CN116288741A - 用于甲基化扩增子建库的组合物及应用、pcr反应液及一步法甲基化扩增子建库的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种用于甲基化扩增子建库的组合物及应用、PCR反应液及一步法甲基化扩增子建库的方法，属于分子生物学检测技术领域。组合物包括序列分别如SEQ ID NO.1‑10所示的第一至第五引物对。本申请的组合物可在一个PCR反应体系中，通过一步PCR扩增，即实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平定量结果，扩增效率高、扩增特异性强，纯化后的扩增产物可直接用于二代测序；且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约时间成本，简化实验步骤，也提高了实验结果的可信度。

Description

用于甲基化扩增子建库的组合物及应用、PCR反应液及一步法 甲基化扩增子建库的方法
技术领域
本申请涉及分子生物学检测技术领域，具体而言，涉及一种用于甲基化扩增子建库的组合物及应用、PCR反应液及一步法甲基化扩增子建库的方法。
背景技术
宫颈癌是全球女性第四大常见癌症。宫颈上皮内瘤变(CIN)是宫颈癌前病变的阶段，随病变程度加重，癌变几率升高。即使对于同一级别癌前病变个体，癌症风险也存在差别。CINⅠ的自然消退率为60-85％，大部分病例可在2年内恢复正常，进展为CINⅡ至CINⅢ的比例为10-15％，而进展为癌的比例约0.3％；CINⅡ的自然消退率约50％，23％左右的病变呈持续状态；CINⅢ则有30％的比例能够进展成宫颈癌。所以需要一种可以区分不同的CIN级别的方法，既可以避免过度治疗，又可以避免癌变风险。
DNA甲基化是在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶；是一种表观遗传学效应，不改变核酸序列，但可通过改变染色体的结构，调控蛋白表达，在许多肿瘤发生、发展的各个阶段均有其特异性的改变模式。基因甲基化分析是非形态学的分子检测方法，既能避免细胞检查的局限性，又可保证诊断的准确性。因此，对宫颈癌相关基因的甲基化程度检测，可用于评估宫颈组织的甲基化水平。
目前，检测某位点或某基因甲基化程度的方法主要有以下几种：
(1)qPCR检测技术：其是通过引物和探针的设计来对引物和探针上所包含的甲基化位点的甲基化情况进行检测。但是，qPCR检测技术由于只能检测引物和探针上的甲基化位点，所以检测位点比较有限。
(2)MSP(甲基化特异性PCR)：其是通过对目标区域设计上下游引物，根据能否扩增出条带来判断目标区域的甲基化情况。需要针对亚硫酸氢盐转换后甲基化位点和非甲基化位点分别设计引物，PCR扩增后通过凝胶电泳进行检测。但是，MSP只能定性，不能定量。
(3)焦磷酸测序：其是通过PCR扩增BS转换后的DNA样本后，再进行焦磷酸测序的方法实现甲基化水平的定量。但是，焦磷酸的测序长度只有100bp，有效读长较短，约为60bp，且价格昂贵。
(4)甲基化建库捕获技术，先建库，然后通过探针杂交的方式捕获到目的片段后进行测序。但是，甲基化建库捕获技术中探针的设计位点，捕获效率等对目标位点的测序均会造成影响；且需要合成探针，成本高，建库时间长。
因此，需要开发一种可快速对多个位点的甲基化情况进行定量检测、且成本低的方法，以用于评估宫颈组织的甲基化水平。
发明内容
本申请实施例提供一种用于甲基化扩增子建库的组合物及应用、PCR反应液及一步法甲基化扩增子建库的方法，其旨在实现同时且快速准确扩增出不同甲基化程度的样本的多个片段，以得到多个基因多个位点的甲基化情况，进而可建立用于评估宫颈组织的甲基化水平的文库。
第一方面，本申请实施例提供一种用于甲基化扩增子建库的组合物，包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对。
其中，第一引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，第一引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；第二引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，第二引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；第三引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，第三引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示；第四引物对的正向引物的序列如SEQ IDNO.7所示，第四引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；第五引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示，第五引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.10所示。
