群投薬の31日後、ビヒクル群における平均腫瘍体積は559.9±144.9mm3であり、陽性対照SCT200低用量5mpk群においては、44.3%のTGIを有して317.1±197.6mm3であり、それはビヒクル群と有意に異ならなかった(P=11.28%)。EGFR-HPA8低用量5mpk群は、ビヒクル群と比較して有意な差である、113.8±74.0mm3の腫瘍体積及び80.0%のTGIを有してより優れた効力を示し(P<0.05)、EGFR-HPA8が、この用量において陽性対照SCT200よりもわずかに優れた腫瘍阻害特性を示すことを示した(P=0.09)。陽性対照SCT200 20mpk群における腫瘍体積は、66.5%のTGIを有して191.8±189.1mm3であり、それはビヒクル群と有意に異なった(P<0.05)。EGFR-HPA8高用量20mpk群における腫瘍体積は、68.9%のTGIを有して175.0±175.0mm3であり、それはビヒクル群と有意に異なった(P<0.05)。EGFR-HPA8及び陽性対照SCT200 20mpk群は、有意な腫瘍阻害効果を有し、2つの投与群の間で腫瘍体積の有意な差はなかった(P=0.9)。結論として、EGFR-HPA8分子は、5mpk及び20mpk用量レベルの両方で、SNU-5ヒト胃癌異種移植腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効力を示し、腫瘍阻害効果は、低用量においてSCT200よりもわずかに優れていた。
Figure 2023523981000010
EGFR-HPA8は、ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H1975皮下異種移植マウスモデルの腫瘍に対しても有意な腫瘍阻害効果を示した。Balb/cヌードマウスに、NCI-H1975細胞を右背に皮下接種し(Cell Resource Center、中国科学院上海生命科学研究院)、グループ分け及び投薬はTable 8(表10)に示される。
Figure 2023523981000011
注記:投与体積は、10mL/kgマウス体重であった。
すべての実験動物は良好な状態にあり、投与のコースを通じて体重のいくらかの増加を示し、溶媒対照と比較して、各投与群におけるマウスの体重に有意な差はなかった(P>0.05)。すべての動物の体重の変化は、図11及びTable 9(表11)に示される。
Figure 2023523981000012
試行における各群に対する腫瘍体積及びTGI結果は、Table 10(表12)及び図12に示される。グループ分け及び投薬の18日後、陽性対照SCT200及びEGFR-HPA8の高用量及び低用量群は、各投与群とビヒクル群との間で有意な腫瘍阻害効果及び腫瘍体積の統計的に有意な差を示した。18日目のビヒクル群における平均腫瘍体積は1564.3±529.0mm3であった。SCT200 5mpk及びEGFR-HPA8 5mpk処理後の腫瘍体積は、それぞれ90.4%及び94.5%のTGIを有して151.9±99.1mm3及び86.5±107.5mm3であった。SCT200 20mpk及びEGFR-HPA8 20mpk処理後の腫瘍体積は、それぞれ81.8%及び90.4%のTGIを有して289.8±321.4mm3及び149.3±94.9mm3であった。5mpk及び20mpkの両用量でのEGFR-HPA8は、陽性対照SCT200よりもわずかに優れた腫瘍阻害効果を示したが、統計的に有意な差はなかった。まとめると、これらの結果は、EGFR-HPA8分子が、NCI-H1975ヒト非小細胞肺癌異種移植腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効力を有することを示唆する。
Figure 2023523981000013
(実施例3)
TGFβR2の種々の短縮形態を含有するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の設計及び検査
3.1 TGFβR2の種々の短縮形態のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質発現ベクターの設計、タンパク質発現、及び精製
本実施例は、融合タンパク質の標的化部分として抗EGFR抗体、及び融合タンパク質の免疫調節部としてTGFβR2細胞外ドメインを使用する。TGFβR2細胞外ドメインは、相同組み換えによってEGFR抗体の重鎖のC末端に連結され、EGFR抗体/TGFβR2細胞外ドメイン融合タンパク質(EGFR/TGFβR2)は、軽鎖及び重鎖の2本の鎖によって形成される。融合タンパク質の構造は図13に示される。質量分析結果は、全長TGFβR2細胞外ドメインのN末端7～15部位の間に複数の感受性部位が存在することを示した。融合タンパク質の構造的安定性を向上させるために、本実施例において、TGFβR2の細胞外ドメインのN末端アミノ酸配列を、種々のアミノ酸残基数のアミノ酸欠失を用いて改変した(配列番号47～65)。EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質は、(G4S)4リンカー(配列番号66)を介して、種々のアミノ酸欠失形態を有するTGFβR2の細胞外ドメインにEGFR抗体の重鎖C末端のアミノ酸を連結する。加えて、EGFR抗体の重鎖C末端リジンを除去して、タンパク質分解のリスクを低下させた。EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質設計の具体的なプロトコールは、Table 11(表13)に示される。
Figure 2023523981000014
上記プロトコールにおいて、標的遺伝子をPCR又はオーバーラップPCRによって増幅し、インフュージョンによって発現ベクターにライゲートし、プラスミドをシーケンシング検証の後に別個に抽出し、HEK-293細胞(fut8ノックアウト)に一過性に移し、7日目まで培養した。上清を遠心分離し、収集する。遠心分離後の細胞上清を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製して、ADCC増強EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質を獲得した。
