CN116676393A - 用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物、引物对和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物、引物对和方法。该甲基化标志物包括第一区域(定位于人JAM3基因chr11:133938952‑133939063)、第二区域(定位于人ZNF671基因chr19:58238765‑58238903)和第三区域(定位于人ZNF671基因chr19:58238674‑58238790)中的至少一个甲基化位点，缓解了现有技术中存在的宫颈癌甲基化标志物特异性低，在非宫颈癌样本中，例如炎症样本及低级别宫颈上皮内瘤变也具有较高甲基化水平的问题。

Description

用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物、引物对和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物、引物对和方法。
背景技术
子宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，是发展中国家女性癌症死亡的主要原因。目前宫颈癌的筛查包括宫颈细胞学检测及人类乳头状瘤病毒(HPV)检测。细胞学检测包括巴氏涂片和TCT液基细胞压片。TCT相较于巴氏涂片更易于发现异常细胞，敏感性较高，但价格相对较高，且诊断水平受医师主观因素影响较大。HPV DNA检测相比细胞学检测，能够对高危型和低危型进行分型和定量检测，但是>80％的妇女一生中都会感染HPV，90％以上的感染者体内的病毒在两年内自动清除，HPV DNA检测产生大量的假阳性，检测特异度低。宫颈上皮内瘤变(CIN)是宫颈癌前病变的阶段，随病变程度加重，癌变几率升高。即使对于同一级别癌前病变个体，癌症风险也存在差别。CIN1的自然消退率为60～85％，大部分病例可在2年内恢复正常，进展为CIN2～3的比例为10～15％，而进展为癌的比例约0.3％；CIN2的自然消退率约50％，23％左右的病变呈持续状态；CIN3则有30％的比例能够进展成宫颈癌。所以需要一种方法可以区分宫颈上皮内瘤变和子宫颈癌，既可以避免过度治疗，又可以避免癌变风险。
DNA甲基化是在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶；是一种表观遗传学效应，不改变核酸序列，但可通过改变染色体的结构，调控蛋白表达，在许多肿瘤发生、发展的各个阶段均有其特异性的改变模式。基因甲基化分析是非形态学的分子检测方法，既能避免细胞检查的局限性，又可保证诊断的准确性。
目前现有的宫颈癌相关的甲基化基因有几十个，但是真正可以用于早期筛查的基因却不多，因为宫颈细胞出现炎症也会引起相关基因的甲基化水平升高，若用这些基因来筛选的话则很容易造成假阳性。所以理想的宫颈癌早筛基因需要在宫颈炎症和CIN1细胞中甲基化水平极低，但在宫颈病变组织中甲基化水平随病变程度逐渐升高，且在宫颈癌组织中甲基化水平较高。
同时，目前检测某位点或某基因甲基化程度的手段也有待改进。目前检测某位点或某基因甲基化程度的方法有以下几种：
甲基化建库捕获技术，先建库，然后通过探针杂交的方式捕获到目的片段后进行测序。甲基化建库捕获技术中探针的设计位点，捕获效率等对目标位点的测序均会造成影响。且需要合成探针，成本高，建库时间长。
qPCR检测技术是通过引物和探针的设计来对引物和探针上所包含的甲基化位点的甲基化情况进行检测。该检测技术由于只能检测引物和探针上的甲基化位点，所以检测位点比较有限。
MSP(甲基化特异性PCR)通过对目标区域设计上下游引物，根据能否扩增出条带来判断目标区域的甲基化情况。需要针对亚硫酸氢盐转换后甲基化位点和非甲基化位点分别设计引物，PCR扩增后通过凝胶电泳进行检测。但MSP方法只能定性，不能定量。
焦磷酸测序通过PCR扩增亚硫酸氢盐转换后的DNA样本后再进行焦磷酸测序的方法实现甲基化水平的定量。焦磷酸的测序长度只有100bp，有效读长较短，约为60bp，且价格昂贵。
因此，在宫颈癌组织中甲基化水平具有特异性的甲基化位点，以及优化这些位点甲基化水平的检测方法是目前市场需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，该标志物在子宫颈癌病变细胞或组织中的甲基化水平特异性升高。
本发明的第二目的在于提供用于扩增上述甲基化标志物的引物对。
本发明的第三目的在于提供用于检测目标区域甲基化水平的方法。
本发明的第四目的在于提供用上述甲基化标志物，引物对或方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供了一种用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，包括第一区域、第二区域和第三区域中的至少一个甲基化位点：
所述第一区域定位于人JAM3基因chr11:133938952-133939063；
