ES2906192T3 - Biomarcadores para una enfermedad inflamatoria del intestino - Google Patents

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Abstract

Un método para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o un riesgo bajo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino (EII), comprendiendo el método establecer, mediante la determinación del nivel de expresión de cuatro o más genes en una muestra de sangre completa que se ha obtenido del individuo, si dicho individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2), en donde los cuatro o más genes se seleccionan del grupo que consiste en: dominio de arrestina que contiene 4 (ARRDC4); proteína 5 de unión a guanilato (GBP5); receptor purinérgico P2Y 14 acoplado a proteína G (P2RY14); ARN de bóveda 1-1 (VTRNA1-1); proteína accesoria del receptor de interleucina 18 (IL18RAP); haptoglobina (HP); motivo 7 de tipo nudix (fracción X unida a nucleósido difosfato) (NUDT7); grancima H (GZMH); constante γ del receptor de linfocitos T 2 (TRGC2); lectina, de tipo unión a galactósidos (LGALSL); receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); proteína 44 similar a la inducida por interferón (IFI44L); ARN intergénico largo no codificante de proteínas 1136 (LINC01136); antígeno de linfocitos 96 (LY96); grancima K (GZMK); y variable del receptor de linfocitos T 3 (TRGV3); en donde un fenotipo EII1 se caracteriza por la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2, y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2, y en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1.

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcadores para una enfermedad inflamatoria del intestino
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente británica GB 1611738.4, presentada el 5 de julio de 2016,
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino (EII), incluida la progresión de la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU). De manera opcional, el individuo puede además someterse a, o seleccionarse para, un tratamiento para la EII, siendo el tratamiento seleccionado en función de si el individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de la EII.
Antecedentes de la invención
Se ha establecido que la introducción temprana de terapias agresivas en la EC conduce a mejores resultados, en comparación con el enfoque convencional de intensificación (D'Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010). En particular, los pacientes tratados con terapia de combinación temprana (infliximab en combinación con azatioprina; D'Haens et al., 2008) experimentan períodos más largos de remisión sin esteroides, tienen más probabilidades de lograr la cicatrización de la mucosa y, en última instancia, de evitar la resección quirúrgica (D'Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010). Sin embargo, esta estrategia no es adecuada para todos los pacientes porque una proporción no despreciable de pacientes habría logrado una remisión prolongada incluso con el enfoque de tratamiento convencional (Jess et al., 2007) y, por lo tanto, su tratamiento con terapia combinada los expondría a efectos secundarios y toxicidad innecesarios. Por este motivo, la capacidad de predecir el pronóstico sería un paso importante para mejorar la atención de los pacientes con EC y EII en general (IBD Research Priority, 2015; Gerich et al., 2014).
Varias variables diferentes se han asociado al pronóstico de la EC; a saber, factores clínicos, marcadores serológicos y variantes genéticas (Gerich et al., 2014; Billiet et al., 2014). Sin embargo, el poder predictivo de estos marcadores, utilizados solos o en combinación, ha demostrado ser limitado hasta el momento, y ninguno es adecuado para su uso rutinario en la consulta (Loly et al., 2008; Markowitz et al., 2011; Ananthakrishnan et al., 2014). Como consecuencia, desarrollar una prueba de pronóstico fiable para una EII, que incluya la EC y la CU, sigue siendo una prioridad, y actualmente se reconoce como una de las necesidades insatisfechas más importantes en gastroenterología (IBD Research Priority, 2015).
Para lograr este objetivo, las variantes genéticas son marcadores pronósticos candidatos prometedores, porque son estables, se pueden medir fácilmente y debido a que la arquitectura genética de la EC ya se ha estudiado de manera extensa, al menos con respecto a la susceptibilidad (Jostins et al., 2012). Sin embargo, los factores genéticos descubiertos hasta ahora solo pueden explicar del 5 al 6 % de la variación fenotípica observada en el resultado de la EC entre los pacientes. Incluso si esta cifra aumentara, a medida que estudios con mayor poder estadístico descubran otras variantes asociadas a los resultados, parece poco probable que los factores genéticos sean suficientes, de manera aislada, para permitir una predicción precisa del resultado en la EC y una EII en general. Esto es coherente con la idea de que los factores ambientales, incluido el tabaquismo, juegan un papel importante en la evolución natural de la EII (Kaser et al., 2010).
Los marcadores de expresión génica pueden ser mejores candidatos para superar estas limitaciones, en particular, si se miden directamente en tejidos o tipos de células que están implicadas en la patogenia de la enfermedad (McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011). De hecho, la expresión génica puede registrar más información sobre las interacciones entre el organismo y el ambiente externo (Choi et al., 2007), aunque todavía refleja algunos aspectos de los antecedentes genéticos individuales. Por otro lado, normalmente, no se espera que la expresión génica sea estable con el tiempo, y aislar poblaciones celulares particulares sin afectar los niveles de expresión génica es un desafío técnico (Lyons et al., 2007). Fuera de un entorno de investigación controlado, todos estos factores limitan el uso de marcadores de expresión génica en un contexto clínico.
Recientemente se informó que una señal distintiva de la expresión génica, detectable en linfocitos T CD8+, se puede utilizar para predecir el pronóstico en una EII (Lee et al., 2011). En particular, dicha señal fue capaz de identificar, en el momento del diagnóstico y antes del tratamiento, dos grupos distintos de pacientes (EII1 y EII2), asociados a diferentes desarrollos clínicos tanto en la EC como en la CU (Lee et al., 2011). De manera más precisa, cuando se tratan con el enfoque convencional de intensificación (Peyrin-Biroulet et al., 2008), los pacientes clasificados como pertenecientes al grupo EII1 mostraron de manera coherente un riesgo significativamente mayor de aumento escalonado del tratamiento que los pacientes en el grupo EII2 (Lee et al., 2011), proporcionando así una justificación para tratar a estos pacientes con terapias más agresivas en una etapa más temprana (Lee et al., 2011). Por consiguiente, el documento WO2010/084312 describe métodos para determinar si un sujeto tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una enfermedad autoinmunitaria mediante la determinación del subtipo de células CD8 del sujeto.
La señal antes mencionada representó un gran avance hacia la predicción del resultado en una EII (Friedman et al., 2011) por tres razones principales. En primer lugar, la diferencia en el resultado entre los estratos de pacientes es lo suficientemente marcada como para ser potencialmente útil para guiar las decisiones terapéuticas (Lee et al., 2011; Friedman et al., 2011), a diferencia de los marcadores pronósticos informados previamente (Gerich et al., 2014). En segundo lugar, se informó previamente de una señal de expresión del gen CD8+ superpuesta para predecir el resultado de la enfermedad en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) y vasculitis asociada a ANCA (VAA), lo que sugiere la hipótesis de que los procesos biológicos comunes pueden subyacer al pronóstico de diferentes enfermedades inflamatorias (McKinney et al., 2010). Por último, recientemente se propuso una explicación mecánica parcial pero convincente de los procesos biológicos subyacentes (McKinney et al., 2015). Estos dos últimos puntos son particularmente importantes. De hecho, investigar el pronóstico requiere necesariamente estudios longitudinales en los que la recopilación de datos requiere mucho tiempo y es costosa, lo que limita el tamaño del estudio. Como consecuencia, a menudo queda en duda si una pequeña cohorte de pacientes puede registrar suficiente complejidad de la población subyacente y si el marcador de pronóstico propuesto es realmente reproducible. En vista de esto, observar la coherencia con respecto a los resultados de la enfermedad en diferentes cohortes de pacientes con diferentes enfermedades, junto con percepciones mecánicas creíbles, aumenta de manera considerable la confianza en la reproducibilidad de la señal de expresión génica de linfocitos T CD8+ antes mencionada (McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011).
Sin embargo, queda por resolver un problema importante antes de que la señal de expresión génica de linfocitos T CD8+ se pueda utilizar de forma rutinaria para estratificar a los pacientes en un entorno clínico. La asignación de un paciente a los grupos EN1/EN2 actualmente requiere la extracción de ARN de linfocitos T CD8+ purificados (McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011). Se ha observado de manera repetida que esta etapa añade una cantidad considerable de complejidad a una posible prueba de pronóstico, limitando así su aplicabilidad a un pequeño número de muestras en un entorno de investigación controlado (Friedman et al., 2011; Billiet et al., 2014).
Por el contrario, ser capaz de detectar los subgrupos EN1/EN2 en una muestra biológica fácilmente accesible, tal como sangre completa, facilitaría enormemente su utilidad clínica y, posiblemente, su aplicabilidad como marcador pronóstico. Además, debido a que las muestras de sangre entera, pero no los linfocitos T CD8+ purificados, se recogieron de forma rutinaria durante algunos ensayos clínicos, esto abriría la posibilidad de volver a analizar los ensayos anteriores de medicamentos para la EII con el fin de volver a evaluar la eficacia del fármaco después de la estratificación de los pacientes.
A pesar de ser potencialmente útil, hay que tener en cuenta que la detección de la señal EII1/EII2 en muestras diferentes a los linfocitos T CD8+ purificados ha demostrado previamente ser compleja (Lee et al., 2011). De hecho, se observó de manera repetida que las señales de expresión génica procedentes de linfocitos T CD4+ no se podían utilizar para estratificar a los pacientes mediante el resultado de la enfermedad en la EII (Lee et al., 2011), el l Es o la VAA (McKinney et al., 2010). De acuerdo con estas observaciones, no fue posible identificar señales de pronóstico equivalentes en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés "peripheral blood mononuclear cells") utilizando los mismos métodos de agrupación no supervisados (Monti et al., 2003) utilizados originalmente para descubrir la señal de expresión de linfocitos T CD8+ (McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011). Esto puede deberse al hecho de que los linfocitos T CD8+ representan una fracción muy pequeña y variable de la población de PBMC (Lyons et al., 2007). El documento WO2010/084312 divulga un método para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de la EII mediante la determinación del nivel de expresión de uno o más genes en las células CD8+. Lee et al. (2011) divulga el uso de una señal de expresión génica en linfocitos T CD8+ para pronosticar enfermedades autoinmunitarias, incluida la EII. La señal de expresión génica permite clasificar a los pacientes en riesgo alto y bajo.
Asimismo, mientras que las señales pronósticas se pueden descubrir utilizando tecnologías de perfilado de expresión génica de alto rendimiento, tales como micromatrices (Schena et al., 1995), una prueba de pronóstico viable debe basarse en una plataforma de expresión génica a menor escala tal como una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) (Freeman et al., 1999). De hecho, la mayoría de las pruebas de pronóstico modernas desarrolladas para diferentes afecciones, tales como AlloMap, Oncotype Dx y CorusCAD son pruebas basadas en qPCR (Micheel et al., 2012) , mientras que solo unas pocas pruebas más antiguas, tales como MammaPrint, se basan en micromatrices (Micheel et al., 2012). Por este motivo, si se pudiera descubrir una señal que recapitulara los subgrupos EII1/EII2 en sangre entera, la posibilidad de detectarlo mediante qPCR sería clave para su aplicación en un entorno clínico.
Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad en la materia de una señal de expresión génica de EII1/EII2 que se pueda detectar en la sangre completa utilizando métodos tales como qPCR.
Exposición de la invención
Los presentes inventores han identificado de manera sorprendente una señal de expresión génica que se puede utilizar para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII (por ejemplo, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn) mediante el análisis de la expresión génica en una muestra de sangre completa obtenida del individuo. Se puede determinar la expresión de estos genes en la sangre completa, por ejemplo, mediante RT-qPCR. De manera específica, los presentes inventores han descubierto que un fenotipo de riesgo alto (EII1) se caracteriza por la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en la sangre completa, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2).
En un aspecto, la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, proporciona, por lo tanto, un método para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII que comprende establecer, mediante la determinación del nivel de expresión de cuatro o más genes en una muestra de sangre completa obtenida del individuo, si dicho individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2), en donde los cuatro o más genes se seleccionan del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, Vt RnA 1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96, GZMK y TRGV3, y en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1. Un fenotipo EII1 se caracteriza por la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2 y la expresión regulada disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2.
En una realización, el método puede comprender determinar el nivel de expresión de dichos dos o más genes utilizando, por ejemplo, RT-qPCR, PCR digital o secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo. En este caso, el método puede comprender: (i) proporcionar una muestra de sangre completa obtenida del individuo; (ii) extraer ARN (por ejemplo, ARNm) de la muestra de sangre completa; (iii) convertir el ARN (por ejemplo, el ARNm) en ADNc, y (iv) realizar una RT-qPCR, PCR digital o secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo para determinar el nivel de expresión de los cuatro o más genes.
La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, también proporciona un sistema de evaluación del riesgo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino para su uso en un método de la invención, en donde el sistema comprende una herramienta o herramientas para determinar la expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en:
ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1, y un ordenador programado para calcular una puntuación de riesgo de progresión de la EII a partir de los datos de expresión génica del sujeto.
La(s) herramienta(s) para determinar la expresión de los genes pueden ser, o comprender, reactivos para establecer el nivel de expresión de los genes en cuestión utilizando cualquier técnica descrita en el presente documento, tal como RT-qPCR, PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo. Por ejemplo, la(s) herramienta(s) puede(n) ser, o comprender, cebadores adecuados para establecer el nivel de expresión de los genes en cuestión utilizando, por ejemplo, RT-qPCR, PCR digital, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo. El diseño de cebadores adecuados es rutinario y está dentro de las capacidades del experto en la materia. Cuando el método comprende el análisis de la expresión génica múltiple, la(s) herramienta(s) puede(n) además, o de manera alternativa, incluir sondas fluorescentes para establecer el nivel de expresión de los genes en cuestión. La(s) herramienta(s) también puede(n) ser, o comprender, reactivos de extracción de ARN y/o reactivos para la transcripción inversa de ARN en ADNc. La(s) herramienta(s) también puede(n) ser, o comprender, uno o más elementos y/o reactivos para la realización del método, tales como soluciones tampón y/o medios para obtener la muestra de prueba en sí, por ejemplo, medios para obtener y/o aislar una muestra y recipientes de manipulación de muestras (siendo en general dichos componentes estériles). El cálculo de una puntuación de riesgo de progresión de EII se puede lograr de varias maneras y los métodos ilustrativos se exponen a continuación.
La presente invención proporciona además un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa para su uso en un método de tratamiento de una EII en un individuo. El método comprende: (i) identificar al individuo como uno que tiene riesgo alto o bajo de progresión de una EII utilizando un método de la invención, y (ii) someter al individuo a tratamiento con el fármaco antinflamatorio o esteroide antinflamatorio, o inhibidor de TNFa.
