TWI589591B - 雙特異性ｔ細胞活化抗原結合分子 - Google Patents

雙特異性ｔ細胞活化抗原結合分子 Download PDF

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Description

雙特異性T細胞活化抗原結合分子
本發明大體上係關於用於活化T細胞的雙特異性抗原結合分子。另外，本發明係關於編碼此類雙特異性抗原結合分子的聚核苷酸，以及包含此類聚核苷酸的載體及宿主細胞。本發明進一步關於製造本發明之雙特異性抗原結合分子的方法，及使用此等雙特異性抗原結合分子治療疾病的方法。
多個臨床背景中經常需要選擇性摧毀個別細胞或特定細胞類型。舉例而言，癌症療法的主要目標為特異性地摧毀腫瘤細胞、同時使健康細胞及組織完整且不受損害。
達成此目標的一種有吸引力之方式為誘導針對腫瘤的免疫反應，以使免疫效應細胞(諸如天然殺手(NK)細胞或細胞毒性T淋巴細胞(CTL))攻擊及摧毀腫瘤細胞。CTL構成免疫系統之最強效應細胞，然而其不能藉由習知治療抗體之Fc域介導的效應機制活化。
就此而言，設計成以一個「臂」結合至靶細胞上之表面抗原且以第二「臂」結合至T細胞受體(TCR)複合物之活化非變異組分的雙特異性抗體近年來已變得受人關注。此類抗體同時結合至其兩個標靶將迫使靶細胞與T細胞之間產生暫時性相互作用，引起任何細胞毒性T細胞活化及隨後靶細胞溶胞。從而使免疫反應再定向靶細胞且不依 賴於靶細胞呈遞肽抗原或不依賴於T細胞之特異性，此與CTL之正常MHC限制性活化有關。在此情形中，關鍵的是，當靶細胞向CTL呈遞雙特異性抗體時，亦即模擬免疫學突觸時，CTL僅被活化。特別需要的是，雙特異性抗體不需要淋巴細胞預處理或共刺激以便誘發靶細胞發生有效溶胞。
已開發出若干種雙特異性抗體形式且已研究其用於T細胞介導式免疫療法的適合性。其中，所謂的BiTE(雙特異性T細胞接合子)分子已得到極充分的表徵且已在臨床中顯示一些前景(回顧於Nagorsen及Bäuerle,Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))中。BiTE為串聯scFv分子，其中兩個scFv分子經柔性連接子稠合。針對T細胞接合所評價的其他雙特異性形式包括雙功能抗體(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，諸如串聯雙功能抗體(Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-66(1999))。最近開發出所謂的DART(雙親和性再靶向)分子，其係基於雙功能抗體形式，但特徵為C末端二硫橋鍵以達成額外穩定化(Moore等人，Blood 117,4542-51(2011))。所謂的特瑞單抗(triomabs)(其為完整的小鼠/大鼠IgG雜交分子且目前亦在臨床試驗中評價)代表一種較大型的形式(回顧於Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36,458-467(2010))中。
正開發的多種形式顯示因T細胞再靶向及活化而產生的用於免疫療法中的潛力巨大。然而，產生適於其之雙特異性抗體的任務絕非無足輕重的，而是涉及必定遇到的與抗體之功效、毒性、應用性及可製造性有關的多種挑戰。
小構築體(諸如BiTE分子)雖然能夠有效地使效應子與靶細胞交聯，但其血清半衰期極短，需要藉由連續輸注將其投與患者。另一方面，IgG樣形式雖然具有半衰期長的較大益處，但困擾於與IgG分子固有之原生效應功能相關的毒性。其免疫原性潛在性構成IgG樣雙特異 性抗體(尤其是非人類形式)對於成功治療性開發而言之另一不利特徵。最後，雙特異性抗體之一般性開發中的主要挑戰為生產臨床上足量且足夠純度的雙特異性抗體構築體，原因在於共表現時不同特異性之抗體重鏈與輕鏈會發生誤配，使正確組裝之構築體產量降低且產生多種非功能性副產物，所要雙特異性抗體可能難以與此等非功能性副產物分離。
已採用不同方法來克服雙特異性抗體中的鏈結合問題(參見例如Klein等人，mAbs 6,653-663(2012))。舉例而言，『臼包杵(knobs-into-holes)』策略旨在藉由將突變引入CH3域以修飾接觸界面來迫使兩個不同抗體重鏈配對。一個鏈上的龐大胺基酸經具有短側鏈的胺基酸置換以產生『臼』。反之，將具有大型側鏈的胺基酸引入另一CH3域中以產生『杵』。藉由共表現此等兩個重鏈(及兩個相同輕鏈，此兩個輕鏈對於兩個重鏈而言必須適當)，觀測到雜二聚體(『杵-臼』)的產量高於均二聚體(『臼-臼』或『杵-杵』)(Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621；及WO 96/027011)。藉由使用噬菌體呈現方法改造兩個CH3域之相互作用表面及引入二硫橋鍵來使雜二聚體穩定可進一步提高雜二聚體的百分比(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。臼包杵技術的新穎方法描述於例如EP 1870459 A1中。
然而，『臼包杵』策略卻未解決包含結合至不同靶抗原之不同輕鏈之雙特異性抗體中發生的重鏈-輕鏈誤配問題。
防止重鏈-輕鏈誤配的策略為使雙特異性抗體之結合臂之一中的重鏈與輕鏈之間發生域交換(參見WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254及Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-11191，其係關於發生域交換的雙特異性IgG抗體)。
使雙特異性抗體之結合臂之一中的重鏈與輕鏈可變域VH與VL發生交換(WO2009/080252，亦參見Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-11191)明顯地減少因針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈發生誤配所產生的副產物(相較於不使用此類域交換的方法)。儘管如此，此等抗體製劑仍不能澈底地不含副產物。主要副產物係基於瓊斯本型相互作用(Bence Jones-type interaction)(Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-11191；於增刊之圖S1I中)。因此需要進一步減少此類副產物以改良例如此類雙特異性抗體之產量。
鑒於目前可供T細胞介導式免疫療法利用的雙特異性抗體存在相關的困難及缺點，因此此類分子仍需要新穎的改良形式。本發明提供經設計用於活化T細胞及使其再定向的雙特異性抗原結合分子，其具有良好功效及可製造性與低毒性及有利藥物動力學特性的組合。
根據本發明，所要雙特異性抗體相較於非所要副產物(詳言之，結合臂之一中發生VH/VL域交換之雙特異性抗體中所出現的瓊斯本型副產物)的比率可藉由將具有相反電荷的帶電胺基酸引入CH1及CL域中的特定胺基酸位置來改良。
因此，在第一態樣中，本發明提供T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；(b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域VL與及Fab重鏈可變域VH彼此間置換；其中第一抗原為活化T細胞抗原且第二抗原為靶細胞抗原，或第一抗原為靶細胞抗原且第二抗原為活化T細胞抗原；且其中i)在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立 地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
根據本發明，第二Fab分子為互換型Fab分子，其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變區發生交換。在特定實施例中，第一(及第三，若存在)Fab分子為習知Fab分子。在另一特定實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子中存在不超過一個能夠特異性結合至活化T細胞抗原的Fab分子(亦即T細胞活化雙特異性抗原結合分子向活化T細胞抗原提供單價結合)。
在一個特定實施例中，第一抗原為靶細胞抗原且第二抗原為活化T細胞抗原。在更特定的實施例中，活化T細胞抗原為CD3，特定言之，CD3 ε。在一個實施例中，靶細胞抗原為CD20。
在根據本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一個實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據 Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在又另一個實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一特定實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含(a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；(b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域 VL與及Fab重鏈可變域VH彼此間置換；其中第一抗原為靶細胞抗原且第二抗原為活化T細胞抗原；且其中在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。在根據本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之替代實施例中，在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在再另一個實施例中，在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精 胺酸(R)取代)，且在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含特異性結合至第一抗原的第三Fab分子。
在特定實施例中，第三Fab分子與第一Fab分子相同。在此等實施例中，第三Fab分子因此包含與第一Fab分子相同的胺基酸取代。如同第一Fab分子，第三Fab分子尤其為習知Fab分子。
在一個特定實施例中，若存在第三Fab分子，則第一及第三Fab分子特異性結合至靶細胞抗原，且第二Fab分子特異性結合至活化T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之CD3 ε。
在本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一些實施例中，a)項下之第一Fab分子及b)項下之第二Fab分子彼此間稠合，視情況經由肽連接子稠合。在一個特定實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在一個替代性實施例中，第一 Fab分子在Fab重鏈C末端C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在其中(i)第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合或(ii)第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合的實施例中，Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈另外可彼此間稠合，視情況經由肽連接子稠合。
在特定實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子另外包含由能夠穩定結合之第一亞單元與第二亞單元組成的Fc域。
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可具有不同組態，亦即，第一、第二(及視情況第三)Fab分子可彼此間稠合且可以不同方式稠合至Fc域。組分可彼此間直接稠合或較佳經由一或多個適合肽連接子稠合。在與Fc域亞單元之N末端稠合的情況下，其典型地經由免疫球蛋白鉸鏈區發生。
在一個實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元N末端稠合。在此類實施例中，第一Fab分子可在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合或與Fc域亞單元中之另一者之N末端稠合。
在一個實施例中，第一及第二Fab分子各自在Fab重鏈之C末端與Fc域之亞單元之一之N末端稠合。在此實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上包含免疫球蛋白分子，其中在Fab臂之一中，重鏈及輕鏈可變區VH及VL彼此間交換/置換(參見圖1A、D)。
在替代實施例中，第三Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元之N末端稠合。在特定此類實施例中，第二及第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與Fc域之亞單元之一之N末端稠合，且第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在此實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上包含免疫球蛋白分子，其中在Fab臂之一中，重鏈及輕鏈可變區VH及VL彼此間交換/置 換，且其中另一種(習知)Fab分子在N末端稠合至該Fab臂(參見圖1B、E)。在另一個此類實施例中，第一第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與Fc域之亞單元之一之N末端稠合，且第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在此實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上包含其中另一Fab分子經N末端稠合至免疫球蛋白Fab臂之一的免疫球蛋白分子，其中在該另一Fab分子中，重鏈及輕鏈可變區VH與VL彼此間交換/置換(參見圖1C、F)。
在本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之所有不同組態中，本文所述之胺基酸取代可發生於第一Fab分子及(若存在)第三Fab分子之CH1及CL域中，或發生於第二Fab分子之CH1及CL域中。其較佳發生於第一Fab分子及(若存在)第三Fab分子之CH1及CL域中。根據本發明之構思，若如本文所述之胺基酸取代發生於第一(及第三，若存在)Fab分子中，則第二Fab分子中不發生此類胺基酸取代。反之，若如本文所述之胺基酸取代發生於第二Fab分子中，則第一(及第三，若存在)Fab分子中不發生此類胺基酸取代。
在本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之特定實施例中，特定言之，在其中如本文所述之胺基酸取代發生於第一(及第三，若存在)Fab分子中的特定實施例中，第一(及第三，若存在)Fab分子之恆定域CL為κ同型。在本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之其他實施例中，特定言之，在其中如本文所述之胺基酸取代發生於第二Fab分子中的其他實施例中，第二Fab分子之恆定域CL為κ同型。在一些實施例中，第一(及第三，若存在)Fab分子之恆定域CL及第二Fab分子之恆定域CL為κ同型。
在一個特定實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含之免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一個更特定的實施例中，免疫球蛋白為IgG1子類免疫球蛋白。在另一個實施例中， 免疫球蛋白為IgG4子類免疫球蛋白。
在一個特定實施例中，本發明提供T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；(b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域VL與及Fab重鏈可變域VH彼此間置換；c)特異性結合至第一抗原的第三Fab分子；及d)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域；其中第一抗原為靶細胞抗原且第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3 ε；其中c)項下的第三Fab分子與a)項下的第一Fab分子相同；其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中(i)a)項下之第一Fab分子在Fab重鏈C末端與b)項下之第二Fab分子之Fab重鏈N末端稠合，且b)項下之第二Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與d)項下之Fc域之亞單元之一的N末端稠合，或(ii)b)項下之第二Fab分子在Fab重鏈C末端與a)項下之第一Fab分子之Fab重鏈N末端稠合，且a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與d)項下之Fc域之亞單元之一的N末端稠合。
在一個甚至更特定的實施例中，本發明提供T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；(b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域VL與及Fab重鏈可變域VH彼此間置換；c)特異性結合至第一抗原的第三Fab分子；及d)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域；其中第一抗原為靶細胞抗原且第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3 ε；其中c)項下的第三Fab分子與a)項下的第一Fab分子相同；其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中a)項下之第一Fab分子在Fab重鏈C末端與b)項下之第二Fab分子之Fab重鏈N末端稠合，且b)項下之第二Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與d)項下之Fc域之亞單元之一的N末端稠合。
在另一實施例中，本發明提供T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域VL與Fab重鏈可變域VH彼此間置換；及c)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域； 其中(i)第一抗原為靶細胞抗原且第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3 ε；或(ii)第二抗原為靶細胞抗原且第一抗原為活化T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3 ε；其中在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中a)項下之第一Fab分子及b)項下之第二Fab分子各自在Fab重鏈C末端與c)項下之Fc域之亞單元之一的N末端稠合。
在T細胞活化雙特異性抗原結合分子之特定實施例中，Fc域為IgG Fc域。在一個特定實施例中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一特定實施例中，Fc域為IgG4 Fc域。在一個甚至更特定的實施例中，Fc域為包含胺基酸取代S228P(Kabat編號)的IgG4 Fc域。在特定實施例中，Fc域為人類Fc域。
在特定實施例中，Fc域包含促進第一Fc域亞單元與第二Fc域亞單元結合的修飾。在一個特定的此類實施例中，Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在第二亞單元之CH3域內產生可供第一亞單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的空腔。
在一個特定實施例中，相較於原生IgG1 Fc域，Fc域對Fc受體展現降低之結合親和力及/或減少的效應功能。在某些實施例中，相較 於未經工程改造的Fc域，經工程改造的Fc域對Fc受體的結合親和力降低且/或效應功能減少。在一個實施例中，Fc域包含使與Fc受體之結合及/或效應功能減少的一或多個胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域中之使與Fc受體之結合及/或效應功能減少的一或多個胺基酸取代為一或多個選自L234、L235及P329之群組的位置(Kabat EU索引編號)。在特定實施例中，Fc域之各亞單元包含使與Fc受體之結合及/或效應功能減少的三個胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G(Kabat EU索引編號)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。在其他實施例中，Fc域之各亞單元包含使與Fc受體之結合及/或效應功能減少的兩個胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L235A及P329G(Kabat EU索引編號)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG4 Fc域，特定言之，人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子之Fc域為IgG4 Fc域且包含胺基酸取代L235E及S228P(SPLE)(Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一個特定實施例中，Fc受體為人類FcγRIIa、FcγRI及/或FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一個特定實施例中，特異性結合至活化T細胞抗原(特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε)的Fab分子包含SEQ ID NO：4之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：5之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：8之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR 3。在一個甚至更特定的實施例中，特異性結合至活化T細胞抗原(特定言之，CD3，更特定言之，CD3 ε)的Fab分子包含胺基酸序列與SEQ ID NO：3之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或 100%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區。在一個特定實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含之第二Fab分子特異性結合至CD3(更特定言之，CD3 ε)，且包含SEQ ID NO：4之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：5之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：8之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR 3。在一個甚至更特定的實施例中，該第二Fab分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：3的重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：7的輕鏈可變區。
在本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之另一個特定實施例中，特異性結合至靶細胞抗原(特定言之，CD20)的Fab分子包含SEQ ID NO：46之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：47之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：48之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：49之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：50之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：51之輕鏈CDR 3。在一個甚至更特定的實施例中，特異性結合至靶細胞抗原(特定言之，CD20)的Fab分子包含胺基酸序列與SEQ ID NO：30之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區。在一個特定實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含之第一(及第三，若存在)Fab分子特異性結合至CD20，且包含SEQ ID NO：46之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：47之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：48之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：49之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：50之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：51之輕鏈CDR 3。在一個甚至更特定的實施例中，該第一(及該第三，若存在)Fab分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：30的重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：31的輕鏈可變區。
在一特定態樣中，本發明提供T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含：a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域VL與Fab重鏈可變域VH彼此間置換；c)特異性結合至第一抗原的第三Fab分子；及d)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域；其中(i)第一抗原為CD20且第二抗原為CD3，特定言之，CD3 ε；(ii)a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含SEQ ID NO：46之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：47之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：48之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：49之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：50之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：51之輕鏈CDR 3，且b)項下之第二Fab分子包含SEQ ID NO：4之重鏈CDR 1、SEQ ID NO：5之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：8之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR 3；(iii)在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及(iv)a)項下之第一Fab分子在Fab重鏈C末端與b)項下之第二Fab分子之Fab重鏈N末端稠合，且b)項下之第二Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與d)項下之Fc域之亞單元之一的N末端稠合。
在另一態樣中，本發明提供T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含：a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域VL與Fab重鏈可變域VH彼此間置換；c)特異性結合至第一抗原的第三Fab分子；及d)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域；其中(i)第一抗原為CD20且第二抗原為CD3，特定言之，CD3 ε；(ii)a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自包含SEQ ID NO：46之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：47之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：48之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：49之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：50之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：51之輕鏈CDR 3，且b)項下之第二Fab分子包含SEQ ID NO：4之重鏈CDR 1、SEQ ID NO：67之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：68之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR 3；(iii)在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代，特別是經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子及c)項下之第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及(iv)a)項下之第一Fab分子在Fab重鏈C末端與b)項下之第二Fab分子之Fab重鏈N末端稠合，且b)項下之第二Fab分子及c)項下之第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與d)項下之Fc域之亞單元之一的N末端稠 合。
根據本發明之另一態樣，提供一或多種編碼本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的經分離之聚核苷酸。本發明進一步提供一或多種包含本發明之經分離聚核苷酸的表現載體，及包含本發明之經分離聚核苷酸或表現載體的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為真核生物細胞，特定言之，哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供一種製造本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的方法，包含以下步驟：a)在適於表現T細胞活化雙特異性抗原結合分子的條件下培養本發明之宿主細胞及b)回收T細胞活化雙特異性抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明方法製得的T細胞活化雙特異性抗原結合分子。
本發明進一步提供包含本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明亦涵蓋使用本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子及醫藥組合物的方法。在一個態樣中，本發明提供用作藥物的本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子或醫藥組合物。在一個態樣中，提供用於治療有需要之個體之疾病的本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子或醫藥組合物。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。
亦提供本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子用於製造供治療有需要之個體之疾病用之藥物的用途；以及治療個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之包含本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子、呈醫藥學上可接受之形式的組合物。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在任一上述實施例中，個體較佳為哺乳動物，特定言之，人類。
本發明亦提供一種誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶胞的方法，包含在T細胞(特定言之，細胞毒性T細胞)存在下使靶細胞與本發 明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子接觸。
圖1：本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子(TCB)之例示性組態。(A，D)說明「1+1互換單抗(CrossMab)」分子。(B，E)說明「2+1 IgG互換Fab(Crossfab)」分子，其中互換Fab及Fab組分的次序為替代的(「倒置式」)。(C，F)說明「2+1 IgG互換Fab」分子。(G，K)說明「1+1 IgG互換Fab」分子，其中互換Fab及Fab組分的次序為替代的(「倒置式」)。(H，L)說明「1+1 IgG互換Fab」分子。(I，M)說明具有兩個互換Fab的「2+1 IgG互換Fab」分子。(J，N)說明具有兩個互換Fab的「2+1 IgG互換Fab」分子，其中互換Fab及Fab組分之次序為替代的(「倒置式」)。(O，S)說明「Fab-互換Fab」分子。(P，T)說明「互換Fab-Fab」分子。(Q，U)說明「(Fab)2-互換Fab」分子。(R，V)說明「互換Fab-(Fab)2」分子。(W，Y)說明「Fab-(互換Fab)2」分子。(X，Z)說明「(互換Fab)2-Fab」分子。黑點：Fc域中視情況存在之促進雜二聚化之修飾。++，--：引入CH及CL域中之帶相反電荷的胺基酸。
圖2：說明實例1中所製備的TCB。(A)無電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之CH1/CL交換)，(B)具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)，(C)具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)，(D)無電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換)，(E)無電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH-CH1/VL-Cl交換)，(F)具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD20結合子中之VH/VL交換，CD3結合子中之電荷修飾， EE=147E，213E；KK=123K，124K)，(G)具有電荷修飾且Fc區中具有DDKK突變的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)，(H)具有電荷修飾的「1+1互換單抗」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)，(I)具有電荷修飾的「1+1互換單抗」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K，不同CD20結合子)，(J)具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」213E、123R(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾，E=213E；R=123R)，(K)具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換及電荷修飾)。
