CN111349699A - 试剂盒及从宫颈分泌物中检测brca基因突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种试剂盒及从宫颈分泌物中检测BRCA基因突变的方法。该方法包括：(1)取宫颈分泌物，提取DNA，以便获得全基因组DNA；(2)基于所述全基因组DNA，利用引物扩增，构建含有BRCA基因的测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，获得所述BRCA基因突变的结果。利用宫颈分泌物检测BRCA基因突变，可以用来进行遗传性乳腺癌卵巢癌综合征的筛查。同时还可以利用宫颈分泌物进行宫颈癌的筛查，实现同一样本的多癌筛查。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种试剂盒以及从宫颈分泌物中检测BRCA基因突变的方法。
背景技术
乳腺癌和卵巢癌是我国妇女发病率较高的恶性肿瘤。在过去20年我国乳腺癌发病率稳步上升，预计未来十年将翻番。引人注目的是，我国早期乳腺癌发病率最高的是45岁，比美国妇女早了十年。乳腺癌在我国具有发病率、死亡率和年轻化程度三线走高的严峻形势，而且大城市女性患乳腺癌风险是小城市的2倍。研究表明，遗传性乳腺癌占乳腺癌总体的5～10％。该类患者约90％发生BRCA1或BRCA2突变，而BRCA1或BRCA2突变携带者一生中患乳腺癌的危险为60％～85％患卵巢癌的风险分别为39～44％和11～18％。另有研究证明，40％～50％的遗传性乳腺癌是由BRCA1突变引起的。NCCN指南强烈建议家族成员中存在BRCA1/BRCA2基因致病性突变或≥1位乳腺癌近亲的人群进行遗传性乳腺癌/卵巢癌检测。
BRCA1和BRCA2基因变异多种多样，涉及到近万个变异位点，而且这些突变分散遍布于各个外显子，没有证据表明存在突变热点区域。若用传统的Sanger测序、qPCR方法或MLPA等对BRCA1/2整个基因进行检测，都不能一次性检测BRCA1和BRCA2基因的所有变异类型，且需要耗费大量的时间并且价格不菲。相比之下，高通量二代测序技术(NGS)以其更为高效快速且能一次性对BRCA1和BRCA2基因所有外显子及邻近上下游区域内的变异同时进行检测，以更高性价比的优势脱颖而出，成为BRCA1/2基因检测市场的主力军。
基于NGS的BRCA基因检测产品的市场报价在国内参次不齐(几百至几千)，而国外产品报价更高(上万元)。目前国内外开发遗传性乳腺癌/卵巢癌BRCA1/2检测试剂盒主要针对唾液和血液gDNA样本。开发适用于乳腺癌检测的试剂盒及筛查乳腺癌的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种从宫颈分泌物中检测BRCA基因突变的方法以及试剂盒。
本发明的发明人在研究过程中发现：
目前国内开发遗传性乳腺癌/卵巢癌BRCA1/2检测试剂盒的公司较少，大多数是基于客户提供样本进行探针杂交捕获+二代测序(NGS)检测服务，实现BRCA1/2全外显子区或全编码区突变检测。这种检测方法的缺点是订购探针成本高及探针可能捕获效率低。其他BRCA基因检测方法主要包括PCR+Sanger测序，荧光定量PCR和多重PCR+NGS法。Sanger测序法准确度高但通量低；荧光定量PCR法，一般针对若干个已知的基因突变信息进行检测，而且检测灵敏度低；基于多重PCR+NGS法开发BRCA1/2检测的试剂盒主要针对外周血和FFPE切片。通过多重PCR的靶向测序文库制备，可以缩短检测时间及降低成本，但存在均一性差、某些基因位点难以扩增的问题，而且目前大多是基于Illumina或Ion Torrent PGM测序平台。
基于当前BRCA检测的探针杂交捕获法成本高；Sanger测序法通量低；荧光定量PCR法只针对若干个已知突变。市面上的高通量遗传性乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1/2检测试剂盒主要依托Illumina测序平台，而本研究的目的是希望依托于华大测序仪MGISEQ-2000的测序时长短和测序成本低的优势，建立一种基于NGS的乳腺癌/卵巢癌BRCA基因的多重PCR检测方法，在保证缩短检测时间与降低花费成本基础上，确保试剂盒的最优检测性能，提供全面的变异位点解析。同时本发明的应用场景更灵活，可为适龄妇女进行HPV筛查时，提供多一份BRCA基因筛查结果，从而实现样本资源的多重利用。
