KR101068939B1 - 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 검출용 dna 칩, pna 칩 및 이를 이용한 근이양증 진단키트 - Google Patents

Abstract

근육과 뉴런 세포막에 존재하며, 세포골격(cytoskeleton)의 지지대 역할을 디스트로핀 단백질을 코딩하는 dystrophin 유전자의 결실(deletion), 중복(duplication), 점 돌연변이(point mutation) 및 이로 인한 단백질 결핍으로 발생하는 근이양증은 X 염색체 연관된 근 질환이다.

PCR 방법론을 사용하는 종래의 근이양증 검사방법은 증폭된 반응산물들의 길이(base pairs)에 따른 차이로 결과를 해석하기 때문에 멀티플렉싱(multiplexing)의 집적도(integrity)에 제약이 따르기 마련이고, 반응의 집적도가 증가할수록 small size의 반응산물들의 증폭 효율이 증가하는 경향으로 인해 중복 변이 결과해석에 있어 분석오류의 가능성이 많다.

본 발명의 근이양증 유전변이 감별분석용 칩은 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이를 자동화된 고-처리량 정량분석으로 판별한다. 대조군 대비 검체의 형광신호강도를 log 값 relative ratio로 판별하는 정량유전자량(quantitative gene dosage) 분석을 구현함으로써 중복 변이의 정확한 정량해석이 가능한 특징이 있다. 이와 동시에, 동일한 반응산물의 일부를 이용한 직접 염기서열분석(direct sequencing)을 통해 점 돌연변이까지 일괄분석할 수 있다.

디스트로핀(Dystrophin), 근이양증(Muscular dystrophy), 뒤셴/베커형(Duchenne/Becker type), 결실(deletion), 중복(duplication), 점 돌연변이(point mutation), 정량유전자량분석(Quantitative gene dosage analysis), DNA칩(DNA chip)

Description

디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 검출용 DNA 칩, PNA 칩 및 이를 이용한 근이양증 진단키트{DNA chip and PNA chip for the dystrophin gene deletion, duplication, point mutation and DMD/BMD screening test therethrough}

본 발명은 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 일괄분석이 가능한 디스트로핀 유전변이 검출용 DNA 칩, PNA 칩 및 이를 이용한 근이양증 진단키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 디스트로핀 78개 각 exon별 대조군 대비 검체의 형광신호강도를 log 값 relative ratio로 판별하는 정량유전자량(quantitative gene dosage) 분석을 구현함으로써 유전자 결실, 중복 변이의 정확한 정량해석을 특징으로 하는 DNA 칩, PNA 칩 및 진단키트에 관한 것이다.

근이양증 또는 근이영양증(Muscular dystrophy)은 진행성의 근위약을 보이며 근육의 괴사 및 재생과정을 통해 근섬유의 크기가 고르지 않고 다양하며 근섬유가 괴사된 부위가 지방 및 섬유화 조직으로 대치되어 팔, 다리등의 근육이 굳어져 결국 전혀 움직일 수 없게 되는 X 염색체 연관된 근 질환이다. 말기가 되면 호흡부전, 심부전 등의 합병증으로 사망까지 이르게 된다. 1987년 디스트로핀(Dystrophin) 유전자 결실 및 이로 인한 단백질 결핍이 뒤셴형 근이양증(Duchenne's muscular dystrophy, DMD)과 베커형 근이양증(Becker's muscular dystrophy, BMD)을 유발함이 증명된 이후, 근이양증의 병태생리를 이해함에 있어 획기적인 전환을 가져오게 되었다(Hoffman EP et al. Cell (1987) 51:919-928).

디스트로핀 유전자는 Xp21.2 locus에 위치하는 2.4 Mbp(mega base pairs)의 게노믹 DNA 크기와 14,000 bp에 달하는 cDNA 크기를 갖는 인간 최대 유전자 중 하나이다. 디스트로핀 단백질은 N-말단, rod domain, 시스테인-rich 부위, C-말단, 4개 domain으로 구성되며 골격근, 평활근, 심근의 세포질막에 존재하고, 뇌에서는 뉴런(neuron)의 시냅스후 막(postsynaptic membrane)에 존재한다(Hoffman EP et al. Cell (1987) 51:919-928, Ervasti JM et al. Cell (1992) 66:1121-1131).

디스트로핀은 주로 세포골격(cytoskeleton)의 지지대 역할을 하는 근세포막단백질로 근육수축의 긴장을 견디게 하는 역할을 한다. 근이양증 환자에서는 근세포 내로 물질 유입이 일어나면 팽창된 세포는 압력을 견디지 못하고 터지게 된다(Arahata K et al. Nature (1988) 333:861-863). 디스트로핀은 당단백질들과 결합을 통해 디스트로핀-당단백질 복합체(dystrophin-glycoprotein complex)를 형성하는데, 이를 구성하는 단백질의 결핍이 여러 근이양증의 원인으로 보고되었다(Campbell KP et al. Nature (1989) 338:259-262, Ervasti JM et al. Cell (1991) 66:1121-1131).

면역조직화학염색법(immunohistochemical staining)을 통해 근이양증의 아형(subtype)들이 지속적으로 보고되고 있다. 조직검사 소견은 유사하지만, 그 유전적인 원인은 매우 다양해서, 유전의 양상, 침범부위, 진행속도등 임상 특징에 의하여 근이양증은 여러가지 형태로 분류된다. 국내에서도 뒤셴/베커(Duchenne/Becker)형 근이양증, 안인두근이양증, 안면견갑상완 근이양증, 지대(Limb-girdle)형 근이양증, 원위근이양증 등 매우 많은 종류의 근이양증이 보고되었다(Kim SY et al. J Korean Neurol Assoc (1993) 11:68-77).

뒤셴/베커형 이외에 여러가지 아형의 근이양증이 상염색체, 성염색체 열성 또는 우성의 다양한 유전양상을 나타내며 신경학적 검사, 근전도 검사 등의 임상소견만으로는 진단이 어렵다. 최근에는 뒤셴/베커형 근이양증에 대한 분자유전학적 진단을 가장 우선 시행하며, 음성의 결과인 경우, 근육 내 원인 단백질의 양을 in situ 측정하거나, 근생검을 통한 근조직 면역조직화학염색을 시행하여 진단한다.

뒤셴/베커형 근이양증은 유전성 신경 근 질환의 약 90%에 해당하는 X 염색체 연관성 질환으로 뒤셴형 근이양증은 남자아이 약 3,300 - 3,500명 당 1명의 비교적 높은 발생율을 나타낸다. 디스트로핀 유전자의 결손(deletion), 중복(duplication), 점 돌연변이(point mutation)에 의해 발병하는 DMD와 BMD는 동일한 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 질환이지만, 뒤셴형의 경우 많은 수에서 초기 운동발달이 느려 18개월까지 독립보행을 못하는 경우가 많고, 보통 4 - 5세경 자주 넘어지거나 까치발로 걷거나 또는 계단을 올라가기 힘든 증상이 나타난다. 대다수에서 비복근(종아리 근육)의 가성비대(pseudohypertrophy)를 보이며 하지 근위부에서 근위약이 시작되고 진행경과가 빨라 평균 10세경에 독립보행이 불가능해진 다. 베커형의 경우 그 임상 양상 및 발병 연령이 다양하여 6 - 19세 사이에 발병하고 병의 진행 경과는 뒤셴형에 비해 느리고 다양하다(Moser H Hum Genet (1984) 66:17-40, Emery AEH Nature (1977) 266:472-473, Leibowitz D et al. Dev Med Neurol (1981) 23:577-590). DMD는 돌연변이의 결과로 DNA 전사(transcription)과정의 reading frame이 변화되어 단백질이 전혀 생성되지 않는 경우가 대부분이고, BMD는 reading frame에는 변화를 주지않는 small 돌연변이로 인해 크기가 작거나 비정상적인 단백질이 만들어지는 경우가 많지만 모든 경우에서 일치하지는 않는다(Winnard AV et al. Hum Mol Genet (1993) 2:737-744). 결실과 삽입 변이는 유전자 전사(transcription)과정에서 아미노산으로 코딩되는 단위인 reading frame을 이동시키기에 전사과정이 조기에 종료되어 truncated 비활성 단백질이 생성되거나 비정상적인 단백질이 합성된다. 중복은 2개 염색체에 single copy씩 총 2개 copy가 존재하는 일반적인 경우와 달리 유전자가 multi-copy로 존재하는 카피 수 변화(copy number variation)로 인해 gene dosage가 변하는 변이를 나타낸다.

DMD/BMD의 대부분에서 사춘기를 전후하여 확장성 심근병증(dilated cardiomyopathy)과 울혈성 심부전(congestive heart failure)이 발생하며 DMD의 20%, BMD의 50%에서 각각 사망원인으로 작용한다(Finsterer J et al. Cardiology (2003) 99:1-19). DMD/BMD에서 혈청내 CK(creatinine kinase) 수치는 약 3세 전후로 최고치를 보이고 이후 점차 감소되는 것으로 알려져 있으며 DMD의 경우 정상 상한치의 약 100배, BMD의 경우 정상 상한치의 약 50배 이상 증가된다는 보고가 있다(Zatz M et al. Muscular dystrophy Methods and protocols 1st ed. (2001) 31-49).