En una realización alternativa, el método puede comprender: (i) revisar los resultados de las pruebas que clasifican a dicho individuo como EII1 (riesgo alto de progresión de una EII) o EII2 (riesgo bajo de progresión de una EII), en donde dicha prueba determina el nivel de expresión de cuatro o más genes en una muestra de sangre completa obtenida del individuo, en donde los cuatro o más genes se seleccionan del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1, en donde la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2) y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2), indica que el individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1), y en donde la expresión disminuida de los genes A r r Dc 4, Gb P5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) y la expresión aumentada de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1), indica que el individuo tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2), y (ii) tratar al individuo que se determinó que tiene un fenotipo EII1 o EII2 para la EII con la terapia antinflamatoria o inmunosupresora.
Breve descripción de las figuras
En la figura 1 se muestra un gráfico de Kaplan-Meier que compara la supervivencia sin aumento escalonado del tratamiento entre los grupos EN1/EN2 basados en linfocitos T CD8 originarios (izquierda) y los grupos EN1/EN2 previstos utilizando el clasificador de qPCR de sangre completa descrito en el ejemplo 1 (derecha; véase la tabla 1 para obtener detalles de los genes incluidos en el clasificador). Obs: grupos originarios observados; prev: grupos previstos utilizando datos de qPCR de sangre completa; p: Valor p de la prueba de rangos logarítmicos. CL1 y CL2 se refieren a los subgrupos EII1 (riesgo alto) y EII2 (riesgo bajo), respectivamente.
En la figura 2 se muestra un gráfico que demuestra la probabilidad prevista de que cada paciente pertenezca al grupo EII1, de acuerdo con el clasificador de qPCR (Tabla 1). Puntos vacíos: Pacientes EII1; puntos rellenos: Pacientes EII2.
En la figura 3 se muestra un diagrama de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia sin aumento escalonado del tratamiento en los grupos EN1/EN2 previstos utilizando el clasificador de qPCR de sangre completa optimizado descrito en el ejemplo 2 en una cohorte independiente de 85 pacientes con EII recién diagnosticados (véase la tabla 2 para obtener detalles de los genes incluidos en el clasificador). qPCR PAX1 y qPCR PAX2 se refieren a los subgrupos EII1 y EII2, respectivamente. El cociente de riesgos instantáneos para el subgrupo EII1 en relación con el subgrupo EII2 fue 3,52, como se indica en la figura 3.
En la figura 4 se muestran diagramas de Kaplan-Meier que comparan la supervivencia sin aumento escalonado del tratamiento entre los grupos EN1/EII2 previstos utilizando las señales de expresión génica descritas en el documento WO2010/084312. p: Valor p de la prueba de rangos logarítmicos. CL1 y CL2 se refieren a los subgrupos EII1 y EII2, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
Tal como se ha mencionado anteriormente, los presentes inventores han identificado una señal de expresión génica que se puede utilizar para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII mediante el análisis de la expresión génica en una muestra de sangre completa obtenida del individuo, por ejemplo, mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR).
De manera específica, los presentes inventores han descubierto que un fenotipo de riesgo alto (EII1) se caracteriza por la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2). Los números de referencia de NCBI (así como los números de GI) para estos genes se establecen en la tabla 2 a continuación.
Tal como se ha explicado anteriormente, aunque los métodos para evaluar si un individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) se han descrito anteriormente, estos métodos no se pueden aplicar directamente a muestras de sangre completa, sino que requieren el aislamiento de, por ejemplo, linfocitos T CD8 de las muestras de sangre, lo que limita de manera intensa su aplicabilidad clínica. Por el contrario, la señal de expresión génica identificada por los presentes inventores se puede detectar en muestras de sangre completa, lo que elimina la necesidad de aislar un tipo de célula particular de la muestra de sangre y aumenta enormemente la utilidad clínica de los métodos de diagnóstico que emplean esta señal de expresión génica. En particular, evitar la necesidad de aislar un tipo de célula particular antes del análisis de la expresión génica reduce la complejidad técnica de los métodos de la invención, así como hacer que dichos métodos consuman menos tiempo y sean más rentables de realizar.
Un método divulgado en el presente documento, tal como un método para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII, puede comprender, por lo tanto, determinar el nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3. Los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 representan los 16 genes marcadores principales para determinar la presencia de un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo, como han identificado los presentes inventores. De acuerdo con la invención, los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1.
Se espera que la determinación del nivel de expresión de cuatro o más de dichos genes sea más consistente que la determinación del nivel de expresión de un solo gen. Por ejemplo, determinar el nivel de expresión de cuatro o más genes puede permitir determinar con precisión la presencia, o ausencia, de un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) incluso si el nivel de expresión de, por ejemplo, un gen no se puede determinar o es inexacto.
Por ejemplo, un método divulgado en el presente documento, puede comprender determinar el nivel de expresión de tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más o los dieciséis genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3. De acuerdo con la invención, el método comprende determinar el nivel de expresión de cuatro o más genes. Preferentemente, un método divulgado en el presente documento comprende determinar el nivel de expresión de al menos cinco de los genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
Por ejemplo, un método como se divulga en el presente documento puede comprender determinar el nivel de expresión de IL18RAP y TRGC2. Opcionalmente, dicho método puede comprender además determinar el nivel de expresión de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más o los catorce genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
Como otro ejemplo, un método como se divulga en el presente documento puede comprender determinar el nivel de expresión de IL18RAP, TRGC2 y TRGV3. Opcionalmente, dicho método puede comprender además determinar el nivel de expresión de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más o los trece genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136 y LY96.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino (EII), comprendiendo el método establecer, mediante la determinación del nivel de expresión de cuatro o más genes en una muestra de sangre completa obtenida del individuo, si el individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2), en donde los cuatro o más genes se seleccionan del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, y los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1. De acuerdo con la invención, un fenotipo EII1 se caracteriza por la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2. El método de la invención puede comprender además determinar el riesgo de progresión de una EII en el individuo mediante el cálculo de una puntuación de riesgo para el paciente mediante a) la ponderación de los niveles de expresión medidos de los genes seleccionados; b) la aplicación de un modelo de regresión logística a los niveles de expresión ponderados para determinar la puntuación de riesgo, en donde una puntuación de riesgo de menos de 0,5 es indicativa de riesgo bajo de progresión de la EII y una puntuación de riesgo de más de 0,5 es indicativa de riesgo alto de progresión de la EII; y c) la creación de un informe que resuma el resultado de la determinación.
En determinados aspectos de la invención, el método puede comprender seleccionar un individuo identificado como uno que tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII para el tratamiento de la EII. El método de divulgación puede comprender además, en realizaciones no reclamadas, someter a un individuo identificado como de riesgo alto o de riesgo bajo de progresión de una EII a un tratamiento para la EII.
En determinados aspectos de la invención, el nivel de expresión de los cuatro o más genes se determina mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo.
En determinados aspectos de la invención, el método comprende: (i) proporcionar una muestra de sangre completa obtenida del individuo; (ii) extraer ARN de la muestra de sangre completa; (iii) convertir el ARN en ADNc; y (iv) realizar una RT-qPCR, PCR digital o secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo para determinar el nivel de expresión de los cuatro o más genes.
En determinados aspectos, la divulgación se refiere a una terapia antinflamatoria o inmunosupresora para su uso en un método para tratar una EII en un individuo, comprendiendo el método (i) identificar al individuo como uno que tiene riesgo alto o bajo de progresión de la EII y (ii) someter al individuo a tratamiento para la EII con la terapia antinflamatoria o inmunosupresora.
Otros aspectos de la invención incluyen un sistema de evaluación del riesgo de progresión de la enfermedad autoinmunitaria para su uso en el método de la invención, comprendiendo el sistema una herramienta o herramientas para determinar la expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1, y un ordenador programado para calcular una puntuación de riesgo de progresión de la EII a partir de los datos de expresión génica del sujeto. El sistema puede comprender una herramienta o herramientas para determinar la expresión de dos o más genes mediante RT-qPCR., PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo.
En determinados aspectos, la invención se refiere a una terapia antinflamatoria o inmunosupresora para su uso en un método para tratar una EII en un individuo que se determina que tiene un riesgo alto o bajo de progresión de la EII, comprendiendo el método (i) revisar los resultados de las pruebas que clasifican a dicho individuo como EII1 (riesgo alto de progresión de la EII) o EII2 (riesgo bajo de progresión de la EII), en donde la prueba determina los niveles de expresión de cuatro o más genes, en donde los cuatro o más genes se seleccionan del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en una muestra de sangre completa obtenida del individuo, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1, y en donde la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2), indica que el individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1), y en donde la expresión disminuida de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión aumentada de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1), indica que el individuo tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2), y (ii) tratar al individuo que se determinó que tiene un fenotipo EII1 o EII2 para la EII con la terapia antinflamatoria o inmunosupresora. El método puede comprender además solicitar una prueba que proporcione los resultados de un análisis para determinar el nivel de expresión de los cuatro o más genes mediante RT-qPCR, PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo.
En determinados aspectos no reclamados, la divulgación se refiere a un kit para evaluar si un individuo tiene un fenotipo de riesgo alto EII1 o de riesgo bajo EII2, en donde el kit comprende reactivos para establecer el nivel de expresión de dos o más genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en donde un fenotipo EII1 se caracteriza por la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2, y en donde un fenotipo EII2 se caracteriza por una expresión disminuida de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión aumentada de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII1. El kit puede comprender reactivos para establecer el nivel de expresión de los dos o más genes mediante RT-qPCR, análisis de micromatrices, PCR digital, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo.
En determinados aspectos de la invención, la EII es la colitis ulcerosa (CU) o la enfermedad de Crohn.
También se describe un método in vitro para identificar una sustancia capaz de inducir un fenotipo de riesgo bajo (EII2) en un paciente con una EII, comprendiendo el método proporcionar (i) una muestra de sangre completa obtenida de un paciente con EII antes del tratamiento con la sustancia de interés, y (ii) una muestra de sangre completa obtenida del paciente con EII después del tratamiento con la sustancia de interés, en donde se ha determinado que el paciente con EII tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1); y determinar el nivel de expresión de dos o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en las muestras (i) y (ii); en donde una menor expresión de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y una mayor expresión de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en la muestra (ii) en relación con la muestra (i) indican que la sustancia es capaz de inducir un fenotipo de riesgo bajo (EII2) en un paciente con EII. El método puede comprender además formular una sustancia identificada como capaz de inducir un fenotipo de riesgo bajo (EII2) en un paciente con EII en un medicamento.
También se describe un método in vitro para identificar una sustancia capaz de tratar una EII en un individuo, comprendiendo el método (i) identificar a un individuo que tiene un riesgo alto o bajo de progresión de la EII; y (ii) comparar el nivel de progresión de la EII en el individuo después del tratamiento con la sustancia de interés con un control, en donde un nivel más bajo de progresión de la EII en el individuo en comparación con el control indica que la sustancia es capaz de tratar la EII. El método puede comprender además comprender formular una sustancia identificada como capaz de tratar la EII en un medicamento.
También se describe un método para proporcionar una matriz de productos de expresión génica seleccionados e identificados del paciente a partir de una muestra de sangre completa de un paciente, comprendiendo el método a) proporcionar ARN de una muestra de sangre completa de dicho paciente; b) convertir el ARN en ADNc; c) colocar alícuotas individuales del ADNc en una matriz de manera que las alícuotas de ADNc se identifiquen como alícuotas de ADNc de muestras del paciente; d) realizar una RT-qPCR, PCR digital o secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo en las alícuotas de ADNc individuales para cada gen de los tres o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 para proporcionar productos de RT-qPCR, de PCR digital o de secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo en la matriz, proporcionando así una matriz de productos de expresión génica seleccionados e identificados del paciente que consisten de manera esencial en los tres o más productos de expresión génica. El método puede comprender además la etapa de cuantificar los productos de la RT-qPCR, la PCR digital o la secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo. El producto de la RT-qPCR puede proporcionarse poniendo en contacto el ADNc con un conjunto de cebadores específicos para cada uno de los tres o más genes. El conjunto de cebadores puede comprender un cebador directo, un cebador inverso y un cebador de sonda. En algunas realizaciones, cuatro, cinco, trece, catorce o dieciséis de los genes se seleccionan del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
También se describe una matriz de productos de expresión génica seleccionados e identificados del paciente a partir de una muestra de sangre completa de un paciente, comprendiendo dicha matriz alícuotas de ADNc individuales identificadas como ADNc de muestra del paciente, en donde cada una de las tres o más alícuotas de ADNc de la matriz comprende un par de cebadores de RT-qPCR específicos para amplificar en la alícuota de ADNc un producto de expresión génica seleccionado, en donde la matriz comprende pares de cebadores específicos para tres o más genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3. La matriz puede comprender además una sonda de RT-qPCR específica para los tres o más genes. En algunas realizaciones, cuatro, cinco, trece, catorce o dieciséis de los genes se seleccionan del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
También se describe un método para proporcionar una matriz de productos de expresión génica seleccionados, identificados del paciente y cuantificados a partir de una muestra de sangre completa de un paciente, comprendiendo el método a) proporcionar ARN de una muestra de sangre completa del paciente; b) convertir dicho ARN en ADNc; c) colocar alícuotas de dicho ADNc en una matriz de manera que las alícuotas de ADNc se identifiquen como alícuotas de ADNc de muestra del paciente; y d) realizar una RT-qPCR, PCR digital o secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo en dichas alícuotas de ADNc para proporcionar productos de expresión génica de la RT-qPCR, la PCR digital o la secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo en la matriz; y e) cuantificar la cantidad de un producto de expresión génica para cada gen seleccionado de los tres o más genes seleccionados del grupo de genes que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3; proporcionando así una matriz de productos de expresión génica seleccionados, identificados del paciente y cuantificados a partir de una muestra de sangre completa de un paciente. En determinados aspectos del método, para cada producto de expresión génica seleccionado en la matriz, la cantidad de producto de expresión génica para un gen seleccionado del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, es menor que un control para el gen; y la cantidad de producto de expresión génica para un gen seleccionado del grupo que consiste en: LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 es mayor que un control para el gen. En otro aspecto del método, para cada producto de expresión génica seleccionado en la matriz, la cantidad de producto génico para un gen seleccionado del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, es mayor que un control para el gen; y la cantidad de producto génico para un gen seleccionado del grupo que consiste en: Lg A lSL, FCRL5, IFI44L, LiNc 01136, LY96 y TRGV3 es menor que un control para el gen. En algunas realizaciones, cuatro, cinco, trece, catorce o dieciséis de los genes se seleccionan del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
También se describe una matriz de productos de expresión génica seleccionados, identificados del paciente y cuantificados, comprendiendo la matriz productos de expresión génica cuantificados individuales de una muestra de sangre completa de un paciente, consistiendo los productos de expresión génica cuantificados en productos de ADNc amplificados de tres o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3. En algunas realizaciones, para cada producto de expresión génica seleccionado en la matriz, la cantidad de producto de expresión génica para un gen seleccionado del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, es menor que un control para el gen; y la cantidad de producto de expresión génica para un gen seleccionado del grupo que consiste en: LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 es mayor que un control para el gen. En algunas realizaciones, la cantidad de producto génico para un gen seleccionado del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, es mayor que un control para el gen; y la cantidad de producto génico para un gen seleccionado del grupo que consiste en: Lg A lSL, FCRL5, IFI44L, LiNc 01136, LY96 y TRGV3 es menor que un control para el gen. En algunas realizaciones, cuatro, cinco, trece, catorce o dieciséis de los genes se seleccionan del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "matriz" o "grupo" se define como un conjunto de moléculas de ácido nucleico que está contenido dentro de, o fijado a, uno o más receptáculos, sustratos o soportes sólidos de una manera que permita la identificación y cuantificación de miembros de ácido nucleico individuales durante la manipulación experimental. Ejemplos no limitantes de receptáculos, sustratos o soportes sólidos incluyen una serie de tubos de reacción, micromatrices, placas de pocillos múltiples (por ejemplo, placas de 16 pocillos, 32 pocillos, 48 pocillos, 96 pocillos, 384 pocillos y 1536 pocillos), dispositivos microfluídicos y otros receptáculos, sustratos o soportes sólidos bien conocidos en la materia.