在上述技术方案中，用于甲基化扩增子建库的组合物包括第一至第五引物对，可实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平的定量结果，得到每个样本中每个位点的甲基化的比例；本引物组合有较好的扩增效率，可使5个片段得到有效扩增；本引物组合有较好的扩增特异性，可有效避免非特异性扩增，本引物浓度组合可以使5个片段得到较均一的扩增，有利于避免不同片段的测序数据量之间相差太大，可以节省测序数据量，从而节约成本。纯化后的扩增产物具有测序接头，可得到测序前的文库，可直接用于二代测序，而且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约了时间成本，简化了实验步骤，而且提高了实验结果的可信度。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对的浓度比为1:(1.8-2.2):(0.3-0.7):(1.8-2.2):(0.3-0.7)。
上述配比条件下，有利于使得宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的扩增量较为均衡。
可选地，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对的浓度比为1:(1.95-2.05):(0.45-0.55):(1.95-2.05):(0.45-0.55)。
第二方面，本申请提供一种用于甲基化扩增子建库的PCR反应液，包括：上述第一方面提供的用于甲基化扩增子建库的组合物。
使用本申请提供的用于甲基化扩增子建库的PCR反应液，可实现在一个PCR反应体系中，通过一步PCR扩增，即可实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平的定量结果，得到每个样本中每个位点的甲基化的比例；本申请提供的用于甲基化扩增子建库的PCR反应液具有较好的扩增效率，可使5个片段得到有效扩增；并且有较好的扩增特异性，可有效避免非特异性扩增，可以使5个片段得到较均一的扩增，有利于避免不同片段的测序数据量之间相差太大，可以节省测序数据量，从而节约成本；纯化后的扩增产物具有测序接头，可得到测序前的文库；纯化后的扩增产物可直接通过二代测序平台进行高通量测序。而且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约了时间成本，简化了实验步骤，而且提高了实验结果的可信度。
结合第二方面，本申请可选的实施方式中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对在PCR反应液中的浓度分别为0.16-0.24μM、0.36-0.44μM、0.06-0.14μM、0.36-0.44μM以及0.06-0.14μM。
上述技术方案，有利于使得宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的扩增量较为均衡。
可选地，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对在PCR反应液中的浓度分别为0.19-0.21μM、0.39-0.41μM、0.09-0.11μM、0.39-0.41μM以及0.09-0.11μM。
结合第二方面，本申请可选的实施方式中，PCR反应液还包括扩增组分，扩增组分包括缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶以及dNTPs。
结合第二方面，本申请可选的实施方式中，DNA聚合酶为KAPA2G快速热启动DNA聚合酶。
DNA聚合酶为KAPA2G快速热启动DNA聚合酶，有利于提高PCR扩增的特异性和减少PCR扩增的时间，可有效减少非特异性扩增的情况。
结合第二方面，本申请可选的实施方式中，扩增组分为KAPA2G Fast Multiplexmix。
上述技术方案，有利于进一步提高PCR扩增的特异性。
第三方面，本申请提供一种一步法甲基化扩增子建库的方法，包括：采用上述第二方面提供的PCR反应液对DNA甲基化转化后的样本进行扩增；对扩增后的产物进行纯化，得到测序前的文库。