3.2 TGFβR2の種々の短縮形態を含有するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の分解
発現産物の純度並びに分解を、還元SDS-PAGEによって分析した。実施例3.1において精製された種々の短縮EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質1～16を、還元SDS-PAGEに供した。還元SDS-PAGEの具体的な工程:(1)SDS-PAGE調製:3.9%濃縮ゲル、13%分離ゲル;(2)サンプルを100℃で2分間煮沸し、遠心分離し、次いで8μgをサンプル化(sample)した;(3)40mAの定電流、1時間の電気泳動時間。結果は図14に示される。EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の軽鎖の分子量は約25KDaであり、重鎖の分子量は約66KDaであり、切り取り種(clipping species)の分子量は45～66KDaであった。結果は、TGFβR2の細胞外ドメインに明らかな切り取り種が存在し、一方でTGFβR2細胞外ドメインの種々の短縮形態融合タンパク質は、TGFβR2細胞外ドメインの全長形態融合タンパク質よりも、分解により生じる実質的により少ないバンドを有することを示した。故に、本発明において調製されたTGFβR2細胞外ドメインの種々の短縮形態は、TGF-β受容体含有抗体融合タンパク質の安定性を有意に増強した。
3.3 TGFβR2の種々の短縮形態を含有するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の分解特質
融合タンパク質プロセシングを加速させる293E細胞上清を使用して、EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の種々の短縮形態の安定性を更に評価する。抗体を発現させるためにしばしば使用される293E細胞発現システムは、細胞成長に要される多様な宿主細胞タンパク質(HCP)及びプロテアーゼを発現する。それ故、293E細胞の上清における融合タンパク質の分解傾向を観察することによって、抗体の安定性を査定し得る。
精製された融合タンパク質を、1:0.3の体積比で10日間培養された293E細胞の上清と混合し、融合タンパク質の最終濃度は約1mg/mLであった。混合されたサンプルを振とうし、よく混合し、37℃で48時間インキュベートした。細胞上清なしのインキュベーションの対照も使用した。サンプルの純度及び切り取り種の含有量を還元SDS-PAGEによって検出し、融合タンパク質重鎖純度をBandScanソフトウェアによって算出した。
アッセイの結果は図15に示され、各サンプルにおける破砕パーセンテージはTable 12(表14)に示される。結果は、対照群におけるTGFβR2短縮形態融合タンパク質(融合タンパク質2～16)の剪断された物体のパーセンテージは、すべて4.0%未満であり、それは、24.8%のTGFβR2全長形態融合タンパク質(融合タンパク質1)のものよりもはるかに低いことを示した。同じ細胞上清との37℃で48時間のインキュベーションの後、TGFβR2全長形態融合タンパク質(融合タンパク質1)のすべては、100%のパーセンテージで、実験群において剪断された。TGFβR2融合タンパク質の短縮形態(融合タンパク質2～16)は、種々のパーセンテージの切り取り種を含有したが、全長対照よりも有意に優れており、融合タンパク質2、融合タンパク質6、融合タンパク質9、融合タンパク質10、及び融合タンパク質13は、3.0%未満の切り取り種含有量のパーセンテージで、最良の性能を示した。
Figure 2023523981000015
上記結果は、TGFβR2の種々の短縮形態のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質が、全長形態のTGFβR2融合タンパク質1よりも、プロテアーゼ分解に対してより耐性があることを示す。
3.4 TGF-βに対する、TGFβR2の種々の短縮形態のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の結合アッセイ
100ng/mL TGF-β1及び40ng/mL EGFR-Hisタンパク質を、それぞれ100μL/ウェルで96ウェルプレートに4℃で一晩コートした。プレートを翌日洗浄し、室温で1時間ブロッキングし、2μg/mLのTGFβR2の種々の短縮形態のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質を100μL/ウェルで添加した。1時間のインキュベーションの後にプレートを洗浄して、結合していない抗体を除去し、二次抗体ヤギ抗hIgG Fc/HRPを添加し、インキュベートし、洗浄を繰り返した。最後に、発色現像のために基質発色溶液を添加し、停止後にOD450をマイクロプレートリーダーによって読み取った。結果は図16に示される。TGF-β1への、TGFβR2の種々の短縮形態を有するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の結合能は異なったが、EGFRへの結合能は同様であった。
3.5 TGF-βに対する、TGFβR2の種々の短縮形態のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の中和アッセイ
TGF-βは、複数の標的遺伝子の転写を調節することによって細胞機能を調節する。プラスミノーゲンアクチベーター阻害因子1(PAI-1)は、TGF-β1/Smadシグナル伝達経路下流の重要な標的であり、Smad3がPAI-1プロモーター領域のシス作用性エレメントに結合してPAI-1の発現を調節するように活性化する。PAI-1プロモーター領域を含有するエレメントを、ルシフェラーゼ含有ベクターに特異的形態で挿入し、HepG2細胞に移す。このレポーター遺伝子システムにおいて、外因性TGF-βタンパク質の添加は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現及び基質の存在下における発光を始動する。外因性TGF-β抗体が添加される場合、それは、TGF-βタンパク質を中和し、TGFβR2へのTGF-βの結合を遮断し、下流シグナル伝達経路を阻害し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を最終的に阻害する。それ故、TGF-βを中和するTGF-β抗体のインビトロ効力は、光シグナルの強度を検出することによって判定され得る。