所述第二区域定位于人ZNF671基因chr19:58238765-58238903；
所述第三区域定位于人ZNF671基因chr19:58238674-58238790。
优选地，第一区域定位于人JAM3基因的正义链；第二区域定位于人ZNF671基因的反义链；第三区域定位于人ZNF671基因的反义链。
优选地，宫颈癌样本的所述甲基化位点的甲基化水平至少为80％。
根据本发明的一个方面，还提供了用于扩增上述甲基化标志物的引物对，包括第一引物对、第二引物对和第三引物对中的至少一种；
所述第一引物对用于扩增所述第一区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示片段；
所述第二引物对用于扩增所述第二区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示片段；
所述第三引物对用于扩增所述第三区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示片段。
优选地，至少一条引物的5’端还连接有接头序列；
优选地，所述接头序列中含有标签序列。
根据本发明的一个方面，还提供了用于检测目标区域甲基化水平的方法，包括：获取经甲基化转化的核酸样本，经PCR扩增后纯化扩增产物，测序后分析测序数据，根据甲基化位点的胞嘧啶含量判断该位点的甲基化水平；所述PCR扩增使用的引物含有接头序列；甲基化转化包括使核酸样本中的非甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
优选地，使用亚硫酸氢盐将非甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
优选地，所述甲基化位点的胞嘧啶含量为所述甲基化位点读取为胞嘧啶的数量与所述甲基化位点读取的所有类型核苷酸的数量的比例。
优选地，所述方法检测的区域包括上述的第一区域、第二区域和第三区域中的至少一种；
优选地，使用上述引物对进行所述PCR扩增，所述引物对的5’端连接有接头序列。
根据本发明的一个方面，还提供了上述用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，或上述引物对，或上述方法在制备用于宫颈癌早期筛查的产品中的应用。
根据本发明的一个方面，还提供了上述用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，或上述引物对，或上述方法在非诊断和治疗目的的判断核酸甲基化水平中的应用。
根据本发明的一个方面，还提供了一种用于宫颈癌早期筛查的试剂盒，包括(a)或(b)：
(a)用于检测上述甲基化标志物甲基化水平的试剂；
(b)前述实施方式中的引物对。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物在宫颈癌样本中甲基化水平特异性升高，在正常样本、炎症样本及低级别宫颈上皮内瘤变中的甲基化水平均较低，对宫颈癌的检测具有良好的特异性。
本发明提供的用于检测目标区域甲基化水平的方法基于扩增子建库测序技术，仅需要通过引物扩增来富集靶向目的片段，可对多个位点的甲基化情况进行检测，在建库时间上大幅降低，并且节约了建库成本。本发明用于检测目标区域甲基化水平的方法将建库及加接头的方式通过一步法PCR反应来实现，一方面极大地节省了时间；另一方面减少了建库测序中的PCR次数，由于样本常是正常细胞和癌症细胞的混合物，这种定量方式也可以最大限度的定量甲基化含量，提高检测结果的准确度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中引物对扩增第一区域的结果；
图2为实施例2中引物对扩增第二区域和第三区域的结果；
图3为对比例1中设计的两对引物对扩增ZNF671的CpG岛的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，包括第一区域、第二区域和第三区域中的至少一个甲基化位点：
所述第一区域定位于人JAM3基因chr11:133938952-133939063；
所述第二区域物定位于人ZNF671基因chr19:58238765-58238903；
所述第三区域物定位于人ZNF671基因chr19:58238674-58238790。
上述区域定位以人基因组hg37为参考基因组。
在可选的实施方式中，第一区域定位于人JAM3基因的正义链；第二区域定位于人ZNF671基因的反义链；第三区域定位于人ZNF671基因的反义链。
JAM3(junctional adhesion molecule，连接粘附分子)是免疫超家族中一种特殊类型的跨膜蛋白的家族，它位于极性上皮细胞和内皮细胞的紧密连接处。ZNF671是哺乳动物转录抑制因子KRAB-锌指蛋白家族的成员，研究发现其在乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等实体瘤中发挥了抑癌作用。本发明在NCBI上检索JAM3，ZNF671的CpG岛，综合文献区域筛选出上述甲基化标志物，经实验证实，上述区域中的甲基化位点的甲基化程度在正常样本、炎症样本及宫颈癌前病变的阶段的样本中均低于10％，在宫颈癌样本里面的甲基化程度均高于80％，是理想的宫颈癌早筛区域。
