CN109680039A - 一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法和试剂盒 - Google Patents

一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法和试剂盒，涉及ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1，TGFBR2的基因突变。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)全部被覆盖，并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段，PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池，分别进行多重PCR扩增，再进行引物序列消化、连接测序接头、文库纯化并质检，最终构建检测文库。该方法建库步骤简便快速，有效降低成本，减少工作量，变异类型全面、检测准确率达到100％、通量高。

Description

一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法和试 剂盒。
背景技术
遗传性主动脉疾病(Inherited Aortopathy)以主动脉扩张，主动脉瘤，主动脉夹层为特征，常见 于以下患者：马凡综合征(MFS)、Loeys-Dietz综合征(LDS)、血管型Ehlers-Danlos综合征(vEDS)、 家族性胸主动脉瘤/夹层(FTAAD)等。遗传性主动脉疾病的共同特点是主动脉瘤发生破裂的风险高，必 须通过手术置换损伤部位动脉而避免发生致命性动脉瘤破裂。这些疾病有着不同程度的临床表型重合， 仅靠临床症状往往难以区分确诊。这种情况下，基因检测就显示出无可比拟的优势，可在患者症状表现 完全之前就明确诊断。
遗传性主动脉疾病中，马凡综合征最为常见，发病率为20-33/10万，与乳腺癌的发病率28/10万 相当。马凡氏综合症是一种影响身体许多部位结缔组织的疾病。结缔组织为骨骼、韧带、肌肉、血管和 心脏瓣膜等结构提供力量和灵活性。马凡综合征的体征和症状在严重程度、发病时间和进展速度上有很 大差异。马凡综合征的两个主要特征：1)主动脉缺陷，可能导致血管壁凸起(主动脉瘤)；或者导致 主动脉瓣的渗漏，进一步导致主动脉壁层的突然撕裂(主动脉夹层)。主动脉瘤和主动脉夹层可能危及 生命。2)由一个或两个眼睛的晶状体异位引起的视力问题。
许多患有马凡综合征的人都有其他心脏问题，包括二尖瓣脱垂，主动脉瓣反流。这些阀门的泄漏会 导致呼吸短促、疲劳、心悸。马凡氏综合症的患者通常是高而苗条的，有细长的手指和脚趾，而且手臂 的长度超过了他们的身高。其他常见的特征包括长而窄的脸、拥挤的牙齿、脊椎的异常弯曲(脊柱侧凸 或脊柱后凸)，鸡胸，漏斗胸。有些人会在胸腔内形成一种异常的空气积聚，从而导致自发性气胸。一 种叫做硬脑膜的膜，环绕着大脑和脊髓，可以在马凡综合征患者身上异常放大，硬脑膜扩张。硬脑膜扩 张会导致背部、腹部、腿部或头部疼痛。大多数马凡综合征患者都有一定程度的近视。白内障可能发生 在成年期，在马凡综合征患者中，眼压升高(青光眼)的发生率比常人要高。马凡综合征的特征在婴儿 期到成年期之间是很明显的。根据症状的发作和严重程度，马凡综合征患者在生命早期就可能死亡；然 而，大多数患者都能活到成年晚期。
FBN1(Fibrillin 1)是一种蛋白质编码基因。与FBN1相关的疾病包括马凡综合征。其相关通路包 括ERK信号通路和整合素通路。与该基因相关的基因本体注释包括钙离子结合和胞外基质结构组成。 FBN1所编码蛋白是原纤蛋白家族的一员。编码前原蛋白经蛋白水解生成细胞外基质成分原纤蛋白-1和 白脂素两种蛋白。纤维蛋白-1是一种细胞外基质糖蛋白，作为钙结合微纤维的结构成分。这些微纤维 在全身的弹性和非弹性结缔组织中提供承受力的结构支撑。白脂素已被证明可以调节葡萄糖稳态。该基 因的突变与马凡综合征、Weill-Marchesani综合征、Shprintzen-Goldberg综合征和新生儿早衰综合征 有关。
ACTA2(Actin,Alpha 2)是一种蛋白质编码基因。ACTA2相关疾病包括多系统性平滑肌功能障碍综 合征、主动脉瘤。其相关通路包括ERK信号通路和Apelin信号通路。与该基因相关的基因本体注释包 括蛋白激酶结合。该基因编码六种不同肌动蛋白中的一种。
Actins是一种高度保守的蛋白，参与细胞的运动、结构、完整性和细胞间信号传递。编码蛋白是 一种平滑肌肌动蛋白，参与血管收缩和血压稳态。该基因的突变可引起多种血管疾病，如主动脉疾病、 冠状动脉疾病、中风，以及多系统性平滑肌功能障碍综合征。
COL3A1(型胶原1链)是一种蛋白质编码基因。与COL3A1相关的疾病包括埃勒-丹洛综合征、血管类 型和肢端肥大症、戈特朗型。其相关通路有ERK信号和局灶性粘连。与该基因相关的基因本体注释包括 整合素结合和SMAD结合。该基因编码III型胶原是一种原纤维胶原，存在于可扩展的结缔组织中，如 皮肤、肺、子宫、肠和血管系统，通常与I型胶原有关。该基因的突变与埃勒斯-丹洛斯综合征IV型、 主动脉和动脉动脉瘤有关。通过使用交替的聚腺苷酸化信号，已经确定了该基因的两个转录本。
MYH11(Myosin Heavy Chain 11)是一种蛋白编码基因。与MYH11相关的疾病包括主动脉瘤、骨髓 嗜酸性粒细胞异常的急性髓系白血病(16)(P13q22)或T(16；16)(P13；Q22)。相关通路包括ERK信号通路 和Rho GTPases对肌动蛋白骨架重构的调控。与该基因相关的基因本体注释包括钙调蛋白结合和运动活 性。该基因的一个重要副产物是MYH9。该基因编码的蛋白为平滑肌肌球蛋白，属于肌球蛋白重链家族。 该基因产物是由两个重链亚基和两对不相同的轻链亚基组成的六聚体蛋白质的亚基。它是一种主要的收 缩蛋白，通过ATP的水解将化学能转化为机械能。编码大鼠NUDE1人体正位基因的基因是从该基因的反向链转录而来，其3'端与后者重叠。16号染色体的心包倒置[inv(16)(p13q22)]产生嵌合转录本，该转 录本编码由核结合因子beta N端的前165个残基组成的蛋白，与平滑肌肌球蛋白重链的c端部分融合。 这种染色体重排与M4Eo亚型的急性髓系白血病有关。不同的剪接产生不同表达的亚型，其比值在肌肉 细胞成熟过程中发生变化。另外，已经鉴定出编码不同亚型的剪接转录本变体。
MYLK(Myosin轻链激酶)是一种蛋白质编码基因。与MYLK相关的疾病包括主动脉瘤、家族性胸7 和内脏肌病。其相关通路有局灶性粘附和Apelin信号通路。与该基因相关的基因本体注释包括转移酶 活性、转移含磷基团和蛋白酪氨酸激酶活性。这个基因的一个重要的副基因是SPEG。该基因是免疫球 蛋白基因超家族的肌肉成员，编码肌球蛋白轻链激酶，这是一种钙/钙调蛋白依赖酶。这种激酶磷酸化 肌凝蛋白调节轻链，促进肌凝蛋白与肌动蛋白丝相互作用，产生收缩活性。这个基因编码平滑肌和非肌 肉亚型。此外，在3'区域的内含子中使用一个单独的启动子，它编码端素蛋白，这是一种与肌球蛋白 轻链激酶C端序列相同的小蛋白，它在平滑肌中独立表达，功能是稳定未磷酸化的肌球蛋白丝。伪基因 位于染色体3的p臂上。已鉴定出4个产生4种钙/钙调蛋白依赖酶亚型的转录本，以及2个产生2种 端素蛋白亚型的转录本。已经发现了更多的变体，但是缺少完整的长度记录。
SMAD3(SMAD家族成员3)是一种蛋白质编码基因。与SMAD3相关的疾病包括Loeys-Dietz综合征3 和结节性皮肤多动脉炎。其相关通路包括基因表达和子宫内膜癌。与该基因相关的基因本体注释包括 DNA结合转录因子活性和序列特异性DNA结合。该基因的一个重要副产物是SMAD2。SMAD蛋白是介导多 种信号通路的信号转导和转录调制器。这种蛋白是一种转录调制器，通过转化生长因子-beta被激活， 并被认为在调控致癌过程中发挥作用。
TGFBR1(转化生长因子受体1)是一种蛋白质编码基因。与TGFBR1相关的疾病包括多发性自愈性鳞 状上皮瘤和洛伊斯-迪茨综合征1。相关通路有mTOR通路和p38MAPK信号通路(WikiPathways)。与该 基因相关的基因本体注释包括转移酶活性、转移含磷基团和蛋白酪氨酸激酶活性。ACVR1B基因是该基 因的一个重要副产物。该基因编码的蛋白质与II型tgf-受体结合后形成异聚体，将tgf-信号从细胞 表面传导到细胞质。编码蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该基因的突变与Loeys-Dietz动脉瘤综合征 (LDAS)有关。该基因的多种转录本变体编码了不同的亚型。
TGFBR2(转化生长因子受体2)是一种蛋白质编码基因。与TGFBR2相关的疾病包括Loeys-Dietz综 合征2。相关通路有mTOR通路和乳腺癌综合通路。与该基因相关的基因本体注释包括转移酶活性、转 移含磷基团和蛋白酪氨酸激酶活性。该基因编码的蛋白是一种跨膜蛋白，具有蛋白激酶结构域。这种受 体/配体复合物磷酸化蛋白，然后进入细胞核，调控与细胞增殖、细胞周期阻滞、伤口愈合、免疫抑制 和肿瘤发生相关的基因转录。该基因的突变与马凡综合征、Loeys-Dietz主动脉瘤综合征以及各种类型 肿瘤的发生有关。另外，还对编码不同亚型的剪接转录本变体进行了表征。
sanger测序技术检测ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1，TGFBR2的基因突变 存在很大局限性，表现在：受通量限制，该方法仅适用若干明确致病热点筛查，而对于候选基因或位点 数目较多的大样本病例筛查是难以完成的，不仅耗时，投入产出比也非常低。另外，检测过程复杂，同 一次检测中单核苷酸变异、短片段插入缺失与大片段缺失与重复需要两次PCR反应单独检测。
高通量基因测序技术检测ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1，TGFBR2的基因突 变，需要制备二代测序文库。如果制备文库中涉及到基因组DNA片段化，会存在末端修复、加A、加接 头等步骤，步骤多且繁琐，操作时间长，容易造成污染等问题。这是因为，物理打断需要借助打断仪， 基于超声剪切原理可将DNA打断成100-1500bp片段；化学打断法主要依赖于酶打断法，经内切酶打断 后能产生100-800bp的片段。通过物理打断法对DNA进行打断需要投入打断仪以及仪器维护，而且要经 过磁珠纯化富集DNA片段，才能进行后续的建库步骤，进一步增加了人工操作。
因此，有必要寻找一种新的检测遗传性主动脉疾病的基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本 和劳动强度。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方 法，该方法建库步骤简便快速，有效降低成本，减少工作量，变异类型全面、检测准确率达到100％、 通量高。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性主动脉疾病的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性主动脉疾病的基因检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库，涉及ACTA2，COL3A1，FBN1， MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1，TGFBR2的基因突变。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可 变剪切区)全部被覆盖，并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段，PCR扩增引物被分离 成两个独立的引物池，分别进行多重PCR扩增，再进行引物序列消化、连接测序接头、文库纯化并质检， 最终构建检测文库。
本发明的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：提供受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质检后，要求DNA符合一定质控标 准；
(2)多重PCR扩增：利用上述DNA文库从高通量测序平台自动合成覆盖全部基因的扩增引物文库，对 目标区域进行多重PCR扩增；
(3)引物序列消化：将步骤2得到的引物扩增产物混合，进行消化反应；
(4)连接测序接头：连接高通量半导体测序平台专用的测序接头，含样本标签序列，在DNA连接酶的 作用下，将测序接头与步骤3的消化产物连接；
(5)文库纯化：步骤(4)得到的连接产物中加入纯化磁珠,混匀，置于磁力架上，直到溶液澄清后， 弃掉上清，使用乙醇清洗磁珠，离心，吸尽残余液体，干燥，加入Tris-EDTA缓冲液,吹吸混匀， 室温放置，澄清后即得纯化文库；
(6)文库质检：使用Real-Time PCR对纯化文库定量质检。
本发明上述的遗传性主动脉疾病的基因检测文库构建方法，所述目标区域包含以下基因的全编码区 和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1， TGFBR2。
上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、体液、组织器官样本等，优选 核酸样本为血细胞、口腔黏膜脱落细胞。
上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA浓度≥5ng/μL；DNA纯度：OD260/2801.8-2.0， OD260/230>2；DNA总起始量:15ng。
步骤(1)中所述的核酸提取方法、DNA质控方法均按照现有技术的操作规程进行。
上述步骤(2)中为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)全部被覆盖，并避免 相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池，分别 进行多重PCR扩增。
进一步优选每个引物池反应体系为5-10μL，总体积为10-20μL。更优选每个引物池反应体系为5 μL，总体积为10μL。
上述步骤(2)中所述的多重PCR扩增反应体系按照下述体积比组成，扩增预混液：Aorta引物池： DNA＝1:2.5:1.5；具体反应体系及反应条件见表1。
所述扩增预混液按照现有技术配制而成或者购买。
表1多重PCR扩增反应体系组分及反应条件表
表2多重PCR扩增引物池中引物序列表
本发明所述步骤(3)引物序列消化：将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合，将消化反应 预混液、无核酸水加入到混合PCR产物，其体积比为1:1:10。由于扩增产物两端是引物序列，本步骤 (3)消化反应可避免扩增过程中引入引物5’端的简并碱基，减少测序长度(两端引物序列长度近 40bp)。优选消化反应体系：将1μL消化反应预混液，1μL无核酸水加入到10μLPCR产物中，总体积 12μL。
在PCR仪中依此按照下述条件运行：50℃保持20min；55℃保持20min；60℃保持20min，然后保 持在10℃不超过1h。
本发明步骤(3)中所述的消化反应预混液是由消化酶及Tris-HCL按照现有技术配制而成或者购买。
本发明上述步骤(4)连接高通量半导体测序平台专用的测序接头(含样本标签序列)，在DNA连 接酶的作用下，将测序接头与步骤3的产物连接。所述连接接头反应体系按照下述体积比组成，连接反 应缓冲液：DNA连接酶：接头＝2:1:1。具体反应体系及反应条件见表3。
表3连接接头反应体系组分及反应条件表
本发明上述所述的连接反应缓冲液是指：含Tris-HCL,dNTP，Mg2+的溶液，按照现有技术配制或者 购买。
本发明所述平台通用测序接头序列，A端CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG，P端 CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT。优选是Ion Torrent平台通用测序接头序列。
本发明所述的样本标签序列在测序接头序列A端，长度为10bp,其在测序模板序列的位置如下：
A端接头序列+样本标签序列+GAT+文库序列+P端接头序列+磁珠 CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG+CTAAGGTAAC+GAT+NNNNN+ CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT+磁珠；其中GAT序列是固定序列，为了均衡测序接头 的链接效率。所述NNNNN为文库序列。
所述样本特异性标签见下表4：
步骤(5)所述的纯化过程：在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀，室温保持5min后，置于 磁力架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用150μL新鲜的70％乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清， 短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5min，取下EP管加入50μL的Tris-EDTA缓冲液, 吹吸混匀，室温放置5min，移至磁力架上，澄清后将文库转移到干净的EP管中。
步骤(6)将纯化后的样本文库进行质检：使用Real-Time PCR进行文库定量：先将标准品按照10 倍梯度稀释；将样本文库100-200倍稀释；反应体系是由下述体积比组成，2×Master Mix：20× TaqMan：样本标准品＝5:0.5:4.5。具体反应体系及反应条件按照下表5配制试剂(7500/7300standard)。 样本文库浓度应≥100pM。
表5 Real-Time PCR反应体系及反应条件
进一步优选，步骤(6)将纯化的样本文库进行质检：使用Real-Time PCR进行文库定量：先将标 准品按照S1、S2、S3的顺序稀释，原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM，将 样本文库100-200倍稀释。
本发明上述步骤(2)、步骤(4)所述的高通量半导体为Ion Torrent。
进一步优选，一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库，包括如下步骤：
(1)核酸提取及质检：口腔粘膜脱落细胞经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度: 5ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:15ng；
(2)多重PCR扩增：为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)全部被覆盖，并避免相 邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段，PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池，分别进行多 重PCR扩增，每个反应为5μL，总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增，反应体系为：扩增反应预混液1μL，Aorta引 物池2.5μL，DNA 1.5μL，合计5μL。多重PCR反应条件为：99℃保持2min，然后进行16个循环， 每个循环为99℃保持15s，60℃保持4min，然后保持在10℃，结束反应。
