JP2019527039A - 炎症性腸疾患用のバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年7月5日に出願された英国特許出願第GB1611738.4号に対する優先権を主張し、その内容はその全体が本明細書中に援用される。
本発明は、個体におけるクローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)の進行を含む炎症性腸疾患(IBD)の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法に関する。個体はさらに、任意選択的には、IBDに対する治療を受けてもよく、またはそのために選択されてもよく、ここでは治療は、個体におけるIBDの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかに基づいて選択される。
CDにおける侵襲療法の早期導入が、標準のステップアップ手法と比べてより良好な転帰をもたらすことが確立されている(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010)。特に、早期併用療法(アザチオプリンと組み合わせたインフリキシマブ;D’Haens et al., 2008)で治療された患者は、より長期間のステロイドを含まない寛解を経験し、粘膜治癒を達成し、最終的には外科的切除を回避する可能性はより高い(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010)。しかし、この方法は、無視できない割合の患者が通常の治療手法であっても延長された寛解を得ていることになり(Jess et al., 2007)、ひいては併用療法を用いたそれら治療が彼らを不必要な副作用および毒性に曝露することになるので、すべての患者に適するのではない。この理由のため、予後を予測する能力は、CD、および一般にIBDを有する患者に対する治療の改善に向けての主要なステップとなる(IBD Research Priority, 2015; Gerich et al., 2014)。
本発明者は、意外にも、個体から得られる全血試料中の遺伝子発現を分析することにより、個体におけるIBD(例えば潰瘍性大腸炎またはクローン病)の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するために使用可能な遺伝子発現シグネチャーを同定している。全血中のこれら遺伝子の発現は、例えばRT−qPCRにより測定され得る。詳細には、本発明者は、高リスク(IBD1)表現型が、低リスク(IBD2)表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、全血中の遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKの上方制御発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3の下方制御発現を特徴とすることを発見している。
上述のように、本発明者は、個体から得られる全血試料中の遺伝子発現を分析することにより、例えばリアルタイム定量PCR(RT−qPCR)により個体におけるIBDの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するために使用可能な遺伝子発現シグネチャーを同定している。
(i)一般的な健康問題(0=非常に良い、1=平均を若干下回る、2=不良、3=非常に良くない、4=ひどい)
(ii)腹痛(0=なし、1=軽度、2=中等度、3=重度)
(iii)1日当たりの液体便の回数
(iv)腹部腫瘤(0=なし、1=疑わしい、2=確実、3=圧痛あり)
(v)合併症の存在(各合併症について1ポイントの存在を伴う):関節痛、ぶどう膜炎、結節性紅斑、アフタ性潰瘍、壊疽性膿皮症、裂肛、新しい瘻孔、膿瘍
が測定される。
(i)IBDの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくはIBDの進行が高リスクである個体を本発明の方法を用いて識別することと;
(ii)目的の物質を用いた治療を受けている個体におけるIBDの進行のレベルを対照と比較することと、を含んでもよい。個体におけるIBDの進行の対照と比べてより低いレベルは、物質がIBDを治療する能力があることを示す。IBDの進行のより低いレベルは、IBDの再発(flare-ups)または再発(relapses)の頻度および/または重症度における対照と比べての低下を指してもよい。方法は、上記方法におけるステップ(i)の後およびステップ(ii)の前に個体に目的の物質を用いた治療を施すステップをさらに含んでもよい。対照は、目的の物質を用いて治療されていない、例えば本発明の方法を用いてIBDの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくは高リスクであると識別された、個体または個体群において認められるIBDの進行のレベルであってもよい。
(i)IBDの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくはIBDの進行が高リスクである第1の個体を本発明の方法を用いて識別することと;
(ii)IBDの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくはIBDの進行が高リスクである第2の個体を本発明の方法を用いて識別することと;
(iii)第1の個体におけるIBDの進行のレベルを第2の個体におけるIBDの進行のレベルと比較することと、を含んでもよく、ここで第1の個体は目的の物質を用いた治療を受けており、かつ第1の個体におけるIBDの進行の第2の個体と比べてより低いレベルは、物質がIBDを治療する能力があることを示す。方法は、任意選択的には、ステップ(i)の後であるがステップ(iii)の前に第1の個体を目的の物質を用いて治療するステップをさらに含んでもよい。
