BR112019013189A2 - moléculas de ligação ao antígeno biespecífica, polinucleotídeo, célula hospedeira, método de produção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, composição farmacêutica, uso, métodos para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo e para tratar o câncer ou uma doença infecciosa - Google Patents

moléculas de ligação ao antígeno biespecífica, polinucleotídeo, célula hospedeira, método de produção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, composição farmacêutica, uso, métodos para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo e para tratar o câncer ou uma doença infecciosa Download PDF

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Abstract

a invenção diz respeito a novas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1bb, pelo menos uma porção capaz de se ligar especificamente a um antígeno celular alvo, e um domínio fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, e a métodos de produzir estas moléculas e métodos de utilização das mesmas.

Description

“MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, POLINUCLEOTÍDEO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO, MÉTODOS PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS EM UM INDIVÍDUO E PARA TRATAR O CÂNCER OU UMA DOENÇA INFECCIOSA”
Campo Da Invenção [0001] A invenção diz respeito a novas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, pelo menos uma porção capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável. A invenção diz respeito ainda aos métodos de produção destas moléculas e aos métodos de utilização das mesmas.
Antecedentes Da Invenção [0002] O 4-1 BB (CD137), um membro da superfamília de receptores TNF, foi identificado pela primeira vez como uma molécula cuja expressão é induzida pela ativação de células T (Kwon Y.H. e Weissman S.M. (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 1963-1967). Estudos subsequentes demonstraram expressão de 4-1 BB em linfócitos T e B (Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217 ou Zhang X. et al. (2010), J. Immunol. 184, 787795), células NK (Lin W. et al. (2008), Blood 112, 699-707, células NKT (Kim D.H. et al. (2008), J. Immunol. 180, 2062-2068), monócitos (Kienzle G. e von Kempis J. (2000), Int. Immunol. 12, 73-82, ou Schwarz H. et al. (1995), Blood 85, 1043-1052), neutrófilos (Heinisch I.V. et al. (2000), Eur. J. Immunol. 30, 3441-3446), mastócitos (Nishimoto H. et al. (2005), Blood 106, 4241-4248), e células dendríticas bem como células de origem não hematopoiética, como células endotelais e células musculares lisas (Broil K. et al. (2001), Am. J. Clin.
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Pathol. 115, 543-549 ou Olofsson P.S. et al. (2008), Circulation 117, 12921301). A expressão de 4-1 BB em diferentes tipos de células é principalmente induzível e impulsionada por vários sinais estimuladores, tal como pela ativação do receptor de células T (TCR) ou receptor de célula B, bem como pela sinalização induzida por meio de moléculas coestimulatórias ou receptores de citocinas pró-inflamatórias (Diehl L. et ai. (2002), J. Immunol. 168, 37553762; von Kempis J. et al. (1997), Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406; Zhang X.etal. (2010), J. Immunol. 184, 787-795).
[0003] Sabe-se que a sinalização de CD137 estimula a secreção de IFNy e a proliferação de células NK (Buechele C. et al. (2012), Eur. J. Immunol. 42, 737-748; Lin W. et al. (2008), Stood 112, 699-707; Melero I. et al. (1998), Cell Immunol. 190, 167-172), bem como promove a ativação de DC conforme indicado pelo aumento da sobrevida destas e capacidade de secretar citocinas e regular positivamente moléculas coestimuladoras (Choi B. K. et al. (2009), J. Immunol. 182, 4107-4115; Futagawa T. et al. (2002), Int. Immunol. 14, 275-286; Wilcox R. A. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4262-4267). Entretanto, o CD137 é mais bem caracterizado como uma molécula coestimuladora que modula a ativação induzida por TCR nos subconjuntos CD4+ e CD8+ de células T. Em combinação com a ativação do TCR, anticorpos agonistas específicos para 4-1 BB aumentam a proliferação de células T, estimulam a secreção de linfocinas e diminuem a sensibilidade dos linfócitos T para as células de morte induzidas pela ativação (Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217). De acordo com estes efeitos coestimuladores de anticorpos 4-1 BB sobre as células T in vitro, a administração destes anticorpos em camundongos portadores de tumor leva a potentes efeitos antitumorais em diversos modelos de tumores experimentais (Melero I. et al. (1997), Nat. Med. 3, 682-685; Narazaki H. et al. (2010), Blood 115, 1941-1948). Experimentos In vivo demonstraram que a depleção de células T CD8+ desempenha o papel
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3/331 mais importante no efeito antitumoral de anticorpos específicos para 4-1 BB. Entretanto, dependendo do modelo de tumor ou da terapia combinada, que inclui anti-4-1 BB, foram relatadas contribuições de outros tipos de células, tais como DCs, células NK ou células T CD4+ (Murillo O. et al. (2009), Eur. J. Immunol. 39, 2424-2436; Stagg J. et al. (2011), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 7142-7147).
[0004] Parece que as propriedades imunomoduladoras in vivo de anticorpos 4-1 BB agonistas exigem a presença da porção Fc tipo selvagem sobre a molécula de anticorpo, implicando, assim, a ligação ao receptor de Fc como um importante evento necessário para a atividade farmacológica de tais reagentes, tal como foi descrito para anticorpos agonistas específicos para outros membros de indução da apoptose ou imunomoduladores da superfamília do TNFR (Li F. e Ravetch J.V. (2011), Science 333, 1030-1034; Teng M.W. et al. (2009), J. Immunol. 183, 1911-1920). No entanto, a administração sistêmica de anticorpos agonistas específicos para 4-1 BB com o domínio Fc funcionalmente ativo também induz a expansão das células T CD8+ associada com a toxicidade hepática (Dubrot J. et al. (2010), Cancer Immunol. Immunother. 59, 1223-1233) que é diminuída ou significativamente melhorada na ausência de receptores Fc funcionais em camundongos.
[0005] O urelumab (BMS-666513, clone 10C7) é um anticorpo bloqueador monoclonal lgG4 agonístico, totalmente humano, que se liga ao domínio extracelular de 4-1 BB. Ele é divulgado como 20H4.9-lgG4 na Patente US 7.288.638. Em estudos clínicos com humanos (clinicaltrials.gov, NCT00309023 e NCT00612664), o urelumab administrado uma vez a cada três semanas por 12 semanas induziu a estabilização da doença em pacientes com melanoma, carcinoma de ovário ou de células renais. Contudo, os ensaios foram interrompidos, uma vez que o anticorpo causou hepatite grau 4, levando à ocorrência de duas mortes relacionadas com hepatotoxicidade (Simeone E. e
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Ascierto P.A. (2012), J. Immunotoxicology 9, 241-247). A análise detalhada subsequente dos dados de segurança clínica demonstrou que ο desenvolvimento de transaminite grave é principalmente desencadeado pela dose de urelumab administrada. Também foram observados neutropenia grau 2+, leucopenia e trombocitopenia. A subsequente análise detalhada dos dados de segurança clínica demonstrou que o desenvolvimento de transaminite grave é principalmente desencadeado pela dose de urelumab administrada. Em 2012, o urelumab voltou a entrar em desenvolvimento clínico, porém sob a condição de que fossem utilizadas doses < 1 mg/kg, administradas a cada três semanas. A dose atual recomendada é de 0,1 mg kg administrada a cada três semanas (N. Segai et ai. (2016), Results From an Integrated Safety Analysis of Urelumab, an Agonist Anti-CD137 Monoclonal Antibody, Clin. Cancer Res., Publicado online em 1 de dezembro de 2016). Levando-se em consideração a toxicidade limitante da dose, existe, portanto, a necessidade de melhorar a molécula de ligação ao antígeno específica para 4-1 BB que deve atuar apenas nos locais específicos do tumor, de modo a evitar efeitos colaterais incontroláveis. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção combinam um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar preferencialmente ao antígeno específico do tumor ou associado ao tumor, com pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar agonisticamente ao 4-1 BB. As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser capazes de ativar 4-1 BB não apenas de maneira eficaz, como também de maneira muito seletiva ao local desejado, reduzindo assim os efeitos colaterais indesejáveis que foram observados com anticorpos monoespecíficos convencionais, tal como o urelumab.
Descrição Resumida da Invenção [0006] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que combinam pelo menos um domínio de ligação ao
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5/331 antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, em particular em que domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1 BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável da cadeia leve (Vl4-1BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, com pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo. Estas moléculas de ligação de antígeno biespecíficas são vantajosas porque preferencialmente ativarão 4-1 BB no local onde o antígeno da célula alvo é expresso, devido à sua capacidade de ligação a um antígeno da célula alvo e reduzir a ativação em outros locais do corpo, evitando assim os efeitos colaterais de uma molécula de ligação ao antígeno específica apenas para 4-1 BB. Adicionalmente, as moléculas de ligação de antígeno biespecíficas da invenção compreendem um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em particular um domínio Fc de IgG, que aumenta as propriedades farmacológicas e farmacocinéticas da molécula de ligação ao antígeno biespecífica.
[0007] Em um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes associação estável,
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6/331 em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0008] Em um aspecto específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreendendo uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. De modo mais específico, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0009] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB é um fragmento Fab.
[0010] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB, pelo menos um domínio de ligação ao
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7/331 antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo e um domínio Fc composto por um primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e em que o antígeno da célula alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma (MCSP), Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), Antígeno Carcinoembrionário (CEA), CD19, CD20 e CD33.
[0011] Em um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à proteína de ativação de fibroblastos (FAP).
[0012] De modo específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica na qual o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à proteína de ativação de fibroblastos (FAP) compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a
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8/331 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
20.
[0013] Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica a proteína de ativação de fibroblastos (FAP) compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%,
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96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
[0014] Além disso, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
[0015] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de
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10/331 cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[0016] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA).
[0017] De modo específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
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30, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 182, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 184, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
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189 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192.
[0018] Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% , 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de
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13/331 aminoácidos de SEQ ID NO: 193 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
[0019] Em um aspecto específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
[0020] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de
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14/331 cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.
[0021] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186.
[0022] Ainda em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de
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15/331 cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
[0023] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao CD19.
[0024] De modo específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao CD19 compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que
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16/331 compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
[0025] Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% , 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
[0026] Em um aspecto específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar
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17/331 especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
[0027] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
[0028] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico. Em particular, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um domínio Fc de IgG, particularmente um domínio Fc de IgG 1 ou um domínio Fc de lgG4.
[0029] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo a um receptor Fc e/ou função efetora. Em particular, o domínio Fc é da subclasse IgGi humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e
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P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0030] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidades do domínio Fc. Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreende modificações tipo knob (ou protuberância) e a segunda subunidade do domínio Fc compreende modificações tipo hole (ou cavidade) de acordo com o método conhecido como knobs-into-holes. De modo mais específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração de acordo com o índice EU de Kabat), e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0031] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
mais de um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, em que cada domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0032] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao
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19/331 antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
(b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0033] Em um aspecto específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
(b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc de IgG que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora. De modo mais específico, o domínio Fc de IgG compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou reduz a função efetora.
[0034] Assim, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é bivalente para 4-1 BB e monovalente para o antígeno da célula alvo.
[0035] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo
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20/331 compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL capazes de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas e o domínio VL está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da segunda cadeia pesada.
[0036] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0037] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada
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21/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou (c) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou (d) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.
[0038] Em um aspecto adicional, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um fragmento crossFab capaz de se ligar especificamente ao antígeno da célula alvo que está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas.
[0039] Em um aspecto particular, o fragmento CrossfAb é capaz de se ligar especificamente à FAP, CEA ou CD19. De modo mais específico, o fragmento Crosstab é capaz de se ligar especificamente ao CEA.
[0040] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada
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22/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212, e uma cadeia leve adicional compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213, ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215, e uma cadeia leve adicional compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
[0041] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
(b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0042] Assim, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é tetravalente para 4-1 BB e monovalente para o antígeno da célula alvo.
[0043] Em um aspecto específico, é proporcionada uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que os quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB são fragmentos Fab e cada dois deles está fundido entre si, opcionalmente através de um ligante
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23/331 peptídico.
[0044] Em um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo compreende um domínio VH e VL, e em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico à extremidade C-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e o domínio VL está conectado por um ligante peptídico à extremidade C-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.
[0045] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou (b) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
[0046] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou (b) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência
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24/331 de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou (c) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou (d) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.
[0047] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido anteriormente na presente invenção. A invenção provê ainda um vetor, em particular um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado da invenção e uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo isolado ou o vetor da presente invenção. Em alguns aspectos, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente uma célula de mamífero.
[0048] Em outro aspecto, é fornecido um método para produzir a molécula de ligação ao antígeno biespecífica descrita na presente invenção, compreendendo as etapas de (i) cultivo da célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno, e (ii) recuperação da molécula de ligação ao antígeno. A invenção também abrange a molécula de ligação ao antígeno biespecífica produzida pelo método
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25/331 da invenção.
[0049] A invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme descrito anteriormente e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, a composição farmacêutica é para uso no tratamento de câncer ou doenças infecciosas. Em particular, a composição farmacêutica é para uso no tratamento do câncer.
[0050] A invenção também abrange a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, descrita anteriormente na presente invenção, ou a composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, para uso como medicamento.
[0051] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, tal como descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da invenção, para uso;
(i) na estimulação da resposta de células T, (ii) no suporte à sobrevivência de células T ativadas, (iii) no tratamento de infecções, (iv) no tratamento do câncer, (v) no atraso da progressão do câncer; ou (vi) no prolongamento da sobrevida de um paciente que sofre de câncer.
[0052] Em outro aspecto, a invenção está relacionada a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável,
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26/331 em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB de camundongo compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 172, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 173 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176.
[0053] Em um aspecto específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 177 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 178. De modo específico, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 177 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 178. Em outro aspecto específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo se liga à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) e compreende (a) uma região variável de
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27/331 cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em particular, é proporcionada uma molécula de ligação de antígeno biespecífica, tal como descrita na presente invenção, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e a segunda subunidade da região Fc compreende o substituições de aminoácidos E356K e D399K (numeração de acordo com o índice EU Kabat).
[0054] Em um aspecto específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, tal como descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da invenção, para uso no tratamento do câncer. Em outro aspecto específico, a invenção provê a molécula de ligação ao antígeno biespecífica como descrito na presente invenção para uso no tratamento do câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso na imunoterapia contra o câncer.
[0055] Em outro aspecto, a invenção provê um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo, cujo método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica descrita na presente invenção, ou a composição farmacêutica da invenção, para inibir a crescimento das células tumorais.
[0056] A invenção também provê o uso da molécula de ligação ao
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28/331 antígeno biespecífica descrita na presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo com tal necessidade, em particular para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer ou de doenças infecciosas, bem como um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em um exemplo de realização, a doença é o câncer. Em qualquer um dos exemplos de realização anteriores o indivíduo é preferencialmente um mamífero, particularmente um humano.
Breve Descrição Das Figuras [0057] Figuras 1A e 1B mostram exemplos de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas no formato hulgGI P329GLALA compreendendo dois fragmentos Fab anti-4-1 BB (ligação bivalente para 4-1 BB) e um domínio VH e VL capazes de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, por exemplo, anti-FAP, anti-CEA ou anti-CD19, fundidos ao Cterminal das cadeias pesadas, respectivamente. Este formato é denominado também de formato 2+1. O ponto preto simboliza as mutações knobs-intoholes. A Figura 1A mostra que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio VL do domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar a um antígeno da célula alvo específico está fundido com a extremidade C-terminal da cadeia Fc hole, designado como VL-hole, a Figura 1B mostra a molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo está fundido ao C-terminal da cadeia Fc hole, denominado VH-bo/e. A Figura 1C mostra a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, monovalente anti-4-1 BB e monovalente anti-FAP (hulgGI P329G LALA), também denominada de
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29/331 formato 1+1.0 anti-FAP é um Fab crossover, o que significa que a cadeia pesada compreende VL-CH1, enquanto a cadeia leve compreende VH-CL, e o anti-4-1 BB é um Fab com variantes carregadas. As Figuras 1D e 1E mostram a molécula de ligação ao antígeno biespecífica no formato hulgGI P329GLALA compreendendo dois fragmentos Fab anti-4-1 BB (ligação bivalente para 4-1 BB) e um crossfab capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, por exemplo, anti-FAP, anti-CEA ou anti-CD19, fundido ao C-terminal de uma das cadeias pesadas. Este formato é denominado de formato crossfab 2+1. A Figura 1D mostra a variante com o crossfab CHCL, a Figura 1E mostra a variante crossfab VHVL. Os triângulos na Figura 1E simbolizam a possibilidade de variantes carregadas (mutações no domínio CL do aminoácido na posição 123 (numeração EU) para arginina (R) e do aminoácido na posição 124 (numeração EU) para lisina (K) e no domínio CH1 dos aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e na posição 213 (numeração EU) para ácido glutâmico (E)).
[0058] Figuras 2A e 2B: referem-se à ligação simultânea de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas 2+1 anti-4-1 BB e anti-FAP. A figura 2A é um pictograma da configuração do ensaio. A Figura 2B mostra a ligação simultânea das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-41BB/anti-FAP (analito 1) ao 4-1 BB humano e FAP humana (analito 2) imobilizados.
[0059] Figura 3: exibe um ensaio de competição baseado em FRET para avaliar a ligação do anticorpo bivalente (IgG) anti-41BB (20H4.9) e das moléculas de ligação ao antígeno bivalentes (2+1) anti-4-1 BB (20H4.9)/anti-FAP (4B9) ao 4-1 BB ligado à membrana. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, bivalente (2+1) anti-4-1 BB (20H4.9)/anti-FAP (4B9) compete como a IgG equivalente.
[0060] Figuras 4A e 4B: mostram exemplos de moléculas de
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30/331 ligação ao antígeno biespecíficas no formato hulgGI P329GLALA compreendendo quatro fragmentos Fab anti-4-1 BB (ligação tetravalente para 41 BB) e um domínio VH e VL capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, por exemplo, anti-FAP, anti-CEA ou anti-CD19, fundidos ao Cterminal das cadeias pesadas, respectivamente. Este formato também é denominado de formato 4+1. O ponto preto simboliza as mutações knobs-intoholes. Cada dois dos domínios VHCH1 dos domínios Fab anti-4-1 BB estão fundidos entre si e ao domínio Fc. A Figura 4A mostra que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio VL do domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar a um antígeno da célula alvo específico está fundido com a extremidade C-terminal da cadeia Fc hole, designado como VL-hole, a Figura 1B mostra a molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo está fundido ao C-terminal da cadeia Fc hole, denominado VH-/?o/e.
[0061] Figuras 5A e 5B: referem-se à ligação simultânea de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas 4+1 anti-4-1 BB e anti-FAP. A figura 5A é um pictograma da configuração do ensaio. A Figura 5B mostra a ligação simultânea das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-41BB/anti-FAP (analito 1) ao 4-1 BB humano e FAP humana (analito 2) imobilizados.
[0062] Figura 6: mostra um ensaio de competição baseado em FRET para avaliar a ligação do anticorpo bivalente (IgG) anti-41BB (20H4.9) e das moléculas de ligação ao antígeno tetravalentes (4+1) anti-4-1 BB (20H4.9)/anti-FAP (4B9) ao 4-1 BB ligado à membrana. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, tetravalente (4+1) anti-4-1 BB (20H4.9)/anti-FAP (4B9) compete melhor que a contraparte IgG.
[0063] Figuras 7A a 7D: mostram a ligação às células T humanas
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31/331 em repouso e ativadas. A concentração de moléculas de ligação ao antígeno anti-4-1BB é representada contra a média geométrica da intensidade de fluorescência (MFI) do anticorpo de detecção secundário conjugado com PE. Todos os valores são corrigidos pelos valores basais, subtraindo-se o valor de referência do controle branco (por exemplo, sem utilizar o anticorpo de detecção primário, apenas o secundário). Nos painéis superiores, é mostrada a ligação às células T CD4 em repouso (Figura 7A) ou células T CD4 ativadas (Figura 7B). Nos painéis inferiores, é mostrada a ligação às células T CD8 em repouso (Figura 7C) ou células T CD8 ativadas (Figura 7D). Apenas as moléculas de ligação ao antígeno contendo o domínio de ligação ao 4-1 BB como a molécula de ligação ao antígeno 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (diamante preenchido em preto), molécula de ligação antígeno biespecífica anti-4-1BB (20H4.9)/anti-FAP (4B9) 2+1 (triângulo preenchido em preto, linha pontilhada) e molécula de ligação antígeno anti-4-1BB (20H4.9)/anti-FAP (4B9) 4+1 (quadrado preenchido em cinza) se ligam eficientemente às células que expressam 4-1 BB. Nenhuma ligação pode ser detectada com a molécula de controle DP47 (controle da linhagem germinal) hulgGI P329G LALA (círculos pretos abertos, linha pontilhada).
[0064] Figuras 8A e 8B: mostram a ligação às células T humanas ativadas. Nesses gráficos, é exibida a área sob as curvas das Figuras 7C e 7D. A Figura 8A ilustra a ligação às células T CD8+ ativadas e a Figura 8B ilustra a ligação às células T CD4+ ativadas. O anticorpo 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (preto), molécula de ligação ao antígeno biespecífica 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 (xadrez), molécula de ligação ao antígeno biespecífica 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 (linhas diagonais) e a molécula de controle DP47 hulgGI P329G LALA são mostrados, respectivamente.
[0065] Figuras 9A e 9B: mostram a ligação às células expressando FAP humana. A concentração de moléculas de ligação ao 4-1 BB
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32/331 é representada contra a média geométrica da intensidade de fluorescência (MFI) do anticorpo de detecção secundário conjugado com PE. Todos os valores são corrigidos pelos valores basais, subtraindo-se os valores de referência do controle branco (por exemplo, sem utilizar o anticorpo de detecção primário, apenas o secundário). Na Figura 9A, a ligação à linhagem de células de melanoma humano WM-266-4 que expressa FAP em nível intermediário e na Figura 9B a ligação à linhagem de células NIH/3T3-huFAP clone 19 que expressa FAP em nível alto. Apenas moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno FAP como 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 (triângulo preenchido preto e linha pontilhada) e 41BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 (quadrado cinza) ligam-se de maneira eficiente às células que expressam FAP. Nenhuma ligação pode ser detectada com moléculas não direcionadas à FAP anti-4-1BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (triângulo preenchido preto) e com a molécula de controle DP47 hulgGI P329G LALA (círculos pretos abertos, linha pontilhada).
[0066] Figuras 10A a 10C: mostram a expressão da luciferase mediada por NFkB na linhagem de células repórter expressando 4-1 BB, HeLahu4-1 BB-NFkB-luc. A concentração de moléculas de ligação ao 4-1 BB está representada graficamente contra as unidades de luz liberadas (URL), medidas após 6 h de incubação. Todos os valores são corrigidos pelos valores basais, subtraindo-se os valores de referência do controle branco (por exemplo, sem adição de anticorpos). A Figura 10A mostra a ativação de 4-1 BB independente do direcionamento à FAP, em que a ligação de 4-1 BB induz a expressão da luciferase controlada pelo NFkB na linhagem de células repórteres sem qualquer reticulação mediada por FAP. Na Figura 10B, a linhagem de células de melanoma humano WM-266-4 em expressando níveis intermediários de FAP e na Figura 10C, NIH/3T3-huFAP clone 19 expressando altos níveis de FAP foram adicionadas em uma proporção de 5:1 para a linhagem de células
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33/331 repórter. As células que expressam FAP levam a uma reticulação das moléculas de ligação ao 4-1 BB direcionadas à FAP e aumentam o seu potencial de induzir ativação da luciferase mediada por NFkB na linhagem de células repórteres que expressam 4-1 BB.
[0067] Figuras 10D a 10E: mostram a atividade da expressão da luciferase mediada por NFkB na linhagem de células repórter expressando 41BB, HeLa-hu4-1 BB-NFkB-luc. A concentração da construção de ligação ao 41BB agonista direcionada à FAP, 4-BB (20H4.9) x FAP (4B9) 1+1 (losangos pretos) ou seus controles é representada contra as unidades de luz liberada (URLs) medidas após 6 horas de incubação. Todos os valores são corrigidos pelos valores basais, subtraindo-se os valores de referência do controle branco (por exemplo, sem adição de anticorpos). A Figura 10D mostra a ativação de 41 BB independente do direcionamento à FAP, em que a ligação de 4-1 BB induz a expressão da luciferase controlada pelo NFkB na linhagem de células repórteres sem qualquer reticulação mediada por FAP. Na Figura 10E, a linhagem de células WM-266-4 de melanoma humano que expressa FAP na superfície foi adicionada em uma proporção de 5:1 à linhagem de células repórteres. As células WM-266-4 que expressam FAP levam a uma reticulação da molécula de ligação biespecífica 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 1+1 e aumentam o potencial de induzir ativação da luciferase mediada por NFkB na linhagem de células repórteres que expressam 4-1 BB.
[0068] Figuras 11A a 11C: também mostram a expressão da luciferase mediada por NFkB na linhagem de células repórter expressando 41 BB, HeLa-hu4-1 BB-NFkB-luc. Nesses gráficos, é exibida a área sob as curvas das Figuras 10A e 10C. O anticorpo 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (preto), molécula 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 (xadrez), molécula 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 (linhas diagonais) e a molécula de controle DP47 hulgGI P329G LALA são mostrados, respectivamente.
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34/331 [0069] Figuras 12A a 12D: mostram a ativação de PBMCs humanas na presença da linhagem de células de fibroblastos que expressam FAP humana (NIH/3T3-huFAP). A incubação das PBMCs humanas isoladas frescas na presença de células que expressam FAP e um estímulo CD3 leva a uma regulação positiva (upregulation) de CD25 em células T CD4+ (Figura 12A) e células T CD8+ (Figura 12B), bem como a uma proliferação aumentada de Células T CD4+ (Figura 12C) e células T CD8+ (Figura 12D) se a moléculas de ligação ao antígeno 4-1 BB (20H4.9) (triângulo preenchido com preto e linha pontilhada e quadrado cinza preenchido) ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica 4-1 BB (12B3) x FAP (4B9) 4+1 (estrelas negras, molécula de controle positivo com outro clone anti-4-1BB) estão presentes. Independentemente da razão de direcionamento (4+1 contra 2+1), ambas as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas com o clone de ligação 4-1 BB 20H4.9 são capazes de induzir a ativação de células T CD4 e CD8 de maneira similar, enquanto que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o ligante de 4-1 BB 12B3 leva a ativação menos potente. A molécula de 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA não direciona à FAP (diamante preto preenchido) é capaz apenas de aumentar a ativação e proliferação de células T CD4+ até uma determinada extensão.
[0070] Figura 13: todos os quatro parâmetros mostrados nas Figuras 12A a 12D são resumidos como área sob as curvas. Como controle negativo, a molécula DP47 hulgGI P329G LALA não direcionada é exibida para indicar a ativação e proliferação basal.
[0071] A indução da ativação de células T de camundongo por moléculas de ligação ao antígeno 4-1BB/FAP de camundongo biespecíficas é mostrada nas Figuras 14A a 14J. A concentração adicionada de anticorpos 41 BB agonistas de camundongo (eixo x) é representada contra a percentagem de células positivas (Figuras 14A a 14H) ou a média da intensidade de
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35/331 fluorescência (Figuras 141 e 14J) no eixo y. À esquerda, são mostrados os parâmetros de ativação de células T CD8+ (Figuras 14A, 14C, 14E, 14G e 141) e à direita das células T CD4+ (Figuras 14B, 14D, 14F, 14H e 14J). É mostrada a expressão de 4-1 BB aumentada em células T CD8+ (Figura 14A) e células T CD4+ (Figura 14B), a expressão aumentada de CD25 em células T CD8+ (Figura 14C) e células T CD4+ (Figura 14D), expressão aumentada de granzima B em células T CD8+ (Figura 14E) e células T CD4+ (Figura 14F), aumento da proliferação de células T CD8+ (Figura 14G) e células T CD4+ (Figura 14H) e aumento da estrutura citosólica por aumentar os valores de dispersão lateral nas células T CD8+ (Figura 141) e nas células T CD4+ (Figura 14J). A ativação de células T de camundongo com 0,5 pg/mL de IgG de hamster armênio anti-CD3 de camundongo agonista (sinal 1) em combinação com anticorpo agonista anti-4-1BB de camundongo coestimulatório reticulado (sinal 2) leva ao aumento da ativação de células T - mostrado pela expressão aumentada de 4-1 BB, CD25 e Granzima B, bem como aumento da proliferação e estrutura citosólica pela intensidade média de fluorescência de dispersão lateral. Os efeitos sinérgicos dependem da capacidade de se ligar a 4-1 BB e ser reticulado ao mesmo tempo. A reticulação do anticorpo agonista anti-4-1 BB de camundongo pode ser entregue pela ligação ao FcR (4-1 BB de camundongo (MU137-1) molgGI wt, losangos pretos) ou por ligação simultânea à FAP (4-1 BB camundongo (MU137-1) x FAP (28H1) molgGI DAPG 2+1, estrela cinza e linha pontilhada). Conforme mostrado, por exemplo, pela proliferação de células T CD4+ (Figura 14H), a reticulação via FAP é muito mais potente. Anticorpos inertes de ligação ao 4-1 BB (molgGI não direcionado, círculo aberto cinza e linha pontilhada) ou inerte de ligação para FcyR (4-1 BB de camundongo (MU137-1) molgGI DAPG) não são capazes de aumentar a ativação de células T CD8 e CD4 acima do valor basal.
[0072] Figuras 15A e 15B: mostram a atividade de expressão de
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36/331 luciferase mediada por NFkB em linhagem de células repórter que expressam 4-1 BB. A concentração da construção de ligação ao 4-1 BB agonista direcionada ao CEA, 4-BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 é representada contra as unidades de luz liberada (URLs) medidas após 6 horas de incubação. Todos os valores são corrigidos pelos valores basais, subtraindo-se os valores de referência do controle branco (por exemplo, sem adição de anticorpos). A Figura 15A mostra a ativação de 4-1 BB independente do direcionamento ao CEA, em que a ligação de 4-1 BB induz a expressão da luciferase controlada pelo NFkB na linhagem de células repórteres sem qualquer reticulação mediada por CEA. Na Figura 15B, a linhagem de células de adenocarcinoma gástrico humano que expressa CEA na superfície foi adicionada em uma proporção de 5:1 à linhagem de células repórteres. As células MKN45 que expressam CEA levam a uma reticulação da molécula de ligação 4-1 BB (20H4.9) x CEA (A4B7) 2+1 biespecífica e aumentam o potencial de induzir ativação da luciferase induzida por NFkB na linhagem de células repórteres que expressam 4-1 BB. A área sob a curva (AUC) e valore ECso estão indicados nos gráficos como médias (DP).
[0073] Figura 16A: mostra o formato estrutural 2+1 dos anticorpos biespecíficos, bivalentes anti-4-1 BB/monovalentes anti-CD19 (denominados 41BBxCD19) conforme descrito no Exemplo 8. As moléculas são moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas no formato hulgGI P329GLALA compreendendo dois fragmentos Fab anti-4-1 BB (ligação bivalente para 4-1 BB) e um domínio VH e VL capaz de se ligar de maneira específica ao CD19, fundidos na extremidade C-terminal das cadeias pesadas, respectivamente. O ponto preto simboliza as mutações knobs-into-holes. Exemplos são 4-1 BB (20H4.9) xCD19 (2B11) ou 4-1 BB (20H4.9) xCD19 (8B8-018). A Figura 16B mostra o controle positivo, um trímero 4-19B1 monovalente de CD19 contendo molécula de ligação ao antígeno (hulgGI P329G LALA) com modificações no
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37/331 domínio CH1 e CL adjacente ao dímero 4-1BBL (71-248) e monômero 4-1BBL (71 -248). O ponto preto espesso representa a modificação knob-into-hole. * simboliza modificações de aminoácidos no domínio CH1 e CL (denominados resíduos carregados). A molécula descrita no documento WO 2016/075278 A1 e denominada CD19(2B11)x4-1 BBL, uma vez que compreende o clone ligante de CD19, 2B11. A Figura 16C mostra o controle negativo, uma molécula de ligação ao antígeno não direcionada (DP47) (hulgGI P329G LALA) com o dímero 4-1 BBL (71-248) fundido ao C-terminal da cadeia Fc knob e o monômero 4-1 BBL (71-248) fundido ao C-terminal da cadeia Fc hole.
[0074] Figura 17A: mostra a ligação das construções 4-1BBxCD19 às células B humanas CD19+, detectada por um anticorpo secundário contra Fc humano. 4-1 BB (20H4.9) xCD19 (2B11) se liga às células B humanas de forma dose-dependente, com uma afinidade menor quando comparada com CD19(2B11)x4-1 BBL, enquanto DP47x4-1BBL não direcionada não se liga às células B. A Figura 17B mostra o ligação de diferentes construções de 41BBxCD19 às linhagem de células CD19+, WSU-DLCL2, detectadas pelo anticorpo secundário contra Fc humano. 4-1 BB(20H4.9)xCD19(2B11) se liga às células tumorais CD19+WSU de um modo semelhante ao que ocorre com células B primárias. 4-1 BB(20H4.9)xCD19(8B8-018) mostra uma propriedade de ligação idêntica em comparação com 4-1 BB(20H4.9)xCD19(2B11).
[0075] Figuras 18A e 18B: mostram a ligação das construções 41BBxCD19às células T CD4+ ativadas (Figura 18A) ou células T CD8+ ativadas (Figura 18B). A ligação específica foi analisada nas populações de células CD4 e CD8 puras selecionadas em uma janela de análise (gated). 41 BB(20H4.9)xCD19(2B11) mostrou excelente ligação às células T CD4 ou CD8 expressando 4-1 BB de uma maneira dose-dependente, mas com uma afinidade ligeiramente inferior em comparação com a CD19(2B11)-4-1 BBL. 41 BB(20H4.9)xCD19(018) mostra uma propriedade de ligação idêntica em
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38/331 comparação com 4-1 BB(20H4.9)xCD19(2B11).
[0076] Figura 19: exibe a liberação de IFN-γ por PBMCs ativadas causada pelas construções 4-1BBxCD19. PBMCs humanas totais foram incubadas com microesferas anti-CD3 e anti-CD28 e com uma concentração titulada de construções 4-1BBxCD19. Após dois dias os sobrenadantes foram coletados para a medição do IFN-γ por ELISA.
[0077] Figuras 20A a 20C: referem-se à ligação simultânea de anticorpos agonistas biespecíficos 2+1 de 4-1 BB com ligação monovalente para CEA, em particular à região do epítopo do antígeno N(A2-B2)A e hu41 BB. A figura 20A mostra a configuração do ensaio. A Figura 20B mostra a ligação simultânea da construção 2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(A5B7P) lgG1 PGLALA humana com crosstab CHLC (Analito 1) ao N(A2-B2)A imobilizado e 4-1 BB humano (Analito 2). A Figura 20C mostra a ligação simultânea da construção 2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(A5B7P) lgG1 PGLALA humana com crosstab VHVL (Analito 1) ao N(A2-B2)A imobilizado e 4-1 BB humano (Analito
2).
[0078] Figuras 21A a 21 D: mostram a ligação de moléculas biespecíficas às células humanas que expressam 4-1 BB ou CEA humano, respectivamente. A concentração de moléculas de ligação ao CEA e 4-1 BB biespecíficas é representada contra a média geométrica da intensidade de fluorescência (MFI) do anticorpo de detecção secundário conjugado com PE. Todos os valores são corrigidos pelos valores basais, subtraindo-se o valor de referência do controle branco (por exemplo, sem utilizar o anticorpo de detecção primário, apenas o secundário). A figura 21 A, mostra a ligação à linhagem de células repórteres que expressa 4-1 BB humano, Jurkat-hu4-1 BBNFkB-luc, e a Figura 21B mostra a ligação à linhagem de células humana de câncer gástrico que expressa CEA humano, MKN45. Apenas as moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno 4-1 BB
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39/331 ou um domínio de ligação ao antígeno CEA ligam-se eficientemente às células Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-Iuc expressando 4-1 BB humano ou células MKN45 expressando CEA humano, respectivamente. Como controle negativo, foi utilizado um anticorpo DP47 hulgG P329G LALA inespecífico que forneceu o valor basal. Na Figura 21C, é exibida a área sob a curva (AUC) das curvas de ligação às células Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-Iuc e na Figura 21D é exibida a AUC das curvas de ligação às células MKN45.
[0079] Figuras 22A a 22C: mostram a expressão da luciferase mediada por NFkB, e portanto a atividade destas, na linhagem de células repórter expressando 4-1 BB, (Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-luc2). As concentrações de anticorpo agonístico direcionado ao CEA biespecífico e ao 4-1 BB biespecífico estão representadas graficamente contra unidades de luz liberadas (URL), mensuradas após 6 horas de incubação. Todos os valores são corrigidos pelos valores basais, subtraindo-se os valores de referência do controle branco (por exemplo, sem adição de anticorpos). A Figura 22A mostra a ativação de 4-1 BB independente do direcionamento ao CEA, de modo que a ligação de 4-1 BB induz a expressão da luciferase controlada pelo NFkB na linhagem de células repórteres sem qualquer reticulação mediada por CEA. Na Figura 22B, a linhagem de células de adenocarcinoma gástrico humano que expressa CEA na superfície foi adicionada em uma proporção de 5:1 à linhagem de células repórteres. As células MKN45 que expressam CEA levam a uma reticulação das moléculas de ligação ao antígeno 4-1 BB e CEA biespecíficas e aumentam o potencial de induzir ativação da luciferase induzida por NFkB na linhagem de células repórteres que expressam 4-1 BB. Dependendo do clone de direcionamento para o CEA e do formato biespecífico, as moléculas exibiram diferentes potenciais de ativação. O clone A5B7P foi utilizado em três formatos diferentes, em que a fusão C-terminal VH/VL do clone A5B7P (triângulo cinza) mostra menos atividade que os
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40/331 formatos biespecíficos, onde ο A5B7P foi fundido C-terminalmente como crossFab CH/CL (diamante negro). O maior potencial de ativação foi observado se ο A5B7P foi fundido C-terminalmente como VH/VL crossFab (quadrado aberto preto). Portanto, o clone A5B7P subjaz restrições de formato, levando a um potencial de ativação diferente. A ativação mais forte é observada com o clone CEA-Ligante A5B7 (triângulo preto voltado para baixo). As moléculas de 4-1 BB (20H4.9) não direcionadas (sem alvo) como 4-1 BB (20H4.9) x DP47 2+1 (círculo cinza aberto, linha pontilhada) ou 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (círculo cinza preenchido) exibem uma atividade basal independente de reticulação ao CEA. As AUC calculadas estão resumidas na Figura 22C. Os clones de ligação ao CEA e formatos usados estão indicados no Eixo X e como figuras acima das colunas.
[0080] Figuras 23A a 23D: mostram a ativação de PBMCs humanas na presença de células tumorais que expressam CEA (MKN45). A incubação de PBMCs humanas isoladas frescas na presença de células MKN45 expressando CEA e um estímulo CD3 leva a uma regulação positiva de CD25 em células T CD4+ (Figura 23A) e células T CD8+ (Figura 23B), bem como a um aumento da proliferação de células T CD4+ (Figura 23C) e, em uma extensão menor, de células T CD8+ (Figura 23D) se a molécula de ligação ao antígeno 4-1 BB (20H4.9) (triângulo preto preenchido e linha contínua) direcionada ao CEA está presente. As moléculas não direcionadas ao CEA 41BB (20H4.9) x DP47 2+1 (círculo aberto cinza, linha pontilhada) ou 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (círculo cinza preenchido, linha contínua) levam a uma ativação basal limitada enquanto que o DP47 hulgGI P329G LALA como controle negativo forneceu um valor basal verdadeiro.
[0081] Figuras 24A a 24D: PBMCs humanas de um doador diferente, conforme mostrado nas Figuras 23A a 23D, foram ativadas na presença de células tumorais que expressam CEA (MKN45). A incubação de
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PBMCs humanas isoladas frescas na presença de células MKN45 expressando CEA e um estímulo CD3 leva a uma regulação positiva de CD25 em células T CD4+ (Figura 24A) e células T CD8+ (Figura 24B), bem como a um aumento na proliferação de células T CD4+ (Figura 24C) e, em uma menor extensão, de células T CD8+ (Figura 24D) se as moléculas de ligação ao antígeno 4-1 BB (20H4.9) direcionadas ao CEA estão presentes.
Descrição Detalhada Da Invenção
Definições [0082] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado como comumente utilizado no estado da técnica ao qual esta invenção pertence. Para os propósitos de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que necessário, os termos usados na forma singular também incluirão o plural e vice-versa.
[0083] Conforme utilizado no presente, o termo “molécula de ligação ao antígeno” é utilizado no sentido mais amplo para se referir a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são anticorpos, fragmentos de anticorpos e proteínas estruturais/andaime (scaffold) de ligação ao antígeno.
[0084] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo”, ou “porção capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo” refere-se a uma molécula polipeptídica que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através do seu antígeno da célula alvo. Em um aspecto específico, um domínio de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade ao qual está ligado (por exemplo, o agonista 4-1 BB) para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral ou
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42/331 estroma tumoral que carrega o determinante antigênico. Os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo incluem anticorpos e fragmentos destes, conforme definido adicionalmente na presente invenção. Além disso, os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo incluem as proteínas ligação ao antígeno andaime (scaffold), conforme definido na presente invenção, por exemplo, domínios de ligação que são baseados em proteínas de repetição desenvolvidas ou domínios de repetição personalizados (vide, por exemplo, o documento WO 2002/020565).
[0085] Em relação a um anticorpo ou fragmento do mesmo, o termo “domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à célula alvo” refere-se à parte da molécula que compreende a área que se liga especificamente e que é complementar a parte ou todo de um antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também denominados de regiões variáveis). Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável da cadeia pesada de anticorpo (VH). Em outro aspecto, o “domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo” também pode ser um fragmento Fab ou um fragmento crosstab (ou Fab cruzado).
[0086] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos e multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
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43/331 [0087] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno.
[0088] O termo anticorpo “monoespecífico” conforme utilizado no presente denota um anticorpo que tem um ou mais sítios de ligação, em que cada um deles se liga ao mesmo epítopo do mesmo antígeno. O termo “biespecífico” significa que a molécula de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a, pelo menos, dois determinantes antigênicos distintos. Normalmente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um deles é específico para um determinante antigênico diferente. Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de se ligar, simultaneamente, a dois determinantes antigênicos, em particular dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.
[0089] O termo “valente”, conforme utilizado no presente pedido denota a presença de um número especificado de sítios de ligação específicos para um determinante antigênico distinto em uma molécula de ligação ao antígeno, que são específicos para um determinante antigênico distinto. Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de
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44/331 dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, específicos para certo determinante antigênico, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno. Em aspectos específicos da invenção, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de acordo com a invenção podem ser monovalentes para certo determinante antigênico, o que significa que eles têm apenas um sítio de ligação para o referido determinante antigênico ou elas podem ser bivalentes para certo determinante antigênico, o que significa que elas têm dois sítios de ligação para o referido determinante antigênico.