本申请提供的一步法甲基化扩增子建库的方法采用上述第二方面提供的PCR反应液，可实现在一个PCR反应体系中，通过一步PCR扩增，即可实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平的定量结果，得到每个样本中每个位点的甲基化的比例；本申请提供的用于甲基化扩增子建库的PCR反应液具有较好的扩增效率，可使5个片段得到有效扩增；并且有较好的扩增特异性，可有效避免非特异性扩增，可以使5个片段得到较均一的扩增，有利于避免不同片段的测序数据量之间相差太大，可以节省测序数据量，从而节约成本；纯化后的扩增产物具有测序接头，可得到测序前的文库；纯化后的扩增产物可直接通过二代测序平台进行高通量测序。而且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约了时间成本，简化了实验步骤，而且提高了实验结果的可信度。
结合第三方面，本申请可选的实施方式中，扩增的步骤包括：于97-99℃下预变性2-4min，于97-99℃下变性8-12s，于59-61℃下退火12-17s，于71-73℃下延伸28-32s，然后于71-73℃后保持2-4min。
第四方面，本申请提供一种上述第一方面提供的用于甲基化扩增子建库的组合物在建立用于评估宫颈组织的甲基化水平的文库中的应用。
利用上述第一方面提供的用于甲基化扩增子建库的组合物，可有利于快速进行宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4扩增子建库，建立的文库以便于用于评估扩增子范围内每个CpG位点的甲基化比例，进而可以评估其患宫颈癌的风险。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为采用实施例4提供的扩增方法对不同的宫颈临床样本进行扩增的扩增结果图。
图2为对PAX1基团的扩增结果对比图。
图3为对JAM3基团和FAM19A4基团的扩增结果对比图。
图4为扩增时选用不同DNA聚合酶的扩增结果对比图。
具体实施方式
PAX1(Paired Box 1)基因在普遍存在于脊柱动物中，并且不同物种间高度同源。PAX1位于人类基因中的20p11号染色体上，由一个包含124个碱基的配对域(PairedDomain，PD)和一个包含24个碱基的八肽域(Octapeptide，OP)构成。PAX1是高度保守的转录因子，主要参与细胞内信号传导调控，对细胞分化、更新、凋亡等方面起着重要的调控意义。Lim等研究发现PAX1甲基化程度与宫颈病变的严重程度呈正相关，随着宫颈病变的进展PAX1基因的甲基化程度有上升趋势。
连接粘附分子(junctional adhesion molecule，JAM)是免疫超家族中一种特殊类型的跨膜蛋白的家族，它位于极性上皮细胞和内皮细胞的紧密连接处。JAM3基因甲基化在宫颈癌中具有序列相似性的19家族(趋化因子(C-Cmotif)-样)成员A4(family withsequence similarity 19member A4，FAM19A4)，是能编码小分子蛋白的TAFA基因家族中的一员。其编码的蛋白在固定位置含有保守的半胱氨酸残基，并且与MIP-1α(C-C趋化因子家族成员，可作为免疫、神经细胞的调节剂和特异性趋化因子)相关。
FAM19A4编码的细胞因子是甲酰肽受体-1(FPR1)的新型配体，参与应激、炎症等反应，能促进巨噬细胞的吞噬及迁移作用。Steenbergen等最先发现FAM19A4基因甲基化检出率在宫颈鳞状细胞癌及正常宫颈组织中存在明显表达差异，FAM19A4能识别宫颈癌与正常宫颈。
本申请提供一种用于甲基化扩增子建库的组合物，其用于对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4进行扩增，以进行宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4扩增子建库，建立的文库以便于用于评估扩增子范围内每个CpG位点的甲基化比例，进而可以评估其患宫颈癌的风险。
用于甲基化扩增子建库的组合物包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对。其中，第一引物对的正向引物(PAX1-F)的序列如SEQ ID NO.1所示，第一引物对的反向引物(PAX1-R)的序列如SEQ ID NO.2所示；第二引物对的正向引物(JAM3-1F)的序列如SEQ ID NO.3所示，第二引物对的反向引物(JAM3-1R)的序列如SEQIDNO.4所示；第三引物对的正向引物(JAM3-2F)的序列如SEQ ID NO.5所示，第三引物对的反向引物(JAM3-2R)的序列如SEQ ID NO.6所示；第四引物对的正向引物(FAM19A4-1F)的序列如SEQ ID NO.7所示，第四引物对的反向引物(FAM19A4-1R)的序列如SEQ ID NO.8所示；第五引物对的正向引物(FAM19A4-2F)的序列如SEQ ID NO.9所示，第五引物对的反向引物(FAM19A4-2R)的序列如SEQ ID NO.10所示。