圖3：(A-I、N、O)實例1中所製備之TCB(最終純化製劑)的CE-SDS分析。(A)圖2A中所示之分子「A」的電泳圖(譜)，(B)圖2B中所示之分子「B」的電泳圖(譜)，(C)圖2C中所示之分子「C」的電泳圖(譜)，(D)圖2D中所示之分子「D」的電泳圖(譜)，(E)圖2E中所示之分子「E」的電泳圖(譜)，(F)圖2F中所示之分子「F」的電泳圖(譜)，(G)圖2G中所示之分子「G」的電泳圖(譜)，(H)圖2H中所示之分子「H」的電泳圖(譜)，(I)圖2I中所示之分子「I」的電泳圖(譜)，圖2J中所示之分子「J」的電泳圖(譜)，(O)圖2K中所示之分子「K」的電泳圖(譜)。泳道A=非還原，泳道B=還原。(J-L、P、Q)實例1中所製備之TCB在第一純化步驟(蛋白質A親和層析)之後的SDS-PAGE分析。(J)4-12% Bis-Tris SDS-PAGE，非還原；泳道1=標記(標記12，未染色標準物，Invitrogen)；泳道2-11=分子B經蛋白質A親和層析所產生的溶離份，(K)3-8% Tris-乙酸鹽SDS-PAGE，非還原；泳道1=標記(HiMark,Invitrogen)；泳道2-12=分子C經蛋白質A親和層析所產生的溶離份，(L)4-12% Bis-Tris SDS-PAGE，非還原；泳道1=標記(標記 12，未染色標準物，Invitrogen)；泳道2-14=分子D經蛋白質A親和層析所產生的溶離份，(P)4-12% Bis/Tris SDS PAGE，非還原；泳道1=標記(標記12，Invitrogen)；泳道2-10=分子J經蛋白質A親和層析所產生的溶離份，(Q)4-12% Bis/Tris SDS PAGE，非還原；泳道1=標記(標記12，Invitrogen)；泳道2-12=分子K經蛋白質A親和層析所產生的溶離份。(M)實例1中所製備之TCB的製備型尺寸排阻層析(SEC；第一純化步驟)(分子A(第一SEC步驟)、B及D，如圖示)。
圖4：具有或不具有電荷修飾(「電荷殘基」)之抗CD3/抗CD20 T細胞雙特異性(TCB)抗體(「CD20 TCB」)的CD3及CD20結合(參見實例1)。
圖5：具有或不具有電荷修飾(「電荷殘基」)之抗CD3/抗CD20 T細胞雙特異性(TCB)抗體(「CD20 TCB」)與人類PBMC一起培育22小時後所誘導的腫瘤細胞溶解(參見實例1)。
圖6：具有或不具有電荷修飾之抗CD3/抗CD20 T細胞雙特異性(TCB)抗體(「CD20 TCB」)誘導T細胞介導式殺死表現CD20之腫瘤靶細胞(Nalm-6)後，CD8+ T細胞(A)或CD4+ T細胞(B)活化(參見實例1)。
圖7：具有或不具有電荷修飾(「電荷殘基」)之抗CD3/抗CD20 T細胞雙特異性(TCB)抗體(「CD20 TCB」)誘導T細胞介導式殺死表現CD20之腫瘤靶細胞(Z-138)後，CD8+ T細胞(A)或CD4+ T細胞(B)活化(參見實例1)。
圖8：與具有或不具有電荷修飾(「電荷殘基」)之抗CD3/抗CD20 T細胞雙特異性(TCB)抗體(「CD20 TCB」)一起培育後，健康人類全血中的B細胞耗乏；22小時分析(參見實例1)。
圖9：具有或不具有電荷修飾之抗CD3/抗CD20 T細胞雙特異性(TCB)抗體(「CD20 TCB」)誘導T細胞介導式殺死人類健康全血中之表現CD20之B細胞後，CD8+ T細胞(A)或CD4+ T細胞(B)活化(參見實 例1)。
圖10：抗CD20/抗CD3 TCB(圖2B中所示之分子「B」)與表現CD20(A)及表現CD3(B)之人類靶細胞的結合。
圖11：抗CD20/抗CD3 TCB(圖2B中所示之分子「B」)與人類及食蟹獼猴之表現CD20及表現CD3之靶細胞的結合。(A)B細胞，(B)CD4 T細胞，(C)CD8 T細胞。
圖12：不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式所介導的腫瘤細胞溶解。(A)21小時，(B)24小時。
圖13：不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式介導的腫瘤細胞溶解及隨後T細胞活化。(A-C)來自三位不同人類供者之PBMC效應細胞所致的Z138腫瘤靶細胞溶解。(D)如圖示之一組DLBCL腫瘤細胞株的溶胞。
圖14：不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式介導的人類全血中之B細胞耗乏。
圖15：不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式引起的T細胞活化，如使用傑卡特-NFAT報導子分析(Jurkat-NFAT reporter assay)定量CD3下游信號傳導強度所評估。
圖16：在NOG小鼠之稀疏取樣資料中，0.5mg/kg靜脈內團式投與抗CD20/抗CD3 TCB抗體(圖2B中所示之分子「B」)的藥物動力學參數。
圖17：評估抗CD20/抗CD3 TCB抗體(圖2B中所示之分子「B」)在完全人類化NOG小鼠中之B細胞耗乏活性之研究設計的示意性圖示。
圖18：經(B)抗CD20/抗CD3 TCB抗體(圖2B中所示之分子「B」)或(A)媒劑對照物處理之完全人類化NOG小鼠之血液中的B細胞及T細胞頻率動力學。D0、D7：治療性注射之天數。
圖19：媒劑(黑色條形圖)或抗CD20/抗CD3 TCB抗體(圖2B中所示之分子「B」)(白色條形圖)注射至完全人類化小鼠中之後第三天(D3)及第十天(D10)，對周邊T細胞上之不同表面標記表現的分析。
圖20：研究終止時(首次治療性注射之後的D10)，對經媒劑(黑色條形圖)或抗CD20/抗CD3 TCB抗體(圖2B中所示之分子「B」)(白色條形圖)處理之完全人類化小鼠之脾臟中之B細胞頻率(A)、T細胞頻率(B)及T細胞上之表面標記表現(C)的分析。
圖21：抗CD20/抗CD3 TCB抗體(圖2B中所示之分子「B」)(0.5mg/kg，一週一次)在移植有huPBMC之NOG小鼠WSU-DLCL2模型中的抗腫瘤活性。
圖22：說明實例2中所製備之「2+1 IgG互換Fab，倒置式」分子。(1)無電荷修飾的分子，(2)特異性結合至BCMA之Fab分子之CH1及CL域中具有電荷修飾的分子(EE=147E，213E；KK=123K，124K)。
圖23：實例2中所用之「2+1 IgG互換Fab，倒置式」分子的CE-SDS分析(泳道A=非還原，泳道B=還原，泳道A之峰值表)。對無電荷修飾之分子(83A10-TCB；圖23A及B)及具有電荷修飾之分子(83A10-TCBcv；圖23C)應用不同純化方法(蛋白質A親和層析(PA)、尺寸排阻層析(SEC)、陽離子交換層析(cIEX)及最終尺寸排阻層析步驟(re-SEC))。
圖24A-F：蛋白質A親和層析(PA)及尺寸排阻層析(SEC)純化步驟之後，以頭對頭(H2H)比較方式對實例2中所用之「2+1 IgG互換Fab，倒置式」分子進行的CE-SDS分析(泳道A=非還原，泳道B=還原，泳道A之峰值表)。
圖25：流式細胞術分析抗BCMA/抗CD3 T細胞雙特異性抗體與BCMA陽性多發性骨髓瘤細胞株的結合。(A)83A10-TCB對於H929細 胞及MKN45細胞的結合，(B)83A10-TCBcv對於H929細胞及MKN45細胞的結合，(C)83A10-TCB與83A10-TCBcv對於H929細胞之結合情況之比較，(D)83A10-TCB及83A10-TCBcv對於BCMA陽性H929細胞及BCMC/CD3陰性MKN45細胞之結合情況之比較。
圖26：BCMA陽性H929骨髓瘤細胞被抗BCMA/抗CD3 TCB抗體殺死((A及B)83A10-TCB，(C及D)83A10-TCBcv)，如根據LDH釋放所量測。
圖27：說明實例3中所製備之TCB。(A)具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換，Her2結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)，(B)具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab」(CD3結合子中之VH/VL交換，Her3結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)。
圖28：實例3中所製備之TCB的CE-SDS分析(最終純化製劑)。(A)圖27A中所示之Her2 TCB之電泳圖(譜)，(B)圖27B中所示之Her3 TCB之電泳圖(譜)。泳道A=非還原，泳道B=還原。
圖29：Her2 TCB(A)及Her3 TCB(B)與細胞的結合，如藉由FACS所測定。Her2 TCB分子結合至傑卡特細胞上之人類CD3(左圖)或KPL-4細胞上之人類Her2(A)或Her3(B)(右圖)的中值螢光強度，如藉由流式細胞術所量測。描繪有基於一式三份的中值螢光值，包括SD。
圖30：Her3 TCB引起的T細胞活化。人類PBMC效應細胞、KPL-4靶細胞及遞增濃度之Her3 TCB共培育48小時後，藉由FACS量測CD69陽性CD8 T細胞的百分比。圖示為一式三份，具有SD。
圖31：5小時之後，傑卡特細胞經由CD3發生活化，如根據發光所測定。KPL4腫瘤細胞與傑卡特-NFAT報導子細胞(E：T 5：1(A)或2.5：1(B))及遞增濃度之Her2 TCB(A)或Her3 TCB(B)一起培育5小時 後，根據相對發光信號(RLUS)來測定傑卡特活化。藉由GraphPadPrism計算EC50值(34.4pM(A)及22pM(B))。描繪有來自一式三份的平均值，誤差條表示SD。
圖32：Her2陽性KPL4、N87、T47D或MDA-MB-231靶細胞與人類PBMC效應細胞(E：T 10：1)及遞增濃度之Her 2 TCB分子一起培育25小時(A)或46小時(B)後，如根據LDH釋放所量測的(A，B)腫瘤細胞溶解。描繪有來自一式三份的平均值，誤差條表示SD。藉由GraphPadPrism計算EC50值：7.5pM(KPL4細胞)、25.6pM(N87細胞)、30.6pM(T47D細胞)及59.9pM(MDA-MB-231細胞)。(C)Her3陽性KPL4靶細胞與人類PBMC效應細胞(E：T 10：1)及遞增濃度之Her 3 TCB分子一起培育24小時或48小時後，如根據LDH釋放所量測的腫瘤細胞溶解，如圖示。描繪有來自一式三份的平均值，誤差條表示SD。藉由GraphPadPrism計算EC50值：2.54pM(24小時)及0.53pM(48小時)。
圖33：Her3 TCB誘導的腫瘤細胞溶解，如根據卡斯蛋白酶3/7活性(發光)所測定。圖示為相對發光信號，其係在KPL-4-卡斯蛋白酶-3/7 GloSensor靶細胞與PBMC(E：T=10：1)及不同濃度之Her3 TCB共培育6.5小時之後，作為該等靶細胞中之卡斯蛋白酶3/7活性的結果來量測，如圖示。圖示為一式三份，具有SD。藉由GraphPadPrism計算EC50值：0.7pM。
圖34：說明實例4中所製備之TCB。(A)具有電荷修飾的「(Fab)2-互換Fab」(CD3結合子中之VH/VL交換，MCSP結合子中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)，(B)無電荷修飾的「(Fab)2-互換Fab」(CD3結合子中之VH/VL交換)。
圖35：實例4中所製備之具有電荷修飾之TCB(最終純化製劑)的CE-SDS分析：圖34A中所示之(Fab)2-XFab-LC007cv之電泳圖(譜)。泳 道A=非還原，泳道B=還原。
圖36：TCB分子結合至MV-3細胞上之MCSP(左圖)或傑卡特細胞上之人類CD3(右圖)的中值螢光強度，如藉由流式細胞術所量測。描繪有基於一式三份的中值螢光值，包括SD。
圖37：人類MCSP陽性MV-3細胞與人類PBMC效應細胞(E：T 10：1)及遞增濃度之TCB分子一起培育24小時(左圖)或48小時(右圖)後，如根據LDH釋放所量測的腫瘤細胞溶解。描繪有來自一式三份的平均值，誤差條表示SD。
定義
除非在下文中另外定義，否則術語在本文中的使用如此項技術一般性所用。
如本文所用，術語「抗原結合分子」在其最廣泛的意義上係指特異性地結合抗原性決定子的分子。抗原結合分子之實例為免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。
術語「雙特異性」意謂抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩個不同抗原性決定子。典型地，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中之每一者特異性針對不同抗原性決定子。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原性決定子，詳言之，兩個不同細胞上所表現的兩個抗原性決定子。
如本文所用，術語「價」表示抗原結合分子中存在指定數目個抗原結合位點。因而，術語「單價結合至抗原」表示抗原結合分子中存在一個(及不超過一個)特異性針對抗原的抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指抗原結合分子中之提供與抗原相互作用的位點，亦即一或多個胺基酸殘基。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基。原生免疫球蛋白分子典型地 具有兩個抗原結合位點，Fab分子典型地具有單個抗原結合位點。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合抗原性決定子的多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠使其所連接的實體(例如第二抗原結合部分)定向靶點，例如攜帶抗原性決定子的特定類型腫瘤細胞或腫瘤基質。在另一個實施例中，抗原結合部分能夠經由其靶抗原(例如T細胞受體複合物抗原)活化信號傳導。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文進一步定義及此項技術中已知的抗體恆定區。適用的重鏈恆定區包括五種同型中的任一者：α、δ、ε、γ或μ。適用的輕鏈恆定區包括兩種同型中的任一者：κ及λ。
如本文所用，術語「抗原性決定子」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上的位點(例如相連胺基酸區段或由非相連胺基酸之不同區域組成的構形組態)，該位點由抗原結合部分結合，從而形成抗原結合部分-抗原複合物。適用的抗原性決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或細胞外基質中(ECM)。除非另外指明，否則本文中稱為抗原的蛋白質(例如CD3)可為來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之蛋白質的任何原生形式。在一個特定實施例中，抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」的未處理蛋白質，以及在細胞中處理所產生的任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。適用作抗原的例示性人類蛋白質為CD3，特定言之，CD3之ε亞單元(參見UniProt第P07766號(130版)，NCBI RefSeq第NP_000724.1號，SEQ ID NO：1(人類序列)；或UniProt第Q95LI5號 (49版)，NCBI基因庫第BAB71849.1號，SEQ ID NO：2(食蟹獼猴[Macaca fascicularis]序列))。在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子結合至CD3或靶細胞抗原的抗原決定基，該抗原決定基在來自不同物種之CD3或靶細胞抗原中具保守性。
「特異性結合」意謂結合對於抗原而言具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合部分結合至特定抗原性決定子的能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一個實施例中，抗原結合部分與無關蛋白質結合的程度小於抗原結合部分與抗原之結合的約10%，如藉由例如SPR所量測。在某些實施例中，結合至抗原的抗原結合部分或包含該抗原結合部分的抗原結合分子具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或小於10-8M，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解離常數(KD)。
「親和力」係指分子(例如受體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如配位體)之間非共價相互作用力的總和。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗原結合部分與抗原，或受體與其配位體)之間1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(KD)表示，解離常數為解離速率常數與結合速率常數(分別為koff與kon)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同。可藉由此項技術中已知之明確方法(包括本文所述之方法)量測親和力。一種用於測量親和力的特定方法為表面電漿子共振(SPR)。
「還原性結合」(例如還原性結合至Fc受體)係指對應相互作用的 親和力降低，如藉由例如SPR所量測。為了清楚起見，該術語亦包括親和力降低至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即相互作用完全消除。反之，「增強的結合」係指對應相互作用的結合親和力增強。
如本文所用，「活化T細胞抗原」係指T淋巴細胞(特定言之，細胞毒性T淋巴細胞)表面上所表現之抗原性決定子，其與抗原結合分子相互作用時能夠誘導T細胞活化。具體而言，抗原結合分子與活化T細胞抗原的相互作用可藉由觸發T細胞受體複合物之信號級聯來誘導T細胞活化。在一個特定實施例中，活化T細胞抗原為CD3，特定言之，CD3之ε亞單元(參見UniProt第P07766號(130版)，NCBI RefSeq第NP_000724.1號，SEQ ID NO：1(人類序列)；或UniProt第Q95LI5號(49版)，NCBI基因庫第BAB71849.1號，SEQ ID NO：2(食蟹獼猴[Macaca fascicularis]序列))。
如本文所用，「T細胞活化」係指T淋巴細胞(特定言之，細胞毒性T淋巴細胞)的一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記表現。本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子能夠誘導T細胞活化。適於量測T細胞活化的分析在本文所述之技術中已知。
如本文所用，「靶細胞抗原」係指靶細胞(例如腫瘤細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)表面上所呈遞的抗原性決定子。在一個特定實施例中，靶細胞抗原為CD20，特定言之，人類CD20(參見UniProt第P11836號)。
如本文所用，當各類型部分超過一種時，為了便於區別，結合Fab分子使用術語「第一」、「第二」或「第三」。使用此等術語並非希望賦予T細胞活化雙特異性抗原結合分子以特定次序或取向，除非明確如此陳述。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1 域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成的蛋白質。
「稠合」意謂各組分(例如Fab分子與Fc域亞單元)經肽鍵直接連接，經由一或多個肽連接子連接。
如本文所用，術語「單鏈」係指包含胺基酸單體經肽鍵線性連接而成的分子。在某些實施例中，抗原結合部分之一為單鏈Fab分子，亦即其中Fab輕鏈與Fab重鏈經肽連接子連接而形成單一肽鏈的Fab分子。在一個特定的此類實施例中，在單鏈Fab分子中，Fab輕鏈C末端連接至Fab重鏈N末端。
「互換型」Fab分子(亦稱為互換Fab」)意謂一種Fab分子，其中Fab重鏈與輕鏈可變域發生交換(亦即彼此間置換)，亦即，互換型Fab分子包含由輕鏈可變域VL及重鏈恆定域1 CH1組成的肽鏈(VL-CH1，N末端至C末端方向)及由重鏈可變域VH及輕鏈恆定域CL組成的肽鏈(VH-CL，N末端至C末端方向)。為了清楚起見，在其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域交換的互換型Fab分子中，包含重鏈恆定域1 CH1的肽鏈在本文中稱為互換型Fab分子之「重鏈」。
與此相反，「習知」Fab分子意謂呈天然形式的Fab分子，亦即包含由重鏈可變域及恆定域組成的重鏈(VH-CH1，N末端至C末端方向)及由輕鏈可變域及恆定域組成的輕鏈(VL-CL，N末端至C末端方向)。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體之結構的蛋白質。舉例而言，IgG類免疫球蛋白為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由兩條輕鏈及兩條重鏈經二硫鍵鍵結而組成。自N末端至C末端，各重鏈具有可變域(VH)，亦稱為重鏈可變域或重鏈可變區；繼之為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N末端至C末端，各輕鏈具有可變域(VL)，亦稱為輕鏈可變域或輕鏈可變區；繼之為輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白重鏈可歸為五種類型之一，稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ (IgG)或μ(IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。免疫球蛋白輕鏈基於其恆定域胺基酸序列可歸為兩種類型之一，稱為kappa(κ)及lambda(λ)。免疫球蛋白基本上由兩個Fab分子及一個Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區連接而組成。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性。
「抗體片段」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合由完整抗體結合的抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單域抗體。欲回顧某些抗體片段，參見Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。欲回顧scFv片段，參見例如Plückthun，於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中。單域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或全部或一部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第號6,248,516 B1)。抗體片段可藉由各種技術製得，包括 (但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所述。
術語「抗原結合域」係指抗體之一部分，該部分包含特異性結合至抗原之一部分或全部且與之互補的區域。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。詳言之，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體結合至抗原之抗體重鏈或輕鏈域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域一般具有類似的結構，其中各域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中之在序列上具有高變性且/或形成結構上定義之環(「高變環」)的各區域。一般而言，原生四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性且/或涉及抗原識別。除VH中之CDR1之外，CDR一般包含形成高變環的胺基酸殘基。高變區(HVR)亦稱為「互補決定區」(CDR)，且此等術語在本文中、在提及形成抗原結合區之可變區之一部分時可互換使用。此特定區域已描述於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國公共衛生署，國家衛生研究院(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)(1991)及Chothia等人，J Mol Biol 196：901-917(1987)，其中定義包括彼此間比較時胺基酸殘基之重疊或亞群。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任何定義的應用意欲處於如本文中所定義及所用之術語 的範疇內。包含如上述各參考文獻所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表1中作為比較。包含特定CDR的確切殘基數目將視CDR序列及大小而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定的情況下，熟習此項技術者可以常規方式確定哪個殘基包含特定CDR。本文中指定的CDR序列一般依據Kabat定義。
1表1中之所有CDR定義之編號均依據Kabat等人所闡述之編號約定(參見下文)。 2如表1中所用之含有小寫字母「b」的「AbM」係指如藉由Oxford Molecular之「AbM」抗體模型化軟體所定義的CDR。
Kabat等人亦定義適用於任何抗體的可變區序列編號系統。一般技術者可針對任何可變區序列明確地指定此「Kabat編號」系統，而不依賴於超過序列本身的任何實驗資料。如本文中關於可變區序列所用，「Kabat編號」係指Kabat等人闡述的編號系統，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國公共衛生署，國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991)。除非另外說明，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置的編號係依據Kabat編號系統。
如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及恆定域中的胺基酸位置均根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國公共衛生署，國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991)中所述之Kabat編號系統編號且在本文中稱為「根據Kabat編號」或「Kabat編號」。具體而言，κ及λ同型之輕鏈恆定域CL使用Kabat編號系 統(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版之第647-660頁，美國公共衛生署，國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991))且重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)使用Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)，在此情況下，在本文中藉由參考「根據Kabat EU索引編號」來進一步澄清。
序列表之多肽序列並非根據Kabat編號系統編號。然而，將序列表之序列編號轉換為Kabat編號完全屬於熟習此項技術者之普通技能範圍內。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，在VH(或VL)中，HVR及FR序列一般依以下序列呈現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗體或免疫球蛋白之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文術語「Fc域」或「Fc區」用於定義含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈C末端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。雖然IgG重鏈Fc區邊界可能稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自Cys226或自Pro230延伸至重鏈羧基末端。然而，宿主細胞所產生的抗體可能在重鏈C末端經歷一或多個(特定言之，一個或兩個)胺基酸之轉譯後分裂。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈的分裂型變異體(在本文中亦被稱作「分裂變異型重鏈」)。在重鏈之最末兩個C末端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編 號)的情況下，情況可為如此。因此，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)或C末端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)可能存在或可能不存在。除非另有說明，否則包括Fc域(或如本文所定義之Fc域之亞單元)之重鏈的胺基酸序列在本文中指明無C末端甘胺酸-離胺酸二肽。在本發明之一個實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含的重鏈(該重鏈包括如本文說明的Fc域亞單元)包含另一個C末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含的重鏈(該重鏈包括如本文說明的Fc域亞單元)包含另一個C末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。本發明之組合物(諸如本文所述之醫藥組合物)包含本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子群。T細胞活化雙特異性抗原結合分子群可包含具有全長重鏈的分子及具有分裂變異型重鏈的分子。T細胞活化雙特異性抗原結合分子群可由具有全長重鏈之分子及具有分裂變異型重鏈之分子的混合物組成，其中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的T細胞活化雙特異性抗原結合分子具有分裂變異型重鏈。在本發明之一個實施例中，包含本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子群的組合物包含含有重鏈的T細胞活化雙特異性抗原結合分子，該重鏈包括如本文說明的Fc域亞單元及另一個C末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，包含本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子群的組合物包含含有重鏈的T細胞活化雙特異性抗原結合分子，該重鏈包括如本文說明的Fc域亞單元及另一個C末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，此組合物包含由以下組成的T細胞活化雙特異性抗原結合分子群：包含包括如本文說明之Fc域亞單元之重鏈的分子；包含包括如本文說明之Fc域亞單元及另一個C末端甘胺酸殘基(G446，根據 Kabat EU索引編號)之重鏈的分子；及包含包括如本文說明之Fc域亞單元及另一個C末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)之重鏈的分子。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國公共衛生署，國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991)中所述(亦參見上文)。如本文所用，Fc域「亞單元」係指形成二聚Fc域之兩個多肽之一，亦即包含免疫球蛋白重鏈C末端恆定區的多肽，其能夠穩定的自結合。舉例而言，IgG Fc域亞單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾」為肽主鏈之操縱或Fc域亞單元之轉譯後修飾，從而減少或阻止包含Fc域亞單元之多肽與相同多肽結合形成均二聚體。詳言之，如本文所用之促進結合的修飾包括分別對欲結合之兩個Fc域亞單元(亦即Fc域之第一及第二亞單元)中之每一者進行的修飾，其中該等修飾彼此間互補以便促進兩個Fc域亞單元結合。舉例而言，促進結合的修飾可改變Fc域亞單元中之一或兩者的結構或電荷以便使其結合在空間上或在靜電上分別為有利的。因此，包含第一Fc域亞單元之多肽與包含第二Fc域亞單元之多肽之間發生(雜)二聚，就與亞單元(例如抗原結合部分)中之每一者稠合的其他組分不相同而言，(雜)二聚可能不相同。在一些實施例中，促進結合的修飾包含存在於Fc域中的胺基酸突變，特定言之，胺基酸取代。在一個特定實施例中，促進結合的修飾包含存在於Fc域之兩個亞單元中之每一者中的各別胺基酸突變，特定言之，胺基酸取代。
術語「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞激素分泌、免疫複合物介導抗原呈遞細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。
如本文所用，術語「工程化、工程改造」視為包括肽主鏈之任何操縱或天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括胺基酸序列、糖基化模式或個別胺基酸之側鏈基團之修飾，以及此等方法之組合。
如本文所用，術語「胺基酸突變」意欲包含胺基酸取代、缺失、插入及修飾。取代、缺失、插入及修飾可進行任意組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如與Fc受體的結合減少，或與另一肽的結合增強。胺基酸序列缺失及插入包括胺基酸之胺基末端及/或羧基末端缺失及插入。特定胺基酸突變為胺基酸取代。出於改變例如Fc區之結合特徵之目的，尤其較佳為非保守性胺基酸取代，亦即一個胺基酸經具有不同結構及/或化學特性的另一胺基酸置換。胺基酸取代包括經非天然存在之胺基酸置換或經二十種標準胺基酸之天然存在之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)置換。胺基酸突變可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法產生。遺傳學方法可包括定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。預期藉由除遺傳學工程改造之外的方法(諸如化學修飾)改變胺基酸側鏈基團的方法亦可為適用的。本文中可使用不同名稱表示相同的胺基酸突變。舉例而言，Fc域之位置329之脯胺酸取代為甘胺酸可以329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly表示。
如本文所用，術語「多肽」係指一種分子，其由單體(胺基酸)經醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接而組成。術語「多肽」係指兩個或兩個以上胺基酸之任何鏈，且並非指產物之特定長度。因此，「多肽」之 定義內包括肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指兩個或兩個以上胺基酸之鏈的任何其他術語且可使用術語「多肽」替代此等術語中的任一者，或術語「多肽」可與此等術語中的任一者互換使用。術語「多肽」亦意指多肽之表現後修飾產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解分裂或藉由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物學來源或藉由重組技術製得，但不必定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括化學合成。本發明多肽之大小可為約3個或超過3個、5個或超過5個、10個或超過10個、20個或超過20個、25個或超過25個、50個或超過50個、75個或超過75個、100個或超過100個、200個或超過200個、500個或超過500個、1,000個或超過1,000個，或2,000個或超過2,000個胺基酸。多肽可具有定義的三維結構，但其不必定具有此類結構。具有定義之三維結構的多肽稱為摺疊，且不具有定義之三維結構，而是可採用許多不同構形的多肽稱為展開。
