CN109097461B

CN109097461B - 一种心肌病相关基因检测试剂及其应用

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Publication number: CN109097461B
Application number: CN201811035431.6A
Authority: CN
Inventors: 潘智; 陈正; 马娜; 张宇; 王东升; 江茂华; 李征; 李一平
Original assignee: Beijing Zhongguancun Life Science Garden Bio Medicine Technology Hatching Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongguancun Life Science Garden Bio Medicine Technology Hatching Co ltd
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN109097461A

Abstract

本发明提供了一种心肌病相关基因检测试剂以及该试剂在检测心肌病中的应用。具体而言，本发明涵盖了9种常见心肌病类型的27个目标致病基因位点的捕获引物，通过多重PCR扩增，进行DNA文库构建，可应用于Illumina平台的高通量测序方法，测序后进行数据分析，获得临床参考检测报告。

Description

一种心肌病相关基因检测试剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种心肌病相关基因检测试剂以及该试剂在检测心肌病中的应用。具体而言，本发明涵盖了9种常见心肌病类型的27个目标致病基因位点的捕获引物，通过多重PCR扩增，进行DNA文库构建，可应用于Illumina平台的高通量测序方法，测序后进行数据分析，获得临床参考检测报告。属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。

背景技术

心血管病是导致我国居民死亡的首要原因，据估我国心血管病患者2.9亿，即每5个人中有1人患心血管病。其中，心力衰竭人数超过420万人，是死亡率最高的心血管疾病。原发性心肌病大多有遗传机制的作用，其发病晚期均会导致心脏衰竭。现在主要采用全外显子测序的方法检测相关的单基因突变，其测序的深度不足，常常导致结果不准确，而且成本高。另外，也有一些医院开发了一些心肌病诊断试剂盒，但这些试剂盒涉及的基因太多，例如80个，包括很多临床上发病率很低的心肌疾病，以及一些相关性非常低的基因，这些基因检测，无疑极大的增加了患者的就医成本。

发明内容

本发明利用新型技术开发一种心肌病相关基因检测试剂盒/诊断装置，用于筛查检测判定受检者是否存在患有肥厚型心脏病、扩张性心肌病、致心律失常性右室发育不良/心肌病、左心室肌致密化不全、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速、长QT间期综合症、Brugada综合征和loeys-dietz综合征(LDS)等遗传性心肌病的风险。因此，

本发明提供一种包含遗传性心肌病致病相关基因的DNA文库。

优选的，所述遗传性心肌病致病相关基因是表1所示的27个基因：

表1：遗传性心肌病致病相关基因

本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断遗传性心肌病。

本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断遗传性心肌病。优选的，所述诊断装置是测序芯片。

进一步，所述应用包括下列步骤：

(1)提供受试者样本的基因组DNA；

(2)对步骤(1)的基因组DNA进行定量；

(3)靶区域扩增：利用上述的DNA文库合成覆盖全部27个相关基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；

(4)PCR产物纯化：对步骤(3)得到的PCR产物用磁珠进行纯化；

(5)第二轮PCR：对步骤(4)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，引入Illumina测序相应接头与barcode；

(6)PCR终产物回收：对步骤(5)得到的二次扩增终产物用磁珠进行回收，获得的终产物用于后续试验或置于-20℃保存。

进一步，

所述步骤(2)中采用

dsDNA HS Assay Kit或荧光定量PCR对基因组进行定量。

所述步骤(3)的靶区域扩增步骤为：A.配制扩增体系；B.扩增靶区域。优选的，扩增体系中DNA含量为5ng/μl以上，更优选的，所述DNA含量为20ng/μl以上，最优选的，所述DNA含量为50-200ng/μl。

优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。例如，可以是外周血、唾液、口腔粘膜、粪便等来源。

更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，不同的疾病有不同的治疗方法，根据基因诊断结果不同，选择适合的治疗方案，ICD植入术或者单纯药物治疗。

本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含27个遗传性心肌病的相关基因的DNA文库。

本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含27个遗传性心肌病的相关基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。

