CN112501286A - 一种遗传性甲状腺功能异常性疾病致病基因的标志物及其检测试剂盒 - Google Patents
一种遗传性甲状腺功能异常性疾病致病基因的标志物及其检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种遗传性甲状腺功能异常性疾病致病基因的标志物及其检测试剂盒，目标区域不仅包括所有外显子区还覆盖了剪接区及部分内含子区，且目标区域覆盖率高达98.4％。因此，本发明设计的试剂盒覆盖基因更为全面；单次检测的基因多，经济高效、有助于提高突变检出率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种遗传性甲状腺功能异常性疾病致病基因的标志物及其检测试剂盒。
背景技术
遗传性甲状腺功能异常性疾病是一大组由于胚系基因突变导致的甲状腺功能减退或者亢进的疾病。其疾病谱较广，涵盖了下丘脑-垂体-甲状腺轴的缺陷、血液中甲状腺激素转运的异常、靶组织中甲状腺激素的转运及反应异常；主要由于涉及下丘脑-垂体-甲状腺发育、甲状腺激素合成通路、甲状腺激素运输及靶器官反应的相关基因突变所导致的各种疾病，包括基因突变所致甲状腺发育不全(thyroid dysgenesis)、基因突变所致甲状腺激素合成障碍(thyroid dyshormonogenesis，TD)、TSH受体基因突变所致甲状腺疾病、遗传性下丘脑-垂体功能异常所致甲状腺疾病、甲状腺激素运载蛋白基因突变所致遗传性甲状腺激素结合蛋白异常性疾病以及甲状腺激素抵抗综合征(syndrome of resistance tothyroid hormone，RTH)等，主要表现为先天性甲状腺功能亢进(congenitalhyperthyroidism)、甲状腺功能减退(congenital hypothyroidism，CH)以及甲状腺功能正常性高/低甲状腺激素血症等。其中CH为其主要临床特征。
CH是一种常见的新生儿内分泌代谢紊乱疾病，是新生儿筛查时最常见的甲状腺疾病，发病率约1/2000-1/4000，约80％-85％为甲状腺发育不全，余15％-20％为TD。其中，与甲状腺发育相关的甲状腺转录因子(NKX2-1，FOXE1，NKX2-5)、PAX8、TSHR等基因突变，可引起甲状腺发育不全从而导致先天性甲状腺功能减退(congenital hypothyroidism，CH)，可表现为原发性先天性甲减伴甲状腺萎缩(thyroid hypoplasia)、甲状腺缺如(athyreosis)或异位甲状腺(thyroid ectopy)等。与甲状腺激素合成过程(碘转运、碘有机化、碘化酪氨酸偶联、碘的再循环等)相关的基因如NIS、TG、TPO、SLC26A4(PDS)等基因突变后可导致激素合成步骤受阻或出错从而引起TD，常表现为甲状腺肿大伴不同程度的甲减，甚至仅存在亚临床甲减。TH合成后进入血，需要结合相关运载蛋白进行转运和储存，在循环中，TH大部分以结合型存在，仅0.03％的T4和0.3％的T3以未结合的形式(游离型)存在。血液中TH结合蛋白主要包括甲状腺素结合球蛋白(thyroxine-binding globulin，TBG)、甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)和人血清白蛋白(albumin，ALB)；相应的编码基因包括突变可使TH在血液中的运输受到影响，循环激素浓度发生改变，导致正常甲状腺功能性高甲状腺激素血症或正常甲状腺功能性低甲状腺激素血症。另外由于THRB突变引起全身靶器官或组织对甲状腺激素的敏感性降低，从而引起RTH，近年来由于甲状腺激素受体α亚基(THRA)突变导致的RTH也陆续被报道；基因突变引起甲状腺或靶器官对甲状腺激素反应低下患者可表现为甲状腺激素抵抗(Resistance to thyroid hormone，RTH)，大部分患者甲状腺功能正常或呈轻度甲减表现，亦有患者表现为甲亢。
较之CH，先天性甲状腺功能亢进(congenital hyperthyroidism)更为少见，但它对生长和发育的影响是巨大的。大多数病例发生于母体的Graves’病的背景下。然而，在一些罕见的情况下，先天性甲亢是由于TSHR激活突变所致，TSHR激活突变可引起该受体的构成性激活从而引起甲亢表型，为常染色体显性遗传，具有非自身免疫性甲亢的特点，包括家族性非自身免疫性常染色体显性遗传性进甲亢(familial non-autoimmune autosomaldominant hyperthyroidism,FNAH)及散发性先天性非自身免疫性甲亢(sporadiccongenital nonautoimmune hyperthyroidism,SNAH)。患者甲亢发病时间不一，早至出生后数月，亦有成年后才发病者，一定程度上发病时间可能与突变体的激活强度有关。
遗传性甲状腺功能异常性疾病患者临床表型各异，早期无临床症状或表现不具特异性；同时严重程度相差较大，重者于出生时新生儿筛查时即可被发现，而有些轻微患者由于出生后前几年甲状腺激素足够维持自身需求而无表现，表现为迟发型甲减；甚至亦存在部分患者，仅表现为亚临床型甲减。另外，一些基因突变还存在甲状腺外的表现，如SLC26A4(PDS)突变可引起Pendred综合征，患者有严重的耳聋，甲减程度不一；另外THRB基因突变患者除具有RTH表现外，亦有部分患者可伴有神经系统异常、耳聋及躯体畸形等。上述情况极易造成误诊、漏诊，临床诊治困难。分子诊断能够明确致病基因，以协助诊断、指导治疗与遗传咨询。
传统Sanger测序是针对已知的致病基因进行设计引物，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增、测序，非常适用于致病基因明确的单基因遗传病，具有准确性高、经济高效的优势。然而遗传性甲状腺功能异常性疾病，致病因种类繁多，临床表现异质性大，严重程度不一，不同致病基因引起的症状互有重叠。如若采取候选基因Sanger测序方法，由于其通量小、灵敏度低及样本需求量大等限制，常费时费力甚是有时无法得到明确的分子病因，因此对准确、高效的多基因检测的需求愈发迫切。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种遗传性甲状腺功能异常性疾病致病基因的标志物及其检测试剂盒，克服现有Sanger测序方法，由于其通量小、灵敏度低及样本需求量大等技术缺陷。
本发明的一种遗传性甲状腺功能异常性疾病致病基因的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括下述基因的基因集：PAX8,NKX2-1,FOXE1,NKX2-5,SLC5A5,TPO,DUOX1,SLC26A4,TG,DUOXA2,DUOX2,DIO1,DIO2,DIO3,SECISBP2,DEHAL1,TSHR,TSHB,THRA,THRB,SLC16A2,TRHR,POU1F1,PROP1,LHX3,IGSF1,GLIS3,TBG,TTR,ALB,CRYM。
本发明的一种所述基因标志物的扩增引物池，其特征在于，所述引物池包括引物池1和引物池2，所述引物池1和引物池2包括如下引物：扩增池1(含273个扩增子)从SEQ IDNO:1-546，扩增池2(含264个扩增子)的引物对序列，从SEQ ID NO:547-1074。
本发明的一种遗传性甲状腺功能异常性疾病的致病基因标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的扩增引物池。
所述试剂盒还包括接头序列为SEQ ID NO:1075-1122。
所述试剂盒还包括缓冲液。
本发明的一种基因检测方法，包括如下步骤：(1)DNA样本采集(2)文库构建及上机流程(3)试剂盒测序检测效能评估。
所述文库构建及上机流程依次包括如下步骤：建库DNA样本纯化、纯化后的DNA定量、多重PCR扩增、清除残余引物、接头序列连接、磁珠纯化连接体系、文库质检、油包水PCR、乳液PCR反应、微珠富集、测序反应、和测序数据分析。
本发明的一种所述试剂盒的说明书，包括如下步骤的指示：(1)DNA样本采集(2)文库构建及上机流程(3)试剂盒测序检测效能评估。
所述文库构建及上机流程依次包括如下步骤：建库DNA样本纯化、纯化后的DNA定量、多重PCR扩增、清除残余引物、接头序列连接、磁珠纯化连接体系、文库质检、油包水PCR、乳液PCR反应、微珠富集、测序反应、和测序数据分析。
本发明提供一种所述基因标志物的扩增引物池的应用，包括用于制备检测遗传性甲状腺功能异常性疾病(包括甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症)的试剂盒。