「經分離」之多肽或其變異體或衍生物意指不處於天然環境下的多肽。不需要特定的純化程度。舉例而言，分離多肽可自其原生或天然環境中移除。出於本發明之目的，宿主細胞中所表現之重組產生型多肽及蛋白質視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離或部分或實質上純化的原生或重組多肽亦視為經分離。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，候選序列中之與參考多肽序列胺基酸殘基一致的胺基酸殘基百分比，且任何保守性取代不視為序列一致性之一部分。用於測定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以此項技術之技能範圍內之多種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、 ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創作，且原始碼已隨使用者文件一起提交於美國版權局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其在美國版權局以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程序可公開獲自Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或可自原始碼編寫。ALIGN-2程序經編寫可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變化。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，指定胺基酸序列A相對於、與或針對指定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表述為，指定胺基酸序列A具有或包含相對於、與或針對指定胺基酸序列B的胺基酸序列一致性一定%)如下計算：100×分數X/Y
其中X為在A與B之程式比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%不相等。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值係使用ALIGN-2電腦程式獲得，如前一段落中剛剛所述。
術語「聚核苷酸」係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)、病毒源RNA或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在的任一個或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。
「分離」之核酸分子或聚核苷酸意指已自原生環境中移除的核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組性聚核苷酸視為經分離。分離之聚核苷酸之其他實例包括異質宿主細胞中所維持的重組聚核苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。分離之RNA分子包括本發明的活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之分離之聚核苷酸或核酸進一步包括合成方式產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
一種核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少例如95%「一致」意指該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可每100個核苷酸中包括至多五個點突變。換言之，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入數目佔參考序列核苷酸總數至多5%的核苷酸。參考序列之此等變化可發生於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地散佈於參考序列殘基中或參考序列內的一或多個相連基團中。實際來看，任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可習知地使用已知電腦程式確定，諸如上文針對多肽所論述的電腦程式(例如ALIGN-2)。
術語「表現卡匣」係指重組或合成方式產生的聚核苷酸，其具有允許靶細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸 片段中。典型地，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄的核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且導引該基因表現的DNA分子，該DNA分子與該基因在靶細胞中可操作地連接。該術語包括作為自複製核酸結構的載體以及併入其已引入之宿主細胞基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與親代細胞可能不完全相同，而是可能含有突變。本文包括在原始轉型細胞中篩選或選擇之具有相同功能或生物活性之突變型後代。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或稠合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養植物或動物組織內所含的細胞。
「活化Fc受體」為一種Fc受體，其與抗體Fc域接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。人類活化Fc受體包 括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為一種免疫機制，其促使免疫效應細胞溶解塗有抗體之靶細胞。靶細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物特異性結合(一般經由Fc區N末端之蛋白質部分結合)的細胞。如本文所使用，術語「降低之ADCC」定義為在圍繞靶細胞之介質中、在指定的抗體濃度下、在指定時間內、藉由上文所定義之ADCC機制溶解之靶細胞數目減少，及/或在圍繞靶細胞之介質中，在指定時間內藉由ADCC機制達成指定數目個靶細胞溶解所必需的抗體濃度增加。ADCC降低係相對於由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，Fc域中包含降低ADCC之胺基酸取代的抗體所介導之ADCC降低係相對於Fc域中無此胺基酸取代之相同抗體所介導的ADCC而言。適於量測ADCC的分析在此項技術中已熟知(參見例如PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT公開案第WO 2012/130831號)。
藥劑之「有效量」係指使其所投與之細胞或組織中產生生理學變化所必需的量。
藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在必需的劑量及時間段情況下，有效達成所要治療或預防結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑消除、減少、延遲、最小化或預防疾病副作用。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體為人類。
術語「醫藥組合物」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生 物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中之除活性成分之外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之疾病之自然過程的臨床介入且可出於預防的或在臨床病理學過程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、減緩疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告之資訊。
實施例之詳細說明
本發明提供一種T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其在治療性應用中具有有利特性，特定言之，具有改良之可製造性(例如在純度、產量方面)。本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含之Fab分子中的胺基酸取代特別有效地減少輕鏈與非匹配重鏈(瓊斯本型副產物)之誤配，誤配在產生基於Fab之雙特異性/多特異性抗原結合分子(其結合臂之一(或多個，在分子包含超過兩個抗原結合Fab分子的情況下)中存在VH/VL交換)時會發生(亦參見PCT申請案第PCT/EP2015/057165號，特別是其中的實例，該案以全文引用的方式併入本文中)。
在第一態樣中，本發明提供一種T細胞活化雙特異性抗原結合分 子，其包含：(a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子(b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中Fab輕鏈可變域VL與Fab重鏈可變域VH彼此間置換，其中第一抗原為活化T細胞抗原且第二抗原為靶細胞抗原，或第一抗原為靶細胞抗原且第二抗原為活化T細胞抗原；且其中i)在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經帶正電的胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸經帶負電的胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)在b)項下之第二Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經帶正電的胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在b)項下之第二Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸經帶負電的胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
根據本發明，T細胞活化雙特異性抗原結合分子不包含i)及ii)項下提及的兩種修飾。第二Fab分子之恆定域CL與CH1彼此間不置換(亦即保持不交換狀態)。
在根據本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一個實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據 Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個更特定的實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個甚至更特定的實施例中，在a)項下之第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在a)項下之第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在特定實施例中，a)項下之第一Fab分子之恆定域CL為κ同型。
或者，根據上述實施例之胺基酸取代可發生於b)項下之第二Fab 分子之恆定域CL及恆定域CH1中，而非a)項下之第一Fab分子之恆定域CL及恆定域CH1中。在特定的此類實施例中，b)項下之第二Fab分子之恆定域CL為κ同型。
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可進一步包含特異性結合至第一抗原的第三Fab分子。在特定實施例中，該第三Fab分子與a)項下的第一Fab分子相同。在此等實施例中，根據上述實施例之胺基酸取代發生於第一Fab分子及第三Fab分子中之每一者之恆定域CL及恆定域CH1中。或者，根據上述實施例之胺基酸取代可發生於b)項下之第二Fab分子之恆定域CL及恆定域CH1中，而非發生於第一Fab分子及第三Fab分子之恆定域CL及恆定域CH1中。
在特定實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合的第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域。
T細胞活化雙特異性抗原結合分子形式
T細胞活化雙特異性抗原結合分子之組分彼此間可以多種組態稠合。例示性組態描繪於圖1中。
在特定實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元N末端稠合。
在一個此類實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在一個特定的此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元組成的Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第二Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1G及1K中。視情況，第一Fab分子之 Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此間稠合。
在另一此類實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元之N末端稠合。在一個特定的此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元組成的Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一及第二Fab分子各自在Fab重鏈C末端與Fc域之亞單元之一的N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1A及圖1D中。第一及第二Fab分子可與Fc域直接稠合或經由肽連接子稠合。在一個特定實施例中，第一及第二Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域稠合。在一個特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區，特別是Fc域為IgG1 Fc域的情況下。
在其他實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元之N末端稠合。
在一個此類實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在一個特定的此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元組成的Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第一Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1H及1L中。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此間稠合。
Fab分子可直接或經由包含一或多個胺基酸(典型地，約2-20個胺基酸)的肽連接子與Fc域稠合或彼此間稠合。肽連接子在此項技術中已知且描述於本文中。適合的非免疫原性肽連接子包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子。「n」一般為整數1至10，典型地為2至4。在一個實施例中，該肽連接子具有至少5個胺基酸之長度； 在一個實施例中，具有5至100個胺基酸之長度；在另一實施例中，具有10至50個胺基酸之長度。在一個實施例中，該肽連接子為(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5且m=0、1、2或3)，在一個實施例中，x=4且n=2或3，在另一實施例中，x=4且n=2。在一個實施例中，該肽連接子為(G4S)2。特別適用於第一Fab分子與第二Fab分子之Fab輕鏈彼此間稠合的肽連接子為(G4S)2。適於連接第一Fab片段與第二Fab片段Fab重鏈的例示性肽連接子包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 11及12)。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特別是在Fab分子與Fc域亞單元N末端稠合的情況下，其可在另外的肽連接子存在或不存在的情況下經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分稠合。
使用具有能夠特異性結合至靶細胞抗原之單一抗原結合部分(諸如Fab分子)的T細胞活化雙特異性抗原結合分子(例如如圖1A、D、G、H、K、L中所示)，特別是在高親和性抗原結合部分結合之後預期靶細胞抗原發生內化的情況下。在此等情況下，存在超過一個特異性針對靶細胞抗原的抗原結合部分可增強靶細胞抗原之內化，從而降低其可利用性。
然而，在許多其他情況下，有利的是T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含兩個或超過兩個特異性針對靶細胞抗原的抗原結合部分(諸如Fab分子)(參見圖1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N中所示之實例)，以例如使靶向靶點最佳化或允許靶細胞抗原交聯。
因此，在特定實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含特異性結合至第一抗原的第三Fab分子。第一抗原較佳為靶細胞抗原。在一個實施例中，第三Fab分子為習知Fab分子。在一個實施例中，第三Fab分子與第一Fab分子相同(亦即，第一及第三Fab分子包含相同的重鏈及輕鏈胺基酸序列且具有相同的域排列(亦即 習知或互換型))。在一個特定實施例中，第二Fab分子特異性結合至活化T細胞抗原，特定言之，CD3，且第一及第三Fab分子特異性結合至靶細胞抗原。
在替代實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含特異性結合至第二抗原的第三Fab分子。在此等實施例中，第二抗原較佳為靶細胞抗原。，在一個此類實施例中，第三Fab分子為互換型Fab分子(其中Fab重鏈可變域VH與及Fab輕鏈可變域VL彼此間交換/置換)。在一個此類實施例中，第三Fab分子與第二Fab分子相同(亦即，第二及第三Fab分子包含相同的重鏈及輕鏈胺基酸序列且具有相同的域排列(亦即習知或互換型))。在一個此類實施例中，第一Fab分子特異性結合至活化T細胞抗原，特定言之，CD3，且第一及第三Fab分子特異性結合至靶細胞抗原。
在一個實施例中，第三Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一或第二亞單元之N末端稠合。
在一個特定實施例中，第二及第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與Fc域之亞單元之一之N末端稠合，且第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在一個特定的此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、由第一及第二亞單元組成的Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第二Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一亞單元之N末端稠合，且其中第三Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第二亞單元之N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1B及1E(特定實施例，其中第三Fab分子為習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)，及圖1I及圖1M(替代實施例，其中第三Fab分子為互換型Fab分子且較佳與第二Fab分子相同)。第一及第三Fab分子可與Fc域直接稠合或經由肽連 接子稠合。在一個特定實施例中，第二及第三Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域稠合。在一個特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區，特別是Fc域為IgG1 Fc域的情況下。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此間稠合。
在另一個實施例中，第一第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與Fc域之亞單元之一之N末端稠合，且第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在一個特定的此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、由第一及第二亞單元組成的Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第一Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第一亞單元之N末端稠合，且其中第三Fab分子在Fab重鏈C末端與Fc域之第二亞單元之N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1C及1F(特定實施例，其中第三Fab分子為習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)，及圖1J及圖1N(替代實施例，其中第三Fab分子為互換型Fab分子且較佳與第二Fab分子相同)。第一及第三Fab分子可與Fc域直接稠合或經由肽連接子稠合。在一個特定實施例中，第一及第三Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域稠合。在一個特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區，特別是Fc域為IgG1 Fc域的情況下。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此間稠合。
在其中Fab分子於Fab重鏈C末端經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域之亞單元中之每一者之N末端稠合的T細胞活化雙特異性抗原結合分子之組態中，兩個Fab分子、鉸鏈區及Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一個特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一個更特定的實施例中，免疫球蛋白為IgG1子類免疫球蛋白。在另一個實施例中，免疫球蛋白為IgG4子類免疫球蛋白。在另一個特定實施 例中，免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
在本發明之一些T細胞活化雙特異性抗原結合分子中，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈彼此間稠合，視情況經由肽連接子稠合。視第一及第二Fab分子之組態而定，第一Fab分子之Fab輕鏈可在其C末端與第二Fab分子之Fab輕鏈之N末端稠合，或第二Fab分子之Fab輕鏈可在其C末端與第一Fab分子之Fab輕鏈之N末端稠合。第一與第二Fab分子之Fab輕鏈之稠合進一步降低不匹配Fab重鏈與輕鏈之誤配，且亦降低為了表現本發明之一些T細胞活化雙特異性抗原結合分子所需的質體數目。
在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域亞單元共用羧基末端肽鍵(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))的多肽；及其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共用羧基末端肽鍵(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))的多肽。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵的多肽。在某些實施例中，多肽係共價連接，例如經雙硫鍵連接。
在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵、第一Fab分子之Fab重鏈又與 Fc域亞單元共用羧基末端肽鍵(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵、第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域亞單元共用羧基末端肽鍵(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些此等實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含第二Fab分子之互換型Fab輕鏈多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵。在其他此等實施例中，適當時，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共用羧基末端肽鍵(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))的多肽；或其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵、第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))的多肽。
根據此等實施例之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域亞單元多肽(CH2-CH3(-CH4))；或(ii)其中第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))共用羧基末端肽鍵的多肽。在某些實施例中，多肽係共價連接，例如經雙硫鍵連接。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子之Fab重鏈之N末端稠合。在某些此類實施例中，T細胞活化雙特異性 抗原結合分子不包含Fc域。在某些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子，以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1O及1S中。
在其他實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在某些此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子不包含Fc域。在某些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子，以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1P及1T中。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。在特定的此類實施例中，該第三Fab分子為習知Fab分子。在其他此類實施例中，該第三Fab分子為如本文所述的互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。在某些此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子，以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第三Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1Q及1U中(特定實施例，其中第三Fab分子為習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈N末端與第二Fab分子 Fab重鏈C末端稠合。在特定的此類實施例中，該第三Fab分子為如本文所述的互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。在其他此類實施例中，該第三Fab分子為習知Fab分子。在某些此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子，以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第三Fab分子在Fab重鏈N末端與第二Fab分子Fab重鏈C末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1W及1Y中(特定實施例，其中第三Fab分子為互換型Fab分子且較佳與第二Fab分子相同)。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈N末端與第一Fab分子Fab重鏈C末端稠合。在特定的此類實施例中，該第三Fab分子為習知Fab分子。在其他此類實施例中，該第三Fab分子為如本文所述的互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。在某些此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子，以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第三Fab分子在Fab重鏈N末端與第一Fab分子Fab重鏈C末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1R及1V中(特定實施例，其中第三Fab分子為習知Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子 Fab重鏈N末端稠合。在特定的此類實施例中，該第三Fab分子為如本文所述的互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。在其他此類實施例中，該第三Fab分子為習知Fab分子。在某些此類實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子，以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈C末端與第一Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且第三Fab分子在Fab重鏈C末端與第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合。此組態示意性地描繪於圖1X及1Z中(特定實施例，其中第三Fab分子為互換型Fab分子且較佳與第一Fab分子相同)。
在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵、第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵的多肽。
在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經置換)、第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵 (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵的多肽。
在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵、第一Fab分子之Fab重鏈又與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵、第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵的多肽。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵、第一Fab分子之Fab重鏈又與第三Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵的多肽。在一些實施例中，T細胞活化 雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵、第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第三Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵、第三Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵的多肽。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VH(3)-CL(3))的多肽。
在某些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第三Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵、第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(亦即第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。 在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2)-CL(2))及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))共用羧基末端肽鍵的多肽。在一些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VH(3)-CL(3))的多肽。
根據任一上述實施例，T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之組分(例如Fab分子、Fc域)可直接或經由各種連接子(特定言之，本文所述或此項技術中已知之包含一或多個胺基酸、典型地約2-20個胺基酸的肽連接子)稠合。適合的非免疫原性肽連接子包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子，其中n一般為整數1至10，典型地為2至4。
Fc域
T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之Fc域係由一對包含免疫球蛋白分子重鏈域的多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G(IgG)分子中之Fc域為二聚體，其中各亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個亞單元彼此間能夠穩定結合。在一個實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含不超過一個Fc域。
在根據本發明之一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之Fc域為IgG Fc域。在一個特定實施例中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一實施例中，Fc域為IgG4 Fc域。在一個更特定實施例中，Fc域為包含位置S228(Kabat編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少活體內IgG4抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一個特定實施例中，Fc域為人類Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列明示於SEQ ID NO：13中。
促進雜二聚化之Fc域修飾