(i)目的の物質を用いる治療前にIBD患者から得られる全血試料、および(ii)目的の物質を用いる治療後にIBD患者から得られる全血試料を提供することであって、IBD患者は本発明に従う方法を用いて高リスク(IBD1)表現型を有することが判定されている、提供することと;
試料(i)および(ii)中の、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される2個以上の遺伝子の発現レベルを測定することと、を含み、
試料(i)に対する試料(ii)中の遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKのより低い発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3のより高い発現が、物質がIBD患者において低リスク(IBD2)表現型を誘導する能力があることを示す、方法を提供する。
実施例1−全血中のIBD1/IBD2遺伝子シグネチャーの同定
材料および方法
遺伝子発現プロファイリングのための患者動員
活動性クローン病(CD)(n=39)および潰瘍性大腸炎(UC)(n=30)を有する患者69名を治療開始前にリクルートし、その後、(Lee et al., 2011)に既に記載のようにフォローアップデータを収集した。この作業のための倫理的承認は、Cambridgeshire Regional Ethics Committee (REC08/H0306/21)から得た。すべての参加者が、書面でのインフォームドコンセントを提出した。
(Lyons et al., 2007)に記載の方法に従い、CD8+T細胞を患者69名から得た血液試料から陽性選択し、(Lee et al., 2011)に既に記載のように、RNEasy Mini Kits (Qiagen)を用いて、製造業者の使用説明書に従い、RNAを抽出した。
直ぐにRNAを固定するため、全血2.5mlを患者69名からRNeasy miniまたはPAXgene Blood RNA Tube IVD (Qiagen)へ収集した(Rainen et al., 2002)。収集した試料を、製造業者の使用説明書に従って貯蔵し、その後、PAXgene Blood RNA Kit IVD (Qiagen)を用いてRNAを抽出した。
RNAの量および質を各々、Nanodrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)およびAgilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies)を用いて判定した。
200ngの全RNAを、Affymetrix Human Gene ST 1.0マイクロアレイ(CD8+RNA試料)またはAffymetrix Human Gene ST 2.0(全血RNA試料)上で処理およびハイブリダイズし、次に製造業者の使用説明書に従って洗浄およびスキャンした。
マイクロアレイの生データは、BioConductor (Huber et al., 2015)におけるpreprocessCoreパッケージ(Bolstad, 2013)を用いてRで処理した。つまり、生データは、表4.1に報告されたコードを用いて、バックグラウンド補正、分位正規化、および要約を行った。潜在的な異常値の存在は、パッケージarrayQualityMetricsを用いて評価した(Kauffmann et al., 2009)。バッチ補正をComBatを用いて実施した(Johnson et al., 2007)。重要なことに、一個抜き交差検証により汎化誤差推定値における任意の下向きバイアスを回避するため、個体試料のIBD1/IBD2メンバーシップについての知識をバッチ補正手順に組み込まなかった。(試料の少なくとも75%においてlog2発現シグナル>7.0を示すプローブセットとして定義した)発現された転写物を検出するプローブセットのみを保持した。未発現のプローブセットおよびアノテーションのないプローブセットをデータセットから除去し、全血遺伝子発現データセットとして、12,874のプローブセットが残った。
候補遺伝子および3個の参照遺伝子におけるmRNAのレベルを、Roche LightCycler 480リアルタイムPCR機器上でTaqMan Expression Assays (Life Technologies)を用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。プレート内およびプレート間の変動を最小化するため、PCR条件を最適化した。転写物の存在量を、ΔΔCT法(Livak et al., 2001)を用いて計算した。健常者の全血から抽出したプールRNAに由来するcDNA試料を各プレートに加え、標準物質として用いた。各測定を3回反復し、3回の技術的反復の中央値を最終分析に用いた。
IBD1(予後不良)またはIBD2(良好な予後)状態を患者69名に割り当てるため、患者のCD8+T細胞試料からの正規化した発現データを、本発明者の既存のIBD患者コホートからのデータとマージした。次に、Lee et al., 2011に記載のように、マージしたデータセットのコンセンサスクラスタリングを用いて、コホートを2つの以前に識別された予後群に層別化した。