[0090] As expressões “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são utilizadas no presente de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativa. Os “anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulinas de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, anticorpos da classe IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por ligações de bissulfeto. A partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também denominados de região constante da cadeia pesada. Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante de cadeia leve (CL), também denominado de região constante da cadeia leve. A cadeia pesada de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre cinco tipos, denominados de a (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ou μ (IgM), alguns dos quais podem ser ainda divididos em subtipos, por exemplo,
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45/331 γι (IgGi), γ2 (lgG2), γ3 (IgGa), γ4 (lgG4), αι (IgAi) e 02 (lgA2). A “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.
[0091] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual 0 anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab’, Fab’SH, F(ab’)2, diacorpos (diabodies), triabodies, tetrabodies, fragmentos crosstab, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg & Moore., (Springer-Verlag, Nova Iorque), págs. 269-315 (1994); vide também 0 WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epitopo que se ligam a receptores de resgate (salvage) e têm meia vida in vivo aumentada, consulte patente US 5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos, consulte, por exemplo, a Patente EP 404,097; documento WO 1993/01161; Hudson etal., Nat Med 9, 129- 134 (2003); e Hollinger etal., Proc Natl Acad Sei USA 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo de domínio único é um
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46/331 anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.
[0092] A digestão de anticorpos intactos pela papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, denominados de fragmentos “Fab”, cada um contendo domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve, e também o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “fragmento Fab” refere-se a um fragmento de anticorpo compreendendo um fragmento da cadeia leve que compreende um domínio VL e um domínio constante de uma cadeia leve (LC), e um domínio VH e um primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CHi de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab’-SH são fragmentos Fab’ no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carrega(m) um grupo tiol livre. O tratamento com a pepsina gera um fragmento F(ab’)2 que contém dois sítios de ligação a antígenos (dois fragmentos Fab) e e uma parte da região Fc. De acordo com a presente invenção, o termo “fragmento Fab” também inclui “fragmentos crosstab ou “fragmentos Fab recombinantes”, conforme definido abaixo.
[0093] O termo “fragmento crosstab ou “fragmento xFab” ou “fragmento Fab crossover (cruzado) refere-se a um fragmento Fab em que as regiões variáveis e regiões constantes da cadeia pesada e leve estão trocadas. Duas composições de cadeia diferentes de uma molécula crosstab são
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47/331 possíveis e compreendidas nos anticorpos biespecíficos da invenção: Por um lado, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do Fab estão trocadas, ou seja, a molécula Fab crossover compreende uma cadeia peptídica composta da região variável de cadeia leve (VL) e a região constante de cadeia pesada (CH1), e uma cadeia peptídica composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e região constante de cadeia leve (CL). Esta molécula de Fab crossover recombinante também é referida como “CrossFab (vlvh)”. Por outro lado, quando as regiões constantes da cadeia pesada e leve do Fab são trocadas, a molécula de Fab crossover compreende uma cadeia peptídica constituída pela região variável de cadeia pesada (VH) e região constante de cadeia leve (CL), e uma cadeia peptídica constituída pela região variável de cadeia leve (VL) e região constante de cadeia pesada (CH1). Esta molécula de Fab crossover também é referida como “CrossFab (clchi)”.
[0094] Um “fragmento Fab de cadeia única” ou “scFab” é um polipeptídeo que consiste de um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante 1 de anticorpo (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante tem uma das seguintes ordens na direção N-terminal para Cterminal: a) VH-CH1-ligante-VL-CL, b) VL-CL-ligante-VH-CH1, c) VH-CLligante-VL-CH1 ou d) VL-CH1-ligante-VH-CL; e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de preferência entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos Fab de cadeia única são estabilizados pela ligação de bissulfeto natural entre o domínio CL e o domínio CH1. Além disso, estas moléculas Fab de cadeia única podem ser ainda mais estabilizadas pela geração de ligações de bissulfeto intercadeias por meio da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, na posição 44 da cadeia pesada variável e posição 100 da cadeia leve variável de acordo com a
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48/331 numeração de Kabat).
[0095] Um “fragmento Fab de cadeia única crossover” (ou cruzado) ou “x-scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante 1 de anticorpo (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante tem uma das seguintes ordens na direção N-terminal para C-terminal: a) VH-CL-ligante-VL-CH1 e b) VL-CH1ligante-VH-CL; em que o VH e VL formam em conjunto um sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos. Além disso, estas moléculas x-scFab podem ser ainda mais estabilizadas pela geração de ligações de bissulfeto intercadeias por meio da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, na posição 44 da cadeia pesada variável e posição 100 da cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).
[0096] Um “fragmento variável de cadeia única (scFv)” é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, ligados por um ligante peptídico curto de cerca de dez a 25 aminoácidos. O ligante é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como resíduos de serina ou treonina para solubilidade, e podem conectar a extremidade N-terminal do Vh, com a extremidade C-terminal do Vl, ou viceversa. Esta proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e a introdução do ligante. Os anticorpos scFv estão descritos, por exemplo, em Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96. Além disso, os fragmentos de anticorpos compreendem polipeptídeos de cadeia única possuindo as características de um domínio Vh, ou seja, que são capazes de montar juntamente com um domínio Vi_um sítio de ligação ao antígeno funcional, ou possuindo as características de um domínio
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Vl, ou seja, que são capazes de montar juntamente com um domínio Vh um sítio de ligação ao antígeno funcional, proporcionando desse modo a propriedade de ligação ao antígeno de um anticorpo de comprimento total.
[0097] As proteínas de ligação ao antígeno estruturais/andaime (scaffold) conhecidas no estado da técnica, por exemplo, a fibronectina, e proteínas de repetição de anquirina (DARPins) concebidas têm sido utilizadas como suportes alternativos para domínios de ligação ao antígeno, vide, por exemplo, Gebauer e Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13: 245-255 (2009) e Stumpp etal., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). Em um aspecto da invenção, uma proteína de ligação ao antígeno de andaime é selecionada a partir do grupo que consiste em CTLA-4 (Evibody), lipocalinas (Anticalin), molécula derivada da proteína A, tal como domínio Z da proteína A (Affibody), domínio-A (Avimer/Maxibody), transferrina sérica (trans-body); proteína de repetição de anquirina modificada (DARPin), domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada do anticorpo (anticorpo de domínio único, sdAb), domínio variável de cadeia pesada do anticorpo (nanocorpo, aVH), fragmentos Vnar, fibronectina (AdNectin), domínio lectina tipo C (tetranectina); domínio variável de um novo receptor do antígeno betalactamase (fragmentos Vnar), gama-cristalina ou ubiquitina humanas (moléculas Affilin); domínio tipo Kunitz de inibidores de proteases humanas, microcorpos, como proteínas da família knottin, aptâmeros peptídicos e fibronectina (adnectin). CTLA-4 (antígeno associado a linfócito T citotóxico 4) é um receptor da família CD28 expresso principalmente em células T CD4+. Seu domínio extracelular tem um domínio variável similar a IgG. As alças (loops) correspondentes às CDRs de anticorpos podem ser substituídas pela sequência heteróloga para conferir diferentes propriedades de ligação. As moléculas CTLA-4 modificadas para terem diferentes especificidades de
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50/331 ligação também são conhecidas como Evibodies (por exemplo, US7166697B1). Os Evibodies são aproximadamente do mesmo tamanho da região variável de um anticorpo isolada (por exemplo, um domínio de anticorpo). Para mais detalhes veja Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001). As lipocalinas são uma família de proteínas extracelulares que transportam pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como esteroides, bilinas, retinoides e lipídeos. Eles possuem estrutura em folha-beta rígida com um número de alças na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser manipulada para se ligar a diferentes antígenos-alvo. Anticalinas são de 160-180 aminoácidos de tamanho, e são derivadas de lipocalinas. Para mais detalhes veja Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 e US20070224633. Um affibody é um arcabouço (scaffold) derivado da proteína A de Staphylococcus aureus que pode ser manipulado para se ligar ao antígeno. O domínio consiste em um feixe tri-helicoidal de aproximadamente 58 aminoácidos. As bibliotecas foram geradas por randomização de resíduos de superfície. Para mais detalhes vide Protein Eng. Des. Sei. 2004 17, 455-462 e a publicação EP 1641818A1. Avimers são proteínas multidomínios derivadas da família de andaime domínioA. Os domínios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adotam uma estrutura de ligada por bissulfeto definida. A diversidade é gerada pelo embaralhamento da variação natural exibida pela família de domínios-A. Para mais detalhes veja Nature Biotechnology 23 (12), 1556-1561 (2005) e Expert Opinion on Investigational Drugs 16 (6), 909-917 (Junho de 2007). A transferrina é uma glicoproteína monomérica de transporte sérico. As transferrinas podem ser manipuladas para se ligarem a diferentes antígenos alvo pela inserção de sequências peptídicas em uma alça (loop) de superfície permissiva. Exemplos de andaimes de transferrina modificados incluem o Trans-body. Para mais detalhes vide J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999). As proteínas de repetição de anquirina (DARPins) desenvolvidas são derivadas
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51/331 da Anquirina que é uma família de proteínas que medeia a ligação de proteínas de membrana integral ao citoesqueleto. Uma única repetição anquirina é um motivo de 33 resíduos composto por duas alfa hélices e uma volta beta. Elas podem ser concebidas para se ligarem a diferentes antígenos-alvo pela randomização de resíduos na primeira alfa hélice e volta beta de cada repetição. A sua interface de ligação pode ser aumentada pelo aumento do número de módulos (um método de maturação de afinidade). Para mais detalhes veja J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) e J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) e US20040132028A1. Um anticorpo de domínio único é um fragmento de anticorpo consistindo em um único domínio de anticorpo variável monomérico. Os primeiros domínios únicos foram derivados do domínio variável da cadeia pesada de anticorpo a partir de camelídeos (nanocorpos (nanobodies) ou fragmentos VhH). Além disso, o termo anticorpo de domínio único inclui um domínio variável de cadeia pesada autônomo humano (aVH) ou fragmentos Vnar derivados de tubarões. A fibronectina é um andaime (scaffold) que pode ser manipulado para se ligar ao antígeno. Adnectinas consistem em uma cadeia principal com a sequência de aminoácidos natural do 10s domínio das 15 unidades de repetição da fibronectina humana tipo III (FN3). Três alças em uma extremidade do sanduíche β podem ser manipuladas para permitir uma Adnectina reconhecer especificamente um alvo terapêutico de interesse. Para mais detalhes veja Protein Eng. Des. Sei. 18, 435- 444 (2005), US20080139791, W02005056764 e US6818418B1. Aptâmeros peptídicos são moléculas de reconhecimento combinatórias que consistem em uma proteína andaime constante, tipicamente tioredoxina (TrxA) que contém uma alça variável peptídica restringida inserida no local ativo. Para mais detalhes veja Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005). Os microbodies (ou microcorpos) são derivados de microproteínas de ocorrência natural de 25-50 aminoácidos de comprimento contendo 3-4
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52/331 ligações de cisteína - exemplos de microproteínas incluem KalataBI e conotoxina e knottins. Os microproteínas possuem uma alça que pode ser modificada para incluir até 25 aminoácidos sem afetar o enovelamento global da microproteina. Para mais detalhes sobre domínios knottin modificados, vide WQ2008098796.
[0098] Uma “molécula de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo” como uma molécula de referência refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno que bloqueia em 50% ou mais a ligação da molécula de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e inversamente, a molécula de referência bloqueia a ligação da molécula de ligação ao antígeno ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.
[0099] O termo “domínio de ligação ao antígeno” ou “sítio de ligação ao antígeno” refere-se à parte de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga especificamente e é complementar a parte ou a todo o antígeno. Quando um antígeno é grande, uma molécula de ligação ao antígeno pode se ligar apenas a uma porção específica do antígeno, cuja porção é denominada de epítopo. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis (também denominados de regiões variáveis). Preferencialmente, um domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável da cadeia pesada de anticorpo (VH).
[00100] Conforme utilizado no presente, o termo “determinante antigênico” é sinônimo de “antígeno” e “epítopo”, e refere-se a um local (por exemplo, um trecho contíguo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídica ao qual se liga uma porção de ligação ao antígeno, formando um complexo “molécula de ligação ao antígeno-antígeno”. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados,
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53/331 por exemplo, sobre as superfícies de células tumorais, sobre as superfícies de células infectadas por vírus, sobre as superfícies de outras células doentes, sobre as superfícies de células do sistema imunológico, livres no soro sanguíneo, e/ou na matriz extracelular (ECM). O termo “proteínas úteis como antígenos” utilizado na presente invenção pode ser qualquer forma nativa de proteína a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tal como os primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo quando indicado de outra forma. Em um exemplo de realização específico, o antígeno é uma proteína humana. Sempre que se faça referência a uma proteína específica na presente invenção, o termo abrange a referida proteína “completa” ou “de comprimento total”, não processada, bem como qualquer forma da proteína resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes que ocorrem naturalmente da proteína, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas.
[00101] O termo “se liga especificamente” ou “ligação específica” significa que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada a partir de interações não desejadas ou não específicas. A capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno se ligar a um antígeno específico pode ser mensurada por meio de um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) ou por outras técnicas familiares para um técnico hábil no assunto, por exemplo, a técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glico J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em um exemplo de realização, o grau de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno, conforme mensurado, por exemplo, por SPR. Em determinados exemplos de
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54/331 realização, uma molécula que se liga ao antígeno tem uma constante de dissociação (Kd) 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10’8 M ou menos, por exemplo, de 10’8 a 10’13, por exemplo, de 10’9 a 10’13 M).
[00102] “Afinidade” ou “afinidade de ligação” refere-se, em geral, à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd), que é a relação entre a velocidade de dissociação e de associação (kOff e kon, respectivamente). Deste modo, as afinidades equivalentes podem compreender diferentes constantes de velocidade, desde que a razão entre as constantes de velocidade continue a ser a mesma. A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Um método particular para mensurar a afinidade é a ressonância plasmônica de superfície (SPR).
[00103] Um anticorpo “maturado por afinidade” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), em comparação com um anticorpo parental que não possui tais alterações, e estas modificações resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo ao antígeno.
[00104] Um “antígeno da célula alvo”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a um determinante antigênico apresentado sobre a superfície de uma célula-alvo, por exemplo, uma célula tumoral, tal como uma célula cancerosa ou célula do estroma do tumor. Em determinados exemplos
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55/331 de realização, o antígeno da célula alvo é um antígeno na superfície de uma célula tumoral. Em um exemplo de realização, o antígeno da célula alvo é selecionado a partir do grupo consistindo de Proteína Ativadora de Fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionário (CEA), sulfato de condroitina proteoglicano associado ao melanoma (MCSP), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), CD19, CD20 e CD33. Em particular, o antígeno da célula alvo é Proteína Ativadora de Fibroblastos (FAP).
[00105] O termo “Proteína Ativadora de Fibroblastos”, também conhecida como Prolil endopeptidase FAP ou Seprase (EC 3.4.21), refere-se a qualquer FAP nativa a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange FAPs não processadas “de comprimento total”, bem como qualquer forma de FAP que resulte da transformação na célula. O termo também abrange formas variantes de FAP que ocorrem naturalmente, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é capaz de se ligar especificamente à FAP humana, de camundongo e/ou de cinomolgos. A sequência de aminoácidos da FAP humana é exibida na UniProt (www.uniprot.org) sob o ns de acesso Q12884 (versão 149, SEQ ID NO: 95), ou no NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq.: NP_004451.2. O domínio extracelular (ECD) da FAP humana se estende desde a posição de aminoácido 26 até a posição 760. A sequência de aminoácidos de um ECD de FAP humana marcado com His (His tagged) é exibida na SEQ ID NO: 96. A sequência de aminoácidos da FAP de camundongo é exibida na UniProt sob o número de acesso P97321 (versão 126, SEQ ID NO: 97), ou no NCBI com a RefSeq NP_032012.1. O domínio extracelular (ECD) da FAP de camundongo
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56/331 se estende desde a posição de aminoácido 26 até a posição 761. A SEQ ID NO: 98 exibe a sequência de aminoácidos de um ECD de FAP de camundongo marcado com His (His tagged). A SEQ ID NO: 99 exibe a sequência de aminoácidos de um ECD de FAP de cinomolgo marcado com His. Preferencialmente, uma molécula de ligação à FAP da invenção se liga ao domínio extracelular da FAP.
[00106] O termo “antígeno carcinoembrionário” (CEA), também conhecido como molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 5 (CEACAM5), refere-se a qualquer CEA nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CEA humano é exibida na UniProt sob o número de acesso P06731 (versão 151, SEQ ID NO: 100). O CEA foi identificado como um antígeno associado ao tumor (Gold e Freedman, J. Exp. Med., 121:439-462, 1965;. Berinstein N.L., J Clin Oncol, 20:2197-2207, 2002). Originalmente classificado como uma proteína expressa apenas no tecido fetal, o CEA já foi identificado em diversos tecidos de adultos normais. Estes tecidos são principalmente de origem epitelial, incluindo as células do trato gastrointestinal, respiratório e urogential e células do cólon, colo uterino, glândulas sudoríparas, e próstata (Nap et al, Tumor Biol, 9 (2-
3):145 -53, 1988; Nap et al, Cancer Res., 52 (8):2329-23339, 1992). Os tumores de origem epitelial, bem como as suas metástases, contêm CEA como um antígeno associado ao tumor. Embora a presença do próprio CEA não indique a transformação em uma célula cancerosa, a distribuição do CEA é indicativa. No tecido normal, o CEA é geralmente expresso na superfície apical da célula (Hammarstrõm S., Semin. Cancer Biol. 9 (2):67-81 (1999)), tornandoo inacessível a anticorpos na corrente sanguínea. Em contraste com o tecido
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57/331 normal, o CEA tende a ser expresso ao longo de toda a superfície das células cancerosas (Hammarstrõm S., Semin. Cancer Biol. 9 (2):67-81 (1999)). Essa alteração de padrão de expressão torna o CEA acessível à ligação de anticorpos nas células cancerosas. Além disso, o CEA tem expressão aumentada em células cancerosas. Adicionalmente, o aumento da expressão do CEA promove o aumento da adesão intercelular, que pode levar à metástase (Marshall, J., Semin. Oncol., 30 (Supl. 8) :30-6, 2003). A prevalência de expressão do CEA em diversas entidades tumorais é geralmente bastante elevada. Em concordância com os dados publicados, análises próprias realizadas em amostras de tecido confirmaram a sua prevalência elevada, com cerca de 95% no carcinoma colorretal (CRC), 90% em câncer pancreático, 80% em câncer gástrico, 60% em câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC, onde é coexpresso com HER3), e 40% em câncer da mama; a baixa expressão foi encontrada em câncer de pulmão de pequenas células e glioblastoma.
[00107] O CEA é rapidamente clivado a partir da superfície celular e é liberado na corrente sanguínea a partir dos tumores, diretamente ou através dos vasos linfáticos. Devido a esta propriedade, o nível sérico de CEA tem sido usado como um marcador clínico para o diagnóstico do câncer e triagem da recorrência do câncer, particularmente do câncer colorretal (Goldenberg M. D., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006).
[00108] O termo “proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma (MCSP)”, também conhecido como proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4), refere-se a qualquer MCSP nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos
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58/331 cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do MCSP humano é exibida na UniProt sob o número de acesso Q6UVK1 (versão 103, SEQ ID NO: 101). O termo “receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)”, também denominado de proto-oncogene c-ErbB-1 ou receptor tirosina quinase ErbB-1, refere-se a qualquer EGFR nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do EGFR humano é exibida na UniProt sob o número de acesso P00533 (versão 211, SEQ ID NO: 102). O termo “CD19” refere-se ao antígeno CD19 de linfócitos B, também conhecido como antígeno B4 da superfície de linfócitos B ou antígeno Leu-12 da superfície de linfócitos T e inclui a qualquer CD19 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CD19 humano é exibida na UniProt sob o número de acesso P15391 (versão 160, SEQ ID NO: 103). O termo “CD20” refere-se ao antígeno CD20 de linfócitos B, também conhecido como membro 1 da subfamília A de 4 domínios transmembrana (MS4A1), antígeno B1 da superfície de linfócitos B ou antígeno Leu-16 da superfície de leucócitos e inclui a qualquer CD20 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CD20 humano é exibida na UniProt sob o número de acesso P11836 (versão 149, SEQ ID NO: 104). “CD33” refere-se a qualquer antígeno CD33 da superfície de células
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59/331 mieloides, também conhecido como SIGLC3 ou gp67, e inclui qualquer CD33 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CD33 humano é exibida na UniProt sob o número de acesso P20138 (versão 157, SEQ ID NO: 105).
[00109] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões conservadas denominadas regiões estruturais ou arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman & Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.
[00110] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que é hipervariável na sequência e/ou forma alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). Geralmente, os anticorpos nativos de quatro cadeias compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). As HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo esta última de maior variabilidade de sequência e/ou estando envolvida no reconhecimento do antígeno. Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3). (Chothia e Lesk, J. Mo/, β/ο/. 196:901 -917
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60/331 (1987)) As CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de L1,50-56 de L2, 8997 de L3, 31-35B de H1,50-65 de H2 e 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). As regiões hipervariáveis (HVRs) também são referidas como “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), e estes termos são utilizados na presente invenção de modo alternado, e se referem às porções da região variável que formam as regiões de ligação ao antígeno. Esta região foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest’ (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), de modo que as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados entre si. No entanto, pretende-se que o uso de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou as formas variantes do mesmo esteja dentro do escopo do termo conforme definido e usado no presente. Os resíduos de aminoácidos adequados que compreendem as CDR tal como definido por cada uma das referências citadas acima são apresentados abaixo na Tabela A como uma comparação. O número exato de resíduos que abrangem uma CDR em particular irá variar dependendo do tamanho da sequência e da CDR. Os técnicos hábeis no assunto podem determinar quais os resíduos que rotineiramente compreendem uma CDR em particular, dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.
Tabela A
Definições de CDR1
CDR Kabat Chothia AbM2
VhCDRI 31-35 26-32 26-35
Vh CDR2 50-65 52-58 50-58
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Vh CDR3 95-102 95-102 95-102
VlCDRI 24-34 26-32 24-34
VlCDR2 50-56 50-52 50-56
VlCDR3 89-97 91-96 89-97
1 A numeração de todas as definições CDR da Tabela A é de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (vide abaixo) 2 “AbM”, com uma minúscula “b”, usada na Tabela A refere-se as CDRs conforme definido pelo software de design de anticorpos Oxford Molecular's “AbM.
[00111] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as sequências da região variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um técnico no assunto pode atribuir inequivocamente o sistema de “numeração de Kabat” para qualquer sequência da região variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Tal como utilizado no presente, a expressão “numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest’ (1983). Salvo quando indicado de outra forma, referências feitas à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicas em uma região variável de anticorpo estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[00112] Com exceção da CDR1 no VH, as CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. As CDRs também compreendem “resíduos determinantes da especificidade”, ou “SDRs”, que são os resíduos que fazem contato com o antígeno. As SDRs estão contidas dentro de regiões das CDRs denominadas de CDRsabreviadas, ou “a-CDRs”. As a-CDRs exemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, aCDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de
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62/331 aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 e 95-102 de H3. (Vide Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)). Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat etal., Supra.
[00113] “Região de arcabouço” ou “região estrutural” ou “FR” (de framework) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR) A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.
[00114] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma determinada fonte ou espécie, enquanto que o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[00115] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, lgG2, IgGa, lgG4, IgAi e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de α, δ, ε, γ e μ respectivamente.
[00116] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem
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63/331 aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados” abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou alterada a partir do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou ligação ao receptor Fc (FcR).
[00117] Um anticorpo “humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno.
[00118] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de anticorpo contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Uma região Fc de IgG compreende um domínio CH2 da IgG e um CH3 da IgG. O “domínio Ch2” de uma região Fc de IgG humana normalmente se estende a partir de um resíduo de aminoácido que está aproximadamente na posição 231 até um resíduo do aminoácido que está aproximadamente na posição 340. Em um exemplo de realização, uma cadeia de carboidrato está anexada ao domínio
CH2. O domínio Ch2 na presente invenção pode ser um domínio Ch2 de sequência nativa ou domínio Ch2 variante. O “domínio Ch3” compreende o
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64/331 alongamento dos resíduos C-terminais até um domínio Ch2 em uma região Fc (ou seja, a partir de um resíduo de aminoácido na posição 341 até cerca de um resíduo de aminoácido na posição 447 de uma IgG). A região Ch3 pode ser uma sequência nativa do domínio Ch3 ou um domínio Ch3 variante (por exemplo, um domínio Ch3 com uma “protuberância” (“knob) introduzida em uma cadeia deste e uma “cavidade” (“hole) correspondente introduzida na outra cadeia do mesmo; vide a Patente US 5.821.333, incorporada ao presente pela referência). Tais domínios CH3 variantes podem ser utilizados para promover a heterodimerização de duas cadeias pesadas de anticorpo não idênticas, tal como descrito na presente invenção. Em um exemplo de realização, uma região Fc de cadeia pesada da IgG humana estende-se desde da Cis226, ou desde a Pro230, até a extremidade carboxi-terminal da cadeia pesada. Entretanto, a lisina C-terminal (Lis447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[00119] A tecnologia “knob-into-hole” (protuberância-emcavidades) está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 7.695.936; e em Ridgway et ai, Prot Eng. 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente (“hole) na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por
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65/331 aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina). A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítioespecífica, ou por síntese peptídica. Um exemplo de realização específico de uma modificação knob compreende a substituição de aminoácidos T366W em uma das duas subunidades do domínio Fc, e a modificação hole compreende as substituições de aminoácidos T366S, L368A e Y407V na outra dentre as duas subunidades do domínio Fc. Em outro exemplo de realização específico, a subunidade do domínio Fc compreendendo a modificação knob compreende adicionalmente a substituição de aminoácido S354C, e a subunidade do domínio Fc compreendendo a modificação hole compreende adicionalmente a substituição de aminoácidos Y349C. A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte de bissulfeto entre as duas subunidades da região Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
[00120] Uma “região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina” significa pretende incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina, bem como variantes com alterações que produzem substituições, adições ou deleções, mas que não diminuem substancialmente a capacidade da imunoglobulina de mediar funções efetoras (tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser excluídos da extremidade Nterminal ou C-terminal da região Fc de uma imunoglobulina sem haver perda significativa da função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas de
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66/331 acordo com regras gerais conhecidas no estado da técnica, de modo a ter um efeito mínimo sobre a atividade (vide, por exemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247, 1306-1310 (1990)).
[00121] O termo “funções efetoras” refere-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP); secreção de citocina; captação de antígeno mediada pelo complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de célula B.
[00122] As funções efetoras dependentes de ligação ao receptor Fc podem ser mediadas pela interação da região Fc de um anticorpo com receptores Fc (FcRs), que são receptores de superfície celular especializados em células hematopoiéticas. Receptores Fc pertencem à superfamília de imunoglobulinas, e foi demonstrado que eles medeiam tanto a remoção de patógenos revestidos de anticorpo por fagocitose de complexos imunes, como a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) revestidos com o anticorpo correspondente, através de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (consulte, por exemplo, Van de Winkel, J.G. e Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Os FcRs são definidos por suas especificidades para isotipos de imunoglobulinas: Receptores Fc para anticorpos IgG são citados como FcyR. Os FcRs estão descritos, por exemplo, em Ravetch, J.V. e Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., etal., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; e Gessner, J.E., etal., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.
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67/331 [00123] A recombinação pro reticulação (cross-linking) de receptores para a região Fc de anticorpos IgG (FcyR) desencadeia uma grande variedade de funções efetoras incluindo fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo e liberação de mediadores inflamatórios, bem como a liberação do complexo imune e a regulação da produção de anticorpos. Em humanos, foram caracterizadas três classes de FcyR, que são:
- FcyRI (CD64) se liga a IgG monomérica com alta afinidade e é expressa em macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. A modificação na região Fc de IgG em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327 e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) reduz ligação ao FcyRI. Os resíduos de lgG2 nas posições 233 a 236, substituídos na lgG1 e lgG4, reduzem ligação ao FcyRI em 103 vezes e eliminam a resposta de monócitos humanos aos eritrócitos sensibilizados por anticorpo (Armor, K.L., et ai., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624);
- FcyRII (CD32) se liga a IgG complexada com meio em baixa afinidade e é amplamente expresso. Este receptor pode ser dividido em dois subtipos, FcyRIIA e FcyRIIB. O FcyRIIA é encontrado em muitas células envolvidas na morte (por exemplo, macrófagos, monócitos, neutrófilos) e parece ser capaz de ativar o processo de morte. O FcyRIIB parece desempenhar um papel importante em processos inibitórios e é encontrado em células B, macrófagos e mastócitos e eosinófilos. Em células B ele parece funcionar para suprimir adicionalmente a produção de imunoglobulinas e a alteração de isotipo, por exemplo, para classe IgE. Em macrófagos, o FcyRIIB age inibindo a fagocitose quando mediado por FcyRIIA.
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Em eosinófilos e mastócitos, a forma B pode auxiliar a suprimir a ativação dessas células através de ligação de IgE ao seu receptor separado. A ligação reduzida ao FcyRIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreendem uma região Fc de IgG com mutações em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 e K414 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e
- FcyRIII (CD16) se liga a IgG com afinidade média a baixa e existe como dois tipos. O FcyRIIIA é encontrado em células NK, macrófagos, eosinófilos e alguns monócitos e células T e medeia a ADCC. O FcyRIIIB é altamente expresso em neutrófilos. A ligação reduzida ao FcyRIIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreendem uma região Fc de IgG com mutações em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 e D376 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0100] O mapeamento dos sítios de ligação na lgG1 humana para receptores Fc, os sítios de mutação mencionados acima e os métodos para medição da ligação ao FcyRI e FcyRIIA estão descritos em Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
[0101] O termo “ADCC” ou “citotoxicidade celular dependente de anticorpo” é uma função mediada por ligação ao receptor Fc e refere-se à lise de células alvo por um anticorpo, conforme relatado na presente invenção na presença de células efetoras. A capacidade do anticorpo em induzir as etapas iniciais que medeiam a ADCC é investigada medindo sua ligação às células que expressam receptores Fcy, como células que expressam FcyRI e/ou
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FcyRI ΙΑ de forma recombinante ou células NK (que expressam essencialmente FcyRIIIA). Em particular, é medida a ligação ao FcyR em células NK.
[0102] Um “receptor Fc de ativação” é um receptor Fc que, após o acoplamento por uma região Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam as células que carregam o receptor a executarem funções efetoras. Receptores Fc de ativação incluem FcyRllla (CD16a), FcyRI (CD64), FcyRlla (CD32), e FcaRI (CD89). Um receptor Fc de ativação particular é o FcyRIHa humano (vide o n° de acesso UniProt: P08637, versão 141).
[0103] A “superfamília dos receptores do fator de necrose tumoral” ou “superfamília dos receptores de TNF” atualmente consiste de 27 receptores. É um grupo de receptores de citocinas caracterizado pela capacidade de se ligar aos fatores de necrose tumoral (TNFs) através de um domínio rico em cisteína extracelular (CRD). Estas pseudorrepetições são definidas por bissulfetos intracadeia gerados por resíduos de cisteína altamente conservados dentro das cadeias de receptores. Com exceção do fator de crescimento neural (NGF), todos os TNFs são homólogos ao arquétipo TNF-alfa. Na sua forma ativa, a maioria dos receptores de TNF forma complexos triméricos na membrama plasmática. Consequentemente, a maioria dos receptores de TNF contém domínios transmembrana (TMDs). Diversos destes receptores também contêm domínios de morte intracelular (DDs) que recrutam proteínas de interação com a caspase após ligação de ligante para iniciar a via extrínseca de ativação da caspase. Outros receptores da superfamília de TNF que são desprovidos de domínios que se ligam a fatores associados ao receptor de TNF e ativam as vias de sinalização intracelular que podem levar à proliferação ou diferenciação. Esses receptores também podem iniciar a apoptose, mas o fazem através de mecanismos indiretos. Além da regulação da apoptose, diversos receptores da superfamília de TNF estão envolvidos na regulação de
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70/331 funções de células imunes, como homeostase e ativação de células B, ativação de células assassinas naturais (natural killed θ coestimulação de células T. Vários outros regulam as respostas específicas de tipos celulares como o desenvolvimento do folículo piloso e desenvolvimento de osteoclastos. Os membros da superfamília do receptor de TNF incluem os seguintes: Receptor 1 do fator de necrose tumoral (1A) (TNFRSF1A, CD120a), receptor 2 do fator de necrose tumoral (1B) (TNFRSF1B, CD120b), receptor de linfotoxina beta (LTBR, CD18), 0X40 (TNFRSF4, CD134), CD40 (Bp50), receptor Fas (Apo- 1, CD95, FAS), receptor Decoy 3 (TR6, M68, TNFRSF6B), CD27 (S152, Tp55), CD30 (Ki-1, TNFRSF8), 4-1 BB (CD137, TNFRSF9), DR4 (TRAILR1, Apo-2, CD261, TNFRSF10A), DR5 (TRAILR2, CD262, TNFRSF10B), Receptor Decoy 1 (TRAILR3, CD263, TNFRSF10C), Receptor Decoy 2 (TRAILR4, CD264, TNFRSF10D), RANK (CD265, TNFRSF11A), Osteoprotegerina (OCIF, TR1, TNFRSF11B), receptor TWEAK (Fn14, CD266, TNFRSF12A), TACI (CD267, TNFRSF13B), receptor BAFF (CD268, TNFRSF13C), mediador de entrada de Herpesvirus (HVEM, TR2, CD270, TNFRSF14), fator de crescimento neural (p75NTR, CD271, NGFR), antígeno de maturação de células B (CD269, TNFRSF17), TNFR-relacionado induzido por glicocorticoide (GITR, AITR, CD357, TNFRSF18), TROY (TNFRSF19), DR6 (CD358, TNFRSF21), DR3 (Apo- 3, TRAMP, WS-1, TNFRSF25) e receptor de ectodisplasina A2 (XEDAR, EDA2R).
[0104] Vários membros da família do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) funcionam após a ativação das células T para sustentar respostas de células T. O termo “membro da família de ligante de TNF coestimulador” ou “ligante da família TNF coestimulador” refere-se a um subporção de membros da família de ligantes do TNF que são capazes de coestimular a proliferação e produção de citocinas em células T. O termo refere-se a qualquer receptor da família do TNF nativo a partir de qualquer
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71/331 fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. Em exemplos de realização específicos da invenção, os membros da superfamília do receptor de TNF coestimuladores são selecionados a partir do grupo que consiste em 0X40 (CD134), 4-1 BB (CD137), CD27, HVEM (CD270), CD30, e GITR, que podem ter efeitos coestimulatórios em células T. Em um aspecto mais específico, o membro da família de receptor de TNF coestimulador é 4-1BBL.
[0105]0 termo “4-1 BB”, como utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer 4-1 BB nativo a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo quando indicado de outra forma. O termo engloba 4-1 BB não processado “inteiro”, “de comprimento total” ou “completo”, bem como qualquer forma de 4-1 BB que resulta do processamento na célula. O termo também abrange 4-1 BB variantes que ocorrem naturalmente, por exemplo, as formas variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um 4-1 BB humano exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 106 (número de acesso Uniprot Q07011), a sequência de aminoácidos de um 4-1 BB murino exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 107 (número de acesso Uniprot P20334) e a sequência de aminoácidos de um 4- 1 BB de cinomolgo (de Macaca mulatta) exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 108 (número de acesso Uniprot F6W5G6).
[0106] Os termos “anticorpo anti-4-1BB”, “anti-4-1 BB”, “anticorpo 4-1 BB” e “um anticorpo que se liga especificamente ao 4-1 BB” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a 4-1 BB com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento ao 4-1 BB. Em uma realização, o grau de ligação de um
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72/331 anticorpo anti-4-1 BB a uma proteína não 4-1 BB não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo a 4-1 BB conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA) ou citometria de fluxo (FACS). Em determinados realizações, um anticorpo que se liga a 4-1 BB tem uma constante de dissociação (Kd) < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10’6 M ou menos, por exemplo, de 10’68 M a IO’13 M, por exemplo, de 10’8 M a 10’1° M). Em particular, o anticorpo anti4-1 BB é o clone 20H4.9 como divulgado na Patente US 7.288.638.
[0107] O termo “ligante peptídico” refere-se a um peptídeo que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2 a 20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos no estado da técnica ou estão descritos na presente invenção. Os ligantes peptídicos não imunogênicos adequados incluem, por exemplo, os ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n, ou G4(SG4)n, em que “n” é geralmente um número entre 1 e 10, e tipicamente entre 2 e 4, e particularmente 2; ou seja, os peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em GGGGS (SEQ ID NO: 109) GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:110), SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:111) e GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:112), mas também inclui as sequências GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:113), (G4S)3 (SEQ ID NO:114), (G4S)4 (SEQ ID NO:115), GSGSGSGS (SEQ ID NO:116), GSGSGNGS (SEQ ID NO:117), GGSGSGSG (SEQ ID NO:118), GGSGSG (SEQ ID NO:119), GGSG (SEQ ID NQ:120), GGSGNGSG (SEQ ID NO:121), GGNGSGSG (SEQ ID NO:122) e GGNGSG (SEQ ID NO:123). Os ligantes peptídicos de particular interesse são (G4S) (SEQ ID NQ:109), (G4S)2 ou GGGGSGGGGS (SEQ ID NQ:110), (G4S)3 (SEQ ID NO:114) e (G4S)4 (SEQ ID NO:115).
[0108] O termo “aminoácido” conforme utilizando neste pedido indica o grupo de α-aminoácidos carboxi de ocorrência natural compreendendo alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), arginina (arg, R),
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73/331 asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (Cis, C), glutamina (gin, Q), ácido glutâmico (Glu, E), glicina (Gli, G), histidina (his, H), isoleucina (He, I), leucina (leu, L), lisina (Lis, K), metionina (met, M), fenilalanina (fen ou phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (tre ou thr, T ), triptofano (trp, W), tirosina (tir, Y) e valina (vai, V).
[0109] “Fundido” ou “conectado” significa que os componentes (por exemplo, uma cadeia pesada de um anticorpo e um fragmento Fab) estão ligados por meio de ligações peptídicas, seja diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.
[0110] O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica (proteína) é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, SAWI ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 é de autoria da Genentech, Inc., e o código fonte foram
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74/331 depositados com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais: TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinado sequência de aminoácido A que contenha uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculado da seguinte forma:
100 vezes a fração X/Y em que, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento A e B do programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Será compreendido que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não é igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos, tal como descrito no parágrafo anterior, pelo uso do programa ALIGN-2.
[0111] Em determinados exemplos, são contempladas sequências de aminoácidos variantes das moléculas de ligação ao antígeno contendo o trímero ligante de TNF fornecidas na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável
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75/331 melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas das moléculas de ligação ao antígeno contendo o trímero ligante de TNF. As sequências de aminoácidos variantes das moléculas de ligação ao antígeno contendo o trímero ligante de TNF podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica as moléculas ou pela síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno. Os sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e arcabouços (frameworks - FRs). As substituições conservadoras são apresentadas na Tabela B sob o título “substituições preferidas” e adicionalmente descritas adiante em referência a classes de aminoácidos de cadeia lateral (1) a (6). As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas na molécula de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, uma ligação ao antígeno melhorada/mantida, diminuição da imunogenicidade, ou ADCC ou CDC melhorada.
Tabela B
Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas
Ala (A) Vai; Leu; lie Vai
Arg (R) Lis; Gin; Asn Lis
Asn (N) Gin; His; Asp, Lis; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cis (C) Ser; Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gli (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lis; Arg Arg
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Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas
He O Leu; Vai; Met; Ala; Fen; Norleucina Leu
Leu (L) Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Fen lie
Lis (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Fen; lie Leu
Fen (F) Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tir Tir
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Tre Tre
Tre (T) Vai; Ser Ser
Trp (W) Tir; Fen Tir
Tir (1) Trp; Fen; Tre; Ser Fen
Vai (V) lie; Leu; Met; Fen; Ala; Norleucina Leu
[0112] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, He;
(2) hidrofílico neutro: Cis, Ser, Tre, Asn, Gin;
(3) ácido: Asp, Glu (4) básico: His, Lis, Arg;
(5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gli, Pro;
(6) aromático: Trp, Tir, Fen.
[0113] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0114] O termo “sequências de aminoácidos variantes” inclui variantes substanciais em que há substituições de aminoácidos em um ou mais resíduos da região hipervariável de uma molécula de ligação ao antígeno original (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para um estudo mais aprofundado
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77/331 terá(ão) modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, aumento da afinidade, imunogenicidade reduzida) em relação à molécula de ligação ao antígeno parental e/ou terá(ão) certas propriedades biológicas da molécula de ligação ao antígeno parental substancialmente retidas. Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo de afinidade maturada que pode ser facilmente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação de afinidade baseadas na exibição por fagos, tal como aquelas descritas no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos da HVR está mutado e as moléculas de ligação ao antígeno variantes são apresentadas no fago e rastreadas por uma atividade biológica específica (por exemplo, a afinidade de ligação). Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade das moléculas de ligação ao antígeno se ligarem ao antígeno. Por exemplo, podem ser feitas alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme previsto na presente invenção) nas HVRs que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação. Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionados para mutagênese é denominado de “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells, (1989) Science, 244: 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvos (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lis e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser analisada uma estrutura cristalina de um complexo ‘molécula de ligação ao
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78/331 antígeno - antígeno’ para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser selecionados ou eliminados como candidatos a substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[0115] As inserções de sequências de aminoácidos incluem: fusões carbóxi- e/ou amino-terminais que variam de comprimento desde um resíduo, até polipeptídeos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula incluem a fusão do N- ou C-terminal a um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas.
[0116] Em determinados exemplos de realização, a moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidas na presente invenção são alteradas para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado. As formas variantes de glicosilação das moléculas podem ser convenientemente obtidas pela alteração da sequência de aminoácidos de modo que um ou mais sítios de glicosilação são criados ou removidos. Quando a molécula de ligação ao antígeno contendo o trímero ligante de TNF compreende uma região Fc, o carboidrato ligado aos mesmos pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, bianternário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, Nacetilglicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário.
