KR20190025637A - 염증성 장 질환을 위한 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전혈 샘플에서 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정함으로써 개체가 염증성 장 질환(IBD) 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 방법을 제공한다. 또한, IBD 진행 위험이 높거나 낮은 것으로 결정되는 개체에서 IBD를 치료하기 위한 방법 및 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하기 위한 키트가 제공된다. 환자의 전혈 샘플로부터 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이 및 어레이의 제공 방법 또한 제공된다.

Description

염증성 장 질환을 위한 바이오마커
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 7월 5일 출원된 영국 특허 출원 GB 1611738.4에 대하여 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 개체가 크론병(Crohn's disease, CD) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC)의 진행을 비롯한 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD) 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 방법에 관한 것이다. 개체는 선택적으로 추가로 IBD 치료를 받거나 IBD 치료를 위해 선택될 수 있으며, 치료는 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지에 기초하여 선택된다.
공격적인 치료법(aggressive therapy)을 CD에 조기에 도입하면, 표준 스텝-업 접근법(standard step-up approach)(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010)에 비해 더 나은 결과를 얻을 수 있다는 것이 확인되었다. 특히, 조기 병용 요법(인플릭시맙(infliximab)과 아자티오프린(Azathioprine)의 병용; D' Haens et al., 2008)으로 치료받은 환자는 장기간의 탈-스테로이드 관해(steroid-free remission)를 경험하고, 점막 치유를 달성할 가능성이 더 높으며, 궁극적으로는 외과적 절제를 피할 가능성이 더 높다(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010). 그러나 무시할 수 없는 비율의 환자가 기존의 치료 접근법에서도 장기적인 관해를 달성했을 것이므로 병용 요법을 사용한 환자의 치료는 그들을 불필요한 부작용 및 독성에 노출시킬 것이기 때문에, 이 전략이 모든 환자에게 적합하지는 않다(Jess et al., 2007). 이러한 이유로, 예후를 예측할 수 있는 능력은 CD 환자 및 일반적으로 IBD 환자의 치료(care)를 개선하기 위한 중요한 단계가 될 것이다(IBD Research Priority, 2015; Gerich et al., 2014).
여러 가지 상이한 변수, 즉 임상 인자, 혈청학적 마커 및 유전적 변이체가 CD의 예후와 관련되어 있다(Gerich et al., 2014; Billiet et al., 2014). 그러나 단독으로 또는 조합하여 사용되는 이들 마커의 예측력은 지금까지 제한적인 것으로 입증되었으며, 어떠한 마커도 임상에서의 일상적인 사용에는 적합하지 않다(Loly et al., 2008; Markowitz et al., 2011; Ananthakrishnan et al., 2014). 결과적으로, CD와 UC를 포함한 IBD에 대한 신뢰할 수 있는 예후 검사를 개발하는 것이 우선순위이며, 현재 소화기내과(gastroenterology)에서 가장 중요한, 충족되지 않은 요구 중 하나로 인식되고 있다(IBD Research Priority, 2015).
이 목표를 달성하기 위하여, 유전적 변이체는 안정적이고, 쉽게 측정될 수 있을뿐만 아니라 적어도 감수성(susceptibility)과 관련하여 CD의 유전적 구조가 이미 광범위하게 연구되었으므로, 유망한 후보 예후 마커이다(Jostins et al., 2012). 그러나 지금까지 발견된 유전적 인자는 환자 간의 CD 결과에서 관찰된 표현형 분산(phenotypic variance)의 5 내지 6%만을 설명할 수 있다. 이러한 수치가 증가한다 할지라도, 훨씬 공신력이 있는(better-powered) 연구가 다른 결과-관련 변이체를 발견하기 때문에, 유전적 인자가 CD 및 일반적으로 IBD에서 단독으로 결과의 정확한 예측을 가능하게 하기에 충분할 것 같지 않다. 이는 흡연을 포함한 환경적 인자가 IBD의 자연사(natural history)에서 중요한 역할을 한다는 개념과 일치한다(Kaser et al., 2010).
유전자 발현 마커는 특히, 질병의 발병기전(pathogenesis)에 관여하는 조직이나 세포 유형에서 직접 측정될 경우, 이러한 제한을 극복하기 위한 더 나은 후보가 될 수 있다(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011). 실제로, 유전자 발현은 유기체와 외부 환경 간의 상호 작용에 관한 더 많은 정보를 얻을 수 있지만(Choi et al., 2007), 여전히 개개의 유전적 배경의 일부 측면을 반영한다. 반면에, 유전자 발현은 일반적으로 시간이 지남에 따라 안정적일 것으로 예상되지 않으며, 유전자 발현 수준에 영향을 미치지 않으면서 특정 세포 집단을 분리하는 것은 기술적으로 어려운 일이다(Lyons et al., 2007). 통제된 연구 환경 밖에서, 이들 인자 모두는 임상적인 맥락에서 유전자 발현 마커의 사용을 제한한다.
최근 CD8+ T 세포에서 검출 가능한, 독특한 유전자 발현 시그니처(gene expression signature)가 IBD의 예후를 예측하는 데 사용될 수 있음이 보고된 바 있다(Lee et al., 2011). 특히, 이러한 시그니처는 진단 당시와 치료 전, CD와 UC 모두에서 서로 다른 임상적 경과와 관련된 두 개의 별개의 환자군(IBD1과 IBD2)을 확인할 수 있었다(Lee et al., 2011). 더욱 정확하게는, 표준 단계적 접근법으로 관리된 경우(Peyrin-Biroulet et al., 2008), IBD1 군에 속하는 것으로 분류된 환자는 IBD2 군의 환자보다 치료의 단계적 강화(treatment escalation) 위험이 현저하게 높았으므로(Lee et al., 2011), 조기 단계에서 더욱 공격적인 치료법으로 이들 환자를 치료하기 위한 이유를 제공한다(Lee et al., 2011).
전술된 시그니처는 세 가지 주된 이유로 IBD(Friedman et al., 2011)에서 결과 예측에 대한 중요한 발전을 나타내었다. 첫째, 이전에 보고된 예후 마커(Gerich et al., 2014)와는 달리, 환자 계층 간 결과의 차이는 치료 결정을 유도하는 데 잠재적으로 유용할 만큼 충분히 뚜렷하다(Lee et al., 2011; Friedman et al., 2011). 둘째, 중복(overlapping) CD8+ 유전자 발현 시그니처는 이전에 전신 홍반성 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus, SLE) 및 ANCA-관련 혈관염(ANCA-associated vasculitis, AAV) 환자의 질병 결과를 예측하는 것으로 보고된 바 있으므로, 공통의 생물학적 프로세스가 서로 다른 염증성 질환 예후의 기저를 이룰 수 있다는 가설을 제시한다(McKinney et al., 2010). 마지막으로, 근본적인 생물학적 프로세스에 대한 부분적이지만 설득력 있는 기계론적인 설명이 최근에 제안되었다(McKinney et al., 2015). 이들 마지막 두 가지 포인트가 특히 중요하다. 사실, 예후를 조사하기 위해서는 반드시 데이터 수집에 시간이 소모되고 비용도 많이 드는 종단 연구(longitudinal studies)가 필요하므로 연구 규모가 제한된다. 결과적으로, 작은 코호트(cohort)의 환자가 기본 집단(underlying population)으로부터 충분한 복잡성을 확보할 수 있는지 여부와 제안된 예후 마커가 실제로 재현 가능한지 여부는 종종 의심의 여지가 있다. 이와 관련하여, 신뢰할 수 있는 기계론적 통찰과 함께 상이한 질병을 앓고 있는 환자의 상이한 코호트에 걸친 질병 결과에 대한 일관성을 관찰하는 것은 전술한 CD8+ T 세포 유전자 발현 시그니처의 재현성에 대한 신뢰를 크게 증가시킨다(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011).
그러나 CD8+ T 세포 유전자 발현 시그니처가 임상 환경에서 환자를 계층화시키기 위해 일상적으로 사용될 수 있기 전에 해결되어야 할 중요한 문제가 아직 남아 있다. 환자를 IBD1/IBD2 군에 배정하기 위해서는 현재 정제된 CD8+ T 세포로부터의 RNA 추출이 필요하다(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011). 이 단계가 잠재적인 예후 시험에 상당한 양의 복잡성을 추가하여 제어된 연구 환경에서 적은 수의 샘플에 대한 적용 가능성을 제한한다는 점이 반복적으로 관찰되었다(Friedman et al., 2011; Billiet et al., 2014).
이와 반대로, 전혈(whole blood)과 같이 쉽게 접근할 수 있는 생물학적 샘플에서 IBD1/IBD2 하위 그룹을 검출할 수 있다면, 임상적 유용성 및 잠재적으로 예후 마커로서의 그것의 적용 가능성을 크게 촉진할 것이다. 나아가, 정제된 CD8+ T 세포는 그렇지 않지만, 전혈 샘플은 일부 임상 시험 중에 일상적으로 수집되어 왔으므로, 이는 환자 계층화 이후 약물 효능을 재평가하기 위하여 과거의 IBD 약물 시험 재분석을 다시 할 수 있는 가능성을 열어 줄 것이다.
잠재적으로 유용함에도 불구하고, 정제된 CD8+ T 세포와는 다른 샘플에서 IBD1/IBD2 시그니처를 검출하는 것은 이전에 도전(challenging)이었음이 입증되었다는 점에 유의해야 한다(Lee et al., 2011). 사실, CD4+ T 세포에서 유래되는 유전자 발현 시그니처는 IBD(Lee et al., 2011), SLE 또는 AAV(McKinney et al., 2010)에서 질병 결과에 의해 환자를 계층화하는 데 사용될 수 없음이 반복적으로 관찰되었다. 이러한 관찰과 일관되게, 원래 CD8+ T 세포 발현 시그니처를 발견하기 위해 사용된 것과 동일한 비감독 클러스터링(unsupervised clustering) 방법(Monti et al., 2003)을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 동등한 예후 시그니처를 확인하는 것이 가능하지 않았다(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011). 이것은 CD8+ T 세포가 PBMC 집단의 매우 작고 다양한 부분을 대표한다는 사실 때문일 수 있다(Lyons et al., 2007).
또한, 예후 시그니처는 마이크로어레이(Schena et al., 1995)와 같은 고속 처리 유전자 발현 프로파일링 기술을 사용하여 발견될 수도 있지만, 실행 가능한 예후 시험은 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR)과 같은 더 작은 규모의 유전자 발현 플랫폼에 의존할 필요가 있다(Freeman et al., 1999). 실제로, AlloMap, Oncotype Dx 및 CorusCAD와 같은, 상이한 조건을 위해 개발된 대부분의 현대적인 예후 시험은 qPCR 기반 시험이며(Micheel et al., 2012), MammaPrint와 같은 소수의 오래된 시험이 마이크로어레이에 의존한다(Micheel et al., 2012). 이러한 이유로, IBD1/IBD2 하위 그룹을 개괄한 시그니처가 전혈에서 발견될 수 있다면, 이를 qPCR로 검출할 가능성은 임상 환경에서 이를 적용하는 데 결정적일 것이다.
따라서, qPCR과 같은 방법을 사용하여 전혈에서 검출될 수 있는 IBD1/IBD2 유전자 발현 시그니처에 대한 당업계에서의 요구가 여전히 남아있다.
본 발명자들은 놀랍게도 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 발현을 분석함으로써, 개체가 IBD(예를 들어, 궤양성 대장염 또는 크론병) 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 데 사용될 수 있는 유전자 발현 시그니처를 확인하였다. 전혈에서 이들 유전자의 발현은 예를 들어, RT-qPCR에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은 저위험(IBD2) 표현형을 갖는 개체에서의 해당 유전자의 발현 수준에 비해, 고위험(IBD1) 표현형은 전혈에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현 및 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현을 특징으로 함을 발견하였다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정함으로써 상기 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 가지는지를 확립(establishing)하는 단계를 포함하는, 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 방법을 제공하며, 여기에서 2종 이상의 유전자는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96, GZMK 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 방법은 예를 들어, RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석(whole transcriptome shotgun sequencing)을 사용하여 상기 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우, 방법은 (i) 개체로부터 수득된 전혈 샘플을 제공하는 단계; (ii) 전혈 샘플로부터 RNA(예를 들어, mRNA)를 추출하는 단계; (iii) RNA(예를 들어, mRNA)를 cDNA로 전환시키는 단계; 및 (iv) RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 수행하여 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 자가면역질환 진행 위험 평가 시스템을 제공하며, 여기에서 시스템은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현을 결정하기 위한 도구 또는 도구들; 및 대상체의 유전자 발현 데이터로부터 IBD 진행 위험 점수를 산출하도록 프로그램된 컴퓨터를 포함한다.
유전자 발현을 결정하기 위한 도구(들)는 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석과 같은, 본원에 기술된 임의의 기법을 사용하여 해당(in question) 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도구(들)는 예를 들어, RT-qPCR, 디지털 PCR, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석을 사용하여 해당 유전자의 발현 수준을 확립하기에 적합한 프라이머일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 적합한 프라이머의 설계는 통상적이며, 충분히 당업자의 능력 내에 있다. 방법이 다중화 유전자 발현 분석을 포함할 경우, 도구(들)는 부가적으로 또는 대안적으로, 해당 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 형광 프로브를 포함할 수 있다. 도구(들)는 또한 RNA 추출 시약 및/또는 RNA의 cDNA로의 역전사를 위한 시약일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 도구(들)는 또한, 완충 용액과 같은 방법의 수행을 위한 하나 이상의 물품(article) 및/또는 시약, 및/또는 시험 샘플 그 자체를 수득하기 위한 수단, 예를 들어 샘플을 수득 및/또는 분리하기 위한 수단 및 샘플 취급 용기(이러한 구성요소는 일반적으로 멸균 상태임)일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. IBD 진행 위험 점수 산출은 여러 가지 방식으로 달성될 수 있으며, 예시적인 방법이 아래에 기재된다.
본 발명은 개체에서 IBD를 치료하는 방법을 더 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 (i) 본 발명의 방법을 사용하여 개체를 IBD 진행 위험이 높거나 또는 낮은 개체로 확인하는 단계, 및 (ii) 개체가 IBD에 대한 치료를 받게 하는 단계를 포함할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 방법은 (i) 분석 결과를 제공하는 시험을 요청하여 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 여기에서 2종 이상의 유전자는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단계, 및 (ii) IBD에 대해 IBD1 또는 IBD2 표현형을 갖는 것으로 결정된 개체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 개체가 고위험 IBD1 또는 저위험 IBD2 표현형을 갖는지를 평가하기 위한 키트가 제공되며, 여기에서 상기 키트는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함한다.