디스트로핀 유전자 돌연변이의 약 65 - 85%는 Dystrophin 유전자를 구성하는 1개 이상의 엑손 결실(exon deletion)이 발생하는 경우이고 그 외 약 30%는 점 돌연변이, 6% 내외는 엑손의 duplication이 발생한다. 결실은 디스트로핀 유전자의 center 부위에서 주로 발생하며(~80%), 5' 말단에서 약 20% 빈도로 발생한다. 200 kb 걸쳐 존재하는 인트론 44, 엑손 45, 인트론 45 region이 주요한 결실 breakpoint이고 인종별로 결실의 분포 양상에 차이가 있다. (Forest S et al. Nature (1987) 329:638-640, Darras BT et al. Am J Hum Genet (1988) 43:620-629). 매우 큰 유전자 크기, 그 중에서도 평균 크기가 35 kb에 달할 정도로 큰 인트론 크기가 높은 결실 빈도의 원인 중 하나로 간주된다. 임상진단을 위한 디스트로핀 유전자 돌연변이 스크리닝 검사는 넓은 범위의 결실과 중복을 확인할 수 있는 서던 블랏팅(Southern blotting), 멀티플렉스 PCR(multiplex polymerase chain reaction), 정량형광-PCR(quantitative fluorescent-PCR), MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification) 방법과, 점 돌연변이 발생 여부를 확인하기 위한 dHPLC(denaturing high performance liquid chromatography), 전체 exon 약 14,000bp에 대한 direct sequencing방법 그리고 nonsense 돌연변이 검색을 위한 PTT(protein truncation test) 방법등이 적용되어 왔다. 그러나 이러한 방법론들 중 단일 방법만으로는 디스트로핀 유전자의 결실, 중복, 삽입, 점 돌연변이 등 모든 돌연변이 양상을 동시에 분석할 수 없었다.

종래의 근이양증 분석방법들 중에서, 2002년 개발된 MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)를 포함한 PCR 방법론은, 증폭된 반응산물들의 길이(base pairs)에 따른 차이로 결과를 해석하기 때문에 1회 반응에 최대 포함가능한 타겟 부위의 갯수가 고-처리량 분석방법인 칩 분석에 비해 제한적이라는 단점이 있다. 그리고 반응이 포함하는 타겟 부위의 갯수가 증가할수록, 즉 complexity가 증가할수록 small size의 반응산물들의 증폭 효율이 증가하는 경향으로 인해 유전자 결실 및 중복의 결과해석에서 오류 가능성이 있으며, 또한 반응 초기의 타겟 유전자 copy number가 정량화된 수치가 아니기에 반응 종료시점의 반응산물 intensity만으로 정량적인 해석은 무리가 따른다. 증폭산물의 존재 유무와 아가로스 젤 전기영동 이미지 intensity를 통한 육안 판독에 의존하는 기존 분석방법의 상기 단점들을 해결할 수 있는 고-처리량의 정량분석이 가능한 판독 시스템을 제공하고자 한다. 그리고 종래의 검사방법 중, 면역조직화학염색 검사법은 디스트로핀 단백질의 C-말단, N-말단, rod domain, 3가지 항체 모두를 사용하고, 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 동시에 수행해야만 근이양증의 아형을 특이적으로 확인할 수 있으나, 높은 검사비용과 delayed 분석 소요시간으로 인해 연구목적 이외에 진단목적으로는 여러가지 문제점이 있었다.

또한, 정상 대조군의 디스트로핀 유전자 각 exon별 증폭산물 형광 시그널 대비 임상검체의 증폭산물 형광 시그널을 비교함으로써, 그 log값 형광 ratio를 통해 디스트로핀 유전자 dosage 평가를 정량화하고 정확도가 향상된 중복 변이 분석방법을 제공하고자 한다. 특히, X 염색체 2개 중 하나에서 결실이 있어 정상적인 경우에 비해 유전자 dosage가 절반가량으로 감소된 여성 보인자(carrier) 감별에 효과적인 진단방법을 제공하고자 한다.

전기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이를 검출하는 고-처리량 정량분석을 위한 DNA 칩, PNA 칩 및 진단키트를 제공한다.

자세하게는 디스트로핀 유전자의 전체 78개 각 exon별 프로브 형광신호강도 분석에 있어, 정상 대조군 대비 임상검체의 형광신호강도를 log 값 relative ratio로 판별하는 정량유전자량(quantitative gene dosage) 분석을 구현함으로써 중복(duplication) 변이의 정확한 정량해석이 가능하고, 동일한 반응산물의 일부를 이용한 직접 염기서열분석(direct sequencing)을 통해 점 돌연변이까지 일괄분석하는 근이양증 돌연변이 유전소인 검출방법, 키트 그리고 칩을 제공한다.

그리고 더욱 자세하게 상기 분석방법에 있어서, 5'- 또는 3'-말단에 아미노 모디파이어(amino modifier) 또는 티올 모디파이어(thiol modifier)가 수식된 프로브가 스팟팅(spotting)된 칩(chip)을 제작하는 단계;

검체로부터 게노믹(genomic) DNA를 분리하는 단계;

디스트로핀 유전자의 전체 78개 엑손을 대상으로 결실, 중복 변이를 판별하는 프로브 타겟(target) 부위를 멀티플렉스-PCR 반응을 통해 증폭하면서, 형광색소(fluorescent dye)가 포함되도록 타겟 DNA 증폭산물을 준비하는 단계;

상기 멀티플렉스-PCR 반응산물의 일부를 자동염기서열분석법을 이용해서 점 돌연변이(point mutation) 유무를 분석하는 단계;

상기 멀티플렉스-PCR 반응산물과 칩 표면에 고정화된 프로브간 혼성화(hybridization) 반응을 수행하고 세척(washing)하는 단계;

형광색소에 특이적인 파장의 레이저(laser)로 칩을 스캐닝(scanning)하고 혼성화 반응 결과에 따른 형광강도를 측정함으로써 디스트로핀 mRNA를 코딩하는 엑손의 결실 및 중복 변이를 감별분석하는 단계; 그리고

상기 분석단계 전부를 포함하는 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 검출방법, 키트 및 칩을 제공한다.

그리고, 본 발명의 목적을 바람직하게 실현하기 위해, 서열목록번호 1 내지 156의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 프로브(probe)를 포함하는 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 검출용 칩을 제공한다.

또한, 본 발명의 분석방법을 바람직하게 실현하기 위해, 서열목록번호 1 내지 156의 염기서열을 갖는 프로브로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브 타겟 부위를 증폭할 수 있는 키트를 제공한다.

본 발명의 근이양증 유전변이 감별분석용 칩을 통하여 질환의 원인이 되는 유전자 결실 및 중복을 자동화된 고-처리량 정량분석으로 판별할 수 있다. 상세하게는, 대조군 대비 검체의 형광신호강도를 log 값 relative ratio로 판별하는 정량 유전자량(quantitative gene dosage) 분석을 구현함으로써 유전자 중복(duplication) 변이의 정확한 정량해석이 가능하다. 이와 동시에, 동일한 반응산물의 일부를 이용한 직접 염기서열분석(direct sequencing)을 통해 점 돌연변이까지 일괄분석함으로써 유전변이 감별분석결과 신뢰도가 더욱 견고해진다.

본 발명의 바람직한 구현을 통해 근 생검(muscle biopsy)에 비해 비-침습적(non-invasive)이며, 방사성 동위원소를 사용하는 서던 블랏팅(Southern blotting)에 비해 검사소요시간이 단축되고, 면역조직화학염색법에 비해 분석원가가 저렴한 근이양증 스크리닝 검사가 가능하다.

또한, 자동화된 칩 플랫폼의 특성과 칩 스캐닝 및 형광신호강도 분석 소프트웨어의 동일한 세팅이 부합되어, 실험자 또는 기관별 동일한 분석결과가 가능하다.

이하 도면 및 표를 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재된 도, 표 및 실시예에 도시된 구성은 본 발명을 가장 바람직하게 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않으며, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

또한 본 발명이 청구하는 범위내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형의 실시가 가능하며 이러한 변형은 본 발명의 범위에 속한다.

< 실시예 1> 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 분석을 위한 멀티플 렉스 PCR 반응에 포함되는 프라이머 ( primer ) 디자인 및 합성