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Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em uma molécula de ligação ao antígeno contendo o trímero ligante da família TNF podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas. Em um aspecto, são fornecidos variantes de moléculas de ligação ao antígeno ou anticorpos biespecíficos possuindo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexa (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Essas variantes de fucosilação podem ter a função ADCC melhorada; vide, por exemplo, as Publicações de Patentes US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Em outro aspecto, variantes das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ou anticorpos da invenção são fornecidas com oligossacarídeos bifurcados ou birramificado, por exemplo, em que um oligossacarídeos biantenário fixado à região Fc é bifurcado por GlcNAc. Tais variantes podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, o documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al); a Patente US 6.602.684 (Umana et al), e US 2005/0123546 (Umana etal.). Também são fornecidas formas variantes com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpos que podem ter função CDC melhorada estão descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al.); documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0117] Em certos aspectos, pode ser desejável criar variantes geneticamente modificadas com cisteína das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, por exemplo, “thioMAbs, em que um ou mais resíduos de molécula são substituídos por resíduos de cisteína. Em aspectos específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis da molécula. Pela substituição de tais resíduos com cisteína, os grupos tióis reativos são assim posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de drogas
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80/331 ou moléculas ligantes de drogas, para criar um imunoconjugado. Em determinadas aspectos, um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada e S400 (numeração EU) da cadeia pesada da região Fc. As moléculas de ligação ao antígeno modificadas com cisteína podem ser geradas conforme descrito, por exemplo, na Patente US 7.521.541.
[0118] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula isolada de ácido nucleico ou a construção, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus, ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrado nos ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, DNA ou fragmentos de RNA, presente em um polinucleotídeo.
[0119] Pelo termo “isolado” na expressão “molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo isolado” entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui um polinucleotídeo contido em células que normalmente expressam o polinucleotídeo, mas o polinucleotídeo está presente extracromossomalmente ou em um local cromossômico que é diferente de sua localização cromossômica natural. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, bem como formas de fita positiva e negativa, e as formas de dupla fita. Polinucleotídeos ou
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81/331 ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda estas moléculas produzidas de maneira sintética. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico que pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo, ou de terminador da transcrição.
[0120] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretendese dizer que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações pontuais para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos de até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5’ ou 3’ terminal da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Como uma questão prática, se qualquer sequência polinucleotídica particular, é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos da presente invenção, isto pode ser determinado convencionalmente pelo uso de programas de computador conhecidos, tal como os discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).
[0121] O termo “cassete de expressão” refere-se a um
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82/331 polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos especificados de ácido nucleico que permite a transcrição de um ácido nucleico específico em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Normalmente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em determinados exemplos de realização, o cassete de expressão da presente invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.
[0122] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônimo de “construção de expressão” e refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e direcionar a expressão de um gene específico ao qual está operacionalmente ligada em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula-alvo, a molécula de ácido ribonucleico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e/ou maquinário de tradução. Em um exemplo de realização, o vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.
[0123] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira
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83/331 alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizada para gerar as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção. As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, tais como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongos P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura , células de inseto e células vegetais, para citar apenas algumas, como também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.
[0124] Uma “quantidade eficaz” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para provocar uma alteração do estado fisiológico da célula ou do tecido ao qual é administrado.
[0125] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, atrasa, minimiza ou evita os efeitos adversos de uma doença.
[0126] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas,
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84/331 ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.
[0127] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação deveria ser administrada.
[0128] Um “excipiente farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um excipiente farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, estabilizante ou conservante.
[0129] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.
[0130] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença, e remissão
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85/331 ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, as moléculas da presente invenção são usadas para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou para retardar a progressão de uma doença.
[0131] O termo câncer conforme utilizado no presente refere-se a doenças proliferativas, tais como linfomas, leucemias linfocítica, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioalveolar, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma de colo do útero, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer das vias biliares, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisário e sarcoma de Ewing, incluindo as versões refratárias de qualquer um dos cânceres descritos acima, ou uma combinação de um ou mais cânceres descritos acima.
Anticorpos Biespecíficos Da Invenção [0132] A invenção provê novas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas com propriedades particularmente vantajosas, tais como produtibilidade, estabilidade, afinidade de ligação e atividade biológica, eficiência de direcionamento e toxicidade reduzida.
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Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Exemplares [0133] Em um aspecto, a invenção provê moléculas de ligação ao antígeno biespecífica, que compreendem;
(a) pelo menos quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB;
(b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade, capazes de associação estável;
em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0134] Em um aspecto particular, estas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são caracterizadas por ligação agonista direcionada ao 4-1 BB. Em particular, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um agonista de 4-1 BB que é direcionado contra um antígeno da célula alvo associada a tumor.
[0135] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula de ligação de antígeno biespecífica, compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, em que o referido domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia
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87/331 pesada (Vh4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0136] Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0137] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, conforme definido anteriormente na presente invenção. Em particular, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB conforme definido anteriormente na presente invenção. Em outro aspecto específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar especificamente ao 41 BB, conforme definido anteriormente na presente invenção.
[0138] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção são adicionalmente caracterizadas por compreenderem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas possuem assim a vantagem em relação aos anticorpos convencionais capazes de ligação específica ao 4-1 BB, que induzem seletivamente uma resposta de células T coestimuladoras nas células alvo, que são tipicamente células de
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88/331 câncer. Em um aspecto, o antígeno da célula alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma (MCSP), Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), Antígeno Carcinoembrionário (CEA), CD19, CD20 e CD33. Particularmente, o antígeno da célula alvo é selecionado a partir da Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), Antígeno Carcinoembrionário (CEA) e CD19. Em um aspecto particular, o antígeno da célula alvo é selecionado a partir da Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), Antígeno Carcinoembrionário (CEA). Em outro aspecto particular, o antígeno da célula-alvo é CD19.
Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Em Que o Antígeno da Célula Alvo é FAP [0139] Em um aspecto particular, o antígeno da célula alvo é a Proteína Ativadora de Fibroblastos (FAP). As porções de ligação à FAP foram descritas no documento WO 2012/020006, que está integralmente incluído ao presente pela referência. As porções de ligação de FAP de interesse particular são descritas abaixo.
[0140] Em um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica na qual o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à proteína de ativação de fibroblastos (FAP) compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a
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89/331 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
[0141] Em particular, é proporcionada uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
[0142] Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a
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90/331 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
[0143] De modo específico, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à proteína de ativação de fibroblastos (FAP) compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
[0144] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica à FAP compreende uma região variável de
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91/331 cadeia pesada Vh compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada Vh compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Que Se Ligam Ao 4-1 BB E
ÀFAP [0145] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
[0146] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de
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92/331 aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Que Se Ligam Ao 4-1 BB de Camundongo [0147] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 172, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 173 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176.
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93/331 [0148] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 172, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 173 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176, e em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo se liga a Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) e compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de
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SEQ ID NO: 14.
[0149] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 177 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[0150] Em um aspecto específico, é proporcionada uma molécula de ligação de antígeno biespecífica, compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e a segunda subunidade da região Fc compreende o substituições de aminoácidos E356K e D399K (numeração de acordo com o índice EU Kabat).
Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Em Que o Antígeno da Célula Alvo é CEA [0151] Em um aspecto particular, o antígeno da célula alvo é o Antígeno Carcinoembrionário (CEA). As porções de ligação ao CEA foram descritas, por exemplo, no documento WO 2016/075278 A2 ou WO
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2007/071426 que são integralmente incluídas ao presente por referência. As porções de ligação ao CEA de interesse particular são descritas abaixo.
[0152] Em um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica na qual o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que
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96/331 compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 182, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 184, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192.
[0153] Em particular, é proporcionada uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia
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97/331 leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
[0154] Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.
[0155] Em um aspecto adicional, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180, e (iii) CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 182, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183 e (vi) CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 184.
[0156] Em outro aspecto adicional, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187, (ii) CDR-H2
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98/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, e (iii) CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191 e (vi) CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192.
[0157] Particularmente, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, cujo domínio de ligação ao antígeno é capaz de se ligar de maneira específica ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% , 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos
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99/331 cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
[0158] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada Vh compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; ou o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada Vh compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.
[0159] Em um aspecto adicional, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada Vh compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; ou o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada Vh compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Que Se Ligam Ao 4-1 BB e ao CEA [0160] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar
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100/331 especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
[0161] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.
[0162] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar
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101/331 especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186.
[0163] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Em Que o Antígeno da CÉLULA ALVOÉCD19 [0164] Em um aspecto específico, o antígeno da célula-alvo é
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CD19. As porções de ligação ao CD19 foram descritas no documento WO 2016/075278 A1, que está integralmente incluído ao presente pela referência. As porções de ligação ao CD19 de interesse particular são descritas abaixo.
[0165] Em um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica na qual o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao CD19 compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
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103/331 [0166] Em particular, é proporcionada uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160.
[0167] Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
[0168] Particularmente, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, cujo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos
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104/331 cerca de 95%, 96%, 97%, 98% , 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
[0169] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada Vh compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; ou o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada Vh compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas Que Se Ligam Ao 4-1 BB e CD19 [0170] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar
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105/331 especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
[0171] Em um aspecto adicional, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
Moléculas De Ligação De Antígeno Monovalentes, Biespecíficas (Formato 1+1} [0172] Em um aspecto, a invenção está relacionado a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0173] Em um aspecto específico, é fornecida uma molécula de
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106/331 ligação ao antígeno biespecífica, em que a referida molécula compreende;
(a) um primeiro fragmento Fab capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um segundo fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo; e (c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável;
em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0174] Em um aspecto, o antígeno da célula alvo é FAP. Em um aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) um primeiro fragmento Fab capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um segundo fragmento Fab capaz de se ligar de maneira específica à FAP, e (c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável;
em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
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107/331 uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0175] Em um aspecto específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126, uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125.
Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas Bivalentes Para Ligação Ao 4-1 BB E MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO PA CÉLULA ALVO (Formato 2+1) [0176] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
(b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável;
em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de
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108/331 maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0177] Assim, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é bivalente para 4-1 BB e monovalente para o antígeno da célula alvo.
[0178] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula alvo, em que o domínio VH e o domínio VL estão ligados, cada um, pot um ligante peptídico a uma das extremidades C-terminais das duas cadeias pesadas.
[0179] Em um aspecto específico, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114 e SEQ ID NO: 115. Mais particularmente, o ligante peptídico compreende a SEQ ID NO: 115.
[0180] Em um aspecto particular, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo
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109/331 compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das cadeias pesadas e o domínio VL está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da segunda cadeia pesada.
[0181] Em outro aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da cadeia pesada de Fc knob e em que o domínio VL está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da cadeia pesada de Fc hole.
[0182] Em um aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um domínio VH e um VL capazes de ligar especificamente à FAP, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0183] Em outro aspecto específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada
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110/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0184] Em outro aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um domínio VH e VL capaz de se ligar especificamente ao CEA, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0185] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, ou (c) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada
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111/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, ou (d) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.
[0186] Em outro aspecto adicional, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
(e) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
137, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou (f) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
138, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.
[0187] Em um aspecto adicional, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
(g) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 195, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 196, ou (h) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de
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112/331 aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 198; ou (i) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 199, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; ou (j) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 201, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 202.
[0188] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um domínio VH e um VL capazes de se ligar especificamente ao CD19, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0189] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 140; ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de
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113/331 aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142, ou (c) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 143, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144, ou (d) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146.
Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas Bivalentes Para Ligação Ao 4-1 BB E MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO PA CÉLULA ALVO (Formato CrossFab 2+1) [0190] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
(b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável;
em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um fragmento crossFab; e
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114/331 em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0191] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula de ligação de antígeno biespecífica, em que os dois domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB são fragmentos Fab e o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um fragmento crossFab.
[0192] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um fragmento crossFab capaz de se ligar especificamente ao antígeno da célula alvo que está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas.
[0193] Em um aspecto específico, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114 e SEQ ID NO: 115. Mais particularmente, o ligante peptídico compreende a SEQ ID NO: 115.
[0194] Em um aspecto, as duas cadeias pesadas de um anticorpo
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115/331 que compreendem dois fragmentos Fab, capazes de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreendem mutações knob-into-hole e o fragmento crossFab capaz de se ligar de maneira específica ao antígeno da célula alvo está ligado através de um ligante peptídico ao C-terminal da cadeia pesada que compreende as mutações knob. Em outro aspecto, o fragmento crossFab capaz de se ligar especificamente ao antígeno da célula alvo está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da cadeia pesada que compreende as mutações hole.
[0195] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um fragmento crossFab (CHCL) capaz de se ligar especificamente ao antígeno da célula alvo que está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas.
[0196] Em outro aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um fragmento crossFab (VHVL) capaz de se ligar especificamente ao antígeno da célula alvo que está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas.
[0197] Em um aspecto específico, é fornecida molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que nos domínios CL dos dois fragmentos Fab
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116/331 que se ligam ao 4-1 BB o aminoácido na posição 123 (numeração EU) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração EU) foi substituído por lisina (K), e em que nos domínios CH1 dos dois fragmentos Fab que se ligam ao 4-1 BB os aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e na posição 213 (numeração EU) foram substituídos por ácido glutâmico (E).
[0198] Em um aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um fragmento crossFab capaz de ligar especificamente à FAP, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0199] Em outro aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um fragmento crossFab capaz de se ligar especificamente ao CEA, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0200] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212, e uma cadeia leve adicional compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213, ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de
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117/331 aminoácidos de SEQ ID NO: 216, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215, e uma cadeia leve adicional compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217.
[0201] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um fragmento crossFab capaz de se ligar especificamente ao CD19, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas Tetravalentes Para Ligação Ao 4-1 BB E Monovalentes Para Ligação Ao Antígeno Da Célula Alvo (Formato 4+1) [0202] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
(b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável;
em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de
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SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0203] Assim, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é tetravalente para 4-1 BB e monovalente para o antígeno da célula alvo.
[0204] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que os quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB são fragmentos Fab e cada dois deles está fundido entre si, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em um aspecto particular, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110. Mais particularmente, a molécula de ligação ao antígeno compreende duas cadeias pesadas compreendendo, cada uma, um fragmento VHCH1-ligante peptídico-VHCH1. Em um aspecto particular, o ligante peptídico tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110.
[0205] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo compreende um domínio VH e VL, e em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico à extremidade C-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e o domínio VL está conectado por um ligante peptídico à extremidade C-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.
[0206] Em um aspecto particular, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende;
(a) quatro cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo
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119/331 compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL capazes de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das cadeias pesadas e, em que, o domínio VL está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da segunda cadeia pesada.
[0207] Em um aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
(a) quatro fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um domínio VH e um VL capazes de ligar especificamente à FAP, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0208] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
(a) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou (b) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
[0209] Em outro aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) quatro fragmentos Fab
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120/331 capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um domínio VH e VL capaz de se ligar especificamente ao CEA, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0210] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
(a) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou (b) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou (c) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou (d) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.
[0211] Em outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo;
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121/331 (e) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 203, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; ou (f) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; ou (g) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; ou (h) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210.
[0212] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) quatro fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um domínio VH e um VL capazes de se ligar especificamente ao CD19, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0213] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo;
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122/331 (a) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 147, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 148; ou (b) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150; ou (c) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; ou (d) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 154.
Modificações Do Domínio Fc Que Reduzem A Ligação Ao Receptor Fc E/Ou A Função Efetora [0214] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende ainda um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0215] Em alguns aspectos, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido na presente invenção, gerando assim um variante da região Fc. A região Fc
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123/331 variante humana pode compreender uma sequência da região Fc (por exemplo, sequência da região Fc de IgG 1, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos.
[0216] O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis ao anticorpo da presente invenção, incluindo uma meia-vida sérica longa que contribui para a boa acumulação no tecido alvo e uma relação de distribuição tecido/sangue favorável. Ao mesmo tempo, ele pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável dos anticorpos biespecíficos da invenção para células que expressam receptores Fc ao invés de direcionar para as células contendo antígenos preferenciais. Consequentemente, em exemplos de realização específicos, o domínio Fc dos anticorpos biespecíficos da invenção exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou uma função efetora reduzida, quando comparado a um domínio Fc de IgG nativo, em particular, um domínio Fc de IgGi ou domínio Fc de lgG4. Em um exemplo de realização específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgGi.
[0217] Em tal aspecto, o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo o referido domínio Fc) exibe menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferivelmente menos do que 10% e mais preferivelmente ainda menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc quando comparado com um domínio Fc de IgGi nativo (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo um domínio Fc de IgGi nativo), e/ou menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferencialmente menos do que 10% e mais preferivelmente menos do que 5% da função efetora, em comparação com a função efetora de um domínio Fc de IgGi nativo (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo um domínio Fc de IgGi nativo). Em um aspecto, o
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124/331 domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo o referido domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ou induz função efetora. Em um aspecto particular, o receptor Fc é um receptor Fey. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcy humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FcyRlla humanos, mais especificamente FcyRllla humano. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc inibitório. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcy inibidor humano, mais especificamente FcyRIIB humano. Em um aspecto, a função efetora é uma ou mais dentre CDC, ADCC, ADCP, e secreção de citocina. Em um aspecto particular, a função efetora é a ADCC. Em um aspecto, o domínio Fc exibe uma afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor Fc neonatal (FcRn), em comparação com um domínio Fc de IgGi nativo. Uma ligação substancialmente semelhante ao FcRn é alcançada quando o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70%, particularmente mais do que cerca de 80%, particularmente mais do que cerca de 90% da afinidade de ligação do domínio Fc de IgGi nativo (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo um domínio Fc de IgGi nativo) para o FcRn.
[0218] Em um aspecto específico, o domínio Fc é modificado/manipulado para ter uma afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio de Fc não modificado. Em um aspecto específico, o domínio de Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc e/ou reduz a função efetora. Normalmente, a mesma uma
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125/331 ou mais mutações de aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em um aspecto, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc. Em outro aspecto, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes. Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo um domínio Fc modificado exibe menos do que 20%, particularmente menos do que 10%, e mais particularmente menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc quando comparado com anticorpos biespecíficos da invenção que compreendem um domínio Fc não modificado. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fey. Em outro aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc inibitório. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcy inibidor humano, mais especificamente FcyRIIB humano. Em alguns aspectos, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcy humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FcyRlla humanos, mais especificamente FcyRllla humano. Preferencialmente, a ligação a cada um destes receptores é reduzida. Em alguns aspectos, a afinidade de ligação a um componente do complemento, especificamente a afinidade de ligação ao C1q, também está reduzida. Em um aspecto, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) não está reduzida. Uma ligação substancialmente similar ao FcRn, ou seja, a manutenção da afinidade de ligação do domínio Fc para o referido receptor é obtida quando o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70% de afinidade de ligação para o FcRn em relação a uma forma não modificada/manipulada do domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo a
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126/331 referida forma não modificada do domínio Fc). O domínio Fc, ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção, compreendendo o referido domínio de ligação ao Fc, pode apresentar mais do que cerca de 80% e mesmo mais do que cerca de 90% de tal afinidade. Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é modificada para ter uma redução da função efetora em comparação com um domínio Fc não modificado. A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, uma ou mais das seguintes: redução da citotoxicidade dependente de complemento (CDC), redução da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), redução da fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), redução da secreção de citocinas, redução da captação de antígeno mediada por complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno, redução da ligação de células NK, redução da ligação aos macrófagos, redução da ligação aos monócitos, redução da ligação as células polimorfonucleares, redução do sinal de indução de apoptose direta, redução da maturação de células dendríticas, ou redução do priming (ativação da célula náíve no primeiro encontro com o antígeno na superfície de uma APC) de células T.
[0219] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos seguintes resíduos da região Fc: 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581). Certos variantes de anticorpos com ligação a FCRs melhorada ou diminuída são descritos, (vide, por exemplo, a Patente US 6.737.056; o documento WO 2004/056312, e Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
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127/331 [0220] Em um aspecto da invenção, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição de E233, L234, L235, N297, P331 e P329. Em alguns aspectos, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (“LALA”). Em tal exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgGi, particularmente um domínio Fc de IgGi humana. Em um aspecto, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329. Em um aspecto mais específico a substituição de aminoácido é a P329A ou P329G, particularmente a P329G. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e outra substituição de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em exemplos de realização particulares, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”). O combinação “P329G LALA” de substituições de aminoácidos elimina quase completamente a ligação ao receptor Fcy de um domínio Fc de IgGi humana, tal como descrito no Pedido PCT WO 2012/130831 A1. O referido documento também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para a determinação de suas propriedades, tal como funções de ligação aos receptores Fc ou funções efetoras. Esse anticorpo é uma IgGi com mutações L234A e L235E ou com mutações L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat et al., (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
[0221] Em um aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de lgG4. Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de lgG4 que compreende uma substituição de aminoácido na posição S228 (numeração de Kabat), particularmente a substituição de aminoácido S228P. Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc
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128/331 de lgG4 compreendendo as substituições de aminoácidos L235E e S228P e P329G. Esta substituição de aminoácidos reduz in vivo a troca braço Fab de anticorpos lgG4 (vide Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)).
[0222] Anticorpos com a meia-vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) melhorada, que são responsáveis pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 e Kim, J. K„ et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), são descritos na US 2005/0014934. Tais anticorpos compreendem uma região Fc, com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas com substituições de um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, a substituição do resíduo 434 da região Fc (Patente US 7.371.826). Vide também Duncan, A.R., e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5.648.260; US 5.624.821; e WO 94/29351 relativos a outros exemplos de variantes da região Fc.
[0223] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando instrumentos convencionais, tais como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e os receptores Fc podem ser obtidos por expressão recombinante. Um ensaio de ligação adequado é descrito na presente invenção. Alternativamente, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de ativação de célula T compreendendo um domínio Fc aos receptores Fc pode ser avaliada utilizando linhagens de células que expressam receptores Fc específicos, tais como as células NK humanas que expressam o receptor Fcyllla. A função efetora de um domínio Fc, ou das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção
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129/331 compreendendo um domínio Fc, pode ser mensurada por métodos conhecidos no estado da técnica. Um ensaio adequado para mensurar a ADCC é descrito na presente invenção. Outros exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse encontram-se descritos na Patente US 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sei USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sei USA 82, 1499-1502 (1985); Patente US 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaios não radioativos (vide, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI® para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA), e o ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl)). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sei USA 95, 652-656 (1998).
[0224] A seção a seguir descreve exemplos de realização preferidos das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção que compreendem modificações no domínio Fc que reduzem a ligação ao receptor Fc e/ou a função efetora. Em um aspecto, a invenção diz respeito a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de se associar de maneira estável, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo a um receptor Fc, em particular, ao receptor Fey. Em outro aspecto, a invenção diz respeito a
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130/331 molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 41BB, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a função efetora. Em um aspecto particular, o domínio Fc é da subclasse IgGi humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
Modificações Do Domínio Fc Para Promoção Da Heterodimerização [0225] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção compreendem diferentes sítios de ligação ao antígeno, fundidos a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim, as duas subunidades do domínio Fc são tipicamente compostas por duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e a subsequente dimerização conduzem a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e pureza das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção na produção recombinante, será, portanto, vantajoso introduzir no domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção uma modificação para promover a associação dos polipeptídeos desejados.
[0226] Consequentemente, em um aspecto particular, a invenção diz respeito a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio Fc compreende uma modificação que
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131/331 promove a associação da primeira e segunda subunidades do domínio Fc. O local de interação proteína-proteína mais amplo entre as duas subunidades de um domínio Fc de IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um aspecto, a referida modificação é no domínio CH3 do domínio Fc.
[0227] Em um aspecto específico, a referida modificação é uma modificação denominada “knob-into-hole, que compreende uma modificação formando uma protuberância (knob) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação formando uma cavidade (hole) na outra das duas subunidades do domínio Fc. Assim, em um aspecto particular, a invenção diz respeito a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreende modificações Knob e a segunda subunidade do domínio Fc compreende modificações Hole, de acordo com o método Knob-into-Hole. Em um aspecto específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU), e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0228] A tecnologia knob-into-hole está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 7.695.936; e em Ridgway et ai, Prot Eng. 9, 617621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade/orifício correspondente (“hole) na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e
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132/331 impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina).
[0229] Consequentemente, em um aspecto, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção um resíduo aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que pode ser posicionada dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade; e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade pode ser posicionada. A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítioespecífica, ou por síntese peptídica. Em um aspecto, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc o resíduo tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em um aspecto, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo treonina na posição 366 é substituído por um resíduo serina (T366S) e o resíduo leucina na posição 368
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133/331 é substituído por um resíduo de alanina (L368A).
[0230] Em um aspecto adicional, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C). A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte de bissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, (2001), J Immunol Methods 248, 7-15). Em um aspecto específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU), e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0231] Em um aspecto uma associação promove a modificação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação que medeia efeitos de direcionamento eletrostático, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT WO 2009/089004. Em geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados de modo que a formação de homodímeros se torna eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável.
[0232] A porção C-terminal da cadeia pesada do anticorpo biespecífico, como divulgado na presente invenção, pode ser um porção Cterminal completa terminando com os resíduos de aminoácidos PGK. O Cterminal da cadeia pesada pode ser um C-terminal encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácido do C-terminal foram removidos. Em um aspecto preferido, o C-terminal da cadeia pesada é uma porção C-terminal encurtada que termina em PG. Em um aspecto de todos os aspectos aqui
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134/331 divulgados, um anticorpo biespecífico compreendendo uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 C-terminal tal como especificado na presente invenção, compreende o dipeptídeo glicina-lisina C-terminal (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização de todos os aspectos aqui divulgados, um anticorpo biespecífico compreendendo uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 C-terminal tal como especificado na presente invenção, compreende o resíduo glicina Cterminal (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
Modificações nos Domínios CH1/CL [0233] Para melhorar ainda mais o pareamento correto, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem conter substituições de aminoácidos carregados de modo diferente (denominados “resíduos carregados”). Estas modificações são introduzidas nos domínios CH1 e CL cruzados ou não cruzados. Em um aspecto específico, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que em pelo menos um domínio CL o aminoácido na posição 123 (numeração EU) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração EU) foi substituído por lisina (K), e em que em pelo menos um domínio CH1 os aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e posição 213 (numeração EU) foram substituídos por ácido glutâmico (E).
[0234] De modo mais específico, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que no domínio CL do domínio Fab que se liga ao 4-1 BB o aminoácido na posição 123 (numeração EU) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração EU) foi substituído por lisina (K), e em que no domínio CH1 do domínio Fab que se liga ao 4-1 BB os aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e na posição 213 (numeração EU) foram substituídos por ácido glutâmico (E).
Modificações Nos Domínios Fab
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135/331 [0235] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) um primeiro fragmento Fab capaz de se ligar de forma específica ao 4-1 BB, (b) um segundo fragmento capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que em um dos fragmentos Fab os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL são trocados. Os anticorpos biespecíficos são preparados de acordo com a tecnologia Crossmab.
[0236] Os anticorpos multiespecíficos com uma substituição/troca de domínio em um braço de ligação (CrossMab VH_VL ou CrossMab CH-CL) são descritos em detalhes no documento W02009/080252 e em Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Eles claramente reduzem os subprodutos causados pelo pareamento incorreto de uma cadeia leve contra um primeiro antígeno com a cadeia pesada contra o segundo antígeno (em comparação com abordagens sem essa troca de domínio).
[0237] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) um primeiro fragmento Fab capaz de se ligar de forma específica ao 4-1 BB, (b) um segundo fragmento capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que em um dos fragmentos Fab os domínios constantes CL e CH1 estão substituídos um pelo outro de modo a que o domínio CH1 é parte da cadeia leve e o domínio CL é parte da cadeia pesada (crossmab CH-CL). Em outro aspecto, em um dos fragmentos Fab, os domínios variáveis VL e VH estão substituídos entre si, de modo que o domínio VH é parte da cadeia leve e o domínio VL é parte da cadeia pesada (crossmab VH-VL). Mais particularmente, no segundo fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, os domínios constantes CL e
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CH1 são substituídos entre si de modo que o domínio CH1 é parte da cadeia leve e o domínio CL é parte da cadeia pesada.
[0238] Em um aspecto particular, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) um primeiro fragmento Fab capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) um segundo fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que os domínios constantes CL e CH1 estão substituídos entre si, de modo que o domínio CH1 é parte da cadeia leve e o domínio CL é parte da cadeia pesada. Tal molécula é chamada de molécula de ligação ao antígeno biespecífica monovalente.
[0239] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e o domínio Fc e (b) dois fragmentos Fab adicionais capazes de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que os referidos fragmentos Fab adicionais estão conectados, cada um, por um ligante peptídico ao C-terminal das cadeias pesadas de (a). Em um aspecto específico, os fragmentos Fab adicionais são fragmentos Fab em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos entre si, de modo que o domínio VH é parte da cadeia leve e o domínio VL é parte da cadeia pesada.
[0240] Assim, em um aspecto, a invenção compreende uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e o domínio Fc e (b) dois fragmentos Fab adicionais capazes de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que os referidos dois fragmentos Fab adicionais capazes de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo são
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137/331 fragmentos Fab cruzados (Fab crossover), em que os domínios variáveis VL e VH estão trocados entre si, e as cadeias VL-CH são, cada uma, ligadas por um ligante peptídico ao C-terminal das cadeias pesadas de (a).
[0241] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e o domínio Fc e (b) um fragmento Fab adicional capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que o referido fragmento Fab adicional está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das cadeias pesadas de (a). Em um aspecto específico, o fragmento Fab adicional é um fragmento Fab em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos entre si, de modo que o domínio VH é parte da cadeia leve e o domínio VL é parte da cadeia pesada. Em outro aspecto específico, o fragmento Fab adicional é um fragmento Fab em que os domínios constantes CL e CH1 são substituídos entre si, de modo que o domínio CH1 é parte da cadeia leve e o domínio CL é parte da cadeia pesada.
POLINUCLEOTÍDEOS [0242] A invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados que codificam uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, tal como descrito na presente invenção ou um fragmento da mesma.
[0243] Os polinucleotídeos isolados que codificam as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica toda a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ativadora de célula T ou na forma de múltiplos polinucleotídeos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar-se por meio de, por exemplo, pontes de bissulfeto ou outros meios para formar uma molécula de ligação ao antígeno funcional. Por exemplo, a
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138/331 porção da cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção da cadeia pesada da imunoglobulina. Quando coexpressos, os polipeptídeos de cadeia pesada irão se associar com os polipeptídeos de cadeia leve de modo a formar a imunoglobulina.
[0244] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido na molécula biespecífica de acordo com a invenção conforme descrito no presente.
[0245] Em outro aspecto, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado codificante de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0246] Em determinados exemplos de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de fita
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139/331 simples ou de fita dupla.
Métodos Recombinantes [0247] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser obtidas, por exemplo, por produção recombinante. Para a produção recombinante, são proporcionados um ou mais polinucleotídeos codificantes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou seus fragmentos polipeptídicos. O um ou mais polinucleotídeo que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica são isolados e inseridos em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Tal polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais. Em um aspecto da invenção é fornecido um vetor, de preferência um vetor de expressão, compreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção. Os métodos que são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência codificante da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento) juntamente com os sinais de controle transcricional/traducional apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in v/vo/recombinação genética. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, NY. (1989) e Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY (1989). O vetor de expressão pode ser parte de urn plasmideo, virus, ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão em que o polinucleotídeo codificante da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou um fragmento polipeptídico da mesma (ou seja, a região codificante) é clonado em associação operativa com um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou da tradução.
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Conforme utilizado na presente invenção, uma “região codificante” ou “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste de códons que são traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de parada” ou “códon de terminação” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores da transcrição, introns, regiões 5' e 3' não traduzidas, e similares, não são parte de uma ‘região codificante’. Duas ou mais regiões codificantes podem estar presentes em uma única construção de polinucleotídeos, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em (diferentes) vetores separados. Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificante, ou pode compreender duas ou mais regiões codificantes, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são pós- ou cotraducionalmente separados nas proteínas finais pela divagem proteolítica. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificantes heterólogas, fundidas ou não fundidas com um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ou um fragmento polipeptídico da mesma, ou formas variantes ou derivadas da mesma. As regiões codificantes heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados tal como um peptídeo sinal de secreção ou um domínio funcional heterólogo. Uma associação operável é quando uma região codificante de um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, é associado a uma ou mais sequências reguladoras, de tal maneira que coloca a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região codificante do polipeptídeo e um promotor associado a esta) estão ‘Operacionalmente associados”, se a indução da função promotora resulta na
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141/331 transcrição de mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão no controle da expressão do produto do gene, ou não interfere com a capacidade do DNA molde de ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição do referido ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor ‘célula-específico’, que controla a transcrição substancial do DNA apenas em células pré-determinadas. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, facilitadores (enhancers), operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem estar operacionalmente associados com o polinucleotídeo para controlar a transcrição célula-específica.
[0248] Os promotores adequados e outras regiões de controle da transcrição são divulgados na presente invenção. Diversas regiões de controle da transcrição são conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto. Dentre estas podemos citar, sem se limitar, as regiões de controle da transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não se limitando a, promotor e segmentos enhancers de citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor precoce), e retrovirus (por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados como a actina, proteína de choque térmico, hormônio do crescimento bovino e α-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. Regiões de controle da transcrição adequadas adicionais incluem promotores e facilitadores tecido-específicos, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores indutíveis por tetraciclinas). Da mesma forma, uma variedade de
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142/331 elementos de controle da tradução é conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. Estes incluem, mas não se limitam a, sítios de ligação ao ribossomo e de início da tradução, códons de terminação e elementos derivados de sistemas virais (em particular, um sítio interno de entrada de ribossomo, ou IRES, também referido como sequência CITE). O cassete de expressão também pode incluir outros recursos, como uma origem de replicação, e/ou elementos de integração cromossômica, tal como as repetições terminais longas retrovirais (LTRs) ou repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV).
[0249] O polinucleotídeo e as regiões codificantes de ácido nucleico da presente invenção podem ser associados com regiões codificantes adicionais que codificam peptídeos de secreção ou de sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se é desejada a secreção da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou um fragmento polipeptídico desta, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico codificante da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ou fragmento da mesma. De acordo com a hipótese do sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência de comando de secreção, que é clivada a partir da proteína madura, quando a exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso é iniciada. Os técnicos hábeis estão cientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados têm, em geral, um peptídeo de sinal fundido com a extremidade N- terminal do polipeptídeo, e que é clivado a partir do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em determinados exemplos de realização, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal da cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina é utilizado, ou um derivado funcional desta sequência que
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143/331 retenha a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo ao qual está operacionalmente associada. Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser utilizado. Por exemplo, a sequência líder tipo-selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou o β-glucuronidase de camundongo.
[0250] Um DNA codificante de uma sequência de proteína curta que pode ser utilizado para facilitar a posterior purificação (por exemplo, um marcador histidina) ou auxiliar na marcação da proteína de fusão pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo codificante da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou fragmentos polipeptídicos da mesma.
[0251] Em aspecto adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em determinados aspectos, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas na presente invenção em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em um aspecto, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um vetor que compreende um polinucleotídeo codificante (parte de) uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. Conforme utilizado no presente, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulada para gerar as proteínas de fusão da presente invenção ou fragmentos das mesmas. As células hospedeiras adequadas para a replicação e para suportar a expressão das moléculas de ligação ao antígeno são bem conhecidas no estado da técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas, conforme apropriado, com o vetor de expressão particular, e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas em
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144/331 fermentadores de larga escala para se obter quantidades suficientes das moléculas de ligação ao antígeno para aplicações clínicas. As células hospedeiras adequadas incluem micro-organismos procarióticos, como E. coli, ou várias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de insetos, ou similares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação não é necessária. Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado. Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de polipeptídeos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
[0252] Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovirus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais podem também ser utilizadas como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (que descrevem a tecnologia PLANTIBODIES® para produção de anticorpos em plantas transgênicas). Células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são;
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145/331 linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células rim de hamster neonato (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562);. células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals NY Acad.Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR’ (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sei USA 77:4216 (1980)) e linhagem de células de mieloma, como a NSO e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteínas, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods In Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Imprensa Humana, Fairfield, NJ, 2003 ), págs 255-268. 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, células de leveduras, células de insetos, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, ou planta transgênica ou cultura ou tecido de planta ou animal. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, de preferência uma célula de mamífero, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula de rim embrionário humano (HEK) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NSO, SP20). As tecnologias-padrão para expressar genes exógenos em tais sistemas são conhecidas no estado da técnica. As células que expressam um
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146/331 polipeptídeo compreendendo a cadeia pesada ou leve de uma imunoglobulina podem ser manipuladas de modo a expressarem também as outras cadeias de imunoglobulina de tal modo que o produto expresso é uma imunoglobulina que tem tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve.
[0253] Em um aspecto, é fornecido um método de produção de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou fragmentos polipeptídicos da mesma, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira que compreende polinucleotídeos que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ou fragmentos polipeptídicos da mesma, sob condições adequadas para expressão da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou fragmentos polipeptídicos da mesma pela célula hospedeira, e a recuperação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ou fragmentos polipeptídicos da mesma (ou meio de cultura da célula hospedeira).
[0254] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas preparadas conforme descrito na presente invenção podem ser purificadas por técnicas conhecidas pelos especialistas no assunto, tal como a cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e técnicas similares. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores como a carga líquida, a hidrofobicidade, a hidrofilicidade, e etc, e serão evidentes para os especialistas no assunto. Para a purificação usando a cromatografia de afinidade, pode ser usado um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno ao qual a molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga. Por exemplo, para a purificação da proteína de fusão da invenção por cromatografia de afinidade, pode ser usada uma matriz com a proteína A ou proteína G. A cromatografia de afinidade em Proteína A ou G sequencial e a cromatografia de exclusão por tamanho podem ser usadas para isolar a molécula de ligação ao antígeno essencialmente conforme
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147/331 descrito nos Exemplos. A pureza da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou fragmentos da mesma pode ser determinada por qualquer um dentre uma variedade de métodos bem conhecidos, incluindo a análise por eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão, e similares. Por exemplo, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas nos Exemplos se mostraram intactas e devidamente montadas, conforme demonstrado por SDS-PAGE redutor e não redutor.
Ensaios [0255] As moléculas de ligação ao antígeno fornecidas na presente invenção podem ser identificadas, rastreadas, ou caracterizadas por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos no estado da técnica.
1. Ensaios de afinidade [0256] A afinidade das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anticorpos e fragmentos de anticorpo fornecidos na presente invenção para 4-1 BB e um antígeno da célula-alvo pode ser determinada de acordo com os métodos descritos nos Exemplos pela ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando instrumentos convencionais, como um instrumento BIAcore (GE Heathcare), e receptores ou proteínas alvo, que podem ser obtidos por expressão recombinante. A afinidade da molécula de ligação ao antígeno biespecífica para o antígeno da célula alvo também pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando a instrumentação convencional, tal como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores ou proteínas alvo, como pode ser obtido pela expressão recombinante. Um exemplo de realização específico ilustrativo e exemplar para mensurar a afinidade de ligação é descrito no Exemplo 1.2. De acordo com um aspecto, a Kd é mensurada pela ressonância plasmônica de superfície utilizando um dispositivo BIACORE® T100 (GE Healthcare), a 25QC.
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2. Ensaios de ligação e outros ensaios [0257] A ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica fornecida na presente invenção nas células que expressam o receptor correspondente pode ser avaliada utilizando as linhagens de células que expressam o receptor específico ou antígeno alvo, por exemplo, por citometria de fluxo (FACS). Em um aspecto, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) frescas que expressam 4-1 BB são utilizadas no ensaio de ligação. Essas células são usadas diretamente após o isolamento (PMBCs naive) ou após a estimulação (PMBCs ativadas). Em outro aspecto, foram utilizados esplenócitos ativados de camundongos (expressando 4-1 BB) para demonstrar a ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção às células que expressam 4-1 BB. Em outro aspecto, foram utilizadas PBMCs isoladas a partir do sangue heparinizado de Macaca fascicularis saudáveis para mostrar a ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo às células de cinomolgos correspondentes que expressam 4-1 BB.
[0258] Em outro aspecto, linhagens de células de câncer que expressam o antígeno da célula alvo, por exemplo, FAP ou CEA, foram usadas para demonstrar a ligação das moléculas de ligação ao antígeno sobre o antígeno das células alvo.
[0259] Em outro aspecto, podem ser utilizados ensaios de competição para identificar uma molécula de ligação ao antígeno que compete com um anticorpo específico ou molécula ou antígeno de ligação específica para a ligação ao alvo ou 4-1 BB, respectivamente. Em determinados exemplos de realização, tal molécula de ligação ao antígeno competidora se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado pelo anticorpo anti-alvo específico ou um anticorpo específico para 41 BB. Métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao
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149/331 qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” Em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
3. Ensaios de Atividade [0260] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar moléculas de ligação de antígeno biespecíficas que se ligam a um antígeno da célula alvo específico e ao 4-1 BB possuindo atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, a sinalização agonista através de 4-1 BB nas células que expressam o antígeno da célula alvo. Também são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas identificadas pelos ensaios como tendo tal atividade biológica in vitro.
[0261] Em determinados aspectos, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é testada para essa atividade biológica. Além disso, os ensaios para a detecção da lise celular (por exemplo, pela medição de liberação de LDH), cinética de apoptose induzida (por exemplo, pela medição da atividade da caspase 3/7) ou apoptose (por exemplo, utilizando o ensaio TUNEL) são bem conhecidos no estado da técnica. Além disso, a atividade biológica de tais complexos pode ser avaliada por meio da avaliação dos seus efeitos sobre a sobrevida, proliferação e secreção de linfocinas de vários subconjuntos de linfócitos, tais como células NK, células NKT ou células T γδ ou avaliando a capacidade de tais complexos em modular o fenótipo e função de células apresentadoras de antígenos, tais como células dendríticas, monócitos/macrófagos ou células-B.
Composições Farmacêuticas, Formulações e Modo de Administração [0262] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidas no presente, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos descritos abaixo. Em um exemplo de
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150/331 realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidas na presente invenção e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outro exemplo de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidas na presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.
[0263] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais molécula de ligação ao antígeno biespecífica dissolvida ou dispersa em um excipiente farmaceuticamente aceitável. As frases “farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitáveis” refere-se a entidades moleculares e composições que são geralmente atóxicas para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, ou seja, não produzem uma reação adversa nociva, alérgica ou outra quando administrada a um animal, por exemplo, um humano, quando apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém, pelo menos, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será do conhecimento dos técnicos no assunto à luz da presente divulgação, conforme exemplificado em Flemington’s Pharmaceutical Sciences, 18â Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pela referência. Especificamente, as composições são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Conforme utilizado na presente invenção, “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, agentes tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, sais, estabilizantes e combinações dos mesmos, como do conhecimento de um técnico hábil no assunto.