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含與Fc域之兩個亞單元中之一者或另一者稠合的不同Fab分子，因此Fc域之該兩個亞單元典型地包含於兩個非一致多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及隨後二聚化引起兩種多肽出現若干種可能的組合。因此有利的是，將促進所要多肽結合的修飾引入T細胞活化雙特異性抗原結合分子之Fc域中以改良T細胞活化雙特異性抗原結合分子在重組製造時的產量及純度。
因此，在特定實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個亞單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc域之CH3域中。因此，在一個實施例中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。
Fc域之CH3域中的修飾存在若干種方法以便進行雜二聚化，此等方法充分描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。典型地，在所有此類方法中，Fc域之第一亞單元之CH3域與Fc域之第二亞單元之CH3域均以互補方式經工程改造，使得各CH3域(或包含其的重鏈)本身不再發生均二聚，而是被迫與以互補方式經工程改造之另一CH3域雜二聚(使得第一CH3域與第二CH3域發生雜二聚且兩個第一CH3域或兩個第二CH3域之間不形成均二聚體)。涵蓋用於改良重鏈雜二聚化的此等不同方法作為不同替代方案與本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中的重鏈-輕鏈修飾(一個結合臂中存在VH與VL交換/置換且帶電胺基酸經相反電荷取代引入CH1/CL界面)的組合，從而減少輕鏈誤配及瓊斯 本型副產物。
在一個特定實施例中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的該修飾為所謂的「臼包杵」型修飾，包含位於Fc域之兩個亞單元之一中的「杵」型修飾及位於Fc域之兩個亞單元之另一者中的「臼」型修飾。
臼包杵型技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。一般而言，方法包括在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應空腔(「臼」)，使得隆凸可定位於空腔中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構建隆凸。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而在第二多肽界面中產生大小與隆凸相同或相似的補償性空腔。
因此，在一個特定實施例中，在T細胞活化雙特異性抗原結合分子之Fc域之第一亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且在Fc域之第二亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在第二亞單元之CH3域內產生供第一亞單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的空腔。
較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群。
較佳地，具有較小側鏈體積的胺基酸殘基選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。
隆凸及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸(例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成來改變)來產生。
在一特定實施例中，在Fc域之第一亞單元(「杵」亞單元)之CH3域中，位置366之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元(「臼」亞單元)之CH3域中，位置407之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個實施例中，在Fc域之第二亞單元中，另外，位置366之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基(S354C)置換或位置356之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個亞單元之間形成二硫橋鍵，進一步穩定二聚體(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一個特定實施例中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，特異性結合活化T細胞抗原的Fab分子與Fc域之第一亞單元(包含「杵」型修飾)稠合(視情況經由特異性結合至靶細胞抗原的Fab分子稠合)。不希望受理論束縛，特異性結合活化T細胞抗原之Fab分子與Fc域之含杵亞單元稠合(進一步)使包含兩個結合至活化T細胞抗原之Fab分子之抗原結合分子的產生最小化(兩個含杵多肽在空間上有抵觸)。
涵蓋用於增強雜二聚化之CH3修飾的其他技術作為本發明之替代方案且此等技術描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個實施例中，替代地使用EP 1870459 A1中所述之雜二聚化方法。此方法係基於在Fc域之兩個亞單元之間的CH3/CH3域界面中的特定胺基酸位置引入具有相反電荷的帶電胺基酸。本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一個較佳實施例為存在於(Fc域之)兩個CH3域之一中的胺基酸突變R409D、K370E及存在於Fc域之另一個CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變T366W及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變T366S、L368A、Y407V；以及另外存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366W及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V，或該T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366W及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V以及另外存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(所有編號均根據Kabat EU索引)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2013/157953中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366K且第二CH3域包含胺基酸突變L351D(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3域進一步包含胺基酸突變L351K。在另一實施例中，第二CH3域進一步包含選自Y349E、Y349D及L368E之胺基酸突變(較 佳為L368E)(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2012/058768中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3域包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392之另一胺基酸突變，例如選自以下之胺基酸突變：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b)D399R、D399W、D399Y或D399K；c)S400E、S400D、S400R或S400K；d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W；e)N390R、N390K或N390D；f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R及S400R(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2011/143545中所述之雜二聚化方法，例如發生於選自由368及409組成之群之位置的胺基酸修飾(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2011/090762中所述之雜二聚化方法，其亦使用上述臼包杵技術。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366W且第二CH3域包含胺基酸突變Y407A。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366Y且第二CH3域包含胺基酸突變Y407T(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子或其Fc域屬於IgG2子類且替代地使用WO 2010/129304中所述之雜二聚化方法。
在一個替代實施例中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結 合的修飾包含介導靜電導引作用的修飾，例如如PCT公開案WO 2009/089004中所述。一般而言，此方法包括兩個Fc域亞單元界面處的一或多個胺基酸殘基經帶電胺基酸殘基置換，以致均二聚體形成在靜電上變得不利，但雜二聚化在靜電上變得有利。在一個此類實施例中，第一CH3域包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳為K392D或N392D)對K392或N392發生的胺基酸取代且第二CH3域包含帶正電胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，較佳為D399K、E356K、D356K或E357K，且更佳為D399K及E356K)對D399、E356、D356或E357發生的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳為K409D或R409D)對K409或R409發生的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步或替代地包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))對K439及/或K370發生的胺基酸取代(所有編號均根據Kabat EU索引)。
在又另一個實施例中，替代地使用WO 2007/147901中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變K253E、D282K及K322D且第二CH3域包含胺基酸突變D239K、E240K及K292D(根據Kabat EU索引編號)。
在再另一個實施例中，可替代地使用WO 2007/110205中所述之雜二聚化方法。
在一個實施例中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代K392D及K409D，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代D356K及D399K(根據Kabat EU索引編號)。
Fc域修飾降低Fc受體結合及/或效應功能
Fc域賦予T細胞活化雙特異性抗原結合分子有利的藥物動力學特性，包括較長血清半衰期，其有助於良好聚積於靶組織中及有利的組 織-血液分佈比率。然而，其同時引起T細胞活化雙特異性抗原結合分子非所需地靶向表現Fc受體之細胞，而非優先靶向攜帶抗原之細胞。此外，Fc受體信號傳導路徑之共活化可引起細胞激素釋放，細胞激素釋放與抗原結合分子之T細胞活化特性及長半衰期組合，導致全身性投藥後的細胞激素受體過度活化及重度副作用。由於T細胞存在被摧毀(例如被NK細胞摧毀)的可能性，因此除T細胞之外之免疫細胞(攜帶Fc受體)之活化甚至會降低T細胞活化雙特異性抗原結合分子之功效。
因此，在特定實施例中，相較於原生IgG1 Fc域，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之Fc域針對Fc受體展現降低之結合親和力及/或降低之效應功能。在一個此類實施例中，Fc域(或包含該Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)對Fc受體展現的結合親和力小於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)對Fc受體之結合親和力的50%，較佳小於20%，更佳小於10%且最佳小於5%，且/或Fc域(或包含該Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)現的效應功能小於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)所展現之效應功能的50%，較佳小於20%，更佳小於10%且最佳小於5%。在一個實施例中，Fc域(或包含該Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)實質上不結合至Fc受體且/或誘導效應功能。在一個特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一個特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，人類FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為選自CDC、ADCC、ADCP及細胞激素分泌之群組的一或多者。在一個特定實施例中，效應功能為ADCC。在一個實施例中，Fc域對新生兒Fc受體(FcRn)展現的結合親和力實質上類似於原生IgG1 Fc域。當Fc域(或包含該Fc域的T細胞活化雙特異性抗 原結合分子)對FcRn展現的結合親和力大於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)對FcRn之結合親和力的約70%、特定言之大於約80%、更特定言之大於約90%時，對FcRn達成實質上相似的結合。
在某些實施例中，相較於未經工程改造的Fc域，經工程改造的Fc域對Fc受體的結合親和力減小且/或效應功能減少。在特定實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子之Fc域包含一或多個使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸突變。典型地，Fc域之兩個亞單元中之每一者中存在該一或多個胺基酸突變。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在超過一個使Fc域對Fc受體之結合親和力減小之胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可使Fc域對Fc受體的結合親和力減小至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，包含經工程改造之Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體展現的結合親和力小於包含未經工程改造之Fc域之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之結合親和力的20%，特定言之小於10%，更特定言之小於5%。在一個特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一些實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一個特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之每一者的結合減少。在一些實施例中，相對於補體組分的結合親和力，特定言之，相對於C1q的結合親和力，亦減小。在一個實施例中，相對於新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力未減小。當Fc域(或包含該Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)對FcRn展現的結合親和力大於未經工程改造之Fc域形式(或包含該未經 工程改造之Fc域形式的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)之結合親和力的約70%時，對FcRn達成實質上相似的結合，亦即，保持Fc域對該受體的結合親和力。Fc域或本發明之包含該Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子可展現大於此親和力的約80%且甚至大於約90%。在某些實施例中，相較於未經工程改造之Fc域，T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之Fc域經工程改造可具有減少之效應功能。減少之效應功能可包括(但不限於)以下一或多者：補體依賴性細胞毒性(CDC)降低、抗體依賴性細胞介導性細胞毒性(ADCC)降低、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)減少、細胞激素分泌減少、免疫複合物介導抗原呈遞細胞攝入抗原減少、相對於NK細胞的結合減少、相對於巨噬細胞的結合減少、相對於單核細胞的結合減少、相對於多形核細胞的結合減少、誘導細胞凋亡之直接信號傳導減少、標靶所結合抗體之交聯減少、樹突狀細胞成熟減少，或T細胞激活減少。在一個實施例中，減少之效應功能為選自以下之群的一或多者：CDC降低、ADCC降低、ADCP降低及細胞激素分泌減少。在一個特定實施例中，減少之效應功能為ADCC降低。在一個實施例中，降低之ADCC小於未經工程改造之Fc域(或包含未經工程改造之Fc域的T細胞活化雙特異性抗原結合分子)所誘導之ADCC的20%。
在一個實施例中，使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域包含位於選自以下之群之位置的胺基酸取代：E233、L234、L235、N297、P331及P329(根據Kabat EU索引編號)。在一個更特定實施例中，Fc域包含位於選自以下之群之位置的胺基酸取代：L234、L235及P329(根據Kabat EU索引編號)。在一些實施例中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A(根據Kabat EU索引編號)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域包含 位置P329之胺基酸取代。在一個更特定的實施例中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之，P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，Fc域包含位置P329之胺基酸取代及選自E233、L234、L235、N297及P331之位置的另一胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個更特定的實施例中，另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，Fc域包含位置P329、L234及L235之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更特定的實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G(「P329G LALA」)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。「P329G LALA」胺基酸取代組合幾乎澈底地消除人類IgG1 Fc域與Fcγ受體(以及補體)之結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所述，該文獻以全文引用的方式併入本文中。WO 2012/130831亦描述製備此類突變型Fc域的方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)的方法。
相較於IgG1抗體，IgG4抗體針對Fc受體展現降低之結合親和力及減少之效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中的Fc域為IgG4 Fc域，特定言之，人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代S228P(根據Kabat EU索引編號)。為了進一步減小其對Fc受體的結合親和力及/或其效應功能，在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置L235之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代L235E(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置P329之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一個特定實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228、L235及P329之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代S228P、L235E及P329G(根據Kabat EU索引編號)。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合特性描述 於PCT公開案第WO 2012/130831號中，該案以全文引用的方式併入本文中。
在一個特定實施例中，相較於原生IgG1 Fc域針對Fc受體展現降低之結合親和力及/或減少之效應功能的Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G的人類IgG1 Fc域，或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G的人類IgG4 Fc域(根據Kabat EU索引編號)。
在某些實施例中，Fc域之N糖基化已消除。在一個此類實施例中，Fc域包含位置N297之胺基酸突變，特定言之，丙胺酸置換天冬醯胺的胺基酸取代(N297A)或天冬胺酸置換天冬醯胺的胺基酸取代(N297D)(根據Kabat EU索引編號)。
除上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所述之Fc域之外，Fc受體結合及/或效應功能減少之Fc域亦包括具有Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的Fc域(美國專利第6,737,056號)(根據Kabat EU索引編號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
突變型Fc域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法、藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳學方法可包括編碼DNA序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如測序來檢驗。
與Fc受體的結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。適合的此類結合分析描述於本文中。或者，Fc域或包含Fc域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受 體的結合親和力可使用已知表現特定Fc受體的細胞株(諸如表現FcγIIIa受體的人類NK細胞)評價。
Fc域或包含Fc域之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC的分析描述於本文中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流式細胞術用的ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可評估所關注分子之活體內ADCC活性，例如在動物模型(諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中所揭示)中。
在一些實施例中，Fc域相對於補體組分(特定言之，C1q)的結合減少。因此，在其中Fc域經工程改造而具有減少之效應功能的一些實施例中，該減少之效應功能包括降低之CDC。可進行C1q結合分析以確定T細胞活化雙特異性抗原結合分子是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；及Cragg及Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
抗原結合部分
本發明之抗原結合分子具有雙特異性，亦即其包含至少兩個能 夠特異性結合至兩個不同抗原性決定子的抗原結合部分。根據本發明，抗原結合部分為Fab分子(亦即由各包含可變域及恆定域之重鏈及輕鏈組成的抗原結合域)。在一個實施例中，該等Fab分子為人類Fab分子。在另一個實施例中，該等Fab分子為人類化Fab分子。在又另一個實施例中，該等Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定域。
抗原結合部分中的至少一者為互換型Fab分子。此類修飾減少來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈之誤配，從而改良本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子在重組製造時之產量及純度。在適用於本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的特定互換型Fab分子中，Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域(分別為VL及VH)發生交換。然而，即使存在此域交換，T細胞活化雙特異性抗原結合分子製劑亦可包含由於誤配之重鏈與輕鏈之間之所謂瓊斯本型相互作用而產生的某些副產物(參見Schaefer等人，PNAS,108(2011)11187-11191)。為了進一步減少來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈之誤配且從而提高本發明之所要T細胞活化雙特異性抗原結合分子的純度及產量，在特異性結合至靶細胞抗原之Fab分子或特異性結合至活化T細胞抗原之Fab分子之CH1及CL域中的特定胺基酸位置引入具有相反電荷的帶電胺基酸。電荷修飾發生於T細胞活化雙特異性抗原結合分子所含之習知Fab分子(諸如圖1 A-C、G-J中所示)中，或發生於T細胞活化雙特異性抗原結合分子所含之互換型Fab分子(諸如圖1 D-F、K-N中所示)中(但並非發生於兩者中)。在特定實施例中，電荷修飾發生於T細胞活化雙特異性抗原結合分子所含之習知Fab分子(在特定實施例中，其特異性結合至靶細胞抗原)中。
在根據本發明之一個特定實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子能夠同時結合至靶細胞抗原(特定言之，腫瘤細胞抗原)及活化T細胞抗原(特定言之，CD3)。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性 抗原結合分子藉由同時結合至靶細胞抗原及活化T細胞抗原而能夠使T細胞與靶細胞交聯。在一個甚至更特定的實施例中，此同時結合引起靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解。在一個實施例中，此同時結合引起T細胞活化。在其他實施例中，此同時結合引起T淋巴細胞(特定言之，細胞毒性T淋巴細胞)之細胞反應，細胞反應選自以下之群組：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒活性及活化標記表現。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子結合至活化T細胞抗原(特定言之，CD3)而不同時結合至靶細胞抗原，未引起T細胞活化。
在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子能夠使T細胞之細胞毒性活性再定向靶細胞。在一個特定實施例中，該再定向不依賴於MHC介導靶細胞呈遞肽抗原及T細胞之特異性。
特定言之，根據本發明之任一實施例的T細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD4+或CD8+ T細胞，特定言之，CD8+ T細胞。
活化T細胞抗原結合Fab分子
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含至少一個特異性結合至活化T細胞抗原的Fab分子(在本文中亦被稱作「活化T細胞抗原結合Fab分子」)。在一個特定實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含不超過一個能夠特異性結合至活化T細胞抗原的Fab分子(或其他Fab分子)。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子向活化T細胞抗原提供單價結合。
在特定實施例中，特異性結合活化T細胞抗原的Fab分子為如本文所述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與Fab輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。在此等實施例中，特異性結合靶細胞抗原的Fab分子為習知Fab分子。在存在超過一個Fab分子特異性結 合至T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含之靶細胞抗原的實施例中，特異性結合至活化T細胞抗原的Fab分子較佳為互換型Fab分子且特異性結合至靶細胞抗原的Fab分子為習知Fab分子。
在替代實施例中，特異性結合活化T細胞抗原的Fab分子為習知Fab分子。在此類實施例中，特異性結合靶細胞抗原的Fab分子為如本文所述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與Fab輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。
在一個特定實施例中，活化T細胞抗原為CD3，特定言之，人類CD3(SEQ ID NO：1)或食蟹獼猴CD3(SEQ ID NO：2)，最特定言之，人類CD3在一個特定實施例中，活化T細胞抗原結合Fab分子對於人類及食蟹獼猴CD3具有交叉反應(亦即特異性結合至人類及食蟹獼猴CD3)。在一些實施例中，活化T細胞抗原為CD3之ε亞單元(CD3 ε)。
在一些實施例中，活化T細胞抗原結合Fab分子特異性結合至CD3(特定言之，CD3 ε)，且包含至少一個選自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10之群組的輕鏈CDR。
在一個實施例中，CD3結合Fab分子包含含有SEQ ID NO：4之重鏈CDR1、SEQ ID NO：5之重鏈CDR2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR3的重鏈可變區，及含有SEQ ID NO：8之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR3的輕鏈可變區。
在另一個實施例中，CD3結合Fab分子包含含有SEQ ID NO：4之重鏈CDR1、SEQ ID NO：67之重鏈CDR2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR3的重鏈可變區，及含有SEQ ID NO：68之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR3的輕鏈可變區。
在一個實施例中，CD3結合Fab分子包含與SEQ ID NO：3至少約 95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：7至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。
在一個實施例中，CD3結合Fab分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：3的重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：7的輕鏈可變區。
在一個實施例中，CD3結合Fab分子包含重鏈可變區序列SEQ ID NO：3及輕鏈可變區序列SEQ ID NO：7。
靶細胞抗原結合Fab分子
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含至少一個特異性結合至靶細胞抗原的Fab分子(在本文中亦被稱作「靶細胞抗原結合Fab分子」)。在某些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含兩個特異性結合至靶細胞抗原的Fab分子。在一個特定的此類實施例中，此等Fab分子中之每一者特異性結合至相同抗原性決定子。在一個甚至更特定的實施例中，所有此等Fab分子均相同，亦即其包含包括如本文所述之CH1及CL域中之相同胺基酸取代的相同胺基酸序列(若存在)。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含特異性結合至靶細胞抗原的免疫球蛋白分子。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含不超過兩個特異性結合至靶細胞抗原的Fab分子。
在特定實施例中，特異性結合至靶細胞抗原的Fab分子為習知Fab分子。在此類實施例中，特異性結合活化T細胞抗原的Fab分子為如本文所述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與Fab輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。
在替代實施例中，特異性結合至靶細胞抗原的Fab分子為如本文所述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈可變域VH與Fab輕鏈可變域VL彼此間交換/置換的Fab分子。在此類實施例中，特異性結合活化T 細胞抗原的Fab分子為習知Fab分子。
靶細胞抗原結合Fab分子結合至特定抗原性決定子且能夠使T細胞活化雙特異性抗原結合分子定向靶點，例如定向攜帶抗原性決定子之特定類型的腫瘤細胞。
在某些實施例中，靶細胞抗原結合Fab分子特異性結合至細胞表面抗原。
在某些實施例中，靶細胞抗原結合Fab分子係針對與病理性病狀相關的抗原，諸如腫瘤細胞或病毒感染細胞所呈遞的抗原。適合的靶細胞抗原為細胞表面抗原，例如(但不限於)細胞表面受體。在特定實施例中，靶細胞抗原為人類抗原。例示性靶細胞抗原包括CD20、Her2、Her3、MCSP(黑色素瘤相關軟骨素硫酸酯蛋白聚醣，亦稱為軟骨素硫酸酯蛋白聚醣4)，或BCMA(人類B細胞成熟標靶，亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員17(UniProt Q02223))。