为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测遗传性乳腺癌卵巢癌综合征，所述试剂用于检测宫颈分泌物中的BRCA基因突变。
根据本发明的实施例，以上所述试剂在制备试剂盒中的用途可以进一步附加如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述BRCA基因包括BRCA1基因和/或BRCA2基因。
在本发明的一些实施例中，所述宫颈分泌物包括宫颈拭子、宫颈脱落细胞。无论是利用宫颈拭子或者是宫颈脱落细胞，都可以检测其中的BRCA基因突变，从而用来表征遗传性乳腺癌卵巢癌综合征的发病情况。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒还可以用于HPV检测的试剂，所述试剂盒用来检测宫颈癌。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种利用宫颈分泌物检测BRCA基因突变的方法，包括：(1)取所述宫颈分泌物，提取DNA，以便获得全基因组DNA；(2)基于所述全基因组DNA，利用引物扩增，构建含有BRCA基因的测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，获得所述BRCA基因突变的结果。
根据本发明的实施例，以上所述利用宫颈分泌物检测BRCA基因突变的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述BRCA基因包括BRCA1基因和/或BRCA2基因。
在本发明的一些实施例中，所述宫颈分泌物包括宫颈试子、宫颈脱落细胞。
在本发明的一些实施例中，从宫颈试子中提取DNA，以便获得全基因组DNA，包括：将所述宫颈试子利用蛋白酶和裂解液裂解，获得裂解物；利用磁珠对所述裂解物进行吸附，以便在所述磁珠上富集全基因组DNA；对富集有全基因组DNA的磁珠漂洗，以便获得所述全基因组DNA。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)进一步包括：基于所述全基因组DNA，利用第一引物组对所述BRCA基因进行第一轮扩增，获得第一产物文库；基于所述第一产物文库，利用第二引物组进行第二轮扩增，获得含有所述BRCA基因的测序文库。
在本发明的一些实施例中，利用磁珠对所述第一产物文库纯化。
在本发明的一些实施例中，利用磁珠对所述含有BRCA基因的测序文库进行纯化。
在本发明的一些实施例中，所述含有BRCA基因的测序文库包括含有BRCA基因全编码区以及BRCA基因上下游各20bp的测序文库。BRCA基因全编码区具体来说，包括BRCA1外显子2～24，以及BRCA2外显子2～27。在此基础上，同时扩增部分外显子两端内含子区域，如BRCA基因上下游各20bp的部分，获得含有BRCA基因的测序文库。
在本发明的一些实施例中，所述第一引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:390。
在本发明的一些实施例中，所述第二引物组包括SEQ ID NO:391以及选自SEQ IDNO:393～SEQ ID NO:487中的至少一个。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)进一步包括：对所述测序文库进行环化处理，以便获得单链环状产物；基于所述单链环状产物，利用测序平台MEISEQ-2000平台进行所述测序。利用MGISEQ-2000测序平台进行测序，可以在48小时内完成，而且成本低，检测周期短，适于生产的需求。
在本发明的一些实施例中，所述突变包括无义突变、移码突变、非移码插入、非移码缺失、错义突变、同义突变、剪接位点突变，以及大片段的缺失或重排。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用来检测乳腺癌，所述试剂盒包括用来从宫颈分泌物中检测BRCA基因突变的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述试剂包括下列中的至少一种：DNA提取试剂，所述DNA提取试剂盒用于从所述宫颈分泌物中提取DNA；扩增引物，所述扩增引物包括SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:390；通用引物，所述通用引物包括SEQ ID NO:391和选自SEQ ID NO:392～SEQ ID NO:487中的至少一个。