並行して、IBD患者69名からの全血遺伝子発現データのデータセットもまた作成した。患者を2つの予後群(IBD1およびIBD2)に全血遺伝子発現データに基づいて層別化するのに必要な幾つかの遺伝子を、適応的エラスティックネット型正則化を伴うロジスティック回帰モデルを全血遺伝子発現データセットに適用することにより選択した。選択された候補遺伝子および幾つかの密接に相関する遺伝子は、リアルタイムPCR分析を用いる試験の対象とした。10の不変参照遺伝子と一緒に各候補遺伝子に対して、TaqManリアルタイムPCRアッセイを実施した。エラスティックネット型正則化回帰モデルをリアルタイムPCRデータに適用し、15個の遺伝子からなる最適なモデルを同定し、それはIBD患者69名のコホートを2つの元の予後群IBD1およびIBD2に層別化することができた(PPV=0.87、NPV=0.94、感度0.94、特異度0.85;図1および2)。IBD1およびIBD2サブグループはまた、拡大を含まない生存(P=0.0074)および幾つかの経時的拡大(P=0.0003、治療拡大の平均数:1.62(IBD1)、0.70(IBD2)の双方の観点で、疾患経過と等価な関連性があることを示した。15個の遺伝子を表1に列挙する。
実施例1で同定した遺伝子をリアルタイムqPCRアッセイ展開の対象とし、全血分類子の最終内容物(16個の有益な遺伝子および2個の参照遺伝子)を最適化し、完了させた。この分類子の一部を形成する有益な遺伝子を下の表2に列挙する。
次に、実施例2で同定された16の遺伝子分類子の予後性能の独立検証を、英国周辺の4つの施設(Cambridge, Nottingham, Exeter,およびLondon)からの85の新規に診断されたIBD患者の第2の独立コホートを用いて実施した。実施例2で展開したqPCRに基づく試験を用いた全血遺伝子発現の分析により、3.52のIBD1/IBD2ハザード比を有する発見コホートにおいて認められる予後層別化が再現された(95パーセント信頼区間[CI]:1.84〜6.76、P=0.0002、図3)。この性能は、既存の遺伝子発現に基づくインビトロ診断検査の場合に匹敵する。例えば、Oncotype DX(乳がん再発を予測する遺伝子発現診断)におけるハザード比は2.81である(95%CI:1.70 4.64)(Paik et al., NEJM, 2004)。
患者を2つの予後群IBD1およびIBD2に層別化するのに必要である、実施例2で展開した最適化された全血分類子の遺伝子の最小数を判定するため、本発明者は、実施例2で同定した16個の遺伝子のあらゆる可能な組み合わせについて徹底的な計算分析を実施し、IBD患者をIBD1およびIBD2サブグループに正確に層別化するのに使用可能な遺伝子の最小数を判定した。
本発明者は、実施例1に既に記載のように、以前に国際公開第2010/084312号に記載された遺伝子発現シグネチャーが、全血遺伝子発現データに基づき、患者を高リスクIBD1および低リスクIBD2サブグループに正確に層別化する能力を試験した。全血中の、国際公開第2010/084312号の表1または2に開示される遺伝子、すなわち国際公開第2010/084312号に記載の遺伝子KAT2B、ANKRD32およびZNF26、またはITGA2、PTPN22およびNOTCH1の発現を測定することにより、当該グラフを下回ることが報告されたログランク検定P値によって示される通り、IBD患者のIBD1およびIBD2サブグループへの正確な分類が得られなかった(図4を参照)。これらの結果は、国際公開第2010/084312号に開示される遺伝子シグネチャーが、遺伝子発現を全血中で測定するとき、個体におけるIBDの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するために適さないことを示す。
本発明の方法は、患者を高または低リスクのIBDの進行を有する患者に層別化し、RNA材料の安定性を促進する捕集管内の全血としてわずか2.5mlの収集を必要とし、(RNAが室温で最大3日間安定性を維持することから)国際的に公開してもよい。アッセイでは、48時間以内に迅速な結果が戻され、治療開始前の患者診断用に定量RT−PCRを通じて遺伝子発現を測定する。
それらの考えられる疾患経過を判定するため、患者429名および483名が、血液試料をPAXGene(登録商標)Blood RNAチューブに提供した。RNA抽出およびcDNA合成後、16個の有益な遺伝子(ARRDC4、FCRL5、GBP5、GZMH、GZMK、HP、IFI44L、IL18RAP、LGALSL、LINC01136、LY96、NUDT7、P2RY14、TRGC2、TRGV3およびVTRNA1−1)および2個の参照遺伝子(RNA18S5およびCDV3)の発現レベルを、Roche Lightcycler 480を用いる定量PCRにより測定した(Ct、表4)。生データを、2個の参照遺伝子の平均値を有益な遺伝子各々から減ずることにより正規化し(dCt、表4)、次に平均中心化により標準化した(dCt’、表4)。
Logit(Psevere)=β0+β1(IL18RAP)+β2(TRGC2)+β3(TRGV3) (1)
Logit(Psevere)=β0+β1(IL18RAP)+β2(LINC01136)+β3(TRGC2)+β4(VTRNA1−1) (2)
Logit(Psevere)=β0+β1(IL18RAP)+β2(LINC01136)+β3(TRGC2)+β4(TRGV3)+β5(VTRNA1−1) (3)
Logit(Psevere)=β0+β1(ARRDC4)+β2(FCRL5)+β3(GBP5)+β4(GZMH)+β5(ΗΡ)+β6(IFI44L)+β7(IL18RAP)+β8(LGALSL)+β9(LINC01136)+β10(LY96)+β11(P2RY14)+β12(TRGV3)+β13(VTRNA1−1) (4)
Logit(Psevere)=β0+β1(FCRL5)+β3(GBP5)+β4(GZMK)+β5(ΗΡ)+β6(IFI44L)+β7(IL18RAP)+β8(LGALSL)+β9(LINC01136)+β10(LY96)+β11(NUDT7)+β12(P2RY14)+β13(TRGC2)+β14(TRGV3) (5)
Logit(Psevere)=β0+β1(ARRDC4)+β2(FCRL5)+β3(GBP5)+β4(GZMH)+β5(GZMK)+β6(ΗΡ)+β7(IFI44L)+β8(IL18RAP)+β9(LGALSL)+β10(LINC01136)+β11(LY96)+β12(NUDT7)+β13(P2RY14)+β14(TRGC2)+β15(TRGV3)+β16(VTRNA1−1) (6)