本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)提供受试者样本的基因组DNA；

(2)对步骤(1)的基因组DNA进行定量；

(4)PCR产物纯化：对步骤(3)得到的PCR产物用磁珠进行纯化；

更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如：不同的疾病有不同的治疗方法，根据基因诊断结果不同，选择适合的治疗方案，ICD植入术或者单纯药物治疗。

采用本发明的DNA文库对遗传性心肌病患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：

1.可避免创伤性检查。

2.基因诊断有助于制定进一步个性化治疗方案和针对性随访计划。

3.本申请的DNA文库是申请人从众多的遗传性心肌病致病基因中选择的27个基因，这27种基因是常见心肌病的常见相关基因，而没有选择那些发病率低，相关性低的基因，例如alstrom综合征，fabry病在心肌病中发病率比较低，而ABCC9，ACTN2，ANKRD1在肥厚性心肌病或者扩张性心肌病中的发病率很低，TMEM43，TGFB3，CACNB3，CACNB4在致心律失常右室心肌病中的发病率也低，我们选择这些常见发病基因作为诊断试剂盒，这样极大的减少了的患者的就医成本。

4.本发明的DNA文库能够检测常见的造成遗传性心肌病的遗传缺陷，包括：肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室发育不良/心肌病、左心室肌致密化不全、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速、长QT间期综合症、Brugada综合征、loeys-dietz综合征(LDS)和主动脉夹层/主动脉瘤等九大类。

5.本发明中采用基于Illumina高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的27个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证单端测序平均1000×条件下可达到如下扩增效果：1).扩增片段长度：单端可读到目标位点；2).目标区域覆盖度：至少98％的设计目标区域可被扩增到；3).测序数据均一性：超过95％以上的扩增片段覆盖度大于平均测序深度的10％；4).扩增特异性：Illumina测序下机去除接头后质控合格的数据在靶区域的mapping比率超过95％。

6.本发明多重平行扩增技术突破了多重PCR的障碍，推出了一个开创性的流程，较常规只能做几个十几个多重扩增相比，本技术能实现数十个、百个甚至数千个位点的快速扩增、测序及低频率等位基因的检测。本技术通过对引物批量设计、特殊修饰、按照特定比率混合，可实现大量片段的平行扩增。一般情况下，该技术基本指标是超过97％的设计片段可被扩增到，片段超过95％覆盖度大于平均覆盖度X10％。

7.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因部分遗传性心肌病患者面临未来心脏移植及猝死的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。遗传性心肌病多数为常染色显性遗传病，患者兄弟姐妹有50％的发病可能性。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。

8.精准医疗更重视“病”的深度特征和“药”的高度精准性，该心肌病筛查捕获技术能够精准地检测出潜在的基因突变和已知疾病的患病机制，具有精准性和便捷性，通过基因测序可以找出病症的突变基因，从而迅速确定对症药物，省去患者尝试各种治疗方法的时间，提升治疗效果，降低患者的治疗成本，获得效益与耗费之比的最大化。精准医疗相比传统经验医学是一个长足进步，可以大大减小临床实践的不确定性。可以预见，心肌病筛查捕获技术的临床应用，将显著改善癌症患者的诊疗体验和诊疗效果，发展潜力大。

综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、特异、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对遗传性心肌病具有很好的辅助诊断价值。

具体实施方式

下面更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然实施例中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例所需仪器和试剂如下：

仪器需求：

试剂需求：

Qubit 2.0DNA定量试剂Cat：Q32854 Life Technologies

AgencourtAMPure XP Beads Cat：A63881 Beckman

多重扩增专用试剂 Morgene

实施例1

1、基因检测

(1)提供受试者的外周血样本，血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理，4℃保存。

(2)对外周血的基因组DNA进行定量

根据Qubit 2.0DNA定量试剂的说明书对基因组进行定量。

(3)靶区域扩增：

A.配制扩增体系

采用0.2ml PCR管/96PCR板，在超净台里按照如表2所示体系配置反应：

表2扩增体系

Primer Pool mix	8ul
		gDNA	20-200ng/μl最多12μl
H<sub>2</sub>0	(12-y)μl
		3X M_Enzyme MIX	10μl
Total	30μl