本发明提供一种所述遗传性甲状腺功能异常性疾病的分子诊断试剂盒的应用，如适用于遗传性甲状腺功能异常性疾病的分子病因的明确，有助于明确诊断、分子分型，指导临床决策及后续治疗。
有益效果
本发明的甲状腺试剂盒靶向的目标基因多，涵盖的疾病表型包含了甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症；目标区域不仅包括所有外显子区还覆盖了剪接区及部分内含子区，且目标区域覆盖率高达98.4％。因此，本发明设计的甲状腺试剂盒覆盖基因更为全面；单次检测的基因多，经济高效、有助于提高突变检出率。
本发明建立了涵盖31个目的基因的试剂盒(Thyroid Panel)测序体系与流程，利用Ion Torrent PGM(personal genome machine，PGM)测序平台，在保证测序质量、测序准确性、敏感性与特异性的前提下，同时具备灵活、经济实惠、简单方便的优势，适用于遗传性甲状腺功能异常性疾病的分子病因的明确，有助于明确诊断、分子分型，指导临床决策及后续治疗。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.1标本采集与存放
1.1.1血液样本
血液样品均留取在专用管中，其中血清留取采用生化测定所用的普管，血浆留取采用EDTA抗凝管。抗凝血标本采集后冻存于－80℃超低温冰箱。
1.1.2外周血DNA提取和保存(按照QIAamp DNA Mini Kit说明书进行)大体步骤如下：
(1)裂解和消化(2)DNA吸附(3)洗涤DNA(4)DNA洗脱(5)DNA浓度测定和质量评估：使用NanoDrop分光光度计测定DNA吸光度及浓度，浓度为20-200ng/μL，OD260/OD280比值在1.8-2.0范围；通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，一般DNA片段大小为20-40kb。(6)样品保存：获得的外周血DNA样品短期存储可置于-20℃冰箱，长期则于-80℃冰箱存储。
1.2靶向基因的选择
选择如下31基因组合成一个试剂盒并命名为甲状腺平台，用以针对患者的临床症状和遗传背景进行基因诊断。
表1目标基因及对应转录本号
1.3多重PCR引物设计
通过Ion AmpliSeq Designer软件，针对靶向基因分别设计引物，覆盖区域包括外显子区及外显子和内含子的交界区，扩增片段大小125bp-375bp。由Ion Torrent公司负责合成多重PCR扩增引物池，共537个扩增子其中扩增池1含273个扩增子，扩增池2含264个扩增子。从SEQ ID NO:1-546,从SEQ ID NO:547-1074。
扩增池1
扩增池2
1.4文库构建及上机流程
1.4.1建库DNA样本纯化
利用磁珠法纯化DNA(Agencourt AMPure XP)。主要步骤如下：
(1)于4℃冰箱取出AMP磁珠，放置于室温进行复温(约30min)，涡旋混匀磁珠。
(2)结合：使用0.5ml的八联管，将DNA与复温后的AMP磁珠混合(30μL DNA+45μL磁珠)，涡旋或吹吸混匀，静置孵育(室温，5min)。等待期间配制75％乙醇(现用现配保证浓度)；
(3)分离：孵育结束稍离心后，移动八联管放于磁力架上静置5min，借助磁力架吸附AMP磁珠及DNA；
(4)乙醇洗涤；(5)再次乙醇洗涤；
(6)晾干：晾干磁珠，干燥至磁珠表面光泽消失、变为类土褐色即可(时间一般控制在5min内)。
(7)洗脱液洗涤：用50μL low TE buffer进行DNA洗脱，与磁珠混匀后，稍微离心，再次放置于磁力架上静置5min。
(8)静置结束，将上清转移至另一新1.5ml EP管中，待下一步定量检测。
1.4.2纯化后的DNA定量(Qubit3.0荧光定量仪检测)
(1)Qubit工作液配制：按照体积比染料：
dsDNA HS Buffer＝1:199进行Qubit显色工作液的配制，注意避光操作；
(2)加样孵育：包括纯化后的DNA样品以及两个试剂盒提供的标准品(S1，S2)均配成200μL的体系(使用Qubit专用的QubitTM assay tubes进行配制)。
表2试剂盒提供的标准品
加样完成后，涡旋混匀，快速离心。静置孵育2min，操作过程注意避光；
(3)上机检测：使用Qubit3.0荧光定量仪进行样本浓度检测。首先对2个标准品进行检测，计算标准曲线；然后依次进行待测样本DNA的检测，结束后导出测量结果。
1.4.3多重PCR扩增
使用HiFi高保真酶进行多重PCR扩增，高通量扩增整个引物池片段。甲状腺平台共有2个引物池，分别记为扩增池1和扩增池2，扩增模板选择为纯化后的基因组DNA。扩增体系：10ul。
(1)
表3多重PCR体系(10μL)：
| 试剂 | 10ul体系 |
| 2×引物池 | 5μL |
| 5×HiFi酶 | 2μL |
| DNA | 10ng |
| 无酶水 | 补足至10μL |
(2)多重PCR程序：
①99℃，2min
②99℃，15s
③60℃，4min
④Go to step2重复17cycles
⑤10℃，hold
1.4.4清除残余引物
(1)合并扩增池1和扩增池2中的扩增产物，共计20μl。
(2)加入2μl FuPa消化酶，涡旋混匀，短暂离心，继续放入PCR仪，以清除过剩的引物。
PCR反应条件如下：
①50℃，10min
②55℃，10min
③60℃，20min
④10℃，hold(不超过1h)
1.4.5接头序列“Barcode”连接(Ion XpressTM Barcode Adapters Kit，购自Thermo Scientific公司)
Barcode序列
| SEQ ID NO: | ID | Sequence | SEQ ID NO: | ID | Sequence |
| 1075 | IonXpress_001 | CTAAGGTAAC | 1099 | IonXpress_025 | CCTGAGATAC |
| 1076 | IonXpress_002 | TAAGGAGAAC | 1100 | IonXpress_026 | TTACAACCTC |
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| 1078 | IonXpress_004 | TACCAAGATC | 1102 | IonXpress_028 | ATCCGGAATC |
| 1079 | IonXpress_005 | CAGAAGGAAC | 1103 | IonXpress_029 | TCGACCACTC |
| 1080 | IonXpress_006 | CTGCAAGTTC | 1104 | IonXpress_030 | CGAGGTTATC |
| 1081 | IonXpress_007 | TTCGTGATTC | 1105 | IonXpress_031 | TCCAAGCTGC |
| 1082 | IonXpress_008 | TTCCGATAAC | 1106 | IonXpress_032 | TCTTACACAC |
| 1083 | IonXpress_009 | TGAGCGGAAC | 1107 | IonXpress_033 | TTCTCATTGAAC |
| 1084 | IonXpress_010 | CTGACCGAAC | 1108 | IonXpress_034 | TCGCATCGTTC |
| 1085 | IonXpress_011 | TCCTCGAATC | 1109 | IonXpress_035 | TAAGCCATTGTC |
| 1086 | IonXpress_012 | TAGGTGGTTC | 1110 | IonXpress_036 | AAGGAATCGTC |
| 1087 | IonXpress_013 | TCTAACGGAC | 1111 | IonXpress_037 | CTTGAGAATGTC |
| 1088 | IonXpress_014 | TTGGAGTGTC | 1112 | IonXpress_038 | TGGAGGACGGAC |
| 1089 | IonXpress_015 | TCTAGAGGTC | 1113 | IonXpress_039 | TAACAATCGGC |
| 1090 | IonXpress_016 | TCTGGATGAC | 1114 | IonXpress_040 | CTGACATAATC |
| 1091 | IonXpress_017 | TCTATTCGTC | 1115 | IonXpress_041 | TTCCACTTCGC |