Tal como se utiliza en el presente documento, "identificado del paciente" se define como señalado, marcado, codificado o indicado de otro modo que procede de, se originó o derivó de un paciente individual. Los ejemplos no limitantes incluyen el nombre del paciente, el número de seguro social del paciente, un código de barras, un número de paciente, un código, un símbolo u otros identificadores únicos adecuados.
Tal como se utiliza en el presente documento, "producto de expresión génica" se define como un ácido nucleico producido a partir de la transcripción de un gen particular. Los ejemplos no limitantes de un producto de expresión génica incluyen transcritos de ARNm, ADNc y fragmentos de ADNc creados o procedentes de dicho ARNm, ADN o fragmentos de ADN creados a partir de o procedentes de dicho ARNm o dicho ADNc y fragmentos de ADNc. Los ejemplos no limitantes de productos de expresión génica incluyen ARNm, ADNc y fragmentos de ADNc del mismo creados a partir de dicho ARNm mediante transcripción inversa, y ADN creado o procedente de dicho ARNm, ADNc o fragmentos de ADNc del mismo producidos a través de amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés "polymerase chain reaction"), reacción en cadena de la ligasa (LCR, del inglés "ligase chain reaction") y otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos bien conocidas en la materia.
Tal como se utiliza en el presente documento, "que consiste esencialmente en" se define como "que comprende opcionalmente" otros elementos o productos que no afectan de manera material al resultado, respuesta o lectura del método, ensayo o producto reivindicado.
Tal como se utiliza en el presente documento, "cuantificado" se define como una cantidad determinada de un producto de expresión génica de una muestra obtenida de un paciente. Los métodos adecuados no limitantes para determinar una cantidad de un producto de expresión génica presente en una muestra procedente u obtenida de un paciente incluyen RT-qPCR, PCR digital, secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo, análisis directo y múltiple de la expresión génica, y otros métodos bien conocidos en la materia.
Tal como se utiliza en el presente documento, "par de cebadores" se define como dos cebadores u oligonucleótidos que consisten en un cebador u oligonucleótido directo e inverso, que son capaces de amplificar un ADNc o secuencias de ADN específicas, o fragmentos de los mismos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Tal como se utiliza en el presente documento, "conjunto de cebadores" se define como uno o más pares de cebadores que son capaces de amplificar una o más secuencias de ADNc o ADN específicas, o fragmentos de las mismas, mediante PCR.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "evolución de la enfermedad intensa" se define como la presentación de un paciente con EII con períodos relativamente cortos entre brotes de EII y/o una tasa aumentada de brotes de enfermedad de EII a lo largo del tiempo. Los brotes de EII se caracterizan por un índice de Harvey Bradshaw (actividad de la enfermedad) >5; y (i) un nivel de proteína C reactiva (CRP, del inglés "C Reactive Protein") de >10 mg/l, (ii) un nivel de calprotectina de >200 pg/g, o (iii) indicios endoscópicos de actividad de la enfermedad.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "evolución de la enfermedad leve" se define como la presentación de un paciente con EII con periodos relativamente largos entre brotes de EII y/o una tasa de brotes de enfermedad EII que no aumentan con el tiempo. Los brotes de EII se caracterizan por un índice de Harvey Bradshaw (actividad de la enfermedad) >5; y (i) un nivel de proteína C reactiva (CRP, del inglés "C Reactive Protein") de >10 mg/l, (ii) un nivel de calprotectina de >200 pg/g, o (iii) indicios endoscópicos de actividad de la enfermedad.
Un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) y, por lo tanto, tiene un riesgo alto de progresión de la EII, se caracteriza por la expresión aumentada de los genes Ar Rd C4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo EII2.
De manera similar, un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2) y, por lo tanto, tiene un riesgo bajo de progresión de la EII, se caracteriza por la expresión disminuida de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y la expresión aumentada de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto EII1.
Una expresión aumentada o disminuida de un gen puede referirse a un nivel de expresión de dicho gen significativamente aumentado o significativamente disminuido, respectivamente. Si un individuo tiene un nivel de expresión de los genes en cuestión aumentado o disminuido puede determinarse mediante cualquier medio conveniente y se conocen en la materia muchas técnicas adecuadas y se describen en el presente documento.
Como es el caso con la mayoría de los biomarcadores, la precisión de la predicción puede no ser absoluta. Por lo tanto, los individuos se clasifican como de riesgo alto o bajo de progresión de una EII. Este riesgo puede expresarse de varias maneras.
Por ejemplo, si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII puede expresarse en términos de una tasa de riesgo. La tasa de riesgo en el presente documento describe la probabilidad instantánea de progresión de una EII en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o riesgo bajo (EII2). De manera alternativa, el riesgo de progresión de una EII puede expresarse en términos de un cociente de riesgos instantáneos (HR, del inglés "hazard ratio"), donde el cociente de riesgos instantáneos describe la probabilidad de progresión de una EII en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) en relación con un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2).
Los presentes inventores han demostrado que los individuos que tenían un fenotipo de riesgo alto (EII1) tenían un cociente de riesgos instantáneos de 3,52 con respecto a la probabilidad de progresión de una EII en relación con los individuos que tenían un fenotipo de riesgo bajo (EII2) (véase el ejemplo 3 y la figura 3).
En una realización preferida, un individuo que tiene un riesgo alto de progresión de una EII puede tener además una tasa de riesgo con respecto a la progresión de la EII de al menos 2, al menos 2,5, al menos 3 o al menos 3,5 veces mayor que la tasa de riesgo de un individuo con riesgo bajo de progresión de la EII. De manera similar, un individuo que tiene un riesgo bajo de progresión de una EII puede tener una tasa de riesgo con respecto a la progresión de la EII de al menos 2, al menos 2,5, al menos 3 o al menos 3,5 veces menor que la tasa de riesgo de un individuo con riesgo alto de progresión de la EII. Por lo tanto, un individuo que tiene un riesgo alto de progresión de una EII, puede tener un cociente de riesgos instantáneos con respecto a la progresión de la EII de al menos 2, al menos 2,5, al menos 3 o al menos 3,5 en relación con un individuo que tiene un riesgo bajo de progresión de la EII. Más preferentemente, un individuo que tiene un riesgo alto de progresión de una EII, tiene una tasa de riesgo con respecto a la progresión de la EII que es al menos 3,5 veces mayor que la tasa de riesgo de un individuo que tiene un riesgo bajo de progresión de la EII, es decir, tiene un cociente de riesgos instantáneos con respecto a la progresión de la EII de al menos 3,5 en relación con un individuo que tiene un riesgo bajo de progresión de la EII, y un individuo con un riesgo bajo de progresión de la EII, tiene una tasa de riesgo con respecto a la progresión de la EII que es al menos 3,5 veces menor que la tasa de riesgo de un individuo que tiene un riesgo alto de progresión de la EII.
De manera alternativa, un individuo que tiene un riesgo alto de progresión de una EII, puede ser al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces, al menos 1,5 veces, al menos 1,6 veces, al menos 1,7 veces, al menos 1,8 veces, al menos 1,9 veces, al menos 2 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2,3 veces, al menos 2,4 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,6 veces, al menos 2,7 veces, al menos 2,8 veces, al menos 2,9 veces, al menos 3 veces, al menos 3,1 veces, al menos 3,2 veces, al menos 3,3 veces, al menos 3,4 veces o al menos 3,5 veces, más propenso a experimentar la progresión de la EII que un individuo con riesgo bajo de progresión de la EII. De manera similar, un individuo que tiene riesgo bajo de progresión de una EII, puede ser al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces, al menos 1,5 veces, al menos 1,6 veces, al menos 1,7 veces, al menos 1,8 veces, al menos 1,9 veces, al menos 2 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2,3 veces, al menos 2,4 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,6 veces, al menos 2,7 veces, al menos 2,8 veces, al menos 2,9 veces, al menos 3 veces, al menos 3,1 veces, al menos 3,2 veces, al menos 3,3 veces, al menos 3,4 veces o al menos 3,5 veces, menos propenso a experimentar una progresión de la EII que un individuo que tiene un riesgo alto de progresión de la EII. La probabilidad de progresión de una EII puede referirse a la probabilidad de progresión de la EII durante un periodo de un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años.
Por lo tanto, un individuo con riesgo alto de progresión de una EII puede tener al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, al menos un 180 %, al menos un 190 %, al menos un 200 %, al menos un 210 %, al menos un 220 %, al menos un 230 %, al menos un 240 %, al menos un 250 %, al menos un 260 %, al menos un 270 %, al menos un 280 %, al menos un 290 %, al menos un 300 %, al menos un 310 %, al menos un 320 %, al menos un 330 %, al menos un 340 % o al menos un 350 %, más de probabilidad de progresión de la EII que un individuo con riesgo bajo de progresión de la EII. De manera similar, una persona con riesgo bajo de progresión de una EII puede tener al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, al menos un 180 %, al menos un 190 %, al menos un 200 %, al menos un 210 %, al menos un 220 %, al menos un 230 %, al menos un 240 %, al menos un 250 %, al menos un 260 %, al menos un 270 %, al menos un 280 %, al menos un 290 %, al menos un 300 %, al menos un 310 %, al menos un 320 %, al menos un 330 %, al menos un 340 % o al menos un 350 %, menos de probabilidad de progresión de la EII que un individuo con riesgo alto de progresión de la EII. La probabilidad de progresión de una EII puede referirse a la probabilidad de progresión de la EII durante un periodo de un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años.
Hay muchos métodos adecuados que se pueden utilizar para establecer si un individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) (también denominado en el presente documento como puntuación de riesgo de progresión de la EII), mediante la determinación de los niveles de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, Lg A l s L, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en una muestra obtenida del individuo (es decir, la muestra de prueba), en donde la muestra es preferentemente una muestra de sangre completa.
Por ejemplo, el nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en una muestra obtenida del individuo puede compararse con una recopilación de datos que relaciona la expresión de los genes en cuestión con un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2). En una realización preferida, el nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en una muestra obtenida del individuo se compara con los datos de expresión de los genes en cuestión obtenidos de individuos que se sabe que tienen un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) y, a partir de dicha comparación, se evalúa si el individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de la EII. La comparación puede utilizar un modelo de regresión lineal.
De manera alternativa, el nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en una muestra obtenida del individuo puede utilizarse para establecer si un individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) mediante el uso de un modelo computacional basado en los datos de expresión génica para los genes en cuestión obtenidos de individuos que se sabe que tienen una EII, y una técnica de aprendizaje automático adecuada (tal como regresión logística, máquinas de vectores de soporte o métodos basados en árboles de decisiones). Por ejemplo, el modelo computacional puede basarse en datos de expresión génica para los genes en cuestión obtenidos de individuos que se sabe que tienen un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2). De manera alternativa, el modelo computacional puede basarse en datos de expresión génica para los genes en cuestión obtenidos de individuos que se sabe que tienen una EII y que se sabe que tienen o no han experimentado una progresión de la EII.
En un ejemplo adicional, el nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en una muestra, que es una muestra de sangre completa obtenida de un individuo (es decir, la muestra de prueba), puede compararse con un nivel liminar para cada gen en cuestión. Se puede determinar un nivel liminar adecuado para un gen, por ejemplo, utilizando datos de expresión de qPCR y métodos de aprendizaje automático (tales como regresión logística, máquinas de vectores de soporte o métodos basados en árboles de decisiones) para establecer un umbral de expresión óptimo que permita la máxima separación de pacientes en los subgrupos de pronóstico diferenciados EII1 y EII2. La comparación del nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGAlSl , Fc RL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 con un nivel liminar para cada uno de los genes en cuestión puede, por lo tanto, indicar si el individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2).
De manera alternativa, la mediana del nivel de expresión de cada uno de los genes en cuestión (es decir, cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3) en muestras obtenidas de un grupo de individuos puede utilizarse como valor de control, en donde el grupo consistió en individuos, preferentemente al menos 100, al menos 50 o al menos 10 individuos, que no tuvieron progresión de la EII. En este caso, una mediana del nivel de expresión superior de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 o GZMK, o una mediana del nivel de expresión inferior de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 o TRGV3 en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo puede indicar la presencia de un fenotipo de riesgo alto (EII1), mientras que una mediana del nivel de expresión igual o inferior de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 o GZMK, o una mediana del nivel de expresión igual o superior de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 o TRGV3 en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo puede indicar la presencia de un fenotipo de riesgo bajo (EII2).
Como alternativa adicional, la mediana del nivel de expresión de cada uno de los genes en cuestión en muestras obtenidas de un grupo de individuos, preferentemente al menos 100, al menos 50 o al menos 10 individuos, puede utilizarse como un control, en donde el grupo consiste en individuos que presentaban progresión de una EII. En este caso, una mediana del nivel de expresión igual o superior de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, o GZMK, o una mediana del nivel de expresión igual o inferior de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 o TRGV3 en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo puede indicar la presencia de un fenotipo de riesgo alto (EII1), mientras que una mediana del nivel de expresión inferior de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 o GZMK, o una mediana del nivel de expresión superior de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 o TRGV3 en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo puede indicar la presencia de un fenotipo de riesgo bajo (EII2).