(3)引物序列消化：将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合，加入如下消化反应体系：10μL扩 增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水，总体积12μL。消化反应条件：50℃保持20min,55℃ 保持20min，60℃保持20min，然后保持在10℃，不超过1h。
(4)连接接头：在消化产物中按照以下顺序加入试剂：连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、 接头1μL，合计4μL；反应条件：22℃保持30min；72℃保持10min；最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化：在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀， 室温保持5min后，置于磁力架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用150μL新鲜的70％乙醇清洗磁珠 两次，分别弃掉上清，短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5min，取下EP管加入50μL 的TE,吹吸混匀，室温放置5min，移至磁力架上，澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检：使用Real-Time PCR进行文库定量：先将标准 品按照S1、S2、S3的顺序稀释，原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM，将样 本文库100-200倍稀释；按照下述配制试剂：样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、 20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL；反应条件：50°保持2min，95°保持2min，然后40 个循环，每个循环96°保持15sec，60°保持1min。
(7)乳液PCR：将上述纯化质检后产物进行qPCR定量，计算出样本上样量，然后进行油包水PCR，反 应体系如下；利用Ion PITMHi-QTMOT2 200Kit，One Touch 2仪器上进行反应，制备测序模板。
乳液PCR反应体系
组分 体积
PCR反应液 1920μL
PCR酶混合液 120μL
ISP微珠 100μL
文库 80μL
水 100μL
(8)在Ion Proton基因测序仪上进行测序，在Ion GeneStudioTMS5 Plus上进行数据分析，使用软件 为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性主动脉疾病的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性主动脉疾病的基因检测试剂盒，其包括文库构建试 剂及引物序列。所述引物序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:610。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的文库采用高通量基因测序技术检测ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1， TGFBR2的基因突变，不需要制备二代测序文库，没有涉及到基因组DNA片段化，不存在末端修复 及加A、加接头等步骤，操作简单、所用时间段，技术方法精确度高。
2、本发明的文库避免了化学打断法，不依赖于酶打断法，不容易造成污染等问题。
3、本发明的文库避免了物理打断法中打断仪的使用如超声，无需过多仪器的投入及仪器维护，减少生 产成本及人工成本。
4、本发明提供一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法和试剂盒检测变异类型全面、准确率 高达到100％、通量高。
附图说明
图1是根据本发明的方法构建的血液DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图2是根据本发明的文库构建及测定流程图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体 实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或 “包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
采用20个样本进行文库构建，采用包含ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1，TGFBR2 基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR， 并结合高通量测序平台S5Plus进行DNA测序，然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。 具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：血细胞经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:5ng/μL； DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:15ng；
(2)多重PCR扩增：为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)全部被覆盖，并避免相 邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段，PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池，分别进行多 重PCR扩增，每个反应为5μL，总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增，反应体系为：扩增反应预混液1μL，Aorta引 物池2.5μL，DNA 1.5μL，合计5μL。多重PCR反应条件为：99℃保持2min，然后进行16个循环， 每个循环为99℃保持15s，60℃保持4min，然后保持在10℃，结束反应。
(3)引物序列消化：将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合，加入如下消化反应体系：10μL扩 增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水，总体积12μL。消化反应条件：50℃保持20min,55℃ 保持20min，60℃保持20min，然后保持在10℃，不超过1h。
(4)连接接头：在消化产物中按照以下顺序加入试剂：连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、 接头1μL，合计4μL；反应条件：22℃保持30min；72℃保持10min；最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化：在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀， 室温保持5min后，置于磁力架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用150μL新鲜的70％乙醇清洗磁珠 两次，分别弃掉上清，短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5min，取下EP管加入50μL 的Tris-EDTA,吹吸混匀，室温放置5min，移至磁力架上，澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检：使用Real-Time PCR进行文库定量：先将标准 品按照S1、S2、S3的顺序稀释，原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM，将样 本文库100-200倍稀释；按照下述配制试剂：样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、 20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL；反应条件：50°保持2min，95°保持2min，然后40 个循环，每个循环96°保持15sec，60°保持1min。
(7)乳液PCR和模板富集：将上述纯化并质检后文库进行qPCR定量，计算出样本上样量，然后进行乳 液PCR和模板富集，按照试剂盒操作规程进行，然后进行Ion chef上机，得 到loading好的芯片。
(8)在Ion GeneStudioTMS5 Plus基因测序仪上进行测序及数据分析，使用软件为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读，数据见下表6。
表6 20个样本的测序结果与已知结果100％一致
实施例2
本实施例采用20个样本进行文库构建，采用包含ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3， TGFBR1，TGFBR2基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进 行多重反应PCR，并结合高通量测序平台Ion Torrent PGM进行DNA测序，然后检测点突变(SNP)、 小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：血细胞经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:5ng/μL； DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:15ng；
(2)多重PCR扩增：为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)全部被覆盖，并避免相 邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段，PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池，分别进行多 重PCR扩增，每个反应为5μL，总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增，反应体系为：扩增反应预混液1μL，Aorta引 物池2.5μL，DNA 1.5μL，合计5μL。多重PCR反应条件为：99℃保持2min，然后进行16个循环， 每个循环为99℃保持15s，60℃保持4min，然后保持在10℃，结束反应。
(3)引物序列消化：将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合，加入如下消化反应体系：10μL扩 增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水，总体积12μL。消化反应条件：50℃保持20min,55℃ 保持20min，60℃保持20min，然后保持在10℃，不超过1h。
(4)连接接头：在消化产物中按照以下顺序加入试剂：连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、 接头1μL，合计4μL；反应条件：22℃保持30min；72℃保持10min；最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化：在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀， 室温保持5min后，置于磁力架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用150μL新鲜的70％乙醇清洗磁珠 两次，分别弃掉上清，短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5min，取下EP管加入50μL 的Tris-EDTA,吹吸混匀，室温放置5min，移至磁力架上，澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检：使用Real-Time PCR进行文库定量：先将标准 品按照S1、S2、S3的顺序稀释，原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM，将样 本文库100-200倍稀释；按照下述配制试剂：样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL；反应条件：50°保持2min，95°保持2min，然后40 个循环，每个循环96°保持15sec，60°保持1min。
(7)乳液PCR：将上述纯化及质检后产物进行qPCR定量，上样量计算出样本上样量，然后进行油包水 PCR。利用Ion PGMTMHi-QTMview OT2 Kit，One Touch 2进行测序模板富集。
反应体系表7：
表7乳液PCR反应体系
组分 体积
PCR反应液 800μL
PCR酶混合液 50μL
ISP微珠 100μL
DNA样本文库 25μL
水 25μL
(8)在Ion TorrentTMPGM基因测序仪上进行测序及数据分析使用软件为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读，数据见下表8。
表8 20个样本的测序结果与已知结果100％一致
实施例3
本实施例采用20个样本进行文库构建，采用包含ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3， TGFBR1，TGFBR2基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进 行多重反应PCR，并结合高通量测序平台Ion Torrent PGM进行DNA测序，然后检测点突变(SNP)、 小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：口腔粘膜脱落细胞经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度: 5ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:15ng；
(2)多重PCR扩增：为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)全部被覆盖，并避免相 邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段，PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池，分别进行多 重PCR扩增，每个反应为5μL，总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增，反应体系为：扩增反应预混液1μL，Aorta引 物池2.5μL，DNA 1.5μL，合计5μL。多重PCR反应条件为：99℃保持2min，然后进行16个循环， 每个循环为99℃保持15s，60℃保持4min，然后保持在10℃，结束反应。
(3)引物序列消化：将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合，加入如下消化反应体系：10μL扩 增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水，总体积12μL。消化反应条件：50℃保持20min,55℃ 保持20min，60℃保持20min，然后保持在10℃，不超过1h。
(4)连接接头：在消化产物中按照以下顺序加入试剂：连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、 接头1μL，合计4μL；反应条件：22℃保持30min；72℃保持10min；最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化：在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀， 室温保持5min后，置于磁力架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用150μL新鲜的70％乙醇清洗磁珠 两次，分别弃掉上清，短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5min，取下EP管加入50μL 的TE,吹吸混匀，室温放置5min，移至磁力架上，澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检：使用Real-Time PCR进行文库定量：先将标准 品按照S1、S2、S3的顺序稀释，原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM，将样 本文库100-200倍稀释；按照下述配制试剂：样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、 20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL；反应条件：50°保持2min，95°保持2min，然后40 个循环，每个循环96°保持15sec，60°保持1min。
(7)乳液PCR：将上述纯化质检后产物进行qPCR定量，计算出样本上样量，然后进行油包水PCR，反 应体系为表9；利用Ion PITMHi-QTMOT2 200 Kit，One Touch 2仪器上进行反应，制备测序模板。
表9乳液PCR反应体系
组分 体积
PCR反应液 1920μL
PCR酶混合液 120μL
ISP微珠 100μL
文库 80μL
水 100μL
(8)在Ion Proton基因测序仪上进行测序，在Ion GeneStudioTMS5 Plus上进行数据分析，使用软件 为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读，数据见下表10。
表10 20个样本的测序结果与已知结果100％一致
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限 定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行 选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利 用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及 其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法和试剂盒
<160> 610
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial SequenceArtifial Sequence)
<400> 1