| 1092 | IonXpress_018 | AGGCAATTGC | 1116 | IonXpress_042 | AGCACGAATC |
| 1093 | IonXpress_019 | TTAGTCGGAC | 1117 | IonXpress_043 | CTTGACACCGC |
| 1094 | IonXpress_020 | CAGATCCATC | 1118 | IonXpress_044 | TTGGAGGCCAGC |
| 1095 | IonXpress_021 | TCGCAATTAC | 1119 | IonXpress_045 | TGGAGCTTCCTC |
| 1096 | IonXpress_022 | TTCGAGACGC | 1120 | IonXpress_046 | TCAGTCCGAAC |
| 1097 | IonXpress_023 | TGCCACGAAC | 1121 | IonXpress_047 | TAAGGCAACCAC |
| 1098 | IonXpress_024 | AACCTCATTC | 1122 | IonXpress_048 | TTCTAAGAGAC |
(1)Barcode稀释：稀释比例为Barcode：P1：H2O＝1:1:2(注：每个样品需要2μl稀释后的Barcode)。同时，取出Switch溶液置于室温进行复温(复温需30min)。
(2)Barcode加样：待上一步PCR反应结束取出产物，于每个样本加入4μl Switch溶液和2μl稀释后的Barcode，再加入2μl DNA连接酶共计28μl，涡旋混匀(注：Barcode编号与检测信号一一对应，同一批次上机检测的样本中不可有相同编号的Barcode文库)。
短暂离心后，继续放入PCR仪进行以下反应：
①22℃，30min
②72℃，10min
③10℃，hold(不超过1h)
1.4.6磁珠纯化连接体系
基本步骤同上述基因组DNA纯化：
(1)结合：向上述连接了Barcode后的产物中加入37.5μl AMP磁珠，按照1:1.5的比例进行添加，充分混匀，短暂离心，静置孵育(室温，5min)。
(2)分离：孵育结束后，放置于磁力架上静置5min，吸除上清。
(3)75％乙醇洗涤(2遍)
(4)晾干：于室温充分干燥磁珠(约5min)。
(5)DNA洗脱：加入50μl low TE buffer，充分混匀，短暂离心后放于磁力架上静置5min，转移上清至新的0.5ml EP管。
1.4.7文库质检
使用qPCR法对文库浓度进行定量，具体步骤如下：
(1)标准品稀释：取出6μl标准品母液(68pM)稀释至20μl，所得溶液标为S1(浓度：3x6.8 pM)；然后进行倍比稀释(10倍)得到S2(浓度：3x0.68 pM)与S3(浓度：3x0.068pM)。获得的S1、S2、S3作为标准品用于后续的qPCR反应。
(2)文库稀释：从上一步构建完成的DNA文库中吸取2μl，进行100倍稀释后用于后续qPCR反应。
(3)加样：按照以下qPCR反应体系(10μl)在384孔板中加入相应试剂(注：每个样本需设置复孔)。qPCR反应体系(10μl)如下：
2×qPCR溶液：5μl
20×Taqman探针：0.5μl
稀释后的DNA文库或标准液：1.5μl
无酶水：3μl
(4)文库浓度检测：使用qPCR仪(FAST模式)进行文库浓度的检测，反应条件如下：
①50℃，2min
②95℃，20s
③95℃，3s
④Go to step2重复40cycles
⑤60℃，30s
(5)文库浓度计算：根据标准品的浓度进行DNA文库浓度的计算。
(6)文库质控标准：
①文库浓度＞15ng/ul
②文库有效分子浓度＞10nM
③文库DNA片段大小：300bp-600bp
1.4.8油包水PCR(water-in-oil emulsion PCR)采用Ion PGM Hi-Q试剂盒在IonOneTouchTM 2系统上进行乳液PCR反应。具体步骤如下：
(1)扩增反应试剂准备：取出Ion PGM Hi-Q Reagent Mix置于室温进行复温，复温后，涡旋混匀，短暂离心，置于室温备用；Ion PGM Hi-Q酶预混液取出后短暂离心，置于冰上备用；Ion PGM Hi-Q Ion Sphere Particles(ISPs)取出后置于室温。
(2)文库稀释与混合：将所有待测文库稀释至100pM，选择合适的芯片(一般情况下，Ion Torrent PGM 314芯片可检测～10个样本，Ion Torrent PGM 316芯片可检测～35个样本)，等体积地将待测文库进行混合。
(3)混合文库稀释：使用无核酶水对上述的混合文库进行稀释(2μl混合文库+23μl无核酶水)，充分混匀，短暂离心，置于冰上待用。
(4)ISPs磁珠：涡旋混匀1min，短暂离心，静置待用。
(5)扩增体系：按照下述反应体系(1000μl)依次加入相应试剂(吹打混合)。
①Ion PGMTM Hi-QTM View Reagent Mix：800μl；
②无核酶水：25μl
③Ion PGMTM Hi QTM View Enzyme Mix：50μl
④稀释后的混合文库：25μl
⑤Ion PGMTM Hi QTM View ISPs：100μl
加样完毕，涡旋混匀上述扩增混合液，稍离心，待上机进行PCR反应(15min之内)。
(6)油包水PCR：需先进行Ion OneTouchTM 2仪器的设置——回收管x2安装(内含150μl Ion OneTouch裂解液)；Ion OneTouch扩增板安装；分别王左右两侧的IonOneTouchTM收集管中注入Ion OneTouchTM油与收集液。准备完毕后，往Ion OneTouch反应滤器中加样。
①使用移液枪将上述配制的扩增混合液通过进样孔缓慢加入Ion OneTouch反应滤过器内；
②加入1.7mL Ion OneTouch反应油(Ion OneTouch Reaction Oil)至进样孔；
③倒转反应滤过器，安装至Ion OneTouchTM 2仪器上；
④运行Ion OneTouchTM 2油包水PCR仪，开始PCR反应(反应所需时间约16h左右)。
(7)油包水PCR产物收集：
①待PCR反应结束后，按照操作指示开始进行离心收集。
②取出收集管置于试管架上，吸走部分上清，每管分别保留收集液约100μl；使用移液枪吹打重悬管底的ISPs微珠，移至新的1.5mL EP管；
③每个收集管内加入500μl Ion OneTouch洗涤试剂(Ion One Touch WashSolution)，吹打混匀，洗涤离心收集管；同时将洗涤悬液合并至上述装有ISPs悬液的1.5mLEP管中，置于4℃冰箱中(2～8℃冰箱内保存不可超过8天)，待富集用。富集前需进行离心(最大转速，5min)，吸去部分上清，每管保留100μl，吹打重悬后备用。
1.4.9微珠富集
油包水PCR反应结束后，通过Ion OneTouchTM富集系统(Ion OneTouch ES仪)进行微珠富集。具体操作步骤如下：
(1)Melt-Off Solution配制：按照下述顺序依次加入相应试剂，涡旋混匀，该溶液需现用现配。
表4加入试剂表
| 加样顺序 | 试剂 | 体积 |
| 1 | Tween溶液 | 280μl |
| 2 | 1M NaOH | 40μl |
| — | 总体积 | 320μl |
(2)洗涤和重悬Dynabeads MyOne Streptavidin C1磁珠：
①取出Dynabeads MyOne Streptavidin C1磁珠，涡旋震荡30s，短暂离心(5s)；使用移液枪吹打混匀磁珠，立即吸取13μl磁珠悬液至新的1.5mL EP管中。
②将EP管移到磁力架上，静置5min至上清澄清，吸走上清。
③弃上清后，向EP管中加入130μl MyOne磁珠洗涤液(MyOne Beads WashSolution)，涡旋混匀(30s)，短暂离心(2s)。
(3)八孔槽安装与加样
取出全新的一个八孔槽，方形标记端(方头)置于操作者左手侧，圆形标记端(圆头)靠右侧，从左到右依次加入下述试剂：
表5依次加入试剂表
(4)阳性模板微珠(template-positive ISPs)富集：
①安装Ion OneTouch ES仪器的加样枪头与加样臂(注意：需保证安装紧密)。
②取出新的200μl PCR管，加入10μl中和溶液(Neutralization Solution)，将其安装至Ion OneTouch ES仪器上(左侧的孔)。
③使用移液器反复吹打8孔槽第2孔的Dynabeads MyOne Streptavidin C1磁珠悬液，使其充分混匀。
④运行Ion OneTouch ES仪器。