在可选的实施方式中，宫颈癌样本的所述甲基化位点的甲基化水平至少为80％。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于扩增上述甲基化标志物的引物对，包括如下第一引物对、第二引物对和第三引物对中的至少一种：
所述第一引物对用于扩增所述第一区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示片段；
所述第二引物对用于扩增所述第二区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示片段；
所述第三引物对用于扩增所述第三区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示片段。
在可选的实施方式中，至少1、2、3、4、5条或全部引物的5’端还连接有接头序列，连接接头序列的引物可以在PCR扩增的过程中直接将接头序列连接到目的片段的两端，得到的扩增产物纯化后可直接作为测序前文库。
在可选的实施方式中，所述接头序列中含有标签序列，以用于区分样本，标签序列可选择本领域常规的标签序列，例如可以但不限于index序列和/或barcode序列。
根据本发明的一个方面，还提供了用于检测目标区域甲基化水平的方法，该方法包括获取经甲基化转化的核酸样本，经PCR扩增后纯化扩增产物，测序后分析测序数据，根据甲基化位点的胞嘧啶含量判断该位点的甲基化水平。
在该方法中，甲基化转化包括使核酸样本中的非甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，以在后续测序的步骤中对甲基化和非甲基化的胞嘧啶进行区分。
在该方法中，PCR扩增使用的引物含有接头序列，可以在PCR扩增的过程中直接将接头序列连接到目的片段的两端。本发明将建库及加接头的方式通过一步法PCR反应来实现，该方式极大地节省了时间。由于样本常是正常细胞和癌症细胞的混合物，采用一步法PCR直接将待测样本中的核酸构建为文库，减少了建库测序过程中的PCR次数，也可以最大限度的定量甲基化含量。
在可选的实施方式中，使用亚硫酸氢盐将非甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，对PCR产物进行测序，在测序步骤中，甲基化的位点读取为胞嘧啶，未甲基化的位点读取为胸腺嘧啶。
在可选的实施方式中，所述甲基化位点的胞嘧啶含量为所述甲基化位点读取为胞嘧啶的数量与所述甲基化位点读取的所有类型核苷酸的数量的比例。以亚硫酸氢盐修饰后测序为例，则该甲基化位点的胞嘧啶含量为该位点读取为胞嘧啶的数量与该位点读取为胞嘧啶和该位点读取为胸腺嘧啶数量之和的比例。
在一些可选的实施方式中，用于检测目标区域甲基化水平的方法包括如下步骤：从待测样本获取核酸、亚硫酸氢盐转化、一步法PCR扩增，产物纯化、文库质检、高通量测序和生信分析。
待测样本获取核酸可按照本领域常规的方法或试剂盒获得，本发明对此不做限制，核酸质检标准依据本领域常规的标准。亚硫酸氢盐转化可按照本领域常规的方法或试剂盒进行。
一步法PCR扩增：设计不含CpG位点的片段特异性扩增引物，并在5’加上建库通用的接头序列，区分不同样本的index序列，用该引物进行PCR扩增，完成对靶向目的片段的扩增和富集。
产物纯化可按照本领域常规的方法或试剂盒进行，例如采用磁珠纯化，对PCR扩增的产物进行纯化并回收，得到最终的测序前文库。将上述文库可选地通过二代测序平台进行高通测序后进行生信分析。生信分析包括碱基识别、去除测序接头、删除低质量碱基和比对至人基因组hg37生成bam文件。通过计算每一个CpG位点的C的读数和T的读数，得到C的比例，即C/C+T，最后统计在扩增区域的甲基化情况。
在可选的实施方式中，用于检测目标区域甲基化水平的方法检测的区域包括上述第一区域、第二区域和第三区域中的至少一种。
在可选的实施方式中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示片段的第一引物对扩增第一区域。如某一些具体的实施例，用于扩增第一区域的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示，其中含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示片段，以及接头序列和index序列。
在可选的实施方式中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示片段的第二引物对扩增第二区域。如某一些具体的实施例，用于扩增第二区域的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和10所示，其中含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示片段，以及接头序列和index序列。