再編成方程式(1)重度疾患経過に従う患者429名の確率は、
によって与えられる。
Psevere=0.24
Psevere<0.5であることから、患者429名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者483名においては:
Psevere=0.45
Psevere<0.5であることから、患者483名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
再編成方程式(2)重度疾患経過に従う患者429名の確率は、
によって与えられる。
Psevere=0.13
Psevere<0.5であることから、患者429名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者483名においては:
Psevere=0.73
Psevere>0.5であることから、患者483名は重度疾患経過に従うことが予測される。
再編成方程式(3)重度疾患経過に従う患者429名の確率は、
によって与えられる。
Psevere=0.35
Psevere<0.5であることから、患者429名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者483名においては:
Psevere=0.55
Psevere>0.5であることから、患者483名は重度疾患経過(高リスクのIBD進行)に従うことが予測される。
再編成方程式(4)重度疾患経過に従う患者429名の確率は、
によって与えられる。
Psevere=0.058
Psevere<0.5であることから、患者429名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者483名においては:
Psevere=1
Psevere>0.5であることから、患者483名は重度疾患経過(高リスクのIBD進行)に従うことが予測される。
再編成方程式(5)重度疾患経過に従う患者429名の確率は、
によって与えられる。
Psevere=0.201
Psevere<0.5であることから、患者429名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者483名においては:
Psevere=0.98
Psevere>0.5であることから、患者483名は重度疾患経過(高リスクのIBD進行)に従うことが予測される。
再編成方程式(6)重度疾患経過に従う患者429名の確率は、
によって与えられる。
Psevere=0.008
Psevere<0.5であることから、患者429名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者483名においては:
Psevere=1
Psevere>0.5であることから、患者483名は重度疾患経過に従うことが予測される。
RNA抽出
被験者から得た血液試料を、PAXgene(登録商標)チューブ(PAXgene Blood RNA Kit、カタログ番号762164、BD Biosciences, San Jose, CA)内、室温(15〜25℃)で3時間インキュベートする。次に、試料を含有するチューブを4,000×gで10分間遠心分離し、上清をチューブからデカントし、廃棄する。上清のデカンテーション後、新しい二次的なBD Hemogard(商標)(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)クロージャを用いて、チューブを閉じる。次に、ペレットが見かけ上溶解するまでチューブをボルテックスし、4,000×gで10分間遠心分離する。遠心分離後、全上清を、ピペットを用いて除去および廃棄する。次に、再懸濁緩衝液BR1(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)350μlを添加し、ペレットが見かけ上溶解するまでチューブをボルテックスする。次に、結合緩衝液BR2(PAXgene Blood RNAMDxキット、BD Biosciences, San Jose, CA)300μlおよびプロテイナーゼK40μlが個別に添加された1.5mlのマイクロ遠心チューブに試料をピペッティングする。次に、チューブを5秒間ボルテックスし、シェーカー−インキュベーターを1000rpmで用いて、55℃で10分間インキュベートする。インキュベーション後、マイクロ遠心チューブからの可溶化液を、2mlの処理チューブ内に置いたPAXgene(登録商標)Shredderスピンカラム(ライラック)(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)に直接ピペッティングし、15,000×gで3分間遠心分離した。次に、フロースルー画分の全上清を、新しい1.5mlのマイクロ遠心チューブに、処理チューブ内のペレットを妨げることなく慎重にピペッティングする。96〜100%エタノール350μlを上清に添加し、2秒間ボルテックスし、500×gで1秒間遠心分離し、チューブ蓋内部からの液滴を除去する。試料700μlを、2mlの処理チューブ内に置いたPAXgene(登録商標)RNAスピンカラム(赤)(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)にピペッティングし、15,000×gで1分間遠心分離する。スピンカラムを新しい2mlの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。残存試料を、PAXgene(登録商標)RNAスピンカラム(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)にピペッティングし、15,000×gで1分間遠心分離する。スピンカラムを新しい2mlの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。洗浄緩衝液BR3の350μlを、PAXgene(登録商標)RNAスピンカラムにピペッティングし、15,000×gで1分間遠心分離する。スピンカラムを新しい2mlの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。