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151/331 [0264] As composições parenterais incluem aquelas que foram concebidas para a administração por injeção, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica, intralesional, administração intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção pode ser formulada em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tal como a solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como suspensões, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênicos, antes da utilização. As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação das moléculas de ligação ao antígeno da invenção na quantidade requerida em solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados a seguir, conforme necessário. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação dos diversos ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou outros ingredientes. No caso de pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são secagem à vácuo ou técnicas de liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um meio líquido previamente esterilizado por filtração. O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido de primeiro ser tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente. A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e protegida contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. Será apreciado que a contaminação com
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152/331 endotoxinas deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, menos que 0,5 ng/mg de proteína. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butílico ou benzilíco; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG). As suspensões para injeção aquosas podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, como a carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano, ou outros compostos similares. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas de modo adequado. Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tal como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como cleats de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas.
[0265] Os ingredientes ativos podem ser retidos (encapsulados)
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153/331 em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, (18â Edição, Mack Printing Company 1990). Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o polipeptídeo, que se encontram na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em exemplos de realização específicos, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pela utilização de agentes que atrasam a absorção nas composições, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.
[0266] Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem ainda agentes de dispersão intersticial de fármacos, tais como glicoproteínas hialuronidase neutro-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 humana solúvel, como a rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de utilização, incluindo a rHuPH20, estão descritos nas Publicações de Patente US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.
[0267] Formulações de anticorpos liofilizados exemplares estão descritas na Patente US 6.267.958. As formulações aquosas de anticorpos incluem as descritas na Patente US 6.171.586 e no documento WO 2006/044908, sendo que as formulações deste último incluem um tampão
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154/331 histidina-acetato.
[0268] Além das composições descritas anteriormente, as proteínas de fusão também podem ser formuladas como uma preparação de depósito (depot). Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas pela implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou pela injeção intramuscular. Assim, por exemplo, a proteínas de fusão podem ser formuladas com materiais poliméricos apropriados ou materiais hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.
[0269] As composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser produzidas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsão, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo convencional usando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitem o processamento das proteínas em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.
[0270] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem ser formuladas em uma composição livre de ácido ou base, neutra ou na forma de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Estes incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como o ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de
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155/331 bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, ou de bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e solventes próticos do que as formas de base livre correspondentes.
[0271] A presente composição também pode conter mais de um ingrediente ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não sejam prejudiciais entre si. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0272] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis.
Composições E Métodos Terapêuticos [0273] Qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidas na presente invenção podem ser usadas nos métodos terapêuticos.
[0274] Para o uso em métodos terapêuticos, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser formuladas, dosadas, e administradas de um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos.
[0275] Em um aspecto, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção para uso como um medicamento.
[0276] Em aspectos adicionais, é fornecida uma molécula de
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156/331 ligação ao antígeno biespecífica da invenção para uso (i) no estímulo ou melhora da resposta de células T, (ii) no suporte a sobrevida de células T ativadas, (iii) no tratamento de infecções, (iv) no tratamento do câncer, (v) no atraso da progressão do câncer, ou (vi) no prolongamento da sobrevida de um paciente que sofre de câncer. Em um aspecto específico, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção para uso no tratamento de uma doença, em particular para uso no tratamento do câncer.
[0277] Em determinados aspectos, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção para uso em um método de tratamento. Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme descrito no presente para o uso no tratamento de uma doença em um indivíduo que necessite de tal tratamento. Em determinados aspectos, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica para o uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ao indivíduo. Em certos aspectos, a doença a ser tratada é o câncer. O “sujeito”, “paciente” ou ‘indivíduo” que necessita de tratamento é tipicamente um mamífero, mais especificamente um ser humano.
[0278] Em um aspecto, é fornecido um método para (i) estimular ou melhorar a resposta de células T, (ii) suportar a sobrevivência de células T ativadas, (iii) tratar infecções, (iv) tratar o câncer, (v) retardar a progressão do câncer, ou (vi) prolongar a sobrevida de um paciente sofrendo de câncer, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção a um indivíduo com tal necessidade.
[0279] Em outro aspecto, a invenção provê o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção na fabricação ou
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157/331 preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo com tal necessidade. Em um aspecto adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de uma doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento a um indivíduo possuindo a doença. Em certos aspectos, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo, particularmente o câncer. Exemplos de câncer incluem, mas não se limitam a o câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de útero, câncer do colo uterino, câncer de endométrio, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer hematológico, câncer de pele, carcinoma de células escamosas, câncer nos ossos e câncer renal. Outros exemplos de câncer incluem carcinoma, linfoma, (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin), blastoma, sarcomas e leucemia. Outros distúrbios da proliferação celular que podem ser tratados utilizando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a neoplasias localizadas no: abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireoide, hipófise, testículos, ovários, timo, tireoide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pelve, pele, tecidos moles, baço, região torácica e sistema urogenital. Também estão incluídas as condições ou lesões pré-cancerosas e metástases de cânceres. Em determinados exemplos de realização o câncer é escolhido a partir do grupo que consiste em câncer de células renais, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço. Um técnico no assunto prontamente reconhece que em muitos casos a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção pode não fornecer uma cura, mas pode fornecer um benefício. Em alguns
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158/331 aspectos, uma alteração fisiológica possuindo algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Assim, em alguns aspectos, uma quantidade da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção que fornece uma alteração fisiológica é considerada uma “quantidade eficaz” ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz”.
[0280] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção (quando utilizada isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da via de administração, do peso corpóreo do paciente, da molécula específica, da gravidade e curso da doença, se a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, das intervenções terapêuticas prévias ou concomitantes, do histórico clínico do paciente e resposta à proteína de fusão, e de acordo com o critério do médico atendente. O médico responsável pela administração irá, em qualquer evento, determinar a concentração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e a(s) dose(s) apropriada(s) para o sujeito individual. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo do tempo, em vários pontos de tempo, administração em bolus, e infusão pulsada são contempladas pela presente invenção.
[0281 ] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de molécula de ligação ao antígeno contendo trímero ligante da família TNF é uma possível dose candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão
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159/331 contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar em cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção estaria no intervalo de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em outros exemplos, uma dose pode compreender também de cerca de 1 pg/kg de peso corporal, cerca de 5 pg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg/kg de peso corporal, cerca de 50 pg/kg de peso corporal, cerca de 100 pg/kg de peso corporal, cerca de 200 pg/kg de peso corporal, cerca de 350 pg/kg de peso corporal, cerca de 500 pg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 200 mg/kg de peso corporal, cerca de 350 mg/kg de peso corporal, cerca de 500 mg/kg de peso corporal, a cerca de 1.000 mg/kg de peso corporal ou mais por administração, e qualquer intervalo de valores derivável destes. Exemplos de um intervalo derivável a partir dos números indicados na presente invenção, um intervalo de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 pg/kg de peso corporal a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, etc, pode ser administrado com base nos números descritos acima. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas dosagens) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses da proteína de fusão). Em um aspecto particular, a molécula de ligação de antígeno biespecífica será administrada a cada três semanas. Pode ser
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160/331 administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.
[0282] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção será utilizada em geral em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Para uso no tratamento ou prevenção de uma condição de doença, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção, ou suas composições farmacêuticas, são administrados ou aplicados em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro das capacidades dos especialistas no assunto, especialmente à luz da divulgação detalhada fornecida no presente.
[0283] Para a administração sistêmica, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios in vitro, tais como os ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração na circulação que inclui a IC50 conforme determinado na cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos.
[0284] As doses iniciais podem também ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos de animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica. Um perito no estado da técnica pode prontamente otimizar a administração para seres humanos com base nos dados obtidos em animais.
[0285] A quantidade da dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis plasmáticos da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção que são suficientes para manter o efeito terapêutico. As dosagens habituais nos pacientes para a administração por injeção variam de cerca de 0,1 a 50 mg/kg/dia, normalmente
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161/331 de cerca de 0,1 a 1 mg/kg/dia. Os níveis plasmáticos terapeuticamente eficazes podem ser alcançados pela administração de doses múltiplas todos os dias. Os níveis no plasma podem ser mensurados, por exemplo, por HPLC.
[0286] Nos casos da administração local ou absorção seletiva, a concentração local eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção pode não estar relacionado com a concentração plasmática. Um especialista hábil na técnica será capaz de otimizar dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação indevida.
[0287] Uma dose terapeuticamente eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção geralmente proporcionará benefícios terapêuticos sem causar toxicidade substancial. A toxicidade e a eficácia terapêutica de uma proteína de fusão podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais. Os ensaios com cultura celular e estudos em animais podem ser utilizados para determinar a LDso (dose letal para 50% da população) e a ED50 (dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico que pode ser expresso como a relação LD50/ED50. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que exibem grandes índices terapêuticos são preferidas. Em uma aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção exibe um alto índice terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem adequado para a utilização em seres humanos. A dosagem situa-se preferencialmente dentro de um intervalo de concentrações que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo, dependendo de uma variedade de fatores como, por exemplo, a forma de dosagem utilizada, a via de administração utilizada, a condição do sujeito, e assim por diante. A formulação, a via de administração e
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162/331 a dosagem exata podem ser escolhidas pelo médico, tendo em vista a condição do paciente (vide, por exemplo, Fingi et al, 1975, em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capitulo 1, p 1, integralmente incorporado ao presente pela referência).
[0288] O médico a tratar os pacientes com os anticorpos biespecíficos da invenção sabería como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade, disfunção de órgão, e etc. Inversamente, o médico também sabería como ajustar o tratamento para níveis mais elevados, se a resposta clinica não fosse adequada (impedindo a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no controle do distúrbio de interesse variará com a gravidade da condição a ser tratada, com a via de administração, e outros fatores semelhantes. A gravidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos de avaliação de prognóstico padrão. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose, também variarão de acordo com a idade, peso corporal, e resposta do paciente individual.
Outros Agentes e Tratamentos [0289] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção pode ser administrada em combinação com um ou mais agente(s) adicional(ais) na terapia. Por exemplo, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo “agente terapêutico” abrange qualquer agente que possa ser administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo com necessidade de tal tratamento. Tal agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles que têm atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Em determinados exemplos de realização, um agente terapêutico adicional é outro agente anticâncer ou agente quimioterápico, por exemplo, um disrruptor de
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163/331 microtúbulos, um antimetabólito, um inibidor da topoisomerase, um intercalante de DNA, um agente alquilante, uma antraciclina, uma terapia hormonal, um inibidor da quinase, um antagonista de receptor, um ativador da apoptose de células tumorais ou um agente antiangiogênico. Em determinados aspectos, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor de adesão celular, um agente citotóxico ou citostático, um ativador da apoptose celular, ou um agente que aumenta a sensibilidade das células para indutores apoptóticos.
[0290] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é administrada em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes usados na imunoterapia do câncer. Um agente quimioterápico é um agente anticâncer conforme definido acima. Alternativamente, um agente quimioterápico é selecionado a partir do grupo que consiste em análogos de nucleotídeos (por exemplo, azacitidina, capecitabina, doxifluridina, fluoruracila, gencitabina, hidroxiureia ou metotrexato), agentes à base de platina (por exemplo, carboplatina, cisplatina ou oxaliplatina), taxanos (por exemplo paclitaxel, docetaxel, abraxano ou taxotere), agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, clorambucila, dacarbazina ou temozolomida), antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina ou idarrubicina), inibidores da topoisomerase I (por exemplo, irinotecano ou topotecano), inibidores da topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo ou teniposídeo), inibidores da quinase (por exemplo, erlotinib, imatinib, vemurafenib ou vismodegib), retinoides, inibidores da desacetilase de histona e alcalóides da vinca. Outros agentes para uso em imunoterapia do câncer incluem, por exemplo, agentes que bloqueiam a interação PD-L1/PD-1, tal como um anticorpo PD1 (por exemplo, pembrolizumab ou nivolumab) ou um anticorpo PD-L1 (por exemplo, atezolizumab). As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção também podem ser usadas em combinação
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164/331 com a radioterapia.
[0291] Tais outros agentes estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de proteína de fusão usada, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo da invenção são, em geral, utilizadas nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.
[0292] Tais terapias combinadas referidas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma composição ou em composições distintas), e a administração separada, nesse caso a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo biespecífico da invenção, pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Em um aspecto, a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica e a administração de um agente terapêutico adicional ocorre dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, entre elas.
Artigos De Fabricação [0293] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos anteriormente. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos,
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165/331 seringas, bolsas de soluções para administração I.V. e etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que é por si só, ou em combinação com outra composição, eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa que é perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção.
[0294] O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção, e (b) um segundo recipiente com uma segunda composição ali contida, em que a segunda composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico. O artigo de fabricação neste exemplo de realização pode compreender ainda uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica.
[0295] Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Tabela C (Sequências)
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SEQ ID NO: Nome Sequência
1 4-1 BB (20H4.9) CDR-H1 GYYWS
2 4-1 BB (20H4.9) CDR-H2 EINHGGYVTYNPSLES
3 4-1 BB (20H4.9) CDR-H3 DYGPGNYDWYFDL
4 4-1 BB (20H4.9) CDR-L1 RASQSVSSYLA
5 4-1 BB (20H4.9) CDR-L2 DASNRAT
6 4-1 BB (20H4.9) CDR-L3 QQRSNWPPALT
7 4-1 BB (20H4.9) VH QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY YWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLES RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDY G PG N YDW YFDLWG RGTLVTVSS
8 4-1 BB (20H4.9) VL EIVLTQSPATLSLSPG E RATLSCRASQSVSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGS GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTF GGGTKVEIK
9 FAP (28H1) CDR-H1 SHAMS
10 FAP (28H1) CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG
11 FAP (28H1) CDR-H3 GWLGNFDY
12 FAP (28H1) CDR-L1 RASQSVSRSYLA
13 FAP (28H1) CDR-L2 GASTRAT
14 FAP (28H1) CDR-L3 QQGQVIPPT
15 FAP(4B9) CDR-H1 SYAMS
16 FAP(4B9) CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG
17 FAP(4B9) CDR-H3 GWFGGFNY
18 FAP(4B9) CDR-L1 RASQSVTSSYLA
19 FAP(4B9) CDR-L2 VGSRRAT
20 FAP(4B9) CDR-L3 QQGIMLPPT
21 FAP(28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHA MSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSS
22 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYL AWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQ GTKVEIK
23 FAP(4B9) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSS
24 FAP(4B9) VL EIVLTQSPGTLSLSPG E RATLSCRASQSVTSSYL AWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQ GTKVEIK
25 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H1 DTYMH
26 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H2 RIDPANGNSKYVPKFQG
27 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H3 FGYYVSDYAMAY
28 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L1 RAGESVDIFGVGFLH
29 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L2 RASNRAT
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SEQ ID NO: Nome Sequência
30 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L3 QQTNEDPYT
31 CEA (T84.66-LCHA) VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTY MHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKF QGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAP FGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS
32 CEA (T84.66-LCHA) VL EIVLTQSP ATLSLS PG E R ATLSC R AG ES V DIFG V GFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPY TFGQGTKLEIK
33 CEA (A5B7)- CDR-H1 SYWMH
34 CEA (A5B7)- CDR-H2 FIRNKANGGTTEYAAS
35 CEA (A5B7)- CDR-H3 DRGLRFYFDY
36 CEA (A5B7)- CDR-L1 TLRRGINVGAYSIY
37 CEA (A5B7)- CDR-L2 YKSDSDKQQGS
38 CEA (A5B7)- CDR-L3 MIWHSGASAV
39 CEA (A5B7) VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSY WMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYA ASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
40 CEA (A5B7) VL QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAY SIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVS SRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIW HSGASAVFGGGTKLTVL
41 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-Ziote (4B9 ) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 1
42 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (4B9 ) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 1
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9 ) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 1
44 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-Ziote (4B9) vide a Tabela 1
45 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (4B9 ) vide a Tabela 1
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
47 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-/?o/e (4B9 ) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 2
48 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (4B9 ) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 2
49 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-/?o/e (4B9) vide a Tabela 2
50 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (4B9) vide a Tabela 2
51 Sequência nucleotidica cadeia Fc hole vide a Tabela 4
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SEQ ID NO: Nome Sequência
52 Sequência nucleotídica da cadeia Fc knob para antígeno 41 BB humano vide a Tabela 4
53 cadeia Fc hole vide a Tabela 4
54 cadeia Fc knob para antígeno 4- 1 BB humano vide a Tabela 4
55 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VL-/?o/e(4B9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 6
56 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VH-/mot>(4B9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 6
57 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VL-/?o/e (4B9) vide a Tabela 6
58 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VH-knob (4B9) vide a Tabela 6
59 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-/?o/e (4B9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 7
60 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (4B9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 7
61 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-/?o/e (4B9) vide a Tabela 7
62 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (4B9) vide a Tabela 7
63 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?ote (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 22
64 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 22
65 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?ote (T84.66-LCHA) vide a Tabela 22
66 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (T84.66-LCHA) vide a Tabela 22
67 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-/?o/e (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 23
68 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 23
69 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-/?o/e (T84.66-LCHA) vide a Tabela 23
70 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (T84.66-LCHA) vide a Tabela 23
71 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?ote (A5B7) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 24
72 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada vide a Tabela 24
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SEQ ID NO: Nome Sequência
VH-knob (A5B7) (sequência nucleotídica)
73 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-bote (A5B7) vide a Tabela 24
74 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (A5B7) vide a Tabela 24
75 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-bo/e (A5B7) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 25
76 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (A5B7) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 25
77 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-bo/e (A5B7) vide a Tabela 25
78 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (A5B7) vide a Tabela 25
79 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VL-bo/e(T84.66LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 40
80 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VHknob(T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 40
81 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VL-bo/e (T84.66LCHA) vide a Tabela 40
82 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VH-knob (T84.66-LCHA) vide a Tabela 40
83 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-bo/e (T84.66LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 41
84 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 41
85 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VH-bo/e (T84.66LCHA) vide a Tabela 41
86 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (T84.66-LCHA) vide a Tabela 41
87 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VL-bo/e(A5B7) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 42
88 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VH-/mob(A5B7) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 42
89 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VL-bo/e (A5B7) vide a Tabela 42
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SEQ ID NO: Nome Sequência
90 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VH-knob (A5B7) vide a Tabela 42
91 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-bo/e (A5B7) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 43
92 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (A5B7) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 43
93 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-bo/e (A5B7) vide a Tabela 43
94 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (A5B7) vide a Tabela 43
95 FAP humana (hu) UniProt no. Q12884
96 ectodominio da FAP hu+poly-lystag+his6-tag RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPN WISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRT MKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSY TATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVG SKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIF NGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAE FNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNP VVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSW LTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDW QTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSY DAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGK WEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISI GSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYY ALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENA LKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSK KYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKE GMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVE DQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSL ALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFM GLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIH GTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYS DQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKK KKKKGHHHHHH
97 FAP murina UniProt no. P97321
98 ectodominio da FAP murina+poly-lys-tag+his6-tag RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPN WISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIILSNSTM KSVNATDYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTA TYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQYLCWSPVGSK LAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITYTGRENRIFNG IPDWVYEEEMLATKYALWWSPDGKFLAYVEFN DSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVV RVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYFSW LTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDW HAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFS QDATSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSG KWEAIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRI SIGNSPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKAK YYALVCYGPGLPISTLHDGRTDQEIQVLEENKEL ENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQF DRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLA
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 446/652
171/331
SEQ ID NO: Nome Sequência
SKEG IVIALVDG RGTAFQG DKFLHAVYRKLGVYE VEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGGYVS SLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERF MGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLI HGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWY SDQNHGILSGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDG KKKKKKGHHHHHH
99 ectodominio da FAP de cinomolgo+poly-lys-tag+his6-tag RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPN WISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRT MKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSY TATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVG SKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIF NGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAE FNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNP F VRI Fl IDTTYP AYVG PQ Ε V P V PAM I ASS D YYFSW LTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDW QTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSY DAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGK WEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISI GSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYY ALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENA LKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSK KYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKE GMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVE DQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSL ALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFM GLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIH GTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYS DQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKK KKKKGHHHHHH
100 CEA humane UniProt no. P06731
101 MCSP humane UniProt no. Q6UVK1
102 EGFR humane UniProt no. P00533
103 CD19 humane UniProt no. P15391
104 CD20 humane Uniprot no. P11836
105 CD33 humane UniProt no. P20138
106 4-1BB humane UniProt no. Q07011
107 4-1 BB murine UniProt no. P20334
108 4-1 BB de cinomolgo Uniprot no. F6W5G6
109 Ligante peptídico (G4S) GGGGS
110 Ligante peptídico (G4S)2 GGGGSGGGGS
111 Ligante peptídico (SG4)2 SGGGGSGGGG
112 Ligante peptídico G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
113 ligante peptídico GSPGSSSSGS
114 (G4S)s ligante peptídico GGGGSGGGGSGGGGS3
115 (G4S)4 ligante peptídico GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
116 ligante peptídico GSGSGSGS
117 ligante peptídico GSGSGNGS
118 ligante peptídico GGSGSGSG
119 ligante peptídico GGSGSG
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 447/652
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SEQ ID NO: Nome Sequência
120 ligante peptídico GGSG
121 ligante peptídico GGSGNGSG
122 ligante peptídico GGNGSGSG
123 ligante peptídico GGNGSG
124 VHCH1 (EE) 4-1 BB(20H4.9)- Cadeia pesada knob vide a Tabela 14
125 VLCH1 FAP (4B9)-Cadeia pesada hole vide a Tabela 14
126 VLCL(RK)-Cadeia leve 4-1BB (20H4.9) vide a Tabela 14
127 VHCL-Cadeia leve FAP(4B9) vide a Tabela 14
128 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-hole (DP47) vide a Tabela 17
129 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (DP47) vide a Tabela 17
130 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-bo/e (DP47) vide a Tabela 18
131 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (DP47) vide a Tabela 18
132 VHCH1 (MU137-1)-Cadeia Pesada VL-bo/e (28H1) vide a Tabela 19
133 VHCH1 (MU137-1)-Cadeia Pesada VH-knob (28H1) vide a Tabela 19
134 VLCL-Cadeia leve (MU137-1) vide a Tabela 19
135 VHCH1 (MU137-1)-Cadeia pesada Fc-DD-VH (28H1) vide a Tabela 20
136 VHCH1 (MU137-1)-Cadeia pesada Fc-KK-VL (28H1) vide a Tabela 20
137 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-bote (A5B7) (G4S)2 vide a Tabela 26
138 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-bo/e (A5B7) (G4S)2 vide a Tabela 27
139 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-bote (2B11) vide a Tabela 48
140 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (2B11) vide a Tabela 48
141 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-bo/e (2B11) vide a Tabela 49
142 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (2B11) vide a Tabela 49
143 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-bote (8B8-018) vide a Tabela 50
144 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (8B8-018) vide a Tabela 50
145 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-bo/e (8B8-018) vide a Tabela 51
146 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (8B8-018) vide a Tabela 51
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 448/652
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SEQ ID NO: Nome Sequência
147 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada Fc VL-bo/e (2B11) vide a Tabela 53
148 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada Fc knob-VH (2B11) vide a Tabela 53
149 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-bo/e (2B11) vide a Tabela 54
150 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (2B11) vide a Tabela 54
151 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada Fc VL-bo/e (8B8018) vide a Tabela 55
152 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada Fc knob-VH (8B8-018) vide a Tabela 55
153 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-bo/e (8B8018) vide a Tabela 56
154 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (8B8018) vide a Tabela 56
155 CD19 (8B8-2B11) CDR-H1 DYIMH
156 CD19 (8B8-2B11) CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG
157 CD19 (8B8-2B11) CDR-H3 GTYYYGPQLFDY
158 CD19 (8B8-2B11) CDR-L1 KSSQSLETSTGTTYLN
159 CD19 (8B8-2B11) CDR-L2 RVSKRFS
160 CD19 (8B8-2B11) CDR-L3 LQLLEDPYT
161 CD19 (8B8-2B11) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYI MHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKF QGRVTMTSDTSI ST A YM ELSRLRSD DT A V YYC A RGTYYYG PQLFD YWGQGTTVTVSS
162 CD19 (8B8-2B11) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTG TTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDP YTFGQGTKLEIK
163 CD19 (8B8-018) CDR-H1 DYIMH
164 CD19 (8B8-018) CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG
165 CD19 (8B8-018) CDR-H3 GTYYYGSALFDY
166 CD19 (8B8-018) CDR-L1 KSSQSLENPNGNTYLN
167 CD19 (8B8-018) CDR-L2 RVSKRFS
168 CD19 (8B8-018) CDR-L3 LQLTHVPYT
169 CD19 (8B8-018) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYI MHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKF QGRVTMTSDTSI ST A YM ELSRLRSD DT AV YYC A RGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS
170 CD19 (8B8-018) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNG NTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVP
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 449/652
174/331
SEQ ID NO: Nome Sequência
YTFGQGTKLEIK
171 4-1BB (MU137-1) CDR-H1 YFDMA
172 4-1BB (MU137-1) CDR-H2 SISPSGDIPYYRDSVKG
173 4-1BB (MU137-1) CDR-H3 RSYGGYSELDY
174 4-1BB (MU137-1) CDR-L1 QASQDIGNWLA
175 4-1 BB (MU137-1) CDR-L2 GTSSLAD
176 4-1 BB (MU137-1) CDR-L3 LQAYGAPWT
177 4-1BB (MU137-1) VH DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFD MAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVK GRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYCAR RSYGGYSELDYWGQGVMVTVSS
178 4-1BB (MU137-1) VL DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLA WYHQKPGKSPQLLIYGTSSLADGVPSRFSGSSS GSQYSLKISRLQVEDIGIYYCLQAYGAPWTFGG GTKLELK
179 CEA (A5B7P)- CDR-H1 DYYMN
180 CEA (A5B7P)- CDR-H2 FIGNKANGYTTEYSASVKG
181 CEA (A5B7P)- CDR-H3 DRGLRFYFDY
182 CEA (A5B7P)- CDR-L1 RASSSVTYIH
183 CEA (A5B7P)- CDR-L2 ATSNLAS
184 CEA (A5B7P)- CDR-L3 QHWSSKPPT
185 CEA (A5B7P) VH EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYY MNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSAS VKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCT RDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS
186 CEA (A5B7P) VL QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHW YQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGS GTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGG GTKLEIK
187 CEA (431/26)-CDR-H1 SGYSWH
188 CEA (431/26)-CDR-H2 YIQYSGITNYNPSLKS
189 CEA (431/26)-CDR-H3 EDYDYHWYFDV
190 CEA (431/26)-CDR-L1 STSSSVSYMH
191 CEA (431/26)-CDR-L2 STSNLAS
192 CEA (431/26)-CDR-L3 HQWSSYPT
193 CEA (431/26) VH QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTISSGY SWHWVRQPPGRGLEWIGYIQYSGITNYNPSLKS RVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARE DYDYHWYFDVWGQGSLVTVSS
194 CEA (431/26) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSTSSSVSYMH WYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGS GTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQWSSYPTFGQG TKVEIK
195 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?ote (A5B7P) vide a Tabela 28
196 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (A5B7P) vide a Tabela 28
197 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada vide a Tabela 29
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175/331
SEQ ID NO: Nome Sequência
VH-ho/e (A5B7P)
198 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (A5B7P) vide a Tabela 29
199 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-hote (431/26) vide a Tabela 30
200 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (431/26) vide a Tabela 30
201 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-ho/e (431/26) vide a Tabela 31
202 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (431/26) vide a Tabela 31
203 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VL-ho/e (A5B7P) vide a Tabela 44
204 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VH-/mob (A5B7P) vide a Tabela 44
205 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-ho/e (A5B7P) vide a Tabela 45
206 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VL-/mob (A5B7P) vide a Tabela 45
207 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VL-ho/e (431/26) vide a Tabela 46
208 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VH-knob (431/26) vide a Tabela 46
209 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VH-bo/e (431/26) vide a Tabela 47
210 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VL-knob (431/26) vide a Tabela 47
211 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knobCL (A5B7P) vide a Tabela 33
212 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada hole vide a Tabela 33
213 VLCH1-Cadeia leve (A5B7P) vide a Tabela 33
214 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knobCH (A5B7P) (muatações EE) vide a Tabela 34
215 VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada hole (muatações EE) vide a Tabela 34
216 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (muatações RK) vide a Tabela 34
217 VHCL-Cadeia leve (A5B7P) vide a Tabela 34
[0296] Todas as sequências de nucleotídeos são apresentadas sem as respectivas sequências de códon de parada.
Aspectos Da Invenção
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176/331 [0297] Os seguintes parágrafos numerados descrevem aspectos da presente invenção:
1. Uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
2. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica do parágrafo 1, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 41BB compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
3. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica dos parágrafos 1 ou 2, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar
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177/331 especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
4. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB é um fragmento Fab;
5. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer parágrafo de 1 a 4, em que o antígeno da célula alvo é selecionado a partir do grupo consistindo de proteína ativadora de fibroblastos (FAP), sulfato de condroitina proteoglicano associado ao melanoma (MCSP), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembrionário (CEA), CD19, CD20 e CD33;
6. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à proteína de ativação de fibroblastos (FAP);
7. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos 1 a 6, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) compreende, (a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de
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178/331 aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;
8. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) compreende, (a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo
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179/331 menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
9. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 8, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
10. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 8, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e
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180/331 (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;
11. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA);
12. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreende, (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a
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181/331 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 182, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 184, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191 e (vi) CDR-L3
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182/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192;
13. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 ou 11 ou 12, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% , 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência
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183/331 de aminoácidos de SEQ ID NO: 194;
14. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 ou 11 a 13, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;
15. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 ou 11 a 13, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de
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184/331
SEQ ID NO: 40;
16. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao C19;
17. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos 1 a 5 ou 16, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CD19 compreende;
(a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 e (vi) CDR-L3
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185/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168;
18. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 ou 16 ou 17, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% , 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170;
19. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 ou 16 a 18, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de
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186/331 aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162;
20. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 ou 16 a 18, em que;
(i) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao 4-1 BB compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (ii) o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CEA compreende uma região variável de cadeia pesada VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170;
21. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 20, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um domínio Fc de IgG, particularmente um domínio Fc de IgGi ou um domínio Fc de lgG4;
22. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 21, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituição de aminoácidos que reduz a ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica a um receptor de Fc e/ou a função efetora;
23. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 22, em que o domínio Fc é da subclasse IgGi humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G
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187/331 (numeração de acordo com o índece EU de Kabat);
24. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 23, em que o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio de Fc;
25. A molécula de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 24, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreender as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e a segunda subunidade do Fc domínio compreender as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat);
26. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 25, compreendendo;
mais de um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, em que cada domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB compreende;
uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
27. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 26, compreendendo;
(a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
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188/331 (b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável;
28. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 26, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é bivalente para 4-1 BB e monovalente para o antígeno da célula alvo;
29. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica dos parágrafos 1 a 26, compreendendo;
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL capazes de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das cadeias pesadas e o domínio VL está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da segunda cadeia pesada;
30. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica dos parágrafos 27 a 29, compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada
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189/331 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50;
31. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica dos parágrafos a 29, compreendendo;
(a) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou (b) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, ou (c) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, ou (d) duas cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78;
32. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 26, compreendendo;
(a) quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar
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190/331 especificamente ao 4-1 BB;
(b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
(c) um domínio Fc constituído por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável;
33. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 26 ou 32, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é tetravalente para 4-1 BB e monovalente para o antígeno da célula alvo;
34. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 26 ou 32 ou 33, em que os quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB são fragmentos Fab e cada dois destes estão fundidos entre si, opcionalmente por um ligante peptídico;
35. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 26 ou 32 a 34, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo compreende um domínio VH e VL, e em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico à extremidade C-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e o domínio VL está conectado por um ligante peptídico à extremidade C-terminal da segunda subunidade do domínio Fc;
36. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica dos parágrafos 32 a 35, compreendendo;
(a) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a
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191/331 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou (b) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62;
37. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica dos parágrafos 27 a 30, compreendendo;
(a) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou (b) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou (c) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou (d) quatro cadeias leves, cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94;
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38. Um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos 1 a 37;
39. Uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 37 e, pelo menos, um excipiente farmaceuticamente aceitável;
40. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 37, ou a composição farmacêutica do parágrafo 39, para uso como um medicamento;
41. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 37, ou a composição farmacêutica do parágrafo 39, para uso;
(i) na estimulação da resposta de células T, (ii) no suporte à sobrevivência de células T ativadas, (iii) no tratamento de infecções, (iv) no tratamento do câncer, (v) no atraso da progressão do câncer; ou (vi) no prolongamento da sobrevida de um paciente que sofre de câncer;
42. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 37, ou a composição farmacêutica do parágrafo 39, para uso no tratamento do câncer;
43. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 37, ou a composição farmacêutica do parágrafo 39, para uso no tratamento do câncer, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso na imunoterapia contra o câncer;
44. Um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade
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193/331 eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 37, ou a composição farmacêutica do parágrafo 39, para inibir o crescimento das células tumorais.
Exemplos [0298]A seguir são fornecidos exemplos de métodos e composições da presente invenção. Entende-se que diversas outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.
TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE [0299] Foram usados métodos padronizados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual’', Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes para a biologia molecular foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes. Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas de cadeias leve e pesada de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed., Publicação NIH Ns 91-3242.
Sequenciamento de DNA [0300]As sequências de DNA foram determinadas pelo sequenciamento de dupla-fita.
Síntese de Genes [0301]Segmentos de genes desejados foram gerados por PCR utilizando moldes adequados, ou foram sintetizados pela Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos da PCR por síntese gênica automatizada. Nos casos em que nenhuma sequência exata do gene estava disponível, os iniciadores (primers') de oligonucleotídeos foram desenvolvidos com base em sequências homólogas mais próximas e os genes foram isolados por meio da RT-PCR a partir do
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RNA proveniente de tecido apropriado. Os segmentos gênicos flanqueados por sítios de divagem por endonuclease de restrição únicos foram clonados em vetores de clonagem/sequenciamento convencionais. O DNA plasmidial foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração foi determinada por espectroscopia UV. A sequência de DNA dos fragmentos do gene subclonado foi confirmada pelo sequenciamento do DNA. Segmentos do gene foram concebidos com sítios de restrição apropriados para permitir a subclonagem nos respectivos vetores de expressão. Todas as construções foram concebidas com uma extremidade 5' na sequência de DNA codificante de um peptídeo líder, que direciona as proteínas para a secreção em células eucarióticas.
Purificação de Proteínas [0302] As proteínas foram purificadas a partir dos sobrenadantes de cultura celulares de acordo com protocolos estabelecidos. Resumidamente, os anticorpos foram submetidos a uma coluna Sepharose Proteína A (GE Healthcare) e lavados com PBS. A eluição dos anticorpos foi obtida em pH 2,8 seguido pela neutralização imediata da amostra. A proteína agregada foi separada a partir dos anticorpos monoméricos por cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em PBS ou em Histidina 20 mM, NaCI 150 mM pH 6,0. As frações de anticorpo monoméricas foram reunidas, concentradas (se necessário) usando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), congeladas e armazenadas a -20 SC ou -80 SC. Parte das amostras foi fornecida para a subsequente análise de proteínas e caracterização analítica, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) ou espectrometria de massa.
SDS-PAGE [0303] O sistema “NuPAGE® Pre-Cast gel system (Invitrogen)
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195/331 foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Especificamente, 10% ou 4-12% de gel “NuPAGE ® Novex ® Bis-TRIS Pre Cast-gel” (pH 6,4) e foi utilizado um “NuPAGE ® MES (géis reduzidos, com a adição de tampão de corrida antioxidante NuPAGE®) ou tampão de corrida MOPS (géis não reduzidos).
Cromatografia Analítica de Exclusão por Tamanho [0304]A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para a determinação da agregação e estado oligomérico de anticorpos foi realizada por cromatografia HPLC. Resumidamente, anticorpos purificados por Proteína A foram submetidos a uma coluna “Tosoh TSKgel G3000SW” em 300 mM de NaCI, 50 mM de KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 em um sistema de HPLC “Agilent 1100“ ou a uma coluna “Superdex 200’ (GE Healthcare) em PBS 2x em um sistema de HPLC “Dionex HPLC-System. A proteína eluída foi quantificada pela absorbância UV e integração das áreas de pico. O Padrão de filtração “BioRad Gel Filtration 151-1901 serviu como padrão.
Espectrometria De Massa [0305] Esta seção descreve a caracterização dos anticorpos multiespecíficos com troca VH/VL ou CH/CL (CrossMabs), com ênfase na sua montagem correta. As estruturas primárias esperadas foram analisadas por espectrometria de massa por ionização por eletropulverização (ESI-MS) dos CrossMabs intactos desglicosilados e desglicosilados/ digeridos com plasmina ou alternativamente CrossMabs desglicosilados/digeridos com LysC limitado.
[0306]Os CrossMabs foram desglicosilados com N-glicosidase F em um tampão fosfato ou Tris a 37 SC durante até 17 h, a uma concentração de proteína de 1 mg/mL. As digestões com plasmina ou LysC limitado (Roche) foram realizadas com 100 pg de CrossMabs VH/VL desglicosilados em um tampão Tris pH 8 à temperatura ambiente durante
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120 horas e a 37 SC durante 40 min, respectivamente. Antes de espectrometria de massa, as amostras foram dessalinizadas por meio de HPLC em uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa total desglicosilada foi determinada por meio de ESI-MS em um sistema maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) equipado com uma fonte TriVersa NanoMate (Advion).
Exemplo 1
Preparação, Purificação E Caracterização De Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Bivalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP
1.1 Geração de Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Bivalente Para 41 BB E Ligação Monovalente Para FAP [0307] Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB e ligação monovalente para FAP, também denominados 2+1, como representado nas Figuras 1A e 1B. A tecnologia knobs into bote foi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero.
[0308] Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1 do ligante anti-41 BB (clone 20H4.9), seguido por Fc com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido com a extremidade C-terminal um VL ou VH de um ligante anti-FAP. A segunda cadeia pesada HC2 era compreendida por VHCH1 de anti-4-1BB seguido por Fc hole, no qual foi fundido com o C-terminal de um VH ou VL, respectivamente, do ligante anti-FAP (clone 4B9). A geração e a preparação do ligante de FAP 4B9 estão descritas no documento WO 2012/020006 A2, que incorporado ao presente pela referência. Para o ligante de 4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas de acordo com a
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197/331 publicação US 7.288.638 B2 ou US 7.659.384 B2. A combinação das duas cadeias pesadas permite a geração de um heterodímero, que inclui uma porção de ligação à FAP e dois Fabs de ligação ao 4-1 BB (Figuras 1A e 1B).
[0309] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Publicado WO2012/130831A1.
[0310] Os anticorpos 2+1 anti-4-1 BB anti-FAP hulgGI P329GLALA biespecíficos foram produzidos pela cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando a polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada knob”:“vetor da cadeia leve”:“vetor da cadeia pesada hole).
[0311] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti-4-1 BB, anti-FAP com a-FAP VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 1.
Tabelai
Sequências Das Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas, Anti-41 BB Bivalente / Anti-FAP Monovalente, IgGi Humana P329GLALA (Construções Com a-FAP VL fundido Com A Cadeia Fc holee VH fundido Com A Cadeia Fc Knob, Denominada De VL-hole na Tabela 3 Abaixo)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
41 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VLhole (4B9 ) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGACTGCT gaagcctagcgagacactgagcctgacctgcgccgt gtacggcggcagcttcagcggctactactggtcctg gatcagacagagccccgagaagggcctggaatggat cggcgagatcaaccacggcggctacgtgacctacaa ccccagcctggaaagcagagtgaccatcagcgtgga CACCAG CAAGAACCAGTTCAG CCTGAAG CTGAG CAG CGTGACAGCCGCCGACACAGCCGTGTACTACTGCGC cagagattacggccctggcaactacgactggtacttc gacctgtggggcagaggcaccctcgtgaccgtgtct
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCCAG CAG CTTGG GCACCCAGACCTACATCTG C AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAG CTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAG GAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGA TCCGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACCCTG TCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGC AGAGCCTCCCAGTCCGTGACCTCCTCCTACCTCGCCT GGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGC TGATCAACGTGGGCAGTCGGAGAGCCACCGGCATCC CTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACT TCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACT TCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCATCATGCTGC CCCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCA AG
42 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VHknob (4B9 ) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGACTGCT GAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCAGACAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACAGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGATTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTC GACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTCGTGACCGTGTCT AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CCCTCCAG CAG CTTGG GCACCCAGACCTACATCTG C AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAG CTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCA AGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCA CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCC TGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGC AGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGA GCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGA GGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGG ATCTGAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACT GGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGC CGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAG CTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATG GGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTA CTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAG CCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGAT GAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTG GGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotidica) GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGTCT CTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGA GCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCTACCTGGCTTGGTAT CAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATC TACGACGCCAGCAACCGGGCCACCGGCATCCCTGCC AGAI I I ICTGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACC CTGACCATCAGCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCC GTGTACTACTGCCAGCAGCGGAGCAACTGGCCCCCT GCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAAATC AAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCC CGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTC TGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAG GCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA GCAAG GACAGCACCTACAG CCTCAG CAG CACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
44 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VLhole (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
yfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvv tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdktht cppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvv dvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyr vvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskak gqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdia vewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksr wqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsg gggsggggsggggseivltqspgtlslspgeratlsc rasqsvtssylawyqqkpgqaprllinvgsrratgipd rfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgimlpptfg qgtkveik
45 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob (4B9) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswi rqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgr gtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkd yfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvv tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdktht cppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvv dvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyr vvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskak gqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdia vewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksr wqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsg GGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASG FTFSSYAMSW VRQAPG KG LEW VSAIIGSG ASTYY adsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak gwfggfnywgqgtlvtvss
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqk pgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltissle pedfavyycqqrsnwppaltfgggtkveikrtvaapsv fifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdna lqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkv yacevthqglsspvtksfnrgec
[0312] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti-4-1 BB, anti-FAP com a-FAP VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido à cadeia pesada Fc hole encontram-se, respectivamente, na Tabela 2.