aactgaaggc ataattccac aggac 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial SequenceArtifial Sequence)
<400> 2
cgcactaacg actgcactaa tg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial SequenceArtifial Sequence)
<400> 3
gactcccctt cccaggaaaa g 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 4
agaccctaat gtttgccaca atgt 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 5
ctcaactcca gtccgtcacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 6
cccctctgca tccatcaacc 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 7
gcagtagtgt ggtgttctgt atca 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 8
ggcttggctg taattgattc acaag 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 9
aaaaggaggt tccttccagg aatac 25
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 10
tttcttctgg gattctgaca taaagcat 28
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 11
gtagacccgg acgacctg 18
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 12
ctgtgtcctt tcataccagg gaatc 25
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 13
ctggttttat acatttccta gggcttcg 28
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 14
actcttcaag ttgtcatttt tcatggaag 29
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 15
aacctcattg ttacctaaaa ctggct 26
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 16
gcctgaaact ttactgaggc tgta 24
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 17
gtgctcactt atttactagt atgtcagctt 30
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 18
ggctttaaag acatgtatag ataaaagcta tcca 34
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 19
agggcaagta taattttcta atgaaaggaa gaa 33
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 20
agaacggatc ctgagtcaca ga 22
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 21
agcataacac tcatcgatac atttattttc ac 32
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 22
agccgaactt gaatgttctt ttatgaatat c 31
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 23
tccctgtgtt tcaaccaaga cttt 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 24
catccttgcc atcttcgcct 20
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 25
agccaatttt tcttaagttg agtgttcag 29
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 26
tggtgctagc atttaggaac atagaaa 27
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 27
tgcaaatctg aggcttcaca tgta 24
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 28
caacatatac attccatttt aactggcctt tt 32
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 29
aatatgatta gttattgccc tttgaggatt agt 33
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 30
tctttccagg aggaccctaa aaac 24
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 31
aatgctagca ttgagtttag agtgtacat 29
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 32
aatttgacag tcagatatgc cgtga 25
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 33
tacagtatgc caacatgaca aatgtgta 28
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 34
actactaatc aattgctcta taacctgctg 30
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 35
ctggtcccga aggaggaaag 20
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 36
acaattaaga gaaaacaagt caacaccttg 30
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 37
cctacaaatc ctgagagtta ctcctct 27
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 38
gtcattcggg tctttaggtg gtaaaata 28
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 39
ctggtcctat tggtcctcct g 21
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 40
gcataagtag ctactgtctg tatggg 26
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 41
acgagtaaaa agtgaccgtt tcaatttaaa g 31
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 42
tgtggtaatg aagagaatgt atgatgaaag c 31
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 43
cttcctccct ccctaatggc 20
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 44
ctctttctcc tttaccacca ggttc 25
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 45
cttcatagag ttcctggttt tcaaagg 27
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 46
tgagcgatta caatttttac attctcttta tgg 33
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 47
ctcatcatac acttcagaaa gagcattca 29
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 48
ccaggagcac cagtgttacc 20
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 49
ttatcacaaa tcgattagag aaaaacactg tca 33
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 50
ctgaaggcta ccaaaggaag gaa 23
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 51
ttcattcctt tgtatacagg gtgaaagt 28
<210> 52
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 52
gtggccatat ttacactctt agacattaaa g 31
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 53
ggaaaccctg gatcagatgg tc 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 54
agacagatgc tgcttttggg aa 22
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 55
tctttggagc caaggataga aacatc 26
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 56
acgttcacct gtttcacctt tgt 23
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 57
atcagcatga cacaatggga agat 24
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 58
agaatatctt tctgaaatgc agacatctga a 31
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 59
ttttaaggca ttttcttgga ctagcaatg 29
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 60
tgaaatccat tggttcatct ccataatacg 30
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 61
ttcagtgctt tctgtagtca tagctaac 28
<210> 62
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 62
tttccatatt acagaatacc ttgatagcat cc 32
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 63
cctcctggta ttcctgggag a 21
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 64
cactgaatca gagaacagat acaaagaact 30
<210> 65
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 65
taaacagccc atattacaat atgcatacac a 31
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 66
cactggcctg atccatgtat gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 67
taagaagatt acagctttga agtagagcag 30
<210> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 68
agggtgcaat atctacaata ggtagtct 28
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 69
gagtgtcatt gctttgaagc atgg 24
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 70
ttatgcatgc tggaatggct ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 71
ctacacacat gagaagcctg agaaa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 72
tgaactgggt gataatctga agatgaaaat 30
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 73
tgtggagttc ttacaggcaa agg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 74
accctgtgga aattgagcgt 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 75
tcctaagcac acacagctta atcaa 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 76
agaaactctg tccccatggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 77
ttaaataaga agtctgggtt tccagcat 28
<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 78
aaggagctcc atcctctata aaatggt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 79
taagggaagc tttgagggac atc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 80
tttagttcaa ttggtaggtt cccttttgt 29
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 81
gtatgagtgg atggataaaa cttatttcag tg 32
<210> 82
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 82
ttttctcttg cttaagatat ggacgaatg 29
<210> 83
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 83
aaaagtagca cttaattttc caagatagat gga 33
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 84
cttgtggaga agcttgtaat gaattgc 27
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 85
ccatgtttga aaaataagac caccacaa 28
<210> 86
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 86
cattgtgtgt ttggtacctg atgatg 26
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 87
atgattcctt gagtggtctc tgga 24
<210> 88
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 88
gaagttttga ttattgctgg gattatgaca tc 32
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 89
taggatatca ctgctgcata tctgtct 27
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 90
aagaaatccc caatatatgc agtcatgg 28
<210> 91
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 91
ataaatccag atatctgaag cttcatgaag ac 32
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 92
gaggctttgt tgactggaca c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 93
ggtagctgat cccttccttt tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 94
tgagagctaa gtggcatatg tacattg 27
<210> 95
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 95
actaagaatc agtgtttcaa taaagtgaaa gg 32
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 96
gttctttgct gacccctatc ctc 23
<210> 97