即用可能なAgilent RNA 6000 gel-dye mixチューブ(Agilent RNA 6000 Nano Kit、カタログ番号5067-1511、Agilent, Santa Clara, CA)の一定分量を13,000×gで10分間回転させ、次にgel-dye mixを室温(15〜25℃)で30分間、平衡化しておく。新しいRNA Nano chip(Agilent RNA 6000 Nano Kit、カタログ番号5067-1511、Agilent, Santa Clara, CA)を即用可能なチッププライミングステーション(カタログ番号5065- 4401、Agilent, Santa Clara, CA)上に置く。gel-dye mixの9μlを「G」というマークのウェルの底部にピペッティングする。チッププライミングステーションでは、プランジャー1mlに位置づけ、チッププライミングステーションを閉じる。正確に30秒間待機し、次にプランジャーをクリップリリース機構でリリースし、プランジャーが少なくとも0.3mlのマークまで戻ることを目視検査する。5秒間待機し、次にプランジャーを1mlの位置まで徐々に引き戻す。チッププライミングステーションを開き、gel-dye mixの9μlを反応ウェルの各々にピペッティングする。即用可能なAgilent RNA 6000 Ladder(カタログ番号5067-1529、Agilent, Santa Clara, CA)の一定分量を氷上に15分間置いて完全解凍させ、次に70℃で2分間インキュベートする。Agilent RNA 6000 Ladderの1μlを、ラダー記号をマークしたウェルにピペッティングする。Agilent RNA 6000 Nano marker(Agilent RNA 6000 Nano Kit、カタログ番号5067-1511、Agilent, Santa Clara, CA)5μlを、ラダー記号をマークしたウェルおよび反応ウェルの各々にピペッティングする。RNA試料1μlをRNA Nano chipの左上ウェルにピペッティングする。RNA Nano chipを水平に2400rpmで60秒間ボルテックスする。チップをAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Santa Clara, CA)の容器に慎重に入れ、蓋を閉じ、チップを動作させる。動作の完了後、RNAの完全性を点検し、RIN>7の場合、cDNA合成を処理する前、Nanodrop分光光度計を用いてRNAを定量化する。
標識した0.2mlの薄壁内で氷上チューブを以下と組み合わせ、混合物を作出する(表6)。
解凍したcDNA試料を再懸濁し、緩やかにボルテックスし、次に短時間遠心分離し、チューブの底部で液体を収集する。各試料において、内容物を標識した0.5mlのチューブに移し、ヌクレアーゼを含まない水380μlを添加することにより、20倍に希釈する。参照cDNAにおいて、内容物を標識した0.5mlのチューブに移し、ヌクレアーゼを含まない水200μlを添加することにより、5倍に希釈する。
a.参照cDNA(CDV3およびRNA85S5)ウェルA1〜C6
b.cDNA試料#1ウェルD1〜F6
c.cDNA試料#2ウェルG1〜I6
d.cDNA試料#3ウェルJ1〜L6
e.cDNA試料#4ウェルM1〜O6
a.アッセイ1:ウェルA1〜A3、D1〜D3、G1〜G3、J1〜J3、M1〜M3、P1
b.アッセイ2:ウェルA4〜A6、D4〜D6、G4〜G6、J4〜J6、M4〜M6、P2
c.アッセイ3:ウェルA7〜A9、D7〜D9、G7〜G9、J7〜J9、M7〜M9、P3
d.アッセイ4:ウェルA10〜A12、D10〜D12、G10〜G12、J10〜J12、M10〜M12、P4
e.アッセイ5:ウェルA13〜A15、D13〜D15、G13〜G15、J13〜J15、M13〜M15、P5
f.アッセイ6:ウェルA16〜A18、D16〜D18、G16〜G18、J16〜J18、M16〜M18、P6
g.アッセイ7:ウェルA19〜A21、D19〜D21、G19〜G21、J19〜J21、M19〜M21、P7
h.アッセイ8:ウェルA22〜A24、D22〜D24、G22〜G24、J22〜J24、M22〜M24、P8
i.アッセイ9:ウェルB1〜B3、E1〜E3、H1〜H3、K1〜K3、N1〜N3、P9
j.アッセイ10:ウェルB4〜B6、E4〜E6、H4〜H6、K4〜K6、N4〜N6、P10
k.アッセイ11:ウェルB7〜B9、E7〜E9、H7〜H9、K7〜K9、N7〜N9、P11
l.アッセイ12:ウェルB10〜B12、E10〜E12、H10〜H12、K10〜K12、N10〜N12、P12
m.アッセイ13:ウェルB13〜B15、E13〜E15、H13〜H15、K13〜K15、N13〜N15、P13
n.アッセイ14:ウェルB16〜B18、E16〜E18、H16〜H18、K16〜K18、N16〜N18、P14
o.アッセイ15:ウェルB19〜B21、E19〜E21、H19〜H21、K19〜K21、N19〜N21、P15
p.アッセイ16:ウェルB22〜B24、E22〜E24、H22〜H24、K22〜K24、N22〜N24、P16
q.アッセイ17:ウェルC1〜C3、F1〜F3、I1〜I3、L1〜L3、O1〜O3、P17
r.アッセイ18:ウェルC4〜C6、F4〜F6、I4〜I6、L4〜L6、O4〜O6、P18
a.95℃で10分間
b.95℃で10秒間
c.60℃で1分間
d.40℃で30秒間
本明細書中に記載のすべての文書は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