Como otra alternativa más, la mediana del nivel de expresión de cada uno de los genes en cuestión en muestras obtenidas de un grupo de individuos, preferentemente al menos 100, al menos 50 o al menos 10 individuos pueden utilizarse como control, en donde el grupo comprendía individuos que tenían y no tenían progresión de la EII. Preferentemente, el grupo comprendía un número igual, o un número esencialmente igual, de individuos que tenían y no tenían progresión de la EII. En este caso, una mediana del nivel de expresión superior de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 o GZMK, o una mediana del nivel de expresión inferior de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 o TRGV3 en una muestra de sangre completa obtenida del individuo puede indicar la presencia de un fenotipo de riesgo alto (EII1), mientras que una mediana del nivel de expresión inferior de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 o GZMK, o una mediana del nivel de expresión superior de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 o TRGV3 en una muestra de sangre completa obtenida del individuo puede indicar la presencia de un fenotipo de riesgo bajo (EII2).
El nivel de expresión de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 puede determinarse mediante cualquier medio conveniente y se conocen en la materia muchas técnicas adecuadas. Por ejemplo, las técnicas adecuadas incluyen: PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR, del inglés "real time quantitative"), PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo (RNA-SEQ), análisis directo y múltiple de la expresión génica, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), chips de proteínas, citometría de flujo (tal como Flow-FISH para a Rn , también conocida como FlowRNA), espectrometría de masas, transferencia Western y transferencia Northern. Por lo tanto, un método de la invención puede comprender poner en contacto una muestra de sangre completa obtenida de un individuo con un reactivo adecuado para determinar el nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo de ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1, por ejemplo, un reactivo o reactivos adecuados para determinar el nivel de expresión de dos o más de dichos genes usando RT-qPCR, PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo, análisis directo y múltiple de la expresión génica, ELISA, chips de proteínas, citometría de flujo, espectrometría de masas o transferencia Western. Por ejemplo, el reactivo puede ser un par o pares de cebadores de ácido nucleico, adecuado para determinar el nivel de expresión de uno o más de dichos genes usando RT-qPCR, PCR digital o secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo. De manera alternativa, el reactivo puede ser un anticuerpo adecuado para determinar el nivel de expresión de dichos uno o más genes utilizando ELISA o transferencia Western. Preferentemente, el nivel de expresión de dichos genes se determina mediante RT-qPCR, PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo. Lo más preferentemente, el nivel de expresión de dichos genes se determina mediante RT-qPCR.
La RT-qPCR permite la amplificación y cuantificación simultánea de una molécula de ADN diana. Para analizar los niveles de expresión génica mediante RT-qPCR, el ARNm total de una muestra de sangre completa puede aislarse primero y transcribirse de manera inversa en ADNc con transcriptasa inversa. Por ejemplo, los niveles de ARNm se pueden determinar con, por ejemplo, ensayos de expresión génica Taqman (Applied Biosystems) en un instrumento ABI PRISM 7900HT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La abundancia de transcritos se puede calcular después mediante la comparación con una curva convencional.
La PCR digital es un nuevo enfoque para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos que ofrece un método alternativo a la PCR cuantitativa en tiempo real convencional para la cuantificación absoluta y la detección de alelos raros. La PCR digital funciona dividiendo una muestra de ADN o ADNc en muchas reacciones de PCR individuales y paralelas; algunas de estas reacciones contienen la molécula diana (positivas) mientras que otras no (negativas). Una sola molécula se puede amplificar un millón de veces o más. Durante la amplificación, se utiliza la química TaqMan® con sondas marcadas con tinte para detectar dianas específicas de secuencia. Cuando no hay una secuencia diana presente, no se acumula ninguna señal. Después del análisis PCR, la fracción de reacciones negativas se utiliza para generar un recuento absoluto del número de moléculas diana en la muestra, sin necesidad de normas o controles endógenos. El uso de un chip de nanofluidos proporciona un mecanismo conveniente y sencillo para ejecutar miles de reacciones de PCR en paralelo. Cada pocillo se carga con una mezcla de muestra, mezcla maestra y reactivos del ensayo TaqMan®, y se analizan de manera individual para detectar la presencia (positivo) o ausencia (negativo) de una señal de criterio de valoración. Para tener en cuenta los pocillos que pueden haber recibido más de una molécula de la secuencia diana, se aplica un factor de corrección utilizando el modelo de Poisson.
RNA-SEQ utiliza secuenciación de próxima generación (NGS, del inglés "next-generation sequencing") para la detección y cuantificación de ARN en una muestra biológica en un momento dado. Se prepara una biblioteca de ARN, se transcribe, se fragmenta, se secuencia, se reensambla y la secuencia o secuencias de interés se cuantifican.
La tecnología NanoString utiliza códigos de barras moleculares únicos codificados por colores que pueden hibridarse directamente con muchos tipos diferentes de moléculas de ácido nucleico diana y ofrece una forma rentable de analizar los niveles de expresión de hasta 800 genes de manera simultánea, con una sensibilidad comparable a la de la qPCR.
La Flow-FISH para ARN emplea citometría de flujo para determinar la abundancia de un ARNm diana dentro de una muestra utilizando oligonucleótidos de ARN marcados con fluorescencia. Esta técnica se describe, por ejemplo, en Porichis et al., Nat Comm (2014) 5:5641. La ventaja de esta técnica es que se puede utilizar sin necesidad de separar las células presentes en una muestra.
Las micromatrices permiten comparar la expresión génica en dos muestras. El ARN total se aísla primero de, por ejemplo, PBMC o sangre completa utilizando, por ejemplo, Trizol o un mini kit RNeasy (Qiagen). A continuación, el ARN total aislado se transcribe de forma inversa en ADNc bicatenario utilizando transcriptasa inversa y cebadores polyT y se marca con, por ejemplo, Cy3- o Cy5-dCTP. A continuación, las muestras marcadas con Cy3 y Cy5 adecuadas se agrupan y se hibridan con micromatrices de oligonucleótidos manchadas personalizadas compuestas por sondas que representan genes adecuados y características de control, tales como la micromatriz descrita en (Willcocks et al., J Exp Med 205, 1573-82, 2008). Las muestras pueden hibridarse por duplicado, usando una estrategia de cambio de tinte, frente a un ARN de referencia común procedente de muestras de PBMC agrupadas o de sangre completa. Después de la hibridación, las matrices se lavan y se exploran en, por ejemplo, un Agilent G2565B. Las alternativas adecuadas a las etapas descritas anteriormente son bien conocidas en la materia y serán evidentes para los expertos. Los datos de micromatrices sin procesar obtenidos pueden analizarse a continuación con métodos adecuados para determinar la expresión relativa de los genes ARr Dc 4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, según sea aplicable.
Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) permiten detectar las cantidades relativas de proteínas presentes en una muestra. Primero se inmoviliza la muestra en un soporte sólido, tal como una placa de microtitulación de poliestireno, ya sea directamente o mediante un anticuerpo específico para la proteína de interés. Después de la inmovilización, se detecta el antígeno con un anticuerpo específico para la proteína diana. El anticuerpo primario utilizado para detectar la proteína diana se puede marcar para permitir la detección, o el anticuerpo primario se puede detectar con un anticuerpo secundario marcado de manera adecuada. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse mediante la conjugación del anticuerpo con una enzima indicadora. En este caso, la placa se desarrolló mediante la adición de un sustrato enzimático adecuado para producir una señal visible. La intensidad de la señal depende de la cantidad de proteína diana presente en la muestra.
Los chips de proteínas, también conocido como matrices de proteínas o micromatrices de proteínas, permiten detectar las cantidades relativas de proteínas presentes en una muestra. Se pueden fijar diferentes moléculas de captura al chip. Los ejemplos incluyen anticuerpos, antígenos, sustratos enzimáticos, nucleótidos y otras proteínas. Los chips de proteínas también pueden contener moléculas que se unen a varias proteínas. Los chips de proteínas son bien conocidos en la materia y muchos chips de proteínas diferentes están disponibles comercialmente.
La transferencia Western también permite determinar las cantidades relativas de proteínas presentes en una muestra. Las proteínas presentes en una muestra se separan primero mediante electroforesis en gel. A continuación, las proteínas se transfieren a una membrana, por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o PVDF, y se detectan con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para la proteína diana. Muchos anticuerpos diferentes están disponibles comercialmente y los métodos para producir anticuerpos para una proteína diana dada también están bien establecidos en la materia. Para permitir la detección, los anticuerpos específicos para la(s) proteína(s) de interés, o anticuerpos secundarios adecuados, pueden, por ejemplo, estar unidos a una enzima indicadora, que impulsa una reacción colorimétrica y produce un color cuando se expone a un sustrato adecuado. Otras enzimas indicadoras incluyen la peroxidasa de rábano picante, que produce quimioluminiscencia cuando se le proporciona un sustrato adecuado. Los anticuerpos también se pueden marcar con marcadores radiactivos o fluorescentes adecuados. Dependiendo del marcador utilizado, los niveles de proteína pueden determinarse con densitometría, espectrofotometría, película fotográfica, película de rayos X o un fotosensor.
La citometría de flujo permite determinar las cantidades relativas de proteínas presentes en, por ejemplo, una muestra de PBMC o de sangre completa obtenida de un sujeto. La citometría de flujo también se puede utilizar para detectar o medir el nivel de expresión de una proteína de interés en la superficie de las células. La detección de proteínas y células mediante citometría de flujo normalmente implica unir primero un marcador fluorescente a la proteína o célula de interés. El marcador fluorescente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo marcado con fluorescencia específico para la proteína o célula de interés. Muchos anticuerpos diferentes están disponibles comercialmente y los métodos para producir anticuerpos específicos para una proteína de interés también están bien establecidos en la materia.
La espectrometría de masas, por ejemplo, la espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI, del inglés "matrix-assisted laser desorption/ionization"), permite la identificación de proteínas presentes en una muestra obtenida de un individuo utilizando, por ejemplo, la impresión digital de la masa peptídica. Antes de la espectrometría de masas, las proteínas presentes en la muestra pueden aislarse mediante electroforesis en gel, por ejemplo, SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño o electroforesis en gel bidimensional.
También se divulga de acuerdo con un aspecto no reivindicado, un kit para su uso en la evaluación de si un individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2), o para evaluar si un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) está presente en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo. El kit puede comprender reactivos para establecer el nivel de expresión de dos o más genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3. Los números de registro de NCBI (así como los números de GI) para estos genes se establecen en la tabla 2. El kit puede comprender reactivos para establecer el nivel de expresión de tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más o los dieciséis genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3. Preferentemente, el kit comprende reactivos para establecer el nivel de expresión de al menos cinco de los genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
El kit comprende, en algunos ejemplos, reactivos para establecer el nivel de expresión de IL18RAP y TRGC2, y opcionalmente reactivos para establecer el nivel de expresión de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más o los catorce genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
En un ejemplo adicional, el kit comprende reactivos para establecer el nivel de expresión de IL18RAP, TRGC2 y TRGV3, y opcionalmente reactivos para establecer el nivel de expresión de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más o los trece genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, HP, NUDT7, GZMH, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136 y LY96.
Por ejemplo, los reactivos pueden ser reactivos adecuados para establecer la expresión de los genes en cuestión utilizando cualquier técnica descrita en el presente documento, tal como RT-qPCR, PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo. Por ejemplo, el kit puede comprender cebadores adecuados para establecer el nivel de expresión de los genes en cuestión utilizando, por ejemplo, RT-qPCR, PCR digital, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo. El diseño de cebadores adecuados es rutinario y está dentro de las capacidades del experto en la materia. Un kit para el análisis directo y múltiple de la expresión génica puede además, o de manera alternativa, incluir sondas fluorescentes para establecer el nivel de expresión de los genes en cuestión.
Además de los reactivos de detección, el kit también puede incluir reactivos de extracción de ARN y/o reactivos para la transcripción inversa de ARN en ADNc.
Un kit también puede incluir uno o más elementos y/o reactivos para la realización del método, tales como soluciones tampón y/o medios para obtener la muestra de prueba en sí, por ejemplo, medios para obtener y/o aislar una muestra y recipientes de manipulación de muestras (siendo en general dichos componentes estériles). El kit puede incluir instrucciones para uso del kit en un método para evaluar si un individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2), o si el fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2) está presente en una muestra de sangre completa.
Una ventaja importante de la presente invención es que el nivel de expresión de los genes identificados por los inventores se puede determinar en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo para evaluar si el individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2). Por lo tanto, una muestra a la que se hace referencia en el contexto de la presente invención es una muestra de sangre completa. Las expresiones muestra de sangre completa, muestra de sangre periférica y muestra de sangre completa periférica se usan indistintamente en el presente documento. Una muestra de sangre completa se refiere a una muestra de sangre, por ejemplo, sangre periférica, obtenida de un individuo con todos sus componentes. Por lo tanto, la expresión "muestra de sangre completa", como se utiliza en el presente documento, no incluye una muestra de (a) tipo(s) específico(s) de células sanguíneas aisladas de sangre completa, tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas o linfocitos T aislados, tales como los linfocitos T CD8+ o CD4+, como se emplea en los métodos de la técnica anterior. La muestra de sangre completa puede someterse a procesamiento después de la recogida de la muestra, tal como lisis celular y/o adición de uno o más inhibidores enzimáticos para inhibir la degradación del ARN en la muestra de sangre completa.
Aunque la presente invención está dirigida a un método para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII mediante la determinación del nivel de expresión de cuatro o más genes en una muestra de sangre completa (en lugar de, por ejemplo, una muestra de PBMC) obtenida de el individuo, se espera que la determinación del nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en una muestra de PBMC obtenida de un individuo podría utilizarse de manera similar para evaluar si el individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de una EII. Sin embargo, esto no se reivindica.
El término "individuo" se refiere a un individuo humano. Un individuo también puede denominarse paciente, es decir, un paciente humano. En el contexto de la presente invención, el individuo tiene EII a menos que el contexto indique lo contrario. Preferentemente, el individuo ha sido diagnosticado con EII. Como la EII se caracteriza por períodos de síntomas intensos (brotes) y períodos de remisión, el individuo puede estar experimentando un brote de EII o estar en remisión de la EII.
La EII se refiere a un grupo de afecciones caracterizadas por la inflamación del intestino. Los síntomas de la EII pueden incluir dolor abdominal, diarrea recurrente o con sangre, pérdida de apetito y pérdida de peso, cansancio y astenia, así como anemia. Los dos tipos principales de EII son la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Otros tipos incluyen la colitis colagenosa y la colitis linfocítica. La CU y la enfermedad de Crohn afectan a más de 300.000 personas solo en el Reino Unido. La colitis ulcerosa afecta principalmente al colon y al recto, mientras que la enfermedad de Crohn afecta al intestino delgado y al intestino grueso, y también puede afectar a la boca, el esófago, el estómago y el ano. La CU y la enfermedad de Crohn son afecciones crónicas caracterizadas por períodos de síntomas intensos (brotes de la enfermedad) y períodos de remisión. No hay cura para ninguna de las dos enfermedades, pero hay tratamientos disponibles, incluyendo la terapia antinflamatoria e inmunosupresora, así como la cirugía.