⑤运行程序结束后，立即取下200μl PCR管，关闭PCR反应管管盖，管内液体即为阳性模板富集产物。手动上下颠倒PCR反应管(5次)，使富集产物充分混匀，放置于4℃冰箱待用(不超过3天)。
1.4.10测序反应
根据测序通量选择318芯片(The Ion 318TM Chip v2 BC)，配制相应的测序体系，在Ion Torrent PGM测序仪上继续测序反应。具体操作步骤如下：
(1)选择运行程序：在PGM联机电脑上运行Torrent Suite软件，按操作提示设置运行程序。
(2)PGM测序仪清洗：根据操作说明对PGM仪器进行清洗，包括水洗(18MΩ水)、氯洗(现配的含1M NaOH溶液的清洗剂)、再水洗(18MΩ水)。氯洗过程所需现配的清洗剂具体配制方法：取干净的2L玻璃瓶一个，并加入1L 18MΩ水、一包Ion PGM清洁剂(氯剂)，待清洁剂充分溶解(需要时间约10min)后，加入1mL 1M NaOH溶液，充分混匀，再使用0.22μm(或0.45μm)的滤筛进行杂质颗粒的过滤去除。
(3)PGM测序仪初始化：
①配制W1，W2，W3瓶相应的溶液；配置完毕后，点击“Initialize”开始运行，按图像提示，分别更换W1、W2、W3位置的吸管，同时安装对应的洗瓶，进行第一阶段初始化。
②dNTP储备液取出室温融化，取4个50ml离心管，分别进行标记(A，T，C，G)；各加入20μl对应的dNTP溶液。待上述第一步初始化完成后，移走ATCG位置的反应液吸管及收集盒，更换新的反应液吸管，并将准备的装有dNTP的离心管安装至对应的位置，继续进行初始化。
(4)测序样品准备：
①取出阳性模板富集产物充分混匀，于其中加入ISP对照液(Control IonSphereTM Particles)5μl，吹打混匀。
②离心：离心(15500g，5min)，吸去上清，保留约15μl液体；再加入测序引物(Sequencing Primer)12μl，总体积约27μl，吹打混匀。如若不足27μl，可加入退火缓冲液(Annealing buffer)补足体积。
③退火反应：反应管放入PCR仪行退火处理，反应程序为：95℃，2min；37℃，2min；25℃hold。
④退火反应完成后，加入测序聚合酶(Ion PGM Hi-Q View SequencingPolymerase)3μl，使用移液器充分吹打混匀(注意避免产生气泡)，室温静置5min。
(5)装载芯片、上样测序：
①芯片检查：进行上样前需先检查芯片，再小心将芯片安装到PGM仪器芯片槽内，并根据屏幕内操作指示进行芯片检查(为避免静电，检查前摘下手套)。
②加样：根据芯片的容量加入对应体积步骤(4)准备好的测序样品(Ion TorrentTM314芯片：10μl；Ion TorrentTM 316和Ion TorrentTM 318芯片加30μl)。
③离心：将芯片与底座放入离心机，离心30s；离心时注意将芯片标签朝里避免损坏。
④离心结束后，45°持芯片，用移液枪将芯片内的液体吹吸混匀，重复操作3次以充分混匀芯片内液体(吹打混匀时需注意避免产生气泡)。混匀完毕后，离心30s。
⑤重复上一步操作。
⑥将芯片安装于PGM仪上，根据试验需求选择对应的测序流程，点击“Run”开始运行。
1.4.11测序数据分析
完成测序后，服务器会根据建库使用的Barcode进行测序数据的归类。测序结果使用Ion Torrent SuiteTM Software进行初步分析，具体步骤如下：
(1)测序数据质量控制：原始数据使用本地电脑Ion Torrent Suite Software进行分析，包括数据传输、信号读取、碱基比对、拼接reads、质量控制、覆盖率分析。主要通过以下几个方面进行测序质量评估，包括覆盖深度(Coverage depth，用于特定区域碱基识别的有效核酸测序片段，又称为读段(reads)数目)、覆盖均一性(uniformity of basecoverage，基因组某一特定区域内测序的一致性)、在靶率(on target coverage，比对reads占产生reads的百分比，表示成功比对的reads的比例)。质控符合标准方可用于后续测序数据的分析。
(2)变异识别(本地服务器)：使用Variants caller程序对原始测序数据进行变异识别。
(3)变异注释(在线服务器)：登陆ION-TORRENT云端分析平台，上传上述变异识别文件，使用Annotate variants(reference hg19，version 5.12)程序对识别的变异进行注释。待程序结束，将生成含有基因突变注释信息的VCF格式文件。
(4)变异结果分析判读：对变异进行人工判读及致病性评分，具体的解读流程与标准，参考2015年美国医学遗传学与基因组学学会(The American College of MedicalGenetics and Genomics,ACMG)制定的指南《Standards and guidelines for theinterpretation of sequence variants》。
1.4.12Sanger测序
对于甲状腺平台检测发现的突变，需设计对应引物进行PCR扩增，利用Sanger测序验证突变位点。
1.5试剂盒测序检测效能评估
选取本中心收集的临床诊断、基因诊断明确(Sanger测序明确THRB突变)的RTH患者15例进行试剂盒二代测序，比较Sanger测序结果与甲状腺平台检出的变异情况，评估试剂盒检测效能。
本发明选取了PAX8,NKX2-1,FOXE1,NKX2-5,SLC5A5,TPO,DUOX1,SLC26A4,TG,DUOXA2,DUOX2,DIO1,DIO2,DIO3,SECISBP2,DEHAL1,TSHR,TSHB,THRA,THRB,SLC16A2,TRHR,POU1F1,PROP1,LHX3,IGSF1,GLIS3,TBG,TTR,ALB,CRYM共31个基因，命名为“甲状腺平台”。覆盖了与甲状腺发育不全、甲状腺激素合成障碍、甲状腺激素结合蛋白异常、中枢性CH、RTH等相关的致病基因。
甲状腺平台拟对每个基因的外显子区及侧翼区进行扩增，利用Ion AmpliseqDesigner软件，设计上述31个基因的多重PCR引物，引物设计结果如下：
设计的引物共覆盖了148.98kb的碱基，未覆盖碱基仅1056bp，覆盖目标区域高达98.94％(表6)。对上述基因进行扩增的多重PCR过程分为2个引物池，分扩增池1和扩增池2进行，共含537个扩增子(扩增池1含273个扩增子，扩增池2含264个扩增子)，多重PCR产物大小125-375bp。
表6甲状腺平台靶向基因目标区域及覆盖率
甲状腺平台测序质量控制
利用20份样本进行甲状腺平台测序，平均测序深度429.8，均一性93.99％，20x覆盖率97.64％，表明扩增产物均一性较好，无偏向性；“End to End”(完美产物扩增子)比例高达74.27％；测序在靶率为98.06％。测序质控结果符合Ion Torrent PGM测序质量标准，可用于后续测序数据分析。
以Sample 1单样品测序数据质控数据为例，能与目标区域比对上的片段占比即在靶率为97.65％；平均测序深度490.1，一致性达74.96％。
测序质控结果表明(表7)甲状腺平台扩增效率高，质控指标理想，满足胚系基因突变筛查的需求。
表7各样本测序情况
甲状腺平台的测序效能
选取了15例Sanger测序明确THRB突变诊断为RTH的患者(临床特征及基因型见表8)；15例TSH瘤诊断明确且Sanger测序证实无THRB突变样本作为阴性样本，利用上述方法设计的甲状腺平台对他们进行了靶向二代测序。
15例THRB突变均被检出，15例与阴性样本均未检出THRB突变，与Sanger测序结果一致。检出的THRB突变位点等位基因频率(allele frequency)居于45-55％，甲状腺平台测序结果准确度为100％。
表8 15例RTH患者临床特征及突变信息
注：M：男性；F：女性
实施例2
甲状腺平台的临床应用
针对自2012-2019年入组的共125例患者进行甲状腺平台检测，共诊断46例由基因突变引起的先天性甲状腺功能异常，包括33例THRB突变，6例ALB突变，4例TPO突变，1例PAX8突变以及2例PDS突变；突变类型包括错义突变、移码突变、剪接位点突变等；最常累及THRB基因。33例THRB突变患者均为点突变所引起的错义突变，突变位点均位于THRB第7-10号外显子。平均诊断年龄25.7±14.0岁，患者最常表现为甲状腺肿大，平均FT38.63±2.58pmol/L，FT4 25.61±7.29pmol/L，TSH 6.51±8.20IU/ml。