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 97
tgataatgga gaaactaaaa ctcacctgta c 31
<210> 98
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 98
tgtgatttcc cacatggcat ca 22
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 99
catatctacc tggctatgtt cgtgttt 27
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 100
ttgatagata ttgatgagtg ccaggag 27
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 101
ggtgatagga tttggtcgga aacc 24
<210> 102
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 102
aaatgggaag tgtacacaaa ggtgtta 27
<210> 103
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 103
tggtgctgtt ttcaaaataa tacacagtat g 31
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 104
tggtgatgtc tgcctacact g 21
<210> 105
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 105
agcatcagga atgtttaaat aacctaatct cat 33
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 106
cctgaggaat tagaaagccc ctaac 25
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 107
gtgaagccat cacctgtgta tcc 23
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 108
agtgcactgg tgagtaggaa ag 22
<210> 109
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 109
cctgcaactt ggatccaata taaacg 26
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 110
gccactgtga tatgggctac tc 22
<210> 111
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 111
cccaaactaa ctttatgtaa tttaacagtg ctt 33
<210> 112
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 112
ctcactgaac agtggaacca atatca 26
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 113
aatggagatg agatccaaag atcgtg 26
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 114
gtatcagtgt gcctgcaacc 20
<210> 115
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 115
aagtgtttca atgcaccttt ggtaaaa 27
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 116
tcttcacatc ttgttgggaa gtgat 25
<210> 117
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 117
tttggcaatg atgtcattca aacaact 27
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 118
gcccccacct ttaacatggt 20
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 119
ccaaacttac ccatgcagtt cttc 24
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 120
actgcacagg tcagttaatg agc 23
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 121
aggcaattgg ccatggaaaa c 21
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 122
ctgacagata tccgcctgga aac 23
<210> 123
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 123
ttgcatatca acagaaacta cagttgc 27
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 124
gtgtcagtgt cccagtggaa t 21
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 125
ctgctgcata tttctccctg tga 23
<210> 126
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 126
acttcatgtt ccaggtcatc tttcat 26
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 127
tcaatgacag tctgccagca a 21
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 128
accatctgca taggtattta tctttctgag 30
<210> 129
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 129
cagtcttatg gttttctaat ggcattcc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 130
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 131
gagtcaggcc agactagtgt aaag 24
<210> 132
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 132
cacttaagtt tggttctact cactttgga 29
<210> 133
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 133
tcaatttaca caaaaagaga actgaccct 29
<210> 134
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 134
gcgttgcgtc aacactgat 19
<210> 135
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 135
agtacctcta aacaacataa ggaggagaa 29
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 136
atccagattg gtttccttcg taagc 25
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 137
cttggcctat gcggaagtaa cc 22
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 138
acatgccgct tcttattttg cc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 139
ggaactcctt tgaagccaac c 21
<210> 140
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 140
gaacccagaa agtcttagaa ttatgaggta tt 32
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 141
ggaagcctcc cgtttttctc t 21
<210> 142
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 142
gctttcctcc tggacctcaa at 22
<210> 143
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 143
tctgcatcat gcacattgcc 20
<210> 144
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 144
cgatgtgtgt gtgtgtatgt gtttc 25
<210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 145
acagggtttt tctggtccaa tagc 24
<210> 146
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 146
cattaatact gttgggtctt ttgagtgc 28
<210> 147
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 147
aatggttggc aagaaaacat tcagtaag 28
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 148
ccgtggcttc attccaaata tcc 23
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 149
tcaggaagta gccatgcaga c 21
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 150
gtccttccag aggaccacaa g 21
<210> 151
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 151
gaggaaagcc aaaatcaaat ttaggagaaa a 31
<210> 152
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 152
ctcatttgag gattggtccc ctataac 27
<210> 153
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 153
agtcttccac agggagagtc at 22
<210> 154
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 154
ctcggcatca tgcgtcg 17
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 155
aaggattcac cagctggatc g 21
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 156
atttggcctt ttccgagtta tcct 24
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 157
cccaagctcc tagtgtcacc 20
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 158
tgatgtgctg cctaggtgag 20
<210> 159
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 159
tgcgtcttca tctcctccat ct 22
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 160
gaggatgggt ctgagttggg 20
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 161
cccagagcca cttacgttct t 21
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 162
agtcacctct gggtcttgtg t 21
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 163
tccaggttgg acacgagttg 20
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 164
cctggacgct gtccttgtag 20
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 165
ggatctcagc gcagagaagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 166
gggacctctt tgcatccctt t 21
<210> 167
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 167
ttcaatgaaa gctttgcaca aagatatcc 29
<210> 168
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 168
aagaatatac ttaaccgggc tccttct 27
<210> 169
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 169
tcctccccac agaactggg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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ataagcagac gctggagaaa gag 23
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<211> 26
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 171
ctgtagtaat ttgaggctgc tgatgt 26
<210> 172
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 172
cactgagatg accctctgtc tc 22
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 173
gggatacatg gacacacagc a 21
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 174
atttccgggc atctctctgg 20
<210> 175
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 175
atgcttgttt ttcagcttgg taagattc 28
<210> 176
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 176
tgggacttct ctttaccatt taaaactcta g 31
<210> 177
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 177
caggatctca tcctccagtt tcttg 25
<210> 178
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 178
cttttaggag gctacagagt tctgg 25
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 179
cctgtcttcc tcctcctcca 20
<210> 180
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 180
ctcgcaggta cctgtatgga tg 22
<210> 181
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 181
attccacacc cacttgcga 19
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 182
cagggtgtgg cttcatgacc 20
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 183
aaggaagagc tcctgatttc cac 23
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 184
gactgggtgg aggaatggat g 21
<210> 185
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 185
tcctcctttt cctccaggga t 21
<210> 186
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 186
agctgatgac cacgctacg 19
<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 187
ggacttgggt gttcaattct cca 23
<210> 188
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 188
gtcctggcct tggtttctaa gt 22
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 189
ctcttgagct gcttgaccct 20
<210> 190