本发明所取得的有益效果为：本发明针对宫颈分泌物进行BRCA1/2基因建库测序，实现一份样本同时做多癌(宫颈癌，遗传性乳腺癌和卵巢癌)筛查/检测，可以实现资源的最大利用。而且可以基于宫颈癌防控平台的HPV检测样本(宫颈拭子)进行BRCA1/2基因建库测序，方便快捷获得样本。基于本发明的方法，搭配MGISEQ-2000测序平台，在48小时内完成测序，以“N检合一”方式，低成本，检测周期短。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施例提供的利用HPV检测的宫颈拭子样本来进行癌症筛查的流程图。
图2是根据本发明的一个实施例提供的从用于HPV检测的宫颈拭子样本中获得DNA的示意图。
图3是根据本发明的一个实施例提供的经过两轮PCR扩增后的电泳质检图。
图4是根据本发明的一个实施例提供的利用MGISEQ-2000测序平台进行数据分析的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为了本领域技术人员更好的理解本发明，对本发明中的一些术语进行了解释和说明，这些解释和说明不应看做是对本发明保护范围的限制。
本文中“宫颈分泌物”是指子宫管内膜腺体产生的一种浓厚、透明、粘稠，类似蛋清样的分泌物。可以通过如下方法获取宫颈分泌物：对妇女进行常规消毒外阴，将未涂润滑剂的窥器或者扩阴器等放入阴道内，暴露宫颈，肉眼排除宫颈管内出血，直视下将棉拭子置入宫颈管中深度约1cm，停留至少15秒钟，充分浸渍，取出，获取宫颈分泌物。也可以利用华大基因所研发的自取样SeqHPV分型基因检测产品，使得每个女性在家完成取样。利用该产品获得宫颈分泌物，可以按照本发明所提供的方法对所获得的宫颈分泌物进行BRCA1/2基因的突变检测，从而用作遗传性乳腺癌卵巢癌综合征的筛查。当然利用华大基因所研发的自取样SeqHPV分型基因检测产品，可以直接进行宫颈癌的筛查。
本文中“遗传性乳腺癌卵巢癌综合征”也称为“遗传性乳腺癌&卵巢癌”或者“遗传性乳腺癌/卵巢癌”、或者“遗传性乳腺卵巢癌”，是一种遗传性癌症易感综合征，特征是家族中多个成员罹患乳腺癌和(或)卵巢癌。乳腺癌易感基因1(breast cancer 1gene，BRCA1)和乳腺癌易感基因2(breast cancer 2gene，BRCA2)可以用作遗传性乳腺癌卵巢癌综合征的筛查标志。
本发明借助于宫颈分泌物，提供了一种用于检测BRCA基因突变的方法，从而可以用于检测乳腺癌，尤其是遗传性乳腺癌。同时，借助于宫颈分泌物还可以作为宫颈癌和/或卵巢癌的检测样本，实现一份样本同时做多癌(宫颈癌，遗传性乳腺癌和卵巢癌)筛查/检测，实现“N检合一”，降低检测成本。在此基础上，可以利用测序平台MEGSEQ-2000平台进行检测，即可在短时间内获得检测结果，从而缩短检测周期。
根据本发明的实施例，本发明提供了一种利用宫颈分泌物检测BRCA基因突变的方法，包括：(1)取所述宫颈分泌物，提取DNA，以便获得全基因组DNA；(2)基于所述全基因组DNA，利用引物扩增，构建含有BRCA基因的测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，获得所述BRCA基因突变的结果。
根据本发明的实施例，所述宫颈分泌物可以是宫颈拭子或者宫颈脱落细胞。本文中的“宫颈拭子”是指含有宫颈分泌物或者宫颈脱落物的拭子。常见的是，例如采用华大所自主研发的自取样SeqHPV分型，女性在家取样，所获得的含有宫颈分泌物或者宫颈脱落物的拭子。这些拭子可以用于HPV的检测，也可以用于BRCA基因突变的检测，从而可以同时用于筛查宫颈癌和遗传性乳腺癌卵巢癌综合征的患病情况。
在至少一些具体实施方式中，步骤(2)进一步包括：基于所述全基因组DNA，利用第一引物组对所述BRCA基因进行第一轮扩增，获得第一产物文库；基于所述第一产物文库，利用第二引物组进行第二轮扩增，获得含有所述BRCA基因的测序文库。