6例ALB突变患者来自2个家系，均为R242H杂合突变；2例SLC26A4(PDS)均为复合杂合突变，表现为甲状腺肿伴耳聋；1例PAX8 R133Q杂合突变导致甲状腺发育不全患者，甲状腺超声检查提示双侧甲状腺形态偏小，左甲：3.74*5.47mm右甲：7.29*6.5mm，峡部厚度正常；4例TPO复合杂合突变患者。
表1-3 ALB、SLC26A4(PDS)、TPO、PAX8突变位点总结
| 突变基因 | 突变位点 | |
| 患者1 | ALB | R242H |
| 患者2 | ALB | R242H |
| 患者3 | ALB | R242H |
| 患者4 | ALB | R242H |
| 患者5 | ALB | R242H |
| 患者6 | ALB | R242H |
| 患者7 | SLC26A4(PDS) | c.918+2T>C；c.1692dupA，p.Cys565 fs |
| 患者8 | SLC26A4(PDS) | c.919-2A>G；H723R |
| 患者9 | TPO | p.A544V；p.E641Kfs |
| 患者10 | TPO | p.E337K；p.A544V |
| 患者11 | TPO | p.D224del；p.R665Q |
| 患者12 | TPO | p.D224del；p.C808As |
| 患者13 | PAX8 | p.R133Q |
如上述患者11，青年女性，因颈部增粗就诊，自幼颈粗但未予重视，就诊时甲状腺肿大明显(III度)，甲功检测结果示T3(2.54nmol/L)、FT3(6.08pmol/L)及TSH(6.2051μIU/mL)升高、T4(44.61nmol/L)和FT4(7.91pmol/L)降低，甲状腺抗体阴性；另外患者甲状腺吸碘率升高(44.27％，3h；49.11％，6h；77.73％，24h)。患者就诊前接受L-T4(25μg/d)治疗11个月后，FT4仍低于正常范围。无家族史。患者存在原发性甲功异常伴明显增大的甲状腺肿，病程长，高度怀疑存在甲状腺激素合成障碍。如果采取Sanger测序法逐一检测，对样本量需求高且费时费力。本发明利用甲状腺平台成功检测出该患者存在TPO基因突变：c.670_672delGAC(p.Asp224del)以及c.1994G>A(p.Arg665Gln)；同时利用Sanger测序进行了验证，同时患者父母的外周血验证结果提示上述两个突变分别来自于其父亲与母亲。通过甲状腺平台明确了患者的病因及分子基础，为后续的治疗与随访提供依据。最后，于基因层面找到潜在病因，对于下一代的优生优育亦具有重要意义。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
上海市内分泌代谢病研究所
2, 1
<120> 一种遗传性甲状腺功能异常性疾病致病基因的标志物及其检测试剂盒
<130> 1
<160> 1122
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cgtacaaact ggtcgaggac aa 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcttgcctaa gaagaggaaa tcagg 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gggaagggag catgagtttt cc 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
caggaaaccc taaatgtgtt ggatc 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aggttgttaa accagccgtc atag 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cctgagactg gaaggtcatt tcg 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tgtcctcaga gattctacct ctctatga 28
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cccaggctga gaacatcatg tg 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ggcagcgcca tctatggtt 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
acgagcggta gcgtgatc 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ccttttcact aggcgtggac tt 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gctaaggttg tgtcctcctc aatg 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ccaccctggg atctggaaac 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
cgcgatgctg ctggaaac 18
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
ttgcacagga atggagacca aga 23
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
gcatcctagg ttatcgtagt gtctca 26
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
cgctcaggaa cgctggta 18
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
caccgcgatg tccatcttg 19
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
gtctgagtta gatgtgtgac ttgga 25
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
cctccagctt ctctcccttt ctaa 24
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
gggagcaggt tctgtaagtg aa 22
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
gcagtatttc cgcaacatga agc 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
gctgcaagaa gcttctgggt ta 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
tggagccctt ctattccaca ga 22
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
ctcaaggccc tcaatgcg 18
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
ctgggagaga gaagccacga tg 22
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
atttgtgtat ctgcatattt gtgtgtgtg 29
<210> 28
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<213> 人工序列()
<400> 28
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<211> 30
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 144
tgcagccctc tagtgtaaca ga 22
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<213> 人工序列()
<400> 145
ctgcagcagc agaaacaagt acca 24
<210> 146