La "progresión de la EII" se refiere a la progresión de la EII después de la presentación inicial de la enfermedad en un individuo. La EII, incluyendo la CU y la enfermedad de Crohn, se caracteriza por recaídas de la enfermedad. Estas recaídas también se conocen como brotes. Por consiguiente, la progresión de la EII puede referirse a recaídas, o brotes, de la EII después de la presentación inicial de la enfermedad. En particular, la progresión de la EII puede referirse a una frecuencia elevada de recaídas, o brotes, de la EII después de la presentación inicial de la enfermedad. Los presentes inventores encontraron que los individuos identificados como pertenecientes a los subgrupos EII1 y EII2 en el ejemplo 3 respectivamente tenían un promedio de 0,66 y 0,34 recaídas, o brotes, de la EII durante un período de 12 meses después de la presentación inicial de la enfermedad. Una frecuencia elevada de recaídas, o brotes, por lo tanto, puede referirse a un promedio de 0,5 o más, o 0,6 o más, preferentemente un promedio de 0.6 o más, recaídas, o brotes, durante un período de 12 meses después de la presentación inicial de la enfermedad, o en los 12 meses siguientes a la presentación inicial de la enfermedad. Una recaída o un brote puede ser un acontecimiento que requiera un aumento de la terapia, por ejemplo, un aumento de la terapia inmunosupresora o antinflamatoria o de la cirugía. Dicho requerimiento de aumento de la terapia también puede denominarse aumento escalonado del tratamiento. Una recaída o un brote puede dar como resultado daño o destrucción del intestino si no se trata o si se trata de manera inadecuada. Por lo tanto, un riesgo alto de progresión de la EII puede referirse a un riesgo alto de que el individuo experimente recaídas o brotes de la enfermedad después de la presentación inicial, en particular, un riesgo alto de que el individuo experimente un promedio de 0,6 o más recaídas o brotes de la enfermedad durante un período de 12 meses después de la presentación inicial de la enfermedad, mientras que un riesgo bajo de progresión de la EII puede referirse a un riesgo bajo de que el individuo experimente recaídas o brotes de la enfermedad después de la presentación inicial, en particular, un riesgo bajo de que el individuo experimente un promedio de 0,6 o más recaídas o brotes de la enfermedad durante un período de 12 meses después de la presentación inicial de la enfermedad.
El diagnóstico de una recaída o brote de la enfermedad está dentro de las capacidades del médico experto. Por ejemplo, una recaída o brote de una EII en un individuo puede caracterizarse por un índice de Harvey Bradshaw (actividad de la enfermedad) >5; y (i) un nivel de proteína C reactiva (CRP, del inglés "C Reactive Protein") de >10 mg/l, (ii) un nivel de calprotectina de >200 pg/g, o (iii) indicios endoscópicos de actividad de la enfermedad; y el individuo que ha logrado la remisión después de un brote previo de la enfermedad. La CRP es un marcador sanguíneo de la inflamación producida por el hígado. Los niveles aumentan durante un acontecimiento inflamatorio. Los niveles de CRP generalmente se miden en una muestra de sangre obtenida del individuo, mientras que los niveles de calprotectina generalmente se miden en una muestra de heces.
El índice de Harvey Bradshaw (actividad de la enfermedad) suele medir los siguientes parámetros:
(i) bienestar general (0 = muy bien, 1 = ligeramente por debajo del promedio, 2 = pobre, 3 = muy pobre, 4 = horrible) (ii) dolor abdominal (0 = ninguno, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = intenso)
(iii) número de deposiciones líquidas por día
(iv) masa abdominal (0 = ninguna, 1 = dudosa, 2 = definida, 3 = dolorosa a la palpación)
(v) presencia de complicaciones (con un punto por cada complicación presente): artralgia, uveítis, eritema nodoso, úlceras aftosas, Pyoderma gangrenosum, fisura anal, nueva fístula, absceso
Una puntuación del índice de Harvey Bradshaw >5 indica la presencia de una enfermedad de leve a intensa.
Los tratamientos conocidos para una EII incluyen terapia antinflamatoria, terapia inmunosupresora y cirugía. Los ejemplos de terapia antinflamatoria incluyen el tratamiento con esteroides (tales como costicoesteroides, por ejemplo, prednisolona o budesonida) y/o mesalazina. Los ejemplos de terapia inmunosupresora incluyen el tratamiento con inhibidores de TNFa (tales como infliximab), azatioprina, metotrexato y/o 6-mercaptopurina.
El tratamiento puede referirse al tratamiento de una enfermedad en curso destinado a controlar la enfermedad (también conocido como terapia de mantenimiento), así como el tratamiento de recaídas o brotes de la enfermedad.
Un tratamiento convencional de "intensificación" consiste en aumentar de manera escalonada la terapia solo en respuesta a los brotes de la enfermedad en curso o a la falta de respuesta de la enfermedad al tratamiento inicial. Por ejemplo, el brote inicial de la enfermedad (en el que se realiza el diagnóstico) se trataría con un esteroide antinflamatorio, tal como la prednisolona, o un fármaco antinflamatorio, tal como la mesalazina (por ejemplo, en la CU), pero no se iniciaría ninguna terapia de mantenimiento. Si se produce un brote posterior, este tratamiento se repetiría y después se añadiría también una terapia de mantenimiento (por ejemplo, un tratamiento con azatioprina, metotrexato o 6-mercaptopurina). Si los brotes de la enfermedad continuasen a pesar de esta terapia de mantenimiento, se añadiría entonces una terapia de mantenimiento más fuerte, tal como un tratamiento con un inhibidor del TNFa (infliximab o adalimumab). Esta estrategia de tratamiento evita el sobretratamiento, al aumentar de manera escalonada la terapia solo en respuesta a un control inadecuado de la enfermedad, pero corre el riesgo de exponer a los pacientes con una enfermedad más progresiva a complicaciones sustanciales relacionadas con la enfermedad a medida que se prueban tratamientos que, en última instancia, no son eficaces para controlar la enfermedad.
Como ya se ha explicado anteriormente, se ha encontrado que la introducción temprana de terapias agresivas en una EII, conduce a mejores resultados, en comparación con el enfoque convencional de intensificación. De manera específica, la mayoría de los pacientes con enfermedad de Crohn activa se tratan de manera inicial con costicoesteroides. Aunque este enfoque generalmente controla los síntomas, muchos pacientes se vuelven resistentes o dependientes de los costicoesteroides, y la exposición prolongada a los costicoesteroides se asocia a un mayor riesgo de mortalidad. Una comparación del uso temprano de la terapia inmunosupresora combinada con infliximab y azatioprina con el tratamiento convencional de la enfermedad mostró que la terapia inmunosupresora combinada fue más eficaz que el tratamiento convencional de la enfermedad para inducir la remisión y reducir el uso de costicoesteroides en pacientes a los que se les había diagnosticado recientemente la enfermedad de Crohn. Por lo tanto, el inicio de un tratamiento más intensivo en una fase temprana de la enfermedad podría dar lugar a mejores resultados para los pacientes con EII (D'Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010). En particular, los pacientes con la enfermedad de Crohn tratados con terapia inmunosupresora combinada en una fase temprana (D'Haens et al., 2008) experimentan períodos más largos de remisión sin esteroides, tienen más probabilidades de lograr la cicatrización de la mucosa y, en última instancia, de evitar la resección quirúrgica (D'Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010). Sin embargo, esta estrategia no es adecuada para todos los pacientes con la enfermedad de Crohn, ya que una proporción de los pacientes habría logrado una remisión prolongada incluso con el tratamiento convencional con costicoesteroides (Jess et al., 2007) y, por lo tanto, su tratamiento con la terapia inmunosupresora combinada los expondría a efectos secundarios y toxicidad innecesarios.
El clasificador de genes de sangre completa identificado por los presentes inventores predice la evolución de la enfermedad en una EII, incluida la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. De manera específica, los pacientes en el subgrupo EII1 tienen una incidencia sustancialmente mayor de recaídas o brotes de la enfermedad, lo que da como resultado no solo la necesidad de un aumento escalonado del tratamiento más temprano, sino también de más aumentos escalonados del tratamiento por unidad de tiempo de seguimiento (en comparación con los pacientes en el grupo EII2). Este patrón de recaídas o brotes de la enfermedad está asociado a una morbilidad considerable y, por lo tanto, es más probable que los pacientes del subgrupo EII1 se beneficien de una terapia agresiva temprana, tal como el uso de inhibidores de TNFa.
Por lo tanto, los pacientes identificados como de riesgo alto de progresión de una EII pueden tratarse con una terapia más agresiva que la que normalmente se administra al comienzo de la enfermedad, tal como un enfoque "de arriba abajo" donde los pacientes se tratan con un inhibidor de TNFa, tal como infliximab, en combinación con azatioprina, metotrexato o 6-mercaptopurina en el momento del diagnóstico, con recaídas o brotes posteriores que se tratan con la administración adicional de un esteroide antinflamatorio, tal como la prednisolona, una mayor administración del inhibidor de TNFa o el tratamiento con un anticuerpo anti-integrina, por ejemplo.
En el caso de un individuo identificado como de riesgo alto de progresión de una EII, el tratamiento puede, por lo tanto, comprender tratar o seleccionar al individuo para el tratamiento, con un régimen de tratamiento de la enfermedad más frecuente o más agresivo, o con un régimen de la enfermedad que normalmente no se administra durante la fase de mantenimiento de la EII. Un régimen de tratamiento de la enfermedad más frecuente o más agresivo puede referirse a un régimen de tratamiento de la enfermedad que es más frecuente o más intenso que el tratamiento normalmente administrado durante la fase de mantenimiento de la EII. Un ejemplo de un régimen de tratamiento de la enfermedad más agresiva es el tratamiento con uno o más inmunosupresores, tal como el tratamiento con un inhibidor de TNFa, tal como infliximab, en combinación con azatioprina, 6-mercaptopurina o metotrexato, por ejemplo, en el momento del diagnóstico.
En el caso de un individuo identificado como de riesgo bajo de progresión de una EII, el tratamiento puede comprender tratar o seleccionar al individuo para el tratamiento, con el enfoque convencional de intensificación descrito anteriormente. El enfoque convencional de intensificación evita el sobretratamiento innecesario de dichos pacientes. Por lo tanto, un individuo identificado como uno que tiene riesgo bajo de progresión de una EII, se puede tratar, o seleccionar para el tratamiento, con un esteroide inflamatorio, tal como la prednisolona, o un fármaco antinflamatorio, tal como la mesalazina, en la presentación inicial de la enfermedad. Una recaída posterior, o un brote, de la enfermedad puede tratarse con un esteroide inflamatorio, tal como la prednisolona, o un fármaco antinflamatorio, tal como la mesalazina, en combinación con la administración de una terapia de mantenimiento, tal como el tratamiento con azatioprina, metotrexato o 6-mercaptopurina. Más recaídas o brotes, de la enfermedad pueden tratarse con un esteroide inflamatorio, tal como la prednisolona, o un fármaco antinflamatorio, tal como la mesalazina, en combinación con la administración de un inhibidor de TNFa (tal como infliximab o adalimumab) como terapia de mantenimiento.
Los métodos de la presente invención implican el uso de muestras de sangre completa obtenidas de uno o más individuos y, por lo tanto, son métodos in vitro.
La presente invención proporciona un método in vitro que comprende determinar el nivel de expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18rA p , HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1, en una muestra de sangre completa obtenida de un individuo.
Se espera que los métodos de la presente divulgación encuentren aplicación en métodos para identificar una sustancia capaz de tratar una EII en un individuo, tal como ensayos clínicos. El individuo empleado en dicho método puede tener un riesgo alto o bajo de progresión de la EII, preferentemente el individuo tiene un riesgo alto de progresión de la EII. Se espera que un individuo con riesgo alto de progresión de la EII experimente recaídas o brotes de la enfermedad más frecuentes que un individuo con riesgo bajo de progresión de la EII, lo que facilita la evaluación de la eficacia del posible tratamiento, por ejemplo, en la reducción de la frecuencia y/o la intensidad de dichos brotes o recaídas.
Un método, preferentemente un método in vitro, para identificar una sustancia capaz de tratar una EII en un individuo puede comprender:
(i) identificar a un individuo con riesgo alto o bajo de progresión de la EII, preferentemente con riesgo alto de progresión de la EII, utilizando un método de la invención; y
(ii) comparar el nivel de progresión de la EII en el individuo, en donde el individuo se ha sometido al tratamiento con la sustancia de interés, con un control. Un nivel más bajo de progresión de la EII en el individuo en comparación con el control indica que la sustancia es capaz de tratar la EII. Un nivel más bajo de progresión de la EII puede referirse a una reducción en la frecuencia y/o la intensidad de los brotes o recaídas de la EII en comparación con el control. El método puede comprender además una etapa de someter al individuo al tratamiento con la sustancia de interés después de la etapa (i) y antes de la etapa (ii) en el método anterior. El control puede ser el nivel de progresión de la EII observado en un individuo o grupo de individuos, identificados como riesgo alto o bajo, preferentemente riesgo alto, de la progresión de la EII utilizando, por ejemplo, un método de la presente invención, que no se han tratado con la sustancia de interés.
Por lo tanto, un método para identificar una sustancia capaz de tratar una EII en un individuo puede comprender:
(i) identificar a un primer individuo con riesgo alto o bajo de progresión de la EII, preferentemente con riesgo alto de progresión de la EII, utilizando un método de la invención;
(ii) identificar a un segundo individual con riesgo alto o bajo de progresión de la EII, preferentemente con riesgo alto de progresión de la EII, utilizando un método de la invención; y
(iii) comparar el nivel de progresión de la EII en el primer individuo con el nivel de progresión de la EII en el segundo individuo, en donde el primer individuo se ha sometido al tratamiento con la sustancia de interés, y en donde un nivel más bajo de progresión de la EII en el primer individuo en comparación con el segundo indica que la sustancia es capaz de tratar la EII. El método puede comprender de manera opcional además una etapa de tratar al primer individuo con la sustancia de interés después de la etapa (i) pero antes de la etapa (iii).
También se espera que los métodos de la presente divulgación encuentren aplicación en métodos para identificar una sustancia capaz de inducir un fenotipo de riesgo bajo (EII2) en un paciente con una EII. El paciente empleado en dicho método tiene un riesgo alto de progresión de la EII. De manera específica, también se describe un método, preferentemente un método in vitro, para identificar una sustancia capaz de inducir un fenotipo de riesgo bajo (EII2) en un paciente con una EII, comprendiendo el método:
proporcionar (i) una muestra de sangre completa obtenida de un paciente con EII antes del tratamiento con una sustancia de interés, y (ii) una muestra de sangre completa obtenida de un paciente con EII después del tratamiento con la sustancia de interés, en donde se ha determinado que el paciente con EII tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) utilizando un método de acuerdo con la presente invención; y
determinar el nivel de expresión de dos o más genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en las muestras (i) y (ii);
en donde una menor expresión de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, y una mayor expresión de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en la muestra (ii) en relación con la muestra (i) indican que la sustancia es capaz de inducir un fenotipo de riesgo bajo (EII2) en un paciente con EII.