本申请提供的用于甲基化扩增子建库的组合物是针对CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行设计的，不含有CpG位点(若含有CpG位点，则会在不同的甲基化水平的甲转后样本中对模板的利用率不一样)；且针对的扩增模板是甲基化转化后的模板，甲基化转化后的模板中A和T的含量上升，使得碱基处于不平衡状态，易造成引物的扩增效率低，容易形成二聚体及非特异扩增；此外，考虑到二代测序的读长，为了使得纯化后扩增的产物能够有效进行二测序，所以引物设计的难点在于：(1)扩增后的产物的长度需要在一定的范围内；(2)引物中不能含有CpG位点；(3)需避免引物的扩增效率低以及避免形成二聚体。
本申请通过设计出上述第一至第五引物对，每个引物对中不含有CpG位点且尽可能实现了碱基的平衡，可实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，且有利于较大程度地避免引物自身以及引物之间的二聚体的形成；且由于扩增样本通常是正常细胞和癌症细胞的混合物，使用本申请提供的组合物，建库及加接头(接头通过引物的方式添加至片段的两端)的方式，在5’加上建库通用的接头序列，区分不同样本的index序列；在一个PCR反应体系中，一步PCR扩增就可实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，实现对靶向目的片段的扩增和富集，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平的定量结果，得到每个样本中每个位点的甲基化的比例；本引物组合有较好的扩增效率，可使5个片段得到有效扩增；本引物组合有较好的扩增特异性，可有效避免非特异性扩增，本引物浓度组合可以使5个片段得到较均一的扩增，有利于避免不同片段的测序数据量之间相差太大，可以节省测序数据量，从而节约成本。
相比于现有技术在扩增子建库技术中的两步PCR扩增法，由于现有技术中第一步PCR扩增之后有开盖然后纯化的操作，不可避免的不同样本之间会有气溶胶交叉污染的可能，后续再进行第二步的PCR扩增，则会进一步使这种污染放大，尤其是对于频率低的本底的样本会有被高频率的污染的可能，从而对于实验结果会造成不小的影响，最终使结果不可信。而本申请仅需一步PCR扩增，纯化后的扩增产物纯化后的扩增产物具有测序接头，可得到测序前的文库，可直接用于二代测序；一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约了时间成本，简化了实验步骤，而且提高了实验结果的可信度。
在本申请中，组合物中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对的浓度比为1:(1.8-2.2):(0.3-0.7):(1.8-2.2):(0.3-0.7)。上述配比条件下，有利于使得宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的扩增量较为均衡；即PAX1的扩增量、JAM3的扩增量以及FAM19A4的扩增量较为均衡。
需要说明的是，在本申请中，“第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对的浓度比”是指：第一引物对的正向引物(或反向引物)、第二引物对的正向引物(或反向引物)、第三引物对的正向引物(或反向引物)、第四引物对的正向引物(或反向引物)以及第五引物对的正向引物(或反向引物)的浓度比。
作为示例性地，组合物中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对的浓度比可以为1:1.8:0.3:1.8:0.3、1:1.9:0.4:1.9:0.4、1:2:0.5:2:0.5、1:2.1:0.6:2.1:0.6或者1:2.2:0.7:2.2:0.7等等。
进一步地，组合物中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对的浓度比为1:(1.95-2.05):(0.45-0.55):(1.95-2.05):(0.45-0.55)。上述配比条件下，有利于使得宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的扩增量更加均衡。