뒤셴/베커형 근이양증 유전질환 스크리닝 검사로서의 적절성과 유효성을 평가하기 위해, 디스트로핀 유전자 결실(deletion), 중복(duplication), 점 돌연변이(point mutation) 검출을 위한 고-처리량 칩(chip) 반응을 수행하고자 하였으며, 이에 선행하여 실시하는 멀티플렉스 PCR(multiplex polymerase chain reaction) 반응에 포함되는 프라이머(primer)는 하기와 같이 고안하였다. 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 염기서열 데이터베이스인 GenBank, 일본의 DDBJ(The DNA Data Bank of Japan), 그리고 유럽연합의 EMBL(the European Molecular Biology Laboratory) 염기서열 데이터베이스로부터 검색한 근이양증(muscular dystrophy) 관련 디스트로핀 유전자 mRNA 서열의 약 20종 아형(subtype) 염기서열들을 분석하여 제작하였다. 뒤셴/베커형 디스트로핀 유전자(Dp427m variant, NCBI accession no. NM_004006.1, GI no.:5032282, Gene ID :1756)의 총 78개 엑손(exon)을 증폭 대상부위 크기별로 12개 subset으로 세분한뒤 멀티플렉스-PCR을 통해 증폭하였다. 가급적 엑손 서열내에서 PCR 프라이머(primer)를 고안하고자 하였으며, 여의치 않을 경우 해당 엑손의 5', 3' 양 말단에 위치하는 인트론 서열로부터 프라이머를 고안하였다. 멀티플렉스-PCR을 위한 프라이머 타겟 부위를 대상으로 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스 (DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA) 프로그램을 응용하여 디스트로핀 해당 엑손-특이적 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 선발의 기본 요건은 다음과 같다 ; 프라이머 길이(19 - 24 base pair), 융해온도[Tm(℃), 58 - 62℃], 3' 말단의 GC 함량이 높지 않아야하며, 프라이머 서열내 염기 4개 이상 연속해서 상보적이지 않도록 해서 hairpin 이차구조 형성을 방지하였으며, 3'말단에 동일한 염기가 3개 이상 연속해서 위치하지 않도록 해서 프라이머 이합체(dimer)의 형성을 방지하였다. 그리고 타겟 부위내에 단일염기 다형성(single nucletide polymorphism, SNP)이 포함되지 않도록 하여 높은 특이도를 확보하였다. 또한 해당 프라이머 염기서열이 본 발명이 목적하는 칩을 구성하는 디스트로핀 타 엑손 및 기타 인간 게놈 염기서열과 cross-reactive한 특성을 나타내지 않음을 미국 NCBI 염기서열 데이터베이스 등 다양한 염기서열 검색 툴(tool)을 활용하여 검증하였다. 본 발명에 사용하는 프라이머(primer)는 미국 IDT(Integrated DNA Technologies, Inc., San Jose, CA, USA)를 통해 합성하였다.

본 발명의 바람직한 구현을 통해, 디스트로핀 유전자의 결실, 중복, 점 돌연변이 감별분석을 위한 프라이머는 DNA 염기서열의 5'말단 또는 3'말단에 형광색소가 표지된 프라이머를 사용하거나, 또는 형광색소가 표지되지 않은 일반적인 프라이머를 사용하고 멀티플렉스 PCR 반응 중에 형광색소가 표지된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트가 증폭산물에 삽입되게끔 유도하여 증폭산물을 표지하는 두가지 방법을 모두 확인하였다. 본 발명에 사용하는 형광색소는 6-FAM(6-carboxyfluorescein), Cy5, Cy3, Cy5.5, JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein), Rhodamine Green, TAMRA NHS(N-hydroxysuccinimide) Ester, Texas Red 이다. 프라이머의 농도는 ND-1000 분 광광도계(NanoDrop Technologies, Rockland, Maine, USA)를 통해 확인하고 최종 50 - 200 pmole/uL 범위의 농도가 되도록 3차 탈이온 멸균 증류수로 재현탁(resuspension)하고 aliquots으로 -70℃ 냉동보관하였다.

< 실시예 2> 임상검체 채취 및 이로부터 DNA 분리

근이양증 유전질환의 돌연변이 원인 감별진단을 위한 검체 종류는 전혈(whole blood), 혈청(serum), 양수(amniotic fluid), 융모막(chorionic villus sampling) 검체, 조직(tissue) 등이며, 임상검체로부터 인간 게노믹 DNA(genomic DNA)를 분리함에 있어 상용화된 DNA 추출 키트(LaboPass™ Tissue kit, 코스모진텍, 서울, 한국)를 사용하였다. 혈액은 EDTA튜브를 이용하여 채혈하고 냉장보관, 운송하였으며, 양수, 융모막 검체는 산모 혈액도 채혈하여 산모 세포/DNA 오염여부를 확인하였다. 양수는 약 10mL을 채취하였으며, 채취 당일에 가급적 게노믹 DNA를 분리하였다.

시료를 포함하는 에펜도르프 튜브를 덴빌 260D 고속 원심분리기(high-speed centrifuge, Denville Scientific Inc., Metuchen, NJ, USA)를 이용해서 12,000 rpm(revolutions per minute, 분당회전수), 1분 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물을 500 uL의 PBS 용액에 풀어준 뒤 다시 동일 조건에서 원심분리하여 세척과정을 거쳤다. 검체의 볼륨(volume)이 적을 경우에는 1X PBS 용액 500 uL를 첨가하여 전기 동일한 조건으로 고속원심분리하였다. 1X PBS 용액은 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄, 0.24 g KH₂PO₄를 3차 멸균 증류수 1L에 최종 pH 7.4가 되도록 조성하였다. 상기 침전물에 시료를 분해하는 TL 완충용액(buffer) 200 uL를 첨가하여 풀어주고 단백분해효소 K(Proteinase K, 100 mg/mL) 20 uL를 첨가하고 약하게 교반(vortex)한 후 56℃, 10분간 반응시켰다. 이후 반응물에 TB 완충용액 400 uL를 첨가하고 교반하여 반응물을 혼합하였다. 이어서 반응물을 스핀 칼럼(spin column)의 상층부에 로딩(loading)하고 8,000 rpm, 1분 원심분리하였다. 컬렉션 튜브(collection tube)를 새로 교체하고 검체로 부터 추출된 DNA를 칼럼의 멤브레인(membrane)에 결합시키는 작용을 하는 BW 완충용액 700 uL를 첨가하고 상기 동일 조건으로 원심분리하였다. 컬렉션 튜브(collection tube)를 새로 교체하고 멤브레인으로부터 불순물을 제거하는 NW 완충용액 500 uL를 첨가하고 13,000 rpm, 2분 원심분리하였다. 이후 스핀 칼럼 상층부를 새로운 에펜도르프 튜브로 옮긴뒤 DNA를 용출시키기 위해 탈이온(de-ionized) 멸균 3차 증류수 100 uL를 로딩하고 실온에서 5분 처리하고 8,000 rpm, 2분 원심분리하여 순수한 DNA를 분리하였다.

<실시예 3> 멀티플렉스 PCR을 통한 디스트로핀 유전자 변이 검출용 칩(chip)의 타겟 유전자 증폭

고-처리량 칩(chip) 분석에 앞서, 검체로부터 분리한 게노믹 DNA를 주형으로 디스트로핀 78개 엑손을 멀티플렉스-PCR 반응을 통해 증폭하였다. 멀티플렉스 PCR subset당 7 - 8개 타겟 엑손, 대조군 유전자를 포함하도록 12개 subset 멀티플렉스 조합을 고안하였다. 이후, 증폭된 반응산물들을 칩(chip) 위에 미리 고정화시켜둔 각 엑손의 전체 coding 서열을 분석할 수 있도록 고르게 spanning되어있는 프로브들과 혼성화(hybridization) 반응을 실시함으로써 근이양증 유전질환 분석에 대한 유전 소인 데이터를 제공하게 된다.

1회 반응에 12개 멀티플렉스-PCR을 동시에 실시하여 디스트로핀 전체 exon의 결실, 중복, 점 돌연변이 유무를 분석하는데 필요한 PCR 앰플리콘(amplicon)들을 확보하였다. 96well PCR 플레이트를 사용할 경우 8개의 임상검체를 대상으로 12 subset 멀티플렉스-PCR을 1회 반응만으로 효율적으로 수행할 수 있었다. 상기 멀티플렉스-PCR은 내부 대조군(endogenous control)으로 디스트로핀과 마찬가지로 X 염색체에 위치하는 house keeping gene인 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyltransferase) 유전자(NCBI accession no. NM_000194.2, GI no.:164518913, Gene ID :3251)를 사용하였다. 본 실시예에 기술하는 12개 subset 멀티플렉스-PCR의 PCR 마스터믹스(PCR mastermix)의 구성 조성 및 PCR 반응조건은 하기 표 1과 같다.

디스트로핀 유전자 변이 스크리닝용 멀티플렉스 PCR 마스터믹스 조성 및 PCR 조건

PCR 반응액 조성	부피(uL)	PCR 반응 조건
탈이온 3차 멸균 증류수	3.5 ~ 4.2	초기변성 (Initial denaturation)	95℃, 15분	1회
7 - 8종 프라이머 프리믹스(primer premix)	5.8 ~ 6.5	변성 (Denaturation)	95℃, 30초	25회
2X 멀티플렉스 PCR 프리믹스	15	결합 (Annealing)	56℃ ~ 59℃, 40초
주형 DNA(100 ng 이상)	5	연장 (Extension)	72℃, 60초
최종 부피	30	최종연장 (Extension)	72℃, 7분	1회

멀티플렉스 PCR 반응액 혼합물에 포함되는 PCR 완충용액의 최종농도는 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 8.2이며, 2.5 unit의 Taq 중합효소, 300 uM dNTPs(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 0.01% Tween-20, 10 mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 포함한다.

멀티플렉스-PCR 프라이머 프리믹스에 포함되는 개별 엑손 유전자들의 정방향(sense) 프라이머는 5'- 또는 3'-말단에 Cy3 또는 Cy5 형광색소를 표지시켜 합성하거나, 또는 양 말단의 변형(modification)없이 nascent 올리고뉴클레오티드로 합성하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA).

본 발명의 또한 바람직한 일 양태에 따라, 양 말단에 형광색소 변형이 없는 프라이머를 포함하는 멀티플렉스 PCR 키트는 PCR 과정중에 Cy3 또는 Cy5 형광색소가 표지된 디옥시사이토신 트리포스페이트(Cy3- 또는 Cy5-dCTP )가 증폭산물을 구성하는 뉴클레오티드로 첨가되도록 하여 반응의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있었다. Cy3-dCTP를 멀티플렉스 PCR 반응에 사용할 경우, PCR 마스터믹스는 최종농도 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 8.2, Taq 중합효소 2.5 unit(h-Taq DNA polymerase, Cat.No. SG1202, 솔젠트(주), 대전, 한국), 300 uM dATP, 300 uM dGTP, 300 uM dTTP, 25 uM dCTP, 275 uM Cy3-dCTP(FluoroLink Cy3-dCTP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Piscataway, NJ, USA), 0.01% Tween-20, 그리고 10 mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 포함하였다.