Tabela 2
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB bivalente / anti-FAP monovalente, IgGi humana P329GLALA (construções com a-FAP VH fundido com a cadeia Fc hole e VL fundido com a cadeia Fc
KNOB, DENOMINADAS DE ΜΗ-HOLE NA TABELA 3 ABAIXO)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
47 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VHhole (4B9) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCT GAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTT CGACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTC CAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCT GGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTC CTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTC CTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCA GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGG AGGAGGAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCG GAGGATCCGAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGA GGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCT TGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCC ATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACT GGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAG CACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCAC CATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCG TGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCA ACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCA GC
48 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (4B9) (sequência nucleotídica) AGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTG TACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGG ATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATC GGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAAC
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGAC ACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGC GTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCC AGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTC GACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCC AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCC AG C AG CTTGG GC ACCC AG ACCTAC ATCTG C AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAA CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGT CAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGAC CACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTT CCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTG GCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCT GAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAG GAGGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGT GGATCTGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACC CTGTCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCC TGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGACCTCCTCCTACCTC GCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCG GCTGCTGATCAACGTGGGCAGTCGGAGAGCCACCGG CATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCAC CGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGA GGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCATCAT GCTGCCCCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGA AATCAAG
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
49 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VHhole (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI rqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgr gtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvk dyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssv vtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkt htcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcv
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
50 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATG IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPP TFGQGTKVEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0313] Para a produção em frascos de 500 ml agitados, 400 milhões de células HEK293 EBNA foram semeadas 24 horas antes da transfecção. Para a transfecção, as células foram centrifugadas por 5 minutos a 210 x g e o sobrenadante foi substituído por meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD CHO para um valor final de 200 pg de DNA. Após a adição de 540 pl_ de PEI, a solução foi agitada em vortex durante 15 segundos e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 500 mL e incubadas durante 3 horas a 37SC em uma incubadora com atmosfera de CO2 a 5%. Após 0 tempo de incubação, 160 mL de meio F17 foram adicionados e as células foram cultivadas durante 24 horas. Um dia após a transfecção, 1 mM de ácido valpróico e 7% de Feed foram adicionados. Após uma cultura de 7 dias, 0 sobrenadante celular foi coletado por centrifugação
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204/331 durante 15 minutos a 210 x g. A solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 pm), suplementada com azida sódica para uma concentração final de 0,01% (p/v), e mantida a 4SC.
[0314] As proteínas secretadas foram purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando Proteína A, seguido pela cromatografia de exclusão por tamanho. Para a cromatografia por afinidade o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna HiTrap ProteinA HP (Volume de coluna = 5 mL, GE Healthcare), equilibrada com 40 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida pela lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de tampão contendo fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,5. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear de cloreto de sódio (0-500 mM) criado ao longo de 20 volumes de coluna de citrato de sódio 20 mM, 0,01% (v/v) de Tween-20, pH 3,0. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, 0,01% (v/v) de Tween-20, pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado pela adição de 1/40 (v/v) de 2M de Tris, pH 8,0. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HHoad Superdex 200 (GE Healthcare), equilibrada com MOPS 2 mM, cloreto de sódio 150 mM, solução a 0,02% (p/v) de azida sódica, pH 7,4. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HHoad Superdex 200 (GE Healthcare), equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de solução de cloreto de sódio, pH 6,0.
[0315] A concentração de proteína das construções biespecíficas purificadas foi determinada por medição da Densidade Óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor (Invitrogen, EUA) utilizando um instrumento LabChipGXII (Caliper). O teor
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205/331 agregado das amostras de construções biespecíficas foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão por tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPO4, 125 mM de NaCI, 200 mM de monocloridrato de L-arginina, 0,02% (p/v) de NaNa, tampão de corrida pH 6,7 a 25SC (Tabela 3).
Tabela 3
Análise Bioquímica De Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas
Com Ligação Bivalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP (2+1
4-1BB/FAP IgGi HUMANA P329GLALA)
Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
4-1 BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA lgG1 2+1 (VH-bo/e) 97,7 14 90
Preparação de Antígeno e Ferramenta de Triagem de 4-1 BB Fc (kih) humano [0316] As sequências de DNA que codificam 0 ectodomínio do 4-1 BB humano (sintetizado de acordo com Q07011) foram subclonadas in frame com os domínios de cadeia pesada CH2 e CH3 de lgG1 humana no knob. Um sítio de divagem pela protease AcTEV foi introduzido entre 0 ectodomínio do antígeno e a porção Fc de lgG1 humana. Um marcador Avi tag para a biotinilação dirigida foi introduzido na extremidade C-terminal do antígeno-Fc knob. A combinação antígeno-cadeia Fc knob contendo as mutações S354C/T366W, com uma cadeia Fc hole contendo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V permite a geração de um heterodímero que inclui uma única cópia do ectodomínio de 4-1 BB, criando assim uma forma monomérica de antígeno ligado ao Fc. A Tabela 4 exibe as sequências de cDNA e de aminoácidos das construções de fusão antígeno-Fc.
Tabela 4
Sequências de cDNA e de aminoácidos das moléculas de fusão de antígeno MONOMÉRICO FC fK/fí) (PRODUZIDAS PELA COMBINAÇÃO DE UMA CADEIA FC HOLE
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COM UMA CADEIA FC KNOB DE ANTÍGENO)
SEQ ID NO: Antígeno Sequência
51 Sequência nucleotídica da cadeia Fc hole GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCC C AG CCCCC ATCG AG AAAACC ATCTCC AAAG CC AAAG GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCC CATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCC TCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG ACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGA C AAG AG C AG GTG G C AG C AG G G G A ACG TCTTCTC ATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
52 Sequência nucleotídica da cadeia Fc knob antígeno 4-1 BB humano CTGCAGGACCCCTGCAGCAACTGCCCTGCCGGCACC TTCTGCGACAACAACCGGAACCAGATCTGCAGCCCCT GCCCCCCCAACAGCTTCAGCTCTGCCGGCGGACAGC GGACCTGCGACATCTGCAGACAGTGCAAGGGCGTGT TCAGAACCCGGAAAGAGTGCAGCAGCACCAGCAACG CCGAGTGCGACTGCACCCCCGGCTTCCATTGTCTGG GAGCCGGCTGCAGCATGTGCGAGCAGGACTGCAAGC AGGGCCAGGAACTGACCAAGAAGGGCTGCAAGGACT GCTGCTTCGGCACCTTCAACGACCAGAAGCGGGGCA TCTGCCGGCCCTGGACCAACTGTAGCCTGGACGGCA AGAGCGTGCTGGTCAACGGCACCAAAGAACGGGACG TCGTGTGCGGCCCCAGCCCTGCTGATCTGTCTCCTG GGGCCAGCAGCGTGACCCCTCCTGCCCCTGCCAGAG AGCCTGGCCACTCTCCTCAGGTCGACGAACAGTTATA TTTTCAGGGCGGCTCACCCAAATCTGCAGACAAAACT CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGG ATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAA CGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGA
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SEQ ID NO: Antígeno Sequência
G
53 cadeia Fc hole dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpev tcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqy nstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiekt iskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfy psdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvsklt vdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
54 cadeia Fc knob antígeno 4-1 BB humano lqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqr tcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgag csmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrp wtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassv tppaparepghspqvdeqlyfqggspksadkthtcpp cpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvs hedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvs vltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqp repqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavew esngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwq qgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksgglndife AQKIEWHE
1.2 Ligação de anticorpos biespecíficos bivalentes direcionados ao 4-1 BB e
MONOVALENTES PARA FAP (MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO 2+1)
1.2.1 Ressonância Plasmõnica de Superfície (ligação simultânea) [0317] A capacidade de se ligar simultaneamente a 4-1 BB Fc (kih) humano e FAP foi avaliada por ressonância plasmõnica de superfície (SPR). Todos os experimentos SPR foram realizados em um sistema Biacore T200 a 25SC com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, Tensoativo P20 a 0,005%, Biacore, Freiburg/Alemanha).
[0318] O 4-1 BB Fc (kih) humano biotinilado foi diretamente acoplado a uma célula de fluxo de um chip sensor de estreptavidina (SA). Foram utilizados níveis de imobilização de até 400 unidades de ressonância (RU). Os anticorpos biespecíficos direcionados contra 4-1 BB e FAP foram passados em um intervalo de concentração de 200 nM em uma velocidade de fluxo de 30 pL/minuto através das células de fluxo durante 90 segundos e a dissociação foi estabelecida em zero segundo. A FAP humana foi injetada como o segundo analito a uma velocidade de fluxo de 30 pL/minuto através das
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[0319] Todas as construções biespecíficas poderíam se ligar simultaneamente à FAP humana e ao 4-1 BB humano (Figura 2B).
1.2.2 Ligação ao 4-1 BB Humano - Ensaio Competitivo De Moléculas Bivalentes De Ligação Ao Antígeno Anti-4-1 BB [0320] Para confirmar a capacidade das nossas moléculas de ligação ao antígeno 2+1 anti-4-1 BB se ligarem ao 4-1 BB hu, um ensaio FRET baseado em células (TagLite) foi aplicado. Assim, 2500 células Hek293 EBNA/poço transfectadas com uma fusão hu4-1BB-SNAP e marcadas com o térbio doador FRET (Cisbio) e foram misturadas com 0,6 nM de anti-4-1 BB 20H4.9 marcado com o aceptor FRET d2 (Cisbio). Adicionalmente, foi adicionada uma diluição de concentração variando de 0,006-1000 nM dos anticorpos biespecíficos IgG não marcados (20H4.9) ou bivalentes (20H4.9/4B9 2+1) e incubados durante 2-4 horas à temperatura ambiente. O sinal fluorescente foi medido a 620 nm para o doador fluorescente (Térbio) e a 665 nm para o corante aceptor fluorescente (M100 Pro, Tecan). A proporção de 665/620*1000 foi calculada, e a referência (apenas células) foi subtraída. Para a determinação de EC50, os resultados foram analisados no programa Graph Pad Prismõ. Os valores de EC50 observados após 4 horas são mostrados na Tabela 5. A competição da molécula de ligação biespecífica 2+1 anti-4-1 BB e antígeno FAP (20H4.9/4B9 2+1) é como aquela observada para a IgG parental (Figura 3).
Tabela 5
Valores De ECso Para A Ligação Competitiva De Moléculas De Ligação Ao
Antígeno 4-1 BB Bivalentes
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Construção EC50 (nM)
20H4.9 IgG 1.5 (0.9-2.5)
4-1 BB(20H4.9)/ FAP(4B9) 2+1 1.6 (1.2-2.3)
Exemplo 2
Preparação, Purificação E Caracterização De Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Tetravalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP 2.1 Geração De Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Tetravalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP [0321] Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação tetravalente para 4-1 BB e ligação monovalente para FAP, também denominados 4+1, conforme representado nas Figuras 4A e 4B. A tecnologia knobs into hole foi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero.
[0322] Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1_VHCH1 do ligante anti-4-1 BB (clone 20H4.9), seguido por Fc hole com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido a extremidade C-terminal de um VL ou VH de um ligante anti-FAP (clone 4B9). A segunda cadeia pesada HC2 compreendia de VHCH1_VHCH1 de ligante anti-4-1 BB (clone 20H4.9), seguido por Fc com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido a extremidade C-terminal de um VH ou VL, respectivamente, de um ligante anti-FAP (clone 4B9). A geração e a preparação do ligante de FAP 4B9 estão descritas no documento WO 2012/020006 A2, que incorporado ao presente pela referência. Para o ligante de 4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas de acordo
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210/331 com a publicação US 7.288.638 B2 ou US 7.659.384 B2. A combinação das duas cadeias pesadas permite a geração de um heterodímero, que inclui uma porção de ligação à FAP e quatro Fabs de ligação ao 4-1 BB.
[0323] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Publicado WO2012/130831A1.
[0324] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas 4+1 anti-4-1BB anti-FAP hulgGI P329GLALA foram produzidas pela cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando a polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada knob”:“vetor da cadeia leve”:“vetor da cadeia pesada hole).
[0325] A molécula de ligação ao antígeno foi produzida e purificada como descrito para a molécula biespecífica anti-4-1BB bivalente e anti-FAP hulgGI P329GLALA (vide o Exemplo 1.1).
[0326] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1BB, anti-FAP com a-FAP VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 6. Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1BB, anti-FAP com a-FAP VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido à cadeia pesada Fc hole encontram-se, respectivamente, na Tabela 7.
Tabela 6
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB TETRAVALENTE / ANTI-FAP MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-FAP VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEE VH FUNDIDO COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
55 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?o/e(4B9) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGACTGCTGA AGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTAC GG CGG CAGCTTC AG CGG CTACTACTG GTCCTG G ATC AG ACAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAG ATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCCT GGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGA ACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCC GACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGATTACGGCCC TGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGGCAGAG GCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCTACCAAGGGC CCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCAC ATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAG GACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTC TGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGT CGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGAACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGC GGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGC TGCAGCAGTGGGGCGCTGGCCTGCTGAAACCCTCTGA GACTCTGTCCCTGACATGTGCTGTGTATGGCGGCTCCT TCTCCGGCTACTATTGGAGCTGGATTCGGCAGTCCCCT G AG AAAG G ACTG G AATG G ATTG GG G AAATC AATC ATGG GGGATATGTGACATACAATCCCTCACTGGAATCCCGCG TGACCATCTCCGTGGATACCTCTAAGAATCAGTTCTCTC TGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGATACCGCTGTG TATTACTGTGCCCGGGACTACGGACCCGGCAATTATGA TTGGTAI I I IGATCTGTGGGGACGGGGCACACTCGTGA CTGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA CCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAG TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGG TCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCT CGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCC ATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCT CGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATG AG GCTCTG C AC AACC ACTAC ACG C AG AAG AG CCTC TCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAG
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
GAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATC TGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACCCTGTCTC TGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGC CTCCCAGTCCGTGACCTCCTCCTACCTCGCCTGGTATC AGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCAA CGTGGGCAGTCGGAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGG TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAC CATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACT ACTG CC AG C AG GGC ATC ATG CTG CCCCCC ACCTTTGG C CAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
56 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (4B9) (sequência nucleotidica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGACTGCTGA AGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTAC GGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGATCAG ACAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAG ATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCCT GGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGA ACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCC GACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGATTACGGCCC TGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGGCAGAG GCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCTACCAAGGGC CCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCAC ATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAG GACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTC TGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCC GTG CTGC AG AG C AG CG GCCTGTACTCTCTG AGC AG CGT CGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGAACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGC GGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGC TGCAGCAGTGGGGCGCTGGCCTGCTGAAACCCTCTGA GACTCTGTCCCTGACATGTGCTGTGTATGGCGGCTCCT TCTCCGGCTACTATTGGAGCTGGATTCGGCAGTCCCCT G AG AAAG G ACTG G AATG G ATTG GG G AAATC AATC ATGG GGGATATGTGACATACAATCCCTCACTGGAATCCCGCG TGACCATCTCCGTGGATACCTCTAAGAATCAGTTCTCTC TGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGATACCGCTGTG TATTACTGTGCCCGGGACTACGGACCCGGCAATTATGA TTGGTAI I I IGATCTGTGGGGACGGGGCACACTCGTGA CTGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA CCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAG TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGG TCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCT
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCC CTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGT GGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACT ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAG CTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCC GGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCC TGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAG GAGGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAG GATCCGAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACT GGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCC GCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTG GGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTG TCCGCCATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGC CGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGAC AACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCT GCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAG GGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCA CCCTGGTCACCGTGTCCAGC
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
57 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?o/e (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ SPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSL klssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtlvtv ssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvt vswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgt QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQV QLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSP EKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKL ssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtlvtvss astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvs wnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqt YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW yvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlng keykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrde LTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSP gtlslspgeratlscrasqsvtssylawyqqkpgqaprl linvgsrratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyy cqqgimlpptfgqgtkveik
58 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knot> (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ SPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSL klssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtlvtv ssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvt vswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgt QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQV QLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSP EKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKL ssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtlvtvss
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDE LTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL R AE DTAV YYC AKG W FG G FN YWG QGTLVTVSS
46 VLCL-Cadeia (20H4.9) leve vide a Tabela 1
Tabela 7
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTES / ΑΝΤΙ-FAP MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-FAP VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEE VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA ΜΗ-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
59 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH-bo/e (4B9) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGACTGCTG AAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CAGACAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGC GAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCA GCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAG CAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACA GCCGCCGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGATT ACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCC ACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCA GCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGT CCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACAC CTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCT CTGTCCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAG AGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGA TCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCTGGCCTG CTGAAACCCTCTGAGACTCTGTCCCTGACATGTGCTGT GTATGGCGGCTCCTTCTCCGGCTACTATTGGAGCTGGA TTCGGCAGTCCCCTGAGAAAGGACTGGAATGGATTGG GGAAATCAATCATGGGGGATATGTGACATACAATCCCT CACTGGAATCCCGCGTGACCATCTCCGTGGATACCTCT AAGAATCAGTTCTCTCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGC CGCTGATACCGCTGTGTATTACTGTGCCCGGGACTACG GACCCGGCAATTATGATTGGTAI I I IGATCTGTGGGGA
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215/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
CGGGGCACACTCGTGACTGTGTCCTCTGCTAGCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCT TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA CCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAG TCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGA TCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCCGAG GTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAG CCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCG GCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCC ATCATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACA GCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAG CAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGG GCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGAT GGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCT GGTCACCGTGTCCAGC
60 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (4B9) (sequência nucleotidica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGACTGCTG AAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CAGACAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGC GAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCA GCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAG CAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACA GCCGCCGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGATT ACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCC ACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCA GCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGT CCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACAC CTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCT CTGTCCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGG
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAG AGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGA TCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCTGGCCTG CTGAAACCCTCTGAGACTCTGTCCCTGACATGTGCTGT GTATGGCGGCTCCTTCTCCGGCTACTATTGGAGCTGGA TTCGGCAGTCCCCTGAGAAAGGACTGGAATGGATTGG GGAAATCAATCATGGGGGATATGTGACATACAATCCCT CACTGGAATCCCGCGTGACCATCTCCGTGGATACCTCT AAGAATCAGTTCTCTCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGC CGCTGATACCGCTGTGTATTACTGTGCCCGGGACTACG GACCCGGCAATTATGATTGGTAI I I IGATCTGTGGGGA CGGGGCACACTCGTGACTGTGTCCTCTGCTAGCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCT TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA CCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGG TCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACC ACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCC TGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCA GCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCC TGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAG GATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTG AGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACCCTGTCTCT GAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCC TCCCAGTCCGTGACCTCCTCCTACCTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCAAC GTGGGCAGTCGGAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGT TCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAC CATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTAC TACTG CC AGC AGG GC ATC ATG CTG CCCCCC ACCTTTG GCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
61 VHCH1-VHCH1 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
(20H4.9)-Cadeia pesada VH-hole (4B9) QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQ GTLVTVSS
62 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLA WYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 8
Análise Bioquímica De Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas
Com Ligação Tetravalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP (4+1 4-1BB/FAP IgGi HUMANA P329GLALA)
Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
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Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
4-1 BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA lgG1 4+1 (VH-ho/e) 95,6 6 97,2
2.2 Ligação de anticorpos biespecíficos tetravalentes direcionados ao 4-
BB E MONOVALENTES PARA FAP (MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO 4+1)
2.2.1 Ressonância Plasmõnica de Superfície (ligação simultânea) [0327] A capacidade de se ligar simultaneamente a 4-1 BB Fc (kih) humano e FAP humana foi avaliada por ressonância plasmõnica de superfície (SPR). Todos os experimentos SPR foram realizados em um sistema Biacore T200 a 25SC com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, Tensoativo P20 a 0,005%, Biacore, Freiburg/Alemanha).
[0328] O 4-1 BB Fc (kih) humano biotinilado foi diretamente acoplado a uma célula de fluxo de um chip sensor de estreptavidina (SA). Foram utilizados níveis de imobilização de até 400 unidades de ressonância (RU). Os anticorpos biespecíficos direcionados contra 4-1 BB e FAP foram passados em um intervalo de concentração de 200 nM em uma velocidade de fluxo de 30 pL/minuto através das células de fluxo durante 90 segundos e a dissociação foi estabelecida em zero segundo. A FAP humana foi injetada como o segundo analito a uma velocidade de fluxo de 30 pL/minuto através das células de fluxo durante 90 segundos a uma concentração de 500 nM. A dissociação foi monitorada durante 120 segundos. As diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida em uma célula de fluxo de referência, onde nenhuma proteína foi imobilizada. Todas as construções biespecíficas poderíam se ligar simultaneamente à FAP humana e ao 4-1 BB humano (Figura 5B).
2.3 Ligação ao 4-1 BB humano - ensaio competitivo de construções anti-4-
BB BIVALENTES VS TETRAVALENTES.
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219/331 [0329] Para confirmar a capacidade de ligação de todos os quatro domínio FAb anti-4-1 BB ao 4-1 BB hu, um ensaio FRET baseado em células (TagLite) foi aplicado. Assim, 2500 células Hek293 EBNA/poço transfectadas com uma fusão hu4-1 BB-SNAP e marcadas com o térbio doador FRET (Cisbio) e foram misturadas com 0,6 nM de IgG anti-4-1 BB clone 20H4.9 marcado com o aceptor FRET d2 (Cisbio). Adicionalmente, foi adicionada uma diluição de concentração variando de 0,006-1000 nM das construções biespecíficas não marcadas de IgG anti-4-1-BB (20H4.9), bivalentes (20H4.9/4B9 2+1) ou tetravalentes (20H4.9/4B9 4+1), e as placas foram incubadas durante 2-4 horas à temperatura ambiente. O sinal fluorescente foi medido a 620 nm para o doador fluorescente (Térbio) e a 665 nm para o corante aceptor fluorescente (M100 Pro, Tecan). A proporção de 665/620*1000 foi calculada, e a referência (apenas células) foi subtraída. Para a determinação do valor de ECso, os resultados foram analisados no programa Graph Pad PrismS. Os valores de ECso observados após 4 horas são mostrados na Tabela 9. A molécula de ligação ao antígeno tetravalente 4+1 20H4.9 compete melhor que a contraparte IgG (Figura 6).
Tabela 9
Valores De ECso Para A Ligação Competitiva De Moléculas De Ligação Ao
Antígeno 4-1 BB Bivalentes vs. Tetravalentes
Molécula ECso [nM]
20H4.9 IgG 1,5 (0,9-2,4)
4-1 BB(20H4.9)/ FAP(4B9) 4+1 0,5 (0,3-0,7)
2.4 Ligação nas Células
2.4.1 Ligação às células humanas que expressam 4-1 BB: leucócitos
MONONUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO HUMANO (PBMCs) EM REPOUSO E ATIVADOS
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220/331 [0330] A expressão de 4-1 BB humano está ausente nas células T humanas em repouso (Naives) (Kienzle G. e von Kempis J (2000), Int. Immunol. 12(1):, 73-82, Wen T. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4897-4906). Após a ativação com anticorpo agonista anti-CD3 humano imobilizado, 4-1 BB é regulado positivamente em células T CD4+ e CD8+. A expressão de 4-1 BB também foi relatada em células NK humanas ativadas (Baessler T. et. al. (2010) Blood 115(15), 3058- 3069), células NKT ativadas humanas (Cole S.L. et al. (2014) J. Immunol. 192(8), 3898-3907), células B ativadas humanas (Zhang et al. (2010) J. Immunol. 184(2), 787-795), eosinófilos humanos ativados (Heinisch et al. 2001), constitutivamente em neutrófilos humanos (Heinisch I.V. (2000) J Allergy Clin Immunol. 108(1), 21- 28), monócitos humanos ativados (Langstein J.eí al. (1998) J Immunol. 160(5), 2488-2494, Kwajah M. e Schwarz H. (2010) Eur J Immunol. 40(7), 1938-1949), constitutivamente em células T humanas reguladoras (Bacher P. et al. (2014) Mucosal Immunol. 7(4), 916-928), células dendríticas foliculares humanas (Pauly S. et al. (2002) J Leukoc Biol. 72(1), 35-42), células dendríticas humanas ativadas (Zhang et al. (2004) Cell Mol Immunol. 1(1), 71-76) e em vasos sanguíneos de tumores humanos malignos (Broil K. et al. (2001) Am J Clin Pathol. 115(4), 543-549).
[0331] Para testar a ligação de nossos clones a células que expressam 4-1 BB humano naturalmente, foram usadas células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) em repouso ou pré-ativadas com PHAL/Proleucina e PBMC reativada com CD3/CD28. PBMCs da camada leucoplaquetária obtidas junto ao centro de doação de sangue de Zurique foram isoladas por centrifugação de densidade ficoll com o uso de Histopaque 1077 (SIGMA Life Science, Cat. ns 10771, polissacarose e diatrizoato de sódio, ajustada até uma densidade de 1.077 g/mL) e resuspensas em meio de células T consistindo em meio RPMI 1640 (Gibco, Life Technology, Cat. ns 42401-042)
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221/331 suplementado com soro bovino fetal 10% (SBF, Gibco, Life Technology, Cat. ns. 16000-044, Lote 941273, gama-irradiadas, livres de micoplasma e inativadas por calor a 56SC por 35 min.), 1% (v/v) GlutaMAX-l (GIBCO, Life Technologies, Cat ns 35050 038), piruvato de sódio 1 mM (SIGMA, Cat. No S8636), 1% (v/v) aminoácidos não essenciais MEM (SIGMA, Cat. ns M7145) e 50 μΜ de β- Mercaptoetanol (SIGMA, M3148). As PBMCs foram usadas diretamente após isolamento (células em repouso) ou estimuladas para induzir a expressão de 4-1 BB na superfície celular de células T por cultivo por 3 a 5 dias em meio de células T suplementado com 200 U/mL de Proleucina (Novartis Pharma Schweiz AG, CHCLB-P-476-700-10340) e 2 pg/mL de PHA-L (SIGMA Cat. ns L2769) em uma placa de cultura de tecidos com 6 poços e, em seguida, 2 dias em uma placa de cultura de tecidos com 6 poços revestida com 10 pg/mL de anti-CD3 humano (clone OKT3, BioLegend, Cat. ns 317315) e 2 pg/mL de anti-CD28 humano (clone CD28.2, BioLegend, Cat. ns: 302928) em meio de células T a 37SC e 5% de CO2.
[0332] Para determinar a ligação a 4-1 BB humano expresso por PBMCs humanas, 0,1 a 0,2 x 106 PBMCs recém isoladas, por exemplo, em repouso ou ativadas foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo (Greiner Bio-One, Cellstar, Cat. ns 650185) de células em suspensão. As placas foram centrifugadas durante 4 minutos a 400 x ga 4eC, e o sobrenadante foi descartado. As células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS e, em seguida, incubadas por 30 min. a 4°C com 100 pL/mL de DPBS contendo 1:5000 de de corante do kit de viabilidade celular ‘Fixable Viability Dye eFluor 660’ diluído (eBioscience, Cat. ns 64-0864-18). Posteriormente, as células foram lavadas uma vez com 200 pL/poço de tampão de FACS frio (DPBS suplementado com SBF 2% (v/v), EDTA 5 mM pH 8 (Amresco, Cat. ns E177) e azida sódica 7,5 mM (Sigma-Aldrich S2002)). Em seguida, 50 pL/poço de tampão de FACS frio 4SC contendo ligantes 4-1 BB anti-humano titulados
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222/331 foram adicionados e as células foram incubadas por 120 minutos a 4SC. As células foram lavadas quatro vezes com 200 pL/poço de tampão de FACS 4°C para remover moléculas não ligadas. Posteriormente, as células foram adicionalmente incubadas com 50 pL/poço de tampão de FACS frio 4°C contendo 2,5 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra específico para fragmento Fcy anti-lgG humana AffiniPure conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns. 109-116-098), anti-CD45 humano AF488 (clone HI30, BioLegend, Cat. n° 304019), 0,67 pg/mL de IgGlK de camundongo anti-CD3 humano conjugado a PerCP/Cy5.5 (clone LICHT1, BioLegend, Cat. n° 300430), 0,125 pg/mL de molgGlK anti-CD4 humano conjugado com BV421 (clone RPA-T4, BioLegend, Cat. n° 300532) ou 0,23 pg/mL de lgG2bK de camundongo anti-Cd4 humano conjugado com CD4BV421 (clone OKT4, BioLegend, Cat. ns 317434, 0,33 pg/mL de anti-CD8 human - BV510 (molgGlK, clone SK1, BioLegend, Cat n° 344732) e 0,67 pg/mL de anti-CD19 humano - PE/Cy7 (molgGlK, clone HIB19, BioLegend, Cat. ns 302216) e incubadas por 30 minutos a 4SC. As células foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de tampão de FACS e fixadas por resuspensão em 50 pL/poço de DPBS contendo formaldeído 1% (Sigma, HT501320-9.5L). As aquisições foram realizadas no mesmo dia ou no dia seguinte com o uso do 3-laser MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech). As janelas de análise (gates) foram definidas em células T CD8+ e CD4+ e a média geométrica da intensidade de fluorescência (MFI) do anticorpo de detecção secundário foi usada para analisar a ligação dos anticorpos primários. Com o uso do programa Graph Pad Prism (Software Graph Pad Inc.) os dados foram ajustados aos valore basais subtraindo-se os valores em branco (sem anticorpo primário adicionado) e os valores de ECso foram calculados com o uso do ajuste de curva de regressão não linear (ajuste robusto).
[0333] As células T CD4 e CD8 humanas carecem de expressão de 4-1 BB em um estado de repouso, mas regulam positivamente 4-1 BB após a
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223/331 ativação. As células T CD8+ humanas mostram uma regulação positiva mais forte do que as células T CD4+ sob as condições de ativação descritas. Os anticorpos anti-4-1BB humanos específicos gerados podem se ligar ao 4-1 BB humano expresso por células T humanas ativadas (Figuras 7C e D), enquanto que nenhuma ligação significativa pode ser detectada em células T CD4 e CD8 em repouso (Figuras 7A e B). A ligação é influenciada pelo nível de expressão de 4-1 BB das células, por exemplo, moléculas específicas para 4-1 BB se ligam mais fortemente às células T CD8+ ativadas (Figura 7D) do que às células T CD4+ ativadas (Figura 7C), e pelo formato, por exemplo, ligantes 4-1 BB bivalentes (formatos hulgG P329G LALA e 2+1) se ligam de forma diferente do ligante 4-1 BB tetravalente (formato 4+1). A ligação a 4-1 BB tetravalente leva a uma diminuição da MFI devido à menor afinidade de ligação para epítopos 41 BB-específicos. Nenhuma mudança é observada na ECso (listada na Tabela 10), presumivelmente devido à sensibilidade limitada relacionada ao método. O ensaio Taglite (Figura 6) é mais sensível (sem etapas de lavagem) e mostra claramente uma diferença nos valores de ECso entre a ligação ao 4-1 BB das moléculas bivalente e tetravalente.
[0334] Nas Figuras 8A e 8B são mostradas as áreas sob a curva (AUC). Uma clara reduo da ligação ao 4-1 BB pôde ser observada em células T CD8 ativadas pela seguinte ordem: 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA > 41 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 > 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1. A fusão de um domínio de ligação à FAP ao domínio Fc pode impedir a ligação do fragmento F(ab')2 de anticorpo policlonal de cabra AffiniPure anti-Fc de IgG humana específico conjugado com PE pelo mascaramento de epítopos e leva a uma detecção mais fraca. Isso pode explicar a queda da propriedade de ligação entre o 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA e 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1, apesar do fato de que ambas as moléculas exibem um lado de ligação ao 4-1 BB bivalente. As diferenças na AUC entre 4-1 BB (20H4.9) x FAP
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224/331 (4B9) 2+1 > 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 podem ser explicadas pela competição interna para epítopos 4-1 BB-específicos, conforme explicado acima.
Tabela 10
Valores De EC50 De Curvas De Ligação Para Células T CD4+ E Células T
CD8+ Humanas Ativadas Expressando 4-1 BB Determinados Por Citometria
De Fluxo.
4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1
ECso [nM] em células T CD4+ T ativadas 0,1 0,1 0,1
EC50 [nM] em células T CD8+ T ativadas 0,1 0,1 0,1
2.42 Ligação às células que expressam FAP humana [0335] Para ligação à Proteína de Ativação de Fibroblasto (FAP) humana expressa na superfície celular, foram utilizadas células NIH/3T3-huFAP clone 19, ou a linhagem de células celular de melanoma humano WM-266-4 (ATCC CRL- 1676). A linhagem NIH/3T3-huFAP clone 19 foi gerada por transfecção de células NIH/3T3 de fibroblasto embrionário de camundongo (ATCC CRL- 1658) com o plasmídeo de expressão pETR4921 que codifica a FAP humana sob um promotor de CMV. As células foram mantidas na presença de 1,5 pg/mL de puromicina (InvivoGen, Cat. N°: ant-pr-5). 2 x 105 células tumorais expressando FAP foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo (Greiner bio-one, Cellstar, Cat. ns.: 650185). As células foram lavadas uma vez com 200 pL de DPBS e os péletes foram resuspensos em 100 pL/poço com tampão DPBS frio a 4SC contendo corante Fixable Viability Dye eFluor 450 diluído 1:5000 (eBioscience, Cat. ns 65086318) ou Fixable Viability Dye eFluor 660 (eBioscience, Cat. ns 65-0864-18). As placas foram incubadas por 30 minutos a 4°C e lavadas uma vez com 200 pL de tampão DPBS frio DPS 4°C. Posteriormente, as células foram resuspensas em 50 pL/poço de tampão de
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FACS frio 4SC contendo diferentes concentrações tituladas de anticorpos específicos para 4-1 BB direcionadas à FAP e não direcionados, seguido por incubação por 1 hora a 4°C. Depois de lavar quatro vezes com 200 pL/poço, as células foram coradas com 50 pL/poço de tampão de FACS frio 4°C contendo 2,5 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IGg humana específico para fragmento Fcy AffiniPure conjugado a PE (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns. 109-116-098) ou 30 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IGg humana específico para fragmento Fcy AffiniPure conjugado a FITC (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns 109 096 098) por 30 minutos a 4SC. As células foram lavadas duas vezes com 200 pL de tampão de FACS 4°C e, em seguida, resuspensas em 50 pL/poço de DPBS contendo formaldeído 1% para fixação. O mesmo dia ou no dia seguinte, as células foram resuspensas em 100 pL com tampão de FACS e adquiridas com o uso de 5-laser LSR-Fortessa (BD Bioscience com o software DIVA) ou MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec).
[0336] Conforme mostrado na Figura 9, as moléculas direcionadas à FAP, mas não a molécula não direcionada a FAP, hulgGIo P293G LALA, se ligam eficientemente às células WM-266-4 que expressam FAP (Figura 9A) e células NIH/3T3-huFAP clone 19 (Figura 9B). Portanto, a inclusão de um sítio de ligação a FAP induz um efeito de direcionamento eficiente para células que expressam FAP humana. Os valores de ECso das curvas de ligação, bem como os valores sob as curvas, estão listados na Tabela 11.
Tabela 11
Valores De ECso E Valores Da Área Sob A Curva (AUC) Da Ligação À Linhagem De Células Expressando FAP, NIH/3T3-Hufap Clone 19 E WM266-4
4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1
EC50 WM-266-4 [nM] 1,6 0,7
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4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1
EC50 NIH/3T3-huFAP clone 19 [nM] 2 1,7
AUC WM-266-4 4565 5424
AUC NIH/3T3-huFAP clone 19 6793 8024
2.5 Ativação de NFkB
2.5.1 Geração de células HeLa que expressam 4-1 BB humano e NFkBLUCIFERASE [0337] A linhagem de células de carcinoma do colo do útero HeLa (ATCC CCL-2) foi transduzida com um plasmídeo baseado no vetor de expressão pETR10829, que contém a sequência do 4-1 BB humano (UniProt Q07011) sob o controle de um promotor CMV e um gene que confere resistência à puromicina. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de SBF, 1% (v/v), GlutaMAX-l e 3 pg/mL de puromicina. As células HeLa transduzidas com 4-1 BB foram testadas para a expressão de 4-1 BB por citometria de fluxo: 0,2x106 células vivas foram resuspensas em 100 pL de tampão FACS contendo 0,1 pg de IgGlK de camundongo clone anti-4B4-1 humano conjugado PerCP/Cy5.5 (BioLegend Cat. ns.309814) ou seu controle (anticorpo clone MOPC21 de controle isotípico IgGlK de camundongo conjugado PerCP/Cy5.5, BioLegend Cat. n°: 400150) e incubadas durante 30 minutos a 4 SC. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS, resuspensas em 300 de tampão FACS contendo 0,06 pg de DAPI (Santa Cruz Biotec, Cat. ns. sc-3598) e os resultados foram adquiridos utilizando um analisador 5-laser LSR-Fortessa (BD Bioscience, software DIVA). Diluições limitadas foram realizadas para gerar clones isolados conforme descrito: células HeLa transduzidas com 4-1 BB humano foram resuspensas em meio a uma densidade de 10, 5 e 2,5 células/mL e 200 pL das suspensões de células foram transferidas para placas de 96 poços de fundo
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227/331 redondo (6 placas/concentração de células, TPP Cat. ns:. 92697). Os clones individuais foram coletados, expandidos e testados quanto a expressão de 41 BB, tal como descrito acima. O clone com a expressão mais elevada de 41 BB (clone 5) foi escolhido para a transfecção subsequente com o vetor de expressão 5495p tranlucent hygB da ΝΡκΒ-luciferase. O vetor confere às células transfectadas resistência à higromicina B e capacidade de expressarem luciferase sob controle do elemento de resposta de NFkB (Panomics, Cat. n°. LR0051). Para a trasnfecção, foram cultivadas células HeLa - 4-1 BB humano clone 5 até uma confluência de 70%. 50 pg (40 pL) de vetor de expressão 5495p tranlucent hygB linearizado (enzimas de restrição /Asei e SaU) foram adicionados a uma cuveta Gene Pulser/MicroPulser de 0,4 cm estéril (Biorad, Cat. 165-2081). 2,5x106 células HeLa clone 5 4-1 BB humano foram adicionadas em 400 pL de meio DMEM sem suplemento e elas foram cuidadosamente misturadas com a solução de plasmídeo. A transfecção das células foi realizada usando um sistema Gene Pulser Xcell total (Biorad, Cat 1652660) sob as seguintes configurações: pulso exponencial, capacitância de 500 pF, tensão de 160 V, resistência oo. Imediatamente após a transfecção por pulso as células foram transferidas para um frasco de cultura de 75 cm2 (TPP, Cat. ns. 90075) com 15 mL de meio DMEM aquecido à 37SC (Gibco, Life Technologies Cat. ns. 42430-025) suplementado com 10% de SBF e 1% de GlutaMAX-l. No dia seguinte, foi adicionado meio de cultura contendo 3 pg/mL de puromicina e 200 pg/ml Higromicina B (Roche, Cat. η0:. 10843555001). As células sobreviventes foram expandidas e diluição limitada foi realizada como descrito acima para gerar clones isolados.
[0338] Os clones foram testados quanto à expressão de 4-1 BB, tal como descrito acima e para a atividade da NFkB -luciferase da seguinte forma: Os clones foram coletados em meio de seleção e contados utilizando um contador celular Cell Counter Vi-cell xr 2.03 (Beckman Coulter, Cat. ns:.
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731050). As células foram ajustadas para uma densidade celular de 0,33 x 106 células/mL e 150 pL desta suspensão de células foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de tecido de fundo plano de 96 poços branca estéril com tampa (Greiner Bio One, Cat. ns 655083). As células foram incubadas a 37SC e 5% de CO2 durante a noite em uma incubadora de células (Hera Cell). No dia seguinte, 50 pl_ de meio contendo diferentes concentrações de fator de necrose de tumoral alfa humano recombinante (rhTNF-a, PeproTech, Cat. ns. 300-01 A) foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços resultando em uma concentração final de rhTNF-α de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 0 ng/poço. As células foram incubadas durante 6 horas a 37QC e 5% de CO2 e, em seguida, as células foram lavada três vezes com 200 pL/poço de DPBS. O tampão de lise repórter Reporter Lysis Buffer (Promega, Cat No: E3971) foi adicionado a cada poço (40 μΙ_) e as placas foram armazenadas durante a noite a -20 SC. No dia seguinte as células congeladas e 0 tampão de Detecção (Luciferase 1000 Assay System, Promega, Cat. ns. E4550) foram descongelados em temperatura ambiente. 100 pl_ de tampão de detecção foram adicionados a cada poço e a placa foi medida 0 mais rápido possível, utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M5/M5E e 0 software SoftMax Pro (Molecular Devices). Unidades de luz liberada mensuradas para 500 ms/poço (URLs) acima do controle (sem adição de rhTNF-α) foram tomadas como a atividade de luciferase. A HeLa-hu4-4-1 BB-NF-kB-Iuc clone 26 exibindo a maior atividade de luciferase e um nível considerável de expressão de 4-1 BB foi escolhida para posterior utilização.
2.5.2 Ativação NFkB Em Células HeLa Repórteres Que Expressam 4-1 BB Humano E Luciferase Cocultivadas Com Células Tumorais Que Expressam FAP [0339] Células HeLa-hu4-1 BB-NF-kB-Iuc clone 26 foram coletadas e novamente resuspensas em meio DMEM, suplementado com 10% (v/v) de
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SBF e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 0,2 x 106 células/mL. 100 μΙ_ (2 x 104 células) desta suspensão de células foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de tecido estéril 96 poços de fundo branco plano com tampa (Greiner bio-one, Cat. No. 655083) e a placa foi incubada a 37 SC e 5% de CO2 durante a noite. No dia seguinte, foram adicionados 50 μΙ_ de meio contendo construções anti-4-1BB humano direcionadas à FAP tituladas ou seus anticorpos P329G LALA hulgGI parentais. Células NIH/3T3-huFAP clone 19 ou WM-266-4 expressando FAP foram resuspensas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de SBF e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 2 x 106 células/mL.
[0340] A suspensão de células tumorais que expressam FAP (50 μΙ_) ou o meio usado como controle negativo foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas por 6 horas a 37SC e 5% de CO2 na incubadora de células. As células foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de DPBS. 40 μΙ_ de Tampão de Lise recém preparado (Promega, Cat ns: E3971) foram adicionados a cada poço e a placa foi armazenada durante a noite a -20sC. No dia seguinte as placas de células congeladas e 0 tampão de Detecção (Luciferase 1000 Assay System, Promega, Cat. ns. E4550) foram descongelados em temperatura ambiente. 100 μΙ_ de tampão de detecção foram adicionados a atividade da luciferase foi medida 0 mais rápido possível utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M5/M5E e 0 software SoftMax Pro (Molecular Devices).
[0341] Na Figura 10 é mostrada a propriedade de ativação de diferentes construções específicas para 4-1 BB direcionadas à FAP utilizando a linhagem de célula repórter que expressa 4-1 BB. Na Figura 10A a propriedade de ativação na ausência da FAP é mostrada. Apenas a molécula 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 (quadrado cinza preenchido) contendo os sítios de ligação ao 4-1 BB tetravalentes pode induzir uma forte ativação. As moléculas,
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230/331 contendo apenas um sítio de ligação 4-1 BB bivalente, não induzem esta ativação forte, demonstrando que a ativação de 4-1 BB depende de uma forte reticulação às moléculas 4-1 BB na superfie da célula efetora. Nos blots seguintes as células tumorais expressando FAP foram adicionadas na forma de linhagem de células de melanoma humano WM-266-4 que expressam um nível intermediário de FAP (Figura 10B) ou a linhagem de células de fibrossoma de camundongo NIH/3T3 transfectada para expressar níveis elevados de FAP humana (Figura 10C). Assim que as moléculas direcionadas à FAP são reticuladas através destas células tumorais expressando FAP, os sítios de ligação 4-1 BB levam a uma forte reticulação de 4-1 BB na superfície da linhagem de células repórter e induzem uma forte ativação da expressão de Luciferase mediada por NFkB. Independente da fração dos sítios de ligação de 4-1 BB, a ativação de 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 e 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 é bastante similar. A única diferença óbvia entre os formatos 2+1 e 4+1 é observada na ausência de células tumorais que expressam FAP. A área de ajuste sob a curva (AUC) é mostrada na Figura 11 e os valores de ECso estão listados na Tabela 12.