在特定實施例中，靶細胞抗原為CD20，特定言之，人類CD20。在一個實施例中，靶細胞抗原為CD20且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含含有SEQ ID NO：46之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：47之重鏈CDR 2及SEQ ID NO：48之重鏈CDR 3的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO：49之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：50之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：51之輕鏈CDR 3的輕鏈可變區。在另一實施例中，靶細胞抗原為CD20且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含與序列SEQ ID NO：30至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區，及與序列SEQ ID NO：31至少95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區。在再另一個實施例中，靶細胞抗原為CD20且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含重鏈可變區序列SEQ ID NO：30及輕鏈可變區序列SEQ ID NO：31。在一個特定實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含與序列SEQ ID NO：18至少95%、96%、 97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：19至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：20至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽及與序列SEQ ID NO：21至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一個特定實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含多肽序列SEQ ID NO：18、多肽序列SEQ ID NO：19、多肽序列SEQ ID NO：20及多肽序列SEQ ID NO：21。在另一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含與序列SEQ ID NO：32至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：19至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：20至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽及與序列SEQ ID NO：21至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含多肽序列SEQ ID NO：32、多肽序列SEQ ID NO：19、多肽序列SEQ ID NO：20及多肽序列SEQ ID NO：21。在再另一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含與序列SEQ ID NO：36至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：37至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：38至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽及與序列SEQ ID NO：39至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含多肽序列SEQ ID NO：36、多肽序列SEQ ID NO：37、多肽序列SEQ ID NO：38及多肽序列SEQ ID NO：39。在另一實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含與序列SEQ ID NO：40至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：41至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：20至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽及與序列SEQ ID NO：21至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多 肽。在另一實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含多肽序列SEQ ID NO：40、多肽序列SEQ ID NO：41、多肽序列SEQ ID NO：20及多肽序列SEQ ID NO：21。
在其他實施例中，靶抗原為Her2，特定言之，人類Her2。在一個實施例中，靶細胞抗原為Her2且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含與序列SEQ ID NO：61至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區，及與序列SEQ ID NO：62至少95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區。在另一實施例中，靶細胞抗原為Her2且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含重鏈可變區序列SEQ ID NO：61及輕鏈可變區序列SEQ ID NO：62。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含與序列SEQ ID NO：21至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：52至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：53至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽及與序列SEQ ID NO：54至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含多肽序列SEQ ID NO：21、多肽序列SEQ ID NO：52、多肽序列SEQ ID NO：53及多肽序列SEQ ID NO：54。
在其他實施例中，靶抗原為Her3，特定言之，人類Her3。在一個實施例中，靶細胞抗原為Her3且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含與序列SEQ ID NO：63至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區及與序列SEQ ID NO：64至少95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區。在另一實施例中，靶細胞抗原為Her3且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含重鏈可變區序列SEQ ID NO：63及輕鏈可變區序列SEQ ID NO：64。在一個實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含與序列SEQ ID NO：21至少95%、96%、 97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：55至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與序列SEQ ID NO：56至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽及與序列SEQ ID NO：57至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子包含多肽序列SEQ ID NO：21、多肽序列SEQ ID NO：55、多肽序列SEQ ID NO：56及多肽序列SEQ ID NO：57。
在其他實施例中，靶抗原為黑色素瘤相關軟骨素硫酸酯蛋白聚醣(MCSP)，特定言之，人類MCSP。在一個實施例中，靶細胞抗原為MCSP且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含與序列SEQ ID NO：65至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區，及與序列SEQ ID NO：66至少95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區。在另一實施例中，靶細胞抗原為Her2且特異性結合至該靶細胞抗原的Fab分子包含重鏈可變區序列SEQ ID NO：65及輕鏈可變區序列SEQ ID NO：66。
在一些實施例中，靶抗原為BCMA。在其他實施例中，靶細胞抗原不為BCMA。
聚核苷酸
本發明進一步提供編碼如本文所述之T細胞活化雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離之聚核苷酸。在一些實施例中，該片段為抗原結合片段。
編碼本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的聚核苷酸可以編碼整個T細胞活化雙特異性抗原結合分子之單一聚核苷酸形式或以共表現之多種(例如兩種或超過兩種)聚核苷酸形式表現。由共表現之聚核苷酸編碼的多肽可經由例如二硫鍵或形成功能性T細胞活化雙特異性抗原結合分子的其他方式結合。舉例而言，Fab分子之輕鏈部分 可由與包含Fab分子之重鏈部分、Fc域亞單元及視情況存在之另一Fab分子(之一部分)的T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一部分分離的聚核苷酸編碼。共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽結合而形成Fab分子。在另一實例中，包含兩個Fc域亞單元之一及視情況存在之一或多個Fab分子(一部分)的T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一部分可由與包含兩個Fc域亞單元中之另一者及視情況存在之Fab分子(之一部分)的T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一部分分離的聚核苷酸編碼。共表現時，Fc域亞單元結合而形成Fc域。
在一些實施例中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所述之本發明之整個T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所述之本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子中所包含之多肽。
在某些實施例中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA(mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。
重組方法
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可藉由例如固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組製造法獲得。重組製造時，分離一或多種編碼T細胞活化雙特異性抗原結合分子(片段)的聚核苷酸(例如如上文所述)且插入一或多個載體中用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類聚核苷酸可容易使用習知程序分離及測序。在一個實施例中，提供包含本發明之聚核苷酸中之一或多者的載體，較佳為表現載體。可利用熟習此項技術者已熟知的方法建構含有T細胞活化雙特異性抗原結合分子(片段)之編碼序列與適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術以及活體內重組/基因重組。參見例如以下文 獻中所述之技術：Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括編碼T細胞活化雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸(亦即編碼區)於其中選殖而與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作關聯的表現卡匣。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'未轉譯區及類似序列)不為編碼區之一部分。兩個或超過兩個編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如單一載體上，或存在於各別聚核苷酸構築體中，例如各別(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或超過兩個編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多種多肽，其經由蛋白水解分裂而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼與本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子(片段)的聚核苷酸或其變異體或衍生物稠合或不稠合的異質編碼區。異質編碼區包括(不限於)專門化元件或基元，諸如分泌性信號肽或異質功能域。當基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列以使得基因產物之表現置於調節序列之影響或控制下的方式關聯時，為可操作關聯。若誘導啟動子功能引起編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其相關的啟動子)為「可操作關聯」。因此，若啟動子能夠實現核酸轉錄，則啟動子區域與編碼 多肽之核酸可操作地關聯。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子之外的其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可操作地與導引細胞特異性轉錄的聚核苷酸關聯。適合啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多種轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猴病毒40(例如早期啟動子)及逆轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔α-血球蛋白)的彼等區域，以及能夠控制真核生物細胞中之基因表現的其他序列。其他適合轉錄控制區域包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclins))。類似地，多種轉譯控制元件已為一般技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關聯病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽的其他編碼區關聯，從而導引由本發明之聚核苷酸編碼的多肽分泌。舉例而言，若需要分泌T細胞活化雙特異性抗原結合分子，則編碼信號序列的DNA可置於編碼本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子或其片段之核酸上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有自成熟蛋白質裂解(一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網輸出已起始)的信號肽或分泌性前導序列。一般技術者意識到，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽N末端稠合的信號肽，該信號肽自所轉譯多肽裂 解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或保持導引與其可操作地關聯之多肽分泌之能力的該序列之功能衍生物。或者，可使用異質哺乳動物信號肽，或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。
編碼可用於促進隨後純化(例如組胺酸標記)或有助於標記T細胞活化雙特異性抗原結合分子之短蛋白質序列的DNA可包括於編碼聚核苷酸之T細胞活化雙特異性抗原結合分子(片段)內部或末端。
在另一實施例中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸。在某些實施例中，提供包含本發明之一或多種載體的宿主細胞。聚核苷酸及載體可合併本文分別關於聚核苷酸及載體所述之任一特徵(單個或組合)。在一個此類實施例中，宿主細胞包含含有編碼本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子(一部分)之聚核苷酸的載體(例如已經該載體轉型或轉染)。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經工程改造而產生本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子或其片段的任何種類之細胞系統。適於複製及支持T細胞活化雙特異性抗原結合分子表現的宿主細胞在此項技術中已熟知。此類細胞適當時可經特定表現載體轉染或轉導且可使大量含有載體的細胞生長用於接種大型醱酵器，以獲得足量的T細胞活化雙特異性抗原結合分子用於臨床應用。適合的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核生物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可利用細菌產生多肽，特別是不需要糖基化時。表現之後，可自可溶性部分之細菌細胞糊狀物中分離出多肽且可對該多肽進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」、從而產生具 有部分或完全人類糖基化型態之多肽的真菌及酵母株。參見Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)；及Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株，其可聯合昆蟲細胞使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述利用轉殖基因植物產生抗體的PLANTIBODIESTM技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells)(TM4細胞，如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(海拉細胞(HELA))；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cells)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。欲回顧適於產生蛋白質的某些哺乳動物宿主細胞株，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268(2003)頁。宿主細胞包括經培養細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細 胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核生物細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
此項技術中已知用此等系統表現外源基因的標準技術。表現包含抗原結合域之重鏈或輕鏈之多肽(諸如抗體)的細胞可經工程改造以便亦表現抗體鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈與輕鏈的抗體。
在一個實施例中，提供一種製造本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的方法，其中該方法包含在適於表現T細胞活化雙特異性抗原結合分子的條件下培養如本文所提供之包含編碼T細胞活化雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸的宿主細胞，以及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收T細胞活化雙特異性抗原結合分子。
T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之組分以遺傳學方式彼此間稠合。T細胞活化雙特異性抗原結合分子可設計成其組分彼此間直接稠合或經由連接子序列間接稠合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法確定且可測試其功效。T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之不同組分之間之連接子序列之實例發現於本文所提供之序列中。亦可包括合併裂解位點的其他序列以在必要時將稠合體中之個別組分分隔，例如肽鏈內切酶識別序列。
在某些實施例中，T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之一或多個抗原結合部分包含至少一個能夠結合抗原性決定子的抗體可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段之一部分且來源於天然或非天然存在之抗體及其片段。產生多株抗體及單株抗體的方法在此項技術中已熟知(參見例如Harlow及Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在之抗體可 使用固相肽合成法構建，可以重組方式產生(例如如美國專利第4,186,567號中所述)或可藉由例如篩選包含可變重鏈及可變輕鏈的組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。
任何動物物種之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可用於本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中。適用於本發明的非限制性抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可具有鼠類、靈長類動物或人類來源。若T細胞活化雙特異性抗原結合分子意欲用於人類用途，則可使用呈嵌合形式的抗體，其中抗體恆定區來自人類。呈人類化或完全人類形式的抗體亦可根據此項技術中熟知之方法製備(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法達成，包括(但不限於)(a)將非人類(例如供者抗體)CDR移植至人類(例如受者抗體)構架及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保持良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用的彼等殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用的殘基)移植至人類構架及恆定區上，或(c)移植整個非人類可變域，但藉由表面殘基置換而用人類類似區段「遮掩」其。人類化抗體及其製備方法回顧於例如Almagro及Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述「表面重塑」)； Dall'Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)及Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述FR改組的「指導性選擇」方法)。人類抗體及人類可變區可使用此項技術中已知的各種技術產生。人類抗體一般性描述於van Dijk及van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)。人類可變區可形成藉由稠合瘤方法製得之人類單株抗體的一部分且可來源於藉由稠合瘤方法製得的人類單株抗體(參見例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由將免疫原投與轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物已經改造以產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體作為對抗原性攻毒的反應(參見例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自人類源噬菌體呈現文庫之Fv純系可變區序列來產生(參見例如Hoogenboom等人，於Methods in Molecular Biology 178,1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌體典型地使抗體片段以單鏈Fv(scFv)片段形式或以Fab片段形式呈現。
在某些實施例中，適用於本發明的抗原結合部分根據例如美國專利申請公開案第2004/0132066號中所揭示之方法經工程改造可具有增強的結合親和力，該案之整個內容以引用的方式併入本文中。本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子結合至特定抗原性決定子的能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振技術(在BIACORE T100系統上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。競爭分析可用於鑑別與參考抗體競 爭結合至特定抗原的抗體、抗體片段、抗原結合域或可變域，例如與V9抗體競爭結合至CD3的抗體。在某些實施例中，此競爭抗體結合至與參考抗體所結合相同的抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。抗體所結合之抗原決定基之定位的例示性詳細方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」，於Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。在例示性競爭分析中，所固著之抗原(例如CD3)在溶液中培育，該溶液包含結合至抗原的第一經標記抗體(例如US 6,054,297中所述之V9抗體)及待測試與第一抗體競爭結合至抗原之能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於稠合瘤上清液中。作為對照，所固著之抗原在包含第一經標記抗體、但不包含第二未標記抗體之溶液中培育。在允許第一抗體結合至抗原之條件下培育之後，移除過量的未結合抗體，且量測與所固著抗原相關之標記之量。若測試樣品中與所固著抗原相關之標記之量相對於對照樣品發生實質上降低，則表明第二抗體與第一抗體競爭結合至抗原。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述製備之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術中已知之技術純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排阻層析及類似技術。用於純化特定蛋白質的實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。親和層析純化時，可使用T細胞活化雙特異性抗原結合分子所結合的抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，親和層析純化本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子時，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可依序使用蛋白質A或G親和層析及尺寸排阻層析來基本上分離T細胞活化雙特異性抗原結合分子，如實例中所述。T細胞活化雙特異性抗原結合分子之純度可藉由 多種熟知分析方法中的任一者測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析及類似方法。舉例而言，如實例中所述表現的重鏈稠合蛋白顯示為完整的且經正確組裝，如還原性SDS-PAGE所證明(參見例如圖3)。三條色帶在約Mr 25,000、Mr 50,000及Mr 75,000(對應於T細胞活化雙特異性抗原結合分子輕鏈、重鏈及重鏈/輕鏈稠合蛋白之分子量預測值)解析。
分析
本文所提供之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術中已知的各種分析、根據其物理/化學特性及/或生物學活性加以鑑別、篩選或表徵。
親和力分析
T細胞活化雙特異性抗原結合分子對於Fc受體或靶抗原的親和力可根據實例中所闡述之方法、藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))加以測定，且諸如受體或標靶蛋白質可藉由重組表現來獲得。或者，T細胞活化雙特異性抗原結合分子對於不同受體或標靶抗原的結合可使用表現特定受體或靶抗原的細胞株、藉由例如流式細胞術(FACS)來評價。量測結合親和力的特定說明性及例示性實施例描述於下文及以下實例中。
根據一個實施例，藉由表面電漿子共振、使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)、在25℃量測KD。
為了分析Fc部分與Fc受體之間的相互作用，藉由CM5晶片上所固著的抗Penta His抗體(Qiagen)捕捉經His標記之重組Fc受體且使用雙特異性構築體作為分析物。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧基甲基化聚葡萄糖生物感測晶片(CM5，GE Healthcare)。抗Penta-His抗體用10mM乙酸鈉(pH 5.0)稀釋至40 μg/ml，隨後以5μl/min流速注射以使所偶聯蛋白質達成約6500個反應單位(RU)。注射配位體之後，注射1M乙醇胺以將未反應之基團封端。隨後，Fc受體在4nM或10nM下捕捉60秒。動力學量測時，雙特異性構築體(500nM與4000nM之間的範圍)於HBS-EP(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中之四倍連續稀釋液在25℃、以30μl/min流速注射120秒。
為了測定針對靶抗原的親和力，藉由活化CM5感測晶片表面上所固著之抗人類Fab特異性抗體(GE Healthcare)捕捉雙特異性構築體，如針對抗Penta-His抗體所述。偶聯蛋白質之最終量為約12000RU。雙特異性構築體在300nM捕捉90秒。使靶抗原以250nM至1000nM範圍內之濃度、以30μl/min流速通過流動池180秒。監視解離180秒。
藉由減去參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。藉由朗格繆爾結合等溫線(Langmuir binding isotherm)之非線性曲線擬合，利用穩態反應來推導解離常數KD。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型(BIAcore®評價軟體1.1.1版)、藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)係依比率koff/kon計算。參見例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性分析
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的生物活性可藉由如實例中所述的各種分析來量測。生物學活性可例如包括誘導T細胞增殖、誘導T細胞中之信號傳導、誘導T細胞表現活化標記、誘導T細胞分泌細胞激素、誘導靶細胞(諸如腫瘤細胞)溶解，及誘導腫瘤消退及/或改善存活率。
組合物、調配物及投藥途徑
在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中之任一者的醫藥組合物，例如用於任一以下治療性方法。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中的任一者及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之T細胞活化雙特異性抗原結合分子中的任一者及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。
另外提供一種製造呈適於活體內投與之形式的本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含(a)獲得本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，及(b)用至少一種醫藥學上可接受之載劑調配T細胞活化雙特異性抗原結合分子，藉此調配成用於活體內投與的T細胞活化雙特異性抗原結合分子製劑。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解於或分散於醫藥學上可接受之載劑中的T細胞活化雙特異性抗原結合分子。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般無毒性的分子實體及組合物，亦即當投與動物(適當時諸如人類)時，不產生有害、過敏或其他不良反應。熟習此項技術者根據本發明將獲知含有至少一種T細胞活化雙特異性抗原結合分子及視情況存在之另一種活性成分之醫藥組合物的製備，如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990中舉例說明，該文獻以引用的方式併入本文中。此外，投與動物(例如人類)時，應瞭解，製劑應滿足FDA生物學標準局(FDA Office of Biological Standards)或其他國家之相應機關所要求的無菌性、發熱性、總體安全及純度標準。較佳組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥 物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料及類似材料及其組合，如一般技術者所知(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329頁，該文獻以引用的方式併入本文中)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則涵蓋將其用於治療或醫藥組合物之用途。
組合物可包含不同類型的載劑，此視其是否以固體、液體或氣溶膠形式投與及投藥途徑(諸如注射)是否需要其為無菌而定。本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子(及任何其他治療劑)可如下投與：靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、脾內、腎內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、瘤內、肌內、腹膜內、皮下、結膜下、囊泡內、黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、表面、局部、吸入(例如氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續輸注、局部灌注沐浴靶細胞(直接、經由導管、經由灌洗法)、於乳膏中、於脂質組合物(例如脂質體)中、或藉由一般技術者已知的其他方法或前述者之任何組合(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，該文獻以引用的方式併入本文中)。非經腸投藥，特定言之，靜脈內注射，最常用於投與多肽分子，諸如本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子。