在可选的实施方式中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示片段的第三引物对扩增第三区域。如某一些具体的实施例，用于扩增第三区域的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.11和12所示，其中含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示片段，以及接头序列和index序列。
根据本发明的一个方面，还提供了上述用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，上述引物对，或上述方法在制备用于宫颈癌早期筛查的产品中的应用。
根据本发明的一个方面，还提供了上述用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，上述引物对，或上述方法在非诊断和治疗目的的判断核酸的甲基化水平中的应用。
根据本发明的一个方面，还提供了一种用于宫颈癌早期筛查的试剂盒，该试剂盒包括(a)或(b)：
(a)用于检测上述用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物的试剂，具体的试剂本领域技术人员可以根据该试剂盒的实验目的进行选择，包括但不限于酶、引物、缓冲体系、游离的核苷酸分子、盐或金属离子和磁微粒中的一种或多种。
(b)前述实施方式中第一引物对、第二引物对和第三引物对中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述试剂盒中还包括空白对照、阴性对照和阳性对照中的至少一种。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实施例和对比例中涉及的实验细胞组织如表1所示：
表1
实施例1
检测表1中细胞组织的如下甲基化标志物：
第一区域：定位于人JAM3基因chr11:133938952-133939063；
第二区域：定位于人ZNF671基因chr19:58238765-58238903；
第三区域：定位于人ZNF671基因chr19:58238674-58238790。
采用扩增子检测库测序法检测上述三个区域的甲基化水平，使用含有接头序列和index序列的引物进行扩增。
扩增第一区域的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
JAM3-F：GTYGTTGGCTTTTTAGTAATTTTYGATAT(SEQ ID NO.1)；
JAM3-R：CAAACTCACCCCTAAAAAACAACAAC(SEQ ID NO.2)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增第一区域的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
JAM3-F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGA CGCTCTTCCGATCTGTYGTTGGCTTTTTAGTAATTTTYGATAT(SEQ ID NO.7)；
JAM3-R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG CTCTTCCGATCTCAAACTCACCCCTAAAAAACAACAAC(SEQ ID NO.8)。
扩增第二区域的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
2F：GGAGGAGATGTTGTTTTTAGTGTTT(SEQ ID NO.3)；
R13：RAAATCCRTTAACTCCRCCAT(SEQ ID NO.4)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增第二区域的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
2F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTGGAGGAGATGTTGTTTTTAGTGTTT(SEQ ID NO.9)；
R13:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTRAAATCCRTTAACTCCRCCAT(SEQ ID NO.10)。
扩增第三区域的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
F7:GTTTTATGGYGGAGTTAAYGGAT(SEQ ID NO.5)；
2R:TATCCTAAAACACAAAAACTACAAACACTT(SEQ ID NO.6)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增第三区域的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