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 146
gggtctctac cgtaggcgt 19
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<213> 人工序列()
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cttgttgaaa cacatgataa tgggct 26
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<213> 人工序列()
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agcaaaatct tgacaatgcc aaca 24
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<213> 人工序列()
<400> 149
gctcaggtga ttagagacca agga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 150
gaaccaggtg gtgctagaaa aac 23
<210> 151
<211> 23
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<213> 人工序列()
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ggatgatcac agaccatgga tgt 23
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<213> 人工序列()
<400> 152
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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gctttctctc tttcttgttc ttaatttggt 30
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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caatccgtat cctgctaaaa tgtttatctt 30
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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tgtctccgtt tctggtctca ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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cttccaccca cacatcctct aag 23
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agccaggcac tgagtaaaca ttc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccagtatctt tataaccaac ccagttgt 28
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<213> 人工序列()
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tgtcaaactt ttgctgatca tacgttttt 29
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caacaatttt ggttatcttt gagcagagtt 30
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<213> 人工序列()
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accatccatc ttcagaaact catttcc 27
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<213> 人工序列()
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cgtgcctccc tatcatttac agg 23
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<213> 人工序列()
<400> 395
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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ctgggaggat ctgaagggat tg 22
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<213> 人工序列()
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tgtcctctgt agctgggatg tt 22
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acctagggac tcctaattaa agtcagtaaa 30
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tcgctaaagg gagtacttgg ga 22
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tagagttcta cctgttagac aaccaaaga 29
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tttccttcag aactattcta gtgaatgctg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1003
ccaggccttt cttgtctctt tcc 23
<210> 1004
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1004
ggctctggct aaatccctgt cta 23
<210> 1005
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1005
tcattaagga gtcttggagg acagt 25
<210> 1006
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1006
cctttctgac cagcagtgtt gt 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggcggagcta gataaagagg aag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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tctctccatt ttcgctgcag aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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accatgtaaa taattgacct gaatgatgga 30
<210> 1010
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1010