정상인과 근이양증 환우 검체 DNA 비교분석 결과, 디스트로핀 유전자의 중복(duplication) 변이가 정확하게 구분되는 최대 PCR cycle수는 25 cycle이었다. 증폭 사이클수가 25 이상으로 증가될 경우, 정확한 유전자 dosage분석을 위해 허용되는 편차(deviation) 이상으로 측정치가 변화하였다. 이에, 본 발명의 바람직한 일 양태는 중복 변이의 정확도를 확보하기 위해 멀티플렉스-PCR을 25 cycle까지만 수행한 후, 디스트로핀 유전자의 결실, 중복, 점 돌연변이, 삽입 등의 변이를 감별분석하였다.

< 실시예 4> 디스트로핀 유전자의 점 돌연변이 분석을 위한 멀티플렉스 PCR 증폭산물의 시퀀싱 분석

디스트로핀 78개 엑손을 증폭하기위한 12개 subset 멀티플렉스-PCR 증폭산물을 2% 아가로스 젤 전기영동을 통해 산물의 크기(bp)와 엑손 증폭여부를 확인하였다. 증폭이 확인된 엑손 앰플리콘들은 멀티플렉스-PCR 증폭산물 내의 기타 산물들로부터 순수분리하기위해 아가로스 젤로부터 elution하였다(Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit, Cat. No. D4001, Zymo Research Co. Ltd., Orange, CA, USA). 목적하는 PCR 산물을 포함하는 젤 slice를 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 첨가하고 이의 3배 volume의 ADB buffer를 첨가한 후 55℃, 5분 가열하여 젤을 용해하였다. 반응액을 Zymo-Spin 칼럼으로 옮기고 10,000 rpm, 30초 원심분리하였다. 용출액은 폐기하고 Wash buffer 200 uL를 로딩하고 10,000 rpm, 30초 원심분리하고 이를 1회 반복하였다. 15 uL의 3차 멸균증류수를 첨가하고 12,000 rpm, 60초 원심분리하여 순수한 증폭산물을 분리하였다.

순수분리한 증폭산물은 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Part No. 4337455, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 사용하여 시퀀싱 반응을 수행한 후, ABI Prism 377 자동염기서열분석기(Sequencer)로 염기서열을 확인하였다. 상세하게는, thin wall PCR 튜브에 전기 순수분리 증폭산물 1 - 3 uL(1 - 5 ng), 시퀀싱 프라이머 1 uL(3.2 pmol/uL), Terminator ready reaction mix 4 uL, BigDye 시퀀싱 버퍼 2 uL를 첨가하고 최종 20 uL 되도록 3차 멸균증류수를 가하고 혼합하였다. 혼합된 반응액은 PCR 기기(GeneAmp PCR 2700, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 96℃, 1분 초기변성을 거치고, 96℃/10초(변성), 50℃/5초(annealing), 60℃/4분(연장) 사이클을 25회 진행시켜 사이클 시퀀싱(cycle sequencing) 반응을 수행하였다. 시퀀싱 반응산물에 125 mM EDTA 2 uL, 3 M 소디움 아세테이트(sodium acetate) 2 uL를 첨가하고 가볍게 혼합한 후, 100% 에탄올 50 uL를 첨가하고 가볍게 vortex하였다. 실온에서 15분 incubation한 후, 12,000rpm, 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 75% 에탄올 70 uL를 첨가하고 상기 동일조건으로 원심분리하여 시퀀싱 반응산물을 세척하였다. 에탄올 침전을 통해 반응산물 내에 잔존하는 프라이머, 형광 표지된 디데옥시뉴클레오타이드(ddNTPs)를 제거하였다. 에탄올 침전된 시퀀싱 반응산물 DNA 펠렛(pellet)에 Hi-Di 포름아마이드 : EDTA/블루 덱스트란(5 : 1 ratio) 로딩버퍼 6 uL를 가해서 용해한 후, 100℃, 2분 변성시킨 후 ice위에 보관하였다. 이후, pre-casting된 6% Long ranger gel(Takara, Cat. No. F50660, 타카라코리아, 서울, 한국)의 샘플 웰에 로딩하고 시퀀싱 size에 따라 2 - 4시간동안 전기영동을 수행하였다. 시퀀싱을 통해 확보된 염기서열 데이타를 토대로, 정상 대조군과 임상검체의 각 엑손 염기서열들을 align해서 비교함으로써 점 돌연변이를 분석하였다.

< 실시예 5> 디스트로핀 유전자 변이 감별분석용 칩( chip )을 구성하는 프로브( probe ) 디자인 및 합성

본 발명의 바람직한 실현을 위한 근이양증 유전질환의 돌연변이 원인 감별분석용 칩(chip)을 제공하기 위하여, 디스트로핀 유전자의 78개 엑손들의 결실, 중복 돌연변이를 고-특이도로 판별할 수 있는 프로브(probe)들을 디자인하였다.

상세하게는, 본 발명의 바람직한 양태에 따른 디스트로핀 유전자의 돌연변이 감별분석용 DNA 또는 PNA 칩(chip)은 해당하는 디스트로핀 엑손의 전체 코딩서열 중에서 결실과 중복 변이에 대한 높은 변별력을 나타내는 프로브 부위를 선별하기 위해, 평균 25bp 길이 단위로 일부 엑손 서열이 상호 중첩되도록 고안한 프로브 후보군들 중에서 정상군과 근이양증 환자군 간에 높은 변별력을 나타낸 프로브들을 포함하고 있다. 프로브 선별과정은 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스 (DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA), 또는 올리고어레이(OligoArray 2.0, http://cbr-rbc.nrc-cnrc.gc.ca) 프로그램을 응용하여 수행하였고 그 세부정보는 표 2와 같다. 목적하는 DNA 또는 PNA 프로브 염기서열의 5'말단 또는 3'말단에 아민(amine) 또는 티올(thiol) 그룹이 위치하도록 변형(modification)된 프로브를 합성하였다(MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany). 프로브의 5'말단에 아미노 모디파이어를 수식할 경우 탄소 6 - 9개 또는 티민(thymine) 염기 12 - 15개의 스페이서(spacer)를 첨가하여 반응 효율을 촉진하였다. 프로브의 3'말단에 아미노 모디파이어를 수식할 경우에는 스페이서를 사용하지 않았다. 프로브의 아민기는 1차 아민기의 성질을 지니며, 알데히드-활성화된 또는 카르복실(carboxyl)-활성화된 칩(chip) 표면에 부착하였다. 프로브의 농도는 260nm에서 흡광도 수치를 통해 환산하였고 몰디-토프(MALDI-TOF, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight)를 통해 불순물 함유 여부를 확인하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, High-performance liquid chromatography)를 통해 순수 정제한 후 멸균 3차 증류수에 최종농도가 100-250 pM 되도록 제조하였다.