본 발명은 또한 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 시험관 내(in vitro) 방법에 관한 것이다. 방법은 바람직하게는 (i) 관심 물질을 이용한 치료 전에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플 및 (ii) 관심 물질을 이용한 치료 후에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플을 제공하는 단계로서, 여기에서 IBD 환자는 본 발명의 방법을 사용하여 고위험(IBD1) 표현형을 갖는 것으로 결정되는 단계; 및 샘플 (i) 및 (ii)에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하며; 여기에서 샘플 (i)에 비해 샘플 (ii)에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 낮은 발현 및 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 높은 발현은 이 물질이 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 또한 개체에서 IBD를 치료할 수 있는 물질을 확인하는 시험관 내 방법에 관한 것이다. 방법은 바람직하게는 (i) 본 발명의 방법을 사용하여 IBD 진행의 위험이 높거나 낮은 개체를 확인하는 단계; 및 (ii) 관심 물질을 이용한 치료 후에 개체에서의 IBD 진행의 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하며, 여기에서 대조군과 비교하여 개체에서 더 낮은 IBD 진행 수준은 물질이 IBD를 치료할 수 있음을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
상기 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서, 예를 들어 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의해 유전자 발현을 분석함으로써, 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 데 사용될 수 있는 유전자 발현 시그니처를 확인하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 고위험(IBD1) 표현형이 저위험(IBD2) 표현형을 갖는 개체에서의 유전자의 발현 수준에 비해, 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현을 특징으로 함을 발견하였다. 이들 유전자에 대한 NCBI 등록번호(및 GI 번호)는 하기 표 2에 서술되어 있다.
상기 설명된 바와 같이, 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는지를 평가하는 방법은 이전에 기술된 바 있었으나, 이들 방법은 전혈 샘플에 직접적으로 적용될 수 없었으며, 오히려 전혈로부터 예를 들어, CD8 T 세포의 단리를 필요로 하므로 이들 방법의 임상적 적용 가능성을 심각하게 제한한다. 이와 대조적으로, 본 발명자들에 의해 확인된 유전자 발현 시그니처는 전혈 샘플에서 검출될 수 있으므로, 전혈로부터 특정 세포 유형을 단리할 필요성을 없애고, 이 유전자 발현 시그니처를 사용하는 진단 방법의 임상적 유용성을 크게 증대시킬 수 있다. 특히, 유전자 발현 분석 전에 특정 세포 유형을 단리할 필요성을 방지하여 본 발명의 방법의 기술적 복잡성을 감소시킬 뿐만 아니라, 상기 방법을 수행하는 데 시간을 덜 소비하게 하며 보다 비용 효율적일 수 있게 한다.
따라서, 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 방법과 같은 본원에 개시된 방법은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3은 본 발명자들에 의해 확인된 바와 같이, 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형의 존재를 결정하기 위한 상위(top) 16종의 마커 유전자를 나타낸다.
상기 유전자 중 2종 이상의 발현 수준을 결정하는 것은 오직 하나의 유전자의 발현 수준을 결정하는 것보다 더욱 힘들 것으로 예상된다. 예를 들어, 하나의 유전자의 발현 수준이 결정될 수 없거나 부정확하더라도, 예를 들어 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 것을 통해 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형의 존재 또는 부재가 정확하게 결정될 수 있다.
예를 들어, 본원에 개시된 방법은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상, 13종 이상, 14종 이상, 15종 이상 또는 16종 모두의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 방법은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 중 적어도 5종의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 IL18RAP 및 TRGC2의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예에서, 방법은 선택적으로 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상, 13종 이상 또는 14종 모두의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
추가적인 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 IL18RAP, TRGC2 및 TRGV3의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예에서, 방법은 선택적으로 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136 및 LY96으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상 또는 13종 모두의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 개체가 염증성 장 질환(IBD) 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 방법에 관한 것으로, 방법은 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정함으로써 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는지를 확립하는 단계를 포함하고, 여기에서 2종 이상의 유전자는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 방법은 IBD2 표현형을 갖는 개체에서의 유전자 발현 수준에 비해, 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현에 의한 IBD1 표현형의 특성화(characterisation)를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 a) 선택된 유전자의 측정된 발현 수준에 가중치를 부여하고(weighting); b) 가중치가 부여된 발현 수준에 로지스틱 회귀 모델(logistic regression model)을 적용하여 위험 점수를 결정하며, 여기에서 0.5 미만의 위험 점수는 IBD 진행의 저위험을 나타내고, 0.5 미만의 위험 점수는 IBD 진행의 고위험을 나타내며; c) 결정의 결과를 요약하는 보고서를 생성함으로써, 환자에 대한 위험 점수를 산출하여 개체의 IBD 진행의 위험을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 방법은 IBD 치료를 위한 IBD 진행 위험이 높거나 낮은 개체로 확인된 개체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 IBD 진행 위험이 높거나 낮은 개체로 확인된 개체에게 IBD에 대한 치료를 받게 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 2종 이상의 유전자의 발현 수준은 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR), 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석을 사용하여 결정된다.
본 발명의 특정 양태에서, 방법은 (i) 개체로부터 수득된 전혈 샘플을 제공하는 단계; (ii) 전혈 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계; (iii) RNA를 cDNA로 전환시키는 단계; 및 (iv) RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 수행하여 2종 이상의 유전자의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 개체에서 IBD를 치료하는 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) 개체를 IBD 진행의 위험이 높거나 낮은 것으로 확인하는 단계 및 (ii) 개체에게 IBD에 대한 치료를 받게 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 자가면역질환 진행 위험 평가 시스템을 제공하며, 시스템은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현을 결정하는 도구 또는 도구들, 및 대상체의 유전자 발현 데이터로부터 IBD 진행 위험 점수를 산출하도록 프로그램된 컴퓨터를 포함한다. 시스템은 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석에 의해 2종 이상의 유전자의 발현을 결정하는 도구 또는 도구들을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 IBD 진행의 위험이 높거나 낮은 것으로 결정되는 개체에서 IBD를 치료하는 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) 상기 개체를 IBD1(IBD 진행의 고위험) 또는 IBD2(IBD 진행의 저위험)로 분류하는 시험 결과를 검토하는 단계로서, 여기에서 시험은 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하며, 여기에서 2종 이상의 유전자는 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 저위험(IBD2) 표현형을 갖는 개체에서의 유전자 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현은 개체가 고위험(IBD1) 표현형을 가짐을 나타내고, 여기에서 고위험(IBD1) 표현형을 갖는 개체의 유전자 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 하향 조절된 발현과 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 상향 조절된 발현은 개체가 저위험(IBD2) 표현형을 가짐을 나타내는 것인 단계, 및 (ii) IBD에 대해 IBD1 또는 IBD2 표현형을 갖는 것으로 결정된 개체를 치료하는 단계를 포함한다. 방법은 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석에 의해 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하기 위한 분석의 결과를 제공하는 시험을 요청하는 단계를 더 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 개체가 고위험 IBD1 또는 저위험 IBD2 표현형을 갖는지를 평가하기 위한 키트에 관한 것으로, 여기에서 키트는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함하고, 여기에서 IBD1 표현형은 IBD2 표현형을 갖는 개체의 유전자 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현을 특징으로 하고, 여기에서 IBD2 표현형은 IBD1 표현형을 갖는 개체의 유전자 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 하향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 상향 조절된 발현을 특징으로 한다. 키트는 RT-qPCR, 마이크로어레이 분석, 디지털 PCR, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석에 의해 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 확인하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, IBD는 궤양성 대장염(UC) 또는 크론병이다.
특정 양태에서, 본 발명은 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 시험관 내 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) 관심 물질을 이용한 치료 전에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플, 및 (ii) 관심 물질을 이용한 치료 후에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플을 제공하는 단계로서, 여기에서 IBD 환자는 고위험(IBD1) 표현형을 갖는 것으로 결정된 환자인 단계; 및 샘플 (i) 및 (ii)에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하며; 여기에서 샘플 (i)에 비해 샘플 (ii)에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 낮은 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 높은 발현은 물질이 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있음을 나타낸다. 방법은 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 것으로 확인된 물질을 약제로 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 개체에서 IBD를 치료할 수 있는 물질을 확인하는 시험관 내 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) IBD 진행 위험이 높거나 낮은 개체를 확인하는 단계; 및 (ii) 관심 물질을 이용한 치료 후에 개체에서의 IBD 진행의 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하며, 여기에서 대조군과 비교하여 개체에서 더 낮은 수준의 IBD 진행은 물질이 IBD를 치료할 수 있음을 나타낸다. 방법은 IBD를 치료할 수 있는 것으로 확인된 물질을 약제로 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 환자의 전혈 샘플로부터 환자-확인된(patient-identified) 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 방법에 관한 것으로, 방법은 a) 상기 환자의 전혈 샘플로부터 RNA를 제공하는 단계; b) RNA를 cDNA로 전환시키는 단계; c) cDNA의 개별적인 분취액(aliquot)을 어레이 상에 위치시켜 cDNA 분취액을 환자 샘플 cDNA 분취액으로 확인하는 단계; d) ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자의 각각의 유전자에 대한 개별적인 cDNA 분취액에서 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 수행하여 어레이 상에 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석 생성물을 제공하고, 이에 의해 3종 이상의 유전자 발현 생성물로 필수적으로 이루어지는, 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 단계를 포함한다. 방법은 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석 생성물을 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다. RT-qPCR 생성물은 cDNA를 3종 이상의 유전자 각각에 대해 특이적인 프라이머 세트와 접촉시킴으로써 제공될 수 있다. 프라이머 세트는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종의 유전자는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명은 환자의 전혈 샘플로부터의 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이에 관한 것으로, 상기 어레이는 환자 샘플 cDNA로 확인된 개별적인 cDNA 분취액을 포함하며, 여기에서 어레이의 3개 이상의 cDNA 분취액 각각은 cDNA 분취액에서 선택된 유전자 발현 생성물을 증폭시키기에 특이적인 RT-qPCR 프라이머 쌍을 포함하고, 여기에서 어레이는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 어레이는 3종 이상의 유전자에 대해 특이적인 RT-qPCR 프로브를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종의 유전자는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명은 환자의 전혈 샘플로부터 정량화된 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 방법에 관한 것으로, 방법은 a) 환자의 전혈 샘플로부터 RNA를 제공하는 단계; b) 상기 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계; c) 상기 cDNA의 분취액을 어레이 상에 위치시켜 cDNA 분취액을 환자 샘플 cDNA 분취액으로 확인하는 단계; 및 d) 상기 cDNA 분취액에서 RT-qPCR, 디지털 PCR, 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 수행하여 어레이 상에 RT-qPCR, 디지털 PCR, 또는 전 전사체 산탄 서열분석 유전자 발현 생성물을 제공하는 단계; 및 e) ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 유전자군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자 중 각각의 선택된 유전자에 대해 유전자 발현 생성물의 양을 정량화하여, 환자의 전혈 샘플로부터 정량화된 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 단계를 포함한다. 방법의 특정 양태에서, 어레이 상의 각각의 선택된 유전자 발현 생성물의 경우, ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 적고; LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 많다. 이 방법의 또 다른 양태에서, 어레이 상의 각각의 선택된 유전자 발현 생성물의 경우, ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 많고; LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 적다. 일부 구현예에서, 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종의 유전자는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명은 정량화된 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이에 관한 것으로, 어레이는 환자의 전혈 샘플의 개별적인 정량화된 유전자 발현 생성물을 포함하고, 정량화된 유전자 발현 생성물은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자의 증폭된 cDNA 생성물로 이루어진다. 일부 구현예에서, 어레이 상의 각각의 선택된 유전자 발현 생성물의 경우, ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 적고; LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 많다. 일부 구현예에서, ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 많고; LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 이 유전자에 대한 대조군보다 적다. 일부 구현예에서, 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종의 유전자는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본원에 사용되는 용어 "어레이(array)" 또는 "패널(panel)"은 실험 조작 과정 중에 개별적인 핵산 구성원의 확인 및 정량화를 가능하게 하는 방식으로, 하나 이상의 용기, 기판 또는 고체 지지체에 함유되거나 부착되는 핵산 분자의 풀(pool)을 의미하는 것으로 정의된다. 용기, 기판 또는 고체 지지체의 비제한적인 예로는 일련의 반응 튜브, 마이크로어레이, 멀티웰 플레이트(예를 들어, 16-웰, 32-웰, 48-웰, 96-웰, 384-웰 및 1536-웰 플레이트), 미세유체역학 장치(microfluidic devices) 및 당업계에 잘 알려져 있는 다른 용기, 기판 또는 고체 지지체를 포함한다.
본원에 사용되는 "환자-확인된(patient-identified)"은 개별적인 환자로부터 나오거나(come from), 비롯되거나(originated from) 유래된(derived from) 것으로 표시되거나(marked), 표지되거나(labeled), 부호화되거나(coded) 달리 나타내어지는 것을 의미하는 것으로 정의된다. 비제한적인 예로는 환자의 이름, 환자의 사회 보장 번호, 바코드, 환자 번호, 부호, 상징 또는 기타 적합한 고유한 식별자(identifier)를 포함한다.
본원에 사용되는 "유전자 발현 생성물(gene expression product)"은 특정 유전자의 전사로부터 생성된 핵산을 의미하는 것으로 정의된다. 유전자 발현 생성물의 비제한적인 예로는 mRNA 전사체, 상기 mRNA로부터 생성되거나 유래된 cDNA 및 cDNA 단편, 상기 mRNA 또는 상기 cDNA 및 cDNA 단편으로부터 생성되거나 유래된 DNA 또는 DNA 단편을 포함한다. 유전자 발현 생성물의 비제한적인 예로는 mRNA, 역전사를 통해 상기 mRNA로부터 생성된 cDNA 및 이의 cDNA 단편 및 중합효소 연쇄 반응(amplification using polymerase chain reaction, PCR), 연결효소 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR) 및 기타 당업계에 잘 알려져 있는 핵산 증폭 기술을 사용한 증폭을 통해 생산된 상기 mRNA, cDNA 또는 이의 cDNA 단편으로부터 생성되거나 유래된 DNA를 포함한다.
본원에 사용되는 "필수적으로 이루어지는(consisting essentially)"은 청구된 방법, 분석 또는 생성물의 결과, 성과, 또는 판독치(read-out)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 기타 요소 또는 생성물을 선택적으로 포함하는 것을 의미하는 것으로 정의된다.
본원에 사용되는 "정량화된(quantified)"은 환자로부터 수득된 샘플의 유전자 발현 생성물의 결정된 양을 의미하는 것으로 정의된다. 환자로부터 유래되거나 환자로부터 수득된 샘플에 존재하는 유전자 발현 생성물의 양을 결정하는 비제한적인 적합한 방법으로는 RT-qPCR, 디지털 PCR, 전 전사체 산탄 서열분석, 직접 다중화 유전자 발현 분석 및 기타 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 포함한다.
본원에 사용되는 "프라이머 쌍(primer pair)"은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 특정 cDNA 또는 DNA 서열, 또는 이의 단편을 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 두 개의 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로 정의된다.
본원에 사용되는 "프라이머 세트(primer set)"는 PCR을 통해 1종 이상의 특정 cDNA 또는 DNA 서열, 또는 이의 단편을 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 프라이머 쌍을 의미하는 것으로 정의된다.