Tabela 12
Valores de ECso Da Ativação Da Via De Sinalização NFkB Na Presença De
Células Que Expressam FAP
ECso [nM] 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1
Sem Células FAP+ 1,07 0,73 0,13
WM-266-4 0,64 0,08 0,05
3T3-huFAP 2,17 0,07 0,04
2.6 Ensaio De Ativação De PBMCs Humanas Na Presença De Células Que Expressam FAP [0342] A reticulação mediada por ligação FAP do ligante 4-1 BB
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231/331 agonista 20H4.9 foi utilizada na linhagem de células aderentes NIH/3T3-huFAP clone 19 expressando FAP. As células NIH/3T3-huFAP clone 19 aderentes foram lavadas com DPBS (Gibco, Life Technologies, Cat. ns 14190326) e tratadas com tampão de dissociação celular baseado em PBS, isento de enzimas (Gibco, Life Technologies, Cat. ns. 13151-014) durante 10 minutos a 37 SC. As células foram coletadas e resuspensas em meio de células T consistindo de RPMI 1640 (GIBCO, Life Technologies, Cat. No. 42401-042) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF, origem EUA, PAN biotech, P30-2009, Lote P150307GI, gama-irradiado e isento de micoplasma, inativado por calor 35 min. a 56SC), 1% de L-GlutaMAX-l (GIBCO, Life Technologies, No. Cat. 35050-038), 1 mM de piruvato de sódio (SIGMA-Aldrich, Cat.-No S8636), 1% de Solução de Aminoácidos não essenciais MEM (SIGMA-Aldrich, Cat.- N ° M7145), 50 pM de p-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, Cat. ns M3148) e irradiada com 50 Gy (X- Ray Irradiator RS 2000, fonte Rad). 2 x 104 células NIH/3T3huFAP clone 19 em 50 pL de meio de células T foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços de cultura de tecidos de fundo redondo (TTP, Cat. No. 92697). Foram adicionados 50 pL de meio de células T contendo diferentes concentrações tituladas de 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA, 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1, 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 ou moléculas de controle 4-1 BB (12B3) x FAP (4B9) 4+1 (como descrito no pedido de patente PCT/EP2016/073198) e DP47 hulgGI P329G LALA, respectivamente. As PBMCs humanas foram marcadas em DPBS aquecido a 37 SC contendo 40 nM de CFDA-SE (SIGMA-Aldrich, ns de Catálogo 21888-25MG-F) durante 15 min. a 37SC. A marcação com CFSE foi interrompida pela adição de SBF, as PBMCs foram lavadas por duas vezes e resuspensas em meio de células T a uma concentração final de 1,5 x 106 células/mL. 50 pL desta solução de células PBMCs foram semeadas em cada poço para adicionar 7,5 x 104 PBMCs marcadas com CFSE. Por último, a solução estoque de meio de células T
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232/331 contendo 2 mM de IgGi humana agonista anti-CD3 humano clone V9 foi preparada e 50 pL/poço foram adicionados a cada poço originando uma concentração final de 0,5 mM de IgG 1 humana anti-CD3 humano clone V9.
[0343] As placas foram incubadas por 4 dias a 37SC. As células foram lavadas com DPBS e coradas com 100 pL/poço de DPBS contendo o kit de coloração LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit em uma diluição de 1:1000 (Molecular Probes, Life Technology, Cat- ns L34957) durante 30 min. a 4 SC. As células foram lavadas uma vez com 200 pL/poço DPBS e coradas com 50 pL de tampão FACS (DPBS suplementado com 2% de SBF, 5 mM de EDTA pH 8 (Amresco, Cat. Ns E177) e 7,5 mM de azida de sódica (Sigma-Aldrich S2002)) contendo 0,1 mg/mL de lgG1 de camundongo anti-CD137 humano conjugado com CyCP-Cy5.5 (clone 4B4-1, BioLegend, Cat. No. 309814), 0,1 mg/mL de lgG1k de camundongo anti-PD/1 humano conjugado com PE/Cy7 (clone EH12.2H7, BioLegend, 329918), 0,03 pg/mL IgGi de camundongo anti-CD25 humano conjugado com APC (clone BC96, BioLegend, Cat. No. 302610), 0,06 pg/mL IgGlK de camundongo anti-CD8 humano conjugado com APC/Cy7 (clone RPA-T8, BioLegend, Cat. 3301016), IgGi de camundongo anti-CD4 humano conjugado com BV421 (clone RPA-T4, BioLegend, Cat. No. 300532) durante 30 min. a 4SC. As células foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de DPBS e incubadas por 30 min. a 4SC com 50 pL/poço de tampão FoxP3 Perm/Fix recémpreparado (eBioscience Cat. No. 00-5123). As células foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de DPBS, resuspensas em 50 pL/poço de tampão Perm recém preparado (eBioscience Cat. No. 00-8333) fornecido com Ac IgGlK de camundongo anti-Granzima B humana diluído 1:250 conjugado com PE (clone GB11, Lot 4269803, BD Pharmingen, Cat. No. 561142) e incubadas durante 1 h a 4SC. As placas foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de DPBS e as células foram fixadas durante 15 min. com DPBS contendo formaldeído a 1% (Sigma, HT501320-9.5 L). As células foram resuspensas em tampão FACS de 100
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233/331 pL/poço e adquiridas utilizando o MACS Quant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech). Os dados foram analisados usando FlowJo V10 (FlowJo, LLC) e GraphPad Prism 6.04 (GraphPad Software, Inc).
[0344] Conforme exibido na Figura 12, as moléculas de ligação ao antígeno 4-1 BB (20H4.9) 2+1 e 4+1 agonísticas direcionadas à FAP são capazes de induzir a regulação positiva de CD25 bem como a proliferação melhorada de células T CD4 e CD8 na presença de um estímulo CD3 subótimo. Ambas as moléculas mostram melhores efeitos do que a molécula 4-1 BB (12B3) x FAP (4B9) 4+1, que foi adicionada como controle positivo e foi descrita anteriormente no pedido de patente PCT PCT/EP2016/073198. Portanto, na presença de células que expressam FAP e estímulo TCR subótimo, um agonista 4-1 BB (20H4.9) direcionado à FAP pode induzir a ativação e proliferação de células T independente de seu formato, por exemplo, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica 4+1 não é mais eficiente que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica 2+1.
[0345] Na Figura 13 são mostrados os valores da área sob a curva (AUC) das curvas da Figura 12. Como ativação basal, é mostrada a AUC da molécula de controle (DP47 hulgGI P329G LALA não direcionado). Os valores de ajuste de ECso estão listados na Tabela 13.
Tabela 13
Valores de ECso das Curvas de Ativação de PBMCs Humanas
ECso [nM] hulgGI 4-1 BB (20H4.9) P329G LALA 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 2+1 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 4+1 4-1 BB (12B3) x FAP (4B9) 4+1
% CD25+ CD4 0,1 0,005 0,006 0,009
% CD25+ CD8 n.d. 0,02 0,009 0,012
% CD4 em proliferação 0,07 0,004 0,003 0,008
% CD8 em proliferação n.d. 0,001 0,002 0,0001
Exemplo 3
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Preparação, Purificação E Caracterização De Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Monovalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP
3.1 Geração de anticorpos biespecíficos com ligação monovalente para 41 BB E LIGAÇÃO MONOVALENTE PARA FAP [0346] Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação monovalente para 4-1 BB e ligação monovalente para FAP, também denominados 1+1, conforme representado na Figura 1C. A tecnologia knobs into ho/efoi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero.Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1 de um anti-4-1 BB (clone 20H4.9) seguido por Fc knob. A segunda cadeia pesada HC2 compreendia de VLCH1 of anti-FAP (clone 4B9) seguida por Fc hole. Para melhorar o pareamento correto as seguintes mutações (variantes carregadas) foram introduzidas no CH-CL da anti-4-1 BB (cadeia Fc knob)·. E123R e Q124K na CL e K147E e K213E na CH1. Para o ligante 4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas da Patente US7659384 (B2). A combinação de Fc knob com a cadeia Fc hole permitiu a geração de um heterodímero, que inclui um Fab de ligação à FAP e um Fab de ligação ao 4-1 BB.
[0347] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Internacional Publicado WO2012/130831A1.
[0348] As sequências de aminoácidos para 1+1 anti-4-1 BB, antiFAP hulgGI PGLALA podem ser encontradas na Tabela 14.
Tabela 14
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Sequências De Moléculas De Ligação Ao Antígeno, Biespecíficas, Anti-41 BB/monovalente - Anti-FAP humana IgG1 P329GLALA
SEQ ID NO: Descrição Sequência
124 VHCH1(EE) 4- 1 BB(20H4.9)-Cadeia pesada knob qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswir qspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtsknqf slklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtl vtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpss slgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcp apeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshed pevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvl hqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqv ytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqp ennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscs vmhealhnhytqkslslspgk
125 VLCH1 FAP (4B9)- Cadeia pesada hole EI vltqspgtlslspg e ratlscrasqsvtssylaw yqqk pgqaprllinvgsrratgipdrfsgsgsgtdftltisrlep edfavyycqqgimlpptfgqgtkveikssastkgpsvfpl apsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgv htfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps ntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppk pkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvs nkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvs lscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgs fflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksls LSPGK
126 VLCL(RK)-Cadeia leve 4-1 BB (20H4.9) EI vltqspatlslspg e ratlscrasqsvssylaw yqqkp gqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepe dfavyycqqrsnwppaltfgggtkveikrtvaapsvfifp psdrklksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsg nsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevt hqglsspvtksfnrgec
127 VHCL-Cadeia leve FAP(4B9) evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvr qapgkglewvsaiigsgastyyadsvkgrftisrdnsknt lylqmnslraedtavyycakgwfggfnywgqgtlvtvs sasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakv qwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskad yekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0349] A construção biespecífica 1+1 anti-4-1BB anti-FAP hulgGi
PGLALA foi produzida por cotransfecção de células CHO-K1 cultivadas em suspensão com os vetores de expressão em mamíferos usando eviFect (Evitria AG). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção de 1:1:1:1 (“vetor de cadeia pesada de Fc knob : “vetor de cadeia pesada hole’’ : “vetor de cadeia leve 1” : “vetor de cadeia leve 2”).
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236/331 [0350] Para a transfecção as células CHO-K1 são cultivadas em suspensão em meio de cultura eviMake (Evitria AG) sem soro. Depois de 7 dias a 37SC em uma incubadora em ambiente de 5% de CO2, 0 sobrenadante do cultivo é coletado para purificação por centrifugação e a solução é esterilizada por filtração (filtro de 0,22 mm) e mantida a 4 °C.
[0351] As proteínas secretadas foram purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando Proteína A, seguido pela cromatografia de exclusão por tamanho. Para a cromatografia por afinidade 0 sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de Proteína A MabSelectSure (Volume de coluna (CV) = 5 mL, GE Healthcare), equilibrada com 40 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida pela lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de fosfato de sódio 20 mM, tampão contendo citrato de sódio a 20 mM, pH 7,5. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear de cloreto de sódio (a 20 a 100 mM) criado ao longo de 15 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado pela adição de 1/40 (v/v) de 2M de Tris, pH 8,0. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HHoad Superdex 16/600 S200 (GE Healthcare), equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCI, pH 6,0.
[0352] A concentração de proteína das construções biespecíficas purificadas foi determinada por medição da Densidade Óptica (OD) a 280 nm, utilizando 0 coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e 0 peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor (Invitrogen, EUA) utilizando um instrumento LabChipGXII (Caliper). O teor
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237/331 agregado das construções biespecíficas foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão por tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPO4, 125 mM de NaCI, 200 mM de monocloridrato de Larginina, 0,02% (p/v) de NaNa, tampão de corrida pH 6,7 a 25SC.
Tabela 15
Análise Bioquímica De Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas Com Ligação Monovalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP (1+1 4-1BB/FAP IgGi HUMANA P329GLALA)
Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
4-1 BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA lgG1 1+1 99 120 99
3.2 Caracterização In Vitro Funcional: Capacidade De Induzir A Ativação
De NFkB Via Ligação Simultânea De 4-1 BB E FAP
3.2.1 Geração de células HeLa que expressam 4-1 BB humano e NFkBLUCIFERASE [0353] A linhagem de células de carcinoma do colo do útero HeLa (ATCC CCL-2) foi transduzida com um plasmídeo baseado no vetor de expressão pETR10829, que contém a sequência do 4-1 BB humano (UniProt Q07011) sob 0 controle de um promotor CMV e um gene que confere resistência à puromicina. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de SBF, 1% (v/v), GlutaMAX-l e 3 pg/mL de puromicina.
[0354] As células HeLa transduzidas com 4-1 BB foram testadas para a expressão de 4-1 BB por citometria de fluxo: 0,2x106 células vivas foram resuspensas em 100 pL de tampão FACS contendo 0,1 pg de IgGlK de camundongo clone anti-4B4-1 humano conjugado PerCP/Cy5.5 (BioLegend Cat. ns.309814) ou seu controle (anticorpo clone MOPC21 de controle isotípico IgGlK de camundongo conjugado PerCP/Cy5.5, BioLegend Cat. n°: 400150) e
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238/331 incubadas durante 30 minutos a 4 SC . As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS, resuspensas em 300 de tampão FACS contendo 0,06 pg de DAPI (Santa Cruz Biotec, Cat. ns. sc-3598) e os resultados foram adquiridos utilizando um analisador 5-laser LSR-Fortessa (BD Bioscience, software DIVA). Diluições limitadas foram realizadas para gerar clones isolados conforme descrito: As células HeLa transduzidas com 4-1 BB humano foram resuspensas em meio a uma densidade de 10, 5 e 2,5 células/mL e 200 pL das suspensões de células foram transferidas para placas de 96 poços de fundo redondo (6 placas/concentração de células, TPP Cat. ns:. 92697). Os clones individuais foram coletados, expandidos e testados quanto a expressão de 41 BB, tal como descrito acima. O clone com a expressão mais elevada de 41 BB (clone 5) foi escolhido para a transfecção subsequente com o vetor de expressão 5495p tranlucent hygB da NF-KB-luciferase. O vetor confere às células transfectadas resistência à higromicina B e capacidade de expressarem luciferase sob controle do elemento de resposta de NFkB (Panomics, Cat. n°. LR0051). Para a transfecção. as células HeLa clone 5 4-1 BB Humano foram cultivadas até uma confluência de 70%. 50 pg (40 pL) de vetor de expressão 5495p tranlucent hygB linearizado (enzimas de restrição Asei e SaU) foram adicionados a uma cuveta Gene Pulser/MicroPulser de 0,4 cm estéril (Biorad, Cat. 165-2081). 2,5x106 células HeLa clone 5 4-1 BB humano foram adicionadas em 400 pL de meio DMEM sem suplemento e elas foram cuidadosamente misturadas com a solução de plasmídeo. A transfecção das células foi realizada usando um sistema Gene Pulser Xcell total (Biorad, Cat 1652660) sob as seguintes configurações: pulso exponencial, capacitância de 500 pF, tensão de 160 V, resistência não limitada. Imediatamente após a transfecção por pulso as células foram transferidas para um frasco de cultura de 75 cm2 (TPP, Cat. ns. 90075) com 15 mL de meio DMEM aquecido à 37SC (Gibco, Life Technologies Cat. ns. 42430-025) suplementado com 10% de SBF
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239/331 e 1% de GlutaMAX-l. No dia seguinte, foi adicionado meio de cultura contendo 3 pg/mL de puromicina e 200 pg/ml Higromicina B (Roche, Cat. η0:. 10843555001). As células sobreviventes foram expandidas e diluição limitada foi realizada como descrito acima para gerar clones isolados.
[0355] Os clones foram testados quanto à expressão de 4-1 BB, tal como descrito acima e para a atividade da NFkB -luciferase da seguinte forma: Os clones foram coletados em meio de seleção e contados utilizando um contador celular Cell Counter Vi-cell xr 2.03 (Beckman Coulter, Cat. ns:. 731050). As células foram ajustadas para uma densidade celular de 0,33 x 106 células/mL e 150 pL desta suspensão de células foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de tecido de fundo plano de 96 poços branca estéril com tampa (Greiner Bio One, Cat. ns 655083). As células foram incubadas a 37SC e 5% de CO2 durante a noite em uma incubadora de células (Hera Cell). No dia seguinte, 50 pl_ de meio contendo diferentes concentrações de fator de necrose de tumoral alfa humano recombinante (rhTNF-a, PeproTech, Cat. ns. 300-01 A) foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços resultando em uma concentração final de rhTNF-α de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 0 ng/poço. As células foram incubadas durante 6 horas a 37 3C e 5% de CO2 e, em seguida, as células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS. O tampão de lise repórter Reporter Lysis Buffer (Promega, Cat No: E3971) foi adicionado a cada poço (40 μΙ_) e as placas foram armazenadas durante a noite a -20 SC. No dia seguinte as placas de células congeladas e 0 tampão de Detecção (Luciferase 1000 Assay System, Promega, Cat. ns. E4550) foram descongelados em temperatura ambiente. 100 pl_ de tampão de detecção foram adicionados a cada poço e a placa foi medida 0 mais rápido possível, utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M5/M5E e 0 software SoftMax Pro (Molecular Devices). Unidades de luz liberada mensuradas para 500 ms/poço (URLs) acima do controle (sem adição de rhTNF-α) foram
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240/331 tomadas como a atividade de luciferase. A HeLa-hu4-4-1 BB-NF-kB-Iuc clone 26 exibindo a maior atividade de luciferase e um nível considerável de expressão de 4-1 BB foi escolhida para posterior utilização.
3.2.2 Ativação NFkB Em Linhagem de Células HeLa Repórter Que Expressa
4-1 BB Humano Cocultivada Com Células Tumorais Que Expressam FAP [0356] Células HeLa-hu4-1 BB-NF-kB-Iuc clone 26 foram coletadas e novamente resuspensas em meio DMEM, suplementado com 10% (v/v) de SBF e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 0,2 χ 106 células/mL. 100 pL (2 χ 104 células) desta suspensão de células foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de tecido estéril 96 poços de fundo branco plano com tampa (Greiner bio-one, Cat. No. 655083) e a placa foi incubada a 37 SC e 5% de CO2 durante a noite. No dia seguinte, foram adicionados 50 pL de meio contendo concentrações tituladas de 4-1 BB (20H4.9) χ FAP (4B9) 1+1, 4-1 BB (20H4.9) hulgG4, 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA ou DP47 hulgGI P329G LALA não direcionado. A linhagem de células de melanoma humano expressando FAP, WM-266-4 (ATCC CRL-1676), foram resuspensas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de SBF e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 2 χ 106 células/mL. A suspensão de células WM-266-4 que expressam FAP (50 pL) ou o meio usado como controle negativo foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas por 6 horas a 37SC e 5% de CO2 na incubadora de células. As células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS. 40 pL de Tampão de Lise recém preparado (Promega, Cat n°: E3971) foram adicionados a cada poço e as placas armazenadas durante a noite a -20sC. No dia seguinte as placas de células congeladas e 0 tampão de Detecção (Luciferase 1000 Assay System, Promega, Cat. ns. E4550) foram descongelados em temperatura ambiente. 100 pL de tampão de detecção foram adicionados a atividade da luciferase foi medida 0 mais rápido possível utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M5/M5E e 0 software SoftMax
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Pro (Molecular Devices).
[0357] Nas Figuras 10D e 10E, são mostradas as propriedades de ativação de 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 1+1 (diamante preenchido preto), 41BB (20H4.9) hulgG4 (hexágono preto aberto, linha pontilhada), 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (quadrado cinza preenchido) ou DP47 hulgGI P329G LALA (círculo cinza, linha pontilhada) utilizando uma linhagem de células repórter expressando 4-1 BB. Na Figura 10D foram testadas as propriedades de ativação na ausência de WM-266-4 expressando FAP e na Figura 10E na presença de células WM-266-4. Na ausência de qualquer reticulação, a atuação é observada apenas para 4-1 BB (20H4.9) hulgG4 (hexágono preto aberto) e em uma menor extensão para 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA (quadrado cinza preenchido) contendo uma porção Fc de ligação a FcyR inerte. Na presença de reticulação à FAP o 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 1+1 (losango preto) apresenta o potencial de ativação mais forte devido sua capacidade de se ligar simultaneamente e , consequentemente, desempenhar reticulação mediada por FAP de receptores 4-1 BB na superfície da linhagem de células repórter HeLa-hu4-1BB-NFKB-Luc clone 26. Os valores de EC50 e área sob as curvas (AUC) estão listados na Tabela 16 e os valores de AUC também estão mostrados nas Figuras 11A a 11C.
Tabela 16
Valores de ECso e Área Sob A Curva (AUC) Da Ativação Da Via De
Sinalização NFkB Na Presença De Células Tumorais Expressando FAP
4-1 BB (20H4.9) hulgG4 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 1 + 1 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA DP47 hulgGI P329G LALA Não direc.
EC5o sem céls. como méd. (DP) em nM 0,33 (0,003) n.d. 1,26 (0,96) n.d.
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4-1 BB (20H4.9) hulgG4 4-1 BB (20H4.9) x FAP (4B9) 1 + 1 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA DP47 hulgGI P329G LALA Não direc.
EC50 de WM-266-4 como méd. (DP) em nM 1,06 (0,79) 0,50 (0,12) n.d. n.d.
AUC sem céls. como méd. (DP) em nM 10581 (1069) 4453 (1356) 4279 (281) 5375(149)
AUC de WM-266-4 como méd. (DP) em nM 6108 (896) 12451 (718) 6269 (1206) 5880 (502)
Exemplo 4
Preparação, Purificação E Caracterização De Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas com ligação bivalente para 4-1 BB E Uma Porção VH e VL Não Direcionada (Moléculas De Controle)
4.1 Geração de Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Bivalente para 41 BB e Uma Porção VH e VL c(linhagem germinativa DP47 de controle) [0358] Os anticorpos 4-14BB agonísticos biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB e contendo uma porção VH e VL não direcionada (DP47) foram preparados de um modo semelhante ao formato 2+1 no Exemplo
1, e conforme representado nas Figuras 1A e 1B.Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1 de um anti-4-1BB (clone 20H4.9), seguido por Fc hole, no qual a extremidade C-terminal de um VL ou VH de um clone sem ligação (DP47) foi fundido. A segunda cadeia pesada HC2 compreendia de VHCH1 de anti-4-1 BB (clone 20H4.9), seguido por Fc knob, na qual a extremidade C-terminal de um
VH ou VL, respectivamente, de um clone não (DP47) foi fundido. Para o ligante
4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas da Patente US7659384 (B2). A combinação da cadeia Fc knob com a Fc hole permite a
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243/331 geração de um heterodímero, que inclui uma porção não ligante (DP47) e dois Fabs de ligação ao 4-1 BB (Figuras 1A e 1B).
[0359] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Publicado WO2012/130831A1.
[0360] As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1BB, VH não direcionado (DP47) fundido a cadeia knob e VL fundido a cadeia hole podem ser encontradas, respectivamente, na Tabela 17. As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1 BB, VL não direcionado fundido a cadeia knob e VH fundido a cadeia hole (DP47) podem ser encontradas na Tabela 18, respectivamente.
Tabela 17
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB bivalentes / DP47 IgG1 humana P329GLALA Não Direcionada (Construções COM DP47 VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM A CADEIA FC
KNOB, DENOMINADAS VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
128 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VLhole (DP47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR qspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtsknqf slklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtl vtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp epvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvps sslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppc papeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsh edpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvl tvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqpre pqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesn GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEIVL tqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpg qaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepe dfavyycqqygsspltfgqgtkveik
129 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob (DP47) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswir qspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtsknqf slklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtl vtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
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244/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQ GTLVTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 18
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / DP47 IgG1 HUMANA P329GLALA MONOVALENTE (CONSTRUÇÕES COM
VH DE DP47 FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM A CADEIA FC
KNOB, DENOMINADAS ΜΗ-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
130 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VHhole (DP47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEV QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS
131 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (DP47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0361] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas 2+1 anti-4-1BB DP47 hulgGI P329GLALA foram produzidas pela cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando a polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada knob”:“vetor da cadeia leve”:“vetor da cadeia pesada hole). A produção foi realizada conforme descrito no Exemplo 1.
Exemplo 5
Preparação, Purificação E Caracterização De Moléculas De Ligação De
Ao Antígeno Biespecíficas Com Ligação Bivalente Para 4-1 BB De Camundongo E Monovalente Para FAP
5.1 Geração de anticorpos biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB de Camundongo e ligação monovalente para FAP [0362] Foram preparados anticorpos biespecíficos agonistas 41 BB de camundongo com ligação bivalente para 4-1 BB e ligação monovalente para FAP, também denominados 2+1, e preparados de maneira análoga as Figuras 1A e 1B. Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: o VHCH1 de um anti-4-1BB (clone MU137-1) seguido por Fc contendo as mutações Lys392Asp e Lys409Asp (denominado Fc-DD), no qual o C-terminal de um ligante anti-FAP (clone 28H1) ou VL, ou VH, foi fundido. A segunda cadeia pesada HC2 e era compreendida por VHCH1 de anti-4-1BB (clone MU137-1) seguido por Fc contendo as mutações Glu356Lys e Asp399Lys (denominadas Fc-KK), em que o C terminal de VL, ou VH, do ligante anti-FAP (clone 28H1) foi fundido. As mutações de DDKK para aumentar a formação do heterodímero de anticorpo Fc são, inter
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246/331 alia, descritas por Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010, 19637- 19646. A combinação do anti-FAP-Fc DD direcionado com a cadeia KK anti-4- 1 BB-Fc permite a geração de um heterodímero, que inclui uma unidade de ligação FAP e dois Fabs de ligação a 4-1 BB de camundongo (Figuras 1A e 1B).
[0363] As mutações DAPG foram introduzidas na região constante de uma das cadeias pesadas para anular a ligação aos receptores Fc gama de camundongo de acordo com o método descrito, por exemplo, em Baudino et ai. J. Immunol. (2008), 181, 6664-6669, ou no documento WO 2016/030350 A1. Resumidamente, as Asp265Ala e Pro329Gly mutações foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas Fc-DD e FC- KK para anular a ligação aos receptores Fc-gama (numeração de acordo com índice de Kabat EU, ou seja, D265A, P329G).
[0364] As sequências de aminoácidos para a construção 2 + 1 anti-4-1 BB (MU137-1), anti-FAP (28H1) com a-FAP (28H1) VH fundido a Fc-KK e VL fundido com a cadeia Fc-DD podem ser encontradas respectivamente na Tabela 19. As sequências de aminoácidos para a construção 2 + 1 anti-4-1 BB (MU137-1), anti-FAP (28H1) com a-FAP (28H1) VL fundido a Fc-KK e VH fundido com a cadeia Fc-DD podem ser encontradas respectivamente na Tabela 20.
Tabela 19
Sequências De Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas,
Bivalentes Anti-4-1 BB (MU137-1) / Anti-FAP (28H1) de IgG1 DAPG de
Camundongo (Construções com FAP VL fundido Com Cadeia Fc-DD e VH
Fundido Com Cadeia Fc-KK, também denominada abaixo de Fc-DD-VL)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
132 VHCH1 (MU137-1)- Cadeia pesada Fc- DD-VL (28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVR QAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKS slylqmdslrsedtatyycarrsyggyseldywgqgvm vtvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfp EPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSS
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247/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
TWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVP EVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFS WFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLN GKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPK EQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDN TQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGL HNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIV LTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKP GQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPE DFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
133 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada Fc- KK-VH (28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVR QAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKS SLYLQMDSLRSEDTATYYCARRSYGGYSELDYWGQGVM VTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFP EPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSS TWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVP EVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFS WFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLN GKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPK KQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKN TQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGL HNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEV QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQA PGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS
134 VLCL-Cadeia leve (MU137-1) DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYHQKP GKSPQLLIYGTSSLADGVPSRFSGSSSGSQYSLKISRLQV EDIGIYYCLQAYGAPWTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPP SSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATH KTSTSPIVKSFNRNEC
Tabela 20
Sequências De Moléculas De Ligação Ao Antígeno Biespecíficas,
Bivalentes Anti-4-1 BB (MU137-1)/ Anti-FAP Monovalente (28H1) de IgG1
DAPG DE CAMUNDONGO (CONSTRUÇÕES COM FAP VH FUNDIDO COM CADEIA FC DD
E VL FUNDIDO COM CADEIA FC-KK, TAMBÉM DENOMINADA ABAIXO DE FC- DD-VH)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
135 VHCH1 (MU137-1)- Cadeia pesada Fc- DD-VH (28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVRQ APTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKSSL YLQMDSLRSEDTATYYCARRSYGGYSELDYWGQGVMVT VSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEP VTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTW PSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFV DDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKE FKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQM AKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPI MDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNH
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248/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
HTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKG LEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLR AE DTAV YYC AKG W LG N F D YWG QGTLVTVSS
136 VHCH1 (MU137-1)- Cadeia pesada Fc- KK-VL (28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVRQ APTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKSSL YLQMDSLRSEDTATYYCARRSYGGYSELDYWGQGVMVT VSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEP VTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTW PSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFV DDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKE FKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQM AKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPI MKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNH HTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQ SPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQA PRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
134 VLCL-Cadeia leve (MU137-1) vide a Tabela 19
[0365] A construção biespecífica 2+1 anti-4-1 BB anti-FAP mulgGi
DAPG foi produzida por cotransfecção de células CHO-K1 cultivadas em suspensão com os vetores de expressão em mamíferos usando eviFect (Evitria AG). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção de 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada Fc-DD” : “vetor da cadeia leve”: “vetor a cadeia pesada Fc-KK”).
[0366] Para a transfecção as células CHO-K1 são cultivadas em suspensão em meio de cultura eviMake (Evitria AG) sem soro. Depois de 7 dias a 37SC em uma incubadora em ambiente de 5% de CO2, 0 sobrenadante do cultivo é coletado para purificação por centrifugação e a solução é esterilizada por filtração (filtro de 0,22 mm) e mantida a 4 °C.
[0367] As proteínas secretadas foram purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando Proteína A, seguido pela cromatografia de exclusão por tamanho. Para a cromatografia por afinidade 0 sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de Proteína A MabSelectSure (Volume de coluna (CV) = 5 mL, GE Healthcare),
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249/331 equilibrada com 40 ml_ de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida pela lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de fosfato de sódio 20 mM, tampão contendo citrato de sódio a 20 mM, pH 7,5. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear de cloreto de sódio (a 20 a 100 mM) criado ao longo de 15 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado pela adição de 1/40 (v/v) de 2M de Tris, pH 8,0. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HHoad Superdex 16/600 S200 (GE Healthcare), equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCI, pH 6,0.
[0368] A concentração de proteína das construções biespecíficas purificadas foi determinada por medição da Densidade Óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor (Invitrogen, EUA) utilizando um instrumento LabChipGXII (Caliper). O teor agregado das construções biespecíficas foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão por tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPO4, 125 mM de NaCI, 200 mM de monocloridrato de Larginina, 0,02% (p/v) de NaNa, tampão de corrida pH 6,7 a 25SC.
Tabela 21
Análise Bioquímica De Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas Com Ligação Bivalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para FAP (2+1)
ANTl-4-1 BB (MU137-1), ANTl-FAP(28H1) IgG1 DE CAMUNDONGO DAPG
Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
4-1 BB (MU137-1)/ FAP(28H1) DAPG 98 3.6 92
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Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
lgG1 2+1 (Fc-DD-VL)
5.2 Caracterização funcional in vitro utilizando ensaio de ativação de
ESPLENÓCITOS DE CAMUNDONGOS [0369] Para o ensaio funcional, esplenócitos de camundongo são cocultivados com a linhagem de células de fibroblastos de camundongo NIH/3T3camundongo FAP clone 36. A linhagem de células de fibroblastos de camundongo NIH/3T3-camundongo FAP clone 36 foi obtida pela transfecção da linhagem de células parental NIH/3T3 (ATCC, CRL-1658) com um plasmídeo de expressão codificando FAP de camundongo sob controle de um promotor CMV. As células NIH/3T3-moFAP clone 36 são mantidas na presença de puromicina a 1,5 mg/mL (InvivoGen, cat.: ant-pr-5) em DMEM (GIBCO, Life Technologies, Cat No 42430082) suplementado com 10% de SBF (Gibco, Life Technologies, -gama-irradiado, inativado por calor) e 1% (v/v) de GlutaMAX-l (GIBCO, Life Technologies, Cat.35050-038). Para o ensaio funcional, os baços de camundongo foram isolados a partir de camundongos fêmea C57BL/6 com 6-8 semanas de idade em DPBS estéril (Gibco, Life Techologies, Cat. No. 14190136). Uma suspensão de esplenócitos de tipo celular único foi produzida pela separação dos baços através de um filtro de células Falcon® de 70 pm (Corning, Cat. 352350) e a filtração foi feia através de um filtro de pré-separação de 30 pm (Miltenyi Biotec, Cat. 130041-407) em meio RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies, Cat. No. 42401-042) suplementado com soro bovino fetal a 10% (SBF, Gibco, Life Technologies, gamairradiado, inativado por calor), 1% (v/v) de GlutaMAX-l (GIBCO, Life Technologies, Cat. No. 35050-038), 1 mM de piruvato de sódio (SIGMA-Aldrich, Cat. No. S8636) e 50 pM de beta-mercaptoetanol. Os eritrócitos foram lisados pela resuspensão das células em tampão de lise ACK (0,15 M NFkCI, KHCO3 a 10 mM, EDTA a 0,1 mM em água bidestilada (ddFLO, pH 7,2) e foram incubados durante 10 min. em
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251/331 temperatura ambiente. A lise foi interrompida pela adição de SBF, as células foram lavadas com DPBS estéril e marcados com 0,5 μΜ de corante para viabilidade celular CellTrace Violet Cell Proliferation (Cell tracer, Cat.- N ° C34557) em PBS a 37SC por 10 min. A marcação foi interrompida com SBF. 0,15 x 106 esplenócitos marcados com corante para proliferação foram cocultivados com 0,02 x 106 células NIH/3T3-muFAP clone 36 irradiadas com 50 Gy aderentes, 0,5 pg/mL (~ 3,57 nM) de IgG de hamster armênio anti-CD3 de camundongo clone 145-2C11, BD, Cat. 553057) e diferentes concentrações tituladas de anticorpos agonistas 41BB de camundongo (clone MU137-1) ou controle (lgG1k de camundongo purificada clone LEAF de controle isotípico MOPC-21, BioLegend, Cat 400153) em meio RPMI 1640 a 200 pL/poço (Gibco, Life Technologies, Cat. 42401-042) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF, Gibco, Life Technologies, γirradiado, inativado), GlutaMAX-l a 1% (v/v) (Gibco, Life Technologies, Cat. 35050038), piruvato de sódio a 1 mM (SIGMA-Aldrich, Cat.S8636) e 50 μΜ de betamercaptoetanol em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo redondo (TTP, Cat. N92097) durante quatro dias. Após quatro dias, as células foram lavadas com tampão FACS e coradas durante 30 min. a 4SC a 50 pL/poço com DPBS frio contendo corante de viabilidade LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain diluído 1:5000. Após a lavagem das células com PBS as células foram coradas em 50 pL/poço de tampão FACS frio contendo lgG2a de rato APC/Cy7 anti-CD8ade camundongo (BioLegend, Cat. 100714, clone 53-6.7), lgG2b de rato, k-APC anti-CD4 camundongo (BioLegend, Cat. 100412, clone GK1.5) IgG-ΡΕ de hamster sírio anti-CD137 (4-1 BB) camundongo (BioLegend, Cat. 106106, clone 17B5) e lgG2b de rato PErCP-Cy5.5 anti-CD25 camundongo (BioLegend, Cat. 1019112) durante 30 min. a 4SC. As células foram lavadas e incubadas durante 30 min. a 4SC em tampão Fix/Perm preparados (Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set, eBioscience, Cat. 00-5523-00). Após a lavagem, as células foram coradas com 50 pL/poço de Tampão Perm contendo lgG2b de rato conjugado
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 527/652
252/331 com PE anti-granzima B de camundongo (eBioscience, Cat. 128822, clone 16G6) durante 1 h a 4SC. As células foram lavadas, resuspensas em tampão FACS e adquiridas utilizando o analisador de 3 lasers MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech) e analisadas utilizando o programa FlowJo v/0.0.7(FlowJo LLC).
[0370] Como mostrado nas Figuras 14A a 14J, a ativação das células T de camundongo com 0,5 pg/mL de IgG agonista de hamster anti-CD3 camundongo (sinal 1) em combinação com anticorpo agonista anti-4-1BB de camundongo reticulado leva a um aumento da proliferação conduzindo a um aumento da expressão de 4-1 BB em células T CD8+ (Figura 14A) e células T CD4+ (Figura 14B), aumento da expressão de CD25 em células T CD8+ (Figura 14C) e células T CD4+ (Figura 14D), expressão de Granzima B em Células T CD8+ (Figura 14E) e células T CD4+ (Figura 14F), proliferação das células T CD8+ (Figura 14G) e células T CD4+ (Figura 14H) e a um aumento no tamanho mostrado pelo aumento dos valores de dispersão lateral em Células T CD8+ (Figura 141) e células T CD4+ (Figura 14J). Para sinergia de 4-1 BB, o clone agonista anti-MU137-1 de camundongo tem que ser reticulado. Isso é mediado por reticulação ao FcR (diamante preto preenchido, 4-1 BB de camundongo (MU137-1) molgGI) como mostrado na Figura 14H pela proliferação de CD4 levemente aumentada, ou de uma maneira sinérgica muito mais forte via ligação biespecífica de FAP (estrela cinza, linha tracejada, 4-1 BB de camundongo (MU137-1) x FAP (28H1) molgGI DAPG 2+1) como mostrado nas Figuras 14A a 14F e Figuras 14H a 14J. O anticorpo 4-1 BB de camundongo (MU137-1) molgGI DAP (losango preto aberto, linha tracejada), inerte de ligação ao FcyR e, portanto, reticulante, tem agora um efeito sinérgico acima do fundo.
Exemplo 6
Preparação, Purificação E Caracterização De Moléculas De Ligação De
Ao Antígeno Biespecíficas Com Ligação Bivalente Para 4-1 BB E MONOVALENTE PARA CEA
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6.1 Geração de anticorpos biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB E LIGAÇÃO MONOVALENTE PARA CEA [0371] Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB e ligação monovalente para CEA, também denominados 2+1, como representado nas Figuras 1A e 1B. A tecnologia knobs into bote foi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero.
[0372] Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1 do ligante anti-41 BB (clone 20H4.9), seguido por Fc com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido com a extremidade C-terminal um VL ou VH de um ligante anti-CEA (clone T84.66-LCHA ou A5B7). A segunda cadeia pesada HC2 era compreendida por VHCH1 de anti-4-1BB seguido por Fc hole, no qual foi fundido com o C-terminal de um VH ou VL, respectivamente, do ligante antiCEA (clone T84.66-LCHA ou A5B7). A geração e a preparação do ligante de CEA T84.66-LCHA estão descritas no documento WO 2016/075278 A2, que incorporado ao presente pela referência. As sequências VH e VL do clone CEA A5B7 foram obtidas a partir do documento WO 2007/071426 e derivam do clone murino anti-CEA A5B7. Para o ligante de 4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas de acordo com a publicação US 7.288.638 B2 ou US 7.659.384 B2. A combinação das duas cadeias pesadas permite a geração de um heterodímero, que inclui uma porção de ligação ao CEA e dois Fabs de ligação ao 4-1 BB (Figuras 1A e 1B).
[0373] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 529/652
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Publicado WO2012/130831A1.
[0374] Os anticorpos 2+1 anti-4-1BB anti-CEA hulgGI P329GLALA biespecíficos foram produzidos pela cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando a polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada knob”:“vetor da cadeia leve”:“vetor da cadeia pesada hole).
[0375] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti-4-1 BB, anti-CEA com a-CEA (T84.66-LCHA) VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 22.
Tabela 22
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB BIVALENTE / ANTI-CEA (T84.66-LCHA) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
63 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VLhole (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGT GGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTA GCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC CTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCC AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 530/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AG GAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAG CCCTCG G CGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTC GTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAAC TACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCG GAGGAGGAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCG GAGGATCCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCAC CCTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTGAGC TGTAGAGCCGGCGAGAGCGTGGACATCTTCGGCGTG GGATTTCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGG CCCCCAGACTGCTGATCTACAGAGCCAGCAACCGGGC CACAGGCATCCCCGCCAGAI I I ICTGGCTCTGGCAGC GGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGGAAC CCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGACCAA CGAGGACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTG GAAATCAAG
64 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VHknob (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGT GGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTA GCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC CTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCC AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AG GAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAG CCCTCG G cgcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggg cagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccct
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 531/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
GCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTG GTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACT ACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAG CTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCC GGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGA GGAGGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGT GGATCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAG TGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAA GGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCAC TGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGG ATGGGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAAT ACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGC CGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGC AGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTG CCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGC CTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
65 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VLhole (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGV GFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK
66 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VHknob (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDT YMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVT ITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMA YWGQGTLVTVSS
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 532/652
257/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0376]Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti-4-1 BB, anti-CEA com a-CEA VL (T84.66-LCHA) fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 23.
Tabela 23
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB bivalente / anti-CEA (T84.66-LCHA) monovalente, IgGi humana P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA ΜΗ-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
67 VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VHhole (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCT CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGAC CCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAG CCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCC GGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 533/652
258/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATG AG GCTCTG C AC AACC ACTAC ACG C AG AAG AG CCT CTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGG AGGAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGG ATCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTG AAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGG CCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGG GTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATG GGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACG TGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGA CACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGC CTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCC CCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTAT TGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 534/652
259/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
68 VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VLknob (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCT CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGAC CCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAG CCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCA GAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACA AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTT CTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGT GGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTG AGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGA GGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGA TCTGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGT CACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGTAG AGCCGGCGAGAGCGTGGACATCTTCGGCGTGGGATTT CTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCA G ACTGCTG ATCTAC AG AG CC AG C AACCG GG CC ACAGG CATCCCCGCCAGAI I I ICTGGCTCTGGCAGCGGCACC GACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGGAACCCGAGG ACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGACCAACGAGGA CCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATC AAG
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 535/652
260/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
69 VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VHhole (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMH WVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITAD TSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWG QGTLVTVSS
70 VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VLknob (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFL HWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0377] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti-4-1 BB, anti-CEA com a-CEA (A5B7) VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontramse respectivamente na Tabela 24. A molécula é denominada 2+1 4-1 BB (20H4.9)/CEA (A5B7) lgG1 humana PGLALA (G4S)4, VL hole.