디스트로핀 유전자 변이 감별분석용 칩( chip )을 구성하는 프로브 ( probe ) 조합

서열 목록 번호	프로브 타겟 엑손, 엑손 size(디스트로핀 Dp470m mRNA 서열 내 엑손위치)	프로브 방향, 프로브 염기서열(5'-3')	길이 (mer)
1	exon 1, 31bp(245-275bp)	정방향, AAATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAGA	25
2		정방향, TGCTTTGGTGGGAAGAAGTAGAGGA	25
3	exon 2, 62bp(276-337bp)	역방향, TATTTTGCATTTTAGATGAAAGAGAAGATG	30
4		역방향, CAATTTTCTAAGGTAAGAATGGTTTGTTAC	30
5	exon 3, 93bp(338-430bp)	정방향, ACCTCTTCAGTGACCTACAGGATGGGA	27
6		정방향, TATTGAGAACCTCTTCAGTGACCTACAG	28
7	exon 4, 78bp(431-508bp)	역방향, CCTTGTTGACATTGTTCAGGGCAT	24
8		역방향, CTTGTTGACATTGTTCAGGGCAT	23
9	exon 5, 93bp(509-601bp)	정방향, AACTGACTCTTGGTTTGATTTGGAA	25
10		역방향, AGAGTCAGTTTATGATTTCCATCTACG	27
11	exon 6, 173bp(602-774bp)	정방향, TGGCTTTGAATGCTCTCATCCATAGTC	27
12		정방향, GCAACAAACCAACAGTGAAAAGATT	25
13	exon 7, 119bp(775-893bp)	정방향, AGTGTGGTTTGCCAGCAGTCAGCC	24
14		정방향, TGGTTTGCCAGCAGTCAGCCACAC	24
15	exon 8, 182bp(894-1075bp)	정방향, ACATCACTCTTCCAAGTTTTGCCTC	25
16		정방향, GCCACCTAAAGTGACTAAAGAAGAACA	27
17	exon 9, 129bp(1076-1204bp)	정방향, CTCTGACCCTACACGGAGCCCATT	24
18		정방향, CACACAGGCTGCTTATGTCACCACC	25
19	exon 10, 189bp(1205-1393bp)	정방향, AAGACAAGTCATTTGGCAGTTCATT	25
20		정방향, CAAGGAGAGATTTCTAATGATGTGGA	26
21	exon 11, 182bp(1394-1575bp)	정방향, TCAAGATGGGAATGCCTCAGGGTAG	25
22		정방향, GATTGGAACAGGAAAATTATCAGAAGA	27
23	exon 12, 151bp(1576-1726bp)	정방향, ACTGAAAGAGTTGAATGACTGGCTAA	26
24		정방향, AGAACAAGGAAAATGGAGGAAGAGCC	26
25	exon 13, 120bp(1727-1846bp)	역방향, CTTCCAAAGCAGCAGTTGCGTGAT	24
26		정방향, GGTGGTAGTTGATGAATCTAGTGGAGA	27
27	exon 14, 102bp(1847-1948bp)	역방향, GAACCCAGCGGTCTTCTGTCCATCTA	26
28		정방향, CAAGACATCCTTCTCAAATGGCAACG	26
29	exon 15, 108bp(1949-2056bp)	정방향, GAACAAGATTCACACAACTGGCTTTAA	27
30		정방향, AAGATCAAAATGAAATGTTATCAAGTCTTC	30
31	exon 16, 180bp(2057-2236bp)	정방향, TCAGTGACCCAGAAGACGGAAGCAT	25
32		정방향, TGGGCAAACTGTATTCACTCAAACA	25
33	exon 17, 176bp(2237-2412bp)	정방향, GTAACTACGGTGACCACAAGGGAACAGA	28
34		정방향, TCCCCAAAAGAAGAGGCAGATTACT	25
35	exon 18, 124bp(2413-2536bp)	정방향, GCAATCTTTCGGAAGGAAGGCAACT	25
36		역방향, AAGTTGCCTTCCTTCCGAAAGATTG	25
37	exon 19, 88bp(2537-2624bp)	정방향, GCCCTGGTGGAACAGATGGTGAATG	25
38		정방향, GCCCTGGTGGAACAGATGGTGAA	23
39	exon 20, 242bp(2625-2866bp)	정방향, GCAGATAGCATCAAACAAGCCTCAGA	26
40		정방향, TACTGCTGAAAACTGGTTGAAAATCC	26
41	exon 21, 181bp(2867-3047bp)	정방향, CTATGGCACAGGATGAAGTCAACCG	25
42		정방향, ATACTCTATGGCACAGGATGAAGTCAAC	28
43	exon 22, 146bp(3048-3193bp)	정방향, TGGGTCCAGCAGTCAGAAACCAAAC	25
44		정방향, GCAGTCAGAAACCAAACTCTCCATACC	27
45	exon 23, 213bp(3194-3406bp)	역방향, GCTTCTTCCAGCGTCCCTCAAT	22
46		정방향, TCAGCACCACTGTGAAAGAGATGTCG	26
47	exon 24, 114bp(3407-3520bp)	정방향, AAACCCTGAAGAAATGGATGGCTGA	25
48		정방향, GAAATGGATGGCTGAAGTTGATGTT	25
49	exon 25, 156bp(3521-3676bp)	정방향, AAACAGTGTCAATGAAGGTGGGCAGA	26
50		정방향, TGGGCAGAAGATAAAGAATGAAGCAGA	27
51	exon 26, 171bp(3677-3847bp)	정방향, GAGAAAACTGTAAGCCTCCAGAAAGAT	27
52		정방향, TTACAGAAAGCAGTTGAAGAGATGAAG	27
53	exon 27, 183bp(3848-4030bp)	정방향, GCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGTGAA	26
54		역방향, AGTTTCACTTTCGCTTCTTTTTGTTGG	27
55	exon 28, 135bp(4031-4165bp)	정방향, GGAGAAAGCAAACAAGTGGCTAAATGA	27
56		정방향, AGAAAGCAAACAAGTGGCTAAATGAAGT	28
57	exon 29, 150bp(4166-4315bp)	정방향, TATTGGCACAGACCCTAACAGATGGC	26
58		정방향, TGATGCGACATTCAGAGGATAACCCAA	27
59	exon 30, 162bp(4316-4477bp)	역방향, GCTGCCAACTGCTTGTCAATGAATGT	26
60		역방향, CTGGGCTTCCTGAGGCATTTGAG	23
61	exon 31, 111bp(4478-4588bp)	정방향, AGGGGAAGGAGGCTGCCCAAAGAG	24
62		정방향, AGAGTCCTGTCTCAGATTGATGTTGC	26
63	exon 32, 174bp(4589-4762bp)	정방향, TTTGAGCAGCGTCTACAAGAAAGTAAG	27
64		정방향, GCATTGGAAACAAAGAGTGTGGAAC	25
65	exon 33, 156bp(4763-4918bp)	정방향, GAAAAAGCAGACGGAAAATCCCAAAG	26
66		정방향, CAAAGAACTTGATGAAAGAGTAACAGC	27
67	exon 34, 171bp(4919-5089bp)	정방향, CGTAAGATGCGAAAGGAAATGAATGT	26
68		정방향, ATTTGGATTCTGAAGTTGCCTGGGGA	26
69	exon 35, 180bp(5090-5269bp)	정방향, AACAGTTTTGGGCAAGAAGGAGACG	25
70		정방향, CTGAAGAGTATCACAGAGGTAGGAGAGG	28
71	exon 36, 129bp(5270-5398bp)	역방향, TGATTCATCCAAAAGTGTGTCAGCCT	26
72		정방향, CAGGCTGACACACTTTTGGATGAAT	25
73	exon 37, 171bp(5399-5569bp)	정방향, GCAGAACTGAATGACATACGCCCAA	25
74		정방향, AAGCAGCAAACTTGATGGCAAACCG	25
75	exon 38, 123bp(5570-5692bp)	정방향, TGCTTGAACCACTGGAGGCTGAAAT	25
76		역방향, GTCTTCCTCTTTCAGATTCACCCCCT	26
77	exon 39, 138bp(5693-5830bp	정방향, ATCACAGATGAGAGAAAGCGAGAGGAA	27
78		정방향, CAGACAAAACATAATGCTCTCAAGGTA	27
79	exon 40, 153bp(5831-5983bp)	정방향, AGCCAGCCTACCTGAGCCCAGAGAT	25
80		정방향, GAGGTCTCAAAGAAGAAAAAAGGCT	25
81	exon 41, 183bp(5894-6166bp)	정방향, GCTGAGGGCTTGTCTGAGGATGGG	24
82		정방향, TGAGGGCTTGTCTGAGGATGGGGC	24
83	exon 42, 195bp(6167-6361bp)	정방향, ACAAGCCCTATTAGAAGTGGAACAAC	26
84		정방향, TGACCTCTGTGCTAAGGACTTTGAA	25
85	exon 43, 173bp(6362-6534bp)	정방향, CAACGCCTGTGGAAAGGGTGAAGC	24
86		정방향, CTTCACCCTTTCCACAGGCGTTGC	24
87	exon 44, 148bp(6535-6682bp)	정방향, ATCTGTTGAGAAATGGCGGCGTT	23
88		역방향, AACGCCGCCATTTCTCAACAGAT	23
89	exon 45, 176bp(6683-6858bp)	정방향, GAACTCCAGGATGGCATTGGGCAG	24
90		정방향, ATTGGGAAGCCTGAATCTGCGGTG	24
91	exon 46, 148bp(6859-7006bp)	정방향, AAAAGAGCAGCAACTAAAAGAAAAGC	26
92		정방향, ATTTGTTTTATGGTTGGAGGAAGCAG	26
93	exon 47, 150bp(7007-7156bp)	정방향, TAAATGAAACTGGAGGACCCGTGCT	25
94		정방향, CCCATAAGCCCAGAAGAGCAAGATA	25
95	exon 48, 186bp(7157-7342bp)	정방향, TCATCTGCTGCTGTGGTTATCTCCTA	26
96		정방향, ATAACCAACCAAACCAAGAAGGACCA	26
97	exon 49, 102bp(7343-7444bp)	정방향, TGGAAGAGATTTTGTCTAAAGGGCAGC	27
98		정방향, TACAAGGAAAAACCAGCCACTCAGCC	26
99	exon 50, 109bp(7445-7553bp)	정방향, TCCTGGACTGACCACTATTGGAGCCT	26
100		역방향, AGGCTCCAATAGTGGTCAGTCCAGGA	26
101	exon 51, 233bp(7554-7786bp)	역방향, TCAAGCAGAGAAAGCCAGTCGGTAA	25
102		정방향, TTGGACAGAACTTACCGACTGGCTT	25
103	exon 52, 118bp(7787-7904bp)	정방향, ACAGAGGCGTCCCCAGTTGGAAGAA	25
104		정방향, TGAAAAACAAGACCAGCAATCAAGAGG	27
105	exon 53, 212bp(7905-8116bp)	정방향, TAAAGGATTCAACACAATGGCTGGA	25
106		정방향, GCAATCCAAAAGAAAATCACAGAAACCA	28
107	exon 54, 155bp(8117-8271bp)	정방향, TGGCAGACAAATGTAGATGTGGCAA	25
108		정방향, GCAGATGATACCAGAAAAGTCCACA	25
109	exon 55, 190bp(8272-8461bp)	정방향, CTACAGGATGCTACCCGTAAGGAAAGG	27
110		정방향, CAAAGCAGCCTCTCGCTCACTCACC	25
111	exon 56, 173bp(8462-8634bp)	정방향, TCGGAAAAAGTCTCTCAACATTAGGTAG	28
112		역방향, CCTACCTAATGTTGAGAGACTTTTTCCG	28
113	exon 57, 157bp(8635-8791bp)	정방향, AAGCCAGTTCTGACCAGTGGAAGCGT	26
114		정방향, CAGGCACCTATTGGAGGCGACTTTC	25
115	exon 58, 121(8792-8912bp)	정방향, GAGAAACTCTACCAGGAGCCCAG	23
116		정방향, ATTTCTGACAGAGCAGCCTTTGGAAG	26
117	exon 59, 269bp(8913-9181bp)	정방향, CTCCGCTGACTGGCAGAGAAAAATAGATG	29
118		정방향, TGAGGAGGTCAATACTGAGTGGGAA	25
119	exon 60, 147bp(9182-9328bp)	정방향, CGTATAACCTCAGCACTCTGGAAGACC	27
120		정방향, CTCTCACCGTATAACCTCAGCACTCT	26
121	exon 61, 79bp(9408-9468bp)	정방향, ACTTTGGTCCAGCATCTCAGCACTTTC	27
122		정방향, CTTTCTTTCCAGTAAGTCATTTTCAGC	27
123	exon 62, 61bp(9408-9468bp)	정방향, CTTCTTTTCAGCGTCTGTCCAGGGTC	26
124		정방향, AGAGCCATCTCGCCAAACAAAGTGC	25
125	exon 63, 62bp(9469-9530bp)	정방향, ACGAGACTCAAACAACTTGCTGGGACC	27
126		정방향, TATGTTTTGTGTTTTAGCCACGAGACT	27
127	exon 64, 75bp(9531-9605bp)	정방향, TAATGTCAGATTCTCAGCTTATAGGACTG	29
128		역방향, GCAGTCTTCGGAGTTTCATGGCAGT	25
129	exon 65, 202bp(9606-9807bp)	정방향, GTTTGACCACTATTTATGACCGCCTG	26
130		정방향, TATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGT	27
131	exon 66, 85bp(9808-9893bp)	정방향, TAAAACTGGCATCATTTCCCTGTGTAA	27
132		역방향, TTACACAGGGAAATGATGCCAGTTTTA	27
133	exon 67, 157bp(9894-10051bp)	정방향, CCTTTTCAAGCAAGTGGCAAGTTCAA	26
134		정방향, GCATCCTTTGGGGGCAGTAACATTG	25
135	exon 68, 167bp(10052-10218bp)	정방향, AAACTGCCAAGCATCAGGCCAAATGT	26
136		역방향, ACATTTGGCCTGATGCTTGGCAGTTT	26
137	exon 69, 111bp(10219-10330bp)	정방향, TTTAATTATGACATCTGCCAAAGCTGCT	28
138		역방향, AGCAGCTTTGGCAGATGTCATAATTAAA	28
139	exon 70, 136bp(10331-10467bp)	정방향, AAGGTATTTTGCGAAGCATCCCCGA	25
140		정방향, GAAGCATCCCCGAATGGGCTACCT	24
141	exon 71, 39bp(10468-10506bp)	정방향, GCCAGTAGATTCTGCGTGAGTACTTT	26
142		정방향, AAAGTACTCACGCAGAATCTACTGGC	26
143	exon 72, 66bp(10507-10572bp)	정방향, CACGATGATACTCATTCACGCATTGA	26
144		정방향, GCCTGCCTCGTCCCCTCAGC	20
145	exon 73, 66bp(10573-10638bp)	정방향, TAGCAGAAATGGAAAACAGCAATGG	25
146		정방향, GCAGAAATGGAAAACAGCAATGGAT	25
147	exon 74, 159bp(10639-10797bp)	역방향, TACGAGGCTGGCTCAGGGGGGA	22
148		정방향, ACTCCCCCCTGAGCCAGCCTCGTAG	25
149	exon 75, 244bp(10798-11041bp)	정방향, CCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCT	25
150		정방향, GCTGGAGTCACAGTTACACAGGCTA	25
151	exon 76, 124bp(11042-11165bp)	정방향, GAGTGGTTGGCAGTCAAACTTCGGA	25
152		정방향, AAGTGAATGGCACAACGGTGTCCTCT	26
153	exon 77, 93bp(11166-11258bp)	정방향, CCCCAGGACACAAGCACAGGGTTAG	25
154		정방향, GAGCAACTCAACAACTCCTTCCCTA	25
155	exon 78, 32bp(11259-11290bp)	정방향, AGGAAGAAATACCCCTGGAAAGCGAA	24
156		정방향, TTCGCTTTCCAGGGGTATTTCTTCCT	24