在至少一些具体实施方式中，利用磁珠对所述第一产物文库纯化后，然后再利用第二引物组进行第二轮扩增。向第一产物文库中加入磁珠混匀，静置后去掉澄清液，然后加入75％的乙醇混匀，静置后去掉澄清液，利用溶液溶解DNA，获得纯化后的第一产物文库。经过磁珠纯化去掉第一轮扩增中除去第一产物之外的特异性引物以及引物之间所形成的引物二聚体等等，以免这些物质对于第二轮扩增带来干扰。
在至少一些具体实施方式中，利用磁珠对所述含有BRCA基因的测序文库进行纯化。向含有BRCR基因的测序文库中加入磁珠混匀，静置后去掉澄清液，然后加入75％的乙醇混匀，静置后去掉澄清液，利用溶液溶解DNA，获得纯化后的含有BRCA基因的测序文库。经过纯化去除在第二轮扩增过程中所用到的引物，引物之间所形成的引物二聚体和含有DNA聚合酶的混合物等等，从而方便将含有BRCA基因的测序文库用作后续的测序。
在至少一些实施方式中，所述含有BRCA基因的测序文库包括含有BRCA基因全编码区以及BRCA基因上下游各20bp的测序文库。
在至少一些实施方式中，利用引物SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:390作为第一引物组对所述BRCA基因进行扩增，获得第一产物文库。通过第一引物组对BRCA基因扩增，使得从全基因组DNA中靶向扩增得到BRCA基因。这些引物组中引物作为特异性引物对所检测的靶区域长度为81～146bp。由于这些特异性引物对的上下游引物的核苷酸序列不同，各个特异引物对可以结合至BRCA1基因或者BRCA2基因的不同位置。所有特异性引物对的靶区域拼接后可以覆盖BRCA1基因和BRCA2基因的编码区。其中每个特异性引物对包括上游特异引物和下游特异引物，上游特异引物的核苷酸序列见下表1中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:195，与之对应的下游特异引物的核苷酸序列见下表1中SEQ ID NO:196～SEQ ID NO:390。
在至少一些实施方式中，利用SEQ ID NO:391～SEQ ID NO:487中的至少30对作为第二引物组进行第二轮扩增，获得含有所述BRCA基因的测序文库。第二轮扩增主要是对第一轮扩增产物进行放大，第二引物组作为通用引物，其中SEQ ID NO:391作为上游通用引物，可从SEQ ID NO:392～SEQ ID NO:487中选择任意一个作为下游通用引物进行配对使用，获得目标BRCA基因产物。
由此，所获得的含有BRCA基因的测序文库包括含有BRCA基因全编码区以及BRCA基因上下游各20bp的测序文库。需要说明的是，本文中用于BRAC1基因和BRCA2基因扩增的引物，以及各引物的设计原则等等，均记载在申请号为201810762843.3的专利申请中，可以根据需要将其全部或者部分引入本文。另外，本申请所提供的下游通用引物增加了SEQ IDNO:466～SEQ ID NO:487。这些SEQ ID NO:466～SEQ ID NO:487序列和序列SEQ ID NO:392～SEQ ID NO:465以相同的方式使用。
表1扩增引物
表2通用引物序列
本发明的BRCA检测，使常规的血液和唾液样本测试，推广应用到宫颈脱落细胞样本，为适龄妇女提供多癌(宫颈癌，遗传性乳腺癌和卵巢癌)筛查/检测方案。而针对用于HPV检测的宫颈试子样本，开发出可兼容于人BRCA建库检测的方法。具体流程图如图1所示：
首先可以提取宫颈拭子中的DNA，然后分别进行HPV建库和BRCA建库，具体建库过程请见201810762843.3号专利申请，获得HPV文库以及BRCA文库，分别对HPV文库以及BRCA文库进行测序，进行信息分析、出具报告，利用BRCA文库的测序信息获得遗传性乳腺癌的检测信息，利用HPV文库的测序信息获得宫颈癌和卵巢癌的检测信息。从而可以利用宫颈拭子实现多癌筛查。
当直接利用HPV检测的宫颈拭子作为遗传性乳腺癌的检测对象时，可以利用如下方法提取宫颈拭子中的DNA，包括：(a)将所述宫颈试子利用蛋白酶和裂解液裂解，获得裂解物；(b)利用磁珠对所述裂解物进行吸附，以便在所述磁珠上富集全基因组DNA；(c)对富集有全基因组DNA的磁珠漂洗，以便获得所述全基因组DNA。相比较于其他DNA提取方法，对样本利用磁珠富集具有诸多优势。一方面可以保证所获得的DNA溶液的浓度和纯度，另一方面可以提高DNA的得率，可以借助于自动化平台实现通量检测。