Una sustancia identificada como capaz de tratar una EII o de inducir un fenotipo de riesgo bajo (EII2) en un paciente con una EII puede formularse además en un medicamento. Además de la sustancia, dicho medicamento puede comprender, por ejemplo, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Cuando se utiliza en el presente documento, "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" ha de interpretarse como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno de ellos se expusiera de manera individual en el presente documento.
A menos que el contexto indique otra cosa, las descripciones y definiciones de las características establecidas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.
Determinados aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Identificación de una señal génica EII1/EII2 en sangre completa
Materiales y métodos
Inscripción de pacientes para perfiles de expresión génica
Se inscribieron sesenta y nueve pacientes con enfermedad de Crohn (EC) activa (n = 39) y colitis ulcerosa (CU) (n = 30) antes de comenzar el tratamiento y los datos de seguimiento se recogieron posteriormente como ya se describió en (Lee et al., 2011). La aprobación ética para este trabajo se obtuvo del Cambridgeshire Regional Ethics Committee (REC08/H0306/21). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.
Muestras de linfocitos T CD8+
Los linfocitos T CD8+ se seleccionaron positivamente a partir de muestras de sangre obtenidas de sesenta y nueve pacientes de acuerdo con los métodos descritos en (Lyons et al., 2007) y el ARN se extrajo utilizando RNEasy Mini Kits (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se describió anteriormente en (Lee et al., 2011). Muestras de sangre completa
Se recogieron 2,5 ml de sangre completa de los sesenta y nueve pacientes en RNeasy mini o PAXgene Blood RNA Tube IVD (Qiagen) para fijar inmediatamente el ARN (Rainen et al., 2002). Las muestras recogidas se almacenaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el ARN se extrajo posteriormente con el PAXgene Blood RNA Kit IVD (Qiagen).
Cuantificación de ARN
La cantidad y la calidad del ARN se determinaron con un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) y un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies), respectivamente.
Perfiles de expresión génica en sangre completa
Se procesaron 200 ng de ARN total y se hibridaron en micromatrices Affymetrix Human Gene ST 1.0 (muestras de ARN CD8+) o Affymetrix Human Gene ST 2.0 (muestras de ARN de sangre completa) que después se lavaron y exploraron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Procesamiento de los datos de las micromatrices
Los datos sin procesar de las micromatrices se procesaron en R utilizando el paquete preprocessCore (Bolstad, 2013) en BioConductor (Huber et al., 2015). En resumen, los datos sin procesar se corrigieron por fondo, se normalizaron por cuantiles y se resumieron utilizando el código informado en el listado 4.1. La presencia de posibles valores atípicos se evaluó con el paquete arrayQualityMetrics (Kauffmann et al., 2009). La corrección por lotes se realizó con ComBat (Johnson et al., 2007). De manera importante, el conocimiento sobre la pertenencia a EN1/EN2 de las muestras individuales no se incorporó en el procedimiento de corrección por lotes, para evitar cualquier sesgo a la baja en la estimación del error de generalización mediante la validación cruzada descartando uno. Solo se conservaron los conjuntos de sondas que detectan transcripciones expresadas (definidos como conjuntos de sondas que muestran una señal de expresión log2 >7,0 en al menos un 75 % de las muestras). Los conjuntos de sonda no expresados y los conjuntos de sonda sin anotación se eliminaron del conjunto de datos, dejando 12.874 conjuntos de sondas para el conjunto de datos de expresión génica de sangre completa.
PCR cuantitativa
Se determinaron los niveles de ARNm para genes candidatos y tres genes de referencia utilizando ensayos de expresión TaqMan (Life Technologies) en un instrumento de PCR en tiempo real Roche LightCycler 480 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones de la PCR se optimizaron para minimizar la variación intra e interplaca. La abundancia de transcritos se calculó utilizando el método AACT (Livak et al., 2001). Se incluyó en cada placa una muestra de ADNc procedente de RNA agrupado extraído de la sangre completa de individuos sanos y se utilizó como calibrador. Cada medición se repitió tres veces y en el análisis final se utilizó la mediana de las tres réplicas técnicas.
Clasificación de pacientes en EM1/EN2 basada en datos de expresión génica de linfocitos T CD8+
Para asignar el estado EII1 (mal pronóstico) o EII2 (buen pronóstico) a los sesenta y nueve pacientes, los datos de expresión normalizados de las muestras de linfocitos T CD8+ de los pacientes se fusionaron con los datos de la cohorte de pacientes con EII existente del inventor. A continuación, se utilizó el agolpamiento por consenso del conjunto de datos fusionado para estratificar la cohorte en los dos grupos de pronóstico previamente identificados, tal como se describe en Lee et al., 2011.
Los pacientes en el subgrupo EII1 tienen una incidencia sustancialmente mayor de recaídas o brotes de la enfermedad, caracterizados no solo por una necesidad más temprana de aumento escalonado del tratamiento, sino también por un requisito de más aumentos escalonados del tratamiento por unidad de tiempo de seguimiento (en comparación con un paciente en el grupo EII2).
Clasificación de pacientes en EN1/EN2 basada en datos de expresión génica de sangre completa
En paralelo, también se generó un conjunto de datos de expresión génica de sangre completa de los sesenta y nueve pacientes con EII. Se seleccionaron varios genes necesarios para estratificar a los pacientes en los dos grupos de pronóstico (EII1 e EII2) en función de los datos de expresión génica de sangre completa mediante la aplicación de un modelo de regresión logística con regularización de red elástica adaptativa al conjunto de datos de expresión génica de sangre completa. Los genes candidatos seleccionados y varios genes estrechamente correlacionados se analizaron mediante análisis de PCR en tiempo real.
Se realizaron ensayos de PCR en tiempo real Taqman para cada gen candidato junto con 10 genes de referencia invariantes. Se aplicó un modelo de regresión regularizado de red elástica a los datos de la PCR en tiempo real para identificar un modelo óptimo, compuesto por 15 genes, que fue capaz de estratificar la cohorte de 69 pacientes con EII en los dos grupos de pronóstico originales, EII1 y EIl2 (VPP = 0,87, VPN = 0,94, sensibilidad 0,94, especificidad 0,85; Figuras 1 y 2). Los subgrupos EII1 y EII2 también demostraron una asociación equivalente con la evolución de la enfermedad, tanto en términos de supervivencia sin aumento escalonado (P = 0,0074) como en el número de aumentos escalonados a lo largo del tiempo (P = 0,0003, número medio de aumentos escalonados del tratamiento: 1,62 (EII1), 0,70 (EII2). Los 15 genes se enumeran en la tabla 1.
Tabla 1
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Ejemplo 2 - Optimización del clasificador de sangre completa para análisis RT-qPCR
Los genes identificados en el ejemplo 1 se llevaron al desarrollo del ensayo qPCR en tiempo real, donde se optimizó y finalizó el contenido final del clasificador de sangre completa (16 genes informativos y 2 de referencia). Los genes informativos que forman parte de este clasificador se enumeran en la tabla 2 a continuación.
Al ser detectable en sangre completa mediante métodos tales como RT-qPCR, la estratificación de los pacientes que utilizan este clasificador de genes de sangre completa será más simple y rentable que las pruebas que requieren el aislamiento de tipos de células particulares antes de determinar la expresión génica, como se describe en el documento WO2010/084312, por ejemplo.
Además, se espera que el clasificador de genes de sangre completa tenga una amplia gama de beneficios para la salud, lo que incluye conducir directamente a mejoras importantes en el tratamiento de la EII; permitir que los pacientes con enfermedad agresiva reciban una terapia adecuadamente potente desde el diagnóstico, y garantizar al tiempo que aquellos con enfermedad indolora no estén expuestas a los riesgos y efectos secundarios de la inmunosupresión innecesaria. Se espera que esto mejore los resultados clínicos, al minimizar la toxicidad del tratamiento y reducir las complicaciones de la enfermedad y los costes de la atención médica. También se espera que el clasificador de genes de sangre completa facilite la selección previa de pacientes para ensayos clínicos en función de la probabilidad de brote de la enfermedad, reduciendo así el número de pacientes necesarios para los ensayos de prevención o tratamiento de los brotes por un factor de 2 a 3.
Tabla 2
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Ejemplo 3 - Validación independiente del ensayo de sangre completa basado en qPCR
A continuación, se realizó una validación independiente del rendimiento pronóstico del clasificador de 16 genes identificado en el ejemplo 2 utilizando una segunda cohorte independiente de 85 pacientes con EII recién diagnosticados de 4 centros del Reino Unido (Cambridge, Nottingham, Exeter y Londres). El análisis de la expresión génica de sangre completa mediante la prueba basada en qPCR desarrollada en el ejemplo 2 reprodujo la estratificación pronóstica observada en la cohorte de descubrimiento con un cociente de riesgos instantáneos de EM1/EN2 de 3,52 (intervalo de confianza [IC] al 95 por ciento: 1,84 - 6,76, P = 0,0002, Figura 3). Este rendimiento se compara de manera favorable con el de la expresión génica existente basada en las pruebas de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, el cociente de riesgos instantáneos para Oncotype DX, un diagnóstico de expresión génica que predice la recaída del cáncer de mama, es 2,81 (IC al 95 %: 1,704,64) (Paik et al., NEJM, 2004).
Ejemplo 4 - Clasificador mínimo de genes
Para determinar el número mínimo de genes del clasificador de sangre completa optimizado desarrollado en el ejemplo 2 necesarios para estratificar a los pacientes en los dos grupos de pronóstico, EII1 y EII2, los inventores realizaron un análisis computacional exhaustivo de todas las combinaciones posibles de los 16 genes identificados en el ejemplo 2 para determinar el número mínimo de genes que podrían utilizarse para estratificar con precisión a los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2.
Para cada combinación posible de n genes (con 1< n <16), se ajustó un modelo de regresión logística regularizado L2 a los datos de expresión génica de la qPCR pertinentes y se evaluó el rendimiento previsto asociado para cada modelo como ya se describió en el ejemplo 1.
Los resultados enumerados en la tabla 3 a continuación muestran que los datos de expresión génica de sangre completa de tan solo dos genes seleccionados del clasificador de sangre completa optimizado de 16 genes identificados en el ejemplo 2 podrían utilizarse para estratificar con precisión a los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2. De manera específica, la medición de la expresión de los genes IL18RAP y TRGC2 en muestras de sangre completa obtenidas de pacientes con EII fue suficiente para estratificar a los pacientes en los subgrupos EII1 y EII2 con una precisión de 0,71 (sensibilidad: 0,73; especificidad: 0,69; VPP: 0,69; Vp N: 0,74).
De manera similar, se demostró que los datos de expresión génica de sangre completa para tres genes seleccionados del clasificador de sangre completa optimizado desarrollado en el ejemplo 2 son adecuados para estratificar con precisión a los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2. Por ejemplo, la medición de la expresión de los genes IL18RAP, TRGC2 y TRGV3 en muestras de sangre completa obtenidas de pacientes con EII fue suficiente para estratificar a los pacientes en los subgrupos EII1 y EII2 con una precisión de 0,74 (sensibilidad: 0,74; especificidad: 0,74; VPP: 0,74; VPN: 0,74).
Las combinaciones de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15 genes de los genes enumerados en la tabla 2 se probaron de manera similar y resultaron adecuadas para estratificar a los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2 con una precisión de 0,7 o superior, como se muestra en la tabla 3.
Cabe señalar que por cada número de genes probados, la tabla 3 solo indica la combinación de genes que dio como resultado una estratificación óptima de los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2. Por ejemplo, en la tabla 3 solo se muestra la combinación de cuatro genes que permiten la estratificación óptima de los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2. Sin embargo, otras combinaciones de cuatro genes seleccionados del clasificador de 16 genes identificadas en el ejemplo 2 también fueron adecuadas para estratificar a los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2 con una precisión de 0,7 o superior.
La medición de la expresión de los 16 genes en muestras de sangre completa obtenidas de pacientes con EII estratificó a los pacientes en los subgrupos EII1 y EII2 con una precisión de 0,971 (VPP = 1,000; VPN = 0,941; sensibilidad: 0,946; y especificidad: 1,000)
Tabla 3
Figure imgf000021_0001
continuación
Figure imgf000022_0001
Ejemplo comparativo 5
Los presentes inventores probaron la capacidad de las señales de expresión génica descritas previamente en el documento WO2010/084312 para estratificar de manera correcta a los pacientes en los subgrupos de riesgo alto EII1 y de riesgo bajo EII2 en función de los datos de expresión génica de sangre completa, como ya se describió en el ejemplo 1. La medición de la expresión de los genes divulgados en las tablas 1 o 2 del documentos WO2010/084312, o los genes KAT2B, ANKRD32 y ZNF26 o ITGA2, PTPN22 y NOTCH1, descritos en el documento WO2010/084312, en sangre completa no dio como resultado una clasificación precisa de los pacientes con EII en los subgrupos EII1 y EII2, como lo indican los valores p de la prueba de rango logarítmico indicados debajo de los gráficos pertinentes (véase la figura 4). Estos resultados demuestran que las señales génicas divulgadas en el documento WO2010/084312 no son adecuadas para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o bajo de progresión de la EII cuando la expresión génica se mide en sangre completa.
Ejemplo 6 - Clasificación de pacientes con un modelo de 3, 4, 5, 13, 14 y 16 genes
El método de la invención estratifica a los pacientes en pacientes que tienen un riesgo alto o bajo de progresión de la EII, lo que requiera la recogida de solo 2,5 ml de sangre completa en un tubo de recogida que facilita la estabilidad del material de ARN y puede presentarse internacionalmente (ya que el ARN permanece estable a temperatura ambiente hasta 3 días). El ensayo arroja un resultado rápido dentro de las 48 horas y mide la expresión génica a través de una RT-PCR cuantitativa para el diagnóstico de un paciente, antes de iniciar el tratamiento.
El resultado de cada medición de RT-PCR se basa en un algoritmo para aplicar una ponderación específica para obtener una predicción de resultados (riesgo alto/bajo de progresión de la EII) con una razón de probabilidad validada de 3,5 entre los grupos de resultados de riesgo alto y bajo.
Clasificación de pacientes con un modelo de 3, 4, 5, 13, 14 y 16 genes
Para determinar la evolución probable de la enfermedad, los pacientes 429 y 483 proporcionaron muestras de sangre en tubos PAXGene® Blood RNA. Después de la extracción de ARN y la síntesis de ADNc, los niveles de expresión de 16 genes informativos (ARRDC4, FCRL5, GBP5, GZMH, GZMK, HP, IFI44L, IL18RAP, LGALSL, LINC01136, LY96, NUDT7, P2RY14, TRGC2, TRGV3 y VTRNA1-1) y 2 genes de referencia (RNA18S5 y CDV3) se determinaron mediante una PCR cuantitativa utilizando un Roche Lightcycler 480 (Ct, tabla 4). Los datos sin procesar se normalizaron restando el valor medio de los 2 genes de referencia de cada gen informativo (dCt, tabla 4), y a continuación se estandarizaron mediante centrado en la media (dCt', tabla 4).