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 190
accacctgtt ttccttgctg t 21
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 191
gcacagcttc tccacgaaag 20
<210> 192
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 192
taaactcatc tttatatgtg ggcaaataca gt 32
<210> 193
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 193
tcgctcgatg agctcgatg 19
<210> 194
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 194
gtcttctgac ttcataccaa gatgct 26
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 195
gatggacaga tgcagaggca 20
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 196
tgccacctca tgggaattaa tgt 23
<210> 197
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 197
gataccttca ccttgaaaaa taaccagtg 29
<210> 198
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 198
agtggcttta ggctccaaaa ct 22
<210> 199
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 199
agactgtttt aatagccaat cccttaacc 29
<210> 200
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 200
tgaattgggt gtgacaggga tg 22
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 201
ctctgcacgc aaacactctg 20
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 202
ggcagagttt tgtgacaaca tcc 23
<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 203
gggcctgagt tcttgcaatg 20
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 204
aaggtcacca tggaacgtgt 20
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 205
tcctggcaag aactgcagac 20
<210> 206
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 206
tggaggaggt ctggaagtaa gc 22
<210> 207
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 207
ctttcccaac cgtgaccttc t 21
<210> 208
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 208
ttctgaccct gttaccttat tccac 25
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 209
ctgcaggaga gacagtaggc 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 210
tacccctgag gcatgactcc 20
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 211
gcatctgagg ctctcctagc 20
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 212
ggtcaactgc agaaaatcca agg 23
<210> 213
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 213
agatctgccg catgtacttg atg 23
<210> 214
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 214
gattcaggaa ttgcccatca cc 22
<210> 215
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 215
cactcacatc tccaggacca tg 22
<210> 216
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 216
ggctaaatgt ggcttttctc tcct 24
<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 217
caacttccca ctccacttac gat 23
<210> 218
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 218
cctctctgtc cttccttgtg c 21
<210> 219
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 219
gcaggtcctg gacgttgaa 19
<210> 220
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 220
gtgggtgatg ttgtgcttct ttatc 25
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 221
gccattctcg ctgttctcca 20
<210> 222
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 222
agctggactc tggatgtagg ag 22
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 223
tcccgtcctc atcgtagtct atc 23
<210> 224
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 224
cagtcgataa aggccaacat caaaatt 27
<210> 225
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 225
ggtgtctcct gggatcacat ac 22
<210> 226
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 226
caaataagag tcctccctgg atgag 25
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 227
aggcagttct gtctgacagg 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 228
gatgccaggg caggtactac 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 229
tcagcgtcca gatgatggtg 20
<210> 230
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 230
caatgccaag cctgatgaga ac 22
<210> 231
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 231
ctgccattct ctgctggtaa tttct 25
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 232
ccgagcagat ggatttccgt 20
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 233
catcagcacc aactcctcca 20
<210> 234
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 234
cgatgtaata aaccaactaa gcaagcg 27
<210> 235
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 235
tgaagtggaa gaagcaaaag cttg 24
<210> 236
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 236
ttcgaggtgc ttcagaatga gg 22
<210> 237
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 237
ccctcagtgg gaacaaagta gc 22
<210> 238
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 238
gaactcagca cagcctttgt atc 23
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 239
ggtcctcgga gagcaatacc 20
<210> 240
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 240
ctgtgtttgt tgaatgaatg catgaatg 28
<210> 241
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 241
taccatggac ggtgaccca 19
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 242
gtctcagcgt catgacagca 20
<210> 243
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 243
tgaggtgatt ctgatgtgaa ctcc 24
<210> 244
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 244
atacagctgc actgcttcca a 21
<210> 245
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 245
caaaaccaac caaaacctca aaatgc 26
<210> 246
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 246
cgcactaccc agctggaa 18
<210> 247
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 247
aaggcccttg taaggtggtt tt 22
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 248
agcaaggctg ctaacaggag 20
<210> 249
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 249
ttggttccgg ctgaactctt 20
<210> 250
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 250
gatgtcagga aagaggtgac caat 24
<210> 251
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 251
ctgccccata agatgattca gaaattca 28
<210> 252
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 252
ttcaaaggcc aaagacgttc ag 22
<210> 253
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 253
atcagggtca gggcagaca 19
<210> 254
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 254
gtctgggact ggattctctg c 21
<210> 255
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 255
cagggaccac atctctccca tta 23
<210> 256
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 256
gccttgtgat tcatgctgtc c 21
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 257
cccaagttct ccagcacaga 20
<210> 258
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 258
ggcccctgct ttcattttgc 20
<210> 259
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 259
gggagtaggg aagcaaagac tg 22
<210> 260
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 260
gacctcagtt accactcacc tg 22
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 261
catagttgat cacttcagga gcca 24
<210> 262
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 262
cctgtttaac aaggaggtca gatgt 25
<210> 263
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 263
aacttcgccg agagttgagg 20
<210> 264
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 264
cccgtcttct tgagtttctt gacc 24
<210> 265
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 265
gccattgtgt gtgagcaaag g 21
<210> 266
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 266
ctaggcatgc actcggagag 20
<210> 267
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 267
tgactgtcac caaagcagaa aaag 24
<210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 268
cctcctgcat ggccattttc 20
<210> 269
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 269
ttagcgacag agaaaatagg aggtact 27
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 270
gacagatctc tggccagcaa 20
<210> 271
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 271
ctgtgtgagt tcgccttcaa tatga 25
<210> 272
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 272
caacacagga ggtagaactg tcc 23
<210> 273
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 273
ggaacctcta ctccaagacc tg 22
<210> 274
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 274
gatgaaccca ccagctgcta a 21
<210> 275
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 275
gtggctcttg ccagttttat acgata 26
<210> 276
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 276
cgaggcgtgg aatgtctcc 19
<210> 277
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 277
tgctacattt ccttgggctt cc 22
<210> 278
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 278
acaagtaaaa ttgtcttttg tacagaggtg 30
<210> 279
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 279
gtattgtagg tcatgtgggc tgaa 24
<210> 280
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 280
atggtatctg tggctgaatc atgtc 25
<210> 281
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 281
gaaatgtctg aaaggaggtt catcca 26
<210> 282
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 282