在至少一些实施方式中，步骤(a)中所述裂解液为LB裂解液，所蛋白酶为蛋白酶K。在至少一些实施方式中，步骤(a)中所述裂解为在55～65摄氏度下进行金属浴裂解。在利用磁珠进行纯化时，例如可以选择为度磁珠(苏州为度生物技术有限公司，Vdobiotech)。利用异丙醇和磁珠对所述裂解物进行吸附，可以方便磁珠富集全基因组DNA。
本发明开发的利用宫颈分泌物检测人BRCA基因突变的方法为适龄妇女在进行宫颈癌筛查/检测分析的同时，提供多一份遗传性乳腺癌和卵巢癌筛查分析，实现一份DNA样本的两种用途。宫颈试子DNA样本制备约1h,提取成本约2元；BRCA文库构建7h,费用20元/例；DNB制备与加载4h；上机测序48h,费用21元/例；数据分析解读6h以及临床报告出具6h,从样本到检测报告只需要72h。相比于杂交捕获技术的成本约二百元/例以及检测周期6～7天，本发明采用的多重PCR方法具有降低检测成本及缩短检测时间的优势。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了对30张宫颈试子样本进行BRCA基因突变检测的应用例子：
1、DNA提取及定量
1)切取试子一小片(2*3cm2)，加入蛋白酶K 10ul、裂解液LB 150ul，置于金属浴65℃10min；
2)添加乙醇150ul，再添加磁珠10ul，室温放置5min，中间混匀2～3次；
3)置于磁力架上，2min后吸弃上清；
4)添加漂洗液W1(确保加入无水乙醇)150ul，混匀1min，置于磁力架上1min，弃上清；
5)添加漂洗液W2(确保加入无水乙醇)150ul，混匀1min，置于磁力架上1min，弃上清；
6)重复步骤5)一次；
7)离心管置于磁力架上，室温干燥5min，确保乙醇挥发干净；
8)加入20-30ul TE buffer，置于金属浴56℃5min；
9)置于磁力架，将上清转移至新的离心管中。
10)获得的DNA溶液经过Qubit定量，30例提取的样本Qubit定量结果如下：
表3样本定量结果
2、BRCA文库构建
(1)每个样本取两份10ng DNA为模板，以上述BRCA1/2引物195对(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:390)分两管进行扩增(Multi-PCR Primer Pool 1和Multi-PCR Primer Pool2)，第一轮PCR体系中包括如下组分：
表4第一轮PCR体系
| 组分 | 体积(ul) |
| 样本DNA(10ng) | X |
| 2X KAPA2G Fast ReadyMix2 | 25 |
| Multi-PCR Primer Pool*(0.25uM) | 1 |
| TMAC(5M) | 0.6 |
| H<sub>2</sub>O | 23.4-X |
| 总共 | 50 |
注：*代表扩增引物池Multi-PCR Primer Pool 1和Multi-PCR Primer Pool 2。
第一轮PCR的参数设置为：96℃预变性10min；96℃变性1min，60℃退火15min以及72℃下延伸1min，进行5个循环；接着在68℃充分延伸10min，于4℃保存；
(2)第一轮纯化：先将4℃保存的为度磁珠放置室温下平衡30min，再将第一轮所获得的同一样品的两管PCR产物移至同一新的1.5ml的EP管中，加入体积比为1：0.8X的为度磁珠，震荡混匀，待静置反应10min；再放置磁力架上静置5min，弃掉澄清液；于磁力架上加入200ul的75％乙醇，上下吹打10次，静置5min，弃掉澄清液，该步重复1次；再将EP管置室温下静置3min，晾干，再加入25μl TE溶液溶解DNA，混匀后室温放置5min，移至磁力架上，取上清液，即得纯化后的第一轮PCR产物文库；
(3)第二轮PCR：以第一轮纯化后PCR产物文库为模板，用于第二轮PCR反应，第二轮PCR使用30对通用引物进行扩增，所得PCR产物即为测序文库。PCR体系中包括如下组分：
表5第二轮PCR体系
| 组分 | 体积(ul) |
| 第一轮纯化得到的PCR产物 | 23.9 |
| 2X KAPA2G Fast ReadyMix2 | 25 |
| 通用引物(40uM) | 0.5 |
| TMAC(5M) | 0.6 |
| 总共 | 50 |
第二轮PCR的参数设置为：96℃预变性10min；96℃变性1min，62℃退火1min以及72℃下延伸1min，进行20个循环；接着在68℃充分延伸10min后于4℃保存。