96ウェルプレートに、HepG2-3TP-Luc2p-puro細胞(供給元:Sinocelltech Limited社、以下同じ)を30,000個の細胞/ウェルで均一に接種した。一晩の単層培養の後、96ウェルプレート中の培地を捨て、0.5% FBSを含有するDMEM培地で置き換え、5% CO2インキュベーターにおいて37℃で6時間インキュベートした。96ウェルプレート中の培地を捨て、4ng/mL TGF-β1タンパク質を、0.02μg/mlの最終濃度でのEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質とともに添加し、5% CO2インキュベーターにおいて37℃で18時間インキュベートした。陰性対照M群(細胞及びTGF-β1を含有する)及び陰性対照M'群(TGF-β1なしで細胞を含有する)を同時に使用した。最後に、5×Lysisバッファーを添加し、10μLの細胞サンプルを採取して、生物発光強度値(RLU)を検出し、EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の中和率を算出した。中和率(%)=(M群のRLU値-サンプルのRLU値)/(M群のOD値-M'群のOD値)×100%。抗体の濃度を水平座標として使用し、抗体中和率を垂直座標として使用し、定量的な効力曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して分析し且つプロットした。図17に示されるように、TGFβR2の短縮形態を含有するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質2、融合タンパク質6、融合タンパク質8、融合タンパク質13、融合タンパク質14、及び融合タンパク質16は、TGF-β1を中和するある特定の能力を有し、その中でも融合タンパク質2は、TGFβR2の全長形態を含有する融合タンパク質1と同様の中和能を有し、一方で融合タンパク質5、融合タンパク質6、及び融合タンパク質8は、この濃度で、融合タンパク質1よりも優れた中和能を示した。融合タンパク質6は、TGF-β1を中和する最も強い能力を呈した。TGFβR2の短縮形態を含有する残りのEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質は、本質的に中和能を有しなかった又は弱い中和能を有した。
TGF-β3タンパク質は、TGFβR2に対する高いアフィニティーを有し、TGF-β下流シグナル伝達を活性化し得る。TGF-β3(20ng/mL最終濃度)を中和する融合タンパク質の能力を、本実施例におけるレポーター遺伝子システムを適用することによってアッセイした。結果は図18に示される。融合タンパク質2、融合タンパク質4、及び融合タンパク質13は、融合タンパク質1と、TGF-β3を中和する同様の能力を有し、一方で融合タンパク質3、融合タンパク質5、融合タンパク質6、及び融合タンパク質8は、融合タンパク質1よりもTGF-β3を中和する優れた能力を有した。融合タンパク質6は、TGF-β3を中和する最も強い能力も示した。
TGFβR2短縮形態を含有する融合タンパク質の安定性及び中和能の上記分析に基づいて、本発明は、融合タンパク質2～6、8、13、14、及び16のTGFβR2短縮形態、より好ましくは融合タンパク質2、5、6、及び8のTGFβR2短縮形態、並びに最も好ましくは融合タンパク質6のTGFβR2短縮形態を好む。
(実施例4)
TGFβR2短縮形態のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質である融合タンパク質6のインビトロ生物学的特性
4.1 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の結合能のアッセイ
4.1.1 TGF-βに対する、EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質結合及び競合の特性
2μg/mLの最終濃度のTGF-β1タンパク質及びTGF-β3タンパク質を、それぞれ100μL/ウェルで96ウェルプレートにコートし、4℃で一晩コートした。プレートを翌日洗浄し、室温で1時間ブロッキングし、種々の濃度(1.22pM、4.88pM、19.53pM、78.13pM、312.5pM、1250pM、500pM、2000pM)のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質6とともに1時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄して、結合していない抗体を除去し、二次抗体ヤギ抗hIgG50 2 F(ab)2/HRPとともにインキュベートし、繰り返し洗浄し、発色現像のために基質発色溶液を添加し、停止後にOD450をマイクロプレートリーダーによって読み取った。結果は図19に示される。TGF-β1及びTGF-β3タンパク質に対する融合タンパク質6の結合能は、TGF-β1タンパク質への結合に関して91pMのEC50及びR2=0.998を有して、並びにTGF-β3タンパク質への結合に関して102pMのEC50及びR2=0.998を有して、融合タンパク質1のものと同様であった。
本実施例は、TGFβR2-Fcタンパク質への結合について、TGF-β1タンパク質又はTGF-β3タンパク質と競合する融合タンパク質6の能力をタンパク質レベルで更に分析する。