Figure imgf000023_0001
La puntuación de riesgo, expresada como probabilidad (P), de cualquier paciente que experimente una enfermedad leve (riesgo bajo de progresión de la EII) se puede determinar mediante la aplicación del siguiente modelo de regresión logística a los datos de expresión génica estandarizados utilizando un modelo de 3 genes (ecuación (1)), un modelo de 4 genes (ecuación (2)), un modelo de 5 genes (ecuación (3)), un modelo de 13 genes (ecuación (4)), un modelo de 14 genes (ecuación (5)) y un modelo de 16 genes (ecuación (6)).
Logit(Pintensa) = Po NIL18RAP) P2(TRGC2) Pa(TRGV3) (1)
Logit(Pintensa) = Po P-|(IL18RAP) P2(LINC01136) p3(TRGC2) P4VTRNA1-1) (2) Logit(Pintensa) = Po P1(IL18RAP) P2(LINC01136) Pa(TRGC2) P4TRGV3) P5(VTRNA1-1) (3) Logit(Pintensa) = Po P-|(ARRDC4) P2(FCRL5) Ps(GBP5) P4(GZMH) P5(HP) P6(IFI44L) P/(IL18RAP) Ps(LGALSL) Pg(LINC01136) P^(LY96) Pn(P2RY14) P-,2(TRGV3) P^(VTRNA1-1) (4) Logit(Pintensa) = Po P1(FCRL5) Pa(GBP5) P4(GZMK) Pa(HP) P6(IFI44L) P/(IL18RAP) Ps(LGALSL) Pg(LINC01136) P1o(LY96) Pn(NUDT7) P^(P2RY14) P^(TRGC2) P14(TRGV3) (5) Logit(Pintensa) = Po P1(ARRDC4) P2(FCRL5) Ps(GBP5) P4(GZMH) Pa(GZMK) P6(HP) P/(IFI44L) Ps(IL18RAP) Pg(LGALSL) P1o(LINC01136) Pn(LY96) P12(NUDT7) Pra(P2RY14) P14(TRGC2)
P15(TRGV3) P16(VTRNA1-1) (6)
Las ponderaciones individuales que varían de -60 a 60, de -30 a 30 o de -10 a 10 se aplican después a los datos de expresión génica estandarizados para cada gen en el modelo. Las ponderaciones individuales (P) para cada ensayo se muestran en la tabla 5.
Figure imgf000024_0001
Modelo de 3 genes
Reordenando la ecuación (1), la probabilidad de que el paciente 429 siga una evolución de enfermedad intensa viene dada por:
exp 0,07+(-0,75*-1,42)+(-0,85*2,34)+(1*-0,31)
Pintensa _
1 exp 0,07+(-0,75*-1,42)+(-0,85*2,34)+(1*-0,31)
Pintensa _ 0,24
Dado que Pintensa <0,5 se predice que el paciente 429 seguirá una evolución de la enfermedad leve.
De manera similar, para el paciente 483:
exp 0,07+(-0,75*--0,67)+(-0,85*-1,05)+(1*-0,65)
Pintensa _
1 exp 0,07+(-0,75*--0,67)+(-0,85*-1,05)+(1*-0,65)
Pintensa _ 0,45
Dado que Pintensa <0,5 se predice que el paciente 483 seguirá una evolución de la enfermedad leve.
Modelo de 4 genes
Reordenando la ecuación (2), la probabilidad de que el paciente 429 siga una evolución de enfermedad intensa viene dada por:
exp 0+(-1*-1,42)+(0,9*-0,45)+(-0,8*1,26)
Pintensa _
1 exp 0+(-1*-1,42)+(0,9*-0,45)+(-0,8*1,26)
Pintensa _ 0,13
Dado que Pintensa <0,5 se predice que el paciente 429 seguirá una evolución de la enfermedad leve.
De manera similar, para el paciente 483:
exp 0+(-1*-0,67)+(0,9*-0,10)+(-0,8*0,55)
Pintensa _
1 exp 0+(-1*-0,67)+(0,9*-0,10)+(-0,8*0,55)
Pintensa _ 0,73
Dado que Pintensa >0,5 se predice que el paciente 483 seguirá una evolución de la enfermedad intensa.
Modelo de 5 genes
Reordenando la ecuación (3), la probabilidad de que el paciente 429 siga una evolución de enfermedad intensa viene dada por:
exp0,03+(-0,27*-1,42)+(0,24*-0,45)+(-0,25*2,34)+(0,25*-0,31)+(-0,22*1,26)
Pintensa _
1 exp0,03+(-0,27*-1,42)+(0,24*-0,45)+(-0,25*2,34)+(0,25*-0,31)+(-0,22*1,26)
Pintensa _ 0,35
Dado que Pintensa <0,5 se predice que el paciente 429 seguirá una evolución de la enfermedad leve.
De manera similar, para el paciente 483:
exp0,03+(-0,27*-0,67)+(0,24*0,1)+(-0,25*-1,05)+(0,25*-0,65)+(-0,22*0,55)
Pintensa _
1 exp0,03+(-0,27*-0,67)+(0,24*0,1)+(-0,25*-1,05)+(0,25*-0,65)+(-0,22*0,55)
Pintensa _ 0,55
Dado que Pintensa >0,5 se predice que el paciente 483 seguirá una evolución de enfermedad intensa (riesgo alto de progresión de la EII).
Modelo de 13 genes
Reordenando la ecuación (4), la probabilidad de que el paciente 429 siga una evolución de enfermedad intensa viene dada por:
exp -0,74+(-2,39*0,52)+(2,78*-0,33)+(-7,12*-0,53)+(-2,84*-0,21)+(-3,18*-0,10)+(5,86*-0,42)+(-3,47*-
1,42)+(1,97*0,31)+(4,33*-0,45)+(4,51*-0,31)+(-4,08*-0,91)+(1,47*-0,31)+(-5,96*1,26)
Pintensa 1+ exp-0,74+(-2,39*0,52)+(2,78*-0,33)+(-7,12*-0,53)+(-2,84*-0,21)+(-3,18*-0,10)+(5,86*-0,42)+(-3,47*-
1,42)+(1,97*0,31)+(4,33*-0,45)+(4,51*-0,31)+(-4,08*-0,91)+(1,47*-0,31)+(-5,96*1,26)
Pintensa “ 0,058
Dado que Pintensa <0,5 se predice que el paciente 429 seguirá una evolución de la enfermedad leve.
De manera similar, para el paciente 483:
exp-0,74+(-2,39*-0,52)+(2,78*-0,33)+(-7,12*-0,53)+(-2,84*-0,21)+(-3,18*-0,10)+(5,86*-0,42)+(-3,47*-
1,42)+(1,97*-1,30)+(4,33*0,10)+(4,51*-1,18)+(-4,08*-1,62)+(1,47*-0,65)+(-5,96*0,55)
Pintensa 1+ exp-0,74+(-2,39*-0,52)+(2,78*-0,33)+(-7,12*-0,53)+(-2,84*-0,21)+(-3,18*-0,10)+(5,86*-0,42)+(-3,47*-
1,42)+(1,97*-1,30)+(4,33*0,10)+(4,51*-1,18)+(-4,08*-1,62)+(1,47*-0,65)+(-5,96*0,55)
Pintensa _ 1
Dado que Pintensa >0,5 se predice que el paciente 483 seguirá una evolución de enfermedad intensa (riesgo alto de progresión de la EII).
Modelo de 14 genes
Reordenando la ecuación (5), la probabilidad de que el paciente 429 siga una evolución de enfermedad intensa viene dada por:
exp0’04+(1>22*-0,33)+(-2,88*-1,70)+(-1,28*-0,88)+(-1,32*-0,72)+(1,51*-0,54)+(-1,6*-0,67)+(1,54*-1,30)+(-1,14*0,10)+(1,43*-1,18)+(-1,14*0,62)+(-1,03*-1,62)+(-1,35*-1,05)+(1,71*-0,65)+(-2,25*0,55)
Pintensa 1 exp0’04+(1,22*-0,33)+(-2,88*-1,70)+(-1,28*-0,88)+(-1,32*-0,72)+(1,51*-0,54)+(-1,6*-0,67)+(1,54*-1,30)+(-
1,14*0,10)+(1,43*-1,18)+(-1,14*0,62)+(-1,03*-1,62)+(-1,35*-1,05)+(1,71*-0,65)+(-2,25*0,55)
Pintensa _ 0,201
Dado que Pintensa <0,5 se predice que el paciente 429 seguirá una evolución de la enfermedad leve.
De manera similar, para el paciente 483:
exp0,04+(1,22*-0,80)+(-2,88*-0,53)+(-1,28*-0,85)+(-1,32*-0,1)+(1,51*-0,42)+(-1,6*-1,42)+(1,54*0,31)+(-1,14*-0,45)+(1,43*-0,31)+(-1,14*0,32)+(-1,03*-0,91)+(-1,35*2,34)+(1,71*-0,31)+(-2,25*1,26)
Pintensa 1 eXp0,04+(1,22*-0,80)+(-2,88*-0,53)+(-1,28*-0,85)+(-1,32*-0,1)+(1,51*-0,42)+(-1,6*-1,42)+(1,54*0,31)+(-
1,14*-0,45)+(1,43*-0,31)+(-1,14*0,32)+(-1,03*-0,91)+(-1,35*2,34)+(1,71*-0,31)+(-2,25*1,26)
Pintensa _ 0,98
Dado que Pintensa >0,5 se predice que el paciente 483 seguirá una evolución de enfermedad intensa (riesgo alto de progresión de la EII).
Modelo de 16 genes
Reordenando la ecuación (6), la probabilidad de que el paciente 429 siga una evolución de enfermedad intensa viene dada por:
exp 0,81+(-3,13*0,52)+(5,56*-0,33)+(-9,38*-0,53)+(-2,86*-0,21)+(-3,25*-0,85)+(-5,12*-0,10)+(5,22*-0,428)+(-5,19*-1,42)+(4,17*0,31)+(5,97*-0,45)+(5,98*-0,31)+(-3,91*0,32)+(-2,73*-0,91)+(-1,85*2,34)+(3,89*-0,31)+(-6,83*1,26)
Pintensa 1 exp 0,81+(-3,13*0,52)+(5,56*-0,33)+(-9,38*-0,53)+(-2,86*-0,21)+(-3,25*-0,85)+(-5,12*-0,10)+(5,22*-0,428)+(-5,19*-1,42)+(4,17*0,31)+(5,97*-0,45)+(5,98*-0,31)+(-3,91*0,32)+(-2,73*-0,91)+(-1,85*2,34)+(3,89*-0,31)+(-6,83*1,26)
Pintensa “ 0,008
Dado que Pintensa <0,5 se predice que el paciente 429 seguirá una evolución de la enfermedad leve.
De manera similar, para el paciente 483:
exp 0,81+(-3,13*-1,47)+(5,56*0,80)+(-9,38*-1,70)+(-2,86*-2,60)+(-3,25*-0,88)+(-5,12*-0,72)+(5,22*-0,54)+(-5,19*-0,67)+(4,17*-1,30)+(5,97*0,10)+(5,98*-1,18)+(-3,91*0,62)+(-2,73*-1,62)+(-1,85*-1,05)+(3,89*-0,65)+(-6,83*0,55)
Pintensa 1 exp 0,81+(-3,13*-1,47)+(5,56*0,80)+(-9,38*-1,70)+(-2,86*-2,60)+(-3,25*-0,88)+(-5,12*-0,72)+(5,22*-0,54)+(-5,19*-0,67)+(4,17*-1,30)+(5,97*0,10)+(5,98*-1,18)+(-3,91*0,62)+(-2,73*-1,62)+(-1,85*-1,05)+(3,89*-0,65)+(-6,83*0,55)
Pintensa _ 1
Dado que Pintensa >0,5 se predice que el paciente 483 seguirá una evolución de la enfermedad intensa.
El ejemplo anterior, no limitante, ejemplifica una realización de la divulgación aplicada a tres, cuatro, cinco, trece, catorce y 16 genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3. Sin embargo, el método se puede adaptar de manera fácil por los expertos en la materia a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis genes seleccionados del grupo que consiste en ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3.
MÉTODOS
Extracción de ARN
Se incuba una muestra de sangre obtenida de un sujeto en un tubo PAXgene® (PAXgene Blood RNA Kit, n.° de cat.
762164, BD Biosciences, San Jose, CA) a temperatura ambiente (15 a 25 °C) durante 3 horas. A continuación, el tubo que contiene la muestra se centrifuga durante 10 minutos a 4.000 * g y el sobrenadante se decanta del tubo y se desecha. Después de la decantación del sobrenadante, el tubo se cierra utilizando un nuevo cierre secundario BD Hemogard™ (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA). A continuación, el tubo se agita en vórtex hasta que el sedimento se disuelve de manera visible y se centrifuga durante 10 minutos a 4000 * g. Después de la centrifugación, se retira todo el sobrenadante y se desecha con una pipeta. A continuación, se añaden 350 pl de tampón de resuspensión BR1 (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) y el tubo se agita en vórtex hasta que el sedimento se disuelve de manera visible. Después, la muestra se pipetea en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml al que se añaden de manera individual 300 pl de tampón de unión b R2 (PAXgene Blood RNA MDx Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) y 40 pl de proteinasa K. A continuación, el tubo se agita en vórtex durante 5 segundos y se incuba durante 10 minutos a 55 °C utilizando una incubadora con agitador a 1000 rpm. Después de la incubación, el lisado del tubo de microcentrífuga se pipetea directamente en una columna de centrifugación PAXgene® Shredder (lila) (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) colocada en un tubo de procesamiento de 2 ml y se centrifuga durante 3 minutos a 15.000 * g. A continuación, todo el sobrenadante de la fracción de flujo continuo se pipetea con cuidado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml nuevo sin alterar el sedimento en el tubo de procesamiento. Se añaden al sobrenadante 350 pl de etanol al 96-100 %, se agita durante 2 segundos y se centrifuga durante 1 segundo a 500 *g para eliminar las gotas del interior de la tapa del tubo. Se pipetean 700 pl de la muestra en la columna de centrifugado PAXgene® RNA (roja) (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) colocada en un tubo de procesamiento de 2 ml y se centrifuga durante 1 minuto a 15.000 * g. La columna de centrifugación se coloca en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml y se descarta el antiguo tubo de procesamiento que contiene el flujo continuo. La muestra restante se pipetea en una columna de centrifugación de a Rn PAXgene® (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) y se centrifuga durante 1 minuto a 15.000 * g. La columna de centrifugación se coloca en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml y se descarta el antiguo tubo de procesamiento que contiene el flujo continuo. Se pipetean 350 pl de tampón de lavado BR3 en la columna de centrifugación de ARN PAXgene® y se centrifuga durante 1 minuto a 15.000 * g. La columna de centrifugación se coloca en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml y se descarta el antiguo tubo de procesamiento que contiene el flujo continuo.