aagacaattc ttgaacaact tctgctc 27
<210> 283
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 283
taaaaattct tatccagacc aatggaaaat gg 32
<210> 284
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 284
gacctcccaa attaaaaccc agga 24
<210> 285
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 285
ccgtttgtat gtgcaccctc t 21
<210> 286
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 286
gcaggatctt ggttactctt ataagtctg 29
<210> 287
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 287
gtctgcatct cactcatgtt gatg 24
<210> 288
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 288
actatctcac attctagcaa gttggc 26
<210> 289
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 289
gcgagaacta ttgtgttaca agaaagc 27
<210> 290
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 290
taaggaaaag caaatgttac agacctttat tg 32
<210> 291
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 291
acaatgtaga agaaaatgtg aaggaaatac aga 33
<210> 292
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 292
tgtttaagta atcaaaaagg gatccatgc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 293
cgctgcacat cgtcctg 17
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 294
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 295
aaggcagctg gaattaaatg atgg 24
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 296
acacatgatc ttattttgaa gacaagttta cc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 297
ccaactcatg gtgccctttg 20
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 298
gcagcctctt tggacatgg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 299
cccctcacca cggtacaatg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 300
acttgactgc accgttgttg t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 301
tcccctcgct tccaatgaat c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 302
tcaggtccca cacccttaag a 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 303
taacaccagc aatcctgact tgtt 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 304
gttgtggttg atgttgttgg ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 305
aaggacatct tctcagacat caatctg 27
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 306
tgcacgatgg gcatcttgg 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 307
gtggttatag ggctgacact gc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 308
acttaaggac catggcctgt g 21
<210> 309
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 309
gtgaggatgg tcctggaagt tac 23
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 310
ccagctgcca tggtgactta 20
<210> 311
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 311
ttctaacaga agtttcccca gacc 24
<210> 312
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 312
atgcaggacc tcatgacagc 20
<210> 313
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 313
cagaggaacc taatctgtgt cctg 24
<210> 314
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 314
attacagctg aggctgcttc c 21
<210> 315
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 315
agggcaggga acaacttgat g 21
<210> 316
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 316
aggcaactga ttttcccctt taca 24
<210> 317
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 317
ttataagctt atatcaaagt gggaaaggtc ttc 33
<210> 318
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 318
gctgaagact cactggaggt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 319
gcactttcta gttttcatgt tttcctgtt 29
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 320
gcacctgttt cacccttttc tc 22
<210> 321
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 321
tctttttcta ggctctataa acttttccat aat 33
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 322
tactctaatc ttgacatgtg taagaacagt tg 32
<210> 323
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 323
tcaaaatatt actcatgacc agccattca 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 324
ttgtaaaaat ggtcaacaga gatgctaatg 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 325
gtgtttaaac aggactgaag ggtga 25
<210> 326
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 326
gaagcacatg ctttcatgga gtaag 25
<210> 327
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 327
cttttgcatt ttgcatgaca atagatttgt g 31
<210> 328
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 328
tgatggaatt aaactatacc tttcagtcaa ca 32
<210> 329
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 329
gtgaggctgg tattccaggt g 21
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 330
tgagtggcaa atatttttat gtcatagaat gc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 331
caaatgacgt cctctctttg taacca 26
<210> 332
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 332
agttgctttt gatctgtctt catttgtc 28
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 333
agcatgcttt aatcttctct ttatcaaacc t 31
<210> 334
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 334
ggagactgag ttttgaccat ttctttact 29
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 335
tctctctgta atctgtatta tttctacttc cct 33
<210> 336
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 336
agcaagtttc atcattgctt tggtaaa 27
<210> 337
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 337
gatgtctgga agccagaacc at 22
<210> 338
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 338
acaaacatgg ctatttgatg aacatgac 28
<210> 339
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 339
gcacaacgtt tctaccccta ca 22
<210> 340
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 340
agaagttaat agttgacaaa caaacagtgt g 31
<210> 341
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 341
gttcacaata taataaccta gtggcctgat t 31
<210> 342
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 342
tttttaaacc taggtgaatg gaatgctg 28
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 343
gaggtcttgg aagtcctggt c 21
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 344
tcaggatttg tagggatata tattgggtgt 30
<210> 345
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 345
tctcccagag ttatccccaa aga 23
<210> 346
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 346
aagggttacc ttatctccag gct 23
<210> 347
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 347
gataagatga taagatgaca tttcctgcct aaa 33
<210> 348
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 348
gcagctaaaa tgagactaga aaccaaac 28
<210> 349
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 349
agattgctgt tgttgttgca tgtag 25
<210> 350
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 350
tgtttttcca ttagaacact taggacttac a 31
<210> 351
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 351
aaaccataaa tgactttcag gtacaatgc 29
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 352
aaataagtag caatgtgtaa gtttctcatc ct 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 353
gttctccagg caaggatggg 20
<210> 354
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 354
gagctcccta atacagataa tgaagactta g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 355
atcaatgtaa ctattcagcc ctttgc 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 356
gttctccact gagaccgtta gc 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 357
atgcatggat gaaatggcat ttgg 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 358
ccattttcac cacgatcacc ct 22
<210> 359
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 359
catgatcagt ttaaagaaaa tgtgtaggtc aat 33
<210> 360
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 360
gaccctggtt gtcctggaat ac 22
<210> 361
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 361
aacaatatta acttccaata attgcatgca tact 34
<210> 362
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 362
tggaaaataa aatatttcct acactgtaga atgag 35
<210> 363
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 363
caattcaaaa tatgtttcta aagggtcctc aag 33
<210> 364
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 364
gccttcaaat ccatttctca tctcttcta 29
<210> 365
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 365
ccccagagta agtagcacag aaag 24
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 366
gtgtttctga aaattggaag attgtagca 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 367
gggattggag gtgaaaaagc tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 368
tgccatgaag atgaaagact accaaa 26
<210> 369
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 369
agaatactgg gttgacccta acca 24
<210> 370
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 370
tgtgatgaac atataggaag aatacaaagg at 32
<210> 371
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 371
cttcccagaa catcacatat cactgc 26
<210> 372
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 372
ttgcatgatt aaactaaaat gctgactgc 29
<210> 373
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 373