Tabela 24
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 536/652
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BIVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
71 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VLhole (A5B7) (sequência nucleotidica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTGA AGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTA CGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGATCC GGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGA GATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCC TGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAG AACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGC CGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGGCC CTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGGCAGA GGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGG GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTG CAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACA GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG TGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCG GCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGCGGCGGAGGTT CCGGAGGCGGAGGATCCCAGGCCGTGCTGACACAGCC TGCCAGCCTGTCTGCTTCTCCTGGCGCCTCTGCCTCCC TGACCTGCACACTGAGAAGAGGCATCAACGTGGGCGCC TACAGCATCTACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAGCCC CCCTCAGTACCTGCTGAGATACAAGAGCGACAGCGACA AGCAGCAGGGCAGCGGCGTGTCCAGCAGATTCAGCGC CAGCAAGGACGCCTCTGCCAACGCCGGAATCCTGCTGA TCAGCGGCCTGCAGTCTGAGGACGAGGCCGACTACTAC TGCATGATCTGGCACTCTGGCGCCAGCGCCGTGTTTGG CGGAGGCACAAAACTGACCGTGCTG
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 537/652
262/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
72 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob (A5B7) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTGA AGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTA CGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGATCC GGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGA GATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCC TGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAG AACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGC CGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGGCC CTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGGCAGA GGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGG GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTG CAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACA GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG TACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACC CCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCA GCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGG ACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACC GTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA GCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTAC ACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCG GCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGGGGCGGAGGTT CCGGAGGCGGTGGATCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATC TGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGA CTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCGTGTCCAGCTA CTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGA CTGGAATGGGTCGGATTCATCAGAAACAAGGCCAACGG CGGCACCACCGAGTACGCCGCCTCTGTGAAGGGCCGG TTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTA CCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCC GTGTACTACTGCGCCAGAGACAGAGGCCTGCGGTTCTA CTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTCT CTTCC
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 538/652
263/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
73 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VLhole (A5B7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ spekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtsknqfsl klssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtlvtv ssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvt VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT qtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaa ggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkf nwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwl ngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlpps rdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennyktt PPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH nhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsqavl tqpaslsaspgasasltctlrrginvgaysiywyqqkpgs PPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLIS glqsedeadyycmiwhsgasavfgggtkltvl
74 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob (A5B7) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswirq spekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtsknqfsl klssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtlvtv ssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvt VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT qtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaa ggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkf nwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwl ngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppc rdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykt TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL hnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevq LVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAP gkglewvgfirnkanggtteyaasvkgrftisrddskntl ylqmnslraedtavyycardrglrfyfdywgqgttvtvs s
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0378] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti-4-1 BB, anti-CEA (A5B7) com a-CEA VL (A5B7) fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 25. A molécula é denominada 2+1 41BB (20H4.9)/CEA (A5B7) lgG1 humana PGLALA (G4S)4, VH hole.
Tabela 25
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 539/652
264/331
BIVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
75 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VHhole (A5B7) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCT GAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTC GACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCC AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAG CTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAG GAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGA TCCGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTG GTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCC GCCAGCGGCTTTACCGTGTCCAGCTACTGGATGCACT GGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGG GTCGGATTCATCAGAAACAAGGCCAACGGCGGCACC ACCGAGTACGCCGCCTCTGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTG CAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAGAGACAGAGGCCTGCGGTTCTACT TCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTCT
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 540/652
265/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
CTTCC
76 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (A5B7) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCT GAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTC GACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCC AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCCAG CAG CTTGG GCACCCAGACCTACATCTG C AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAG CTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCA AGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCA CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCC TGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGC AGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGA GCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGA GGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGG ATCTCAGGCCGTGCTGACACAGCCTGCCAGCCTGTC TGCTTCTCCTGGCGCCTCTGCCTCCCTGACCTGCACA CTGAGAAGAGGCATCAACGTGGGCGCCTACAGCATC TACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAGCCCCCCTCAG TACCTGCTGAGATACAAGAGCGACAGCGACAAGCAG CAGGGCAGCGGCGTGTCCAGCAGATTCAGCGCCAGC AAGGACGCCTCTGCCAACGCCGGAATCCTGCTGATC AGCGGCCTGCAGTCTGAGGACGAGGCCGACTACTAC TGCATGATCTGGCACTCTGGCGCCAGCGCCGTGTTT GGCGGAGGCACAAAACTGACCGTGCTG
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 541/652
266/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
77 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VHhole (A5B7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSC AASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGG TTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
78 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (A5B7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASPGASASLTCT LRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQG SGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWH SGASAVFGGGTKLTVL
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0379] As sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti4-1 BB, anti-CEA com a-CEA (A5B7) VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 26. A molécula é denominada 2+1 4-1 BB (20H4.9)/CEA (A5B7) lgG1 humana PGLALA (G4S)2, VL hole.
Tabela 26
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA
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267/331 (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
137 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VLhole (A5B7) (G4S)2 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ SPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDE LTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASPGASAS LTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQ QGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWH SGASAVFGGGTKLTVL
74 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob (A5B7) vide a Tabela 24
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0380] As sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti
4-1 BB, anti-CEA (A5B7) com a-CEA (A5B7) VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 27. A molécula é denominada 2+1 4-1 BB (20H4.9)/CEA (A5B7) lgG1 humana PGLALA (G4S)2, VH hole.
Tabela 27
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ANTI-CEA (A5B7) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
138 VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VHhole (A5B7) (G4S)2 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
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268/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEV QLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQ APGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTT VTVSS
78 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (A5B7) vide a Tabela 25
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0381] Outros exemplos foram preparados com o clone CEA murino A5B7P (como descrito adicionalmente do documento WO 92/01059) e o clone CEA 431/26 (conforme descrito adicionalmente no documento EP 501215 A2). As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1 BB, as construções anti-CEA com a-CEA (A5B7P) parental VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 28. A molécula é denominada 2+1 4-1 BB (20H4.9)/CEA (A5B7P) lgG1 humana PGLALA, VL hole.
Tabela 28
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB bivalente/anti-CEA (A5B7P) monovalente, IgGi humana P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA (G4S)4 VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
195 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VLhole (A5B7P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ SPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 544/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
NHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQTVL SQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPK SWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATY YCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK
196 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VHknob (A5B7P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ SPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC RDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVK LVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPG KALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYL QMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0382] As sequências de aminoácidos para construções 2+1 anti4-1 BB, anti-CEA (A5B7P) com a-CEA (A5B7P) VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 29. A molécula é denominada 2+1 4-1 BB (20H4.9)/CEA (A5B7P) lgG1 humana PGLALA (G4S)4, VH hole.
Tabela 29
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7P) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
197 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VHhole (A5B7P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ SPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 545/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
PPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKL VESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPG KALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYL QMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS
198 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (A5B7P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQ SPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC RDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQTV LSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSP KSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAAT YYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0383] As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1 BB, as construções anti-CEA com a a-CEA (431/26) VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 30. A molécula é denominada 2+1 4-1 BB (20H4.9)/CEA (431/26) lgG1 humana PGLALA (G4S)4, VL hole.
Tabela 30
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ANTI-CEA (431/26) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
199 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VL/70/e(431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 546/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSTSSSVSYMHWYQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL QPEDIATYYCHQWSSYPTFGQGTKVEIK
200 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob (431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTISSGYSWH WVRQPPGRGLEWIGYIQYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTS KNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREDYDYHWYFDVWGQG SLVTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0384] As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1 BB, as construções anti-CEA com a a-CEA (431/26) VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 31. A molécula é denominada 2+1 4-1 BB (20H4.9)/CEA (431/26) lgG1 humana PGLALA (G4S)4, VH hole.
Tabela 31
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ANTI-CEA (431/26) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
201 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VH/70/e(431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 547/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTISSGYSWH WVRQPPGRGLEWIGYIQYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTS KNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREDYDYHWYFDVWGQG SLVTVSS
202 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSTSSSVSYMHWYQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL QPEDIATYYCHQWSSYPTFGQGTKVEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0385] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-4
BB/anti-CEA foram produzidas e purificadas conforme descrito para o anti-41BB bivalente biespecífico e anti-FAP hulgGI P329GLALA (consulte o Exemplo 1.1). Para a produção em frascos de 500 ml agitados, 400 milhões de células HEK293 EBNA foram semeadas 24 horas antes da transfecção. Para a transfecção as células foram centrifugadas por 5 minutos a 210 x g e o sobrenadante foi substituído por meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD CHO para um valor final de 200 pg de DNA. Após a adição de 540 pL de PEI, a solução foi agitada em vortex durante 15 segundos e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 500 mL e incubadas durante 3 horas a 37SC em uma incubadora com atmosfera de CO2 a 5%. Após 0 tempo de incubação 160 mL de meio F17 foram adicionados e as células foram
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273/331 cultivadas durante 24 horas. Um dia após a transfecção, 1 mM de ácido valpróico e 7% de Feed foram adicionados. Após uma cultura de 7 dias, o sobrenadante celular foi coletado por centrifugação durante 15 minutos a 210 x g. A solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 pm), suplementada com azida sódica para uma concentração final de 0,01% (p/ν), e mantida a 4SC.
[0386] As proteínas secretadas foram purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando Proteína A, seguido pela cromatografia de exclusão por tamanho. Para a cromatografia por afinidade o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de Proteína A MabSelectSure (Volume de coluna (CV) = 5 mL, GE Healthcare), equilibrada com 40 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida pela lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de fosfato de sódio 20 mM, tampão contendo citrato de sódio a 20 mM, pH 7,5. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear de cloreto de sódio (a 20 a 100 mM) criado ao longo de 15 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado pela adição de 1/40 (v/v) de 2M de Tris, pH 8,0. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HHoad Superdex 16/600 S200 (GE Healthcare), equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCI, pH 6,0. A concentração de proteína das construções biespecíficas purificadas foi determinada por medição da Densidade Óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor (Invitrogen, EUA) utilizando um instrumento LabChipGXII (Caliper). O teor agregado das construções
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274/331 biespecíficas foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão por tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPO4, 125 mM de NaCI, 200 mM de monocloridrato de L-arginina, 0,02% (p/v) de NaNa, tampão de corrida pH 6,7 a 25SC.
Tabela 32
Análise bioquímica de 2+1 anti-4-1 BB, anti-CEA humano IgGi P329GLALA
Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(T84.66-LCHA) lgG1 PGLALA humana, (G4S)4, VH-hole (Para sequências vide a Tabela 23) 95,2 0,1 81
2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(A5B7) lgG1 PGLALA humana, (G4S)2, VH hole (Para sequências vide a Tabela 27) 99 5,1 82
2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(A5B7) lgG1 PGLALA humana (G4S)4, VH hole (Para sequências vide a Tabela 25) 95,5 8,4 97,4
2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(A5B7P) lgG1 PGLALA humana, (G4S)4, VH hole (Para sequências vide a Tabela 29) 95,5 54 97,6
6.2 Caracterização In Vitro Funcional: Capacidade De Induzir A Ativação De NFkB Via Ligação Simultânea ao 4-1 BB E CEA
6.2.1 Geração de células HeLa que expressam 4-1 BB humano e NFkBLUCIFERASE [0387] A linhagem de células de carcinoma do colo do útero HeLa (ATCC CCL-2) foi transduzida com um plasmídeo baseado no vetor de expressão pETR10829, que contém a sequência do 4-1 BB humano (UniProt Q07011) sob 0 controle de um promotor CMV e um gene que confere resistência à puromicina. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de SBF, 1% (v/v), GlutaMAX-l e 3 pg/mL de puromicina. As células HeLa transduzidas com 4-1 BB foram testadas para a expressão de 4-1 BB por citometria de fluxo: 0,2x106 células vivas foram resuspensas em 100 pL de tampão FACS contendo 0,1 pg de IgGlK de camundongo clone anti-4B4-1 humano conjugado PerCP/Cy5.5 (BioLegend
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Cat. ns.309814) ou seu controle (anticorpo clone MOPC21 de controle isotipico IgdK de camundongo conjugado PerCP/Cy5.5, BioLegend Cat. n°: 400150) e incubadas durante 30 minutos a 4 SC . As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS, resuspensas em 300 de tampão FACS contendo 0,06 pg de DAPI (Santa Cruz Biotec, Cat. ns. sc-3598) e os resultados foram adquiridos utilizando um analisador 5-laser LSR-Fortessa (BD Bioscience, software DIVA). Diluições limitadas foram realizadas para gerar clones isolados conforme descrito: células HeLa transduzidas com 4-1 BB humano foram resuspensas em meio a uma densidade de 10, 5 e 2,5 células/mL e 200 pL das suspensões de células foram transferidas para placas de 96 poços de fundo redondo (6 placas/concentração de células, TPP Cat. ns:. 92697). Os clones individuais foram coletados, expandidos e testados quanto a expressão de 41 BB, tal como descrito acima. O clone com a expressão mais elevada de 41 BB (clone 5) foi escolhido para a transfecção subsequente com o vetor de expressão 5495p tranlucent hygB da NFKB-luciferase. O vetor confere às células transfectadas resistência à higromicina B e capacidade de expressarem luciferase sob controle do elemento de resposta de NFkB (Panomics, Cat. n°. LR0051). Para a trasnfecção, foram cultivadas células HeLa - 4-1 BB humano clone 5 até uma confluência de 70%. 50 pg (40 pL) de vetor de expressão 5495p tranlucent hygB linearizado (enzimas de restrição Asei e SaU) foram adicionados a uma cuveta Gene Pulser/MicroPulser de 0,4 cm estéril (Biorad, Cat. 165-2081). 2,5x106 células HeLa clone 5 4-1 BB humano foram adicionadas em 400 pL de meio DMEM sem suplemento e elas foram cuidadosamente misturadas com a solução de plasmídeo. A transfecção das células foi realizada usando um sistema Gene Pulser Xcell total (Biorad, Cat 1652660) sob as seguintes configurações: pulso exponencial, capacitância de 500 pF, tensão de 160 V, resistência não limitada. Imediatamente após a transfecção por pulso as células foram transferidas para um frasco de cultura
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276/331 de 75 cm2 (TPP, Cat. ns. 90075) com 15 mL de meio DMEM aquecido à 37SC (Gibco, Life Technologies Cat. ns. 42430-025) suplementado com 10% de SBF e 1% de GlutaMAX-l. No dia seguinte, foi adicionado meio de cultura contendo 3 pg/mL de puromicina e 200 pg/ml Higromicina B (Roche, Cat. η0:. 10843555001). As células sobreviventes foram expandidas e diluição limitada foi realizada como descrito acima para gerar clones únicos.
[0388] Os clones foram testados quanto à expressão de 4-1 BB, tal como descrito acima e para a atividade da NFkB -luciferase da seguinte forma: Os clones foram coletados em meio de seleção e contados utilizando um contador celular Cell Counter Vi-cell xr 2.03 (Beckman Coulter, Cat. ns:. 731050). As células foram ajustadas para uma densidade celular de 0,33 x 106 células/mL e 150 pL desta suspensão de células foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de tecido de fundo plano de 96 poços branca estéril com tampa (Greiner Bio One, Cat. ns 655083). As células foram incubadas a 37SC e 5% de CO2 durante a noite em uma incubadora de células (Hera Cell). No dia seguinte, 50 pL de meio contendo diferentes concentrações de fator de necrose de tumoral alfa humano recombinante (rhTNF-a, PeproTech, Cat. ns. 300-01 A) foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços resultando em uma concentração final de rhTNF-α de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 0 ng/poço. As células foram incubadas durante 6 horas a 37 3C e 5% de CO2 e, em seguida, as células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS. O tampão de lise repórter Reporter Lysis Buffer (Promega, Cat No: E3971) foi adicionado a cada poço (40 pL) e as placas foram armazenadas durante a noite a -20 SC. No dia seguinte as placas de células congeladas e 0 tampão de Detecção (Luciferase 1000 Assay System, Promega, Cat. ns. E4550) foram descongelados em temperatura ambiente. 100 pL de tampão de detecção foram adicionados a cada poço e a placa foi medida 0 mais rápido possível, utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M5/M5E e 0 software
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SoftMax Pro (Molecular Devices). Unidades de luz liberada mensuradas para 500 ms/poço (URLs) acima do controle (sem adição de rhTNFa) foram tomadas como a atividade de luciferase. A HeLa-hu4-4-1 BB-NFkB-Iuc clone 26 exibindo a maior atividade de luciferase e um nível considerável de expressão de 4-1 BB foi escolhida para posterior utilização.
6.2.2 Ativação NFkB Em Células HeLa Repórteres Que Expressam 4-1 BB Humano Cocultivadas Com Células Tumorais Que Expressam CEA [0389] Células HeLa-hu4-1 BB-NFkB-Iuc clone 26 foram coletadas e novamente resuspensas em meio DMEM, suplementado com 10% (v/v) de SBF e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 0,2 x 106 células/mL. 100 pL (2 x 104 células) desta suspensão de células foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de tecido estéril 96 poços de fundo branco plano com tampa (Greiner bio-one, Cat. No. 655083) e a placa foi incubada a 37 SC e 5% de CO2 durante a noite. No dia seguinte foram adicionados 50 pL de meio contendo 4-1 BB titulado (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1. Células da linhagem MKN45 (DSMZ ACC 409) de adenocarcinoma gástrico humano expressando CEA foram resuspensas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de SBF e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 2 x 106 células/mL. A suspensão de células MKN45 expressando CEA (50 pL) ou o meio usado como controle negativo foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas por 6 horas a 37SC e 5% de CO2 na incubadora de células. As células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS. 40 pL de Tampão de Lise recém preparado (Promega, Cat ns: E3971) foram adicionados a cada poço e as placas foram armazenadas durante a noite a -20sC. No dia seguinte as placas de células congeladas e 0 tampão de Detecção (Luciferase 1000 Assay System, Promega, Cat. ns. E4550) foram descongelados em temperatura ambiente. 100 pL de tampão de detecção foram adicionados a atividade da luciferase foi medida 0 mais rápido possível utilizando um leitor de microplacas SpectraMax
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M5/M5E e o software SoftMax Pro (Molecular Devices).
[0390] Nas Figuras 15A e 15B é mostrada a propriedade de ativação de 4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 ((G4S)2, VH hole) utilizando uma linhagem de células repórteres expressando 4-1 BB. Na Figura 15A a propriedade de ativação na ausência de MKN45 expressando CEA e na Figura 15B na presença de células MKN45 foi testada. Na ausência de qualquer reticulação, a ativação foi observada apenas em altas concentrações e com um máximo limitado. O valor de ECso pode ser diminuído e o máximo de ativação é aumentado na presença de células MKN45. Portanto, todo o potencial da 41BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 é observado apenas na presença de reticulação mediada por CEA. Os valores de ECso e a área sob a curva (AUC) estão indicados nos gráficos nas Figuras 15A e 15B.
6.3 Geração de anticorpos biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB E LIGAÇÃO MONOVALENTE PARA CEA COMPREENDENDO UM CROSSFAB CTERMINALMENTE LIGADO [0391] Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB e ligação monovalente para CEA, também denominados 2+1 crossFab, conforme ilustrado nas Figuras 1D e 1E. A tecnologia knobs into hole foi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero.
[0392] Neste exemplo, a HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1 do anti-4-1BB (20H4.9 clone) seguido por Fc knob e um VHCL cruzado, ou VLCH1, de um clone de anticorpo anti-CEA (clone A5B7P). O HC2 foi constituído por VHCH1 do anti-4-1BB (clone 20H4.9) seguido pelo Fc hole. LC1 da construção compreendia VHCH1 do anti-4-1BB
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279/331 (clone 20H4.9). A LC2 da construção compreendia um VLCH1 cruzado, ou VHCL de urn ligante anti-CEA (clone A5B7P).
[0393] Em uma das moléculas de ligação ao antígeno, para melhorar o pareamento correto das cadeias leves, as seguintes mutações foram introduzidas no CH-CL do Fab anti-4-1 BB: E123R e Q124K no domínio CL e K147E e K213E no Domínio CH1.
[0394] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Publicado WO2012/130831A1.
[0395] As sequências de aminoácidos para 2+1 de anti-4-1 BB, as construções anti-CEA, com a-CEA (A5B7P) CHCL crossfab fundido com a cadeia pesada Fc knob podem ser encontradas, respectivamente, na Tabela 33.
Tabela 33
Sequências De Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas, Anti-41 BB BIVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7P) MONOVALENTE humana IgG1 P329GLALA (Construção com um crossfab CHCL de a-CEA (A5B7P) fundido com a
CADEIA Fc KNOB, DENOMINADA CHLC-KNOB CROSSFAB)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
211 VHCH1 (20H4.9)Cadeia Pesada VHCL-knob (A5B7P) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswi rqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgr gtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkd yfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvv tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdktht cppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvv dvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyr vvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskak gqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdia vewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksr wqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsg GGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSC atsgftftdyymnwvrqppgkalewlgfignkangyt teysasvkgrftisrdksqsilylqmntlraedsatyyc trdrglrfyfdywgqgttltvssasvaapsvfifppsd
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EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS qesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevt hqglsspvtksfnrgec
212 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada hole qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswi rqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgr gtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclved YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdktht cppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvw DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
213 VLCH1-Cadeia leve (A5B7P) QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQK pgsspkswiyatsnlasgvparfsgsgsgtsysltisrv eaedaatyycqhwsskpptfgggtkleikssastkgps VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA ltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicn VNHKPSNTKVDKKVEPKSC
[0396] As sequências de aminoácidos para 2+1 crosstab anti-41BB, as construções anti-CEA com um a-CEA (A5B7P) crosstab CHCL fundido com a cadeia pesada Fc knob podem ser encontradas, respectivamente, na Tabela 34.
Tabela 34
Sequências De Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas, Anti-41 BB BIVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7P) MONOVALENTE humana IgG1 P329GLALA com Variantes Carregadas (Construção com um crossfab a-CEA VHVL
FUNDIDO COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VHVL-K/VOB CROSSFAB)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
214 VHCH1 (20H4.9)Cadeia pesada VLCH-knob (A5B7P) (muatações EE) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI rqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgr gtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclved YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdktht cppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvw DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA vewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksr
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WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQTVLSQSPAILSASPGEKVTMTC RASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARF SGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGG GTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
215 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada hole (muatações EE) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVED YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
216 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (muatações RK) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLE PEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
217 VHCL-Cadeia leve (A5B7P) EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWV RQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRD KSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQ GTTLTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C
[0397] Os anticorpos biespecíficos compreendendo um crosstab foram gerados por transfecção transitória de células HEK293 EBNA. As células foram centrifugadas e o meio substituído por meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, foi adicionado PEI, e a solução foi submetida à vortex e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação e incubadas durante 3 horas a 37SC em uma incubadora com atmosfera de CO2 a 5%. Após a incubação, foi adicionado meio Excell com suplementos. Um dia após a transfecção foi adicionado 12% de Feed. Os sobrenadantes celulares foram coletados após 7 dias e purificados por métodos padrão. As proteínas foram purificadas a partir dos sobrenadantes de cultura celulares de acordo com protocolos
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282/331 estabelecidos. Resumidamente, as proteínas contendo Fc foram purificadas a partir dos sobrenadantes de cultura celular por cromatografia de afinidade utilizando proteína A. A eluição foi conseguida em pH 3,0 seguido pela neutralização imediata da amostra. A proteína foi concentrada e a proteína agregada foi separada da proteína monomérica por cromatografia de exclusão por tamanho em histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0.
[0398] A concentração de proteína das construções purificadas foi mensurada pela medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace, et al. Protein Science, 1995, 4, 2411-1423. A pureza e o peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor utilizando um instrumento LabChipGXII. Determinação do teor de agregado foi realizada por cromatografia HPLC, utilizando uma coluna de exclusão por tamanho analítica (TSKgel G3000 SW XL) equilibrada em 25 mM de K2 PCU, 125 mM de NaCI, 200 mM de monocloridrato de L-arginina, tampão de execução em pH 6,7 a 25SC.
Tabela 35
Análise bioquímica de 2+1 anti-4-1 BB, anti-CEA crossafab IgGi humana
P329GLALA
Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(A5B7P) lgG1 PGLALA humana, CEA com crosstab CHCL (Para sequências vide a Tabela 33) 99,2 6,1 95
2+1 4-1 BB (20H4.9)/ CEA(A5B7P) lgG1 PGLALA humana, CEA com crosstab VHVL (Para sequências vide a Tabela 34) 99,5 2,1 98,3
6.3.1 Caracterização funcional de anticorpos biespecíficos 2+1 4-1 BB
COMPREENDENDO UM CROSSFAB CEA LIGADO C-TERMINALMENTE [0399] A capacidade de ligação simultânea ao humano 4-1 BB Fc
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283/331 (kih) e ao CEA humano, utilizando o antígeno N(A2-B2)A, que se refere a uma região específica do epítopo no CEA, foi avaliada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Todos os experimentos SPR foram realizados em um sistema Biacore T200a 25SC com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, Tensoativo P20 a 0,005%, Biacore, Freiburg/Alemanha ). O N(A2-B2)A humano foi acoplado diretamente a uma célula de fluxo por acoplamento de amina (chip sensor CM5). Foram utilizados níveis de imobilização de 750 unidades de ressonância (RU).
[0400] O anticorpo 4-1 BB direcionado para CEA foi passado em um intervalo de concentração de 200 nM em uma velocidade de fluxo de 30 pL/minuto através das células de fluxo durante 90 segundos e a dissociação foi estabelecida em zero segundo. O 4-1 BB Fc (kih) humano foi injetado como o segundo analito a uma velocidade de fluxo de 30 pL/minuto através das células de fluxo durante 90 segundos a uma concentração de 500 nM (Figura 20A). A dissociação foi monitorada durante 120 segundos. As diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida em uma célula de fluxo de referência, onde nenhuma proteína foi imobilizada.
[0401] Como pode ser observado nos gráficos das Figuras 20B e 20C, os anticorpos agonistas biespecíficos 2+1 4-1 BB com ligação monovalente para CEA podem se ligar simultaneamente ao N(A2-B2)A humano e 4-1 BB humano.
6.4. Ligação nas Células
6.4.1. Ligação na linhagem de células Jurkat-hu4-1 BB-NF kB-luc2 EXPRESSANDO 4-1 BB HUMANO [0402] Para determinar a ligação em células que expressam 41BB, foram utilizadas células Jurkat-hu4-1 BB-NFk B-luc2 (Promega, CS196004). Assim, foram adicionadas 0,1 x 106 células Jurkat-hu4-1 BB-NFkBluc a cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo (Greiner bio-one,
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Cellstar, Cat. ns.: 650185). As placas foram centrifugadas durante 4 minutos a 400 x g a 4SC, e o sobrenadante foi descartado. As células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS e, em seguida, incubadas por 30 min. a 4SC com 100 pL/mL de DPBS contendo 1:5000 de de corante do kit de viabilidade celular ‘Fixable Viability Dye eFluor 450’ diluído (eBioscience, Cat. n° 64-0863-18). Em seguida, as células foram lavadas uma vez com 200 pL/poço de DPBS. Em seguida, 50 pL/poço de tampão de FACS frio 4°C contendo moléculas anti-41 BB humano biespecíficas direcionadas ao CEA tituladas foram adicionados e as células foram incubadas por 60 minutos a 4SC. As células foram lavadas quatro vezes com 200 pL/poço de tampão de FACS 4°C para remover moléculas não ligadas. Depois as células foram coradas com 50 pL/poço de tampão de FACS frio 4°C contendo 2,5 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IGg humana específico para fragmento Fcy AffiniPure conjugado a PE (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns. 109-116-098) ou 30 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IGg humana específico para fragmento Fcy AffiniPure conjugado a FITC (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns 109 096 098) e incubadas por 30 minutos a 4SC. As células foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de tampão de FACS e fixadas por resuspensão em 50 pL/poço de DPBS contendo formaldeído 1% (Sigma, HT501320-9.5L). As aquisições foram realizadas no mesmo dia ou no dia seguinte com o uso do 3-laser MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech). As janelas de análise (gates) foram definidas em células vivas e a média geométrica da intensidade de fluorescência (MFI) do anticorpo de detecção secundário foi usada para analisar a ligação dos anticorpos primários. Com o uso do programa Graph Pad Prism (Software Graph Pad Inc.) os dados foram ajustados aos valore basais subtraindo-se os valores em branco (sem anticorpo primário adicionado) e os valores de ECso foram calculados com o uso do ajuste de curva de regressão não linear (ajuste robusto), bem como a área sob a curva (AUC).
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285/331 [0403] Na Figura 21 A, a ligação a Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-luc2 é mostrada para moléculas agonistas de 4-1 BB biespecíficas direcionadas ao CEA. Todas as moléculas estão contendo uma porção bivalente do clone 20H4.9 de ligação ao antígeno 4-1 BB e apresentam ligação semelhante às células expressando 4-1 BB humano independentemente da sua porção de ligação ao CEA (diferem no clone ou fusão). Apenas a 4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 (triângulo preto) apresentou um valor de ECso um pouco mais baixo (Tabela 36) e uma AUC ligeiramente aumentada (Figura 21C). Um controle negativo incluído, por exemplo, DP47 hulgGI P329G LALA não direcionado (círculo preto aberto) exibiu o valor basal. Na Tabela 36 estão listados os valores de ECso.
Tabela 36
Valores de ECso De Curvas De Ligação À Linhagem De Células
Transgênicas Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-luc2 Que Expressam 4-1 BB humano
ECso [nM] on Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-Iuc2
4-1 BB (20H4.9) x DP47 2+1 0,05
4-1 BB (20H4.9) x CEA(A5B7) 2+1 0,01
4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7P) 2+1 0,06
4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7P) 2+1 CHCL crosstab 0,06
4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7P) 2+1 VHVL crosstab 0,05
4-1 BB (20H4.9) x CEA (T84.66-LCHA) 2+1 0,07
6.4.2. Ligação à Linhagem de Células Tumorais Que Expressam CEA Humano [0404] Para determinar a ligação ao CEA expresso em células, utilizou-se a linhagem de células de câncer gástrico humano MKN45 (DSMZ ACC 409). Por isso, 0,2 x 106 células MKN45 foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo (Greiner bio-one, Cellstar, Cat. ns.: 650185). As placas foram centrifugadas durante 4 minutos a 400 x g a 4SC, e o sobrenadante foi descartado. As células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS e, em seguida, incubadas por 30 min. a 4°C com 100 pL/mL de DPBS
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286/331 contendo 1:5000 de de corante do kit de viabilidade celular ‘Fixable Viability Dye eFluor 450 diluído (eBioscience, Cat. n° 64-0863-18). Em seguida, as células foram lavadas uma vez com 200 pL/poço de DPBS. Em seguida, 50 pL/poço de tampão de FACS frio 4°C contendo moléculas anti-4-1 BB humano biespecíficas direcionadas ao CEA tituladas foram adicionados e as células foram incubadas por 60 minutos a 4SC. As células foram lavadas quatro vezes com 200 pL/poço de tampão de FACS 4°C para remover moléculas não ligadas. Em seguida, as células foram adicionalmente incubadas com 50 pL/poço de tampão de FACS frio 4°C contendo 2,5 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IGg humana específico para fragmento Fcy AffiniPure conjugado a PE (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns. 109-116-098) ou 30 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IGg humana específico para fragmento Fcy AffiniPure conjugado a FITC (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns 109 096 098) e incubadas por 30 minutos a 4SC. As células foram lavadas duas vezes com 200 pL/poço de tampão de FACS e fixadas por resuspensão em 50 pL/poço de DPBS contendo formaldeído 1% (Sigma, HT501320-9.5L). As aquisições foram realizadas no mesmo dia ou no dia seguinte com o uso do 3-laser MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech). As janelas de análise (gates) foram definidas em células vivas e a média geométrica da intensidade de fluorescência (MFI) do anticorpo de detecção secundário foi usada para analisar a ligação dos anticorpos primários. Com o uso do programa Graph Pad Prism (Software Graph Pad Inc.) os dados foram ajustados aos valore basais subtraindo-se os valores em branco (sem anticorpo primário adicionado) e os valores de ECso foram calculados com o uso do ajuste de curva de regressão não linear (ajuste robusto), bem como a área sob a curva (AUC).
[0405] Na Figura 21B, a ligação à linhagem de células de câncer gástrico humano MKN45 que expressa CEA é mostrada para moléculas agonistas 4-1 BB biespecíficas direcionadas ao CEA. A afinidade mais forte foi
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287/331 observada com a molécula 4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 (triângulo preto) exibida pelo mais baixo valor de ECso de 8,9 nM e o maior valor de AUC mostrado na Figura 21 D. Todas as outras curvas de ligação não atingiram o platô com as concentrações testadas e, portanto, não são indicados os valores ECso. Dependendo do formato e do clone de ligação ao CEA integrado nas moléculas, as moléculas agonistas de 4-1 BB biespecíficas direcionadas ao CEA transmitem diferentes afinidades às células MKN45 que expressam CEA, como também é mostrado na AUC da Figura 21 D.
2.5 Ativação de NFkB
6.5.1 Ativação NFkB Em Células HeLa ou Jurkat Que Expressam 4-1 BB Humano E Linhagem de Células Repórteres Expressando Luciferase COCULTIVADAS COM CÉLULAS TUMORAIS QUE EXPRESSAM CEA [0406] As células HeLa-hu4-1 BB-NFkB-luc clone 26 (como na Figura 15, geração descrita em 2.5.1) ou Jurkat-hu4-1 BB-NFk B-luc2 (adquiridas da Promega, CS196004) foram utilizadas como linhagem de células repórter. Células HeLa-hu4-1 BB-NFkB-Iuc clone 26 foram coletadas e novamente resuspensas em meio DMEM, suplementado com 10% (v/v) de SBF e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 0,2 x 106 células/mL. No caso das células Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-luc2 serem utilizadas como linhagem de células repórter, as células foram coletadas e resuspensas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de SBF e 1% (v/v) de GlutaMAX-l para uma concentração de 0,2 x 106 células/mL. 100 pL (2 x 104 células) desta suspensão de células foram transferidos para cada poço de uma placa de cultura de tecido estéril 96 poços de fundo branco plano com tampa (Greiner bio-one, Cat. No. 655083). No caso das células HeLa-hu4-1 BB-kB NF-luc clone 26 as placas foram incubadas a 37SC e 5% de CO2 durante a noite. Para a realização do ensaio, foram adicionados 50 pL de meio contendo moléculas biespecíficas anti-4-1BB humano direcionadas ao CEA. A linhagem de células
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288/331 de adenocarcinoma gástrico humano expressando CEA, MKN45 (DSMZ ACC 409), foi resuspensa em meio DMEM (se a linhagem HeLa-hu4-1 BB-NF kB-Iuc clone 26 foi usada como linhagem de células repórter) ou meio RPMI 1640 (se a linhagem Jurkat-hu4-1 BB-NFkB-Luc2 foi usada como linhagem de células repórter) suplementado com SBF a 10% (v/v) e 1% (v/v), GlutaMAX-l a uma concentração de 2 x 106 células/mL. A suspensão de células MKN45 expressando CEA (50 pL) ou o meio usado como controle negativo foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas por 6 horas a 37SC e 5% de CO2 na incubadora de células. As células foram lavadas com 200 pL/poço de DPBS. 40 pL de Tampão de Lise recém preparado (Promega, Cat n°: E3971) foram adicionados a cada poço e as placas foram armazenadas durante a noite a -20sC. No dia seguinte as placas de células congeladas e 0 tampão de Detecção (Luciferase 1000 Assay System, Promega, Cat. ns. E4550) foram descongelados em temperatura ambiente. 100 pL de tampão de detecção foram adicionados a atividade da luciferase foi medida 0 mais rápido possível utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M5/M5E e 0 software SoftMax Pro (Molecular Devices).
[0407] Nas Figuras 23A e 23B são mostradas as propriedades de ativação de diferentes moléculas 4-1 BB (20H4.9) direcionadas ao CEA utilizando a linhagem de células repórter Jurkat-hu4-1 BB-NFkB -Iuc2 que expressa em 4-1 BB. Na Figura 23A a propriedade de ativação na ausência de MKN45 expressando CEA e na Figura 23B na presença de células MKN45 foi testada. Na ausência de qualquer reticulação, a ativação foi observada apenas em altas concentrações e com um máximo limitado. Os valores de EC50 estão diminuídos e 0 máximo de ativação aumentado na presença de células MKN45 com moléculas 4-1 BB (20H4.9) direcionadas ao CEA. Os valores AUC são exibidos na Figura 23C. A propriedade de ativação correlaciona-se positivamente com a afinidade de ligação às células MKN45 que expressam
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CEA mostradas na Figura 21B. Os valores de ECso estão listados na Tabela 37.
Tabela 37
Os VALORES DE ECso DAS CURVAS DE ATIVAÇÃO DA LINHAGEM DE CÉLULAS
REPÓRTER JURKAT-HU4-1 BB-NFKB-LUC2 NA PRESENÇA DE CÉLULAS TUMORAIS MKN45 EXPRESSANDO CEA.
ECso [nM]
4-1 BB (20H4.9) x CEA(A5B7P) 2+1 CHCL crossfab 0,09
4-1 BB (20H4.9) x CEA(A5B7P) 2+1 VHVL crossfab 0,05
4-1 BB (20H4.9) x CEA(A5B7P) 2+1 0,16
4-1 BB (20H4.9) x CEA(T84.66-LCHA) 2+1 0,19
4-1 BB (20H4.9) x CEA(A5B7) 2+1 0,03
4-1 BB (20H4.9) x DP47 2+1 0,09
4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA 0,02
6.6 Ensaio De Ativação De PBMCs Humanas Na Presença De Células
Tumorais Que Expressam CEA [0408] As células da linhagem de células MKN45 de câncer gástrico humano expressando CEA foram lavadas com DPBS (Gibco, Life Technologies, Cat. ns 14190326) e tratadas com tampão de dissociação celular baseado em PBS, isento de enzimas (Gibco, Life Technologies, Cat. ns. 13151014) durante 10 minutos a 37 SC. As células foram coletadas e resuspensas em meio de células T consistindo de RPMI 1640 (GIBCO, Life Technologies, Cat. No. 42401-042) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF, origem EUA, PAN biotech, P30-2009, Lote P150307GI, gama-irradiado e isento de micoplasma, inativado por calor 35 min. a 56SC), 1% de L-GlutaMAX-l (GIBCO, Life Technologies, No. Cat. 35050-038), 1 mM de piruvato de sódio (SIGMAAldrich, Cat.-No S8636), 1% de Solução de Aminoácidos não essenciais MEM (SIGMA-Aldrich, Cat.- N ° M7145), 50 μΜ de p-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, Cat. ns M3148) e irradiada com 50 Gy (X- Ray Irradiator RS 2000, fonte Rad). 2 x 104 células MKN45 em 50 pL de meio de células T foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços de cultura de tecidos de fundo redondo (TTP,
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Cat. No. 92697). Foram adicionados 50 μΙ_ de meio de células T contendo diferentes concentrações tituladas de moléculas agonistas de 4-1 BB direcionadas ao CEA ou controles, respectivamente. As PBMCs humanas foram marcadas em DPBS aquecido a 37 SC contendo 40 nM de CFDA-SE (SIGMA-Aldrich, ns de Catálogo 21888-25MG-F) durante 15 min. a 37SC. A marcação com CFSE foi interrompida pela adição de SBF, as PBMCs foram lavadas por duas vezes e resuspensas em meio de células T a uma concentração final de 1,5 x 106 células/mL. 50 μΙ_ desta solução de células PBMCs foram semeadas em cada poço para adicionar 7,5 x 104 PBMCs marcadas com CFSE. Por último, a solução estoque de meio de células T contendo 2 mM de IgGi humana agonista anti-CD3 humano clone V9 foi preparada e 50 pL/poço foram adicionados a cada poço originando uma concentração final de 0,5 mM de IgG 1 humana anti-CD3 humano clone V9.
[0409] As placas foram incubadas por 4 dias a 37SC. As células foram lavadas com DPBS e coradas com 100 pL/poço de DPBS contendo o kit de coloração LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit em uma diluição de 1:1000 (Molecular Probes, Life Technology, Cat.- ns L34957) durante 30 min. a 4 SC. As células foram lavadas uma vez com 200 pL/poço DPBS e coradas com 50 pL de tampão FACS (DPBS suplementado com 2% de SBF, 5 mM de EDTA pH 8 (Amresco, Cat. Ns E177) e 7,5 mM de azida de sódica (SigmaAldrich S2002)) contendo 0,1 mg/mL de lgG1 de camundongo anti-CD137 humano conjugado com CyCP-Cy5.5 (clone 4B4-1, BioLegend, Cat. No. 309814), 0,1 mg/mL de lgG1k de camundongo anti-PD/1 humano conjugado com PE/Cy7 (clone EH12.2H7, BioLegend, 329918), 0,03 pg/mL IgGi de camundongo anti-CD25 humano conjugado com APC (clone BC96, BioLegend, Cat. No. 302610), 0,06 pg/mL IgGlK de camundongo anti-CD8 humano conjugado com APC/Cy7 (clone RPA-T8, BioLegend, Cat. 3301016), IgGi de camundongo anti-CD4 humano conjugado com BV421 (clone RPA-T4,
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BioLegend, Cat. No: 300532) durante 30 min. a 4SC. As células foram resuspensas em tampão FACS de 100 pL/poço e adquiridas utilizando o MACS Quant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech). Os dados foram analisados usando FlowJo V10 (FlowJo, LLC) e GraphPad Prism 6.04 (GraphPad Software, Inc).
[0410] Conforme exibido nas Figuras 23A a 23D, as moléculas 41 BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 (G4S)2 são capazes de induzir a regulação positiva de CD25 bem como a proliferação melhorada de células T CD4 e CD8 na presença de um estímulo CD3 subótimo. As moléculas não direcionadas 41BB (20H4.9) x DP47 2+1 ou 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA induzem apenas ativação limitada de células T. Portanto, na presença de células que expressam CEA e um estímulo TCR subótimo as moléculas 4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 (G4S) 2 agonistas podem induzir a ativação e proliferação de células T de modo mais forte do que moléculas não direcionadas. Na Tabela 38 estão listados os valores de ECso.
Tabela 38
Valores de ECso De Curvas De Ativação De PBMCs Na Presença De
CÉLULAS TUMORAIS MKN45 QUE EXPRESSAM CEA.