< 실시예 5> 디스트로핀 유전자 변이 감별분석용 칩( chip ) 제작

본 발명의 바람직한 양태로 제공하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이 감별분석용 DNA 또는 PNA 칩(chip)은 해당하는 디스트로핀 유전자의 78개 엑손들의 결실, 중복 돌연변이를 고-특이도로 판별할 수 있는 empirically 선별된 156종의 프로브(probe)가 집적되어 있다. 내부 대조군(endogenous control)으로 디스트로핀과 마찬가지로 X 염색체에 위치하는 house keeping gene인 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyltransferase) 유전자 프로브가 고정화되어있다. 하나의 칩 기판위에 총 디스트로핀 78개 엑손의 결실, 중복 변이에 대한 고-처리량 감별분석이 가능한 그리드(grid)가 8개씩 포함되도록 칩 레이아웃을 고안하여, 8 웰 혼성화 반응 챔버(8 well hybridization reaction chamber)를 통해 8개의 개별 검체에 대한 분석을 동시에 진행할 수 있도록 고안하였다(도 2 참조). 영하 70℃ 보관중인 프로브 스탁(stock)을 실온에서 해동한 후, 탈이온 멸균 3차 증류수에 최종농도 100 μM이 되도록 희석하여 워킹 스탁(working stock)으로 사용하였다. 워킹 스탁을 50배 희석한 각각의 프로브들을 3X SSC 스포팅 용액(500 mM NaCl, 3 mM sodium citrate, 1.5 M N,N,N-trimethylglycine, pH 6.8)과 1 : 5 - 10 비율(v/v)로 혼합하여 최종 96 웰 플레이트(well plate)에 분주되는 프로브의 농도범위가 20 - 30 pmole/uL 가 되도록 하였다. 상기 master 플레이트를 Microssys 5100 microarrayer(Cartesian Technologies, Ann Arbor, MI, USA)에 장착하고 이로부터 알데하이드(aldehyde)-, 티오이소시아네이트(thioisocyanate)-활성화된 글라스 슬라이드(CEL associates Inc., Houston, TX, USA), 에폭시(epoxy)-활성화된 플라스틱 칩, 또는 골드 필름 표면에 프로브들을 순서에 따라 2개씩 duplicate으로 스포팅하였다. 스팟(spot)의 평균 크기(diameter)는 80 - 140 마이크로미터(micrometer)이며 스팟간 크로스-토크(cross-talk)효과를 최소화하기 위해 스팟간의 거리는 350 - 500 마이크로미터를 유지하였다. 칩 제작은 75% 습도(humidity)를 유지하는 클래스 10,000 룸에서 실시하였다. 프로브가 스팟팅된 칩은 120℃, 1시간 베이킹(baking)한 후, 0.25% SDS(Sodium dodecyl sulfate)용액에서 3분간 세척하고 멸균 3차 증류수로 다시 세척하였다. 이후 칩을 0.2% 소디움 보로하이드라이드(NaBH₄)를 포함하는 용액에 15분간 반응시켜 프로브를 블럭킹(blocking)하였다. 이후 3차 증류수로 2회 세척하고 물기를 제거한 후 chip slide 보관 box에 위치시키고, 사용시점까지 데시케이터(dessicator)에 보관하였다.

< 실시예 6> 디스트로핀 유전자 변이 감별분석용 칩( chip ) 혼성화( hybridization ) 반응 및 결과 분석

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 디스트로핀 유전자의 78개 엑손들과 대조군 유전자를 증폭하는 12개 서브셋(subset) 멀티플렉스-PCR 증폭산물을 각각 5 - 10 uL씩 총 60 - 120 uL를 이와 동일한 volume의 탈이온 3차 멸균 증류수가 미리 첨가된 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 이 mixture를 부드럽게 vortex하고, 95℃, 5분간 열변성시킨 후 얼음위에 5분간 보존하고 원심분리기로 스핀다운(spin down)하였다. 분석용 칩(chip) 표면에 8 웰 혼성화 반응 챔버(8 well hybridization chamber)를 위치시키고 웰 커버(cover)로 웰 상층부를 덮어두었다. 이후 반응시키고자하는 웰(well)에 상기 반응 혼합용액에 혼성화 반응 온도인 58℃로 미리 가열해둔 60 - 120uL의 혼성화 반응 용액(3X SSC, 0.1% SDS, 0.2 mg/mL 소혈청알부민, pH 7)을 첨가하여 혼합한 후 웰 커버의 구멍(hole)을 통해 반응액 혼합물을 주입하고 버블(bubble)이 발생하지 않도록 주의하였다. 챔버 리드(lid)를 고정시킨 후 58℃, 30분간 혼성화 반응을 통해 칩 표면의 프로브와 멀티플렉스 PCR 반응산물간 특이적인 뉴클레오티드 상보적(complementary) 결합을 유도하였다. 혼성화 반응이 종료된 칩 표면의 웰 커버를 제거하고 칩을 세척버퍼 1(0.1X SSC, 0.05% SDS)용액에 담그고 2분간 2,000 rpm에서 교반하면서 세척(washing)하고 이를 반복하였다. 이후 세척용액 2(2X SSC, 0.1% SDS)용액에 2분간 2,000 rpm에서 교반하면서 세척(washing)하고 이를 반복하였다. 이후 탈이온 3차 멸균 증류수에 담가 2회 세척하고 1,000 rpm에서 원심분리하여 칩을 건조하였다. 전기 세척과정을 통해 칩 반응의 비특이적인 시그널을 제거한 후, 디스트로핀 변이 감별분석용 칩을 스캔어래이 라이트(ScanArray Lite, Packard Instrument Co., Meriden, CT, USA) 스캐너를 이용하여 판독하였고, 분석 소프트웨어(QuantArray 2.0)를 이용하여 양성 대조군 스팟들의 평균 형광강도(fluorescence intensity) 및 표준오차를 스팟 주변의 값들과 비교하여 signal-to-noise(S/R) 비율을 구한 뒤 그 값이 4 이상일 경우 양성 값으로 스코어링(scoring) 처리하였다(도 3, 4, 5 참조).