本申请还提供一种用于甲基化扩增子建库的PCR反应液，包括：上述提供的用于甲基化扩增子建库的组合物。
使用本申请提供的用于甲基化扩增子建库的PCR反应液，可实现在一个PCR反应体系中，通过一步PCR扩增，即可实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平的定量结果，得到每个样本中每个位点的甲基化的比例；本申请提供的用于甲基化扩增子建库的PCR反应液具有较好的扩增效率，可使5个片段得到有效扩增；并且有较好的扩增特异性，可有效避免非特异性扩增，可以使5个片段得到较均一的扩增，有利于避免不同片段的测序数据量之间相差太大，可以节省测序数据量，从而节约成本。纯化后的扩增产物具有测序接头，可得到测序前的文库，可直接用于二代测序，而且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约了时间成本，简化了实验步骤，而且提高了实验结果的可信度。
在本申请中，PCR反应液中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对在PCR反应液中的浓度分别为0.16-0.24μM、0.36-0.44μM、0.06-0.14μM、0.36-0.44μM以及0.06-0.14μM。上述浓度条件下，有利于使得宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的扩增量较为均衡。
需要说明的是，在本申请中，“第一引物对在PCR反应液中的浓度”是指：第一引物对的正向引物或第一引物对的反向引物在PCR反应液中的浓度；“第二引物对在PCR反应液中的浓度”是指：第二引物对的正向引物或第二引物对的反向引物在PCR反应液中的浓度；“第三引物对在PCR反应液中的浓度”是指：第三引物对的正向引物或第三引物对的反向引物在PCR反应液中的浓度；“第四引物对在PCR反应液中的浓度”是指：第四引物对的正向引物或第四引物对的反向引物在PCR反应液中的浓度；“第五引物对在PCR反应液中的浓度”是指：第五引物对的正向引物或第五引物对的反向引物在PCR反应液中的浓度。
作为示例性地，第一引物对在PCR反应液中的浓度可以为0.16μM、0.18μM、0.2μM、0.22μM或者0.24μM等等；第二引物对在PCR反应液中的浓度可以为0.36μM、0.38μM、0.4μM、0.42μM或者0.44μM等等；第三引物对在PCR反应液中的浓度可以为0.06μM、0.08μM、0.1μM、0.12μM或者0.14μM等等；第四引物对在PCR反应液中的浓度可以为0.36μM、0.38μM、0.4μM、0.42μM或者0.44μM等等；第五引物对在PCR反应液中的浓度可以为0.06μM、0.08μM、0.1μM、0.12μM或者0.14μM等等。
进一步地，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对在PCR反应液中的浓度分别为0.19-0.21μM、0.39-0.41μM、0.09-0.11μM、0.39-0.41μM以及0.09-0.11μM。上述浓度条件下，有利于使得宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的扩增量更加均衡。
在本申请中，PCR反应液还包括扩增组分，扩增组分包括缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶以及dNTPs。
进一步地，DNA聚合酶为KAPA2G快速热启动DNA聚合酶，有利于提高PCR扩增的特异性和减少PCR扩增的时间，可有效减少非特异性扩增的情况。
再进一步地，扩增组分为KAPA2G Fast Multiplex mix，有利于进一步提高PCR扩增的特异性。
需要说明的是，KAPA2G Fast Multiplex mix是商品化的产品，其为液态，且其中含有配置好的缓冲液、MgCl2、KAPA2G快速热启动DNA聚合酶以及dNTPs。
作为示例性地，本申请中，使用2×KAPA2G Fast Multiplex mix，且2×KAPA2GFast Multiplex mix在PCR反应液中的体积分数可以为45-55％。
需要说明的是，在其他可行的实施例方式中，扩增组分也可以不为KAPA2G FastMultiplex mix，例如，扩增组分由独立的缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶以及dNTPs组成；DNA聚合酶也可以不为KAPA2G快速热启动DNA聚合酶，DNA聚合酶可以选自Epi Taq DNA聚合酶；但是，当DNA聚合酶选自Epi Taq DNA聚合酶时，扩增的特异性不如选用KAPA2G快速热启动DNA聚合酶时好。