F7:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTGTTTTATGGYGGAGTTAAYGGAT(SEQ ID NO.11)；
2R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCT TCCGATCTTATCCTAAAACACAAAAACTACAAACACTT(SEQ ID NO.12)。
检测步骤：
(1)从宫颈细胞获取核酸，使用康为FFPE提取试剂盒；
(2)亚硫酸氢盐转化：按照甲基化转化试剂盒说明书对宫颈细胞样本进行亚硫酸氢盐转化，并放于-20℃冰箱保存备用。
(3)采用上述含有SEQ ID NO.1～6，接头序列和index序列的引对各样本进行PCR扩增，完成对靶向目的片段的扩增和富集。PCR扩增体系和程序如下：
表2一步法PCR体系
成份 用量μl
2×KAPA2G Fast Mμltiplex Mix 12.5
引物混合液(Primer Mix) 终浓度为0.1μM
DNA模板 10ng
PCR-grade water 补齐至反应体系体积
Total 25
表3一步法PCR程序
(4)磁珠纯化：对PCR扩增的产物进行纯化并回收，得到最终的测序前文库。
(5)测序及生信分析：将上述文库加入20％phix文库进行碱基平衡后通过illumina novaseq-6000二代测序平台进行高通测序，每个样本的测序深度大于500×，测序完成后按照不同index进行数据拆分后进行生信分析。生信分析包括碱基识别、去除测序接头、删除低质量碱基和比对至人基因组hg37生成bam文件。通过计算每一个CpG位点的C的读数和T的读数，得到C的比例，即C/C+T，最后统计在扩增区域的CpG位点的甲基化情况。测序结果如表2～表8所示。
检测结果：
(1)第一区域：JAM3基因chr11:133938952-133939063的测序结果：
表4
CIN2-T CESC_N CESC_T Normal-1 Normal-2 CIN2_N CIN2_T
chr11.133938983 3.54 3.83 83.04 2.07 3.28 4.74 2.03
chr11.133938991 2.36 3.33 80.00 2.29 3.40 4.79 2.25
chr11.133938998 1.52 3.18 86.22 3.09 3.28 4.89 2.13
chr11.133939000 4.05 4.06 76.13 1.89 2.45 4.20 1.81
chr11.133939006 3.44 3.83 81.37 2.19 2.99 5.63 1.78
chr11.133939014 2.97 4.26 86.27 2.14 2.94 4.78 1.71
chr11.133939018 2.50 0.93 45.30 1.05 1.93 3.99 1.27
(2)第二区域：ZNF671基因chr19:58238765-58238903的测序结果：
表5
CESC_T Normal-1 CINⅠ_T infla with phosp infla Hela
chr19.58238792 77.78 3.70 3.35 5.33 4.83 88.41
chr19.58238798 89.31 3.99 3.48 4.34 7.86 95.51
chr19.58238800 89.07 6.82 5.26 5.06 4.16 96.96
chr19.58238811 86.15 1.81 4.54 5.56 5.90 96.13
chr19.58238817 88.95 1.84 4.74 6.02 2.36 97.60
chr19.58238824 88.65 2.87 2.90 3.97 3.01 96.44
chr19.58238829 88.86 2.34 3.47 4.09 5.17 83.99
chr19.58238833 87.90 2.38 3.44 2.91 6.36 84.46
chr19.58238839 88.45 1.57 2.09 6.43 1.76 81.27
chr19.58238851 88.58 1.98 2.38 3.09 2.83 91.94
chr19.58238871 88.40 0.59 2.13 3.96 3.05 97.40
chr19.58238873 87.59 3.30 2.13 5.65 2.27 97.10
chr19.58238878 88.64 2.21 2.90 4.44 3.13 93.94
(3)第三区域：ZNF671基因chr19:58238674-58238790的测序结果：
表6
CESC_T Normal-1 Normal-2 CINⅠ_T infla with phosp infla Hela
chr19.58238707 84.94 5.49 2.32 4.39 7.04 4.79 95.20
chr19.58238712 83.92 5.55 2.79 4.40 5.31 7.75 94.97