gagcaaaaca gtctttgaat atcgaaca 28
<210> 374
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 374
attttgtcgg tcacttgcac tg 22
<210> 375
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 375
cctatcagta gacagtagat gttgcatg 28
<210> 376
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 376
actgaattcc tagaagagca accattc 27
<210> 377
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 377
actggagtaa aatttgctga ttacattcac 30
<210> 378
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 378
acaaaggtag gttccatatg gaattatcg 29
<210> 379
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 379
ccaacagcag aggaaataga aaataatcc 29
<210> 380
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 380
tgcttcatag ggtcagcttc c 21
<210> 381
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 381
atctaaaatt tccacttgag gataagccat 30
<210> 382
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 382
tgaagtgacc ccctacatat taatgttg 28
<210> 383
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 383
ctataaatga agtacctgct ccattggt 28
<210> 384
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 384
acatcccctt tgccatataa tgtcc 25
<210> 385
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 385
ggttccttct gtccactgtc ac 22
<210> 386
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 386
aagtcaggta attaaggcag atatatgcat tt 32
<210> 387
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 387
taagacttgt aatcaaccaa ttgttccca 29
<210> 388
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 388
ttacagttta aaatcctctg atagaataaa aggt 34
<210> 389
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 389
aattatttgg tctctggatg gtgaattaat ga 32
<210> 390
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 390
tcgaatctgg aaatgaagat ggctt 25
<210> 391
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 391
gcactgtcca tgtttacaga catc 24
<210> 392
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 392
ctcagcattt ctcagtattc tcaatctgc 29
<210> 393
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 393
ttacttacat catggccagt ctgc 24
<210> 394
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 394
tggtgcaata cggactcagt ag 22
<210> 395
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 395
gacgtcatta caaaaattct cattctgct 29
<210> 396
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 396
attttaattg tttgatggaa gtcatgcca 29
<210> 397
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 397
aacacatata aaactgactt cctttgctga 30
<210> 398
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agggaaagca ttttaccttt tctaatgtat ttg 33
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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ccgtgtcctt gcttccttca 20
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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aacgacaaat cttgcagaag agga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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gcaacttgag aaggtcacgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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gtgttccagt cccaatccca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 486
gaggagatac tgcatgagat ggag 24
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 487
tgcttttctc tggcctgaga g 21
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 488
ccaactctcc gcgacagg 18
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 489
caagtcctgt tccccagca 19
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<211> 28
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 490
tatccctttg ccacaaaaac aaatgatg 28
<210> 491
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 491
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 492
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<210> 493
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 493
cgtagcttga aacacagagc aga 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 494
gatccactgc cctctttgac c 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 495
atgatgcagc gcacgaag 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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gagcctctgg cctatttagg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 497
cccaaggttc tgccactctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 498
ggaatgctgg ttccccaaag 20
<210> 499
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 499
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<210> 500
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 500
cttcatcgac tttgggctgg a 21
<210> 501
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 501
aaaaagccca tctcagacaa cca 23
<210> 502
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 502
gcctggctta tgtgaaaatg gag 23
<210> 503
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 503
tacgaggagt gaggatggat ctg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 504
tttaggacac ttcaagctat attcatggtc 30
<210> 505
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 505
gttccactgg tatccaggca a 21
<210> 506
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 506
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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cctaagaggc tggaaagata gaggt 25
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<211> 22
<212> DNA
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acctcccatc ctctgtacca tc 22
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<400> 510
ctcatggcct tcactctcct c 21
<210> 511
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 511
tctagggcct accccatttc tac 23
<210> 512
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 512
aggagctgac cagtctgtct 20
<210> 513
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 513
aacagaagaa aaagcagttc cacttac 27
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 514
ctgccctttt ggctttggtc 20
<210> 515
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 515
agccctccca acacatttct aatg 24
<210> 516
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 516
atgaggtggt tgtggagctg 20
<210> 517
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 517
ctctgcttca gagccctctt c 21
<210> 518
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 518
gaggaagaac atgtactttc aagggt 26
<210> 519
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 519
ctgagcccct gatgtgatct g 21
<210> 520
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 520
gccatcaagc agctacgc 18
<210> 521
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 521
tagaaactgc ttttctctgg ctttgt 26
<210> 522
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 522
gatgaccagt caatcaggga gtc 23
<210> 523
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 523
actgtgcaca gaccttcgg 19
<210> 524
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 524
gtgtgtggat gcctttgaag aaaa 24
<210> 525
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 525
agagagtcct gggtgagtga g 21
<210> 526
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 526
acaaaaagta tctgacttct acgacattga 30
<210> 527
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 527
ccagtcatca ttaatgtttc ctcagttc 28
<210> 528
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 528
tggaaggaac tagccacatg c 21
<210> 529
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 529
caggagtggt gagagataat ggg 23
<210> 530
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 530
cccctagatc caggaaagcg 20
<210> 531
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 531
catttctcat ccctttcggt cca 23
<210> 532
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 532
gcgtcgaatg tgatcagaat gc 22
<210> 533
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 533
aagagtgagt gaccagaaag tgg 23
<210> 534
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 534
ctgaggtggg attttgactg agag 24
<210> 535
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 535
ggccctccta cctgctaaac 20
<210> 536
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 536
ctccagtgcc aggtgtcttc 20
<210> 537
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 537
ctttcttgag ttcttctttg ctagcg 26
<210> 538
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 538
ccggattttc gctcagtgc 19
<210> 539
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 539
cgtcttccga tagggtcttt gtac 24
<210> 540
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 540
agctgcgagg acctctgt 18
<210> 541
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 541
gctctccctt ctggctttgg 20
<210> 542
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 542
ccagagggcc tcttgatctt tattg 25
<210> 543
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 543
taccatccag ccacacccta 20