본원에 사용되는 "중증의 질병 경과(severe disease course)"는 IBD 플레어(flare) 사이의 비교적 짧은 기간 및/또는 시간 경과에 따른 IBD 질병 플레어의 증가된 비율을 갖는 IBD 환자의 제시를 의미하는 것으로 정의된다. IBD 플레어는 5 초과의 하비 브래드쇼(Harvey Bradshaw)(질병 활성도) 지수; 및 (i) 10 mg/L 초과의 C 반응성 단백질(C Reactive Protein, CRP) 수준, (ii) 200 μg/g 초과의 칼프로텍틴(calprotectin) 수준, 또는 (iii) 질병 활성도의 내시경적 증거(endoscopic evidence)를 특징으로 한다.
본원에 사용되는 "경도의 질병 경과(mild disease course)"는 IBD 플레어 사이의 비교적 긴 기간 및/또는 시간 경과에 따라 증가하지 않는 IBD 질병 플레어의 비율을 갖는 IBD 환자의 제시를 의미하는 것으로 정의된다. IBD 플레어는 5 초과의 하비 브래드쇼(질병 활성도) 지수; 및 (i) 10 mg/L 초과의 C 반응성 단백질 수준, (ii) 200 μg/g 초과의 칼프로텍틴 수준, 또는 (iii) 질병 활성도의 내시경적 증거를 특징으로 한다.
고위험(IBD1) 표현형을 가져 IBD 진행 위험이 높은 개체는 저위험 IBD2 표현형을 갖는 개체에서의 유전자 발현 수준에 비해, 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현을 특징으로 한다.
마찬가지로, 저위험(IBD2) 표현형을 가져 IBD 진행 위험이 낮은 개체는 고위험 IBD1 표현형을 갖는 개체에서의 유전자 발현 수준에 비해, 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 하향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 상향 조절된 발현을 특징으로 한다.
유전자의 상향 조절된 발현 또는 하향 조절된 발현은 각각 현저하게(significantly) 상향 조절된 또는 현저하게 하향 조절된, 상기 유전자의 발현 수준을 지칭할 수 있다. 개체가 유전자의 상향 조절된 또는 하향 조절된 발현 수준을 갖는지는 임의의 편리한 수단에 의해 결정될 수 있고, 많은 적합한 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 본원에 기술된다.
대부분의 바이오마커의 경우와 마찬가지로, 예측의 정확도는 절대적이지 않을 수 있다. 따라서, 개체는 IBD 진행 위험이 높거나 낮은 것으로 분류된다. 이 위험은 여러 가지 방식으로 표현될 수 있다.
예를 들어, 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지는 위험률(hazard rate)로 표현될 수 있다. 여기서 위험률은 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는 개체에서의 IBD 진행의 순간 확률(instantaneous probability)을 말한다. 대안적으로, IBD 진행의 위험은 위험률(HR)로 표현될 수 있으며, 여기서 위험률은 저위험(IBD2) 표현형을 가진 개체와 관련하여 고위험(IBD1) 표현형을 갖는 개체에서 발생하는 IBD 진행의 확률을 기술한다.
본 발명자들은 고위험(IBD1) 표현형을 가진 개체가 저위험(IBD2) 표현형을 가진 개체에 비해 IBD 진행 확률과 관련하여 3.52의 위험률을 가졌음을 보여주었다(실시예 3 및 도 3을 참조).
따라서, 바람직한 구현예에서, IBD 진행 위험이 높은 개체는 IBD 진행 위험이 낮은 개체의 위험률보다 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배 또는 적어도 3.5배 높은 IBD 진행에 관한 위험률을 가질 수 있다. 마찬가지로, IBD 진행 위험이 낮은 개체는 IBD 진행 위험이 높은 개체의 위험률보다 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배 또는 적어도 3.5배 낮은 IBD 진행에 관한 위험률을 가질 수 있다. 따라서, IBD 진행 위험이 높은 개체는 IBD 진행 위험이 낮은 개체에 비해 적어도 2, 적어도 2.5, 적어도 3 또는 적어도 3.5의 IBD 진행에 관한 위험률을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, IBD 진행 위험이 높은 개체는 IBD 진행 위험이 낮은 개체의 위험률보다 적어도 3.5배 높은 IBD 진행에 관한 위험률을 가지고, 즉 IBD 진행 위험이 낮은 개체에 비해 적어도 3.5의 IBD 진행에 관한 위험률을 가지고, IBD 진행 위험이 낮은 개체는 IBD 진행 위험이 높은 개체의 위험률보다 적어도 3.5배 낮은 IBD 진행에 관한 위험률을 갖는다.
대안적으로, IBD 진행 위험이 높은 개체는 IBD 진행 위험이 낮은 개체보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.1배, 적어도 3.2배, 적어도 3.3배, 적어도 3.4배 또는 적어도 3.5배 IBD 진행을 경험할 가능성이 높다. 마찬가지로, IBD 진행 위험이 낮은 개체는 IBD 진행 위험이 높은 개체보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3배, 적어도 3.1배, 적어도 3.2배, 적어도 3.3배, 적어도 3.4배 또는 적어도 3.5배 IBD 진행을 경험할 가능성이 낮다. IBD 진행 가능성은 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년의 기간에 걸친 IBD 진행 가능성을 지칭할 수 있다.
따라서, IBD 진행 위험이 높은 개체는 IBD 진행 위험이 낮은 개체보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340% 또는 적어도 350% 높은 IBD 진행 확률을 가질 수 있다. 마찬가지로, IBD 진행 위험이 낮은 개체는 IBD 진행 위험이 높은 개체보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340% 또는 적어도 350% 낮은 IBD 진행 확률을 가질 수 있다. IBD 진행 확률은 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년의 기간에 걸친 IBD 진행 확률을 지칭할 수 있다.
개체로부터 수득된 샘플(즉, 시험 샘플)에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정함으로써, 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는지(또는 본원에서는 IBD 진행 위험 점수라 지칭됨)를 확립하는 데 사용될 수 있는 많은 적합한 방법이 있으며, 여기에서 샘플은 바람직하게는 전혈 샘플이다.
예를 들어, 개체로부터 수득된 샘플에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준은 해당 유전자의 발현을 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형과 연결시키는 데이터 수집(collection)과 비교될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 개체로부터 수득된 샘플에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준은 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는 것으로 알려져 있는 개체들로부터 수득된 해당 유전자에 대한 발현 데이터와 비교되며, 상기 비교로부터 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지가 평가된다. 비교는 선형 회귀 모델을 사용할 수 있다.
대안적으로, 개체로부터 수득된 샘플에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준은 IBD를 앓고 있는 것으로 알려져 있는 개체들로부터 수득된 해당 유전자에 대한 유전자 발현 데이터를 기초로 한 컴퓨터 모델 및 적합한 기계 학습 기법(machine learning technique)(예컨대, 로지스틱 회귀(logistic regression), 서포트 벡터 기계(support vector machines) 또는 의사결정 계통도 기반 방법(decision tree-based methods))의 사용을 통해, 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 가지는지를 확립하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 모델은 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는 것으로 알려져 있는 개체들로부터 수득된 해당 유전자에 대한 유전자 발현 데이터를 기반으로 할 수 있다. 대안적으로, 컴퓨터 모델은 IBD를 앓고 있는 것으로 알려져 있으며 IBD 진행을 경험한 적이 있거나 경험한 적이 없는 것으로 알려져 있는 개체들로부터 수득된 해당 유전자에 대한 유전자 발현 데이터를 기반으로 할 수 있다.
추가적인 예에서, 샘플, 바람직하게는 개체로부터 수득된 전혈 샘플(즉, 시험 샘플)에서, ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준은 각각의 해당 유전자에 대한 임계 수준(threshold level)과 비교될 수 있다. 유전자에 대한 적합한 임계 수준은 환자를 별개의 예후 하위군 IBD1 및 IBD2로 최대한 분리할 수 있게 하는 최적의 발현 임계치를 확립하기 위하여, 예를 들어 qPCR 발현 데이터 및 기계 학습 방법(예컨대, 로지스틱 회귀, 서포트 벡터 기계, 또는 의사결정 계통도 기반 방법)을 사용하여 결정될 수 있다. 따라서, ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 해당 유전자 각각에 대한 임계 수준과 비교하면 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는지를 나타낼 수 있다.
대안적으로, 개체군으로부터 수득된 샘플에서 해당 유전자(즉, ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자) 각각의 중앙값(median) 발현 수준은 대조군 값으로 사용될 수 있고, 여기에서 군은 IBD 진행을 나타내지 않은 개체들, 바람직하게는 적어도 100명, 적어도 50명 또는 적어도 10명의 개체들로 이루어져 있다. 이 경우, 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, 또는 GZMK의 중앙값 초과의 발현 수준 또는 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96, 또는 TRGV3의 중앙값 미만의 발현 수준은 고위험(IBD1) 표현형의 존재를 나타낼 수 있는 반면, 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, 또는 GZMK의 중앙값 이하의 발현 수준 또는 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96, 또는 TRGV3의 중앙값 이상의 발현 수준은 저위험(IBD2) 표현형의 존재를 나타낼 수 있다.
추가적인 대안으로서, 개체군, 바람직하게는 적어도 100명, 적어도 50명 또는 적어도 10명의 개체들로부터 수득된 샘플에서 해당 유전자 각각의 중앙값 발현 수준은 대조군으로서 사용될 수 있고, 여기에서 개체군은 IBD 진행을 나타낸 개체로 이루어져 있다. 이 경우, 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 또는 GZMK의 중앙값 이상의 발현 수준 또는 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96, 또는 TRGV3의 중앙값 이하의 발현 수준은 고위험(IBD1) 표현형의 존재를 나타낼 수 있는 반면, 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 또는 GZMK의 중앙값 미만의 발현 수준 또는 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96, 또는 TRGV3의 중앙값 초과의 발현 수준은 저위험(IBD2) 표현형의 존재를 나타낼 수 있다.
또한, 추가적인 대안으로서, 개체군, 바람직하게는 적어도 100명, 적어도 50명 또는 적어도 10명의 개체들로부터 수득된 샘플에서의 해당 유전자 각각의 중앙값 발현 수준은 대조군으로서 사용될 수 있고, 여기에서 개체군은 IBD 진행을 나타내거나 나타내지 않은 개체들로 이루어져 있다. 바람직하게는, 개체군은 IBD 진행을 나타내거나 나타내지 않은 개체를 동일한 수로, 또는 필수적으로 동일한 수로 포함한다. 이 경우, 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, 또는 GZMK의 중앙값 초과의 발현 수준 또는 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96, 또는 TRGV3의 중앙값 미만의 발현 수준은 고위험(IBD1) 표현형의 존재를 나타낼 수 있는 반면, 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 또는 GZMK의 중앙값 미만의 발현 수준 또는 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 또는 TRGV3의 중앙값 초과의 발현 수준은 저위험(IBD2) 표현형의 존재를 나타낼 수 있다.
유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 발현 수준은 임의의 편리한 수단에 의해 결정될 수 있고, 많은 적합한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 기술로는 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR), 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석(RNA-SEQ), 직접 다중화 유전자 발현 분석, 효소 결합 면역 흡착 측정법(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA), 단백질 칩, 유세포 분석법(예컨대, RNA에 대한 Flow-FISH, FlowRNA라고도 지칭됨), 질량 분광분석법, 웨스턴 블롯팅 및 노던 블롯팅을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 개체로부터 수득된 전혈 샘플을 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자들의 발현 수준을 결정하기에 적합한 시약, 예를 들어 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석, 직접 다중화 유전자 발현 분석, ELISA, 단백질 칩, 유세포 분석법, 질량 분광분석법 또는 웨스턴 블롯팅을 사용하여 상기 유전자 중 2종 이상의 발현 수준을 결정하기에 적합한 시약과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시약은 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 사용하여 상기 유전자 중 1종 이상의 발현 수준을 결정하기에 적합한 핵산 프라이머 쌍 또는 쌍들일 수 있다. 대안적으로, 시약은 ELISA 또는 웨스턴 블롯팅을 사용하여 상기 1종 이상 유전자의 발현 수준을 결정하기에 적합한 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자의 발현 수준은 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석을 사용하여 결정된다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자의 발현 수준은 RT-qPCR을 사용하여 결정된다.
RT-qPCR은 표적 DNA 분자의 증폭 및 동시 정량화를 가능하게 한다. RT-qPCR을 사용하여 유전자 발현 수준을 분석하기 위하여, 전혈 샘플의 총 mRNA는 먼저 단리되어 역전사효소를 사용하여 cDNA로 역번역될 수 있다. 예를 들어, mRNA 수준은 예들 들어, 제조사의 설명서에 따라 ABI PRISM 7900HT 기기의 Taqman Gene Expression Assays(Applied Biosystems)을 사용하여 결정될 수 있다. 그런 다음, 표준곡선과의 비교에 의해 전사체의 존재량(transcript abundance)이 산출될 수 있다.
디지털 PCR은 절대적 정량화 및 희귀한 대립 형질(allele)의 검출을 위한 종래의 실시간 정량적 PCR에 대한 대안적인 방법을 제공하는 핵산 검출 및 정량화의 새로운 접근법이다. 디지털 PCR은 DNA 또는 cDNA의 샘플을 다수의 개별적인, 평행한(parallel) PCR 반응으로 분배함으로써 작용하며; 이들 반응 중 일부는 표적 분자(양성)를 함유하는 반면, 다른 것들은 그렇지 않다(음성). 단일 분자는 100만 배 이상 증폭될 수 있다. 증폭하는 동안, 염료로 표지된 프로브를 사용하는 TaqMan® 화학을 사용하여 서열 특이적인 표적을 검출한다. 표적 서열이 존재하지 않을 경우, 신호는 축적되지 않는다. PCR 분석 후, 음성 반응물의 분획은 표준물질 또는 내인성(endogenous) 대조군의 필요 없이 샘플 내의 표적 분자의 수의 절대적 수치(absolute count)를 생성하는 데 사용된다. 나노유체 칩의 사용은 수천 가지의 PCR 반응을 병렬로 실행하기에 편리하고 간단한 메커니즘을 제공한다. 각 웰에 샘플, 마스터 혼합물(master mix) 및 TaqMan® 분석 시약의 혼합물을 로딩하고, 개별적으로 분석하여 종점 신호(endpoint signal)의 존재(양성) 또는 부재(음성)를 검출한다. 표적 서열의 하나의 초과의 분자를 수용할 수 있는 웰의 소재를 확인(account for)하기 위하여, 보정 계수(correction factor)가 프와송(Poisson) 모델을 사용하여 적용된다.
RNA-SEQ는 주어진 시간 내에 생물학적 샘플에서 RNA의 검출 및 정량화를 위한 차세대 서열분석(next generation sequencing, NGS)을 사용한다. RNA 라이브러리가 제조되고, 전사되고, 단편화되고, 서열분석되고, 재조립되어, 서열 또는 관심 서열이 정량화된다.
나노스트링(nanostring) 기술은 많은 다른 유형의 표적 핵산 분자에 직접 혼성화될 수 있는 독특한 색깔로 부호화된 분자 바코드를 사용하며, qPCR에 필적하는 민감도로 최대 800종의 유전자의 발현 수준을 동시에 분석하는 비용 효율적인 방법을 제공한다.