本申请还提供一种一步法甲基化扩增子建库的方法，包括：采用上述提供的PCR反应液对DNA甲基化转化后的样本进行扩增；对扩增后的产物进行纯化，得到测序前的文库。
本申请提供的一步法甲基化扩增子建库的方法采用上述第二方面提供的PCR反应液，可实现在一个PCR反应体系中，通过一步PCR扩增，即可实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中的宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平的定量结果，得到每个样本中每个位点的甲基化的比例；本申请提供的用于甲基化扩增子建库的PCR反应液具有较好的扩增效率，可使5个片段得到有效扩增；并且有较好的扩增特异性，可有效避免非特异性扩增，可以使5个片段得到较均一的扩增，有利于避免不同片段的测序数据量之间相差太大，可以节省测序数据量，从而节约成本。纯化后的扩增产物具有测序接头，可得到测序前的文库，可直接用于二代测序，而且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约了时间成本，简化了实验步骤，而且提高了实验结果的可信度。
作为示例性地，DNA甲基化转化后的样本可以采用甲基化转化试剂盒对宫颈细胞样本进行亚硫酸氢盐转化得到。
在本申请中，扩增的步骤包括：于97-99℃下预变性2-4min，于97-99℃下变性8-12s，于59-61℃下退火12-17s，于71-73℃下延伸28-32s，然后于71-73℃后保持2-4min。
需要说明的是，本申请不对后续的生信分析等的具体方法进行限定。作为示例性地，生信分析包括碱基识别、去除测序接头、删除低质量碱基和比对至人基因组hg38生成bam文件。通过计算每一个CpG位点的C的读数和T的读数，得到C的比例，即C/C+T，最后统计在扩增区域的甲基化情况，进而可以用于评估其患宫颈癌的风险。
本申请提供一种上述提供的用于甲基化扩增子建库的组合物在建立用于评估宫颈组织的甲基化水平的文库中的应用。
利用上述第一方面提供的用于甲基化扩增子建库的组合物，可有利于快速进行宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的扩增子建库，建立的文库以便于用于评估扩增子范围内每个CpG位点的甲基化比例，进而可以评估其患宫颈癌的风险。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种用于甲基化扩增子建库的组合物，第一引物对(PAX1-F和PAX1-R)、第二引物对(JAM3-1F和JAM3-1R)、第三引物对(JAM3-2F和JAM3-2R)、第四引物对(FAM19A4-1F和FAM19A4-1R)以及第五引物对(FAM19A4-2F和FAM19A4-2R)。
其中，各正向引物和反向引物对应序列序号如表1所示。
表1
Figure SMS_1
实施例2
本实施例提供一种用于甲基化扩增子建库的PCR反应液，PCR反应液中各组分如表2所示，PCR反应液中各个引物对的浓度如表3所示。
表2
组分 体积(μL)
2×KAPA2G Fast Multiplex mix 12.5
引物对混合物 2
甲基化转化的样本 1
无核酸酶水 9.5
共计 25
表3
Figure SMS_2
实施例3
本实施例提供一种用于甲基化扩增子建库的PCR反应液，PCR反应液中各组分如表4所示，PCR反应液中各个引物对的浓度如表5所示。
表4
Figure SMS_3
Figure SMS_4
表4中，Epi Taq DNA聚合酶的浓度为5U/ul，buffer溶液的浓度是10×，dNTPs的浓度为2.5mM，MgCl2溶液的浓度为25mM。
表5
Figure SMS_5
实施例4
本实施例提供一种扩增方法，采用如下步骤：
采用PCR反应液对DNA甲基化转化后的样本进行扩增；其中，PCR反应液采用实施例2提供的PCR反应液，扩增条件如表6所示。
表6
Figure SMS_6
实施例5
本实施例提供一种一步法甲基化扩增子建库的方法，采用如下步骤：
采用PCR反应液对DNA甲基化转化后的样本进行PCR扩增；然后对PCR产物进行纯化，得到测序前的文库。取1μL文库使用
Figure SMS_7
3.0Fluorometer进行文库浓度测定，记录文库浓度。
其中，扩增采用实施例4提供的扩增方法；纯化步骤如下：
(1)向装放有PCR产物的离心管中加入(0.8×)贝克曼磁珠，用移液器吸打混匀数次，避免产生气泡；然后室温孵育5min；