(4)第二轮纯化：将步骤(3)获得的产物中加入体积比为1：0.8X的为度磁珠，震荡混匀，静置反应10min，再放置磁力架上静置5min，弃掉澄清液；于磁力架上加入200ul的75％乙醇，上下吹打10次，静置5min，弃掉澄清液，该步重复1次；将EP管置室温下静置3min，再加入20μl TE溶液溶解DNA，混匀室温放置5min，移至磁力架上，取上清液，即得纯化后的测序文库；
(5)产物片段大小鉴定：取2μl纯化产物在6％的PAGE胶(即聚丙烯酰胺凝胶)上进行电泳检测，部分结果参见附图3所示，图3中显示主要条带的片段大小为200～300bp，在大于400bp的范围中，有非特异性扩增片段产生；同时取1μl产物进行Qubit定量；
(6)测序文库使用MGISEQ-2000测序仪上机测序，读长模式为PE100；
(7)测序下机数据分析，根据通用引物中的Barcode标签，将测序数据与样品对应，使用序列比对程序BLAST/SOAP，将每个样品的测序序列与人基因组(hg19)进行比对，计算目标区域覆盖率及多重PCR引物均一性评估。
利用MGISEQ-2000测序平台下机后数据分析流程如图4所示，包括：
1)下机后得到的原始数据，单个样本2M reads可满足需求，错误率(Error rate)用于体现原始测序质量的指标；
2)数据进行Barcode拆分，得到拆分率等数据信息，其中Barcode序列用于区分不同的生物样本；
3)过滤，去除接头污染，得到过滤后质量值(Q值)，例如Q20和Q30；
4)处理后的下机数据进一步比对到人类基因组数据库上(hg19)，得到相关的比对率和测序深度及所包含的重复序列占下机数据的百分比等信息；对覆盖到人类基因组序列的这部分数据再进一步比对到所要扩增富集的目标基因编码区序列上(BRCA1/2Codingregions)，获得目标区域深度分布情况，计算目标区域覆盖率(Capture Rate),覆盖(100X)和均一性(Uniformity)等；
5)SNP分析(SNP calling)。
表6
其中表1中Q20表示过滤后的reads中质量值大于20的碱基数占总碱基数的百分比；Q30表示过滤后的reads中质量值大于30的碱基数占总碱基数的百分比；比对率是指将测序数据与人类全基因组重测序进行比对，序列一致的碱基占测序碱基总数的比率；目标区域覆盖率指的是：测序数据与靶基因参考序列进行比对，考察多重PCR技术覆盖效率的高低；平均深度：测序平均深度，一般>10000X；覆盖度是指测序数据经过组装、比对，被定位到染色体上，这里指测序数据覆盖到BRCA基因区域的深浅；均一性：一般设置0.2X的系数，保证扩增子间拷贝数差异控制在平均测序深度0.2X以上。
从表6可以看出，本实施例中各上机样品的测序数据质量评估：Q20>98％，Q30>91％；样本参考序列比对及测序深度统计，BRCA平均测序深度>10000X，目标区域覆盖率90％左右，测序深度不低于100X的覆盖率>99.9％，测序深度不低于0.2x平均测序深度的覆盖率(均一性)>97％。这些检测指标表明本实施例所开发的宫颈试子用磁珠法提取DNA并进行BRCA建库的方案可行。而且本实施例中对宫颈试子样本进行BRCA基因突变检测，检测灵敏度极高。
(8)突变信息与WGS数据比较，将检测到的30例宫颈试子的BRCA位点变异情况与WGS(血液样本gDNA)数据中BRCA位点变异情况进行比较，考察从宫颈脱落细胞中检测人BRCA基因突变的准确性(见表7)。从表7可以看出，这30份样本对应的个人WGS数据中，BRCA基因突变位点数总共313个，在宫颈试子测试中检出319个，一致位点数311个，漏检2个，多检8个。
表7比对结果
采用宫颈试子样本进行BRCA检测的诊断评估如下表8所示：
表8各样本统计结果
| 测序平台 | MGISEQ-2000 |
| 灵敏度 | 99.37％ |
| 特异度 | 99.95％ |
| 阳性预测值 | 97.51％ |
| 阴性预测值 | 99.99％ |
其中表8中各统计结果按照如下方法进行计算：
以WGS的检测结果为参照，真阳性位点313个，假阳性位点8个，假阴性位点2个，真阴性位点计算：按数据库收录约18000个BRCA位点，本次检测真阴性位点数理论为18000-313＝17687个；
灵敏度＝313/(313+2)
按照真阴性位点理论数除以真阴性理论位点数与假阳性位点的和，得到检测的特异度，计算方法如下：