chr19.58238718 84.02 9.29 3.55 6.50 6.25 7.73 92.91
chr19.58238741 83.97 5.84 2.37 4.34 4.98 2.84 94.01
chr19.58238748 67.51 5.81 1.30 3.69 3.08 3.04 78.62
chr19.58238761 83.24 6.74 1.59 5.15 4.31 2.77 95.46
chr19.58238763 84.28 5.82 1.31 3.86 6.80 4.29 96.46
chr19.58238765 84.62 8.29 2.67 4.31 7.85 7.64 96.61
结果显示，JAM3一个区域和ZNF671的两个区域的甲基化程度在正常样本、炎症样本及CIN1样本里均低于10％，而在宫颈癌样本里面的甲基化程度均高于80％，是理想的宫颈癌早筛区域。可以用来做扩增子及qPCR的位点设计。
实施例2
分别使用上述SEQ ID NO.1～6所示的引物扩增目的片段，结果如图1和图2所示。
使用扩增第一区域～第三区域的如下引物扩增目的片段，
扩增第一区域(JAM3基因chr11:133938952-133939063正义链)的引物：
JAM3-F：GTYGTTGGCTTTTTAGTAATTTTYGATAT(SEQ ID NO.1)；
JAM3-R：CAAACTCACCCCTAAAAAACAACAAC(SEQ ID NO.2)。
扩增第二区域(ZNF671基因chr19:58238765-58238903反义链)的引物：
2F：GGAGGAGATGTTGTTTTTAGTGTTT(SEQ ID NO.3)；
R13：RAAATCCRTTAACTCCRCCAT(SEQ ID NO.4)。
扩增第三区域(ZNF671基因chr19:58238674-58238790反义链)的引物：
F7:GTTTTATGGYGGAGTTAAYGGAT(SEQ ID NO.5)；
2R:TATCCTAAAACACAAAAACTACAAACACTT(SEQ ID NO.6)。
图1种泳道1～16为扩增第一区域的引物SEQ ID NO.1和2的扩增结果，引物在绝大部分样本中的扩增效率较高，扩增条带单一，下机数据比对率大于90％；图2中泳道1～8为扩增第二区域的引物SEQ ID NO.3和4的扩增结果，图3中泳道9～16为扩增第三区域的引物SEQ ID NO.5和6的扩增结果，这两对引物的扩增效率较高，扩增条带单一，下机数据比对率大于90％。
对比例1
对于JAM3和ZNF671的CpG岛引物的设计并非是容易的，因为甲基化转化后的片段是非碱基平衡的，T碱基的比例升高，导致引物不仅难设计，而且扩增效率不高，极易产生非目的条带，包括引物二聚体和非特异扩增。
设计对ZNF671的CpG岛的其他扩增引物，如下所示：
1F:AGGGTTTAGGAGAGGGGTGTTTTAG(SEQ ID NO.13)；
1R:CAAACACTTCCRTCCCTACAAAAC(SEQ ID NO.14)；
和，
2F:GGAGGAGATGTTGTTTTTAGTGTTT(SEQ ID NO.3)；
2R:TATCCTAAAACACAAAAACTACAAACACTT(SEQ ID NO.6)。
使用上述引物扩增，扩增结果如图3所示，图3中泳道1～6为引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的扩增结果；泳道7～12为引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6的扩增结果。可以看出上述两对引物有较多非目的条带，大部分样本的下机数据比对率低于50％。
对比例2
对宫颈癌甲基化相关的其他基因进行CpG岛的扩增，扩增区域和扩增引物如下，检测步骤同实施例1。
(一)扩增区域如下：
PAX1的区域1：chr20：21686444-21686573正义链；
PAX1的区域2：chr20：21686972-21687213正义链；
PAX1的区域3：chr20:21694736-21694940正义链；
FAM19A4的区域1：chr3:68981581-68981798反义链；
FAM19A4的区域2：chr3:68981776-68981946反义链。
(二)使用含有接头序列和index序列的引物进行扩增，扩增引物如下：
(1)扩增PAX1的区域1的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
F:GYGTTTYGTTGTYGYGTATAG(SEQ ID NO.15)；
R:CRACRCAATCCRAAAAAACTT(SEQ ID NO.16)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增PAX1的区域1的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGYGTTTYGTTGTYGYGTATAG(SEQ ID NO.17)；