RNA에 대한 Flow-FISH는 유세포 분석법을 활용하여, 형광 태그된 RNA 올리고를 사용하여 샘플 내 표적 mRNA의 존재량(abundance)을 결정한다. 이 기술은 예를 들어, 문헌[Porichis et al., Nat Comm (2014) 5:5641]에 기술되어 있다. 이 기술의 장점은 샘플에 존재하는 세포를 분리할 필요가 없이 사용될 수 있다는 점이다.
마이크로어레이는 비교되는 두 샘플에서 유전자 발현을 가능하게 한다. 예를 들어, 트리졸(trizol) 또는 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 예를 들어, PBMC 또는 전혈로부터 총 RNA가 먼저 단리된다. 그런 다음, 단리된 총 RNA는 역전사 효소 및 폴리T 프라이머를 사용하여 이중 가닥 cDNA로 역전사되고, Cy3- 또는 Cy5-dCTP를 사용하여 표지된다. 그런 다음, 적절한 Cy3- 및 Cy5-표지된 샘플을 모으고, 문헌[Willcocks et al., J Exp Med 205, 1573-82, 2008]에 기술된 마이크로어레이와 같은 적합한 유전자 및 대조군 특징을 나타내는 프로브로 구성된 맞춤형 스팟팅된 올리고뉴클레오티드(custum spotted oligonucleotide) 마이크로어레이에 혼성화시킨다. 모여진 PBMC 또는 전혈 샘플로부터 유래된 공통 참조(common reference) RNA에 대해, 염료-교체(dye-swap) 전략을 사용하여, 샘플은 2반복으로(in duplicate) 혼성화될 수 있다. 혼성화 후, 어레이를 세척하고, 예를 들어 애질런트(Agilent) G2565B 스캐너로 스캔한다. 상기 기술된 단계에 대하여 적합한 대안은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에게 자명할 것이다. 그 후, 수득된 원시(raw) 마이크로어레이 데이터를 적합한 방법을 사용하여 분석하여, 해당될 경우 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 상대적인 발현을 결정할 수 있다.
효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)은 샘플에 존재하는 단백질의 상대적인 양이 검출될 수 있게 한다. 샘플은 먼저 폴리스티렌 미세역가 플레이트와 같은 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 관심 단백질에 특이적인 항체를 통해 고정된다. 고정 후, 항원은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 검출된다. 표적 단백질 검출에 사용되는 1차 항체는 검출 가능하도록 표지될 수 있으며, 1치 항체는 적절하게 표지된 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 항체를 리포터 효소에 접합시킴으로써 표지될 수 있다. 이 경우, 플레이트는 적합한 효소 기질을 첨가하여 가시적인 신호를 생성시킴으로써 발현된다. 신호의 세기는 샘플에 존재하는 표적 단백질의 양에 의존한다.
단백질 어레이 또는 단백질 마이크로어레이라고도 지칭되는 단백질 칩은 샘플에 존재하는 단백질의 상대적인 양이 검출될 수 있게 한다. 서로 다른 포획 분자가 칩에 부착될 수 있다. 예로는 항체, 항원, 효소 기질, 뉴클레오티드 및 기타 단백질을 포함한다. 또한, 단백질 칩은 다양한 단백질에 결합하는 분자를 함유할 수 있다. 단백질 칩은 당업계에 잘 알려져 있으며, 여러 가지 상이한 단백질 칩이 상업적으로 입수 가능하다.
웨스턴 블롯팅 또한 샘플에 존재하는 단백질의 상대적인 양이 결정될 수 있게 한다. 샘플에 존재하는 단백질은 먼저 겔 전기영동을 사용하여 분리된다. 그런 다음, 단백질은 막, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막으로 옮겨지고, 표적 단백질에 특이적인 단일클론 또는 다클론 항체를 사용하여 검출된다. 여러 상이한 항체가 상업적으로 입수 가능하며, 주어진 표적 단백질에 대한 항체의 제조 방법 또한 당업계에 잘 확립되어 있다. 검출을 가능하게 하기 위하여, 관심 단백질(들)에 특이적인 항체 또는 적합한 2차 항체는 예를 들어, 리포터 효소에 연결될 수 있으며, 이는 적절한 기질에 노출될 때 비색 반응(colorimetric reaction)을 일으키게 하여 색을 발생시킨다. 다른 리포터 효소로는 고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)를 포함하며, 이는 적절한 기질과 함께 제공될 때 화학발광을 생성한다. 또한, 항체는 적합한 방사성 또는 형광 표지로 표지될 수 있다. 사용되는 표지에 따라, 단백질 수준은 밀도계측법, 분광광도법, 사진 필름, X선 필름 또는 광센서를 사용하여 결정될 수 있다.
유세포 분석법은 대상체로부터 수득된, 예를 들어 PBMC 또는 전혈 샘플에 존재하는 단백질의 상대적인 양이 결정될 수 있게 한다. 유세포 분석법 또한, 세포 표면의 관심 단백질의 발현 수준을 검출 또는 측정하는 데 사용될 수 있다. 유세포 분석법을 사용하는 단백질 및 세포의 검출은 보통 관심 단백질 또는 세포에 형광 표지를 먼저 부착시키는 것을 수반한다. 형광 표지는 예를 들어, 관심 단백질 또는 세포에 특이적인 형광 표지된 항체일 수 있다. 여러 상이한 항체가 상업적으로 입수 가능하며, 관심 단백질에 특이적인 항체의 제조 방법 또한 당업계에 잘 확립되어 있다.
질량 분광분석법, 예를 들어 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 질량 분광분석법은, 예를 들어 펩티드 질량 핑거 프린팅을 사용하여 개체로부터 수득된 샘플에 존재하는 단백질의 확인을 가능하게 한다. 질량 분광분석법 전에, 샘플에 존재하는 단백질은 겔 전기영동, 예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 또는 2차원 겔 전기영동을 사용하여 단리될 수 있다.
또한, 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는지를 평가하는 데 사용하기 위한 키트, 또는 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형이 개체로부터 수득된 전혈 샘플에 존재하는지를 평가하기 위한 키트가 개시된다. 키트는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 이들 유전자에 대한 NCBI 등록번호(및 GI 번호)는 표 2에 서술되어 있다. 키트는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상, 13종 이상, 14종 이상, 15종 이상 또는 16종 모두의 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 중 적어도 5종의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 키트는 IL18RAP 및 TRGC2의 발현 수준을 확립하기 위한 시약, 및 선택적으로 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상, 13종 이상 또는 14종 모두의 유전자의 발현 수준을 확인하기 위한 시약을 포함한다.
추가적인 바람직한 구현예에서, 키트는 IL18RAP, TRGC2 및 TRGV3의 발현 수준을 확인하기 위한 시약, 및 선택적으로 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136 및 LY96으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상 또는 13종 모두의 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함한다.
예를 들어, 시약은 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석과 같은, 본원에 기술된 임의의 기술을 사용하여 해당 유전자의 발현을 확립하기에 적합한 시약일 수 있다. 예를 들어, 키트는 예를 들어, RT-qPCR, 디지털 PCR, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석을 사용하여 해당 유전자의 발현 수준을 확립하기에 적합한 프라이머를 포함할 수 있다. 적합한 프라이머의 설계는 통상적이며, 충분히 당업자의 능력 내에 있다. 직접 다중화 유전자 발현 분석을 위한 키트는 부가적으로 또는 대안적으로 해당 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 형광 프로브를 포함할 수 있다.
검출 시약 이외에도, 키트는 RNA 추출 시약 및/또는 RNA의 cDNA로의 역전사를 위한 시약도 포함할 수 있다.
키트는 또한 완충 용액과 같은, 방법의 수행을 위한 하나 이상의 물품 및/또는 시약, 및/또는 시험 샘플 그 자체를 수득하기 위한 수단, 예를 들어 샘플을 수득 및/또는 단리하기 위한 수단 및 샘플 취급 용기를 포함할 수 있다(이러한 구성요소는 일반적으로 멸균 상태임). 키트는 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는지 또는 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형이 전혈 샘플에 존재하는지를 평가하기 위한 방법에서 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 주요 장점은 본 발명자들에 의해 확인된 유전자의 발현 수준이 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 갖는지를 평가하기 위하여 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 결정될 수 있다는 점이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 언급되는 샘플은 바람직하게는 전혈 샘플이다. 용어 전혈 샘플, 말초 혈액 샘플 및 말초 전혈 샘플은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 전혈 샘플은 모든 혈액 성분이 있는 개체로부터 수득된 혈액, 예를 들어 말초 혈액의 샘플을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용되는 용어 "전혈 샘플(whole blood sample)"은 선행 기술의 방법에서 사용되는 바와 같이, 전혈로부터 단리된 특정 혈액 세포 유형(들), 예컨대 단리된 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 단리된 T 세포, 예컨대 단리된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 샘플을 포함하지 않는다. 전혈 샘플은 세포 용해 및/또는 전혈 샘플에서 RNA 분해를 억제하기 위한 1종 이상의 효소 억제제의 첨가와 같은 샘플 수집 후 처리를 받을 수 있다.
본 발명은 개체로부터 수득된 (예를 들어, PBMC 샘플이 아닌) 전혈 샘플에서 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정함으로써 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 방법에 관한 것이지만, 개체로부터 수득된 PBMC 샘플에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 것도 마찬가지로 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 데 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 그러나 이는 청구되지 않는다.
용어 "개체(individual)"는 인간 개체를 지칭한다. 개체는 또한 환자, 즉 인간 환자로 지칭될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 개체는 IBD를 앓는다. 바람직하게는, 개체는 IBD로 진단되었다. IBD는 중증 증상(플레어 업(flare-up)) 기간과 관해 기간을 특징으로 하므로, 개체는 IBD의 플레어-업을 경험하고 있거나 IBD로부터의 관해 상태일 수 있다.
IBD는 소화관의 염증을 특징으로 하는 상태의 집단을 지칭한다. IBD의 증상으로는 복통, 재발성 또는 혈성 설사, 식욕부진 및 체중 감소, 권태 및 피로뿐만 아니라 빈혈 또한 포함한다. IBD의 두 가지 주요 유형은 궤양성 대장염(UC)과 크론병(CD)이다. 다른 유형으로는 콜라겐성 결장염과 림프구성 결장염을 포함한다. UC와 크론병은 영국에서만 30만 명이 넘는 사람들에게 영향을 미친다. 궤양성 대장염은 주로 결장과 직장에 영향을 미치는 반면, 크론병은 소장과 대장에 영향을 미치고, 또한 입, 식도, 위 및 항문에도 영향을 미칠 수 있다. UC와 크론병은 중증 증상(질병 플레어-업) 기간과 관해 기간을 특징으로 하는 만성적인 상태이다. 어느 질병에도 치료법은 없으나, 항염증요법과 면역억제요법뿐만 아니라 수술을 포함한 치료법을 이용할 수 있다.
"IBD 진행(IBD progression)"은 개체에서 질병의 최초 발병(presentation) 후 IBD의 진행을 지칭한다. UC와 크론병을 비롯한 IBD는 질병의 재발(relapse)을 특징으로 한다. 이러한 재발은 플레어-업(flare-up)이라고도 지칭된다. 따라서, IBD 진행은 질병의 최초 발병 후, IBD의 재발 또는 플레어-업을 지칭할 수 있다. 특히, IBD 진행은 질병의 최초 발병 후, IBD의 높은 빈도의 재발 또는 플레어-업을 지칭할 수 있다. 본 발명자들은 실시예 3에서 각각 IBD1 및 IBD2 하위군에 속하는 것으로 확인된 개체가 질병의 최초 발병 후 12개월의 기간에 걸쳐 IBD의 평균 0.66회 및 0.34회의 재발 또는 플레어-업을 보임을 발견하였다. 따라서, 높은 빈도의 재발 또는 플레어-업은 질병의 최초 발병 후 12개월의 기간에 걸친 또는 질병의 최초 발병 12개월 이내의, 평균 0.5회 이상 또는 0.6회 이상, 바람직하게는 평균 0.6회 이상의 재발 또는 플레어-업을 지칭할 수 있다. 재발 또는 플레어-업은 증가된 치료, 예를 들어 증가된 면역억제요법 또는 항염증요법 또는 수술을 요하는 이벤트(event)일 수 있다. 이러한 증가된 치료에 대한 요구는 치료의 단계적 강화로도 지칭될 수 있다. 재발 또는 플레어-업은 치료되지 않은 채로 두거나 불충분하게 치료될 경우, 장 손상 또는 파괴를 초래할 수 있다. 따라서, IBD 진행의 고위험은 개체가 최초 발병 후 질병의 재발 또는 플레어-업을 경험할 높은 위험, 특히 개체가 질병의 최초 발병 후 12개월의 기간에 걸쳐 평균 0.6회 이상의 질병의 재발 또는 플레어-업을 경험할 높은 위험을 지칭할 수 있는 반면, IBD 진행의 저위험은 개체가 최초 발병 후 질병의 재발 또는 플레어-업을 경험할 낮은 위험, 특히 개체가 질병의 최초 발병 후 12개월의 기간에 걸쳐 평균 0.6회 이상의 질병의 재발 또는 플레어-업을 경험할 낮은 위험을 지칭할 수 있다.
질병의 재발 또는 플레어-업의 진단은 숙련된 의사의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 개체에서 IBD의 재발 또는 플레어-업은 5 초과의 하비 브래드쇼(질병 활성도) 지수; 및 (i) 10 mg/L 초과의 C 반응성 단백질(CRP) 수준, (ii) 200 μg/g 초과의 칼프로텍틴 수준 또는 (iii) 질병 활성도의 내시경적 증거; 및 이전에 질병의 플레어-업 이후에 관해를 달성한 개체를 특징으로 할 수 있다. CRP는 간에 의해 생성된 염증의 혈중 마커이다. 염증성 이벤트가 일어나는 동안 수준이 상승한다. CRP 수준은 대개 개체로부터 수득된 혈액 샘플에서 측정되고, 칼프로텍틴 수준은 대개 대변 샘플에서 측정된다.
하비 브래드쇼(질병 활성도) 지수는 보통 다음의 파라미터를 측정한다:
(i) 일반적인 웰빙(0 = 매우 좋음, 1 = 평균보다 약간 아래, 2 = 좋지 못함, 3 = 매우 좋지 못함, 4 = 형편없음)
(ii) 복통(0 = 없음, 1 = 경도, 2 = 중등도, 3 = 중증)
(iii) 1일 점액 대변(liquid stool) 횟수
(iv) 복부 종괴(0 = 없음, 1 = 의심형(duious), 2 = 확정형(definite), 3 = 압통형(tender))
(v) 합병증의 존재(존재하는 각 합병증에 대해 1점): 관절통(arthralgia), 포도막염(uveitis), 결절 홍반(erythema nodosum), 아프타 궤양(aphthous ulcer), 괴저성 농피증(Pyoderma gangrenosum), 항문 열창(anal fissure), 신생 누공(new fistula), 농양(abscess)
5 초과의 하비 브래드쇼 지수 점수는 경도 내지 중증 질병의 존재를 나타낸다.