(2)把步骤(1)中室温孵育后的离心管(含有PCR产物和贝克曼磁珠)置于磁力架上3min直至澄清，然后移除上清，离心管继续放置在磁力架上；
(3)向离心管内加入200μL的体积分数为80％的乙醇溶液，用移液器吹打洗涤磁珠表面；
(4)移除上清，再向离心管内加入200μL的体积分数为80％的乙醇溶液，用移液器吹打洗涤磁珠表面后，使用10μL移液器彻底移除上清；
(5)离心10-15s，将离心管放回磁力架，使用10μL吸头将管底剩余的痕量乙醇完全清除。
(6)向步骤(5)的离心管中加入30μL的无核酸酶水，将离心管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，室温静置5min；
(7)将离心管置于磁力架上2min；用移液器吸取30μL上清液，转移到新的离心管中(置于冰盒上)，在离心管上标记好样本号，样本记为第一次纯化后的产物。
(8)向装放有第一次纯化后的产物的离心管中加入(0.8×)贝克曼磁珠，按照步骤(1)-(7)重复纯化一次。
(9)将纯化前和纯化后的PCR产物跑琼脂糖凝胶，检测扩增情况。
实验例1
采用实施例4提供的扩增方法对不同的宫颈细胞样本进行扩增，扩增结果如图1所示。
其中，待扩增的样本先按照甲基化转化试剂盒说明书进行亚硫酸氢盐转化；图1中的标号1-8分别对应不同的宫颈细胞样本，标号1：慢性宫颈炎患者的宫颈细胞FFPE样本，标号2：慢性宫颈炎患者的宫颈细胞FFPE样本，标号3：CINⅢ患者的宫颈细胞FFPE样本，标号4：炎症伴磷化患者的宫颈细胞FFPE样本，标号5：宫颈癌患者的宫颈细胞FFPE样本；标号6：宫颈癌Hela细胞系样本，标号7：CINⅠ患者的宫颈癌变细胞FFPE样本(并非一定会发展为癌症)，标号8：CINⅠ患者的宫颈癌旁细胞FFPE样本。
从图1可以看出，本申请提供的引物组合(引物对序列为SEQ IDNO.1-10)在不同宫颈癌发展阶段及宫颈炎症患者的样本中均能得到良好扩增，在FFPE样本和细胞系DNA中均能得到良好扩增，并且扩增条带单一，无非特异扩增；说明该引物组合的扩增效率不受甲基化程度和样本类型的影响。
实验例2
采用凝胶电泳法分别对PAX1、JAM3以及FAM19A4基因的扩增引物对进行对比筛选，对比结果如图2和图3所示。
其中，待扩增的宫颈细胞样本先按照甲基化转化试剂盒说明书进行亚硫酸氢盐转化，PCR反应液中各组分如表7所示，扩增条件请参阅实施例4。
进行对比各个引物对的序列和在PCR反应液的终浓度如表8所示。
表7
Figure SMS_8
Figure SMS_9
表8
Figure SMS_10
图2中的标号与引物对和扩增样本的对应关系如表9所示。
表9
Figure SMS_11
从图2可以看出，“PAX1-F和PAX1-R”引物对的扩增效果最好，条带单一且是目的条带。
图3中的标号与引物对和扩增样本的对应关系如表10所示。
表10
Figure SMS_12
从图3可以看出，“JAM3-1F和JAM3-1R”引物对、“JAM3-2F和JAM3-2R”引物对以及“FAM19A4-1F和FAM19A4-1R”引物对的扩增效果好，条带单一且是目的条带。
实验例3
采用凝胶电泳法分别对扩增时选用不同DNA聚合酶进行对比筛选，对比结果如图4所示。
其中，待扩增的宫颈细胞样本先按照甲基化转化试剂盒说明书进行亚硫酸氢盐转化。采用KAPA2G快速热启动DNA聚合酶时，PCR反应液中各组分参照实施例2，与实施例2中PCR反应液的区别在于：将表2中的“引物对混合物”替换为单个引物对。采用Epi Taq DNA聚合酶时，PCR反应液中各组分参照实施例3，与实施例3中PCR反应液的区别在于：将表4中的“引物对混合物”替换为单个引物对。扩增使用的引物对为“PAX1-2-F和PAX1-2-R”引物对或“PAX1-F和PAX1-R”引物对，且“PAX1-2-F和PAX1-2-R”引物对或“PAX1-F和PAX1-R”引物对在PCR反应液中的终浓度均为0.2μM。
图4中的标号与聚合酶、引物对和扩增样本的对应关系如表11所示。
表11
Figure SMS_13
从图4可以看出，采用Epi Taq DNA聚合酶时的扩增效果远不如采用KAPA2G快速热启动DNA聚合酶(即使用KAPA2G Fast Multiplex mix)的效果好。