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Claims (36)
- 個体における炎症性腸疾患(IBD)の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法であって、前記個体から得られる全血試料中の2個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより、前記個体が高リスク(IBD1)表現型を有するかまたは低リスク(IBD2)表現型を有するかを確認することを含み、
ここで、前記2個以上の遺伝子が、
アレスチンドメイン含有4(ARRDC4);
グアニル酸結合タンパク質5(GBP5);
プリン作動性受容体P2Y Gタンパク質共役、14(P2RY14);
ヴォールトRNA1−1(VTRNA1−1);
インターロイキン18受容体アクセサリータンパク質(IL18RAP);
ハプトグロビン(HP);
nudix(ヌクレオシド二リン酸連結部分X)型モチーフ7(NUDT7);
グランザイムH(GZMH);
T細胞受容体γ定常2(TRGC2);
レクチン、ガラクトシド結合様(LGALSL);
Fc受容体様5(FCRL5);
インターフェロン誘導タンパク質44様(IFI44L);
長い遺伝子間非タンパク質コードRNA1136(LINC01136);
リンパ球抗原96(LY96);
グランザイムK(GZMK);および
T細胞受容体γ可変3(TRGV3)
からなる群から選択される、方法。 - IBD1表現型が、IBD2表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKの上方制御発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3の下方制御発現を特徴としている、請求項1に記載の方法。
- 前記個体におけるIBDの進行の前記リスクが、
a)前記選択遺伝子の前記測定された発現レベルを重み付けすること;
b)前記リスクスコアを決定するために、ロジスティック回帰モデルを前記重み付けした発現レベルに適用すること、ここで、0.5未満のリスクスコアがIBDの進行の低リスクを示し、かつ0.5未満のリスクスコアがIBDの進行の高リスクを示す、および
c)前記決定の結果をまとめた報告を作成すること、
によって前記患者におけるリスクスコアを計算することにより決定される、請求項1に記載の方法。 - 前記2個以上の遺伝子の発現レベルが、リアルタイム定量PCR(RT−qPCR)、デジタルPCR、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて測定される、請求項2または3に記載の方法。
- 前記2個以上の遺伝子の発現レベルが、RT−qPCRを用いて測定される、請求項4に記載の方法。
- (i)前記個体から得られる全血試料を準備すること;
(ii)前記全血試料からRNAを抽出すること;
(iii)前記RNAをcDNAに変換すること;および
(iv)前記2個以上の遺伝子の発現レベルを決定するため、RT−qPCR、デジタルPCR、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施すること、
を含む、請求項5に記載の方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法における使用のための自己免疫性疾患の進行リスク評価システムであって、
ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される2個以上の遺伝子の発現を測定するための1つまたは複数のツールと、ならびに
前記被験者の前記遺伝子発現データからIBDの進行リスクスコアを計算するようにプログラムされたコンピュータと、を含む、システム。 - 2個以上の遺伝子の前記発現を、RT−qPCR、デジタルPCR、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により測定するための1つまたは複数のツールを含む、請求項7に記載の自己免疫性疾患の進行リスク評価システム。
- (ii)IBDに対する治療におけるステップ(i)において、IBDの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別された個体を選択することをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- (ii)ステップ(i)におけるIBDの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別された個体にIBDに対する治療を施すことをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 個体におけるIBDを治療するための方法であって、
(i)IBDの進行が高リスクまたは低リスクである個体を、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法を用いて識別することと、
(ii)前記個体にIBDに対する治療を施すことと、
を含む、方法。 - IBDの進行について高リスクまたは低リスクであると判定される個体におけるIBDを治療するための方法であって、
(i)前記個体をIBD1(高リスクのIBDの進行)またはIBD2(低リスクのIBDの進行)として分類する試験結果をレビューすることと、
ここで、前記試験は、前記個体から得られる全血試料中の、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される2個以上の遺伝子の発現レベルを測定し、