0.2μg/mLの最終濃度のTGF-β1タンパク質又は0.5μg/mLのTGF-β3タンパク質を、100μL/ウェルで4℃で一晩96ウェルプレートにコートした。プレートを翌日洗浄し、室温で1時間ブロッキングし、種々の濃度(0.05nM、0.14nM、0.42nM、1.25nM、3.75nM、11.24nM、33.71nM、101.12nM)の100μLのEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質を、0.2μg/mL(TGF-β1競合)又は1μg/mL(TGF-β3競合)の最終濃度の100μLのビオチン標識TGFβR2-Fcタンパク質(タンパク質供給元:Sino Biological, Inc.社、及びSinocelltech Limited社によってビオチン標識された、以下同じ)とともに添加した。TGFβR2-Fcタンパク質のみを有する陽性対照ウェルも使用した。プレートを1時間のインキュベーション後に洗浄し、プレートを、検出二次抗体ストレプトアビジン/HRPを添加することによって、1時間のインキュベーション後に繰り返し洗浄した。最後に、発色現像のために基質発色溶液を添加し、停止後、マイクロプレートリーダーがOD450を読み取った。融合タンパク質の競合阻害率PI%を、OD450値に基づいて算出した、阻害率PI(%)=(陽性ウェルのOD450値-サンプルウェルのOD450値)/陽性ウェルのOD450値×100%。結果は図20に示され、融合タンパク質6は、融合タンパク質1と、TGFβR2-FcへのTGF-β1タンパク質又はTGF-β3タンパク質の結合を遮断する同様の能力を有する。
4.1.2 EGFRに対するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の結合特性
実施例1.2.1を参照して、組み換えヒトEGFRタンパク質への融合タンパク質の結合能をELISAによって測定した。図21に示されるように、EGFRへの融合タンパク質6の結合能、及びEGFRに結合するEGFと競合する能力は、133.1ng/mLのEC50及びR2=1.000を有して、EGFR-HPA8のものと同様であった。
4.2 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質結合アフィニティーアッセイ
本実施例において、ビオチン化組み換えヒトEGFRタンパク質及びTGF-β1タンパク質へのEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質結合のアフィニティーを、陰性対照としてそれぞれEGFR-HPA8及びH7N9-R1を用いて、生体分子相互作用分析システム(モデル:OctetRED96e、メーカー:Fortebio社)を使用して判定した。複数の濃度点の結合及び解離曲線をフィットさせることによって、アフィニティーパラメーターを導き出し、結果はTable 13(表15)及びTable 14(表16)に示され、具体的な速度論的特徴のあるパラメーター曲線は図22及び図23に示される。
結果は、融合タンパク質6が、8.77pMのKD値、1.68E+06M-1s-1の結合定数kon値、及び1.47E-05s-1の解離定数kdisを有して、モノクローナル抗体EGFR-HPA8と比較して、ヒトEGFRタンパク質へのより高い結合アフィニティーを保持することを示した。更に、短縮形態のTGFβR2融合タンパク質6は、96.1pMのkD値、1.53E+06M s-1-1の結合定数kon値、及び1.47E-04 s-1の解離定数kdisを有して、全長形態のTGFβR2融合タンパク質1への、ヒトEGFRタンパク質と同様のアフィニティーを有する。
Figure 2023523981000016
Figure 2023523981000017
上記結果は、融合タンパク質6が、ヒトEGFR及びTGF-β1の両方との優れたアフィニティーを有することを示す。
4.3 TGF-βを中和するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質のアッセイ
TGF-β1は、Mv-1-1u細胞の増殖を阻害し得、そのため、TGF-β1を中和するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の能力は、WST-8アッセイを使用して検出され得る。
Mv-1-lu細胞(供給元:Cell Resource Center、中国科学院上海生命科学研究院)を、1×103個/ウェルの細胞接種密度で96ウェルプレートに50μL/ウェルで均一に接種した。細胞をCO2インキュベーターにおいて約3時間インキュベートしてウェル壁に接着させ、次いで、10% FBSを含有する1640培地に希釈された種々の濃度(0.0078nM、0.0156nM、0.0313nM、0.0625nM、0.125nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2nM)のEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質サンプルを50μL/ウェルで添加した。最後に、1ng/mLの最終濃度のTGF-β1因子を10μL/ウェルで添加した。陽性対照M群(細胞及びTGF-β1を含有する)、陰性対照M'群(TGF-β1なしで細胞を含有する)、及びブランク対照B群(細胞なしで培養培地のみを添加する)も使用した。細胞を37℃及び5% CO2でCO2インキュベーターにおいて5日間インキュベートし、次いでWST-8を10μL/ウェルで添加した。サンプルを180分間放置し、OD450～OD630の読み取りをマイクロプレートリーダーによって測定し、EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の中和率を、ブランク対照Bの読み取りを差し引くことによって算出した。中和率(%)=(M'群のOD-サンプルのOD)/(M'群のOD-M群のOD)×100%、定量的な効力曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して分析し且つプロットし、水平座標は抗体濃度であり、垂直座標は阻害率である。図24に示されるように、融合タンパク質6及びTGFβR2の対照産物H7N9-R1-43-IgG1(L9)(供給元:ビオチン標識に関してSinocelltech Limited社、以下同じ)の両方とも、用量依存的関係性でTGF-β1によるMv-1-lu増殖の阻害を有効に中和し得、融合タンパク質6の半有効濃度は、対照産物H7N9-R1-43-IgG1(L9)のものよりも小さく、該分子のより優れた中和活性を示した。EGFR-HPA8はTGF-β1を中和せず、TGF-β1に対して中和効果を示すのは、融合タンパク質6のTGFβR2部分であることを示唆した。