도 1은 정상인과 뒤셴형 근이양증의 디스트로핀 엑손 결실 유무와 근섬유 조직염색을 통한 디스트로핀 단백질의 존재유무를 비교하여 나타낸다. 디스트로핀 엑손 결실이 없는 정상인(좌측 상단)과 달리 근이양증 환자들은 디스트로핀 유전자의 복수이상의 엑손 결실을 확인할 수 있다(우측 상단). 정상인은 근섬유 조직염색에서 디스트로핀 단백질의 존재를 확인할 수 있으나(좌측 하단), 근이양증 환자들의 조직에서는 희박하게 존재함을 확인할 수 있다(우측 하단).

도 2는 본 발명에 따라 제작된 뒤셴/베커형 근이양증 유전질환의 원인을 규명하기 위한 디스트로핀 유전자 돌연변이 감별분석용 칩의 모식도이다. 디스트로핀 mRNA(약 14,000bp)를 코딩하는 전체 엑손의 결실, 중복 변이를 높은 변별력으로 분석하는 프로브가 배열된 칩 그리드(grid)를 나타내었으며, 형광물질이 표지된 타겟 DNA와 칩 위에 배열된 프로브간 혼성화(hybridization)반응이 이루어지는 8웰 혼성화 반응 챔버를 모식하여 나타냈다.

도 3은 본 발명에 따라 프로브가 고정화된 칩 제작 이후, 임상검체로부터 분리한 genomic DNA를 주형으로 디스트로핀 78개 전체 엑손을 멀티플렉스 PCR을 통해 증폭한 뒤, 형광 표지된 증폭산물과 칩 위의 선택적 프로브들과 혼성화(hybridization) 반응을 실시함으로써 디스트로핀 유전자의 결실, 중복 돌연변이를 분석하고, 동시에 멀티플렉스 증폭산물의 일부를 direct sequencing을 통해 점 돌연변이 유무를 확인함으로써 근이양증 유전질환의 원인이 되는 디스트로핀 유전자 변이를 감별진단하는 분석흐름도이다.

도 4는 본 발명에 따라 임상검체로부터 디스트로핀 유전자의 돌연변이 감별분석한 결과를 나타내는 칩 그리드(상단)와 칩 스캔 이미지(하단)를 나타낸다. 엑손 3번, 4번, 5번, 9번, 19번, 22번, 23번, 24번, 25번, 26번, 40번, 41번, 42번, 43번, 44번, 45번, 51번, 52번이 large deletion된 뒤셴형 근이양증 환자의 칩 분석이미지를 나타낸다.

도 5는 본 발명에 따라 임상검체로부터 디스트로핀 유전자의 돌연변이 감별분석한 결과를 나타내는 칩 그리드(상단)와 칩 스캔 이미지(하단)를 나타낸다. 엑손 25번, 26번, 27번, 28번, 29번, 30번, 48번, 49번, 50번, 51번, 52번이 small deletion된 베커형 근이양증 환자의 칩 분석이미지를 나타낸다.