特异度＝17687/(8+17687)
阳性预测值计算方法如下：
PPV＝313/(313+8)
阴性预测值计算方法如下：
NPV＝17687/(2+17687)
其中在两个样本中(barcode54和66)存在漏检同一位点(chr13,32912299)，经sanger验证为negative(阴性)，即不存在该突变。表明基于靶向扩增的BRCA测序方法更准确。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测遗传性乳腺癌卵巢癌综合征，所述试剂用于检测宫颈分泌物中的BRCA基因突变。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述BRCA基因包括BRCA1基因和/或BRCA2基因；
任选地，所述宫颈分泌物包括宫颈拭子、宫颈脱落细胞；
任选地，所述试剂盒还包括用于HPV检测的试剂，所述试剂盒用来检测宫颈癌。
3.一种利用宫颈分泌物检测BRCA基因突变的方法，其特征在于，包括：
(1)取所述宫颈分泌物，提取DNA，以便获得全基因组DNA；
(2)基于所述全基因组DNA，利用引物扩增，构建含有BRCA基因的测序文库；
(3)对所述测序文库进行测序，获得所述BRCA基因突变的结果；
任选地，所述BRCA基因包括BRCA1基因和/或BRCA2基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宫颈分泌物包括宫颈拭子、宫颈脱落细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，从宫颈拭子提取DNA，以便获得全基因组DNA，包括：
将所述宫颈试子利用蛋白酶和裂解液裂解，获得裂解物；
利用磁珠对所述裂解物进行吸附，以便在所述磁珠上富集全基因组DNA；
对富集有全基因组DNA的磁珠漂洗，以便获得所述全基因组DNA。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：
基于所述全基因组DNA，利用第一引物组对所述BRCA基因进行第一轮扩增，获得第一产物文库；
基于所述第一产物文库，利用第二引物组进行第二轮扩增，获得含有所述BRCA基因的测序文库；
任选地，利用磁珠对所述第一产物文库纯化；
任选地，利用磁珠对所述含有BRCA基因的测序文库进行纯化；
任选地，所述含有BRCA基因的测序文库包括含有BRCA基因全编码区以及BRCA基因上下游各20bp的测序文库。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一引物组包括SEQ ID NO:1～SEQID NO:390；
任选地，所述第二引物组包括SEQ ID NO:391以及选自SEQ ID NO:392～SEQ ID NO:487中的至少一个。
8.根据权利要求3～7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括：
对所述测序文库进行环化处理，以便获得单链环状产物；
基于所述单链环状产物，利用测序平台MEISEQ-2000平台进行所述测序；
任选地，所述突变包括无义突变、移码突变、非移码插入、非移码缺失、错义突变、同义突变、剪接位点突变，以及大片段的缺失或重排。
9.一种试剂盒，所述试剂盒用来检测乳腺癌，其特征在于，所述试剂盒包括用来从宫颈分泌物中检测BRCA基因突变的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括下列中的至少一种：
DNA提取试剂，所述DNA提取试剂用于从所述宫颈分泌物中提取DNA；
扩增引物，所述扩增引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:390；
通用引物，所述通用引物包括SEQ ID NO:391和选自SEQ ID NO:392～SEQ ID NO:487中的至少一个。
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2018
- 2018-12-24 CN CN201811581390.0A patent/CN111349699A/zh active Pending
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