<210> 544
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 544
cgagaacaac gagtgaagaa atgac 25
<210> 545
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 545
ggctgcacct tctttagaac ca 22
<210> 546
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 546
ggacatccct gtttagctct gc 22
<210> 547
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 547
gggtcagcct caccttgtac 20
<210> 548
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 548
ggaggacctc cctaaccaat c 21
<210> 549
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 549
gcacttttta aggaccctct cct 23
<210> 550
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 550
gcctagctga gaatgccttg g 21
<210> 551
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 551
gcataaatgg ctcagaggga taagt 25
<210> 552
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 552
agagtgggca agctgtgatc 20
<210> 553
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 553
ggtccagcta caggacagc 19
<210> 554
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 554
agggagctca cgttctttac c 21
<210> 555
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 555
gggaatgctg aatccctctg g 21
<210> 556
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 556
agaagacttc cagctccatc ac 22
<210> 557
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 557
agactgtcca gcttcgactc 20
<210> 558
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 558
tgctcttact tgcccttaac ttgt 24
<210> 559
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 559
gcagggatcg ttctgcacta 20
<210> 560
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 560
agcagatttg tatgaccaag ttaccc 26
<210> 561
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 561
gccaagactt actccccaga c 21
<210> 562
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 562
tcaccatcac tatcccaccc a 21
<210> 563
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 563
ggcttcacag gtatactttc ccc 23
<210> 564
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 564
ccaaacaata cctgacacag agagag 26
<210> 565
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 565
ctgggaatga aagtggcttg aac 23
<210> 566
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 566
cctcccattt ctgaactaac cagtg 25
<210> 567
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 567
gtggctcctt ctttgatgca ga 22
<210> 568
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 568
gactggacac acctgatgcc 20
<210> 569
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 569
ctccccatca tgacaatggc a 21
<210> 570
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 570
tctctgaagg tcctctttgg ca 22
<210> 571
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 571
acactcagtg tgagaggaaa cg 22
<210> 572
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 572
tgacgaggac tttgagctga c 21
<210> 573
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 573
tccatctcct actacgagct gaa 23
<210> 574
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 574
ttcagaggct gtgtgttcag g 21
<210> 575
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 575
gggtccagga cttgctttat cc 22
<210> 576
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 576
agttgggtcc cctgatgtag g 21
<210> 577
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 577
gagaaatggt gcgagaaggc 20
<210> 578
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 578
cacccacaca gtctcactcc 20
<210> 579
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 579
gagagagctt tccaagtgtc tgaaa 25
<210> 580
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 580
tagtggtagg gattcacgca ga 22
<210> 581
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 581
tcgacactga gccacctct 19
<210> 582
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 582
ggccacagga ctgatgtcg 19
<210> 583
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 583
ttgggctacc cctccttgat at 22
<210> 584
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 584
ctgagctggg ctgatggtag 20
<210> 585
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 585
gactcagctc tggttggtgt 20
<210> 586
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 586
ccagcctcca ccttctattt tcat 24
<210> 587
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 587
ggaacttgct gtattgcaga cttag 25
<210> 588
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 588
atgagatctt cttacctgtt ggcaatc 27
<210> 589
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 589
tgaaacactg taataggtct ctcaggt 27
<210> 590
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 590
agcagaagca gtttagaaaa ttgcc 25
<210> 591
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 591
tttctaagaa tctttctctt tttccagcgt ta 32
<210> 592
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 592
tgcagcaata tgttgtagtc acaga 25
<210> 593
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 593
taaactgctg taatgaggct ctttgg 26
<210> 594
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 594
tgaatgacag tgcggttgtg 20
<210> 595
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 595
tctccccagt gagataaatt cctaaagg 28
<210> 596
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 596
ttcctctcca aacttctcca aatcg 25
<210> 597
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 597
ttacgtcatg aaaacatcct gggatt 26
<210> 598
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 598
tttaggaatg ctatcaagag tcaagaaaat ctt 33
<210> 599
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 599
acctccacag tgatcacact c 21
<210> 600
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 600
atggatcaag aggtagggtg agg 23
<210> 601
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 601
ctgcacatgc cattctcagt g 21
<210> 602
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 602
tccctcagat ttaagctcaa tattccag 28
<210> 603
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 603
tttcaaaaca gtttcacttt cctgtcatc 29
<210> 604
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 604
cttagattta cttacaaatt aagcagtgag gga 33
<210> 605
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 605
tctttctctc tcctcagtta ataacgaca 29
<210> 606
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 606
gagatacact gactgtgtgt actatgaga 29
<210> 607
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 607
ggctgaacga gcatgcac 18
<210> 608
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 608
ggctgatgcc tgtcacttga 20
<210> 609
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 609
tggaagatga ccgctctgac 20
<210> 610
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 610
agccgtcagg aactggagta 20

Claims (10)

1.一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：提供受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质检后，要求DNA符合一定质控标准；
(2)多重PCR扩增：利用上述DNA文库从高通量测序平台自动合成覆盖全部基因的扩增引物文库，对目标区域进行多重PCR扩增；
(3)引物序列消化：将步骤2得到的引物扩增产物混合，进行消化反应；
(4)连接测序接头：连接高通量半导体测序平台专用的测序接头，含样本标签序列，在DNA连接酶的作用下，将测序接头与步骤3的消化产物连接；
(5)文库纯化：步骤(4)得到的连接产物中加入纯化磁珠,混匀，置于磁力架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用乙醇清洗磁珠，离心，吸尽残余液体，干燥，加入Tris-EDTA缓冲液,吹吸混匀，室温放置，澄清后即得纯化文库；
(6)文库质检：使用Real-Time PCR对纯化文库定量质检。
2.如权利要求1所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA浓度≥5ng/μL；DNA纯度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:15ng。
3.如权利要求1所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的目标区域包含以下基因的全编码区和外显子向内含子外延20bp的可变剪切区：ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1，TGFBR2。
4.如权利要求1所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池，分别进行多重PCR扩增。
5.如权利要求4所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，每个引物池反应体系为5-10μL，总体积为10-20μL；多重PCR扩增反应体系按照下述体积比组成扩增预混液：Aorta引物池：DNA＝1:2.5:1.5；反应条件：99℃保持2min；然后进行16个循环，每个循环为99℃15s，60℃4min；最后保持在10℃不超过12h。
6.如权利要求1所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合，将消化反应预混液、无核酸水加入到混合PCR产物，其体积比为1:1:10；反应条件：50℃保持20min；55℃保持20min；60℃保持20min，然后保持在10℃不超过1h。
7.如权利要求1所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述连接接头反应体系按照下述体积比组成，连接反应缓冲液：DNA连接酶：接头＝2:1:1；所述反应条件：22℃保持30min；72℃保持10min；最后保持在10℃不超过1h。
8.如权利要求1所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述高通量测序平台为Ion Torrent平台，其通用测序接头序列，A端CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG，P端CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT；所述的样本标签序列在测序接头序列A端，长度为10bp,其在测序模板序列的位置如下：
A端接头序列+样本标签序列+GAT+文库序列+P端接头序列+磁珠。
9.如权利要求1所述的一种遗传性主动脉疾病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(6)使用Real-Time PCR进行文库定量：先将标准品按照10倍梯度稀释；将样本文库100-200倍稀释，样本文库浓度应≥100pM；反应体系是由下述体积比组成，2×Master Mix：20×TaqMan：样本标准品＝5:0.5:4.5；反应条件：50℃保持2min，95℃保持2min，然后40个循环，每个循环96℃保持15sec，60℃保持1min。
10.一种遗传性主动脉疾病的基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-9任意一项中所述的基因检测文库的建库试剂及引物序列，所述引物序列SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:610。
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