IBD에 대해 공지된 치료법에는 항염증요법, 면역억제요법 및 수술이 포함된다. 항염증요법의 예로는 스테로이드(예컨대, 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론, 또는 부데소니드) 및/또는 메살라진 치료가 포함된다. 면역억제요법의 예로는 TNFα 억제제(예컨대, 인플릭시맙), 아자티오프린, 메토트렉세이트 및/또는 6-머캅토퓨린 치료가 포함된다.
치료는 질병을 관리하기 위한 진행중인(ongoing) 질병의 치료(유지요법(maintenance therapy)이라고도 지칭됨)뿐만 아니라, 질병의 재발 또는 플레어-업의 치료를 지칭할 수 있다.
표준 "스텝-업(step-up)" 치료는 진행중인 질병의 플레어-업 또는 질병의 초기 치료에 대한 반응의 실패에 대한 대응으로만 치료법을 단계적으로 강화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 질병의 최초 플레어-업(진단이 이루어지는 시점)은 프레드니솔론과 같은 항염증 스테로이드 또는 메살라진과 같은 항염증제(예를 들어, UC에서)로 치료되지만, 유지요법은 시작되지 않을 것이다. 이후에 플레어-업이 발생하면 이 치료는 반복되고, 그 후 유지요법이 추가될 것이다(예를 들어, 아자티오프린, 메토트렉세이트 또는 6-머캅토퓨린을 이용한 치료). 이러한 유지요법에도 불구하고 질병의 플레어-업이 계속될 경우, TNFα 억제제(인플릭시맙 또는 아달리무맙) 치료와 같은 더욱 강력한 유지요법이 추가된다. 이 치료 전략은 불충분하게 통제된 질병에 대응하여 치료법을 단계적으로 강화하는 것만으로 과잉치료를 방지하지만, 궁극적으로는 질병을 통제하는데 효과적이지 않은 치료가 시도되므로, 더욱 진행성인 질병을 가진 환자를 실질적인 질병 관련 합병증에 노출시킬 위험이 있다.
이미 앞서 설명한 바와 같이, IBD에서 공격적인 치료법의 조기 도입은 표준 스텝-업 접근법과 비교하여, 보다 우수한 결과를 가져온다는 점이 밝혀졌다. 구체적으로, 활동성 크론병을 앓고 있는 대부분의 환자는 초기에 코르티코스테로이드 치료를 받는다. 이 접근법은 일반적으로 증상을 조절하지만, 많은 환자가 코르티코스테로이드에 내성을 나타내거나 의존하게 되며, 장기적인 코르티코스테로이드 노출은 사망 위험 증가와 관련이 있다. 인플릭시맙 및 아자티오프린을 사용한 병용 면역억제요법의 조기 사용을 기존의 질병 관리와 비교한 결과, 최근에 크론병 진단을 받았던 환자에서 면역억제요법을 병용하면 관해를 유도하고 코르티코스테로이드 사용을 감소시키는 데 있어서 기존의 질병 관리보다 훨씬 효과적이었다. 따라서, 질병의 경과에 있어서 조기에 보다 집중적인 치료를 개시하면 IBD 환자에게 더 나은 결과를 가져올 수 있다(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010). 특히, 조기 병용 면역억제요법(D’Haens et al., 2008)으로 치료받은 크론병 환자는 더욱 장기간의 탈-스테로이드 관해를 경험하고, 점막 치유를 달성할 가능성이 높으며, 궁극적으로는 외과적 절제를 피할 가능성이 높다(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010). 그러나 일부 환자는 기존의 코르티코스테로이드 치료로도 장기간의 관해를 달성했을 것이므로 이 전략이 모든 크론병 환자에게 적합한 것은 아니며(Jess et al., 2007), 따라서 병용 면역억제요법으로의 치료는 환자를 불필요한 부작용 및 독성에 노출시킬 것이다.
본 발명자들에 의해 확인된 전혈 유전자 분류기(classifier)는 크론병 및 궤양성 대장염을 비롯한 IBD에서의 질병 경과를 예측한다. 구체적으로, (IBD2군의 환자와 비교하여) IBD1 하위군의 환자는 실질적으로 더 높은 질병의 재발 또는 플레어-업 발생률(incidence)을 나타내어, 더 이른 치료의 단계적 강화의 필요성뿐만 아니라 치료 후(follow up) 단위시간당 더 많은 단계적 치료의 단계적 강화를 초래한다. 질병의 이러한 재발 또는 플레어-업 패턴은 적지 않은 사망률과 관련이 있으며, 따라서 IBD1 하위군의 환자는 TNFα 억제제의 사용과 같은 조기의 공격적인 치료법으로부터 이익을 볼 가능성이 크다.
따라서, IBD 진행 위험이 높은 것으로 확인된 환자는 질병 경과에서 조기에 정상적으로 투여되는 것보다 더욱 공격적인 치료법, 예컨대 환자가 진단시 아자티오프린, 메토트렉세이트 또는 6-머캅토퓨린과 함께 인플릭시맙과 같은 TNFα 억제제로 치료되고, 이후의 재발 또는 플레어-업은 프레드니솔론과 같은 항염증 스테로이드의 부가적인 투여, TNFα 억제제의 증가된 투여 또는 예를 들어, 항-인테그린 항체를 이용한 치료로 치료되는 "하향식(top-down)" 접근법으로 치료될 수 있다.
따라서, IBD 진행 위험이 높은 것으로 확인된 개체의 경우, 치료는 더욱 빈번하거나 더욱 공격적인 질병 치료 요법, 또는 IBD의 유지 단계 중에 정상적으로 투여되지 않는 질병 요법으로 치료하는 단계, 또는 이러한 치료 요법 또는 질병 요법으로 치료하기 위한 개체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 더욱 빈번하거나 더욱 공격적인 질병 치료 요법은 IBD의 유지 단계 중에 정상적으로 투여되는 치료제보다 더욱 빈번하거나 더욱 강력한 질병 치료 요법을 지칭할 수 있다. 더욱 공격적인 질병 치료 요법의 예는 예를 들어, 진단시 1종 이상의 면역억제제를 이용한 치료, 예컨대 아자티오프린, 6-머캅토퓨린 또는 메토트렉세이트와 함께 인플릭시맙과 같은 TNFα 억제제를 이용한 치료이다.
IBD 진행 위험이 낮은 것으로 확인된 개체의 경우, 치료는 상기 기술된 표준 스텝-업 치료 접근법으로 치료하는 단계, 또는 이러한 치료 접근법으로 치료하기 위한 개체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 표준 스텝-업 접근법은 이러한 환자의 불필요한 과잉 치료를 방지한다. 따라서, IBD 진행 위험이 낮은 것으로 확인된 개체는 질병의 최초 발병시에 프레드니솔론과 같은 염증 스테로이드 또는 메살라진과 같은 항염증제로 치료될 수 있거나, 이러한 치료법으로의 치료를 위해 선택될 수 있다. 이후의 질병의 재발 또는 플레어-업은 아자티오프린, 메토트렉세이트 또는 6-머캅토퓨린으로의 치료와 같은 유지요법의 투여와 병용하여, 프레드니솔론과 같은 염증 스테로이드 또는 메살라진과 같은 항염증제로 치료될 수 있다. 질병의 추가적인 재발 또는 플레어-업은 유지요법으로서 TNFα 억제제(예컨대, 인플릭시맙 또는 아달리무맙)의 투여와 병용하여, 프레드니솔론과 같은 염증 스테로이드 또는 메살라진과 같은 항염증제로 치료될 수 있다.
본 발명의 방법은 1명 이상의 개체로부터 수득된 전혈 샘플의 사용을 포함하므로, 이는 시험관 내(in vitro) 방법이다.
본 발명은 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는 시험관 내 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 임상 시험과 같은, 개체에서 IBD를 치료할 수 있는 물질을 확인하는 방법에서의 적용을 찾을 것으로 기대된다. 이러한 방법에 사용되는 개체는 IBD 진행의 위험이 높거나 낮을 수 있고, 바람직하게는 IBD 진행의 위험이 높다. IBD 진행의 위험이 높은 개체는 IBD 진행의 위험이 낮은 개체보다 질병의 재발 또는 플레어-업을 더욱 빈번하게 경험할 것으로 예상되므로, 예를 들어 이러한 플레어-업 또는 재발의 빈도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 있어서 추정상의(putative) 치료 효율의 평가를 더욱 용이하게 한다.
개체에서 IBD를 치료할 수 있는 물질을 확인하는 방법, 바람직하게는 시험관 내 방법은 다음을 포함할 수 있다:
(i) 본 발명의 방법을 사용하여 IBD 진행 위험이 높거나 낮은, 바람직하게는 IBD 진행 위험이 높은 개체를 확인하는 단계; 및
(ii) 개체에서의 IBD 진행의 수준을 대조군과 비교하는 단계로서, 여기에서 개체는 관심 물질로 치료를 받은 적이 있는 개체인 단계. 대조군과 비교하여 개체에서 낮은 수준의 IBD 진행은 물질이 IBD를 치료할 수 있음을 나타낸다. 낮은 수준의 IBD 진행은 대조군과 비교하여 IBD의 플레어-업 또는 재발의 빈도 및/또는 중증도의 감소를 지칭할 수 있다. 방법은 상기 방법에서 단계 (i) 이후 및 단계 (ii) 이전에 개체를 관심 물질로 치료를 받게 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 대조군은 관심 물질로 치료된 적이 없으며, 예를 들어 본 발명의 방법을 사용하여 IBD 진행의 위험이 높거나 낮은 것으로 확인된 개체 또는 개체군, 바람직하게는 위험이 높은 것으로 확인된 개체 또는 개체군에서 관찰된 IBD 진행 수준일 수 있다.
따라서, 개체에서 IBD를 치료할 수 있는 물질을 확인하는 방법은 다음을 포함할 수 있다:
(i) 본 발명의 방법을 사용하여 IBD 진행 위험이 높거나 낮은, 바람직하게는 IBD 진행 위험이 높은 제1 개체를 확인하는 단계;
(ii) 본 발명의 방법을 사용하여 IBD 진행 위험이 높거나 낮은, 바람직하게는 IBD 진행 위험이 높은 제2 개체를 확인하는 단계; 및
(iii) 제1 개체에서의 IBD 진행 수준을 제2 개체에서의 IBD 진행 수준과 비교하는 단계로서, 여기에서 제1 개체는 관심 물질로 치료를 받은 적이 있고, 여기에서 제2 개체와 비교하여 제1 개체에서 더 낮은 수준의 IBD 진행은 물질이 IBD를 치료할 수 있음을 나타내는 단계. 방법은 단계 (i) 이후 그러나 단계 (iii) 이전에, 관심 물질로 제1 개체를 치료하는 단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법에서의 적용을 찾을 것으로 기대된다. 이러한 방법에 사용되는 환자는 IBD 진행 위험이 높다. 구체적으로, 본 발명은 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 방법, 바람직하게는 시험관 내 방법을 제공하며, 방법은
(i) 관심 물질을 이용한 치료 전에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플, 및 (ii) 관심 물질을 이용한 치료 후에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플을 제공하는 단계로서, 여기에서 IBD 환자는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 고위험(IBD1) 표현형을 갖는 것으로 결정되는 단계; 및
샘플 (i) 및 (ii)에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
를 포함하며, 여기에서 샘플 (i)에 비해 샘플 (ii)에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 낮은 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 높은 발현은 물질이 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있음을 나타낸다.
IBD 환자에서 IBD를 치료할 수 있거나 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 것으로 확인된 물질은 추가적으로 약제로 제형화될 수 있다. 이 물질 이외에도, 이러한 약제는 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태 및 구현예는 다음의 실험적 예시를 비롯한 본 개시를 고려하면 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 사용되는 "및/또는"은 두 개의 명시된 특징 또는 구성요소 각각은 그 이외의 것과 관계없이 구체적으로 개시된 것으로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 마치 각각이 본원에 개별적으로 기재된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B 각각의 구체적인 개시로 간주된다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기 기재된 특징에 대한 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 구현예에 한정되지 않으며, 기술되는 모든 양태 및 구현예에 동일하게 적용된다.
도 1은 원래의 CD8 T-세포 기반의 IBD1/IBD2군(왼쪽)과 실시예 1에 기술된 전혈 qPCR 분류기를 사용하여 예측된 IBD1/IBD2군(오른쪽; 분류기에 포함된 유전자에 대한 상세사항은 표 1을 참조) 사이의 치료의 단계적 강화가 없는 생존(treatment escalation-free survival)을 비교하는 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier plot)을 나타낸다. Obs: 관찰된 원래의 군; pred: 전혈 qPCR 데이터를 사용하여 예측된 군; p: 로그-순위(Log-rank) 검정 p값. CL1 및 CL2는 각각 IBD1(고위험) 및 IBD2(저위험) 하위군을 지칭한다. 도 2는 qPCR 분류기(표 1)에 따라 IBD1군에 속하는 각 환자의 예측 확률을 보여주는 곡선을 나타낸다. 빈 점: IBD1 환자; 채워진 점: IBD2 환자.
도 3은 85명의 새롭게 진단된 IBD 환자의 독립적인 코호트에서 실시예 2에 기술된 최적화된 전혈 qPCR 분류기를 사용하여 예측된 IBD1/IBD2군에서의 치료의 단계적 강화가 없는 생존을 보여주는 카플란-마이어 곡선을 나타낸다(분류기에 포함된 유전자에 대한 상세사항은 표 2를 참조). qPCR PAX1 및 qPCR PAX2는 각각 하위군 IBD1 및 IBD2를 지칭한다. 도 3에 나타난 바와 같이, 하위군 IBD2에 대한 하위군 IBD1의 위험비(hazard ratio)는 3.52였다.
도 4는 WO2010/084312에 기술된 유전자 발현 시그니처를 사용하여 예측된 IBD1/IBD2군 사이의 치료의 단계적 강화가 없는 생존을 비교하는 카플란-마이어 곡선을 나타낸다. p: 로그-순위 검정 p값. CL1 및 CL2는 각각 IBD1 및 IBD2 하위군을 지칭한다.
이에 본 발명의 특정 양태 및 구현예를 실시예에 의해, 그리고 위에 기술된 도면을 참조하여 설명한다.
실시예
실시예 1 - 전혈에서의 BD1/IBD2 유전자 시그니처의 확인
재료 및 방법
유전자 발현 프로파일링을 위한 환자 모집
활동성 크론병(CD) 환자(n = 39)와 궤양성 대장염(UC) 환자(n = 30) 69명을 치료가 시작되기 전에 모집하고, 그 후 문헌[Lee et al., 2011]에 이미 기술된 바와 같이 추적(follow-up) 데이터를 수집하였다. 이 작업에 대한 윤리적 승인은 캠브리지셔 지역 윤리 위원회(REC08/H0306/21)로부터 얻었다. 모든 참가자가 사전 서면 동의를 제공하였다.
CD8+ T 세포 샘플
문헌[Lyons et al., 2007]에 기술된 방법에 따라 환자 69명으로부터 수득한 혈액 샘플로부터 CD8+ T 세포를 적극적으로 수집하였고, 문헌[Lee et al., 2011]에 이전에 기술된 바와 같이 제조사의 설명서에 따라 RNEasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하였다.