cattcagtgt acaaaggatc tctctctttt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcaacttcca gctgctttga tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtgtcactct cactccctga c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gagactgagg ttagaaggca ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gctcctcatc accttttcgg at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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tcttcatttt acaaaaactc gcaaatgga 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
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cagtcagtaa agtgagcttt agaaagaaac 30
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaacctgtcc acggccaa 18
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggactaggaa acacggagta aacag 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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acagcaataa agatttgcaa accaagt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccattctgtt tgacgtttta aatagcact 29
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcaggtaatc aggctgatga ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggattaact ttgcatgaat aatgtgagt 29
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1051
ggagacaagt gcaatgcaat gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gctccaggag gatattctcc ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cacatcctgg ctgtatcttt tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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agcaacaggg aaatagacac agtc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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tcaaagctaa gaatccactc atgca 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccatttcctt atctgtgaac gaggat 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcccaccatt ctcttccact tata 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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caatagctcc aggatgagct ttaca 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gctccttttg accagcagag aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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agcaaatcac tgacatgtgg gaa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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gttgcctgct cttctcactt ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1063
ggcttgcact gctatgagtg aa 22
<210> 1064
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccttccaact aggaagtgcc aa 22
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<213> 人工序列()
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gatcacagat ttcaacagag ttttaggc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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atgagctgat gtgacattat gcca 24
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<213> 人工序列()
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ctgccataga cagcaccatg at 22
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<213> 人工序列()
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agccaactag acttttgcag ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcatttgcaa acatttatac agcaca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1070
atttgaatct ctttgccctt tccaac 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtatgttgga gctaccttac aaagga 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gttttaatgg tttgatttgg tttgtctcga 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcaaaaggtc aatatgacac gaataggtta 30
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cttctttatg attctgctca aaacaccac 29
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctaaggtaac 10
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<213> 人工序列()
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taaggagaac 10
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<213> 人工序列()
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taccaagatc 10
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cagaaggaac 10