综上，本申请提供的用于甲基化扩增子建库的组合物包括第一至第五引物对(序列为SEQ ID NO.1-10)，即实现同时、快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中宫颈癌甲基化差异区域进行扩增，同时可以得到多基因多位点的甲基化水平的定量结果，得到每个样本中每个位点的甲基化的比例本引物组合有较好的扩增效率，可使5个片段得到有效扩增；本引物组合有较好的扩增特异性，可有效避免非特异性扩增，本引物浓度组合可以使5个片段得到较均一的扩增，有利于避免不同片段的测序数据量之间相差太大，可以节省测序数据量，从而节约成本。纯化后的扩增产物具有测序接头，可得到测序前的文库，可直接用于二代测序，而且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低，不仅节约了时间成本，简化了实验步骤，而且提高了实验结果的可信度。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于甲基化扩增子建库的组合物，其特征在于，包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对以及第五引物对；
其中，所述第一引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第二引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第三引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第三引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述第四引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示，所述第四引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；
所述第五引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示，所述第五引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对、所述第四引物对以及所述第五引物对的浓度比为1:(1.8-2.2):(0.3-0.7):(1.8-2.2):(0.3-0.7)；
可选地，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对、所述第四引物对以及所述第五引物对的浓度比为1:(1.95-2.05):(0.45-0.55):(1.95-2.05):(0.45-0.55)。
3.一种用于甲基化扩增子建库的PCR反应液，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的用于甲基化扩增子建库的组合物。
4.根据权利要求3所述的PCR反应液，其特征在于，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对、所述第四引物对以及所述第五引物对在所述PCR反应液中的浓度分别为0.16-0.24μM、0.36-0.44μM、0.06-0.14μM、0.36-0.44μM以及0.06-0.14μM；
可选地，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对、所述第四引物对以及所述第五引物对在所述PCR反应液中的浓度分别为0.19-0.21μM、0.39-0.41μM、0.09-0.11μM、0.39-0.41μM以及0.09-0.11μM。
5.根据权利要求3所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液还包括扩增组分，所述扩增组分包括缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶以及dNTPs。
6.根据权利要求5所述的PCR反应液，其特征在于，所述DNA聚合酶为KAPA2G快速热启动DNA聚合酶。
7.根据权利要求5或6所述的PCR反应液，其特征在于，所述扩增组分为KAPA2G FastMultiplex mix。
8.一种一步法甲基化扩增子建库的方法，其特征在于，包括：采用权利要求3-7中任一项所述PCR反应液对DNA甲基化转化后的样本进行扩增；对扩增后的产物进行纯化，得到测序前的文库。
9.根据权利要求8所述的甲基化扩增子建库的方法，其特征在于，所述扩增的步骤包括：于97-99℃下预变性2-4min，于97-99℃下变性8-12s，于59-61℃下退火12-17s，于71-73℃下延伸28-32s，然后于71-73℃后保持2-4min。
10.权利要求1或2所述的用于甲基化扩增子建库的组合物在建立用于评估宫颈组织的甲基化水平的文库中的应用。
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