전혈 샘플
RNA를 즉시 고정시키기 위하여, 69명의 환자로부터 2.5 ml의 전혈을 RNeasy 미니 또는 PAXgene 혈액 RNA 튜브 IVD(Qiagen)에 수집하였다(Rainen et al., 2002). 수집된 샘플을 제조사의 설명서에 따라 보관하고, 이후에 PAXgene 혈액 RNA 키트 IVD(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하였다.
RNA 정량
RNA의 양과 품질을 각각 나노드롭(Nanodrop) 1000 분광광도계(Thermo Scientific) 및 애질런트(Agilent) 2100 바이오애널라이저(bioanalyser)(Agilent Technologies)를 사용하여 결정하였다.
전혈 유전자 발현 프로파일링
200 ng의 총 RNA를 프로세싱하고, Affymetrix Human Gene ST 1.0 마이크로어레이(CD8+ RNA 샘플) 또는 Affymetrix Human Gene ST 2.0(전혈 RNA 샘플)에 혼성화시킨 다음, 세척하고 제조사의 설명서에 따라 스캔하였다.
마이크로어레이 데이터 프로세싱
마이크로어레이 원시 데이터를 바이오컨덕터(BioConductor)의 프리프로세스코어 패키지(preprocessCore package, Bolstad, 2013)를 사용하여 R에서 프로세싱하였다(Huber et al., 2015). 간략하게는, 원시 데이터를 배경 보정(background corrected)하고, 사분위수(quantile) 정규화하고, 목록 4.1에 보고된 코드를 사용하여 요약하였다. 패키지 어레이퀄리티메트릭스(arrayQualityMetrics)를 사용하여 잠재적인 이상치(outlier)의 존재를 평가하였다(Kauffmann et al., 2009). 컴배트(ComBat)를 사용하여 배치 보정을 수행하였다(Johnson et al., 2007). 중요하게는, 개체 샘플의 IBD1/IBD2 멤버쉽에 대한 지식은 리브-원-아웃 교차 검증(leave-one-out cross-validation)에 의한 일반화 오차 추정의 임의의 하향 편중(downward bias)을 피하기 위하여 배치 보정 과정에 포함시키지 않았다.
발현된 전사체를 검출하는 프로브 세트(샘플의 적어도 75%에서 7.0 초과의 로그2 발현 신호를 나타내는 프로브 세트로 정의됨) 만을 유지시켰다. 발현되지 않은 프로브 세트와 주석(annotation)이 없는 프로브 세트를 데이터세트로부터 제거하고, 전혈 유전자 발현 데이터세트에 대해 12,874개의 프로브 세트를 남겼다.
정량적 PCR
후보 유전자 및 3종의 참조 유전자에 대한 mRNA의 수준을 제조사의 설명서에 따라 Roche LightCycler 480 실시간 PCR 기기에서 TaqMan Expression Assays(Life Technologies)를 사용하여 결정하였다. 플레이트내(intra-plate) 및 플레이트간(inter-plate) 변이를 최소화하기 위하여 PCR 조건을 최적화하였다. 전사체의 존재량을 ΔΔCT 방법을 사용하여 계산하였다(Livak et al., 2001). 건강한 개체의 전혈로부터 추출된 통합(pooled) RNA로부터 유래된 cDNA 샘플을 각 플레이트에 포함시키고 교정기(calibrator)로서 사용하였다. 각각의 측정을 3회 반복하고, 3회의 기술적 반복의 중앙값을 최종 분석에 사용하였다.
CD8+ T 세포 유전자 발현 데이터를 기반으로 한 IBD1/IBD2 환자 분류
69명의 환자에 IBD1(불량한 예후) 또는 IBD2(양호한 예후) 상태를 부여하기 위하여, 환자의 CD8+ T 세포 샘플로부터 정규화된 발현 데이터를 본 발명자의 기존의 IBD 환자 코호트로부터의 데이터와 병합하였다. 문헌[Lee et al., 2011]에 기술된 바와 같이, 병합된 데이터세트의 컨센서스 클러스터링(consensus clustering)을 사용하여 코호트를 2개의 이전에 확인된 예후군으로 계층화시켰다.
IBD1 하위군의 환자는 (IBD2군의 환자와 비교하여) 치료의 단계적 강화를 더욱 조기에 필요로 할 뿐만 아니라, 후속 조치 단위 시간당 더 많은 치료의 단계적 강화를 필요로 하는 것을 특징으로 하는, 질병 재발 또는 플레어-업의 빈도가 상당히 높다.
전혈 유전자 발현 데이터를 기반으로 한 IBD1/IBD2 환자 분류
이와 동시에, 69명의 IBD 환자로부터의 전혈 유전자 발현 데이터의 데이터세트 또한 생성하였다. 전혈 유전자 발현 데이터세트에 적응형 탄성 망 정규화(adaptive elastic net regularization)와 함께 로지스틱 회귀 모델을 적용하여, 전혈 유전자 발현 데이터를 기반으로 환자를 2개의 예후군(IBD1 및 IBD2)으로 계층화하는 데 필요한 다수의 유전자를 선택하였다. 실시간 PCR 분석을 이용한 시험을 위하여, 선택된 후보 유전자 및 몇 가지 밀접하게 상호 관련된 유전자를 취하였다.
10종의 불변(invariant) 참조 유전자와 함께 각각의 후보 유전자에 대해 Taqman 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 탄성 망 정규화된 회귀 모델을 실시간 PCR 데이터에 적용하여, 69명의 IBD 환자의 코호트를 2개의 원래의 예후군인 IBD1 및 IBD2로 계층화할 수 있는 15종의 유전자로 구성된 최적 모델을 확인하였다(PPV = 0.87, NPV = 0.94, 민감도 0.94, 특이도 0.85; 도 1 및 도 2). 또한, IBD1 하위군과 IBD2 하위군은 단계적 강화가 없는 생존(P = 0.0074) 및 시간 경과에 따른 단계적 강화의 횟수(P = 0.0003, 치료의 단계적 강화의 평균 횟수: 1.62(IBD1), 0.70(IBD2))의 두 가지 측면 모두에 있어서, 질병 경과와 동등한 관련성을 보여주었다. 15종의 유전자를 표 1에 열거하였다.
Figure pct00001
실시예 2 - RT-qPCR 분석을 위한 전혈 분류기의 최적화
실시간 qPCR 분석법 개발을 위하여 실시예 1에서 확인된 유전자를 취하였으며, 여기에서 전혈 분류기의 최종 내용(16종의 정보 제공(informative) 유전자와 2종의 참조 유전자)을 최적화하고 최종화하였다. 이 분류기의 일부를 형성하는 정보 제공 유전자를 아래 표 2에 열거하였다.
RT-qPCR과 같은 방법에 의해 전혈에서 검출 가능하다는 점을 통해, 이 전혈 유전자 분류기를 사용한 환자의 계층화는 예를 들어, WO2010/084312에 기술된 바와 같은 유전자 발현을 결정하기 전에 특정한 세포 유형의 단리를 필요로 하는 시험보다 간단하고 훨씬 비용 효율적일 것이다.
나아가, 전혈 유전자 분류기는 IBD 관리의 주요 개선 사항을 직접적으로 이끌어내고; 난치성 질병(indolent disease)을 가진 환자를 불필요한 면역억제제의 위험과 부작용에 노출시키지 않으면서, 공격적인 질병을 가진 환자가 진단으로부터 적절히 강력한 치료를 받을 수 있게 하는 것을 포함하는, 광범위한 의료 혜택을 가질 것으로 기대된다. 이는 치료 독성을 최소화하고 질병 합병증 및 의료 비용을 감소시킴으로써, 임상 결과를 개선시킬 것으로 기대된다. 또한, 전혈 유전자 분류기는 질병 플레어의 가능성에 기초한 임상 시험을 위한 환자의 사전 선택을 용이하게 하여, 플레어 예방 또는 치료의 시험에 필요한 환자의 수를 2배 내지 3배 만큼 감소시킬 것으로 기대된다.
Figure pct00002
실시예 3 - qPCR 기반 전혈 분석법의 독립적 검증
그 후, 영국의 네 곳(캠브리지, 노팅엄, 엑서터 및 런던)으로부터의 85명의 새롭게 진단된 IBD 환자의 제2의 독립적인 코호트를 사용하여, 실시예 2에서 확인된 16종 유전자 분류기의 예후 성능의 독립적인 검증을 수행하였다. 실시예 2에서 개발된 qPCR 기반의 시험을 사용하여 전혈 유전자 발현을 분석하여, 3.52의 IBD1/IBD2 위험률을 갖는 발견(discovery) 코호트에서 관찰된 예후 계층화를 반복 검증하였다(95퍼센트 신뢰 구간[CI]: 1.84 - 6.76, P = 0.0002, 도 3). 이 성과는 시험관 내 진단 시험을 기반으로 한 기존의 유전자 발현의 성과보다 나은 것이다. 예를 들어, 유방암 재발을 예측하는 유전자 발현 진단법인 Oncotype DX에 대한 위험률은 2.81이다(95% CI: 1.70 4.64)(Paik et al., NEJM, 2004).
실시예 4 - 최소 유전자 분류기
환자를 2개의 예후군 IBD1 및 IBD2로 계층화하는 데 필요한, 실시예 2에서 개발된 최적화된 전혈 분류기의 최소 유전자의 수를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 IBD 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 정확하게 계층화하는 데 사용될 수 있는 최소한의 유전자 수를 결정하고자 실시예 2에서 확인된 16종의 유전자의 모든 가능성 있는 조합에 대한 철저한 컴퓨터 분석을 수행하였다.
n(1 <= n <= 16)개 유전자의 각각의 가능성 있는 조합을 위해, L2 정규화된 로지스틱 회귀 모델을 관련(relevant) qPCR 유전자 발현 데이터에 피팅하고, 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이 각각의 모델에 대한 연관(associated) 예측 성과를 평가하였다.
아래 표 3에 열거된 결과는 실시예 2에서 확인된 최적화된 16종-유전자 전혈 분류기로부터 선택되는 겨우 2종의 유전자로부터의 전혈 유전자 발현 데이터가 IBD 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 정확하게 계층화하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 특히, IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 IL18RAP 및 TRGC2의 발현을 측정하는 것은 0.71의 정확도(민감도: 0.73; 특이도: 0.69; PPV: 0.69; NPV: 0.74)로 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 계층화하기에 충분하였다.
마찬가지로, 실시예 2에서 개발된 최적화된 전혈 분류기로부터 선택되는 3종의 유전자에 대한 전혈 유전자 발현 데이터는 IBD 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 정확하게 계층화하는 데 적합한 것으로 나타났다. 예를 들어, IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플에서 유전자 IL18RAP, TRGC2 및 TRGV3의 발현을 측정하는 것은 0.74의 정확도(민감도: 0.74; 특이도: 0.74; PPV: 0.74; NPV: 0.74)로 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 계층화하기에 충분하였다.
마찬가지로 표 2에 열거된 유전자로부터 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종, 11종, 12종, 13종, 14종 및 15종 유전자의 조합을 시험하였고, 표 3에 나타난 바와 같이, 이러한 조합은 0.7 이상의 정확도로 IBD 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 계층화하기에 적합한 것으로 밝혀졌다.
시험된 각각의 유전자 수에 대하여, 표 3은 IBD 환자의 IBD1 및 IBD2 하위군으로의 최적 계층화를 가져오는 유전자의 조합만을 보고하고 있다는 점에 유의하여야 한다. 예를 들어, IBD 환자의 IBD1 및 IBD2 하위군으로의 최적 계층화를 가능하게 하는 4종의 유전자의 조합만이 표 3에 나타나 있다. 그러나 실시예 2에서 확인된 16종-유전자 분류기로부터 선택되는 4종의 유전자의 다른 조합 또한 0.7 이상의 정확도로 IBD 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 계층화하는 데 적합하였다.
IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플에서 16종 유전자 전부의 발현을 측정하는 것은 0.971의 정확도(PPV = 1.000; NPV = 0.941; 민감도: 0.946; 및 특이도: 1.000)로 환자를 IBD1 및 IBD2 하위군으로 계층화하였다.
Figure pct00003
비교예 5
본 발명자들은 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이, WO2010/084312에 이미 기술된 유전자 발현 시그니처가 전혈 유전자 발현 데이터를 기반으로 환자를 고위험 IBD1 및 저위험 IBD2 하위군으로 정확하게 계층화하는 능력을 시험하였다. 전혈에서 WO2010/084312의 표 1 또는 표 2에 개시된 유전자, 또는 WO2010/084312에 기술된 유전자 KAT2B, ANKRD32 및 ZNF26, 또는 ITGA2, PTPN22 및 NOTCH1의 발현을 측정한 결과, 아래의 관련 그래프에 보고된 로그 순위 검정 p값으로 나타낸 바와 같이, IBD 환자의 IBD1 및 IBD2 하위군으로의 정확한 분류를 야기하지 않았다(도 4 참조). 이들 결과는 WO2010/084312에 개시된 유전자 시그니처는 유전자 발현이 전혈에서 측정될 때 개체가 IBD 진행 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하기에 적합하지 않음을 입증한다.
실시예 6: 3종 -, 4종-, 5종-, 13종-, 14종- 및 16종-유전자 모델을 사용한 환자 분류
본 발명의 방법은 환자를 IBD 진행의 고위험 또는 저위험 환자로 계층화하고, RNA 물질을 안정하게 하는 수집관에 단지 2.5 ml의 전혈의 수집만을 필요로 하며, (RNA는 최대 3일 동안 실온에서 계속하여 안정적이므로) 전세계적으로 발송될 수 있다. 분석법은 48시간 내에 신속한 결과를 보고하며, 치료를 시작하기 전에 환자 진단을 위하여 정량적 RT-PCR을 통해 유전자 발현을 측정한다.
각각의 RT-PCR 측정의 결과는 고위험 및 저위험 결과군 사이에서 3.5의 검증된 오즈비(odds ratio)로 결과 예측(IBD 진행의 고위험/저위험)을 보고하도록 특정 가중치를 적용하는 알고리즘에 의존한다.
3종-, 4종-, 5종-, 13종-, 14종- 및 16종-유전자 모델을 사용한 환자 분류
가능성 있는 질병 경과를 결정하기 위하여, 환자 429와 환자 483이 PAXGene® 혈액 RNA 튜브에 혈액 샘플을 제공하였다. RNA 추출 및 cDNA 합성 후, 16종의 정보 제공 유전자(ARRDC4, FCRL5, GBP5, GZMH, GZMK, HP, IFI44L, IL18RAP, LGALSL, LINC01136, LY96, NUDT7, P2RY14, TRGC2, TRGV3 및 VTRNA1-1) 및 2종의 참조 유전자(RNA18S5 및 CDV3)의 발현 수준을 Roche Lightcycler 480을 사용하여 정량적 PCR로 결정하였다(Ct, 표 4). 각각의 정보 제공 유전자로부터 2종의 참조 유전자의 평균값을 빼서 원시 데이터를 정규화한 다음(dCt, 표 4), 평균 중심화(mean centering)시켜 표준화하였다(dCt', 표 4).