TGF-βを中和する融合タンパク質6の能力を、実施例3.5を参照して、本実施例においてレポーター遺伝子システムを使用することによって更にアッセイした。結果は図25に示され、融合タンパク質6及びTGFβR2の対照産物H7N9-R1-43-IgG1(L9)の両方とも、用量依存的関係性でTGF-β1を有効に中和し得、融合タンパク質6の最大中和率(74.8%)は、対照産物H7N9-R1-43-IgG1(L9)のもの(55.3%)よりもはるかに高く、融合タンパク質6の素晴らしい中和活性を更に示した。
4.4 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の細胞増殖阻害活性のアッセイ
MDA-MB-468細胞の成長に対するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質阻害を、実施例1.2.2に従ってWST-8法によってアッセイして、そのEGFR部分特性を判定した。図26に示されるように、MDA-MB-468細胞の増殖を阻害する融合タンパク質6の能力は、EGFR-HPA8のものと同様であり、阻害率は、「S」曲線で、医薬濃度の増加とともに増加した。TGFβR2機能を有する対照産物H7N9-R1-43-IgG1(L9)は、MDA-MB-468細胞の増殖を阻害せず、融合タンパク質6が、そのEGFR部分によって腫瘍細胞の増殖を阻害することを示した。
4.5 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質のADCC効果
EGFR発現細胞に対するEGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質によって媒介されるADCC効果を、実施例2.2.3を参照してアッセイした。結果は図27に示される。0.00004～3nMの濃度域において、融合タンパク質6及び抗EGFR抗体EGFR-HPA8は、EGFR発現腫瘍細胞A431に対して同様のADCC効果を媒介し得る。TGFβR2機能を有する対照産物H7N9-R1-43-IgG1(L9)は、A431細胞に対してADCC効果を有せず、この実験システムにおいてADCC機能を媒介するのは、融合タンパク質6のEGFR部分であることを示した。
(実施例5)
NCI-H1975皮下グラフト腫瘍モデルにおけるTGFβR2短縮形態(融合タンパク質6)EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質に関する薬力学的調査
Balb/c-nuマウスに、1×106個のNCI-H1975細胞を胸郭の右側に皮下接種した。腫瘍体積が約300mm3に到達した時点で、各群において6匹の動物に、動物を腫瘍体積によって無作為にグループ分けし、投与した。投薬をグループ分けの日に開始し、医薬を、1週間に2回で連続10投薬、腹腔内注射(I.P.)によって投与し、最後の投薬後に中止して腫瘍再発を観察した。具体的な投薬レジメンは、下のTable 15(表17)に示される。
Figure 2023523981000018
注記:投与体積は、10mL/kgマウス体重であった。
各群における動物は、投与のコースの間、活動及び摂食等、良好な全身状態にあり、それらの体重はある程度増加した。投薬後の投薬群と溶媒対照群との間で、体重に有意な差はなかった(P>0.05)。すべての動物の体重の変化は、Table 16(表18)及び図28に示される。
Figure 2023523981000019
試行における各群に対する腫瘍体積結果は、Table 17(表19)及び図29に示される。群における処理の35日後、溶媒対照群における平均腫瘍体積は7150.78±780.4mm3であった。融合タンパク質6投与群における6匹中5匹のマウスは、4.55±4.55mm3の平均腫瘍体積及び99.9%のTGIを有して完全な腫瘍消失(CR)を有し、それは溶媒対照群のものと有意に異なった(P<0.001)。対照的に、EGFR-HPA8投与群における1匹のマウスのみが、79.44±28.65mm3の平均腫瘍体積及び98.9%のTGIを有して完全な腫瘍消失を示した。結果は、融合タンパク質6が、NCI-H1975非小細胞肺癌皮下移植腫瘍に対して有意な阻害効果を有し、腫瘍阻害効果は、同じモル用量でEGFR-HPA8のものよりも秀でていることを示した(P=0.237)。
Figure 2023523981000020
(実施例6)
TGFβR2短縮形態(融合タンパク質6)EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の安定性分析
6.1 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の限外濾過安定性分析
EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質サンプルを、100mMグリシン、10mM NaCl、50mM Tris、pH7.5バッファーにおける限外濾過を使用して約10mg/mLの濃度に濃縮した。濃縮サンプルを、限外濾過されたサンプルの純度及び安定性について、還元SDS-PAGE及び分子ふるいクロマトグラフィー(SEC-HPLC、Agilent 1260液体クロマトグラフィーシステム、TSK-G3000SWXLカラム)によって検査した。EC-HPLC運転工程:(1)移動相:200mM NaH2PO4、100mMアルギニン、pH6.5;(2)負荷体積は80μgであった;(3)分析時間は30分間であり、流速は0.5mL/分であり、カラム温度は25℃であった;(4)純度を、ピーク面積の正規化法に従って算出した。
サンプル濃縮後の純度検査の結果は図30に示され、サンプル純度及びフラグメント比はTable 18(表20)に示される。結果は、TGFβR2短縮融合タンパク質6が、全長TGFβR2融合タンパク質と比較して、濃縮後に壊れる可能性が低く、より高い限外濾過安定性を有することを示した。
Figure 2023523981000021
6.2 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の熱安定性分析