非經腸組合物包括為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥所設計的彼等物。注射時，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可於水溶液中調配，較佳於生理上相容的緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，T細胞活化雙特異 性抗原結合分子可呈粉末形式以便在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質水)復原。無菌可注射溶液係藉由必要時將含有所需量之本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子的適當溶劑與下文所列之各種其他成分合併來製備。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其利用預先無菌過濾之液體介質產生活性成分與任何其他所需成分之粉末。必要時，液體介質宜經緩衝，且在用足量鹽水或葡萄糖注射之前，首先使液體稀釋劑呈等張性。組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且針對微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用加以保存。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5ng/mg蛋白質。醫藥學上可接受之適合載劑包括(但不限於)緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解 度之藥劑以允許製備高度濃縮之溶液。另外，活性化合物懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質體。
活性成分可截留於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；截留於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中。可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
除先前描述的組合物之外，T細胞活化雙特異性抗原結合分子亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，T細胞活化雙特異性抗原結合分子可用適合聚合物或疏水性材料(例如可接受油中之乳液)或離子交換樹脂調配，或調配為微溶性衍生物，例如調配為微溶性鹽。
包含本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、截留或凍乾方法製造。醫藥組合物可使用一或多種有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑、以習知方式調配。適當調配物視所選投藥途徑而定。
T細胞活化雙特異性抗原結合分子可調配成呈游離酸或鹼、中性或鹽形式的組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保持游離酸或鹼之 生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之自由胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與自由羧基形成的鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於對應游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更溶於水性及其他質子溶劑中。
治療方法及組合物
本文所提供之任一種T細胞活化雙特異性抗原結合分子可用於治療方法中。本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可用作免疫治療劑，例如治療癌症。
用於治療方法時，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子係以符合良好醫學實務之方式調配、給予及投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑遞送部位、投藥方法、投藥時程及從醫者已知之其他因素。
在一個態樣中，提供用作藥物的本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在其他態樣中，提供用於治療疾病的本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，提供用於治療方法中的本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供用於治療有需要之個體之疾病的如本文所述之T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有疾病之個體之方法中的T細胞活化雙特異性抗原結合分子，該方法包含向該個體投與治療有效量之T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑(若所治療之疾病為癌症)。在其他實施 例中，本發明提供如本文所述之用於誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，本發明提供用於誘導個體中之靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解之方法中的T細胞活化雙特異性抗原結合分子，該方法包含向該個體投與有效量之T細胞活化雙特異性抗原結合分子以誘導靶細胞溶解。根據任一上述實施例之「個體」為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子用於製造或製備藥物的用途。在一個實施例中，藥物用於治療有需要之個體的疾病。在另一實施例中，藥物係用於治療疾病之方法中，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥物。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在一個實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑(若所治療之疾病為癌症)。在另一實施例中，藥物係用於誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解。在再另一個實施例中，藥物係用於誘導個體之靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法中，該方法包含向個體投與有效量之誘導靶細胞溶解的藥物。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種治療疾病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類疾病之個體投與治療有效量之本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，向該個體投與包含本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子、呈醫藥學上可接受之形式的組合物。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑(若所治療之疾病為癌症)。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較 佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法。在一個實施例中，該方法包含使靶細胞與本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子在T細胞(特定言之，細胞毒性T細胞)存在下接觸。在另一態樣中，提供一種誘導個體之靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法。在一個此類實施例中，該方法包含向個體投與有效量之T細胞活化雙特異性抗原結合分子以誘導靶細胞溶解。在一個實施例中，「個體」為人類。
在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症，特定言之，癌症。癌症之非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎臟癌。可使用本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子治療的其他細胞增殖病症包括(但不限於)位於以下中之贅瘤：腹部、骨、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺體(腎上腺、副甲狀腺、腦垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸區域及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病變及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習此項技術者容易認識到，在許多情況下，T細胞活化雙特異性抗原結合分子可能不提供治癒，而是僅可提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學變化亦視為治療上有益的。因此，在一些實施例中，提供生理學變化之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的量視為「有效量」或「治療有效量」。個體、患者或需要治療之個體典型地為哺乳動物，更特定言之，人類。
在一些實施例中，將有效量之本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子投與細胞。在其他實施例中，將治療有效量之本發明T細胞活化雙特異性抗原結合分子投與個體以便治療疾病。
預防或治療疾病時，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子(單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)的適當劑量將視以下而定：所治療之疾病類型、投藥途徑、患者體重、T細胞活化雙特異性抗原結合分子類型、疾病之嚴重程度及病程、投與T細胞活化雙特異性抗原結合分子是否用於預防或治療目的、先前或並行治療介入、患者臨床病史及對T細胞活化雙特異性抗原結合分子的反應，以及主治醫師判斷。負責投藥的從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及適用於單獨個體的劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。
T細胞活化雙特異性抗原結合分子宜一次性或在一系列治療期間投與患者。視疾病類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可為投與患者的初始候選劑量(不論例如藉由一或多次各別投藥，或藉由連續輸注)。一種典型的日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上之範圍內，此視上文所提及之因素而定。經歷數日或更長時間重複投藥時，視病狀而定，治療一般持續至疾病症狀發生所需抑制為止。T細胞活化雙特異性抗原結合分子之一種例示性劑量在約0.005mg/kg至約10mg/kg範圍內。在其他非限制性實例中，每次投藥時的劑量亦可包含每公斤體重約1微克、每公斤體重約5微克、每公斤體重約10微克、每公斤體重約50微克、每公斤體重約100微克、每公斤體重約200微克、每公斤體重約350微克、每公斤體重約500微克、每公斤體重約1毫克、每公斤體重約5毫克、每公斤體重約10毫克、每公斤體重約50 毫克、每公斤體重約100毫克、每公斤體重約200毫克、每公斤體重約350毫克、每公斤體重約500毫克至每公斤體重約1000毫克或1000毫克以上，及可推導出的其中任何範圍。在本文所列數字之可推導範圍之非限制性實例中，基於上述數字，可投與的範圍為每公斤體重約5mg至約每公斤體重約100mg、每公斤體重約5微克至約每公斤體重約500毫克等。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週投與(例如使得患者接受約2至約20次，或例如約6次劑量之T細胞活化雙特異性抗原結合分子)。初始可投與較高起始劑量，隨後可投與一或多次較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程容易藉由習知技術及分析來監視。
本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子一般以有效達成預定目的的量使用。用於治療或預防疾病病狀時，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子或其醫藥組合物係以治療有效量投與或施用。治療有效量之確定完全屬於熟習此項技術者之能力範圍內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。
全身性投藥時，可首先利用活體外分析(諸如細胞培養分析)估算治療有效劑量。接著可利用動物模型配製劑量以達成循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中測定的IC50。此類資訊可用於更準確地判定適用於人類之劑量。
初始劑量亦可利用活體內資料(例如動物模型)、使用此項技術中熟知的技術估算。一般熟習此項技術者根據動物資料容易最佳化人類投藥。
劑量及時間間隔可個別地調整以提供足以維持治療作用的T細胞活化雙特異性抗原結合分子之血漿含量。常見的患者注射投藥劑量範圍為每天約0.1mg/kg至50mg/kg，典型地為每天約0.5mg/kg至1 mg/kg。治療有效的血漿含量可藉由每日投與多次劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC量測。
在局部投藥或選擇性吸收之情況下，T細胞活化雙特異性抗原結合分子之有效局部濃度可與血漿濃度無關。熟習此項技術者能夠最佳化治療有效局部劑量而無需不當實驗。
治療有效劑量之本文所述T細胞活化雙特異性抗原結合分子通常提供治療益處而不會導致實質性毒性。T細胞活化雙特異性抗原結合分子之毒性及治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物之標準醫藥程序測定。可利用細胞培養分析及動物研究來確定LD50(50%群體致死劑量)及ED50(50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數，其可以比率LD50/ED50表示。較佳為展現大治療指數的T細胞活化雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子展現高治療指數。自細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類的劑量範圍。劑量較佳在循環濃度範圍內，包括毒性極小或無毒性的ED50。視多種因素(例如所用劑型、所用投藥途徑、個體病狀及類似因素)而定，劑量可在此範圍內變化。準確的配方、投藥途徑及劑量可由個別醫師根據患者病狀來選擇(參見例如Fingl等人，1975，於：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁，該文獻以全文引用的方式併入本文中)。
經本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子治療之患者的主治醫師瞭解由於毒性、器官功能障礙及類似因素而如何及何時終止、中斷或調整投藥。反之，主治醫師亦已知若臨床反應不夠(排除毒性)則調整療法至更高水準。管理所關注病症時所投與劑量之量值將因所治療之病狀之嚴重強度及投藥途徑及類似因素而不同。病狀之嚴重程度可例如部分地依據標準預後評價方法來評價。另外，劑量及可能的給 藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變。
其他藥劑及療法
治療時，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可與一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子可與至少一種其他治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此類治療之個體之症狀或疾病而投與的任何藥劑。此類其他治療劑可包含適於治療特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些實施例中，其他治療劑為免疫調節劑、細胞抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑，或增強細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性的藥劑。在一個特定實施例中，其他治療劑為抗癌劑，例如微管中斷劑、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑，或抗血管生成劑。
此類其他藥劑宜以有效達成預定目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視T細胞活化雙特異性抗原結合分子之用量、病症類型或療法及上文所論述的其他因素而定。T細胞活化雙特異性抗原結合分子通常以相同劑量且使用如本文所述的投藥途徑使用，或以本文所述劑量之約1至99%，或以憑經驗/臨床上確定為適當的任何劑量及任何途徑使用。
上文指出的此類組合療法包含組合投藥(其中相同或各別組合物中包括兩種或兩種以上治療劑)及各別投藥，在此情況下，本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子之投與可發生於其他治療劑及/或佐劑之投與之前、同時及/或之後。本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子亦可與輻射療法組合使用。
製品
在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷 上述病症之物質的製品。製品包含容器及附於或系連於容器之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中組合物包含本發明之T細胞活化雙特異性抗原結合分子；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般說明，可實施各種其他實施例。
通用方法 重組DNA技術
使用標準方法操縱DNA，如Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根據製造商說明書，使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資訊明示於Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公告第91-3242號。
DNA測序
藉由雙股測序法測定DNA序列。
基因合成
必要時，所要基因區段係藉由PCR、使用適當模板產生，或藉由Geneart AG(Regensburg,Germany)、藉由自動化基因合成法、自合成寡核苷酸及PCR產物合成。在確切基因序列無法獲得的情況下，根據來自最近同源物的序列來設計寡核苷酸引子且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖入標準選殖/測序載體中。自經轉型之細菌純化質體DNA且藉由UV光譜學來測定濃度。經次選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA測序來證實。基因區段經設計具有允許次選殖入相應表現載體中的適合限制位點。所有構築體經設計具有5'端DNA序列，該序列編碼靶向真核生物細胞中分泌之蛋白質的前導肽。
實例1 製備具有及不具有電荷修飾之T細胞雙特異性(TCB)抗體(抗CD20/抗CD3)
此實例中製備以下分子，其示意性說明顯示於圖2中：
A. 不具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之CH1/CL交換)(圖2A，SEQ ID NO 14-17)
B. 具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾)(圖2B，SEQ ID NO 18-21)
C. 具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾)(圖2C，SEQ ID NO 32、19-21)
D. 不具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換)(圖2D，SEQ ID NO 33、15、17、21)
E. 不具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH-CH1/VL-CL)(圖2E，SEQ ID NO 34、15、17、35)
F. 具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD20結合子中之VH/VL交換，CD3結合子中之電荷修飾)(圖2F，SEQ ID NO 36-39)
G. 具有電荷修飾且Fc區中具有DDKK突變的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾)(圖2G，SEQ ID NO 40、41、20、21)
H. 具有電荷修飾的「1+1互換單抗」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾)(圖2H，SEQ ID NO 42、43、20、21)
I. 具有電荷修飾的「1+1互換單抗」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾，不同CD20結合子)(圖2I，SEQ ID NO 43-45、21)
J. 具有電荷修飾213E、123R的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換，CD20結合子中之電荷修飾)(圖2J，SEQ ID NO 69-71、21)
K. 具有電荷修飾的「2+1 IgG互換Fab，倒置式」(CD3結合子中之VH/VL交換及電荷修飾)(圖2K，SEQ ID NO 15、17、72、73)。
將重鏈及輕鏈DNA序列之可變區次選殖入框中，其中恆定重鏈或恆定輕鏈預插入相應受者哺乳動物表現載體中。蛋白質表現藉由MPSV啟動子驅動且合成聚腺苷酸信號序列存在於CDS之3'端。另外，各載體含有EBV OriP序列。
藉由使用聚伸乙基亞胺(PEI)、用哺乳動物表現載體共轉染生長於懸浮液中的HEK293-EBNA細胞來產生分子。細胞用1：2：1：1比率(A：「載體重鏈(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VL-CL)」：「載體重鏈(VH-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VL-CH1)」；B、D、G、J、K：「載體重鏈(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VL- CL)」：「載體重鏈(VH-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VH-CL)」；C：「載體重鏈(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VL-CL)」：「載體重鏈(VH-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VH-CL)」；E：「載體重鏈(VH-CH1-VL-CL-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VL-CL)」：「載體重鏈(VH-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VH-CH1)」；F：「載體重鏈(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VH-CL)」：「載體重鏈(VL-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VH-CH1)」)或1：1：1：1比率(H、I：「載體重鏈(VL-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VL-CL)」：「載體重鏈(VH-CH1-CH2-CH3)」：「載體輕鏈(VH-CL)」)之對應表現載體轉染。
轉染時，HEK293 EBNA細胞於含有6mM L-麩醯胺酸及250mg/l G418的無血清Excell培養基中懸浮培養。在600ml旋轉管燒瓶(最大工作體積400ml)中產生時，轉染之前24小時接種600百萬個HEK293 EBNA細胞。轉染時，細胞以210×g離心5分鐘，且用20ml預溫熱CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至400μg DNA之最終量。添加1080μl PEI溶液(2.7μg/ml)之後，將混合物渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至600ml旋轉管燒瓶中且在具有5% CO2氛圍的保溫箱中、在37℃培育3小時。培育之後，添加360ml Excell+6mM L-麩醯胺酸+5g/L Pepsoy+1.0mM VPA培養基且培養細胞24小時。轉染後第1天添加7%饋料1(Lonza)。7天之後，藉由以3600×g離心20-30分鐘(Sigma 8K離心機)來收集培養上清液用於純化，溶液無菌過濾(0.22mm過濾器)且添加最終濃度為0.01% w/v的疊氮化鈉。溶液保持在4℃。
構築體於培養基中之濃度藉由蛋白質A-HPLC測定。分離依據為含Fc分子在pH 8.0下對蛋白質A之結合及始於pH 2.5之步驟溶離。存在兩個流動相。此等流動相為相同的Tris(10mM)-甘胺酸(50mM)-NaCl(100mM)緩衝液，但其調節至不同pH(8及2.5)。管柱主體為具 有約63μl內部體積、裝填有POROS 20A的Upchurch 2x20mm預裝填管柱。100μl各樣品以0.5ml/min流速注射至平衡材料上。0.67分鐘之後，使用pH步驟溶離樣品直至pH 2.5。藉由測定280nm吸光度及使用人類IgG1濃度範圍為16mg/l至166mg/l之標準曲線計算來進行定量。
藉由親和層析、使用蛋白質A親和層析自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質，隨後進行尺寸排阻層析步驟。
親和層析時，將上清液裝載於經25ml 20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 7.5)平衡的HiTrap蛋白質A HP管柱(CV=5mL，GE Healthcare)上。未結合之蛋白質如下移除：用至少10個管柱體積的20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.5)洗滌，隨後為使用6個管柱體積之10mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 5.45)的另一洗滌步驟。隨後用20ml 10mM MES、100mM氯化鈉(pH 5.0)洗滌管柱，且用6個管柱體積的20mM檸檬酸鈉、100mM氯化鈉、100mM甘胺酸(pH 3.0)溶離靶蛋白。藉由添加1/10之0.5M磷酸鈉(pH 8.0)來中和蛋白質溶液。濃縮靶蛋白且過濾，隨後裝載於經20mM組胺酸、140mM氯化鈉、0.01% Tween-20(pH 6.0)平衡的HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。分子A須藉由另一個製備型尺寸排阻層析(SEC)步驟純化以達成100%之最終單體含量。因此，將第一尺寸排阻步驟所得之具有高單體含量的溶離份合併，濃縮且再次裝載於HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。其他分子無需此額外純化步驟(此視副產物概況而定，然而初次尺寸排阻層析之後進行的溶離份合併及因此回收對於此等分子而言為不同的)。
初次純化步驟(蛋白質A親和層析)之後，在缺乏還原劑及考馬斯(Coomassie)(SimpleBlueTM SafeStain,Invitrogen)染色的情況下藉由SDS-PAGE分析分子的純度及分子量。根據製造商說明書使用NuPAGE®預澆注凝膠系統(Invitrogen,USA)(4-12% Tris-乙酸鹽凝膠或 4-12% Bis-Tris)。
所純化蛋白質樣品之蛋白質濃度係藉由量測280nm光學密度(OD)、使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。
藉由CE-SDS分析，在還原劑存在及不存在下分析分子在最終純化步驟之後的純度及分子量。根據製造商說明書使用測徑規LabChip GXII系統(Caliper lifescience)。使用2μg樣品用於分析。
在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3、pH 6.7操作緩衝液中，在25℃，使用TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析抗體樣品中之聚集物含量。
所有分子依循相同方法產生且純化(但其中分子A已進行額外SEC步驟，如上文所指明)。
初次製備型尺寸排阻層析之後，分子A顯示高聚集物含量。此純化步驟之後的聚集物含量可不測定，原因在於高分子量雜質與單體溶離份不存在基線分離。為了獲得100%單體物質，需要額外的製備型尺寸排阻層析步驟。一次製備型尺寸排阻層析之後，分子B為100%單體。
分子A在上清液中之濃度較高，但最終產量比分子B低2.3倍(由於高聚集物含量)(表2)。
藉由CE-SDS分析所示之分子B之最終純度高於分子A(表3，圖3A及B)。圖3M及3N顯示SEC純化步驟之層析圖(製備型SEC)，其中相較於分子B，分子A具有寬峰，表明裝載於SEC上之分子A製劑不為均質的，而分子B製劑基本上為單體。
分子C可以高效價產生，但最終回收率低於分子B，原因在於高含量的副產物可能無法被所應用的層析方法澈底移除(表2；表3；圖3B及J，及圖3C及K)。如圖3B及3K中所示，蛋白質A純化步驟之後的SDS-PAGE分析顯示分子B無副產物，而分子C製劑含有一些副產物， 其以100kDa之表觀分子量出現。
分子D不同於分子B之處在於抗CD20 Fab中缺乏帶電殘基。此分子亦可以高效價短暫產生，但已如針對分子C所述，由於副產物含量高，因此分子B在分析型SEC上所示之最終品質(分子D為98%單體，相對於分子B之100%單體)及回收率更低(表2；表3；圖3B及J及圖3D及L)。如圖3J及3L中所示，蛋白質A純化步驟之後的SDS-PAGE分析顯示分子B無副產物，而分子D製劑含有一些副產物，其以66kDa及40kDa之表觀分子量出現。圖3N及3O顯示SEC純化步驟之層析圖(製備型SEC)，其中相較於分子B，分子D具有寬峰，表明裝載於SEC上之分子D製劑不為均質的，而分子B製劑基本上為單體。
此外，分子E產生之效價高，但最終產物仍含有低分子量雜質，如分析型SEC及毛細管電泳所示(表2；表3；圖3E)。
與分子B相比，分子F在腫瘤標靶結合部分之Fab上具有VH-VL交換，而抗CD3 Fab中已引入電荷修飾。此分子亦可以高效價產生，但最終回收率由於副產物而較低。對於抗CD20/抗CD3 TCB而言，抗CD20 Fab中具有電荷修飾的形式在製造及純化方面較佳。
分子G為Fc區中具有電荷修飾的分子(「DD」=存在於Fc域亞單元之一中的K392D；K409D，「KK」=存在於Fc域亞單元之另一者中的D356K；D399K(EU編號)，置換「臼包杵」突變。藉由將兩個天冬胺酸殘基引入一個重鏈及將兩個離胺酸殘基引入第二重鏈(圖2G)來促進雙特異性分子產生。此分子可以高效價產生，但最終產物仍具有一些高分子量及低分子量雜質，如分析型SEC及毛細管電泳所示(表2；表3)，而對於攜有「臼包杵」突變的相同分子(分子B)而言，副產物可完全移除。
CD20結合子不同於分子H的分子I顯示最終製備型尺寸排阻層析之後的聚集物含量高於分子H。CE-SDS分析所示之分子H最終純度高 於分子I(表3；圖3H及I)。此外，分子H之回收率比分子I高40%(表2)。此結果顯示分子品質亦依賴於以T細胞雙特異性形式使用的抗體。
分子J及分子K之產生具有良好的初始效價，從而得到良好產量。然而，兩種分子之約20%最終回收率遠低於分子B所達成之48%(表2)。兩種分子之最終品質相似，均>99%單體含量(表2)。在非還原性CE-SDS中，分子J(CL域之位置124及CH1域之位置147缺乏電荷修飾)之純度(接近99%)優於分子K(CD3結合子中具有電荷修飾及VL-VH交換)之純度(90%)(表3，圖3N及3O)。分子J在親和層析之後的濃縮步驟期間顯示一些沈澱。分子K在CD3結合互換Fab中而非在CD20結合Fab中具有電荷修飾。此影響最終品質，如CE-SDS所示(表3，圖3O)。在SDS-Page上進行初次純化步驟之後，品質差異多半為可見的(圖3P、3Q)。分子K含有的150kDa及70kDa副產物(一半分子及構築體可能缺失輕鏈)多於分子J。兩種分子具有相同的熱穩定性，此類似於分子B(表4)。
對於抗CD20/抗CD3 TCB而言，抗CD20 Fab具有電荷修飾的「倒置式」型式(分子B)為可以最高回收率及最終品質產生的形式。
藉由LC-MS分析證實分子量 去糖基化
為了證實分子製劑為均質的，藉由LC-MS分析對最終蛋白質溶液進行分析。為了移除碳水化合物所引入的非均質性，用PNGaseF處理構築體。為此目的，藉由將2μl 2M Tris添加至濃度為0.5mg/ml之20μg蛋白質中來調節蛋白質溶液之pH。添加0.8μg PNGaseF且在37℃培育12小時。
LC-MS分析-線上偵測
在Agilent HPLC 1200耦聯TOF 6441質譜儀(Agilent)上進行LC-MS方法。在Macherey Nagel Polysterene管柱RP1000-8(8μm粒度，4.6×250mm；目錄號719510)上進行層析分離。溶離劑A為含有5%乙腈及0.05%(v/v)甲酸的水，溶離劑B為95%乙腈、5%水及0.05%甲酸。流速為1ml/min，在40℃對前述處理所得之6μg(15μl)蛋白質樣品執行分離。
在最初四分鐘期間，將溶離液引入廢棄物中以防止質譜儀被鹽污染。利用12l/min之乾燥氣流、350℃之溫度及60psi之噴霧器壓力來運作ESI源。使用380V之碎裂器電壓及700m/z至3200m/z質量範圍、以陽離子模式獲取MS譜。藉由儀器軟體獲取MS資料4至17分鐘。
分子A之製劑具有約10-15%之具有錯配輕鏈之分子及痕量的自由或所連輕鏈。分子B之製劑具有痕量的包含兩個CD3輕鏈之分子。諸如自由輕鏈或所連輕鏈之雜質可能偵測不到(表2)。
藉由靜態光散射所得的熱穩定性
藉由靜態光散射(SLS)及藉由量測回應於所施加溫度應力的內源蛋白質螢光來監視熱穩定性。
將蛋白質濃度為1mg/ml之30μg經過濾蛋白質樣品一式兩份施加至Optim 2(Avacta Analytical Ltd；GB)。溫度以0.1℃/min自25℃勻速升至85℃，收集半徑及總散射強度。測定內源蛋白質螢光時，樣品在295nm激發且收集266nm與473nm之間的發射。
測定所有分子的熱穩定性，結果顯示於表4中。施加溫度梯度之後，藉由動態光散射所測定的聚集溫度(TAgg)及藉由蛋白質螢光所量測的熔融溫度(TM)對於所有分子而言均為類似的，其中TAgg範圍為54-58℃且TM範圍為56-60℃(表4)。
結合至抗CD3/抗CD20 TCB抗體之CD3及CD20
使用表現人類CD3之傑卡特細胞，量測具有或不具有電荷修飾之抗CD3/抗CD20 T細胞雙特異性(TCB)抗體(上述分子「A」及「B」)相對於CD3的結合。使用表現人類CD20之Z-138細胞測定相對於CD20的結合。收集懸浮細胞，用PBS洗滌一次，且使用Vicell測定存活率及細胞密度。使懸浮細胞以2×106個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液中。將100μl細胞懸浮液接種於圓底96孔盤中。在4℃執行各步驟。培養 盤以360×g離心5分鐘且移除上清液。製備抗體於PBS/0.1% BSA中之稀釋液。向孔中添加30μl經稀釋之抗CD3/抗CD20 TCB抗體或FACS緩衝液且在4℃培育細胞30分鐘。培育之後，每孔添加120μl FACS緩衝液，培養盤以350×g離心5分鐘，且移除上清液。重複洗滌步驟一次。每孔添加30μl預稀釋的二級抗體，如盤佈局中所示。培養盤在4℃進一步培育30分鐘。培育之後，每孔添加120μl FACS緩衝液，培養盤以350×g離心5分鐘，且移除上清液。所有盤均重複洗滌步驟一次，但具有傑卡特細胞的盤除外，該盤在此一個洗滌步驟之後直接固定。細胞在4℃每孔使用100μl BD固定緩衝液(#BD Biosciences,554655)固定20-30分鐘。將細胞再懸浮於每孔80μl FACS緩衝液中以便使用BD FACS CantoII進行FACS量測。
此實驗結果顯示於圖4中。
抗CD3/抗CD20 TCB抗體誘導T細胞介導式殺死表現CD20之腫瘤靶細胞後發生的腫瘤細胞溶解及CD4 + 及CD8+ T細胞活化