Figure pct00004
경도의 질병을 경험하는 환자 중 어느 한 명의 확률(P)로 나타낸 위험 점수(IBD 진행의 저위험)는 3종-유전자 모델(식 (1)), 4종-유전자 모델(식 (2)), 5종-유전자 모델(식 (3)), 13종-유전자 모델(식 (4)), 14종-유전자 모델(식 (5)) 및 16종-유전자 모델(식 (6))을 사용하여 표준화된 유전자 발현 데이터에 다음의 로지스틱 회귀 모델을 적용하여 결정될 수 있다.
Logit(Psevere) = β0 + β1(IL18RAP) + β2(TRGC2) + β3(TRGV3) (1)
Logit(Psevere) = β0 + β1(IL18RAP) + β2(LINC01136) + β3(TRGC2) + β4(VTRNA1-1) (2)
Logit(Psevere) = β0 + β1(IL18RAP) + β2(LINC01136) + β3(TRGC2) + β4(TRGV3) + β5(VTRNA1-1) (3)
Logit(Psevere) = β0 + β1(ARRDC4) + β2(FCRL5) + β3(GBP5) + β4(GZMH) + β5(HP) + β6(IFI44L) + β7(IL18RAP) + β8(LGALSL) + β9(LINC01136) + β10(LY96) + β11(P2RY14) + β12(TRGV3) + β13(VTRNA1-1) (4)
Logit(Psevere) = β0 + β1(FCRL5) + β3(GBP5) + β4(GZMK) + β5(HP) + β6(IFI44L) + β7(IL18RAP) + β8(LGALSL) + β9(LINC01136) + β10(LY96) + β11(NUDT7) + β12(P2RY14) + β13(TRGC2) + β14(TRGV3) (5)
Logit(Psevere) = β0 + β1(ARRDC4) + β2(FCRL5) + β3(GBP5) + β4(GZMH) + β5(GZMK) + β6(HP) + β7(IFI44L) + β8(IL18RAP) + β9(LGALSL) + β10(LINC01136) + β11(LY96) + β12(NUDT7) + β13(P2RY14) + β14(TRGC2) + β15(TRGV3) + β16(VTRNA1-1) (6)
그런 다음, -60 내지 60, -30 내지 30 또는 -10 내지 10 범위의 개별 가중치가 모델의 각각의 유전자에 대한 표준화된 유전자 발현 데이터에 적용된다. 각 분석에 대한 개별 가중치(베타)는 표 5에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00005
3종-유전자 모델
식 ( 1)을 재배열하면, 중증의 질병 경과를 따르는 환자 429의 확률은 다음에 의해 제공된다:
Figure pct00006
Psevere가 < 0.5이므로, 환자 429는 경도의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
마찬가지로, 환자 483은:
Figure pct00007
Psevere가 < 0.5이므로, 환자 483은 경도의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
4종-유전자 모델
식 ( 2)를 재배열하면, 중증의 질병 경과를 따르는 환자 429의 확률은 다음에 의해 제공된다:
Figure pct00008
Figure pct00009
Psevere가 < 0.5이므로, 환자 429는 경도의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
마찬가지로, 환자 483은:
Figure pct00010
Psevere가 > 0.5이므로, 환자 483은 중증의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
5종-유전자 모델
식 (3)을 재배열하면, 중증의 질병 경과를 따르는 환자 429의 확률은 다음에 의해 제공된다:
Figure pct00011
Psevere가 < 0.5이므로, 환자 429는 경도의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
마찬가지로, 환자 483은:
Figure pct00012
Psevere가 > 0.5이므로, 환자 483은 중증의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다(IBD 진행의 고위험).
13종-유전자 모델
식 ( 4)를 재배열하면, 중증의 질병 경과를 따르는 환자 429의 확률은 다음에 의해 제공된다:
Figure pct00013
Psevere가 < 0.5이므로, 환자 429는 경도의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
마찬가지로, 환자 483은:
Figure pct00014
Psevere가 > 0.5이므로, 환자 483은 중증의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다(IBD 진행의 고위험).
14종-유전자 모델
식 ( 5)를 재배열하면, 중증의 질병 경과를 따르는 환자 429의 확률은 다음에 의해 제공된다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Psevere가 < 0.5이므로, 환자 429는 경도의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
마찬가지로, 환자 483은:
Figure pct00017
Psevere가 > 0.5이므로, 환자 483은 중증의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다(IBD 진행의 고위험).
16종-유전자 모델
식 (6)을 재배열하면, 중증의 질병 경과를 따르는 환자 429의 확률은 다음에 의해 제공된다:
Figure pct00018
Psevere가 < 0.5이므로, 환자 429는 경도의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
마찬가지로, 환자 483은:
Figure pct00019
Figure pct00020
Psevere가 > 0.5이므로, 환자 483은 중증의 질병 경과를 따를 것으로 예측된다.
상기의 비제한적인 실시예는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종, 4종, 5종, 13종, 14종 및 16종 유전자에 적용된 본 발명의 일 구현예를 예시한 것이다. 그러나 이 방법은 당업자에 의해 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종, 11종, 12종, 13종, 14종, 15종, 또는 16종 유전자에 대해 쉽게 조정될 수 있다.
방법
RNA 추출
대상체로부터 수득한 혈액 샘플을 실온(15 내지 25℃)에서 3시간 동안 PAXgene® 튜브(PAXgene Blood RNA Kit, Cat. No. 762164, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재)에서 배양하였다. 그런 다음, 샘플을 함유하는 튜브를 4,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 튜브에서 옮겨 붓고 버렸다. 상등액을 기울여 따른 후, 새로운 2차 BD HemogardTM(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재) 마개를 사용하여 튜브를 밀봉하였다. 그런 다음, 펠릿이 눈에 보이게 용해될 때까지 튜브를 볼텍싱하고, 4,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 전체 상등액을 제거하고, 피펫을 사용하여 버렸다. 그런 다음, 재현탁 완충액 BR1(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재) 350 μl를 첨가하고, 펠릿이 눈에 보이게 용해될 때까지 튜브를 볼텍싱하였다. 그런 다음, 샘플을 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에 피펫팅하고, 이 튜브에 결합 완충액 BR2(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재) 300 μl와 프로테이나제 K 40 μl을 개별적으로 첨가하였다. 그런 다음, 튜브를 5초 동안 볼텍싱하고, 1000 rpm에서 진탕기-인큐베이터를 사용하여 55℃에서 10분 동안 배양하였다. 배양 후, 마이크로원심분리 튜브로부터의 용해물을 2 ml 프로세싱 튜브 안에 넣은 PAXgene® Shredder 스핀 컬럼(연보라색)(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재)에 직접 피펫팅하고, 15,000 x g에서 3분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 프로세싱 튜브의 펠릿을 건드리지 않고, 통과액 분획(flow-through fraction)의 전체 상등액을 새로운 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브로 조심스럽게 피펫팅하였다. 96 내지 100% 에탄올 350 μl를 상등액에 첨가하고, 2초 동안 볼텍싱하고, 500 x g에서 1초 동안 원심분리하여 튜브 뚜껑 내부로부터 액체 방울을 제거하였다. 샘플 700 μl를 2 ml 프로세싱 튜브 안에 넣은 PAXgene® RNA 스핀 컬럼(빨간색)(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재)에 피펫팅하고, 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브에 넣고, 통과액을 함유하는 예전 프로세싱 튜브는 버렸다. 나머지 샘플을 PAXgene® RNA 스핀 컬럼(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재)에 피펫팅하고, 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브에 넣고, 통과액을 함유하는 예전 프로세싱 튜브는 버렸다. 세척 완충액 BR3 350 μl를 PAXgene® RNA 스핀 컬럼에 피펫팅하고, 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브에 넣고, 통과액을 함유하는 예전 프로세싱 튜브는 버렸다.
별도의 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에, DNase I 용액(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재) 10 μl와 완충액 RDD(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재) 70 μl를 혼합하여 DNase I 배양 혼합물을 제조하였다. 그런 다음, DNase I 배양 혼합물 80 μl를 PAXgene® RNA 스핀 컬럼 막 위로 직접 첨가하고, 실온(20 내지 30℃)에서 15분 동안 배양하였다. 완충액 BR3 350 μl를 PAXgene® RNA 스핀 컬럼에 피펫팅하고, 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브에 넣고, 통과액을 함유하는 예전 프로세싱 튜브는 버렸다. 세척 완충액 BR4(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재) 500 μl를 PAXgene® RNA 스핀 컬럼에 피펫팅하고, 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브에 넣고, 통과액을 함유하는 예전 프로세싱 튜브는 버렸다. 완충액 BR4 500 μl를 PAXgene® RNA 스핀 컬럼에 피펫팅하고, 15,000 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브에 넣고, 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. PAXgene® RNA 스핀 컬럼을 5 ml 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 40 μl의 용출 완충액 BR5(PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, 미국 캘리포니아 주 산호세 소재)를 PAXgene RNA 스핀 컬럼 막 위로 직접 피펫팅하고, 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출시켰다. 40 μl의 용출 완충액 BR5 및 동일한 마이크로원심분리 튜브를 사용하여 용출 단계를 반복하였다. 용출액 RNA 샘플을 65℃에서 5분 동안 배양하고, 바로 RNA 샘플을 얼음 위에서 냉각시켰다.
RNA 정량
애질런트(Agilent) RNA 6000 겔-염료 혼합물 튜브(Agilent RNA 6000 Nano Kit, Cat. No. 5067-1511, Agilent, 미국 캘리포니아 주 산타클라라 소재)의 즉시 사용 가능한 분취액(ready to use aliquot)을 13,000 x g에서 10분 동안 회전시킨 다음, 겔-염료 혼합물을 실온(15 내지 25℃)에서 30분 동안 평형을 이루게 하였다. 새로운 RNA 나노 칩(Agilent RNA 6000 Nano Kit, Cat. No. 5067-1511, Agilent, 미국 캘리포니아 주 산타클라라 소재)을 즉시 사용 가능한 칩 프라이밍 스테이션(chip priming station, Cat. No. 5065- 4401, Agilent, 미국 캘리포니아 주 산타클라라 소재)에 위치시켰다. "G"가 마킹된 웰의 바닥에 겔-염료 혼합물 9 μl를 피펫팅하였다. 칩 프라이밍 스테이션에서, 플런저를 1 ml에 두고, 칩 프라이밍 스테이션을 닫았다. 정확하게 30초 기다린 다음, 칩 해제 메커니즘으로 플런저를 해제하고, 플런저가 적어도 0.3 ml 표시까지 뒤로 물러남을 육안으로 점검하였다. 5초 동안 기다린 다음, 서서히 플런저를 1 ml 위치까지 다시 당겼다. 칩 프라이밍 스테이션을 열고, 반응 웰 각각에 겔-염료 혼합물 9 μl를 피펫팅하였다. 애질런트 RNA 6000 래더(Cat. No. 5067-1529, Agilent, 미국 캘리포니아 주 산타클라라 소재)의 즉시 사용 가능한 분취액을 완전히 해동시키기 위해 15분 동안 얼음 위에 둔 다음, 2분 동안 70℃에서 배양하였다. 래더 부호가 표시된 웰에 애질런트 RNA 6000 래더 1 μl를 피펫팅하였다. 래더 부호가 표시된 웰 및 반응 웰 각각에 애질런트 RNA 6000 나노 마커(Agilent RNA 6000 Nano Kit, Cat. No. 5067-1511, Agilent, 미국 캘리포니아 주 산타클라라 소재) 5 μl를 피펫팅하였다. RNA 나노 칩의 상단 왼쪽 웰에 RNA 샘플 1 μl를 피펫팅하였다. RNA 나노 칩을 2400 rpm에서 60초 동안 수평으로 볼텍싱하였다. 애질런트 2100 바이오애널라이저(Agilent, 미국 캘리포니아 주 산타클라라 소재)의 용기에 칩을 조심스럽게 넣고, 뚜껑을 닫고, 칩을 작동시켰다. 작동 완료 후, RNA의 온전성(integrity)을 확인하고, RIN이 > 7인 경우, cDNA 합성 진행 전에 나노드롭 분광광도계를 사용하여 RNA를 정량하였다.
cDNA 합성
얼음 위의, 표지된 0.2 ml의 얇은 벽 튜브에 다음을 조합하여 혼합물을 생성하였다(표 6):
Figure pct00021
각 샘플의 경우, 15 ng/μl로 희석된 RNA 샘플의 10 μl(150 ng의 RNA)에, 제조된 혼합물 10 μl를 첨가하였다. 참조 RNA의 경우, 15 ng/μl로 희석된 참조 RNA 25 μl(375 ng)에, (2.)에 제조된 cDNA 합성 혼합물 25 μl를 첨가하였다. 부드럽게 혼합하고, 튜브를 써모사이클러(Eppendorf MasterCycler Nexus SX1, SKU # 8125-30-1030, Eppendorf AG, 독일)에 넣었다. 25℃에서 10분 동안 배양하였다. 42℃에서 60분 동안 배양하였다. 85℃에서 5분 동안 반응을 종결시켰다. 4℃까지 냉각시켰다. 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브 바닥의 내용물을 수집하고, qPCR 전에 cDNA 샘플을 -20℃에 보관하였다.
qPCR
부드럽게 볼텍싱하여 해동된 cDNA 샘플을 재현탁시킨 다음, 잠시 원심분리하여 튜브 바닥의 액체를 수집하였다. 각 샘플의 경우, 내용물을 표지된 0.5 ml의 튜브로 옮기고, 뉴클레아제 불포함 물(nuclease-free water) 380 μl를 첨가하여 20x로 희석하였다. 참조 cDNA의 경우, 내용물을 표지된 0.5 ml의 튜브로 옮기고, 뉴클레아제 불포함 물 200 μl를 첨가하여 5x로 희석하였다.
분석되는 cDNA 샘플의 수에 따라, 각 분석을 위해 표지된 뉴클레아제 불포함 1.5 ml 튜브에 다음의 성분들을 조합하였다(표 7):
Figure pct00022
다음의 예시적인 RT-qPCR 프라이머(표 8)가 사용될 수 있다. 그러나 당업자는 제시된 예시적인 RT-qPCR 분석을 수행하기 위하여 다른 적합한 프라이머를 용이하게 설계할 수 있다.
Figure pct00023
Figure pct00024
튜브 뚜껑을 덮고, 여러 차례 뒤집어 혼합하였다. 잠시 원심분리하여 튜브 바닥의 반응 혼합물을 수집하였다. 아래의 프로토콜은 4명의 환자로부터의 cDNA 샘플에 대해 수행한 분석법을 예시한 것으로, 2개의 참조 대조군과 함께 16종 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 그러나 이 분석법은 1개 이상의 cDNA 샘플에 대해 수행될 수 있고, 1개 이상의 참조 대조군을 사용하여 16종 유전자 중 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하도록 당업자에 의해 용이하게 설계될 수 있다.