サンプルの熱安定性を、UNcleシステム(Unchained Labs社、モデル:UNCLE-0330)を使用して示差走査蛍光定量法(differential scanning fluorimetry)(DSF)によって測定した。運転工程:(1)サンプル体積は9μLであった;(2)実験パラメーターを設定した:温度域は25℃～95℃であり、加熱速度は0.3℃/分であった;(3)UNcle分析ソフトウェアを適用してデータを分析し、UV266下での内部蛍光変化曲線の中点値をTmとして選び、UV266/Blue473の下で静的光散乱シグナルによって形成される凝集変化曲線の凝集発生温度をTagg266及びTagg473として選んだ。
融合タンパク質6の熱安定性アッセイの結果はTable 19(表21)に示され、それは優れた熱安定性を呈した。
Figure 2023523981000022
6.3 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の熱加速安定性分析
サンプルを45℃で1週間保管した後、サンプルの加速安定性をSEC-HPLC及びSDS-PAGEによって分析し、手順は6.1と同じであった。
融合タンパク質6の熱加速安定性の結果はTable 20(表22)に示される。45℃で1週間の保管の後、融合タンパク質6のSEC純度は0.7%減少したが、純度は依然として高く、凝集体のレベルはそれほど増加せず、フラグメントのレベルは変化せず、それは優れた熱加速安定性を示した。
Figure 2023523981000023
6.4 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の凍結融解安定性分析
サンプルを-80℃で3時間保管し、次いで45℃に1時間移して融解し、5回繰り返しの凍結融解に対してそうした。サンプルの凍結融解安定性をSEC-HPLCによって分析し、手順は6.1においてと同じであった。
融合タンパク質6の凍結融解安定性の結果はTable 21(表23)に示される。5回繰り返しの凍結融解の後、融合タンパク質6のSEC純度は有意に変化せず、凝集体及びフラグメントのレベルは有意に増加せず、それは優れた凍結融解安定性を示した。
Figure 2023523981000024
6.5 EGFR抗体/TGFβR2融合タンパク質の振とう安定性
サンプルをディープウェルプレートに置き、800rpmで24時間ボルテックス振とう器で振とうした。サンプルを、6.1においてと同じ手順を用いてSEC-HPLCによって分析した。結果はTable 22(表24)に示され、それは、サンプルのSEC単量体純度が、24時間の振とう後に有意に変化せず、凝集体及びフラグメントのレベルが有意に増加せず、融合タンパク質6が優れた振とう安定性を有することを示す。
Figure 2023523981000025
(実施例7)
TGFβR2部分がTGFβR2の短縮形態(融合タンパク質6)である、固形腫瘍抗原標的化抗体X/TGFβR2融合タンパク質の設計及び特性アッセイ
7.1 TGFβR2 X抗体/短縮TGFβR2融合タンパク質発現ベクターの設計、発現、及び精製
実施例3.2における選出されたTGFβR2短縮形態の構造的安定性及びTGF-β1を中和する能力を更に検証するために、本実施例は、融合タンパク質の標的化部分として多様な固形腫瘍抗原、及び融合タンパク質の免疫調節部分としてTGFβR2細胞外ドメイン(全長及びECD欠失(6～26)融合タンパク質6)を使用して、X抗体/TGFβR2細胞外ドメイン融合タンパク質(X/TGFβR2融合タンパク質)を形成する。同様に、X/TGFβR2融合タンパク質において、X抗体重鎖のC末端アミノ酸は、(G4S)4リンカーを介してTGFβR2細胞外ドメインに連結する。加えて、X抗体重鎖のC末端リジンを除去して、タンパク質分解的切断のリスクを低下させた。X/TGFβR2融合タンパク質の構築プロトコールはTable 23(表25)に示される。
Figure 2023523981000026
PCR又はオーバーラップPCRは標的遺伝子を増幅し、それをインフュージョンによって発現ベクターにライゲートする。組み換え発現ベクターをシーケンシングによって検証し、プラスミドを抽出し、HEK-293細胞(fut8ノックアウト)に一過性に移し、7日間培養し、上清を遠心分離によって収集した。獲得された細胞上清を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製して、融合タンパク質を精製した。
7.2 X抗体/短縮TGFβR2融合タンパク質の分解
X/TGFβR2融合タンパク質の純度並びに分解を、還元SDS-PAGEによってアッセイした。結果は図31に示される。種々のX/TGFβR2融合タンパク質に関して、TGFβR2細胞外ドメインの選出された短縮形態の発現サンプルは、全長TGFβR2細胞外ドメイン対照サンプルよりも有意に安定であり、より少ない分解バンドを有した。サンプルの安定性は、たとえどんな種類の標的化部分、すなわち抗体が使用されようとも、TGFβR2細胞外ドメインの目下の短縮形態に起因するはずである。
7.3 X抗体/短縮TGFβR2融合タンパク質の分解特質
本実施例では、293E細胞上清を融合タンパク質の加速処理に使用し、選出された短縮TGFβR2細胞外ドメインを有するX/TGFβR2融合タンパク質の分解安定性を、実施例3.3にあるように更に判定した。サンプル純度アッセイの結果は図32に示され、サンプル純度及び剪断物(shearer)のパーセンテージはTable 24(表26)に示される。結果は、好ましいTGFβR2細胞外ドメイン短縮形態を有するX/TGFβR2融合タンパク質が、TGFβR2融合タンパク質の全長形態よりも、プロテアーゼ分解に対してより耐性があることを示す。
Figure 2023523981000027
ある特定の濃度条件下での、選出された短縮TGFβR2細胞外ドメインを有するX/TGFβR2融合タンパク質の安定性をアッセイするために、その限外濾過安定性を、実施例6.1の方法を使用して分析した。結果はTable 25(表27)に示される。TGFβR2の好ましい短縮細胞外ドメインを有するX/TGFβR2融合タンパク質は、濃縮後に分解しにくく、切り取り種含有量のパーセンテージは4.0%未満であり(SDS-PAGE純度)、それは、TGFβR2の全長細胞外ドメインを有するX/TGFβR2融合タンパク質よりも強い限外濾過安定性を有する。