其中，y指gDNA加的体积

B.扩增程序设置，如表3：

表3扩增程序

*如DNA投入量为10ng,适当增加2循环。

(4)PCR产物纯化

1).向PCR反应液/酶促反应液加入0.5倍体积AMPure XP Beads(30μl体系加15μl),用移液器50μl量程上下吹打10-15次，以使扩增产物与AMPure XP Beads充分混匀。室温静置1-2分钟。

2).用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。

3).用移液器吸取上清至新的EP管子/96孔板中(保留上清)，避免吸到磁珠。

4).向新的上清液中加入：0.6倍原始PCR体积AMPure XP Beads(如PCR体系为30μl，则加18μl磁珠)；用移液器50μl量程上下吹打10-15次，以使扩增产物与AMPure XP Beads充分混匀。室温静置1-2分钟。

5).用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠。

6).加入40μl BW10，悬浮磁珠，室温静置2分钟。用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器吸取上清，抛上清，留磁珠。

7).加入100μl 70％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠便洗涤。

8).用磁铁或磁力架吸附磁珠，2分钟，直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。

9).室温放置，直至乙醇挥发干净。本步骤磁珠亦可放于50℃烘箱5分钟左右。

(5)第二轮PCR

A.按照表4的反应体系准备反应混合物,不同的样品请选择不同的barcode引物。

表4第二轮PCR反应体系

3X Enzyme MIX	10μl
		H<sub>2</sub>O	18μl
2PCR primer F	1μl
		2BarcodeprimerR	1μl
总体积	30μl

将30μl mix直接加入到对应的样本磁珠中。

B.PCR反应条件：

(6)PCR终产物回收

1).PCR产物中加0.8倍体积磁珠(30μl体系加24μl)用移液器量程上下吹打，以使回收产物与AMPure XP Beads充分混匀。室温静置2分钟。

2).用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，2分钟，直至溶液澄清为止。

3).用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠。

4).加入40μl BW07，涡旋均匀。

5).用磁铁或磁力架吸附磁珠，2分钟，直至溶液澄清为止。用移液器去除上清，避免吸到磁珠。加入100μl 70％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠便洗涤,用移液器小心去除上清。

6).室温放置，直至乙醇挥发干净。本步骤磁珠亦可放于50℃烘箱5分钟左右，快速蒸干乙醇。

7).加入20μl Elution Buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA。将磁珠用磁铁吸附，所得到上清DNA溶液吸至一新的1.5/0.5/0.2ml离心管/96孔PCR管；本产物直接用于后续试验或置于-20℃保存。

2、结果说明及分析

本发明中采用基于Illumina高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的27个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证单端测序平均1000×条件下可达到如下扩增效果：1).扩增片段长度：单端可读到目标位点；2).目标区域覆盖度：至少98％的设计目标区域可被扩增到；3).测序数据均一性：超过95％以上的扩增片段覆盖度大于平均测序深度的10％；4).扩增特异性：Illumina测序下机去除接头后质控合格的数据在靶区域的mapping比率超过95％。

本发明多重平行扩增技术突破了多重PCR的障碍，推出了一个开创性的流程，较常规只能做几个十几个多重扩增相比，本技术能实现数十个、百个甚至数千个位点的快速扩增、测序及低频率等位基因的检测。本技术通过对引物批量设计、特殊修饰、按照特定比率混合，可实现大量片段的平行扩增。一般情况下，该技术基本指标是超过97％的设计片段可被扩增到，片段超过95％覆盖度大于平均覆盖度X10％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种诊断遗传性心肌病的DNA文库，其特征在于，该文库为27个遗传性心肌病相关的致病基因，其中，所述致病基因如下表：

2.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于诊断遗传性心肌病。

3.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置用于诊断遗传性心肌病。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。

5.如权利要求2-4任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤：

(1)提供受试者样本的基因组DNA；

(2)对步骤(1)的基因组DNA进行定量；

(4)PCR产物纯化：对步骤(3)得到的PCR产物用磁珠进行纯化；

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。

7.如权利要求2-6任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导治疗。

8.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。

9.一种诊断装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1所述的DNA文库。

10.如权利要求9的诊断装置，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。