低リスク(IBD2)表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKの上方制御発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3の下方制御発現が、前記個体が高リスク(IBD1)表現型を有することを示し、かつ
高リスク(IBD1)表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKの下方制御発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3の上方制御発現が、前記個体が低リスク(IBD2)表現型を有することを示す、
(ii)IBDにおけるIBD1またはIBD2表現型を有すると判定された前記個体を治療することと、
を含む、方法。 - ステップ(i)が、RT−qPCR、デジタルPCR、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により2個以上の遺伝子の発現レベルを測定するための分析の結果を提供する試験を要求することを含む、請求項12に記載の方法。
- 個体が高リスクのIBD1表現型を有するかまたは低リスクのIBD2表現型を有するかを評価するためのキットであって、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される2個以上の遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含み、
IBD1表現型が、IBD2表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKの上方制御発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3の下方制御発現を特徴としており、かつ
IBD2表現型が、IBD1表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKの下方制御発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3の上方制御発現を特徴としている、キット。 - 前記キットが、前記2個以上の遺伝子の発現レベルを、RT−qPCR、マイクロアレイ分析、デジタルPCR、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により確認するための試薬を含む、請求項14に記載のキット。
- 前記IBDが、潰瘍性大腸炎(UC)またはクローン病である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法、自己免疫性疾患の進行リスク評価システム、またはキット。
- IBD患者における低リスク(IBD2)表現型を誘導する能力がある物質を同定するインビトロ方法であって、
(i)目的の物質を用いる治療前にIBD患者から得られる全血試料、および(ii)目的の前記物質を用いる治療後に前記IBD患者から得られる全血試料を準備することと、
ここで、前記IBD患者は、請求項1〜4または14のいずれか一項に記載の方法を用いて、高リスク(IBD1)表現型を有することが判定されている;
試料(i)および(ii)中の、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される2個以上の遺伝子の発現レベルを測定することと、
を含み;
試料(i)に対して試料(ii)中での、遺伝子ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKのより低い発現、ならびに遺伝子LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3のより高い発現が、前記物質がIBD患者において低リスク(IBD2)表現型を誘導する能力があることを示す、方法。 - IBD患者において低リスク(IBD2)表現型を誘導する能力があるとして同定された物質を薬剤に配合することをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 個体におけるIBDを治療する能力がある物質を同定するインビトロ方法であって、
(i)IBDの進行が高リスクまたは低リスクである個体を、請求項1〜6または16のいずれか一項に記載の方法を用いて同定することと;
(ii)目的の前記物質を用いる治療後の前記個体におけるIBDの進行の前記レベルを対照と比較することとを含み、ここで、前記対照と比べての前記個体におけるIBDの進行のより低いレベルは、前記物質がIBDを治療する能力があることを示す、方法。 - IBDを治療する能力があるとして同定された物質を薬剤に配合することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 患者の全血試料由来の患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する方法であって、
a)前記患者の全血試料からRNAを準備することと;
b)前記RNAをcDNAに変換することと;
c)前記cDNAの各一定分量を前記cDNAの一定分量が患者試料cDNAの一定分量として同定されるようにアレイ上に置くことと;
d)ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される3個以上の遺伝子の各遺伝子における前記cDNAの各一定分量に対してRT−qPCR、デジタルPCR、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施し、RT−qPCR、デジタルPCRまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の産物を前記アレイ上に提供し、それにより本質的に前記3つ以上の遺伝子発現産物からなる患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供することと、