4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7) 2+1 (G4S)2 4-1 BB (20H4.9) x DP47 2+1 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA
EC50% CD25+ CD4 0,06 1,63 0,29
EC50% CD25+ CD8 0,11 1,70 0,67
EC50% Proliferação de CD4 0,03 0,73 0,28
[0411] Como mostrado nas Figuras 24A a 24D, a ativação de
PBMCs de outro doador, como mostrado na Figura 23, foi monitorada. Todas as moléculas agonistas 4-1 BB (20H4.9) direcionadas ao CEA foram capazes de induzir a regulação positiva de CD25 bem como a proliferação melhorada de células T CD4 e CD8 na presença de um estímulo subótimo de CD3 acima das moléculas 4-1 BB (20H4.9) não direcionadas. Na Tabela 39 estão listados os valores de ECso.
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Tabela 39
Valores de EC50 De Curvas De Ativação De PBMCs Na Presença De
CÉLULAS TUMORAIS MKN45 QUE EXPRESSAM CEA.
4-1 BB (20H4.9) x DP47 2+1 4-1 BB (20H4.9) hulgGI P329G LALA 4-1 BB (20H4.9) x CEA(A5B7P) 2+1 4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7P) 2+1 CHCL cross 4-1 BB (20H4.9) x CEA (A5B7P) 2+1 VHVL cross
EC50% CD25+ CD4 1,64 0,61 0,24 0,19 0,14
EC50% CD25+ CD8 1,80 1,48 0,70 0,24 0,29
EC50% proliferação CD4 1,10 0,09 0,13 0,23 0,14
EC50% proliferação CD8 1,10 0,06 0,09 0,20 0,15
Exemplo 7
Preparação, Purificação E Caracterização De Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Tetravalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para CEA 7.1 Geração de anticorpos biespecíficos com ligação tetravalente para 41 BB E LIGAÇÃO monovalente para CEA [0412] Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação tetravalente para 4-1 BB e ligação monovalente para CEA, também denominados 4+1, conforme representado nas Figuras 4A e 4B. A tecnologia knobs into hole foi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero.
[0413] Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1_VHCH1 do ligante anti-4-1 BB (clone 20H4.9), seguido por Fc hole com a mutação hole (Fc hole), no qual a extremidade C-terminal um VL ou VH de um ligante anti-CEA (clone T84.66-LCHA ou A5B7) foi fundido. A segunda cadeia pesada HC2 compreendia de VHCH1_VHCH1 de ligante anti-4-1 BB (clone 20H4.9), seguido
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293/331 por Fc com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido a extremidade exterminai de um VH ou VL, respectivamente, de um ligante anti-CEA (clone T84.66-LCHA ou A5B7). A geração e a preparação do ligante de CEA T84.66LCHA estão descritas no documento WO 2016/075278 A2, que incorporado ao presente pela referência. As sequências VH e VL do clone CEA A5B7 foram obtidas a partir do documento WO 2007/071426 e derivam do clone murino anti-CEA A5B7. Para o ligante de 4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas de acordo com a publicação US 7.288.638 B2 ou US 7.659.384 B2. A combinação das duas cadeias pesadas permite a geração de um heterodímero, que inclui uma porção de ligação ao CEA e quatro Fabs de ligação ao 4-1 BB.
[0414] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Publicado WO2012/130831A1.
[0415] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas 4+1 anti-4-1BB anti-FAP hulgGI P329GLALA foram produzidas pela cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando a polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada k/?ob”:“vetor da cadeia leve”:“vetor da cadeia pesada hole).
[0416] A molécula de ligação ao antígeno foi produzida e purificada como descrito para a molécula biespecífica anti-4-1BB bivalente e anti-FAP hulgGI P329GLALA (vide o Exemplo 1.1).
[0417] O par de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1 BB, anti-CEA com a-CEA (T84.66-LCHA) VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 40. O par de bases e as sequências
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294/331 de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1 BB, anti-CEA (T84.66-LCHA) com a-CEA VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 41.
Tabela 40
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / ANTI-CEA (T84.66-LCHA) MONOVALENTE, IgGi HUMANA
P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH
FUNDIDO COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
79 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?o/e (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTTCT ACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCA GCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGT CCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACAC CTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCT CTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGG GAACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGA GCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAT CCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGC TGAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGG ATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCG GCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCC CAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACC AGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGA CAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGA CTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGT GGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAG CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGAC CCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG AGTAC AAGTG C AAGGTCTCC AAC AAAG CCCTCG GCG C CCCC ATCG AG AAAACC ATCTCC AAAG CC AAAG GG C AG CCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCC GGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGG AGGAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGG ATCCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTG TCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGTA GAGCCGGCGAGAGCGTGGACATCTTCGGCGTGGGATT TCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCC AGACTGCTGATCTACAGAGCCAGCAACCGGGCCACAG GCATCCCCGCCAGAI I I ICTGGCTCTGGCAGCGGCAC CGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGGAACCCGAG GACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGACCAACGAGG ACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAAT CAAG
80 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (T84.66-LCHA) (sequência nucleotidica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTTCT ACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCA GCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGT CCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACAC CTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCT CTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGG GAACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGA GCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAT CCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGC TGAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGG ATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCG GCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCC CAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACC AGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGA CAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGA
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296/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
CTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGT GGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAG CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGAC CCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG AGTAC AAGTG C AAGGTCTCC AAC AAAG CCCTCG GCG C CCCC ATCG AG AAAACC ATCTCC AAAG CC AAAG GG C AG CCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCA GAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACA AGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTT CTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGT GGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTG AGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGA GGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGA TCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGA AG AAACCCGG CAG C AG CGTG AAG GTGTCCTG C AAGG C CAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGG GTGCGCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATG GGCAGAATCGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACG TGCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGA CACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGC CTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCC CCTTCGGCTACTACGTGTCCGACTACGCCATGGCCTAT TGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotidica) vide a Tabela 1
81 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-bo/e (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 572/652
297/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVG FLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK
82 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTY MHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTIT ADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAY WGQGTLVTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 41
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (T84.66-LCHA) MONOVALENTE, IgGi HUMANA
P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM a-CEA VH FUNDIDO com a cadeia Fc hole eVL
FUNDIDO COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA ΜΗ-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
83 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCT GAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGC
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 573/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CAGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTT CGACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTC CAGCGCTTCCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCT GGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC CGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGA GCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGAC AAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGTCGTGACTGT GCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGCGGAG GCGGATCTGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGCTG CAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGA GACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAG CTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGAG CCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAGATCAA CCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCCTGGA AAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAA CCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGC CGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGG CCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGG CAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC CAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT GCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA CAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTG CACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCA CAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG GGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGG CGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCCCAGGTGC AGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCG GCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCT TCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCA GGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAAT
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 574/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CGACCCCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAA GTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAG CACCTCCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCG GAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCCCTT CGG CTACTACGTGTCCG ACTACG CC ATG GCCTATTG G GGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT
84 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knot> (T84.66-LCHA) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCT GAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTT CGACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTC CAGCGCTTCCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCT GGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC CGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGA GCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGAC AAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGTCGTGACTGT GCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGCGGAG GCGGATCTGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGCTG CAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGA GACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAG CTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGAG CCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAGATCAA CCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCCTGGA AAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAA CCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGC CGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGG CCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGG CAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC CAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT GCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA CAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 575/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTAC CCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGC CAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTG CTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAAC TGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAAC GTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCC GGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGG GGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGAGATCGT GCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCACTGTCTCC AGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGTAGAGCCGGCG AG AG CGTG G AC ATCTTCGG CGTGG G ATTTCTG C ACT GGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGC tgatctacagagccagcaaccgggccacaggcatcc CCGCCAGAI I I ICTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACT tcaccctgacaatcagcagcctggaacccgaggact tcgccgtgtactactgccagcagaccaacgaggacc cctacacctttggccagggcaccaagctggaaatcaa G
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
85 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKP GSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRI DPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS
86 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (T84.66-LCHA) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 576/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSP GERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIY RASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQTNEDPYTFGQGTKLEIK
46 VLCL-Cadeia (20H4.9) leve vide a Tabela 1
[0418] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1 BB, anti-CEA (A5B7) com a-CEA (A5B7) VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 42. Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1 BB, anti-CEA (A5B7) com a-CEA VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 43.
Tabela 42
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / (A5B7) ANTI-CEA MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
91 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (A5B7) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTTCC ACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCA GCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGT
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 577/652
302/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
CCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACAC CTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCT CTGTCCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAG AGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGA TCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTG CTGAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCG TGTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATC GGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACC CCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACAC CAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTG ACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAG ACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTG TGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTA GCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC CTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCA AATCTTGTG AC AAAACTC AC AC ATG CCC ACCGTG CCC A GCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGC GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC AGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATC CCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCG TGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCC TCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAG GAGGAGGATCCGGCGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAG GATCCGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACT GGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCC GCCAGCGGCTTTACCGTGTCCAGCTACTGGATGCACT GGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGG TCG G ATTCATC AG AAAC AAGG CC AACGG CGG C ACC AC CGAGTACGCCGCCTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATC AGCCGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGAGACAGAGGCCTGCGGTTCTACTTCGAC TACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTCTCTTCC
92 VHCH1-VHCH1 CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTG
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 578/652
303/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
(20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (A5B7) (sequência nucleotídica) AAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGT ACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGAT CCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGG CGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCC AGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCA GCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGAC AGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAC TACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTG GGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTTCC ACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCA GCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGT CCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACAC CTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCT CTGTCCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCCTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAG AGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGA TCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTG CTGAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCG TGTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATC GGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAACC CCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACAC CAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTG ACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAG ACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTG TGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTA GCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC CTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCA AATCTTGTG AC AAAACTC AC AC ATG CCC ACCGTG CCC A GCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGC GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTG CAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGG TGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGT G G AGTG GG AG AG C AACGG CC AG CCTG AG AAC AACT AC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCT TCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGG TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGC ACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCT GAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGG AGGAGGATCTGGGGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGG
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 579/652
304/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
ATCTCAGGCCGTGCTGACACAGCCTGCCAGCCTGTCT GCTTCTCCTGGCGCCTCTGCCTCCCTGACCTGCACACT GAGAAGAGGCATCAACGTGGGCGCCTACAGCATCTAC TGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAGCCCCCCTCAGTACC TGCTGAGATACAAGAGCGACAGCGACAAGCAGCAGGG CAGCGGCGTGTCCAGCAGATTCAGCGCCAGCAAGGAC GCCTCTGCCAACGCCGGAATCCTGCTGATCAGCGGCC TGCAGTCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCATGAT CTGGCACTCTGGCGCCAGCGCCGTGTTTGGCGGAGGC ACAAAACTGACCGTGCTG
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
93 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (A5B7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR qspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtsknqf slklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtl vtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpss slgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdggggsggg gsqvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywsw irqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrg tlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyf pepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvp ssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcpp cpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsh edpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvlt vlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprep qvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesng qpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfs csvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggs ggggsevqlvesggglvqpgrslrlscaasgftvssyw mhwvrqapgkglewvgfirnkanggtteyaasvkgrft isrddskntlylqmnslraedtavyycardrglrfyfdy wgqgttvtvss
94 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (A5B7) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswir qspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtsknqf slklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrgtl vtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpss slgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdggggsggg gsqvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywsw irqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgrg tlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyf pepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvp ssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcpp cpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsh edpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvlt vlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprep qvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesng qpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfs csvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggs ggggsqavltqpaslsaspgasasltctlrrginvgaysi
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 580/652
305/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
YWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKD ASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKL TVL
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 43
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
91 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (A5B7) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCT GAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTT CGACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTC CAGCGCTTCCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCT GGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC CGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGA GCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGAC AAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGTCGTGACTGT GCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGCGGAG GCGGATCTGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGCTG CAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGA GACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAG CTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGAG CCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAGATCAA CCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCCTGGA AAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAA CCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGC CGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGG CCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGG CAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC CAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAC
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 581/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT GCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA CAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTG CACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCA CAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG GGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGG CGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCCGAAGTGC AGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTG GCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCT TTACCGTGTCCAGCTACTGGATGCACTGGGTCCGACA GGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTCGGATTCAT CAGAAACAAGGCCAACGGCGGCACCACCGAGTACGC CGCCTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGA CGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAG CCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACAGAGGCCTGCGGTTCTACTTCGACTACTG GGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTCTCTTCC
92 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (A5B7) (sequência nucleotídica) CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCT GAAGCCCAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCGCCGT GTACGGCGGCAGCTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTG GATCCGGCAGAGCCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGAT CGGCGAGATCAACCACGGCGGCTACGTGACCTACAA CCCCAGCCTGGAAAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGA CACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAG CGTGACAGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGGCCCTGGCAACTACGACTGGTACTT CGACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTC CAGCGCTTCCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCT GGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC CGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGA GCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGAC AAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGTCGTGACTGT GCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGCGGAG GCGGATCTGGCGGCGGAGGATCCCAGGTGCAGCTG CAGCAGTGGGGAGCCGGCCTGCTGAAGCCCAGCGA GACACTGAGCCTGACCTGCGCCGTGTACGGCGGCAG CTTCAGCGGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGAG
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 582/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
CCCCGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAGATCAA CCACGGCGGCTACGTGACCTACAACCCCAGCCTGGA AAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAA CCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGC CGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGG CCCTGGCAACTACGACTGGTACTTCGACCTGTGGGG CAGAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC CAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT GCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA CAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTAC CCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGC CAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTG CTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAAC TGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAAC GTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCC GGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGG GGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTCAGGCCG TGCTGACACAGCCTGCCAGCCTGTCTGCTTCTCCTGG CGCCTCTGCCTCCCTGACCTGCACACTGAGAAGAGG CATCAACGTGGGCGCCTACAGCATCTACTGGTATCAG CAGAAGCCCGGCAGCCCCCCTCAGTACCTGCTGAGA TACAAGAGCGACAGCGACAAGCAGCAGGGCAGCGG CGTGTCCAGCAGATTCAGCGCCAGCAAGGACGCCTC TGCCAACGCCGGAATCCTGCTGATCAGCGGCCTGCA GTCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCATGATCTG GCACTCTGGCGCCAGCGCCGTGTTTGGCGGAGGCAC AAAACTGACCGTGCTG
43 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) (sequência nucleotídica) vide a Tabela 1
93 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (A5B7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 583/652
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQP GRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFI RNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
94 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada ML-knob (A5B7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASP GASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRY KSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSED EADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0419] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1 BB, anti-CEA (A5B7P) com a-CEA VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontramse respectivamente na Tabela 44. Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1 BB, anti-CEA (A5B7P) com a-CEA VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 584/652
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Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 45.
Tabela 44
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7P) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
203 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-bo/e (A5B7P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQTVLSQSPAILSASP GEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNL ASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWS SKPPTFGGGTKLEIK
204 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (A5B7P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLVESGGGLVQP GGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFI GNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRA
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 585/652
310/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
EDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 45
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB TETRAVALENTE / ΑΝΤΙ-CEA (A5B7P) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
205 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (A5B7P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYY MNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTI SRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYW GQGTTLTVSS
206 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL knob (A5B7 P) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 586/652
311/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSQTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHW YQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTI SRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0420] Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti-4-1 BB, anti-CEA (431/26) com a-CEA VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontramse respectivamente na Tabela 46. Os pares de bases e as sequências de aminoácidos para 4+1 anti-4-1 BB, construções anti-CEA (431/26) com a-CEA VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 47.
Tabela 46
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / ANTI-CEA (431/26) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VH FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
207 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VL-/?o/e (431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCSTSSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQWSS YPTFGQGTKVEIK
Petição 870190058766, de 25/06/2019, pág. 587/652
312/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
208 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia Pesada VH-knob (431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVRP SQTLSLTCTVSGFTISSGYSWHWVRQPPGRGLEWIGYI QYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADT AVYYCAREDYDYHWYFDVWGQGSLVTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 47
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / ANTI-CEA (431/26) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CEA VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
209 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
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313/331
GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVRP SQTLSLTCTVSGFTISSGYSWHWVRQPPGRGLEWIGYI QYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADT AVYYCAREDYDYHWYFDVWGQGSLVTVSS
210 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (431/26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCSTSSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQWSS YPTFGQGTKVEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Exemplo 8
Preparação, Purificação E Caracterização De Moléculas De Ligação De
Ao Antígeno Biespecíficas Com Ligação Bivalente Para 4-1 BB E Monovalente Para C19
8.1 Geração de anticorpos biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB E LIGAÇÃO MONOVALENTE PARA CD19 [0421]Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação bivalente para 4-1 BB e ligação monovalente para C19, também denominados 2+1, como representado nas Figuras 1A e 1B. A tecnologia knobs into hole foi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e
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314/331 introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero.
[0422]Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1 do ligante anti-4-1BB (clone 20H4.9), seguido por Fc hole com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido a extremidade C-terminal de uma VL ou VH de um ligante anti-C19 (clone 2B11 ou 8B8-018). A segunda cadeia pesada HC2 era compreendida de VHCH1 de anti-4-1BB seguida por Fc knob, na qual o C-terminal de um VH ou VL, respectivamente, do ligante anti-19 (clone 2B11 ou 8B8-018) foi fundido. A geração e a preparação dos ligantes de CD19 clones 2B11 ou 8B8-018 estão descritas no documento WO 2016/075278 A2, que incorporado ao presente pela referência. Para o ligante de 4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas de acordo com a publicação US 7.288.638 B2 ou US 7.659.384 B2. A combinação das duas cadeias pesadas permite a geração de um heterodímero, que inclui uma porção de ligação ao CD19 e dois Fabs de ligação ao 4-1 BB (Figuras 1A e 1B).
[0423]As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Publicado WO2012/130831A1.
[0424]As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1BB, as construções anti-CD19 com a-CD19 (2B11) VH fundido a cadeia knob e VL fundido a cadeia hole podem ser encontradas, respectivamente, na Tabela 48. As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1BB, construções antiCD19 (2B11) com a-CD19 VL fundido a cadeia knob e VH fundido a cadeia hole podem ser encontradas, respectivamente, na Tabela 49.
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315/331
Tabela 48
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ANTI-CP19 (2B11) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CD19 VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEE VH FUNDIDO
COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
139 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VL/?o/e(2B11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC KSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLED PYTFGQGTKLEIK
140 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob(2B11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC KASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSK YTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCA RGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
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316/331
Tabela 49
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ANTI-CD19 (2B11) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-C19 VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEE VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
141 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VH hole (2B11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC KASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSK YTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCA RGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS
142 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VL/otoò(2B11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC KSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLED PYTFGQGTKLEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0425] As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1 BB, as construções anti-CD19 com a-CD19 (8B8-018) VH fundido a cadeia knob e VL fundido a cadeia hole podem ser encontradas, respectivamente, na Tabela 50. As sequências de aminoácidos para 2+1 anti-4-1 BB, as construções anti-CD19 (8B8-018) com a-CD19 VL fundido a cadeia knob e VH fundido a cadeia hole
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317/331 podem ser encontradas, respectivamente, na Tabela 51.
Tabela 50
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ANTI-CD19 (8B8-018) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-CD19 VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEE VH FUNDIDO
COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
143 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VLhole (8B8-018) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLW GRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLS LSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQ SPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK
144 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia Pesada VHknob (8B8-018) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLW GRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGA EVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGL EWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYME LSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTV SS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
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318/331
Tabela 51
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
BIVALENTE / ANTI-CD19 (8B8-018) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-C19 VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
145 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VH hole (8B8-018) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC KASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSK YTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCA RGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS
146 VHCH1 (20H4.9)- Cadeia pesada VLknob (8B8-018) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC KSSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHV PYTFGQGTKLEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0426]As construções 2+1 anti-4-1 BB, anti-CD19 hulgGI
P329GLALA biespecíficas foram produzidas pela cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando a polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada
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319/331 knob'.“vetor da cadeia leve”:“vetor da cadeia pesada hole).
[0427] Para a produção em frascos de 500 ml agitados, 400 milhões de células HEK293 EBNA foram semeadas 24 horas antes da transfecção. Para a transfecção as células foram centrifugadas por 5 minutos a 210 x g e o sobrenadante foi substituído por meio CD CHO préaquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD CHO para um valor final de 200 pg de DNA. Após a adição de 540 pL de PEI, a solução foi agitada em vortex durante 15 segundos e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida as células foram misturadas com a solução DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 500 mL e incubadas durante 3 horas a 37SC em uma incubadora com atmosfera de CO2 a 5%. Após 0 tempo de incubação 160 mL de meio F17 foram adicionados e as células foram cultivadas durante 24 horas. Um dia após a transfecção, 1 mM de ácido valpróico e Feed a 7% foram adicionados. Após uma cultura de 7 dias, 0 sobrenadante celular foi coletado por centrifugação durante 15 minutos a 210 x g. A solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 pm), suplementada com azida sódica para uma concentração final de 0,01% (p/ν), e mantida a 4SC.
[0428]As proteínas secretadas foram purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando Proteína A, seguido pela cromatografia de exclusão por tamanho. Para a cromatografia por afinidade 0 sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de Proteína A MabSelectSure (Volume de coluna (CV) = 5 mL, GE Healthcare), equilibrada com 40 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida pela lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de fosfato de sódio 20 mM, tampão contendo citrato de sódio a 20 mM, pH 7,5. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear de cloreto de sódio (a 20 a 100 mM)
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320/331 criado ao longo de 15 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de citrato de sódio a 20 mM, NaCI a 100 mM, Glicina a 100 mM, em pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado pela adição de 1/40 (v/v) de 2M de Tris, pH 8,0. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna Hiload Superdex 16/600 S200 (GE Healthcare), equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCI, pH 6,0.
[0429] A concentração de proteína das construções biespecíficas purificadas foi determinada por medição da Densidade Óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor (Invitrogen, EUA) utilizando um instrumento LabChipGXII (Caliper). O teor agregado das construções biespecíficas foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão por tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPO4, 125 mM de NaCI, 200 mM de monocloridrato de L-arginina, 0,02% (p/v) de NaNa, tampão de corrida pH 6,7 a 25SC.
Tabela 52
Análise Bioquímica De Moléculas De Ligação De Antígeno Biespecíficas
Com Ligação Bivalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para CD19 (2+1 ANTl-4-1 BB, ANTI-CP19 (2B11) IgG1 HUMANA P329GLALA E 2+1 Anti-41 BB, ANTI-CD19 (8B8-018) IgG1 HUMANA P329GLALA)
Molécula Monômero [%] Rendimento [mg/l] CE-SDS (não redut.)
4-1 BB (20H4.9)/CD19 (2B11) P329GLALA lgG1 2+1 (VL hole) 99 3 100
4-1 BB (20H4.9)/CD19 (8B8-018) P329GLALA lgG1 2+1 (VL hole) 92 2 92
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321/331
Exemplo 9
Preparação, Purificação E Caracterização De Anticorpos Biespecíficos Com Ligação Tetravalente Para 4-1 BB E Ligação Monovalente Para CD19 9.1 Geração de anticorpos biespecíficos com ligação tetravalente para 41 BB E LIGAÇÃO MONOVALENTE PARA CD19 [0430] Foram preparados anticorpos 4-1 BB agonistas biespecíficos com ligação tetravalente para 4-1 BB e ligação monovalente para CD19, também denominados 4+1, conforme representado nas Figuras 4A e 4B. A tecnologia knobs into hole foi aplicada introduzindo as mutações S354C/T366W na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada Fc knob) e introduzindo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada Fc hole) para permitir a geração de um heterodímero. Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção compreendia os seguintes componentes: VHCH1_VHCH1 do ligante anti-41BB (clone 20H4.9), seguido por Fc hole com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido a extremidade C-terminal de uma VL ou VH de um ligante antiC19 (clone 2B11 ou 8B8-018). A segunda cadeia pesada HC2 compreendia de VHCH1_VHCH1 do ligante anti-4-1BB (clone 20H4.9), seguido por Fc com a mutação knob (Fc knob), no qual foi fundido o C-terminal de um VH ou VL, respectivamente, de um ligante anti-CD19 (clone 2B11 ou 8B8-018). A geração e a preparação dos ligantes de CD19 clones 2B11 ou 8B8-018 estão descritas no documento WO 2016/075278 A2, que incorporado ao presente pela referência. Para o ligante de 4-1 BB, as sequências VH e VL do clone 20H4.9 foram obtidas de acordo com a publicação US 7.288.638 B2 ou US 7.659.384 B2. A combinação das duas cadeias pesadas permite a geração de um heterodímero, que inclui uma porção de ligação ao CD19 e quatro Fabs de ligação ao 4-1 BB.
[0431] As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram
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322/331 introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no Pedido Publicado WO2012/130831A1.
[0432] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas 4+1 anti-4-1BB anti-C19 hulgGI P329GLALA foram produzidas pela cotransfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos utilizando a polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção 1:1:1 (“vetor da cadeia pesada knob”:“vetor da cadeia leve”:“vetor da cadeia pesada hole).
[0433] A molécula de ligação ao antígeno foi produzida e purificada como descrito para a molécula biespecífica anti-4-1BB bivalente e anti-CD19 hulgGI P329GLALA (vide o Exemplo 8.1).
[0434] As sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti4-1 BB, anti-CD19 (2B11) com a-CD19 VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 53. As sequências de aminoácidos para 4+1 anti-4-1BB, as construções anti-CD19 (2B11) com a-CD19 VL fundido com a cadeia pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 54.
TABELA 53
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB TETRAVALENTE / ANTI-CP19 MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES 4+1 COM A-CD19 VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEE VH FUNDIDO COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
147 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada Fc VL-/?o/e (2B11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
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323/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTP GQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIY RVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CLQLLEDPYTFGQGTKLEIK
148 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada Fc VH-knob (2B11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYI NPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSD DTAVYYCARGTYYYG PQLFD YWGQGTTVTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 54
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB TETRAVALENTE / ANTI-CP19 (2B11) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-C19 VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLE E VL FUNDIDO COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
149 VHCH1-VHCH1 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR
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324/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
(20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (2B11) QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYI MHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTM TSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDY WGQGTTVTVSS
150 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VL-knob (2B11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGT TYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGT DFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIK
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
[0435] As sequências de aminoácidos para construções 4+1 anti
4-1 BB, anti-CD19 (8B8-018) com a-CD19 VH fundido com a cadeia pesada Fc knob e VL fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 55. As sequências de aminoácidos para 4+1 anti-4-1 BB, as construções anti-CD19 (8B8-018) com a-CD19 VL fundido com a cadeia
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325/331 pesada Fc knob e VH fundido com a cadeia pesada Fc hole encontram-se respectivamente na Tabela 56.
Tabela 55
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB
TETRAVALENTE / ANTI-CP19 MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES 4+1 COM A-CD19 (8B8-018) VL FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEE
VH FUNDIDO COM A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VL-fíOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
151 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada Fc VL-/?o/e (8B8-018) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNG NTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSG TDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK
152 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada Fc VH-knot> (8B8-018) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIR QSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGG GSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSW IRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYI MHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTM
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SEQ ID NO: Descrição Sequência
TSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDY WGQGTTVTVSS
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Tabela 56
Sequências das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, anti-4-1 BB TETRAVALENTE / ANTI-CP19 (8B8-018) MONOVALENTE, IgGi HUMANA P329GLALA (CONSTRUÇÕES COM A-C19 VH FUNDIDO COM A CADEIA FC HOLEEVL FUNDIDO COM
A CADEIA FC KNOB, DENOMINADA VH HOLE)
SEQ ID NO: Descrição Sequência
153 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada VH hole (8B8-018) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWI RQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGR GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGG GSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFS GYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYI NPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSD DTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS
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327/331
SEQ ID NO: Descrição Sequência
154 VHCH1-VHCH1 (20H4.9)-Cadeia pesada ML-knob (8B8-018) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswi rqspekglewigeinhggyvtynpslesrvtisvdtskn qfslklssvtaadtavyycardygpgnydwyfdlwgr gtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkd yfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvv tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdggg gsggggsqvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfs gyywswirqspekglewigeinhggyvtynpslesrvti svdtsknqfslklssvtaadtavyycardygpgnydw yfdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggta algclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssg lyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvep kscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrt pevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpre eqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgap iektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvk gfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslsp gggggsggggsggggsggggsdivmtqtplslsvtp gqpasisckssqslenpngntylnwylqkpgqspqlli yrvskrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvy yclqlthvpytfgqgtkleik
46 VLCL-Cadeia leve (20H4.9) vide a Tabela 1
Exemplo 10
Caracterização Funcional De Moléculas De Ligação A Antígenos Biespecíficas Que Se Ligam Ao 4-1 BB e CD19
10.1 Ligação ao CD19 [0436] As propriedades de ligação de anticorpos biespecíficos, bivalentes para anti-4-1 BB / monovalentes para anti-CD19 (denominados 41BBxCD19) ao CD19 foram medidas em células B humanas primárias ou em linhagens de células tumorais positivas para CD19 (células WSU-DLCL2, ns de acesso DSMZ: 575). Resumidamente, as PBMCs totais foram purificadas a partir da camada leucoplaquetária de doadores saudáveis. As células resupensas em DPBS (Gibco, Life Technologies, Cat. ns. 14190 326) foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo (Greiner bio-one, Cellstar, Cat. ns.: 650185). As células foram lavadas uma vez com 200 pL de DPBS. As células foram resuspensas em 100 pL/poço de tampão DPBS frio a 4SC contendo 1: 5000 de
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328/331 corante Fixable Viability Dye eFluor 660 diluído (eBioscience, Cat. No. 65-0864-18) e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 4SC. As células foram lavadas uma vez com 200 pL/poço de tampão DPBS frio a 4°C e resuspensas em 50 pL/poço de tampão FACS frio a 4 °C (DPBS suplementado com 2% de SBF, 5 mM de EDTA, pH 8 (Amresco, Cat. No. E177) e 7,5 mM de azida sódica (Sigma-Aldrich S2002)) contendo as construções 4-1 BB(20H4.9)xCD19(2B11) 2+1, 4 1BB(20H4.9)xCD19(8B8-018) 2+1 (a estrutura de ambas mostrada na Figura 16A), CD19 (2B11) x4-1 BBL (Figura 16B, descrita no documento WO 2016/075278 A1) e DP-47x4-1BBL (Figura 16C, descrita no documento WO 2016/075278 A1) em um série de concentrações, seguidos por incubação durante 1 hora a 4SC. Após lavagem extensiva, as células foram coradas com 50 pL/poço de tampão FACS frio a 4SC contendo 5 pg/mL de Fragmento F(ab')2 de cabra AffinidPure específico antiF(ab') IgG humano (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109 116 098), e com urn anticorpo CD20 conjugado com APC-H7 (BD, Cat. No. 560734), e um anticorpo anti-CD3 conjugado com APC (Biolegend, Cat. No. 300312) e/ou um anticorpo antiCD19 conjugado com FITC (BD) durante 30 minutos a 4SC. As células foram lavadas por duas vezes com 200 pL/poço de tampão FACS a 4 °C e as células foram fixadas com DPBS contendo formaldeído a 1% (Sigma, HT501320-9.5L). As células foram resuspensas em 100 pL/poço de tampão FACS e adquiridas utilizando o FACS LSR II (BD Biosciences). Os dados foram analisados usando FlowJo V10 (FlowJo, LLC) e GraphPad Prism 6.04 (GraphPad Software, Inc).
[0437] As células foram fechadas na janela de análise (gated) para populações de células CD3-CD20+ residentes, e as médias geométricas da intensidade de fluorescência do fragmento F(ab')2 de cabra específico para o fragmento Fcy de IgG humana AffiniPure conjugado com PE foram plotadas contra a concentração titulada de construções. Conforme mostrado nas Figuras 17A e 17B, a 4-1 BB (20H4.9) xCD19 (2B11) se liga às células B humanas de forma dosedependente, com uma afinidade menor quando comparada com CD19(2B11)x4
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BBL, enquanto que DP47x4-1 BBL não direcionada não se liga às células B (Figura 17A). De maneira similar, as construções 4-1BB(20H4.9)xCD19(2B11) se ligam às células tumorais CD19+WSU de um modo semelhante ao que ocorre com células B primárias. (Figura 17B). A molécula 4-1BB(20H4.9)xCD19(8B8-018) mostra uma propriedade de ligação idêntica em comparação com a 41 BB(20H4.9)xCD19(2B11). Na Tabela 57 estão listados os valores ECso das curvas das curvas de ligação às células tumorais CD19+.
Tabela 57
Valores de EC50 de Curvas de Ligação às Células Tumorais CD19+
FCcn (nMl 4-1 BB(20H4.9) 4-1 BB(20H4.9) CD19(2B11)
xCD19(2B11) xCD19(8B8-018) X4-1BBL
Ligação de células B 5,01 5,72 0,37
Ligação WSU 2,26 3,56 0,30
10.2 Ligação Ao 4-1 BB Em Células T Ativadas [0438] Para verificar a ligação da molécula 4-1 BBxCD19 às células T que expressam 4-1 BB, PBMCs humanas foram pré-ativadas por estimulação TCR para a regulação positiva do 4-1 BB nas células T durante 48 horas. As PBMCs purificadas foram diluídas para uma concentração de 2,8 x 106/mL resuspensas em meio RPMI (Gibco, Cat No. 72400-054) + 10% de SBF (Gibco, No. Cat.: 20012-068) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Cat No. 15070-063) e 50 μΜ de 2Mercaptoetanol (Gibco, No. Cat. 31350-010). 90 pL de células foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo (Greiner bio-one, Cellstar, Cat. η0.: 650185). Em seguida, mais 50 pL de microesferas anti-CD3 e anti-CD28 (Life Technologies, Cat No. 1113 1 D) a uma concentração de 8 x 105 esferas/mL foram adicionados aos poços. Após dois dias, as células foram lavadas com PBS frio (Gibco, 20012-068) por uma vez, e resuspensas com 90 pL de PBS frio, e incubadas com 10 pL de solução contendo as construções (4
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330/331
1BB(20H4.9)xCD19(2B11), 4-1BB(20H4.9)xCD19(018) e CD19(2B11)x4-1BBL) por 1 hora a 4SC. Após lavagem extensiva, as células foram coradas com 50 pL/poço de tampão FACS frio a 4°C contendo 5 pg/mL de fragmento F(ab’)2 de cabra antiIgG humana específico para fragmento F(ab’)2 AffiniPure (Jackson ImmunoResearch, Cat. ns. 109 116 098) e adicionalmente com anticorpos anti-CD3 humano (Biolegend, Cat No. 300312), CD4 (Biolegend, Cat No. 317434) e CD8 (Biolegend, Cat No. 344710) durante 30 minutos a 4 SC. As células foram lavadas por duas vezes com 200 pL/poço de tampão FACS a 4 °C e as células foram fixadas com DPBS contendo formaldeído a 1% (Sigma, HT501320-9.5L). As células foram resuspensas em 100 pL/poço de tampão FACS e adquiridas utilizando o FACS LSR II (BD Biosciences). Os dados foram analisados usando os programas de computação FlowJo V10 (FlowJo, LLC) e GraphPad Prism 6.04 (GraphPad Software, Inc).
[0439] A ligação específica foi analisada nas populações de células CD4 e CD8 puras selecionadas em uma janela de análise (gated). 41BB(20H4.9)xCD19(2B11) mostrou excelente ligação às células T CD4 ou CD8 expressando 4-1 BB de uma maneira dose-dependente, mas com uma afinidade ligeiramente inferior em comparação com a CD19(2B11 )-4-1 BBL (Figuras 18A e 18B). 4-1BB(20H4.9)xCD19(018) mostra uma propriedade de ligação idêntica em comparação com 4-1BB(20H4.9)xCD19(2B11). Na Tabela 58 estão listados os valores ECso das curvas das curvas de ligação às células T CD4+ ou CD8+.
TABELA 58
Valores de ECso de Curvas de Ligação às Células T CD4+ ou CD8+.
EC50 (nM) 4-1 BB(20H4.9) xCD19(2B11) 4-1 BB(20H4.9) xCD19(018) CD19(2B11)x4- 1BBL
Ligação a CD4 2,05 2,63 0,37
Ligação a CD8 0,86 0,55 0,90
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331/331
10.3 A Construção 4-1 BBxCD19 Demonstrou Atividade Biológica
Para medir as atividades biológicas em contextos fisiológicos, foram utilizadas PBMCs humanas ativadas para verificar a liberação da molécula de função efetora, ΙΡΝγ, pelo coestímulo das células T e células NK. Resumidamente, as PBMCs purificadas cocultivadas com as construções 41 BB(20H4.9)xCD19(2B11), 4-1 BB(20H4.9)xCD19(018), CD19(2B11 )x4-1 BBL e DP-47x4-1 BBL) foram adicionadas aos poços em concentrações seriadas, e com mais 50 pL de microesferas anti-CD3 e anti-CD28 (Life Technologies, Cat No. 11131 D) a 8x105 esferas/mL. Após 48 horas de incubação, o sobrenadante foi coletado para a medição de IFN-γ por ELISA (kit DuoSet Human IFNg ELISA, R&D Systems, Cat. DY285). A Figura 19 mostra que ambas as construções 4-1 BB(20H4.9)xCD19(2B11) e CD19(2B11)x4-1 BBL estimularam as PBMCs para produzir uma quantidade semelhante de IFNy de maneira dose-dependente, enquanto que a construção DP47x4-1BBL não direcionada (controle negativo) não ativou as células T ou NK devido à ausência de reticulação. A construção 4-1 BB(20H4.9)xCD19(018) mostrou uma atividade biológica semelhante quando comparada com a construção 41 BB(20H4.9)xCD19(2B11). Na Tabela 59 estão listados os valores de ECso da produção de IFN-y.
Tabela 59
Valores de ECso da produção de IFN-r
EC50 (nM) 4-1 BB(20H4.9) xCD19(2B11) 4-1BB(20H4.9) xCD19(018) CD19(2B11)x4- 1BBL
Produção de IFNy 0,10 0,06 0,03
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Claims (34)

  1. Reivindicações
    1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
    uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1 BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
  2. 2. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB compreender uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (Vl4-1BB) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
  3. 3. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizada pelo
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    2/13 domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB ser um fragmento Fab.
  4. 4. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo antígeno da célula alvo ser selecionado a partir do grupo consistindo de proteína ativadora de fibroblastos (FAP), sulfato de condroitina proteoglicano associado ao melanoma (MCSP), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembrionário (CEA), CD19, CD20 e CD33.
  5. 5. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à proteína de ativação de fibroblastos (FAP).
  6. 6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) compreender, (a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou
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    3/13 (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
  7. 7. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) compreender;
    (a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) compreendendo uma
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    4/13 sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
  8. 8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA).
  9. 9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 ou 8, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreender, (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
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    5/13
    35 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 182, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 184, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192.
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  10. 10. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 ou 8 ou 9, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao Antígeno Carcinoembrionário (CEA) compreender; (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% , 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, ou (c) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186, ou (d) uma região variável de cadeia pesada (VhCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 e uma região variável de cadeia leve (VlCEA) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194.
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    7/13
  11. 11. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao C19.
  12. 12. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 ou 11, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao CD19 compreender;
    (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166, (v) CDR-L2 compreendendo
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    8/13 a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
  13. 13. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 ou 11 ou 12, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao CD19 compreender; (a) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% , 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VhCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 e uma região variável de cadeia leve (VlCD19) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
  14. 14. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada por compreender um domínio Fc de IgG, particularmente um domínio Fc de IgGi ou um domínio Fc de lgG4.
  15. 15. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizada pelo domínio Fc compreender uma ou mais substituição de aminoácidos que reduz a ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica a um receptor de Fc e/ou reduz a função efetora, particularmente as mutações L234A, L235A e
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    9/13
    P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
  16. 16. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizada por compreender;
    (a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
    (b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
    (c) um domínio Fc de IgG que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.
  17. 17. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizada por compreender;
    (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL capazes de ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, em que o domínio VH está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas e o domínio VL está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal da segunda cadeia pesada.
  18. 18. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizada por compreender;
    (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo
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    10/13 compreendendo dois fragmentos Fab capazes de se ligar especificamente ao 4-1 BB e ao domínio Fc, e (b) um fragmento crossFab capaz de se ligar especificamente ao antígeno da célula alvo que está conectado por um ligante peptídico ao C-terminal de uma das duas cadeias pesadas.
  19. 19. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizada por compreender;
    (a) quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente ao 4-1 BB;
    (b) um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e;
    (c) um domínio Fc de IgG que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação da molécula de ligação ao antígeno a um receptor Fc e/ou função efetora.
  20. 20. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado pelo fato de que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
  21. 21. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo da reivindicação 20.
  22. 22. MÉTODO DE PRODUÇÃO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado por compreender a cultura da célula hospedeira da reivindicação 21 sob condições adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno biespecífica.
  23. 23. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizado pelo fato
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    11/13 que compreende uma molécula de ligação biespecífica de qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  24. 24. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada para uso no tratamento do câncer ou doença infecciosas.
  25. 25. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, ou a composição farmacêutica da reivindicação 23, caracterizada por ser utilizada como um medicamento.
  26. 26. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada para uso;
    (i) na estimulação da resposta de células T, (ii) no suporte à sobrevivência de células T ativadas, (iii) no tratamento de infecções, (iv) no tratamento do câncer, (v) no atraso da progressão do câncer; ou (vi) no prolongamento da sobrevida de um paciente que sofre de câncer.
  27. 27. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, ou a composição farmacêutica da reivindicação 23, caracterizada por ser utilizada no tratamento do câncer.
  28. 28. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, para uso no tratamento do câncer, caracterizada por ser administrada em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia e/ou outros agentes para uso na
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    12/13 imunoterapia do câncer.
  29. 29. USO, da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, ou da composição farmacêutica da reivindicação 23, caracterizado pela fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer ou de doenças infecciosas.
  30. 30. MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS EM UM INDIVÍDUO, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, ou da composição farmacêutica da reivindicação 23, para inibir o crescimento das células tumorais.
  31. 31. MÉTODO PARA TRATAR O CÂNCER OU UMA DOENÇA INFECCIOSA, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou a composição farmacêutica da reivindicação 23.
  32. 32. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao 4-1 BB de camundongo, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, e um domínio Fc composto por uma primeira subunidade e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de maneira específica ao 4-1 BB compreende;
    uma região variável de cadeia pesada (Vh4-1BB) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 172, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos
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    13/13 de SEQ ID NO: 173 e uma região variável de cadeia leve (Vi_4-1BB) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176.
  33. 33. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo se ligar a Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) e compreender;
    (a) uma região variável de cadeia pesada (VhFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VlFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
  34. 34. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizada pela primeira subunidade do domínio Fc compreender as substituições de aminoácidos K392D e K409D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e a segunda subunidade da região Fc compreender as substituições de aminoácidos E356K e D399K (numeração de acordo com o índice EU Kabat).
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