En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado, se prepara una mezcla de incubación de ADNasa I mediante la mezcla de 10 pl de solución de ADNasa I (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) con 70 pl de tampón RDD (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA). A continuación, se añaden 80 pl de la mezcla de incubación de ADNasa I directamente a la membrana de la columna de centrifugación de ARN PAXgene® y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente (20 a 30 °C). Se pipetean 350 pl de tampón BR3 en la columna de centrifugación de ARN PAXgene® y se centrifuga durante 1 minuto a 15.000 * g. La columna de centrifugación se coloca en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml y se descarta el antiguo tubo de procesamiento que contiene el flujo continuo. Se pipetean 500 pl de tampón de lavado BR4 (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) en la columna de centrifugación de ARN PAXgene® y se centrifuga durante 1 minuto a 15.000g. La columna de centrifugación se coloca en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml y se descarta el antiguo tubo de procesamiento que contiene el flujo continuo. Se pipetean 500 pl de tampón BR4 en la columna de centrifugación de ARN PAXgene® y se centrifuga durante 3 minutos a 15.000g. La columna de centrifugación se coloca en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml y se centrifuga durante 1 minuto a 15.000 * g. La columna de centrifugación de ARN PAXgene® se coloca en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se pipetean 40 pl de tampón de elución BR5 (PAXgene Blood RNA Kit, BD Biosciences, San Jose, CA) directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación de ARN PAXgene y se centrifuga durante 1 minuto a 15.000 * g para eluir el ARN. Repetir la etapa de elución utilizando 40 pl de tampón de elución BR5 y el mismo tubo de microcentrífuga. Incubar la muestra de eluato de ARN a 65 °C durante 5 minutos e inmediatamente enfriar la muestra de ARN en hielo.
Cuantificación de ARN
Hacer girar una alícuota lista para utilizar del tubo de mezcla de gel y colorante Agilent RNA 6000 (kit Agilent RNA 6000 Nano, n.° de cat. 5067-1511, Agilent, Santa Clara, CA) a 13.000 * g durante 10 minutos y, a continuación, permitir que la mezcla de gel y colorante se equilibre a temperatura ambiente (15 a 25 °C) durante 30 minutos. Colocar un nuevo chip RNA Nano (Kit Agilent RNA 6000 Nano, n.° de cat. 5067-1511, Agilent, Santa Clara, CA) en una estación de cebado de chips lista para utilizar (n.° de cat. 5065-4401, Agilent, Santa Clara, CA). Pipetear 9 pl de la mezcla de gel y colorante en el fondo del pocillo marcado con una "G". En la estación de cebado de chips, colocar el émbolo a 1 ml y cerrar la estación de cebado del chip. Esperar exactamente 30 segundos y después soltar el émbolo con el mecanismo de liberación del clip e inspeccionar de manera visual que el émbolo retroceda al menos hasta la marca de 0,3 ml. Esperar 5 segundos, después tirar lentamente del émbolo hasta la posición de 1 ml. Abrir la estación de cebado del chip y pipetear 9 pl de la mezcla de gel y colorante en cada uno de los pocillos de reacción. Colocar una alícuota lista para utilizar de Agilent RNA 6000 Ladder (N.° de cat. 5067-1529, Agilent, Santa Clara, CA) en hielo durante 15 minutos para completar la descongelación y después incubar a 70 °C durante 2 minutos. Pipetear 1 pl de Agilent RNA 6000 Ladder en el pocilio marcado con el símbolo de escala. Pipetear 5 |jl del marcador Agilent RNA 6000 Nano (kit Agilent RNA 6000 Nano, n.° de cat. 5067-1511, Agilent, Santa Clara, CA) en el pocillo marcado con el símbolo de la escala y en cada uno de los pocillos de reacción. Pipetear 1 j l de la muestra de ARN en el pocillo superior izquierdo del chip RNA Nano. Agitar en vórtex el chip RNA Nano de manera horizontal durante 60 segundos a 2400 rpm. Colocar el chip con cuidado en el receptáculo del bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, Santa Clara, CA) y cerrar la tapa y ejecutar el chip. Una vez completada la serie, se comprueba la integridad del ARN y, si RIN >7, el ARN se cuantifica con un espectrofotómetro Nanodrop antes de continuar con la síntesis del ADNc.
Síntesis de ADNc
En un tubo de pared delgada marcado de 0,2 ml en hielo, combinar lo siguiente para crear una mezcla (Tabla 6):
Tabla 6
Figure imgf000028_0002
Para cada muestra, añadir 10 j l de la mezcla preparada en 10 j l de la muestra de ARN diluida a 15 ng/jl (150 ng de ARN). Para el ARN de referencia, añadir 25 j l de la mezcla de síntesis de ADNc preparada en (2.) a 25 j l de ARN de referencia diluido a 15 ng/jl (375 ng). Mezclar suavemente y colocar los tubos en un termociclador (Eppendorf MasterCycler Nexus SX1, SKU n.° 8125-30-1030, Eppendorf AG, Alemania). Incubar a 25 °C durante 10 minutos. Incubar a 42 °C durante 60 minutos. Terminar la reacción a 85 °C durante 5 minutos. Dejar enfriar a 4 °C. Centrifugar brevemente el tubo para recoger el contenido en la parte inferior del tubo y almacenar las muestras de ADNc a -20 °C antes de la qPCR.
qPCR
Volver a suspender las muestras de ADNc descongeladas agitando en vórtex de manera suave, después, centrifugar brevemente para recolectar líquido en el fondo del tubo. Para cada muestra, transferir el contenido a un tubo marcado de 0,5 ml y diluir 20* mediante la adición de 380 j l de agua sin nucleasas. Para el ADNc de referencia, transferir el contenido a un tubo marcado de 0,5 ml y diluir 5* mediante la adición de 200 j l de agua sin nucleasas.
Dependiendo del número de muestras de ADNc a analizar, para cada ensayo, combinar los siguientes componentes en un tubo marcado de 1,5 ml sin nucleasas (Tabla 7):
Tabla 7
Figure imgf000028_0001
Se pueden utilizar los siguientes cebadores de RT-qPCR ilustrativos (Tabla 8). Sin embargo, el experto en la materia es capaz de diseñar de manera fácil otros cebadores adecuados para realizar el ensayo de RT-qPCR ilustrativo presentado.
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Tapar el tubo e invertirlo varias veces para mezclar. Centrifugar brevemente para recoger la mezcla de reacción en el fondo del tubo. El siguiente protocolo ilustra un ensayo realizado con muestras de ADNc de cuatro pacientes, que mide los niveles de expresión de 16 genes junto con dos controles de referencia. Sin embargo, el ensayo se puede realizar en una o más muestras de ADNc y un experto en la materia puede diseñarlo de manera fácil para medir los niveles de expresión de dos o más genes de los 16 genes utilizando uno o más controles de referencia.
Pipetear 4 pl de cada plantilla de ADNc en los pocillos de una placa de 384 pocillos marcada de la siguiente manera:
a. ADNc de referencia (CDV3 y RNA85S5) pocillos A1-C6
b. Muestra de ADNc n.° 1 pocillos D1-F6
c. Muestra de ADNc n.° 2 pocillos G1-I6
d. Muestra de ADNc n.° 3 pocillos J1-L6
e. Muestra de ADNc n.° 4 pocillos M1-O6
Pipetear 4 de agua sin nucleasas en cada pocillo de control sin plantilla (pocillos P1-P18).
Añadir 16 pl de cada ensayo de expresión génica Taqman en los siguientes pocillos:
Figure imgf000031_0001
q. Ensayo 17: Pocillos C1-C3, F1-F3, I1-I3, L1-L3, 01-03, P17
r. Ensayo 18: Pocillos C4-C6, F4-F6, I4-I6, L4-L6, O4-O6, P18
Sellar la placa de 384 pocillos con la lámina de sellado (n.° de cat. 04729757001, Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). Centrifugar la placa brevemente para mezclar el contenido de los pocillos y cargar la placa en el termociclador (Roche LightCycler480 II, Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). Seleccionar el formato de detección para la sonda de hidrólisis de color doble/sonda UPL, configurar el programa qPCR de la siguiente manera para 70 ciclos y ejecutar el ensayo:
a. 95 °C durante 10 minutos
b. 95 °C durante 10 segundos
c. 60 °C durante 1 minuto
d. 40 °C durante 30 segundos.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para evaluar si un individuo tiene un riesgo alto o un riesgo bajo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino (EII), comprendiendo el método establecer, mediante la determinación del nivel de expresión de cuatro o más genes en una muestra de sangre completa que se ha obtenido del individuo, si dicho individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) o de riesgo bajo (EII2), en donde los cuatro o más genes se seleccionan del grupo que consiste en:
dominio de arrestina que contiene 4 (ARRDC4);
proteína 5 de unión a guanilato (GBP5);
receptor purinérgico P2Y 14 acoplado a proteína G (P2RY14);
ARN de bóveda 1-1 (VTRNA1-1);
proteína accesoria del receptor de interleucina 18 (IL18RAP);
haptoglobina (HP);
motivo 7 de tipo nudix (fracción X unida a nucleósido difosfato) (NUDT7);
grancima H (Gz MH);
constante y del receptor de linfocitos T 2 (TRGC2);
lectina, de tipo unión a galactósidos (LGALSL);
receptor Fc de tipo 5 (FCRL5);
proteína 44 similar a la inducida por interferón (IFI44L);
ARN intergénico largo no codificante de proteínas 1136 (LINC01136);
antígeno de linfocitos 96 (LY96);
grancima K (GZMK); y
variable del receptor de linfocitos T 3 (TRGV3);
en donde un fenotipo EII1 se caracteriza por la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2,
y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo EII2, y en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho riesgo de progresión de una EII en dicho individuo se determina mediante: el cálculo de una puntuación de riesgo para dicho paciente mediante
a) la ponderación de los niveles de expresión medidos de los genes seleccionados;
b) la aplicación de un modelo de regresión logística a los niveles de expresión ponderados para determinar la puntuación de riesgo, en donde una puntuación de riesgo inferior a 0,5 es indicativa de riesgo bajo de progresión de la EII y una puntuación de riesgo superior a 0,5 es indicativa de riesgo alto de progresión de la EII y c) la creación de un informe que resuma el resultado de dicha determinación.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el nivel de expresión de dichos cuatro o más genes se determina utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el nivel de expresión de dichos cuatro o más genes se determina utilizando RT-qPCR.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el método comprende:
(i) proporcionar una muestra de sangre completa que se haya obtenido del individuo
(ii) extraer ARN de la muestra de sangre completa;
(iii) convertir el ARN en ADNc; y
(iv) realizar RT-qPCR, PCR digital o secuenciación indiscriminada del transcriptoma completo para determinar el nivel de expresión de los cuatro o más genes.
6. Un sistema de evaluación del riesgo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino (EII) para su uso en un método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el sistema una herramienta o herramientas que comprenden reactivos para determinar la expresión de cuatro o más genes seleccionados del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1, y un ordenador programado para computar un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para evaluar una puntuación de riesgo de progresión de una EII a partir de los datos de expresión génica del sujeto.
7. El sistema de evaluación del riesgo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino de acuerdo con la reivindicación 6, comprendiendo el sistema una herramienta o herramientas que comprenden reactivos para determinar la expresión de cuatro o más genes mediante RT-qPCR, PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además:
(ii) seleccionar un individuo identificado como uno que tiene un riesgo alto o un riesgo bajo de progresión de una EII en la etapa (i) para el tratamiento de una EII.
9. Un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa para su uso en un método para tratar una EII en un individuo, comprendiendo el método:
(i) identificar al individuo como uno que tiene un riesgo alto o un riesgo bajo de progresión de la EII utilizando un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y
(ii) someter al individuo al tratamiento con el fármaco antinflamatorio, esteroide antinflamatorio o inhibidor del TNFa.
10. Un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa para su uso en un método para tratar una EII en un individuo que se determina que tiene un riesgo alto o un riesgo bajo de progresión de una EII, comprendiendo el método:
(i) revisar los resultados de las pruebas que clasifican a dicho individuo como EII1 (riesgo alto de progresión de una EII) o EII2 (riesgo bajo de progresión de una EII), en donde dicha prueba determina los niveles de expresión de cuatro o más genes, en donde los cuatro o más genes se seleccionan del grupo que consiste en: ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2, GZMK, LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3, en una muestra de sangre completa obtenida del individuo, en donde los cuatro o más genes incluyen IL18RAP, LINC01136, TRGC2 y VTRNA1-1,
en donde la expresión aumentada de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, VTRNA1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2) y la expresión disminuida de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2), indican que el individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1), y
en donde la expresión disminuida de los genes ARRDC4, GBP5, P2RY14, Vt RnA 1-1, IL18RAP, HP, NUDT7, GZMH, TRGC2 y GZMK en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1) y la expresión aumentada de los genes LGALSL, FCRL5, IFI44L, LINC01136, LY96 y TRGV3 en relación con el nivel de expresión de estos genes en un individuo que tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1), indican que el individuo tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2), y
(ii) tratar al individuo que se ha determinado que tiene un fenotipo EII1 o EII2 para la EII con un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa.
11. El un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la etapa (i) comprende solicitar una prueba que proporcione los resultados de un análisis para determinar el nivel de expresión de cuatro o más genes mediante RT-qPCR, PCR digital, análisis de micromatrices, secuenciación indiscriminada de transcriptoma completo o análisis de expresión génica múltiple directo.
12. El un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa para su uso de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde la etapa (ii) comprende tratar al individuo con un inhibidor de TNFa si se determina que el individuo tiene un fenotipo de riesgo alto (EII1), o tratar al individuo con un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio si se determina que el individuo tiene un fenotipo de riesgo bajo (EII2).
13. El un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la etapa (ii) comprende someter al individuo a tratamiento:
con un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio si el individuo se ha identificado en la etapa (i) como alguien que tiene riesgo bajo de progresión de una EII, o
con un inhibidor de TNFa si el individuo se ha identificado en la etapa (i) como alguien que tiene un riesgo alto de progresión de una EII.
14. El método, el sistema de evaluación del riesgo de progresión de una enfermedad inflamatoria del intestino o el un fármaco antinflamatorio o un esteroide antinflamatorio, o un inhibidor de TNFa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la EII es colitis ulcerosa (CU) o enfermedad de Crohn.
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