Figure 2023523981000028
要するに、好ましい短縮TGFβR2細胞外ドメインを含有する融合タンパク質の秀でた安定性を、標的化部分として複数の種類の固形腫瘍抗原を有する融合タンパク質によって更に検証した。
(実施例8)
標的化部分としての標的化固形腫瘍抗原、及び短縮TGFβR2(融合タンパク質6)を有するX/TGFβR2融合タンパク質のインビトロ生物学的特性
8.1 X/TGFβR2融合タンパク質結合TGF-β1アッセイ
TGF-β1へのX/TGFβR2融合タンパク質の結合能を、実施例3.4に従ってELISAによって測定した。図33に示されるように、TGF-β1に結合する、TGFβR2の好ましい短縮形態を有するX/TGFβR2融合タンパク質の能力は、TGFβR2の全長形態を有するX/TGFβR2融合タンパク質のものよりもわずかに低い。
8.2 X/TGFβR2融合タンパク質中和TGF-βアッセイ
TGF-β1及びTGF-β3を中和するX/TGFβR2融合タンパク質の能力を、実施例3.5を参照して検査した。図34に示されるように、TGF-β1及びTGF-β3の両方を中和する、TGFβR2の好ましい短縮形態を有するX/TGFβR2融合タンパク質の能力は、TGFβR2の全長形態を有するX/TGFβR2融合タンパク質のものよりも秀でていた。
8.3 X部分の標的に対するX/TGFβR2融合タンパク質の結合アッセイ
それぞれ10ng/mL、5ng/mL、80ng/mL、80ng/mL、及び40ng/mLの最終濃度の、X部分標的である抗原ERBB2-his、VEGF165、VEGFR2-His、CTLA4-his、及びEGFR-Hisを、100L/ウェルで96ウェルプレートにコートした。プレートに4℃で一晩コートした。プレートを翌日洗浄し、室温で1時間ブロッキングし、13.89nMの最終濃度の100μLのX/TGFβR2融合タンパク質とともに1時間インキュベートした。プレートを洗浄して、結合していない抗体を除去し、二次抗体ヤギ抗hIgG Fc/HRPとともにインキュベートし、洗浄を繰り返した。最後に、発色現像のために基質発色溶液を添加し、停止後にOD450をマイクロプレートリーダーによって読み取った。図35に示されるように、選出された短縮TGFβR2を有するX/TGFβR2融合タンパク質は、TGFβR2の全長形態を含有するX/TGFβR2融合タンパク質と、X側の相当する抗原に結合する同様の能力を有する。
配列表
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［参考文献］
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Claims (26)

  1. その天然形態と比較して、
    a)少なくともその6～16位におけるアミノ酸残基が欠失し、更に任意選択で、その17～17+n位、(式中、nは1～10の整数であり;好ましくは、nは2、4、8、9、若しくは10であり;最も好ましくは、nは9である)におけるアミノ酸残基が欠失している;又は
    b)6～26位におけるそのアミノ酸残基の欠失に基づいて、更に、5、4～5、3～5、2～5、1、1～2、1～3、若しくは1～4位におけるそのアミノ酸残基が欠失している;又は
    c)7～26位におけるアミノ酸残基が欠失している、
    短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子。
  2. アミノ酸配列は配列番号48～62のいずれかを含む、請求項1に記載の分子。
  3. 請求項1又は2に記載の分子を含む、融合タンパク質。
  4. a)請求項1又は2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子;及び
    b)標的化部分
    を含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
  5. 標的化部分は、抗体又はその抗原結合フラグメント、機能的リガンド又はそのFc融合タンパク質、及び受容体タンパク質又はそのFc融合タンパク質から選択される癌細胞特異的標的化部分である、請求項4に記載の融合タンパク質。
  6. 標的化部分は、抗EGFR抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項5に記載の融合タンパク質。
  7. 短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子のN末端は、標的化部分の重鎖のC末端に連結されており、
    任意選択でリンカーによって連結されている、
    請求項4から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. リンカーはG4Sフレキシブルペプチドリンカー、好ましくは(G4S)4ペプチドリンカーである、請求項7に記載の融合タンパク質。
  9. (a)それぞれ配列番号19、20、及び21を含む重鎖CDR1、重鎖CDR2、及び重鎖CDR3ドメインを含む重鎖可変領域、並びに/又は
    (b)それぞれ配列番号16、17、及び18を含む軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、及び軽鎖CDR3ドメインを含む軽鎖可変領域
    を含む、EGFRに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. a)配列番号28を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域;及び/或いは
    b)配列番号29を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項9に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  11. a)配列番号30を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を好ましくは含む重鎖定常領域;及び/或いは