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<212> DNA
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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tctattcgtc 10
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<211> 10
<212> DNA
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<400> 1092
aggcaattgc 10
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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aacctcattc 10
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<213> 人工序列()
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cctgagatac 10
<210> 1100
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1100
ttacaacctc 10
<210> 1101
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1101
aaccatccgc 10
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<211> 10
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<213> 人工序列()
<400> 1102
atccggaatc 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1103
tcgaccactc 10
<210> 1104
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1104
cgaggttatc 10
<210> 1105
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1105
tccaagctgc 10
<210> 1106
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1106
tcttacacac 10
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1107
ttctcattga ac 12
<210> 1108
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1108
tcgcatcgtt c 11
<210> 1109
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1109
taagccattg tc 12
<210> 1110
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1110
aaggaatcgt c 11
<210> 1111
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1111
cttgagaatg tc 12
<210> 1112
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1112
tggaggacgg ac 12
<210> 1113
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1113
taacaatcgg c 11
<210> 1114
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1114
ctgacataat c 11
<210> 1115
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1115
ttccacttcg c 11
<210> 1116
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1116
agcacgaatc 10
<210> 1117
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1117
cttgacaccg c 11
<210> 1118
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1118
ttggaggcca gc 12
<210> 1119
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1119
tggagcttcc tc 12
<210> 1120
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1120
tcagtccgaa c 11
<210> 1121
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1121
taaggcaacc ac 12
<210> 1122
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1122
ttctaagaga c 11
Claims (10)
1.一种遗传性甲状腺功能异常性疾病的致病基因标志物，其特征在于，所述标志物包括下述相关基因的基因集：PAX8,NKX2-1,FOXE1,NKX2-5,SLC5A5,TPO,DUOX1,SLC26A4,TG,DUOXA2,DUOX2,DIO1,DIO2,DIO3,SECISBP2,DEHAL1,TSHR,TSHB,THRA,THRB,SLC16A2,TRHR,POU1F1,PROP1,LHX3,IGSF1,GLIS3,TBG,TTR,ALB,和CRYM。
2.一种如权利要求1所述基因标志物的扩增引物池，其特征在于，所述引物池包括引物池1和引物池2，所述引物池1引物如SEQ ID NO:1-546所示和引物池2的引物如SEQ ID NO:547-1074所示。
3.一种遗传性甲状腺功能异常性疾病的致病基因标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的扩增引物池。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括接头序列为SEQID NO:1075-1122。
5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液。
6.一种基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)DNA样本采集(2)文库构建及上机流程(3)试剂盒测序检测效能评估。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述文库构建及上机流程依次包括如下步骤：建库DNA样本纯化、纯化后的DNA定量、多重PCR扩增、清除残余引物、接头序列连接、磁珠纯化连接体系、文库质检、油包水PCR、乳液PCR反应、微珠富集、测序反应、和测序数据分析。
8.一种权利要求3所述试剂盒的说明书，包括如下步骤的指示：(1)DNA样本采集(2)文库构建及上机流程(3)试剂盒测序检测效能评估。
9.根据权利要求8所述的试剂盒说明书，其特征在于，所述文库构建及上机流程依次包括如下步骤：建库DNA样本纯化、纯化后的DNA定量、多重PCR扩增、清除残余引物、接头序列连接、磁珠纯化连接体系、文库质检、油包水PCR、乳液PCR反应、微珠富集、测序反应、和测序数据分析。
10.一种权利要求2所述基因标志物的扩增引物池的应用，其特征在于，包括用于制备检测遗传性甲状腺功能异常性疾病的试剂盒。
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