を含む、方法。 - (e)前記RT−qPCR、デジタルPCRまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の産物を定量化するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記RT−qPCR産物が、前記cDNAを前記3個以上の遺伝子の各々に特異的なプライマーセットと接触させることにより提供される、請求項21に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブプライマーを含む、請求項23に記載の方法。
- 患者の全血試料由来の患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイであって、
患者試料cDNAとして同定されたcDNAの各一定分量を含み、ここで前記アレイの3つ以上のcDNAの一定分量の各々が、前記cDNAの一定分量中で選択遺伝子発現産物を増幅するための特異的なRT−qPCRプライマー対を含み、
ここで、前記アレイが、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される3個以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、アレイ。 - 前記3個以上の遺伝子に特異的なRT−qPCRプローブをさらに含む、請求項25に記載のアレイ。
- 患者の全血試料由来の定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する方法であって、
a)前記患者の全血試料からRNAを準備することと;
b)前記RNAをcDNAに変換することと;
c)前記cDNAの一定分量を前記cDNAの一定分量が患者試料cDNAの一定分量として同定されるようにアレイ上に置くことと;
d)前記cDNAの一定分量に対してRT−qPCR、デジタルPCR、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施し、RT−qPCR、デジタルPCRまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の遺伝子発現産物を前記アレイ上に提供することと;
e)ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる遺伝子の群から選択される3個以上の遺伝子の選択された各遺伝子における遺伝子発現産物の量を定量化することと、
を含み、それにより患者の全血試料由来の定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する、方法。 - 前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKからなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少なく;かつ
LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多い、
請求項27に記載の方法。 - 前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKからなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多く;かつ
LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少ない、
請求項27に記載の方法。 - 定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイであって、患者の全血試料の個別の定量化された遺伝子発現産物を含み、前記定量化された遺伝子発現産物が、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される3個以上の遺伝子の増幅されたcDNA産物からなる、アレイ。
- 前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKからなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少なく;かつ
LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多い、
請求項30に記載のアレイ。 - 前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、およびGZMKからなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多く;かつ
LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少ない、
請求項30に記載のアレイ。 - 前記遺伝子の4個、5個、13個、14個、または16個が、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記遺伝子の4個、5個、13個、14個、または16個が、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される、請求項25に記載のアレイ。
- 前記遺伝子の4個、5個、13個、14個、または16個が、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記遺伝子の4個、5個、13個、14個、または16個が、ARRDC4、GBP5、P2RY14、VTRNA1−1、IL18RAP、HP、NUDT7、GZMH、TRGC2、GZMK、LGALSL、FCRL5、IFI44L、LINC01136、LY96、およびTRGV3からなる群から選択される、請求項30に記載のアレイ。
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