R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCRACRCAATCCRAAAAAACTT(SEQ ID NO.18)。
(2)扩增PAX1的区域2的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
F:GGAAGTGYGTTTGGGTGTAGTT(SEQ ID NO.19)；
R:CRCRAAACTACCRACTAATATCACA(SEQ ID NO.20)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增PAX1的区域2的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTGGAAGTGYGTTTGGGTGTAGTT(SEQ ID NO.21)；
R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCT TCCGATCTCRCRAAACTACCRACTAATATCACA(SEQ ID NO.22)。
(3)扩增PAX1的区域3的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
F:TGYGGAAGTYGTTATTAGATTTGA(SEQ ID NO.23)；
R:ACRACCAACCCTTCCTCTCC(SEQ ID NO.24)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增PAX1的区域3的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTTGYGGAAGTYGTTATTAGATTTGA(SEQ ID NO.25)；
R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACRACCAACCCTTCCTCTCC(SEQ ID NO.26)。
(4)扩增FAM19A4的区域1的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
F:GGTTAGGTAGGGATAGGAGTAG(SEQ ID NO.27)；
R:AAAAAAACCTAAAACTACTACTAAAAAAA(SEQ ID NO.28)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增FAM19A4的区域1的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTGGTTAGGTAGGGATAGGAGTAG(SEQ ID NO.29)；
R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCT TCCGATCTAAAAAAACCTAAAACTACTACTAAAAAAA(SEQ ID NO.30)。
(5)扩增FAM19A4的区域2的引物含有如下用于与目的区域结合的片段：
F:GTTGTTTTTGTTTTTGTTTGGTT(SEQ ID NO.31)；
R:CCAAACCCTAATCTCCCAACAA(SEQ ID NO.32)。
在一些样本中，含有接头序列和index序列的扩增FAM19A4的区域2的引物举例如下，为了区分各样本，各样本之间采用的index序列不同：
F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCTGTTGTTTTTGTTTTTGTTTGGTT(SEQ ID NO.33)；
R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAAACCCTAATCTCCCAACAA(SEQ ID NO.34)。
(三)测序结果：
(1)PAX1的第一个扩增区域为chr20：21686444-21686573位于PAX1的第一外显子区域，是CG位点密集区域，测序结果如下：
表7
(2)PAX1的第二个扩增区域为：chr20：21686972-21687213测序结果如下：
表8
/>
结果显示，PAX1第一个区域和第二个区域的结果显示，虽然这个区域在癌症样本和宫颈癌细胞系中的甲基化程度较高，但是在正常宫颈样本和炎症样本中均出现甲基化程度大于20％的情况，所以这两区域不适合作为宫颈癌早筛的区域。
(3)PAX1的第三个扩增区域为：chr20:21694736-21694940测序结果：
表9
CESC-T Normal-1 Normal-2 CIN1-T Infla with phosp Hela
chr20.21694738 35.58 39.65 37.17 32.91 35.15 34.86
chr20.21694745 29.89 25.34 26.47 34.42 32.13 30.23
chr20.21694778 75.27 1.93 5.35 4.87 15.10 18.12