針對z-138及Nalm-6腫瘤細胞評估具有或不具有電荷修飾之抗CD3/抗CD20 TCB抗體(上述分子「A」及「B」)誘導T細胞介導式殺死靶細胞及T細胞活化。人類PBMC用作效應子且與雙特異性抗體一起培育之後22小時，偵測殺死率以及T細胞活化。簡言之，收集靶細胞，洗滌且使用圓底96孔盤、以30 000個細胞/孔之密度塗鋪。藉由對健康人類供者的新鮮血液進行Histopaque密度離心來製備周邊血液單核細胞(PBMC)。新鮮血液用無菌PBS稀釋且依Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。離心(450×g，30分鐘，室溫)之後，丟棄含PBMC相界面上方的血漿且將PBMC轉移入新法爾康管(falcon tube)中，隨後填充50ml PBS。離心混合物(400×g，10分鐘，室溫)，丟棄上清液且PBMC離心塊用無菌PBS洗滌兩次(離心步驟350×g，10分鐘)。所得PBMC群自動計數(ViCell)且於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯 胺酸(Biochrom,K0302)之RPMI1640培養基中、在細胞保溫箱(37℃，5% CO2)中保持直至進一步使用(不長於24小時)。在殺死分析中，依指定濃度(1000pM-0.1pM範圍，一式三份)添加抗體。以6：1之最終E：T比率添加PBMC至靶細胞中。培育之後，培養盤以420×g離心4分鐘且向新製平底96孔盤中每孔轉移50μl用於LDH偵測。使用細胞毒性偵測套組(Roche #11644793001)，根據製造商說明書執行LDH偵測。剩餘細胞用含有0.1% BSA的PBS洗滌。根據供應商指示，執行CD8(APCCy7抗人類CD8，Biolegend #301016)、CD4(FITC抗人類CD4，Biolegend #300506)、CD69(BV421抗人類CD69 Biolegend #310930)及CD25(PECy7抗人類CD25 Biolegend #302612)之表面染色。在4℃歷時30分鐘之後，細胞用每孔150μl含有0.1% BSA的PBS洗滌兩次且使用每孔100μl 2% PFA固定。使用BD FACS CantoII執行量測。
此實驗結果顯示於圖5、6及7中。兩種分子在腫瘤細胞溶解及T細胞活化方面均呈現類似的活性。
抗CD3/抗CD20 TCB抗體在人類全血中誘導T細胞介導式殺死健康人類B細胞後發生的B細胞耗乏及CD4 + 以及CD8+ T細胞活化
來自健康供者之人類全血與指定濃度(50000pM至1pM範圍，一式三份)之具有或不具有電荷修飾之抗CD3/抗CD20 TCB抗體(上述分子「A」及「B」)一起培育。22小時之後，混合血液且收集35μl用於20μl FACS抗體混合物染色，該混合物含有CD8(APCCy7抗人類CD8，Biolegend #301016)、CD4(FITC抗人類CD4，Biolegend #300506)、CD69(BV421抗人類CD69，Biolegend #310930)及CD25(PECy7抗人類CD25，Biolegend #302612)、CD22(APC抗人類CD22，Biolegend #302510)及CD45(PerCPCy5.5抗人類CD45，Biolegend #304028)。在室溫下培育15分鐘之後，血液用FACS溶胞溶液(BD， #349202)固定且藉由流式細胞術分析。在未處理樣品設定為0% B細胞耗乏的情況下，根據B細胞數與CD4+ T細胞數之比率來計算B細胞耗乏。
此實驗結果顯示於圖8及圖9中。兩種分子在全血B細胞耗乏及T細胞活化方面顯示類似的活性。
抗CD3/抗CD20 TCB抗體相對於表現人類CD20及CD3之靶細胞
測試上文顯示為分子「B」之抗CD3/抗CD20 TCB抗體對表現人類CD20之彌漫性大細胞B細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞株(WSU DLCL2，0.5-1×106 CD20結合位點)及表現CD3之不朽化T淋巴細胞株(傑卡特)的結合。簡言之，收集細胞，計數，檢查存活率且以1.5×106個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(PBS 0.1% BSA)中。100μl細胞懸浮液(含有0.15×106個細胞)與遞增濃度之CD20 TCB(50pM-200nM)一起在圓底96孔盤中在4℃培育30分鐘，用冷PBS 0.1% BSA洗滌兩次，與經稀釋之PE結合AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)一起在4℃再培育另外30分鐘，用冷PBS 0.1% BSA洗滌兩次，藉由添加2% PFA來固定且藉由FACS、使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)分析(藉由FSC/SSC閘選來排除分析中的死細胞)。
結果顯示於圖10A(結合至WSU DLCL2細胞)及圖10B(結合至傑卡特細胞)中。使用GraphPadPrism5計算結合曲線及與結合有關的EC50值。EC50值為0.98nM(二價結合至表現CD20之WSU DLCL2細胞)及約12.5nM(單價結合至表現CD3之傑卡特細胞)。
抗CD3/抗CD20 TCB抗體相對於人類及食蟹獼猴CD20及CD3表現靶細胞的結合
藉由評估相對於人類及食蟹獼猴CD20表現B細胞及CD3表現CD4及CD8 T細胞的結合來評價上文顯示為分子「B」之抗CD3/抗CD20 TCB抗體的交叉反應性。簡言之，使用來自人類及食蟹獼猴健康供者的肝素化血液，藉由密度離心來分離出PBMC。對所分離之PBMC進行計數，檢查存活率且以4×106個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(100μl PBS 0.1% BSA)中。將100μl細胞懸浮液(含有0.4×106個細胞)塗鋪於U形底96孔盤上且離心(420×g，4分鐘)。移除上清液之後，PBMC與遞增濃度之CD20 TCB-AlexaFlour488(200pM-200nM)一起在4℃培育30分鐘，用冷PBS 0.1% BSA洗滌兩次，與人類/食蟹獼猴交叉反應抗體：抗CD19(內部，純系8B8)-AlexaFluor647、抗CD4(BD，#552838，純系L200)-PerCPCy5.5及抗CD8(BD，#555367，純系RPA-T8)-PE一起在4℃再培育另外30分鐘。30分鐘之後，PBMC用冷PBS 0.1% BSA洗滌兩次且用FACS溶胞溶液(BD，#349202)處理，隨後使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)進行FACS分析。使用GraphPadPrism5獲得結合曲線。
結果顯示於圖11A(結合至人類及食蟹獼猴B細胞)、圖11B(結合至人類及食蟹獼猴CD4 T細胞)及圖11C(結合至人類及食蟹獼猴CD8 T細胞)中。使用GraphPadPrism5所計算的與表現CD20之B細胞之結合有關的EC50值為4.8nM(人類B細胞)及3.3nM(食蟹獼猴B細胞)。
不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式介導的腫瘤細胞溶解
針對Z138細胞(套細胞淋巴瘤，0.06-0.23×106個CD20結合位點)評估不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式(上文顯示的分子「B」、「A」、「C」及「H」)介導的腫瘤細胞溶解。人類PBMC用作效應子且在培育21-24小時時在不同雙特異性抗體形式下偵測腫瘤溶解。簡言之，收集靶細胞，洗滌且使用U形底96孔盤、以50 000個細胞/孔之密度塗鋪。藉由對健康人類血液進行Histopaque密度離心來製備周邊血液單核細胞(PBMC)。新鮮血液用無菌PBS稀釋且依 Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。離心(450×g，30分鐘，室溫，w/o制動)之後，丟棄含PBMC相界面上方的血漿且將PBMC轉移入新法爾康管中，隨後填充50ml PBS。將混合物離心(350×g，10分鐘，室溫)，丟棄上清液且PBMC離心塊用無菌PBS(300×g，10分鐘)洗滌。所得PBMC群自動計數(ViCell)且於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom,K0302)之RPMI1640培養基中、在細胞保溫箱中、在37℃、5% CO2下儲存直至進一步使用(不長於24小時)。在腫瘤溶解分析中，依指定濃度(0.1pM-1nM範圍，一式三份)添加抗體。以6：1之最終E：T比率添加PBMC至靶細胞中。在37℃、5% CO2培育21小時至24小時之後，藉由對自細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中的LDH進行定量(LDH偵測套組，Roche Applied Science，#11 644 793 001)來評估腫瘤細胞溶解。藉由將靶細胞與1% Triton X-100一起培育來使靶細胞達成最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在雙特異性構築體不存在的情況下，靶細胞與效應細胞共培育。
圖12顯示不同的CD20 TCB抗體形式誘導CD20+靶細胞發生較強的標靶特異性溶胞。A圖顯示，「CD20 TCB_2+1_具有電荷，倒置式」(上文顯示的分子「B」)呈現與「CD20 TCB_2+1_無電荷，倒置式」(上文顯示的分子「A」)類似的活性且兩者均比「CD20 TCB_1+1_具有電荷」形式(上文顯示的分子「H」)更強。B圖顯示「CD20 TCB_2+1_具有電荷，倒置式」(上文顯示的分子「B」)比「CD20 TCB_2+1_具有電荷，經典」形式(上文顯示的分子「C」)更強。與使用GraphPadPrism5所計算之殺死分析有關的EC50值明示於表5中。
不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式介導的腫瘤細胞溶解及隨後T細胞活化
使用來源於三個不同健康供者的人類PBMC，針對Z138細胞(套細胞淋巴瘤)以及一組更廣泛的DLBCL細胞株進一步評估不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式(上文顯示的分子「B」及「H」)介導的腫瘤細胞溶解，該等DLBCL細胞株包括OCI Ly-18(0.06-0.2×106個CD20結合位點)、拉莫斯(Ramos)(().1-0.4×106個CD20結合位點)、SU-DHL-5(0.13-0.21×106個CD20結合位點)、SU-DHL-8(低於分析偵測極限的CD20結合位點)、托萊多(Toledo)(0.02×106個CD20結合位點)及U2932(0.09-0.4×106個CD20結合位點)細胞株。腫瘤細胞收集、PBMC分離及分析條件與先前實例中所述相同。圖13 A-C所示分析中的E：T比率為6：1，圖13D所示分析中的E：T比率為3：1。在37℃、5% CO2培育21小時之後，藉由對自細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中的LDH進行定量(LDH偵測套組，Roche Applied Science，#11 644 793 001)來評估腫瘤細胞溶解。評估腫瘤細胞溶解時發生的T細胞活化時，將PBMC轉移至圓底96孔盤中，以400×g離心5分鐘且用含有0.1% BSA的PBS洗滌兩次。根據供應商指示來執行CD8(APCCy7抗人類CD8 Biolegend，#301016)、CD4(FITC抗人類CD4，Biolegend #300506)及CD25(PECy7抗人類CD25，Biolegend #302612)之表面染色。細胞用每孔150μl含有0.1% BSA的PBS洗滌兩次且使用2% PFA或FACS溶胞溶液(BD，# 349202)固定。以BD FACS CantoII分析樣品。
圖13顯示「CD20 TCB_2+1_具有電荷，倒置式」抗體形式(上文顯示的分子「B」)比「CD20 TCB_1+1」抗體形式(上文顯示的分子「H」)更強，如使用來自不同供者之PBMC偵測腫瘤細胞溶解(圖A、D)與T細胞活化(圖B、C)所評估。與Z138細胞之腫瘤溶解及T細胞活化有關的EC50值明示於表6a中。與一組DLBCL細胞株之腫瘤溶解分析有關的EC50值明示於表6b中。使用GraphPadPrism5計算EC50值。
不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式介導的人類全血中之B細胞耗乏
使用來自健康自願者之新鮮人類血液，進一步評估不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式(上文顯示的分子「B」及「H」)及歐比托珠單抗(obinutuzumab)所介導的正常B細胞耗乏。簡言之，用含肝素注射器收集新鮮血液。將血液等分試樣(180微升/孔)置於補充有TCB或抗體稀釋液(10微升/孔+10微升/孔PBS)的96深孔盤中，且在增濕的細胞保溫箱中、在37℃、在5% CO2中培育24小時。培育之後，藉由上下吸移來混合血液，隨後將35μL血液等分試樣轉移入U形底96孔盤中且與螢光抗CD45(APC，Biolegend，#304037)、抗CD4(PerCPCy5.5，BD，#552838)、抗CD8(APCCy7，Biolegend，#301016)、抗CD19(PE，Biolegend，#302208)、抗CD25(PECy7，Biolegend，#302612)及抗CD69(BV421，Biolegend，#310930)一起以55μL總體積培育用於流式細胞術。在室溫下培育15分鐘(在黑暗中)之後，添加180微升/孔FACS溶胞溶液(BD Biosciences)以耗乏紅血球且固定細胞，隨後進行流式細胞術。
圖14顯示「CD20 TCB_2+1_具有電荷，倒置式」(上述分子「B」)在耗乏正常B細胞方面比歐比托珠單抗(Gazyva)及具有電荷的「CD20 TCB_1+1」(上述分子「H」)更強。
使用傑卡特-NFAT報導子分析，藉由對CD3下游信號傳導強度進行定 量所評估的T細胞活化
不同抗CD20/抗CD3 TCB抗體形式誘導T細胞交聯及隨後T細胞活化的能力係使用表現CD20之腫瘤靶細胞與傑卡特-NFAT報導子細胞(具有NFAT啟動子之表現CD3之人類急性淋巴白血病報導子細胞株GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega #CS176501)之共培養物評估。抗CD20/抗CD3 TCB同時結合至CD20抗原(腫瘤細胞上所表現)及CD3抗原(傑卡特-NFAT報導子細胞上所表現)時，NFAT啟動子被活化且引起活性螢火蟲螢光素酶表現。發光信號強度(添加螢光素酶受質時所得)與CD3活化及信號傳導之強度成比例。傑卡特-NFAT報導子細胞於懸浮液中生長且在RPMI1640、2g/l葡萄糖、2g/l NaHCO3、10% FCS、25mM HEPES、2mM L-麩醯胺酸、1×NEAA、1×丙酮酸鈉(每毫升0.1-0.5個mio細胞)、200μg/ml潮黴素(hygromycin)中培養。在分析中，收集腫瘤靶細胞(Z138)且使用ViCell測定存活率。向靶細胞中每孔添加50μl經稀釋之抗體或培養基(用於對照)。在平底白色壁96孔盤(#655098，Greiner bio-one)中每孔塗鋪20 000個細胞。隨後收集傑卡特-NFAT報導子細胞且使用ViCell評估存活率。細胞以2 mio個細胞/毫升再懸浮於不具有潮黴素B的細胞培養基中且以每孔0.1×106個細胞(50微升/孔)添加至腫瘤細胞中以獲得5：1之最終E：T及每孔100μl之最終體積。細胞在增濕保溫箱中在37℃培育6小時。在培育時間結束時，向孔中添加100微升/孔之ONE-Glo溶液(1：1 ONE-Glo及分析培養基體積/孔)且在室溫下、在黑暗中培育10分鐘。使用WALLAC Victor3 ELISA讀取器(PerkinElmer2030)(偵測時間為5秒/孔)偵測發光。
圖15顯示與「CD20 TCB_1+1」(上述分子「H」)相比，「CD20 TCB_2+1_具有電荷，倒置式」(上述分子「B」)引起更強的T細胞活化及CD3下游信號傳導。
抗CD20/抗CD3 TCB於健康NOG小鼠中的單次劑量PK
進行單次劑量藥物動力學研究(SDPK)以評價抗CD20/抗CD3 TCB分子「B」(下文中稱為「CD20 TCB」)在功效研究期間的暴露(圖16)。靜脈內快速注射投與0.5mg/kg投與小鼠且在所選時間點獲得血液樣品用於藥物動力學評價。使用通用免疫分析法量測CD20 TCB之總濃度。CD20 TCB之標準曲線之校準範圍為0.78ng/ml至50ng/ml，其中15ng/ml為定量下限(LLOQ)。
觀測到β半衰期為10天(非間隔分析)及清除率為8mL/d/kg(2隔室模型)的雙相下降。相較於正常非靶向IgG，半衰期及清除率正如所預期(表9)。
使用得自Pharsight Ltd之Phoenix v6.2進行PK分析、模型化及模擬。
抗CD20/抗CD3 TCB之活體內B細胞耗乏活性
測試CD20 TCB在完全人類化NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺乏(NOG)小鼠中之周邊B細胞耗乏活性。
攜帶生理學含量之循環人類B細胞及T細胞的14週齡完全人類化NOG小鼠(Hayakawa J等人(2009),Stem Cells 27(1),175-182)用靜脈內(i.v.)投與之0.5mg/kg劑量的媒劑(n=7)或CD20 TCB(n=6)處理，每週 一次。如圖17中之研究設計所示，在首次治療性注射之後的第1天及第3天(D1、D3)以及第二次治療性注射之後的第3天(D10)，對小鼠抽血用於B細胞及T細胞分析，在此時間點終止研究。在後一時間點，亦收集脾用於B細胞及T細胞分析。治療性注射之前的4天(D-4)，篩選小鼠作為循環B細胞及T細胞計數的基線參考。圖18顯示藉由離體流式細胞術、在不同時間點、在經媒劑(左圖)及CD20 TCB(右圖)處理之小鼠之血液中所分析的B細胞及T細胞計數。結果證明循環B細胞在CD20 TCB注射之後第1天已非常有效地耗乏，且其數目在整個研究期期間保持不可偵測。相反，循環T細胞計數僅在治療性注射之後的D1短暫下降，在D3恢復至基線水準，且在整個研究期期間保持穩定。在首次治療性注射之後的D3及D10，亦藉助於離體流式細胞術、使用不同T細胞表面標記及增殖標記Ki67分析經處理之小鼠之血液中的T細胞活化狀態(圖19)。得自經CD20 TCB處理之小鼠的T細胞在治療性注射之後的D3顯示活化表型(上圖)，相較於得自媒劑對照組的T細胞，CD4與CD8 T細胞隔室中的活化標記CD25、4-1BB、PD-1及顆粒酶-B(GZB)均上調。得自經處理小鼠之T細胞亦表現較高含量的增殖標記Ki67。在首次治療性注射之後的D10，除GZB及PD-1之外，大部分T細胞活化標記已恢復至基線含量，GZB及PD-1表現量仍高於媒劑對照組。
圖20顯示在研究終止時(D10)對經媒劑及CD20 TCB處理之小鼠之脾臟所進行之B細胞及T細胞分析的結果。CD20 TCB處理在此二級淋巴器官中亦介導非常有效的B細胞耗乏(圖20A)，而T細胞計數顯示類似於媒劑對照組的水準(圖20B)。T細胞活化狀態(圖20C)類似於血液中所觀測之狀態，其中經處理小鼠之T細胞中的GZB及PD-1表現高於媒劑對照組。
總之，此等結果證明在治療注射之後已一天，CD20 TCB處理可 介導周邊B細胞發生非常有效的耗乏，其中B細胞仍不可偵測直至研究終止(第二次治療性注射之後三天)。經處理小鼠之脾臟中的B細胞亦發生有效耗乏。B細胞耗乏活性伴隨經處理動物之血液中的暫時T細胞活化，在治療性注射之後第三天，T細胞活化恢復至基線水準，但GZB及PD-1活化標記的表現量仍高於未處理對照組。
抗CD20/抗CD3 TCB在WSU-DLCL2模型中之抗腫瘤活性
測試CD20 TCB在攜有人類彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞株WSU-DLCL2且轉移有人類周邊單核細胞(PBMC)之NOG小鼠中的抗腫瘤活性。簡言之，向雌性NOG小鼠皮下(s.c.)注射1.5×106個WSU-DLCL2細胞(最初獲自歐洲細胞培養物保藏中心(European Collection of Cell Culture))。當平均腫瘤體積達到200mm3時，小鼠接受腹膜內注射人類PBMC(每隻小鼠10×106個細胞)作為人類源T細胞。兩天後，小鼠接受靜脈內CD20 TCB療法，劑量為0.5mg/kg，一週投與一次。如圖21中所描繪，CD20 TCB顯示強抗腫瘤活性，在研究終止時(第34天)觀測到腫瘤幾乎完全消退。
實例2 製備具有及不具有電荷修飾之「2+1 IgG互換Fab，倒置式」T細胞雙特異性抗體(抗BCMA/抗CD3)
此實例中所製備之分子的示意性說明顯示於圖22中。不具有電荷修飾的抗BCMA/抗CD3「2+1 IgG互換Fab，倒置式」分子(在此實例中稱為「83A10-TCB」)包含胺基酸序列SEQ ID NO 22-25，具有電荷修飾的抗BCMA/抗CD3「2+1 IgG互換Fab，倒置式」分子(在此實例中稱為「83A10-TCBcv」)包含胺基酸序列SEQ ID NO 26-29。
為了產生BCMAxCD3雙特異性抗體載體，IgG1源雙特異性分子係由至少兩個能夠特異性結合至兩個不同抗原性決定子CD3及BCMA之抗原結合部分組成。抗原結合部分為由各包含可變區及恆定區之重 鏈及輕鏈組成的Fab片段。Fab片段中的至少一者為「互換Fab」片段，其中VH與VL交換。Fab片段內之VH與VL交換確保不同特異性之Fab片段不具有相同的域排列。雙特異性分子設計對於CD3而言為單價的且對於BCMA而言為二價的，其中一個Fab片段與內部互換Fab(2+1)之N末端稠合。雙特異性分子含有Fc部分以便分子具有較長半衰期。藉由使用聚伸乙基亞胺(PEI)、用哺乳動物表現載體共轉染生長於懸浮液中的HEK293 EBNA細胞來產生分子。製備2+1互換Fab-IgG構築體時，用1：2：1：1比率(「載體Fc(杵)」：「載體輕鏈」：「載體輕鏈互換Fab」：「載體重鏈-互換Fab」)之對應表現載體轉染細胞。
對於雙特異性抗體而言，將置換/交換引入一個結合臂「互換Fab」明顯地減少副產物，但製劑無法完全不含副產物(詳細地描述於WO2009/080252及Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191)。因此，為了進一步減少因針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈之錯配所產生的副產物及為了改良雙特異性抗體產量，藉由在CH1及CL域中之特定胺基酸位置引入具有相反電荷之帶電胺基酸之取代而對分子應用另一種方法，在a)項下之第一輕鏈之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一重鏈之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat編號)；或ii)在b)項下之第二輕鏈之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)取代)，且其中在b)之第二重鏈之恆定域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat編號)。
產生雙特異性抗體時，藉由相應哺乳動物表現載體短暫共轉染 於HEK293-EBNA細胞中、在使用聚伸乙基亞胺(PEI)的懸浮液中培養來表現雙特異性抗體。轉染前一天，HEK293-EBNA細胞於補充有6mM L-麩醯胺酸之Ex-Cell培養基中以每毫升1.5個Mio活細胞接種。每毫升最終製造體積離心2.0個Mio活細胞(5分鐘，210×g)。抽吸上清液且將細胞再懸浮於100μL CD CHO培養基中。藉由將1μg DNA(重鏈：經修飾之重鏈：輕鏈：經修飾之輕鏈比率=1：1：2：1)混合於100μL CD CHO培養基中來製備每毫升最終製造體積之DNA。添加0.27μL PEI溶液(1mg/mL)之後，將混合物渦旋15秒且在室溫下保持10分鐘。10分鐘之後，將再懸浮之細胞及DNA/PEI混合物置於一起且接著轉移入適當容器中，置放於振盪裝置(37℃，5% CO2)中。3小時培育時間之後，每毫升最終製造體積添加800μL之Ex-Cell培養基，該培養基補充有6mM L-麩醯胺酸、1.25mM丙戊酸及12.5% Pepsoy(50g/L)。24小時之後，每毫升最終製造體積添加70μL饋料(SF40，Lonza)。7天之後或細胞存活率等於或低於70%時，藉由離心及無菌過濾自上清液中分離出細胞。藉由親和步驟及一個或兩個精製步驟(為陽離子交換層析及尺寸排阻層析)純化抗體。必要時，使用另一個精製步驟。
在親和步驟中，將上清液裝載於經6 CV 20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 7.5)平衡之蛋白質A管柱(HiTrap蛋白質A FF，5mL，GE Healthcare)上。使用相同緩衝液進行洗滌步驟之後，藉由20mM磷酸鈉、100mM氯化鈉、100mM甘胺酸(pH 3.0)之步驟溶離而將抗體自管柱溶離。具有所要抗體之溶離份立即用0.5M磷酸鈉pH 8.0(1：10)中和，合併且藉由離心來濃縮。無菌過濾濃縮物且藉由陽離子交換層析及/或尺寸排阻層析進一步處理。
在陽離子交換層析步驟中，所濃縮蛋白質用親和步驟所用的溶離緩衝液1：10稀釋且裝載於陽離子交換管柱(Poros 50 HS，Applied Biosystems)。使用平衡緩衝液及洗滌緩衝液(分別為20mM磷酸鈉、 20mM檸檬酸鈉、20mM TRIS pH 5.0及20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、20mM TRIS、100mM氯化鈉pH 5.0)進行兩個洗滌步驟之後，使用20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、20mM TRIS、100mM氯化鈉pH 8.5對蛋白質進行梯度溶離。合併含有所要抗體的溶離份，藉由離心濃縮，無菌過濾且藉由尺寸排阻步驟進一步處理。
在尺寸排阻步驟中，使用20mM組胺酸、140mM氯化鈉pH 6.0(使用或不使用Tween20作為調配緩衝液)將濃縮的蛋白質注射於XK16/60 HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)中。合併含有單體的溶離份，藉由離心濃縮且無菌過濾至無菌小瓶中。
使用0.1%抗體溶液之理論吸光度值、藉由量測280nm吸光度來測定抗體濃度。此值係基於胺基酸序列且藉由GPMAW軟體(Lighthouse資料)計算。
使用25mM磷酸鉀、125mM氯化鈉、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)疊氮化鈉(pH 6.7)緩衝液，分別藉由CE-SDS(Caliper LabChip GXII系統(Caliper Life Sciences))及HPLC(TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh))測定最終蛋白質製劑的純度及單體含量。
為了驗證最終蛋白質製劑之分子量且證實分子製劑最終蛋白質溶液為均質的，使用液相層析-質譜法(LC-MS)。首先進行去糖基化步驟。為了移除碳水化合物所引入的非均質性，用PNGaseF(ProZyme)處理構築體。因此，藉由將2μl 2M Tris添加至濃度為0.5mg/ml之20μg蛋白質中來調節蛋白質溶液pH至pH 7.0。添加0.8μg PNGaseF且在37℃培育12小時。接著進行LC-MS線上偵測。在Agilent HPLC 1200耦聯TOF 6441質譜儀(Agilent)上進行LC-MS方法。在Macherey Nagel Polysterene管柱RP1000-8(8μm粒度，4.6×250mm；目錄號719510)上進行層析分離。溶離劑A為含有5%乙腈及0.05%(v/v)甲酸之水，溶離 劑B為95%乙腈、5%水及0.05%甲酸。流速為1ml/min，在40℃對前述處理所得之6μg(15μl)蛋白質樣品執行分離。
在開始4分鐘期間，將溶離液引入廢棄物中以防止質譜儀被鹽污染。利用12l/min之乾燥氣流、350℃之溫度及60psi之噴霧器壓力來運作ESI源。使用380V之碎裂器電壓及700m/z至3200m/z質量範圍、使用陽離子模式獲取MS譜。藉由儀器軟體獲取MS資料4至17分鐘。
圖23描繪對83A10-TCB及83A10-TCBcv抗體執行不同純化方法之後，最終蛋白質製劑之CE-SDS(非還原性)曲線。對83A10-TCB抗體應用蛋白質A(PA)親和層析及尺寸排阻層析(SEC)純化步驟，產生<30%之純度及82.8%單體含量(A)。當在(A)中對最終蛋白質製劑應用其他純化步驟(包括陽離子交換層析(cIEX)及最終尺寸排阻層析(re-SEC)步驟)時，純度提高至93.4%，但單體含量保持相同且產量顯著降低至0.42mg/L。然而，當對83A10抗BCMA Fab CL-CH1(亦即83A10-TCBcv抗體，TCB分子之製造/純化概況優良，如95.3%純度所證明)施加特定電荷修飾時，已可觀測到100%單體含量及高達3.3mg/L之產量，即使應用PA+cIEX+SEC純化步驟(C)，相比之下，(B)的製造/純化概況顯示產量降低7.9倍且單體含量降低17.2%，儘管包括額外的re-SEC純化步驟。
接著執行可比較83A10-TCB相對於83A10-TCBcv抗體之製造/純化概況的頭對頭製造運作，以進一步評價施加於抗體之CL-CH1電荷修飾的優點。如圖24中所描繪，並行量測83A10-TCB及83A10-TCBcv抗 體之特性且在以下各純化步驟進行比較：1)單獨PA親和層析(A、B)；2)PA親和層析，接著SEC(C，D)；及3)PA親和層析，接著SEC，接著cIEX及re-SEC(E、F)。對83A10-TCB及83A10-TCBcv抗體執行相應純化方法之後的最終蛋白質溶液之CE-SDS(非還原性)曲線展現於圖24中。如圖24A及24B中所示，藉由單獨PA親和層析純化之後，已觀測到向TCB抗體施加電荷變異體所引起的改良。在此頭對頭研究中，PA親和層析純化步驟應用於83A10-TCB抗體產生61.3%之純度、26.2mg/L之產量及63.7%單體含量(24A)。相比之下，當藉由PA親和層析純化83A10-TCBcv抗體時，所有特性均得到改良，產生81.0%之較好純度、51.5mg/L之較好產量及68.2%單體含量(24B)。當對最終蛋白質製劑應用額外的SEC純化步驟時(如圖24A及24B中所見)，83A10-TCB獲得69.5%純度、14.1mg/L產量及74.7%單體含量，相比之下，83A10-TCBcv分別得到高達91.0%及83.9%之改良純度及單體含量，及10.3mg/L產量。儘管在此特定實驗中，83A10-TCBcv之產量稍微低於(亦即低於27%)83A10-TCB，但83A10-TCBcv得到的正確分子百分比遠高於83A10-TCB，分別為90%相對於40-60%，如藉由LC-MS所量測。在第三項頭對頭比較中，將圖24C及24D之83A10-TCB及83A10-TCBcv最終蛋白質製劑與單獨PA親和層析純化步驟之後得自另一純化批次(相同製造)的約1L(等體積)相應最終蛋白質製劑合併。接著藉由cIEX及SEC純化方法進一步純化所合併的蛋白質製劑。如圖24E及24F所描繪，相較於不具有電荷變異體之TCB抗體，一致地觀測到具有電荷變異體之TCB抗體之製造/純化概況改良。使用若干個純化方法步驟(亦即PA +/- SEC+cIEX+SEC)純化83A10-TCB抗體之後，僅達到43.1%純度且可達成98.3%單體含量，但有損於產量，導致產量降低至0.43mg/L。如藉由LC-MS所量測的正確分子百分比仍不良(60-70%)。最後，最終蛋白質製劑品質 為活體外使用所不可接受。形成鮮明對比的是，當對83A10-TCBcv抗體應用具有相同時序的相同多個純化步驟時，達到96.2%純度及98.9%單體含量以及95%正確分子，如藉由LC-MS所量測。然而，cIEX純化步驟之後，產量亦大大降低至0.64mg/L。結果顯示，兩個標準純化步驟(亦即PA親和層析及SEC)之後，僅83A10-TCBcv抗體可達成較好純度、較高單體含量、較高百分比的正確分子及較好產量(圖24D)，而83A10-TCB無法達成此等特性，即使應用額外的純化步驟(圖24E)。
表10概述83A10-TCB在PA純化步驟之後的特性(相較於83A10-TCVcv)。表11概述83A10-TCB在PA及SEC純化步驟之後的特性(相較於83A10-TCVcv)。表12概述83A10-TCB在PA及SEC加單獨PA、接著cIEX及re-SEC純化步驟之後的特性(相較於83A10-TCVcv)。在表10至12中，粗體值突出顯示83A10-TCB相對於83A10-TCVcv之間所比較的優良特性。由3個頭對頭比較實驗產生的83A10-TCBcv之所有製造/純化參數及值優於83A10-TCB，除其中可能不具代表性的一例之外。總體結果明確證明製造/純化特徵之優點可經由向TCB抗體施加CL-CH1電荷修飾來達成且達成已具有極良可開發特性之高品質蛋白質製劑僅需兩個純化步驟(亦即PA親和層析及SEC)。
表11. 抗BCMA/抗CD3T細胞雙特異性抗體在蛋白質A親和層析及尺寸排阻層析純化步驟之後的製造/純化概況。
抗BCMA/抗CD3 T細胞雙特異性抗體相對於BCMA陽性多發性骨髓瘤細胞株的結合(流式細胞術)
藉由流式細胞術分析抗BCMA/抗CD3 TCB抗體(83A10-TCB，13A4-TCBcv)相對於表現BCMA之NCI-H929細胞(ATCC® CRL-9068TM)上之人類BCMA的結合。MKN45(不表現BCMA的人類胃腺癌細胞株)用作陰性對照物。簡言之，收集所培養細胞，計數且使用ViCell評價細胞存活率。活細胞接著在含BSA的FACS染色緩衝液(BD Biosciences)中調節至每毫升2×106個細胞。100μl此細胞懸浮液進一步等分置於圓底96孔盤之每個孔中且與30μl抗BCMA抗體或相應IgG對照物一起在4℃培育30分鐘。所有抗BCMA/抗CD3 TCB抗體(及TCB對照物)在1-300nM之最終濃度範圍內滴定且分析。接著將細胞離心(5分鐘，350×g)，用每孔120μl FACS染色緩衝液(BD Biosciences)洗滌，再懸浮且與結合螢光染料、結合PE之特異性親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fc片段(Jackson Immuno Research Lab；109-116-170)一起在4℃培育額外30分鐘。細胞接著用染色緩衝液(BD Biosciences) 洗滌兩次，在4℃使用每孔100μl BD固定緩衝液(#BD Biosciences，554655)固定20分鐘，再懸浮於120μl FACS緩衝液中且使用BD FACS CantoII分析。如圖25中所描繪，抗BCMA/抗CD3 TCB抗體之平均螢光強度相對於抗體濃度作圖；(A)3A10-TCB針對H929細胞及MKN45細胞；(B)83A10-TCBcv針對H929細胞及MKN45細胞。適當時，使用Prism GraphPad(LaJolla,CA,USA)計算EC50且表示為83A10-TCB及83A10-TCBcv之結合達成50%最大結合所必需之抗體濃度的EC50值概述於表13中。圖25C顯示83A10-TCB及83A10-TCBcv以濃度依賴性方式且以類似效能結合至H929細胞。由於83A10-TCB與83A10-TCBcv分子在相應的VL及VH可變域上具有共同的CDR序列，因此預期會出現此等結果。DP47-TCB對照抗體不結合至BCMA陽性H929骨髓瘤細胞，如根據中值螢光強度缺乏增加所量測。在第二個頭對頭比較實驗中，評價83A10-TCB及83A10-TCBcv相對於BCMA陽性H929細胞的結合及相對於BCMA/CD3陰性MKN45細胞的結合缺乏。如圖25D中所描繪，83A10-TCB及83A10-TCBcv以濃度依賴性方式且以類似效能結合至BCMA陽性H929細胞。此第二實驗中之83A10-TCB及83A10-TCBcv結合至H929細胞的EC50值概述於表14中。
抗BCMA/抗CD3 T細胞雙特異性抗體誘導再定向T細胞對高度表現BCMA之H929骨髓瘤細胞的細胞毒性(LDH釋放分析)