    b)配列番号31を含む配列又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を好ましくは含む軽鎖定常領域
    を更に含む、請求項9又は10に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  12. 標的化部分は、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗EGFR抗体、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、イピリムマブ、又はパニツムマブから選択される、請求項3から8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  13. a)配列番号141又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む重鎖のアミノ酸配列;及び
    b)配列番号23又はそれと少なくとも85%、88%、90%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖のアミノ酸配列を含み、
    融合タンパク質は、2本の重鎖及び2本の軽鎖を含み;ジスルフィド結合は、その第1の軽鎖と第1の重鎖との間で形成され、ジスルフィド結合は、その第2の軽鎖と第2の重鎖との間で形成され、ジスルフィド結合は、その第1の重鎖と第2の重鎖との間で形成される、
    請求項7に記載の融合タンパク質。
  14. ヒトEGFRタンパク質への結合アフィニティーに関して、2.92pM～26.3pM、好ましくは7pM～9pM、最も好ましくは8.77pMのKD値を有し、
    ヒトTGF-β1タンパク質への結合アフィニティーに関して、23pM～288.3pM、好ましくは64pM～144pM、最も好ましくは96.1pMのKD値を有する、
    請求項13に記載の融合タンパク質。
  15. 請求項1又は2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに付加的な治療剤を含むコンジュゲートであって、好ましくは前記抗体又はその抗原結合フラグメント及び付加的な治療剤はリンカーによって連結されている、コンジュゲート。
  16. 請求項1又は2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸であって、mRNA及び/又はDNAである、核酸。
  17. 配列番号32～39のいずれか1つ;若しくは
    配列番号67～84のいずれか1つ;若しくは
    配列番号148～163のいずれか1つ、又はその機能的バリアント
    を含む、請求項16に記載の核酸。
  18. 請求項16又は17に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  19. 請求項16若しくは17に記載の核酸又は請求項18に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  20. 請求項1又は2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するための方法であって、前述のタンパク質分子の発現に適切な条件下で請求項19に記載の宿主細胞を培養する工程、及び培養培地から発現産物を回収する工程を含む、方法。
  21. a)請求項1若しくは2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項15に記載のコンジュゲート、請求項16若しくは17に記載の核酸、又は請求項18に記載の発現ベクター、並びに
    b)薬学的に許容される担体;任意選択で、
    c)1種又は複数の付加的な治療剤
    を含む、医薬組成物。
  22. 癌の予防及び治療のための、好ましくは胃癌の治療のための、請求項1若しくは2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項15に記載のコンジュゲート、請求項16若しくは17に記載の核酸、請求項18に記載の発現ベクター、又は請求項21に記載の医薬組成物の使用。
  23. 癌の予防及び治療のための、好ましくは胃癌の治療のための医薬の調製のための、請求項1若しくは2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項15に記載のコンジュゲート、請求項16若しくは17に記載の核酸、請求項18に記載の発現ベクター、又は請求項21に記載の医薬組成物の使用。
  24. 請求項1若しくは2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項15に記載のコンジュゲート、請求項16若しくは17に記載の核酸、請求項18に記載の発現ベクター、又は請求項21に記載の医薬組成物と、
    1種又は複数の付加的な治療剤と
    を含む、薬学的組み合わせ物。
  25. 請求項1若しくは2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項15に記載のコンジュゲート、請求項16若しくは17に記載の核酸、請求項18に記載の発現ベクター、又は請求項21に記載の医薬組成物
    を含む;好ましくは、
    医薬を投与するためのデバイスを更に含む、
    キット。
  26. 請求項1若しくは2に記載の短縮TGFβR2細胞外ドメイン分子、請求項3から8及び12から14のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項9から11のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、請求項15に記載のコンジュゲート、請求項16若しくは17に記載の核酸、請求項18に記載の発現ベクター、請求項21に記載の医薬組成物、請求項24に記載の薬学的組み合わせ物、又は請求項25に記載のキットを対象に投与する工程を含む、新生物疾患を予防する及び治療する方法。
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