<110> PARK, MinKoo <120> Differential diagnostic method, kit, chip for the dystrophin gene deletion, duplication, point mutation and DMD/BMD screening test therethrough <160> 156 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 1 probe <400> 1 aaatgctttg gtgggaagaa gtaga 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon1 probe <400> 2 tgctttggtg ggaagaagta gagga 25 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon2 probe <400> 3 tattttgcat tttagatgaa agagaagatg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon2 probe <400> 4 caattttcta aggtaagaat ggtttgttac 30 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon3 probe <400> 5 acctcttcag tgacctacag gatggga 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon3 probe <400> 6 tattgagaac ctcttcagtg acctacag 28 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon4 probe <400> 7 ccttgttgac attgttcagg gcat 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon4 probe <400> 8 cttgttgaca ttgttcaggg cat 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon5 probe <400> 9 aactgactct tggtttgatt tggaa 25 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon5 probe <400> 10 agagtcagtt tatgatttcc atctacg 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon6 probe <400> 11 tggctttgaa tgctctcatc catagtc 27 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon6 probe <400> 12 gcaacaaacc aacagtgaaa agatt 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon7 probe <400> 13 agtgtggttt gccagcagtc agcc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon7 probe <400> 14 tggtttgcca gcagtcagcc acac 24 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 8 probe <400> 15 acatcactct tccaagtttt gcctc 25 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 8 probe <400> 16 gccacctaaa gtgactaaag aagaaca 27 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 9 probe <400> 17 ctctgaccct acacggagcc catt 24 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 9 probe <400> 18 cacacaggct gcttatgtca ccacc 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 10 probe <400> 19 aagacaagtc atttggcagt tcatt 25 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 10 probe <400> 20 caaggagaga tttctaatga tgtgga 26 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 11 probe <400> 21 tcaagatggg aatgcctcag ggtag 25 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 11 probe <400> 22 gattggaaca ggaaaattat cagaaga 27 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 12 probe <400> 23 actgaaagag ttgaatgact ggctaa 26 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 12 probe <400> 24 agaacaagga aaatggagga agagcc 26 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 13 probe <400> 25 cttccaaagc agcagttgcg tgat 24 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 13 probe <400> 26 ggtggtagtt gatgaatcta gtggaga 27 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 14 probe <400> 27 gaacccagcg gtcttctgtc catcta 26 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 14 probe <400> 28 caagacatcc ttctcaaatg gcaacg 26 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 15 probe <400> 29 gaacaagatt cacacaactg gctttaa 27 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 15 probe <400> 30 aagatcaaaa tgaaatgtta tcaagtcttc 30 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 16 probe <400> 31 tcagtgaccc agaagacgga agcat 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 16 probe <400> 32 tgggcaaact gtattcactc aaaca 25 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 17 probe <400> 33 gtaactacgg tgaccacaag ggaacaga 28 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 17 probe <400> 34 tccccaaaag aagaggcaga ttact 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 18 probe <400> 35 gcaatctttc ggaaggaagg caact 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 18 probe <400> 36 aagttgcctt ccttccgaaa gattg 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 19 probe <400> 37 gccctggtgg aacagatggt gaatg 25 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 19 probe <400> 38 gccctggtgg aacagatggt gaa 23 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 20 probe <400> 39 gcagatagca tcaaacaagc ctcaga 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 20 probe <400> 40 tactgctgaa aactggttga aaatcc 26 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 21 probe <400> 41 ctatggcaca ggatgaagtc aaccg 25 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 21 probe <400> 42 atactctatg gcacaggatg aagtcaac 28 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 22 probe <400> 43 tgggtccagc agtcagaaac caaac 25 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 22 probe <400> 44 gcagtcagaa accaaactct ccatacc 27 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 23 probe <400> 45 gcttcttcca gcgtccctca at 22 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 23 probe <400> 46 tcagcaccac tgtgaaagag atgtcg 26 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 24 probe <400> 47 aaaccctgaa gaaatggatg gctga 25 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 24 probe <400> 48 gaaatggatg gctgaagttg atgtt 25 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 25 probe <400> 49 aaacagtgtc aatgaaggtg ggcaga 26 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 25 probe <400> 50 tgggcagaag ataaagaatg aagcaga 27 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 26 probe <400> 51 gagaaaactg taagcctcca gaaagat 27 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 26 probe <400> 52 ttacagaaag cagttgaaga gatgaag 27 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 27 probe <400> 53 gcccaacaaa aagaagcgaa agtgaa 26 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 27 probe <400> 54 agtttcactt tcgcttcttt ttgttgg 27 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 28 probe <400> 55 ggagaaagca aacaagtggc taaatga 27 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 28 probe <400> 56 agaaagcaaa caagtggcta aatgaagt 28 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 29 probe <400> 57 tattggcaca gaccctaaca gatggc 26 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 29 probe <400> 58 tgatgcgaca ttcagaggat aacccaa 27 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 30 probe <400> 59 gctgccaact gcttgtcaat gaatgt 26 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 30 probe <400> 60 ctgggcttcc tgaggcattt gag 23 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 31 probe <400> 61 aggggaagga ggctgcccaa agag 24 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 31 probe <400> 62 agagtcctgt ctcagattga tgttgc 26 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 32 probe <400> 63 tttgagcagc gtctacaaga aagtaag 27 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 32 probe <400> 64 gcattggaaa caaagagtgt ggaac 25 <210> 65 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 33 probe <400> 65 gaaaaagcag acggaaaatc ccaaag 26 <210> 66 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 33 probe <400> 66 caaagaactt gatgaaagag taacagc 27 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 34 probe <400> 67 cgtaagatgc gaaaggaaat gaatgt 26 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 34 probe <400> 68 atttggattc tgaagttgcc tgggga 26 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 35 probe <400> 69 aacagttttg ggcaagaagg agacg 25 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 35 probe <400> 70 ctgaagagta tcacagaggt aggagagg 28 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 36 probe <400> 71 tgattcatcc aaaagtgtgt cagcct 26 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 36 probe <400> 72 caggctgaca cacttttgga tgaat 25 <210> 73 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 37 probe <400> 73 gcagaactga atgacatacg cccaa 25 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 37 probe <400> 74 aagcagcaaa cttgatggca aaccg 25 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 38 probe <400> 75 tgcttgaacc actggaggct gaaat 25 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 38 probe <400> 76 gtcttcctct ttcagattca ccccct 26 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 39 probe <400> 77 atcacagatg agagaaagcg agaggaa 27 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 39 probe <400> 78 cagacaaaac ataatgctct caaggta 27 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 40 probe <400> 79 agccagccta cctgagccca gagat 25 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 40 probe <400> 80 gaggtctcaa agaagaaaaa aggct 25 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 41 probe <400> 81 gctgagggct tgtctgagga tggg 24 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 41 probe <400> 82 tgagggcttg tctgaggatg gggc 24 <210> 83 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 42 probe <400> 83 acaagcccta ttagaagtgg aacaac 26 <210> 84 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 42 probe <400> 84 tgacctctgt gctaaggact ttgaa 25 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 43 probe <400> 85 caacgcctgt ggaaagggtg aagc 24 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 43 probe <400> 86 cttcaccctt tccacaggcg ttgc 24 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 44 probe <400> 87 atctgttgag aaatggcggc gtt 23 <210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 44 probe <400> 88 aacgccgcca tttctcaaca gat 23 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 45 probe <400> 89 gaactccagg atggcattgg gcag 24 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 45 probe <400> 90 attgggaagc ctgaatctgc ggtg 24 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 46 probe <400> 91 aaaagagcag caactaaaag aaaagc 26 <210> 92 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 46 probe <400> 92 atttgtttta tggttggagg aagcag 26 <210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 47 probe <400> 93 taaatgaaac tggaggaccc gtgct 25 <210> 94 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 47 probe <400> 94 cccataagcc cagaagagca agata 25 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 48 probe <400> 95 tcatctgctg ctgtggttat ctccta 26 <210> 96 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 48 probe <400> 96 ataaccaacc aaaccaagaa ggacca 26 <210> 97 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 49 probe <400> 97 tggaagagat tttgtctaaa gggcagc 27 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 49 probe <400> 98 tacaaggaaa aaccagccac tcagcc 26 <210> 99 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 50 probe <400> 99 tcctggactg accactattg gagcct 26 <210> 100 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 50 probe <400> 100 aggctccaat agtggtcagt ccagga 26 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 51 probe <400> 101 tcaagcagag aaagccagtc ggtaa 25 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 51 probe <400> 102 ttggacagaa cttaccgact ggctt 25 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 52 probe <400> 103 acagaggcgt ccccagttgg aagaa 25 <210> 104 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 52 probe <400> 104 tgaaaaacaa gaccagcaat caagagg 27 <210> 105 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 53 probe <400> 105 taaaggattc aacacaatgg ctgga 25 <210> 106 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 53 probe <400> 106 gcaatccaaa agaaaatcac agaaacca 28 <210> 107 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 54 probe <400> 107 tggcagacaa atgtagatgt ggcaa 25 <210> 108 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 54 probe <400> 108 gcagatgata ccagaaaagt ccaca 25 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 55 probe <400> 109 ctacaggatg ctacccgtaa ggaaagg 27 <210> 110 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 55 probe <400> 110 caaagcagcc tctcgctcac tcacc 25 <210> 111 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 56 probe <400> 111 tcggaaaaag tctctcaaca ttaggtag 28 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 56 probe <400> 112 cctacctaat gttgagagac tttttccg 28 <210> 113 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 57 probe <400> 113 aagccagttc tgaccagtgg aagcgt 26 <210> 114 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 57 probe <400> 114 caggcaccta ttggaggcga ctttc 25 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 58 probe <400> 115 gagaaactct accaggagcc cag 23 <210> 116 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 58 probe <400> 116 atttctgaca gagcagcctt tggaag 26 <210> 117 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 59 probe <400> 117 ctccgctgac tggcagagaa aaatagatg 29 <210> 118 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 59 probe <400> 118 tgaggaggtc aatactgagt gggaa 25 <210> 119 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 60 probe <400> 119 cgtataacct cagcactctg gaagacc 27 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 60 probe <400> 120 ctctcaccgt ataacctcag cactct 26 <210> 121 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 61 probe <400> 121 actttggtcc agcatctcag cactttc 27 <210> 122 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 61 probe <400> 122 ctttctttcc agtaagtcat tttcagc 27 <210> 123 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 62 probe <400> 123 cttcttttca gcgtctgtcc agggtc 26 <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 62 probe <400> 124 agagccatct cgccaaacaa agtgc 25 <210> 125 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 63 probe <400> 125 acgagactca aacaacttgc tgggacc 27 <210> 126 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 63 probe <400> 126 tatgttttgt gttttagcca cgagact 27 <210> 127 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 64 probe <400> 127 taatgtcaga ttctcagctt ataggactg 29 <210> 128 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 64 probe <400> 128 gcagtcttcg gagtttcatg gcagt 25 <210> 129 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 65 probe <400> 129 gtttgaccac tatttatgac cgcctg 26 <210> 130 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 65 probe <400> 130 tatgtgtctg aactggctgc tgaatgt 27 <210> 131 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 66 probe <400> 131 taaaactggc atcatttccc tgtgtaa 27 <210> 132 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 66 probe <400> 132 ttacacaggg aaatgatgcc agtttta 27 <210> 133 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 67 probe <400> 133 ccttttcaag caagtggcaa gttcaa 26 <210> 134 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 67 probe <400> 134 gcatcctttg ggggcagtaa cattg 25 <210> 135 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 68 probe <400> 135 aaactgccaa gcatcaggcc aaatgt 26 <210> 136 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 68 probe <400> 136 acatttggcc tgatgcttgg cagttt 26 <210> 137 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 69 probe <400> 137 tttaattatg acatctgcca aagctgct 28 <210> 138 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 69 probe <400> 138 agcagctttg gcagatgtca taattaaa 28 <210> 139 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 70 probe <400> 139 aaggtatttt gcgaagcatc cccga 25 <210> 140 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 70 probe <400> 140 gaagcatccc cgaatgggct acct 24 <210> 141 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 71 probe <400> 141 gccagtagat tctgcgtgag tacttt 26 <210> 142 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 71 probe <400> 142 aaagtactca cgcagaatct actggc 26 <210> 143 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 72 probe <400> 143 cacgatgata ctcattcacg cattga 26 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 72 probe <400> 144 gcctgcctcg tcccctcagc 20 <210> 145 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 73 probe <400> 145 tagcagaaat ggaaaacagc aatgg 25 <210> 146 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 73 probe <400> 146 gcagaaatgg aaaacagcaa tggat 25 <210> 147 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 74 probe <400> 147 tacgaggctg gctcaggggg ga 22 <210> 148 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 74 probe <400> 148 actcccccct gagccagcct cgtag 25 <210> 149 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 75 probe <400> 149 ccctcctgaa atgatgccca cctct 25 <210> 150 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 75 probe <400> 150 gctggagtca cagttacaca ggcta 25 <210> 151 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 76 probe <400> 151 gagtggttgg cagtcaaact tcgga 25 <210> 152 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 76 probe <400> 152 aagtgaatgg cacaacggtg tcctct 26 <210> 153 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 77 probe <400> 153 ccccaggaca caagcacagg gttag 25 <210> 154 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 77 probe <400> 154 gagcaactca acaactcctt cccta 25 <210> 155 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 78 probe <400> 155 aggaagaaat acccctggaa agcgaa 26 <210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dystrophin exon 78 probe <400> 156 ttcgctttcc aggggtattt cttcct 26

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1 내지 156의 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드(deoxyribonucleic acid oligonucleotide)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 DNA 프로브(probe)를 포함하는 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 검출용 DNA 칩.
4. 서열번호 1 내지 156의 염기서열을 갖는 PNA 올리고뉴클레오티드(peptide nucleic acid oligonucleotide)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 PNA 프로브를 포함하는 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 검출용 PNA 칩.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 3항에 있어서, 상기 DNA 칩은 알데하이드(aldehyde)-, 티오이소시아네이트(thioisocyanate)-, 또는 카르복실(carboxyl)-활성화된 유리 슬라이드(glass slide)로 구성되거나, 에폭시(epoxy)-활성화된 플라스틱(plastic) 또는 금 필름(gold film) 재질의 칩으로 구성되는 디스트로핀 유전자 결실, 중복, 점 돌연변이 검출용 DNA 칩.
10. 삭제
11. 제 3항의 DNA 칩 또는 제 4항의 PNA 칩을 포함하는 뒤셴/베커형 근이양증 산전(prenatal) 진단키트.

Images