각각의 cDNA 주형 4 μl를 다음과 같이 표지된 384-웰 플레이트의 웰로 피펫팅하였다:
a. 참조 cDNA(CDV3 및 RNA85S5) 웰 A1-C6
b. cDNA 샘플 #1 웰 D1-F6
c. cDNA 샘플 #2 웰 G1-I6
d. cDNA 샘플 #3 웰 J1-L6
e. cDNA 샘플 #4 웰 M1-O6
뉴클레아제 불포함 물 4 μl를 각각의 주형 불포함 대조 웰(웰 P1-P18)로 피펫팅하였다.
각각의 Taqman Gene Expression Assay 16 μl를 다음의 웰에 첨가하였다:
a. 분석 1: 웰 A1-A3, D1-D3, G1-G3, J1-J3, M1-M3, P1
b. 분석 2: 웰 A4-A6, D4-D6, G4-G6, J4-J6, M4-M6, P2
c. 분석 3: 웰 A7-A9, D7-D9, G7-G9, J7-J9, M7-M9, P3
d. 분석 4: 웰 A10-A12, D10-D12, G10-G12, J10-J12, M10-M12, P4
e. 분석 5: 웰 A13-A15, D13-D15, G13-G15, J13-J15, M13-M15, P5
f. 분석 6: 웰 A16-A18, D16-D18, G16-G18, J16-J18, M16-M18, P6
g. 분석 7: 웰 A19-A21, D19-D21, G19-G21, J19-J21, M19-M21, P7
h. 분석 8: 웰 A22-A24, D22-D24, G22-G24, J22-J24, M22-M24, P8
i. 분석 9: 웰 B1-B3, E1-E3, H1-H3, K1-K3, N1-N3, P9
j. 분석 10: 웰 B4-B6, E4-E6, H4-H6, K4-K6, N4-N6, P10
k. 분석 11: 웰 B7-B9, E7-E9, H7-H9, K7-K9, N7-N9, P11
l. 분석 12: 웰 B10-B12, E10-E12, H10-H12, K10-K12, N10-N12, P12
m. 분석 13: 웰 B13-B15, E13-E15, H13-H15, K13-K15, N13-N15, P13
n. 분석 14: 웰 B16-B18, E16-E18, H16-H18, K16-K18, N16-N18, P14
o. 분석 15: 웰 B19-B21, E19-E21, H19-H21, K19-K21, N19-N21, P15
p. 분석 16: 웰 B22-B24, E22-E24, H22-H24, K22-K24, N22-N24, P16
q. 분석 17: 웰 C1-C3, F1-F3, I1-I3, L1-L3, O1-O3, P17
r. 분석 18: 웰 C4-C6, F4-F6, I4-I6, L4-L6, O4-O6, P18
384-웰 플레이트를 밀봉 포일(Cat. No. 04729757001, Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)로 밀봉하였다. 플레이트를 잠시 원심분리하여 웰의 내용물을 혼합하고, 플레이트를 써모사이클러(Roche LightCycler480 II, Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)에 로딩하였다. 듀얼 컬러 가수분해 프로브/UPL 프로브에 대한 검출 포맷을 선택하고, qPCR 프로그램을 70 사이클 동안 다음과 같이 설정하고, 분석을 실행하였다:
a. 95℃, 10분
b. 95℃, 10초
c. 60℃, 1분
d. 40℃, 30초
참고문헌
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
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<213> artificial <220> <223> probe <400> 18 agttcacaaa gaagtattaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> forward primer <400> 19 ggcaaagtac tatcgggagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse primer <400> 20 tccttggact ttaaatattt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe <400> 21 tcggaaagga atacaggctg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> forward primer <400> 22 aaatgtggtt tactcagaag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse primer <400> 23 ttcagagtag atgatagggg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe <400> 24 acggatcatc caagagaaaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> forward primer <400> 25 tgaatacaac aatatcattc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse primer <400> 26 aagagcattt cttctgggct 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe <400> 27 ccttcaaggg aataaaattt 20 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Claims (36)

  1. 개체가 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD) 진행의 위험이 높은지 또는 낮은지를 평가하는 방법으로서,
    방법은 개체로부터 수득된 전혈(whole blood) 샘플에서 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정함으로써, 상기 개체가 고위험(IBD1) 또는 저위험(IBD2) 표현형을 가지는지를 확립하는 단계를 포함하며, 여기에서 2종 이상의 유전자는
    아레스틴 도메인 함유 4(arrestin domain containing 4, ARRDC4);
    구아닐레이트 결합 단백질 5(guanylate binding protein 5, GBP5);
    퓨린수용체 P2Y G-단백질 결합형, 14(purinergic receptor P2Y G-protein coupled, 14, P2RY14);
    볼트(Vault) RNA 1-1(VTRNA1-1);
    인터루킨 18 수용체 부속 단백질(interleukin 18 receptor accessory protein, IL18RAP);
    합토글로빈(haptoglobin, HP);
    누딕스(뉴클레오시드 이인산 연결 모이어티 X)-형 모티프 7(nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 7, NUDT7);
    그랜자임 H(granzyme H, GZMH);
    T 세포 수용체 감마 불변 2(T cell receptor gamma constant 2, TRGC2);
    렉틴, 갈락토시드-결합-유사(lectin, galactoside-binding-like, LGALSL);
    Fc 수용체-유사 5(Fc receptor-like 5, FCRL5);
    인터페론 유도성 단백질 44-유사(interferon-induced protein 44-like, IFI44L);
    긴 유전자간 비-단백질 코딩 RNA(long intergenic non-protein coding RNA) 1136(LINC01136);
    림프구 항원 96(lymphocyte antigen 96, LY96);
    그랜자임 K(granzyme K, GZMK); 및
    T 세포 수용체 감마 가변 3(T Cell Receptor Gamma Variable 3, TRGV3)
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    IBD1 표현형은 IBD2 표현형을 갖는 개체에서의 유전자의 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현을 특징으로 하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 개체에서 상기 IBD 진행 위험은
    a) 선택된 유전자의 측정된 발현 수준에 가중치를 부여하고(weighting);
    b) 가중치가 부여된 발현 수준에 로지스틱 회귀 모델(logistic regression model)을 적용하여 위험 점수(risk score)를 결정하고, 여기에서 0.5 미만의 위험 점수는 IBD 진행의 저위험을 나타내고, 0.5 미만의 위험 점수는 IBD 진행의 고위험을 나타내며;
    c) 상기 결정의 결과를 요약하는 보고서를 생성함으로써,
    상기 환자에 대한 위험 점수를 산출하는 것에 의해 결정되는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 2종 이상의 유전자의 발현 수준은 실시간 정량적 PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR), 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석(whole transcriptome shotgun sequencing) 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석(direct multiplexed gene expression analysis)을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 2종 이상의 유전자의 발현 수준은 RT-qPCR을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (i) 개체로부터 수득된 전혈 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 전혈 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계;
    (iii) RNA를 cDNA로 전환시키는 단계; 및
    (iv) RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 수행하여 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 방법에 사용하기 위한 자가면역질환 진행 위험 평가 시스템으로서,
    시스템은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현을 결정하는 도구 또는 도구들,
    및 대상체의 유전자 발현 데이터로부터 IBD 진행 위험 점수를 산출하도록 프로그램된 컴퓨터
    를 포함하는 자가면역질환 진행 위험 평가 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    시스템은 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석에 의해 2종 이상의 유전자의 발현을 결정하는 도구 또는 도구들을 포함하는 것인 자가면역질환 진행 위험 평가 시스템.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (ii) IBD에 대한 치료를 위해 단계 (i)에서 IBD 진행 위험이 높거나 낮은 것으로 확인된 개체를 선택하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (ii) 단계 (i)에서 IBD 진행 위험이 높거나 낮은 개체로 확인된 개체에게 IBD에 대한 치료를 받게 하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  11. 개체에서 IBD를 치료하기 위한 방법으로서, 방법은
    (i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 개체를 IBD 진행의 위험이 높거나 또는 낮은 것으로 확인하는 단계, 및
    (ii) 개체에게 IBD에 대한 치료를 받게 하는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. IBD 진행 위험이 높거나 낮은 것으로 결정되는 개체에서 IBD를 치료하는 방법으로서, 방법은
    (i) 상기 개체를 IBD1(IBD 진행의 고위험) 또는 IBD2(IBD 진행의 저위험)으로 분류하는 시험 결과를 검토하는 단계로서, 여기에서 상기 시험은 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하며, 여기에서 2종 이상의 유전자는 개체로부터 수득된 전혈 샘플에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    여기에서 저위험(IBD2) 표현형을 갖는 개체에서의 유전자 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현은 개체가 고위험(IBD1) 표현형을 가짐을 나타내고, 그리고
    여기에서 고위험(IBD1) 표현형을 갖는 개체에서의 유전자의 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 하향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 상향 조절된 발현은 개체가 저위험(IBD2) 표현형을 가짐을 나타내는 것인 단계, 및
    (ii) IBD에 대해 IBD1 또는 IBD2 표현형을 갖는 것으로 결정된 개체를 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    단계 (i)은 분석 결과를 제공하는 시험을 요청하여 RT-qPCR, 디지털 PCR, 마이크로어레이 분석, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석에 의해 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 개체가 고위험 IBD1 또는 저위험 IBD2 표현형을 갖는지를 평가하기 위한 키트로서,
    여기에서 상기 키트는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함하고,
    여기에서 IBD1 표현형은 IBD2 표현형을 갖는 개체에서의 유전자 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 상향 조절된 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 하향 조절된 발현을 특징으로 하고, 그리고
    여기에서 IBD2 표현형은 IBD1 표현형을 갖는 개체에서의 유전자 발현 수준에 비해 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 하향 조절된 발현 및 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 상향 조절된 발현을 특징으로 하는 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    키트는 RT-qPCR, 마이크로어레이 분석, 디지털 PCR, 전 전사체 산탄 서열분석 또는 직접 다중화 유전자 발현 분석에 의해 상기 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 확립하기 위한 시약을 포함하는 것인 키트.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법, 자가면역질환 진행 위험 평가 시스템 또는 키트로서,
    여기에서 IBD는 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC) 또는 크론병인 것인 방법, 자가면역질환 진행 위험 평가 시스템 또는 키트.
  17. IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 물질을 확인하는 시험관 내(in vitro) 방법으로서, 방법은
    (i) 관심 물질을 이용한 치료 전에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플, 및 (ii) 관심 물질을 이용한 치료 후에 IBD 환자로부터 수득된 전혈 샘플을 제공하는 단계로서, 여기에서 IBD 환자는 제1항 내지 제4항 또는 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 고위험(IBD1) 표현형을 갖는 것으로 결정되는 단계; 그리고
    샘플 (i) 및 (ii)에서 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
    를 포함하며,
    여기에서 샘플 (i)에 비해 샘플 (ii)에서 유전자 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK의 낮은 발현과 유전자 LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3의 높은 발현은 물질이 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있음을 나타내는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    방법은 IBD 환자에서 저위험(IBD2) 표현형을 유도할 수 있는 것으로 확인되는 물질을 약제로 제형화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 개체에서 IBD를 치료할 수 있는 물질을 확인하는 시험관 내(in vitro) 방법으로서, 방법은
    (i) 제1항 내지 제6항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 IBD 진행의 위험이 높거나 낮은 개체를 확인하는 단계; 및
    (ii) 관심 물질을 이용한 치료 후에 개체에서의 IBD 진행의 수준을 대조군과 비교하는 단계로서, 여기에서 대조군과 비교하여 개체에서 더 낮은 IBD 진행 수준은 이 물질이 IBD를 치료할 수 있음을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    방법은 IBD를 치료할 수 있는 것으로 확인되는 물질을 약제로 제형화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  21. 환자의 전혈 샘플로부터 환자-확인된(patent-identified) 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 방법으로서, 방법은
    a) 상기 환자의 전혈 샘플로부터 RNA를 제공하는 단계;
    b) 상기 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
    c) 상기 cDNA의 개별적인 분취액(aliquot)을 어레이 상에 위치시켜 상기 cDNA 분취액을 환자 샘플 cDNA 분취액으로 확인하는 단계;
    d) ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자의 각각의 유전자에 대한 상기 개별적인 cDNA 분취액에서 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 수행하여 상기 어레이 상에 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석 생성물을 제공하고, 이에 의해 상기 3종 이상의 유전자 발현 생성물로 필수적으로 이루어지는 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (e) 상기 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석 생성물을 정량화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 RT-qPCR 생성물은 상기 cDNA를 상기 3종 이상의 유전자 각각에 대해 특이적인 프라이머 세트와 접촉시킴으로써 제공되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브 프라이머를 포함하는 것인 방법.
  25. 환자의 전혈 샘플로부터의 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이로서, 상기 어레이는
    환자 샘플 cDNA로 확인된 개별적인 cDNA 분취액을 포함하며, 여기에서 상기 어레이의 3개 이상의 cDNA 분취액 각각은 상기 cDNA 분취액에서 선택된 유전자 발현 생성물을 증폭시키기에 특이적인 RT-qPCR 프라이머 쌍을 포함하고,
    여기에서 상기 어레이는 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 어레이.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 3종 이상의 유전자에 대해 특이적인 RT-qPCR 프로브를 더 포함하는 어레이.
  27. 환자의 전혈 샘플로부터 정량화된 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 방법으로서, 방법은
    a) 상기 환자의 전혈 샘플로부터 RNA를 제공하는 단계;
    b) 상기 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
    c) 상기 cDNA의 분취액을 어레이 상에 위치시켜 상기 cDNA 분취액을 환자 샘플 cDNA 분취액으로 확인하는 단계;
    d) 상기 cDNA 분취액에서 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석을 수행하여 상기 어레이 상에 RT-qPCR, 디지털 PCR 또는 전 전사체 산탄 서열분석 유전자 발현 생성물을 제공하는 단계; 및
    e) ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 유전자군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자의 각각의 선택된 유전자에 대해 유전자 발현 생성물의 양을 정량화하는 단계
    를 포함하여, 환자의 전혈 샘플로부터 정량화된 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이를 제공하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 어레이 상의 각각의 선택된 유전자 발현 생성물의 경우,
    ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 적고; 그리고
    LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 많은 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 어레이 상의 각각의 선택된 유전자 발현 생성물의 경우,
    ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 많고; 그리고
    LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 적은 것인 방법.
  30. 정량화된, 환자-확인된 선택된 유전자 발현 생성물의 어레이로서,
    상기 어레이는 환자의 전혈 샘플의 개별적인 정량화된 유전자 발현 생성물을 포함하고, 상기 정량화된 유전자 발현 생성물은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3종 이상의 유전자의 증폭된 cDNA 생성물로 이루어지는 어레이.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 어레이 상의 각각의 선택된 유전자 발현 생성물의 경우,
    ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 적고; 그리고
    LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 발현 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 많은 것인 어레이.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 어레이 상의 각각의 선택된 유전자 발현 생성물의 경우,
    ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 및 GZMK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 많고; 그리고
    LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 유전자 생성물의 양은 상기 유전자에 대한 대조군보다 적은 것인 어레이.
  33. 제21항에 있어서,
    상기 유전자 중 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제25항에 있어서,
    상기 유전자 중 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
  35. 제27항에 있어서,
    상기 유전자 중 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제30항에 있어서,
    상기 유전자 중 4종, 5종, 13종, 14종 또는 16종은 ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 및 TRGV3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
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