chr20.21694821 71.50 3.70 1.72 6.18 11.48 32.83
chr20.21694827 67.29 3.50 1.69 4.70 7.38 23.59
chr20.21694847 76.80 4.71 4.60 3.93 13.10 68.03
chr20.21694872 79.06 6.88 6.10 11.89 11.95 80.63
chr20.21694882 76.78 5.90 6.80 11.16 10.48 87.55
chr20.21694919 30.78 4.13 2.79 0.55 4.80 11.78
chr20.21694938 72.75 70.75 63.89 69.65 72.65 63.70
结果显示，PAX1的第三个区域，结果显示，某些位点可以满足在正常样本和CIN1样本中的甲基化程度低于10％，但不能满足在宫颈癌细胞系中的甲基化程度很高。所以区域三也不是理想区域。
(4)FAM19A4区域1为chr3:68981581-68981798，测序结果如下：
表10
(5)FAM19A4区域2为：chr3:68981776-68981946，测序结果如下：
表11
结果显示，虽然FAM19A4的两个区域在宫颈癌样本和细胞系中的比例较高，但是在炎症样本中的甲基化比例在20％左右，所以FAM19A4的区域不适合作为宫颈癌早筛区域。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，其特征在于，包括第一区域、第二区域和第三区域中的至少一个甲基化位点：
所述第一区域定位于人JAM3基因chr11:133938952-133939063；
所述第二区域定位于人ZNF671基因chr19:58238765-58238903；
所述第三区域定位于人ZNF671基因chr19:58238674-58238790。
2.根据权利要求1所述的甲基化标志物，其特征在于，第一区域定位于人JAM3基因的正义链；第二区域定位于人ZNF671基因的反义链；第三区域定位于人ZNF671基因的反义链；
优选地，宫颈癌样本的所述甲基化位点的甲基化水平至少为80％。
3.用于扩增权利要求1所述的甲基化标志物的引物对，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对和第三引物对中的至少一种；
所述第一引物对用于扩增所述第一区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示片段；
所述第二引物对用于扩增所述第二区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示片段；
所述第三引物对用于扩增所述第三区域，核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；或分别含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示片段。
4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于，至少一条引物的5’端还连接有接头序列；
优选地，所述接头序列中含有标签序列。
5.用于检测目标区域甲基化水平的方法，其特征在于，包括：获取经甲基化转化的核酸样本，经PCR扩增后纯化扩增产物，测序后分析测序数据，根据甲基化位点的胞嘧啶含量判断该位点的甲基化水平；
所述PCR扩增使用的引物含有接头序列；
所述甲基化转化包括使核酸样本中的非甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶；
优选地，使用亚硫酸氢盐将非甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲基化位点的胞嘧啶含量为所述甲基化位点读取为胞嘧啶的数量与所述甲基化位点读取的所有类型核苷酸的数量的比例。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法检测的区域包括权利要求1中所述的第一区域、第二区域和第三区域中的至少一种；
优选地，使用权利要求4所述的引物对进行所述PCR扩增，所述引物对的5’端连接有接头序列。
8.权利要求1或2所述的用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，或权利要求3或4所述的引物对，或权利要求5～7任一项所述的方法在制备用于宫颈癌早期筛查的产品中的应用。
9.权利要求1或2所述用于宫颈癌早期筛查的甲基化标志物，或权利要求3或4所述的引物对，或权利要求5～7任一项所述的方法在非诊断和治疗目的的判断核酸甲基化水平中的应用。
10.用于宫颈癌早期筛查的试剂盒，其特征在于，包括(a)或(b)：
(a)用于检测权利要求1或2所述的甲基化标志物甲基化水平的试剂；
(b)权利要求3或4所述的引物对。
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