亦分析抗BCMA/抗CD3 TCB抗體在構築體經由抗原結合部分結 合至細胞上之BCMA而交聯時，誘導T細胞介導高度表現BCMA之骨髓瘤細胞發生細胞凋亡的可能性。簡言之，利用細胞解離緩衝液收集表現BCMA之人類H929多發性骨髓瘤靶細胞，洗滌且再懸浮於補充有10%胎牛血清的RPMI(Invitrogen)中。在圓底96孔盤中每孔塗鋪約30,000個細胞且根據所要最終濃度添加抗體構築體之相應稀釋液(一式三份)；最終濃度範圍為0.1pM至10nM。為了適當比較，所有TCB構築體及對照物均調節至相同莫耳濃度。向孔中添加人類總T細胞(效應子)以獲得5：1之最終效應子：標靶(E：T)比率。當人類PBMC用作效應細胞時，使用10：1之最終E：T比率。陰性對照組係由單獨效應子或靶細胞表示。作為人類全T細胞活化之陽性對照物，使用1μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)。為了歸一化，藉由將靶細胞與最終濃度之1% Triton X-100一起培育來測定H929 MM靶細胞(=100%)之最大溶解，從而誘導細胞死亡。藉由將靶細胞與單獨效應細胞(亦即，無任何T細胞雙特異性抗體)共培育來代表最小溶解(=0%)。在37℃、5% CO2培育20-24小時之後，接著使用LDH偵測套組(Roche Applied Science)，依據製造商說明書量測LDH自細胞凋亡/壞死骨髓瘤靶細胞向上清液中的釋放。LDH釋放百分比相對於濃度-反應曲線中的抗BCMA/抗CD3 T細胞雙特異性抗體濃度作圖。適當時，使用Prism software(GraphPad)量測EC50值且以引起50%最大LDH釋放的TCB抗體濃度測定。如圖26中所示，抗BCMA/抗CD3 TCB抗體((A、B)83A10-TCB，(C、D)83A10-TCBcv)誘導BCMA陽性H929骨髓瘤細胞發生濃度依賴性殺死，如根據LDH釋放所量測。由於不結合至BCMA陽性靶細胞的DP47-TCB對照抗體確實不誘導LDH釋放(甚至在1nM之最高濃度(A)下)，因此H929細胞之殺死具有特異性。儘管83A10-TCB(A、B)及83A10-TCBcv(C，實驗1)使用Prism(GraphPad)統計學軟體量測不到EC50值，但不帶電TCB分子與帶電TCB分子之EC50值之量級均可大 致估算為較低的皮莫耳濃度效能範圍。在第二實驗中，在再定向T細胞殺死分析中評價83A10-TCBcv之作用且EC50值可量測為1.5pM。由於血液供者可變性，因此作者可不排除稍微較低的EC50值(效能稍微較好)。然而，殺死H929細胞之效能的量級明確地在較低的皮莫耳濃度範圍內。總體結果表明，83A10-TCB(不具有電荷變異體)相對於83A10-TCBcv(具有電荷變異體)在基於細胞之分析中顯示類似的生物特性。
實例3 製備具有電荷修飾之「2+1 IgG互換Fab，倒置式」T細胞雙特異性抗體(抗Her2/抗CD3)及具有電荷修飾之「2+1 IgG互換Fab」T細胞雙特異性抗體(抗Her3/抗CD3)
此實例中所製備之分子的示意性說明顯示於圖27中。具有電荷修飾之抗Her2/抗CD3「2+1 IgG互換Fab，倒置式」分子(在此實例中稱為「Her2 TCB」)包含胺基酸序列SEQ ID NO 21、52、53及54。具有電荷修飾之抗Her3/抗CD3「2+1 IgG互換Fab」分子(在此實例中稱為「Her3 TCB」)包含胺基酸序列SEQ ID NO 21、55、56及57。
如上述實例1中所述(使用單一製備型SEC步驟)製備分子，純化且分析。
兩種分子均可經純化而具有如藉由分析型尺寸排阻層析及CE-SDS所示的最終高品質(表16、17)。雖然Her2 TCB在此製備中的回收 率低於Her3 TCB，但蛋白質在兩個純化步驟(蛋白質A及SEC)之後幾乎為純的。CE-SDS分析顯示僅1.18%的低分子量雜質(約164kDa)(表17)。所偵測到之187.28kDa的物質對應於Fc域上不具有N連接糖基化的靶分子(人類IgG1在真核生物細胞中產生之後，通常藉由CE-SDS偵測此物質)。
Her3 TCB可以良好回收率純化。比較最終單體含量，最終品質優於Her2 TCB。此外，CE-SDS顯示100%靶蛋白，假設在192.05kDa偵測到的峰對應於非糖基化Fc物質。
在兩種製劑中，藉由CE-SDS或分析型尺寸排阻層析均未偵測到與產物相關的低分子量雜質，諸如自由輕鏈(分子量預期為25kDa)、二聚化輕鏈(如其藉由僅在一個輕鏈中引入CH1-CL交換而發生)(分子量預期為50kDa)，或缺失輕鏈或具有非共價連接之輕鏈的分子(分子量預期為125kDa、150kDa或175kDa)。
Her2 TCB及Her3 TCB相對於細胞的結合
收集傑卡特懸浮細胞，用FACS緩衝液(PBS+0.1% BSA)洗滌一次且藉由ViCell測定存活率。
利用細胞解離緩衝液(Gibco Invitrogen)收集黏附的KPL-4腫瘤細胞(由J.Kurebayashi,Kawasaki Medical School,Japan友善提供)且用FACS緩衝液洗滌一次，隨後藉由ViCell測定存活率。
在圓底96孔盤中每孔塗鋪0.2百萬個細胞且培養盤以400g離心4分鐘。TCB於FACS緩衝液中之稀釋液接著以每孔25μl添加至細胞中。細胞在冰箱中培育30分鐘。隨後每孔用150μl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。
每孔添加25μl經適當稀釋之二級抗體(結合FITC之親和純化F(ab')2片段，山羊抗人類IgG，特異性F(ab')2片段，Jackson ImmunoResearch)且培養盤進一步在4℃、在黑暗中染色30分鐘。
培養盤用每孔150μl FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於150μl FACS緩衝液中。使用裝備有FACS Diva軟體的BD FACS CantoII進行分析。中值螢光值(MFI)相對於TCB分子濃度作圖。
如圖29中所示，兩種TCB相對於其在細胞上之相應靶抗原均顯示良好的濃度依賴性結合。
Her3 TCB誘導T細胞介導人類腫瘤細胞溶解之後的人類CD8 + T效應細胞活化
利用10：1之效應子：標靶比率(E：T)及48小時之培育時間，根據CD69陽性細胞百分比來評價Her3 TCB之經典腫瘤細胞溶解實驗(如下文所述)中的CD8+ T效應細胞。
簡言之，在培育之後，將PBMC轉移至圓底96孔盤中，以350×g離心5分鐘且用含有0.1% BSA的PBS洗滌兩次。根據供應商指示來進行CD8(Biolegend #300908)及CD69(BioLegend #310904)之表面染色。細胞用每孔150μl含有0.1% BSA的PBS洗滌兩次且在4℃每孔使用100μl 1% PFA固定20分鐘。離心之後，將樣品再懸浮於每孔200μl PBS 0.1% BSA中且以FACS CantoII(軟體FACS Diva)分析。
如圖30中所示，Her3 TCB經由其相應靶向部分誘導T細胞與腫瘤細胞(KPL-4)之交聯且以濃度依賴性方式誘導T細胞活化。
傑卡特-NFAT活化分析
Her2 TCB及Her3 TCB誘導T細胞交聯及隨後T細胞活化的能力係使用腫瘤抗原陽性靶細胞(KPL-4)與傑卡特-NFAT報導子細胞(具有NFAT啟動子之表現CD3之人類急性淋巴白血病報導子細胞株GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega #CS176501)之共培養物評估。TCB分子同時結合至人類Her2、人類Her3(分別)抗原(腫瘤細胞上所表現)及CD3抗原(傑卡特-NFAT報導子細胞上所表現)時，NFAT啟動子被活化且促使活性螢火蟲螢光素酶表現。發光信號強度(添加螢光素酶受質時所得)與CD3活化及信號傳導之強度成比例。
在分析中，利用細胞解離緩衝液(Gibco Invitrogen)收集KPL-4人類腫瘤細胞且使用ViCell測定存活率。在平底白壁96孔盤(Greiner bio-one)中每孔塗鋪20 000個細胞且添加經稀釋之TCB或培養基(用於對照)。隨後收集傑卡特-NFAT報導子細胞且使用ViCell評估存活率。將細胞再懸浮於細胞培養基中且添加至腫瘤細胞中以獲得2.5：1(對於Her2 TCB)或5：1(對於Her3 TCB)之最終E：T(如所指示)及每孔100μl之最終體積。細胞在增濕保溫箱中在37℃培育5小時。在培育時間結束時，向孔中每孔添加100μl ONE-Glo溶液(Promega，#E6120)(1：1 ONE-Glo及分析培養基體積/孔)且在室溫下、在黑暗中培育10分鐘。使用WALLAC Vietor3 ELISA讀取器(PerkinElmer2030)(偵測時間為5秒/孔)偵測發光。
如圖31中所描繪，兩種TCB分子均經由CD3誘導T細胞交聯及隨後的T細胞活化。Her3 TCB對於KPL-4細胞稍微更強，此可能藉由此等靶細胞上之Her3含量高於Her2來解釋。
Her2 TCB及Her3 TCB誘導腫瘤細胞溶解
使用人類周邊血液單核細胞(PBMC)作為效應子，在E：T為10：1的情況下來評估相應TCB分子誘導表現Her2或Her3之腫瘤靶細胞的腫瘤細胞溶解。與TCB一起培育24小時及48小時之後，藉由量測釋放至上清液中的LDH來測定腫瘤細胞溶解，如所指示。
自新鮮血液或自白血球層中分離出人類PBMC。簡言之，使用PBS稀釋2：1(新鮮血液)或3：1(白血球層)血液。使約30ml血液/PBS混合物在15ml Histopaque(Sigma)上分層且在室溫下以450×g不制動離心30分鐘。使用10ml移液管收集淋巴細胞至含有PBS的50ml管中。用PBS將管填充至50ml且以350g離心10分鐘。丟棄上清液，將離心塊再懸浮於50ml PBS中且以300×g離心10分鐘。洗滌步驟重複一次。將細胞再懸浮於含有10% FCS及1% GlutaMax(Life Technologies)的RPMI中且在保溫箱中、在37℃、5% CO2儲存直至分析開始(不長於24小時)。
利用胰蛋白酶/EDTA收集靶細胞，洗滌且使用平底96孔盤、以30 000個細胞/孔之密度塗鋪。在增濕保溫箱中，讓細胞黏附隔夜。分析當天，分析盤以350×g離心5分鐘且抽出培養基。每孔添加100μl分析培養基。
添加指定濃度(對於Her3 TCB而言，範圍為0.001pM-1nM，且對於Her2 TCB而言，範圍為0.01pM-100nM，一式三份)的TCB。以10：1之最終E：T比率向靶細胞中添加PBMC。培育24小時及48小時之後，藉由對細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中的LDH進行定量(LDH偵測kit，Roche Applied Science，#11 644 793 001)來評估靶細胞殺死率。藉由將靶細胞與1% Triton X-100一起培育來使靶細胞達成最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在雙特異性構築體不存在的情況下，靶細胞與效應細胞共培育。使用GraphPadPrism5計算EC50值。
在另一實驗中，6.5小時之後，藉由微定量盤式讀取器(每孔讀取 時間為5秒)量測發光而根據卡斯蛋白酶3/7活性來測定腫瘤細胞溶解。
測定卡斯蛋白酶3/7活性時，如上文所述收集KPL-4-卡斯蛋白酶-3/7 GloSensor靶細胞(經GloSensor質體穩定轉染的KPL-4細胞)。用PBS洗滌一次之後，用分析培養基(RPMI1640，2% FCS，1% Glutamax)調節濃度至0.3×106個細胞/毫升)且與2% v/v Glosensor cAMP試劑(Promega)混合。將100μl(=30 000個細胞)此靶細胞懸浮液轉移至平底白壁96孔盤之各孔中。
藉由對獲自健康人類供者的增濃淋巴細胞製劑(白血球層)進行Histopaque密度離心來製備周邊血液單核細胞(PBMC)，如上文所述。基本上如上文所述來進行腫瘤細胞溶解分析。
圖32C及圖33中所描繪的結果說明Her3 TCB分子誘導KPL-4腫瘤細胞發生強的濃度依賴性細胞凋亡及溶胞。
對於圖32A及B中所描繪之Her2 TCB而言，的確如此，且該Her2 TCB顯示腫瘤細胞隨著時間發生顯著的濃度依賴性溶解。因此，殺死率之EC50似乎視相應靶細胞上之Her2表現量而定。表現量愈高，Her2 TCB對腫瘤細胞的殺死作用愈好。
實例4 製備具有及不具有電荷修飾之「(Fab) 2 -互換Fab」T細胞雙特異性抗體(抗MCSP/抗CD3)
此實例中所製備之分子的示意性說明顯示於圖34中。MCSP結合子中具有電荷修飾的抗MCSP/抗CD3「(Fab)2-互換Fab」分子(在此實例中稱為「(Fab)2-XFab-LC007cv」)包含胺基酸序列SEQ ID NO 58、59及60。不具有電荷修飾的抗MCSP/抗CD3「(Fab)2-互換Fab」分子(在此實例中稱為「(Fab)2-XFab」)包含不具有電荷修飾的對應胺基酸序列。
基本上如上述實例1中所述製備分子、純化且分析，但其中具有以下修改。
為了產生此等分子，用1：2：1比率(「載體重鏈」：「載體輕鏈抗MSCP Fab」：「載體輕鏈抗CD3 Fab」)的對應表現載體轉染HEK293-EBNA細胞。
藉由蛋白質A-HPLC，基於CH1域中之各部分相對於蛋白質A(pH8.0)的結合及始於pH2.5的步驟溶離(如實例1中所述)來測定培養基中的構築體濃度。
藉由親和層析(使用結合至CH1的親和層析)、隨後藉由尺寸排阻層析步驟而自細胞培養上清液中純化所分泌的蛋白質。
親和層析時，將上清液裝載於經5ml 50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl(pH 8.0)平衡的HiTrap KappaSelect管柱(CV=5mL，GE Healthcare)上。藉由至少10個管柱體積的50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl(pH 8.0)洗滌來移除未結合的蛋白質。在10個管柱體積的50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl(pH 2.0)中梯度溶離靶蛋白。藉由添加1/40之2M Tris pH 8.0來中和蛋白質溶液。濃縮靶蛋白且過濾，隨後裝載於經20mM組胺酸、140mM氯化鈉、0.01% Tween-20(pH 6.0)平衡的HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。
兩種分子均依循相同方法產生及純化。相較於不具有電荷修飾的分子(「(Fab)2-XFab」)，具有電荷之分子的效價降低10倍。然而，兩個抗MCSP Fab中具有電荷修飾之分子(「(Fab)2-XFab-LC007cv」)的最終回收率高約兩倍(表18)。(Fab)2-XFab-LC007cv分子可純化至95.8%之最終單體含量(藉由尺寸排阻層析所示)及94.33%之最終純度(如藉由CE-SDS分析所證實)。
具有及不具有電荷修飾之「(Fab) 2 -互換Fab」T細胞雙特異性抗體(抗MCSP/抗CD3)的細胞結合
收集傑卡特-NFAT懸浮細胞，用FACS緩衝液(PBS+0.1% BSA)洗滌一次且藉由ViCell測定存活率。
利用細胞解離緩衝液(Gibco Invitrogen)收集黏附的MV-3腫瘤細胞且用FACS緩衝液洗滌一次，隨後藉由ViCell測定存活率。
在圓底96孔盤中每孔塗鋪0.2百萬個細胞且培養盤以400×g離心4分鐘。一級抗體於FACS緩衝液中之稀釋液接著以每孔25μl添加至細胞中。細胞在冰箱中培育30分鐘。隨後每孔用150μl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。
每孔添加25μl經稀釋之二級抗體(結合FITC之親和純化F(ab')2片段，山羊抗人類IgG，特異性F(ab')2片段，Jackson ImmunoResearch)且培養盤進一步在4℃、在黑暗中染色30分鐘。
培養盤用每孔150μl FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於150μl FACS緩衝液中。使用裝備有FACS Diva軟體的BD FACS CantoII進行分析。中值螢光值(MFI)相對於MCSP TCB分子濃度作圖。
如圖36中所示，(Fab)2-XFAb-LC007cv分子顯示濃度依賴性結合 至MV-3上之人類MCSP及傑卡特細胞上之人類CD3。不具有電荷修飾之(Fab)2-XFab分子相對於人類MCSP的結合與(Fab)2-XFAb-LC007cv相當((Fab)2-XFAb-LC007cv之結合EC50為2.3nM，而(Fab)2-XFab之EC 50為1.5nM)。
具有及不具有電荷修飾之「(Fab) 2 -互換Fab」T細胞雙特異性抗體(抗MCSP/抗CD3)介導的腫瘤細胞溶解
使用人類PBMC作為效應子，在E：T為10：1的情況下評估MCSP TCB分子誘導表現MCSP之MV-3腫瘤靶細胞的腫瘤細胞溶解。與TCB一起培育24小時及48小時之後，藉由量測釋放至上清液中的LDH來測定腫瘤細胞溶解。
簡言之，利用胰蛋白酶/EDTA收集靶細胞，洗滌且使用平底96孔盤、以25 000個細胞/孔之密度塗鋪。在增濕保溫箱中，讓細胞黏附隔夜。分析當天，分析盤以350×g離心5分鐘且抽出培養基。每孔添加100μl分析培養基。
自新鮮血液中分離出周邊血液單核細胞(PBMC)。簡言之，血液用PBS 2：1稀釋。使約30ml血液/PBS混合物在15ml Histopaque(Sigma)上分層且以450×g不制動離心30分鐘。使用10ml移液管收集淋巴細胞至含有PBS的50ml管中。用PBS將管填充至50ml且以350×g離心10分鐘。丟棄上清液，將離心塊再懸浮於50ml PBS中且以300×g離心10分鐘。洗滌步驟重複一次。將細胞再懸浮於含有10% FCS及1% GlutaMax(Life Technologies)的RPMI中且在保溫箱中、在37℃、5% CO2儲存直至分析開始(不長於24小時)。
在殺死分析中，添加指定濃度(範圍為0.04pM-10nM，一式三份)的TCB分子。以10：1之最終E：T比率向靶細胞中添加PBMC。培育24小時及48小時之後，藉由對細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中的LDH進行定量(LDH偵測kit，Roche Applied Science，#11 644 793 001) 來評估靶細胞殺死率。藉由將靶細胞與1% Triton X-100一起培育來使靶細胞達成最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在雙特異性構築體不存在的情況下，靶細胞與效應細胞共培育。使用GraphPadPrism5計算EC50值。
如圖37中所描繪，兩種分子均顯示表現hMCSP之靶細胞發生濃度依賴性溶胞。(Fab)2-XFAb-LC007cv分子之效能(24小時之後，EC50為2.8pM，且48小時之後，EC50為8.6pM)與不具有電荷修飾之(Fab)2-XFab分子之效能(24小時之後，EC50為5.9pM，且48小時之後，EC50為4.8pM)相當。
雖然前述本發明已藉助於說明及實例較詳細地描述以用於清楚理解之目的，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文引用的所有專利及科學文獻之揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中。
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<212> PRT
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<223> 連接子
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<213> 人工序列
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<223> CD20 VH-CH1(EE)-Fc(臼，P329G LALA)
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<212> PRT
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> CD20 VH-CH1(EE)-Fc(臼，N297G)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 LCDR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> Her2 VH-CH1(EE)-Fc(臼，P329G LALA)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 VL-CL(RK)
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<213> 人工序列
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<223> MCSP VH-CH1(EE)-MCSP VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> CD3 VH-CL
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> MCSP VL-CL(RK)
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR1
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<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VH-CH1(E)-CD3 VL-CH1-Fc(杵，P329G LALA)
<400> 69
<210> 70
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VH-CH1(E)-Fc(臼，P329G LALA)
<400> 70
<210> 71
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VL-CL(R)
<400> 71
<210> 72
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VH-CH1-CD3 VL-CH1(EE)-Fc(杵，P329G LALA)
<400> 72
<210> 73
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH-CL(RK)
<400> 73

Claims (53)

  1. 一種T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含(a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；(b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中該Fab輕鏈可變域VL與該Fab重鏈可變域VH彼此間置換；(c)特異性結合至該第一抗原的第三Fab分子；及(d)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域；其中該第一抗原為靶細胞抗原且該第二抗原為活化T細胞抗原；其中在a)項下之該第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之該第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸及位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中該第二Fab分子及該第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與該Fc域之亞單元之一之N末端稠合，且該第一Fab分子在Fab重鏈C末端與該第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合。
  2. 如請求項1之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3。
  3. 如請求項1之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3 ε。
  4. 如請求項1至3中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中在a)項下之該第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸 (R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之該第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  5. 如請求項1至3中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中在a)項下之該第一Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之該第一Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  6. 如請求項1至3中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該第三Fab分子與該第一Fab分子相同。
  7. 如請求項1至3中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該第一Fab分子及該第二Fab分子彼此間稠合，視情況經由肽連接子稠合。
  8. 如請求項1至3中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該第一Fab分子之Fab輕鏈與該第二Fab分子之Fab輕鏈彼此間稠合，視情況經由肽連接子稠合。
  9. 如請求項1至3中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該第二Fab分子在Fab重鏈C末端與該Fc域之第一或第二亞單元之N末端稠合。
  10. 如請求項1至3中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈C末端與該Fc域之第一或第二亞單元之N末端稠合。
  11. 一種T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含 a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，其中該Fab輕鏈可變域VL與該Fab重鏈可變域VH彼此間置換；c)特異性結合至該第一抗原的第三Fab分子；及d)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域；其中該第一抗原為靶細胞抗原且該第二抗原為活化T細胞抗原；其中c)項下的該第三Fab分子與a)項下的該第一Fab分子相同；其中在a)項下之該第一Fab分子及c)項下之該第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)或離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之該第一Fab分子及c)項下之該第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中a)項下之該第一Fab分子在Fab重鏈C末端與b)項下之該第二Fab分子Fab重鏈N末端稠合，且b)項下之該第二Fab分子及c)項下之該第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與d)項下之該Fc域之次單元之一的N末端稠合。
  12. 如請求項11之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3。
  13. 如請求項11之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3 ε。
  14. 如請求項1至3及11至13中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3，且特異性結合至該活化T細胞抗原的該Fab分子包含SEQ ID NO：4之重鏈互補決定區 (CDR)1、SEQ ID NO：5之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：8之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR 3。
  15. 如請求項14之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3 ε。
  16. 如請求項1至3及11至13中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3，且特異性結合至該活化T細胞抗原的該Fab分子包含胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO：3至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO：7至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區。
  17. 如請求項16之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該活化T細胞抗原為CD3 ε。
  18. 如請求項1至3及11至13中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該靶細胞抗原為CD20，且特異性結合至該靶細胞抗原的該Fab分子包含SEQ ID NO：46之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：47之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：48之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：49之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：50之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：51之輕鏈CDR 3。
  19. 如請求項1至3及11至13中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該靶細胞抗原為CD20且特異性結合至該靶細胞抗原的該Fab分子包含胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO：30至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO：31至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區。
  20. 一種T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其包含 a)特異性結合至第一抗原的第一Fab分子；b)特異性結合至第二抗原的第二Fab分子，且其中該Fab輕鏈可變域VL與該Fab重鏈可變域VH彼此間置換；c)特異性結合至該第一抗原的第三Fab分子；及d)由能夠穩定結合之第一亞單元及第二亞單元組成的Fc域；其中(i)該第一抗原為CD20且該第二抗原為CD3；(ii)a)項下之該第一Fab分子及c)項下之該第三Fab分子各自包含SEQ ID NO：46之重鏈互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：47之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：48之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：49之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：50之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：51之輕鏈CDR 3，且b)項下之該第二Fab分子包含SEQ ID NO：4之重鏈CDR 1、SEQ ID NO：5之重鏈CDR 2、SEQ ID NO：6之重鏈CDR 3、SEQ ID NO：8之輕鏈CDR 1、SEQ ID NO：9之輕鏈CDR 2及SEQ ID NO：10之輕鏈CDR 3；(iii)在a)項下之該第一Fab分子及c)項下之該第三Fab分子之恆定域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代，特別是經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在a)項下之該第一Fab分子及c)項下之該第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及(iv)a)項下之該第一Fab分子在Fab重鏈C末端與b)項下之該第二Fab分子之Fab重鏈N末端稠合，且b)項下之該第二Fab分子及c)項下之該第三Fab分子各自在Fab重鏈C末端與d)項下之該Fc域之次單元之一的N末端稠合。
  21. 如請求項20之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原為CD3 ε。
  22. 如請求項20之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中a)項下之該第一Fab分子及c)項下之該第三Fab分子各自包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：30的重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：31的輕鏈可變區。
  23. 如請求項20之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中b)項下之該第二Fab分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：3的重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：7的輕鏈可變區。
  24. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG Fc域。
  25. 如請求項24之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG1或IgG4 Fc域。
  26. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為人類Fc域。
  27. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含促進該Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。
  28. 如請求項24之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之第一亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在該第一亞單元之CH3域內產生可定位於該第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且在該Fc域之第二亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在該第二亞單元之CH3域內產生可供該第一亞單元之CH3域內之該隆凸可定位於其中的空腔。
  29. 如請求項28之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中具有較大 側鏈體積的該胺基酸殘基選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群，且具有較小側鏈體積的該胺基酸殘基選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。
  30. 如請求項28之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之第一亞單元之CH3域中，位置366之該蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在該Fc域之第二亞單元之CH3域中，位置407之該酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)，且視情況另外在該Fc域之第二亞單元中，位置366之該蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368之該白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
  31. 如請求項28之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中另外在該Fc域之第一亞單元中，位置354之該絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356之該麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)，且另外在該Fc域之第二亞單元中，位置349之該酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。
  32. 如請求項28之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且該Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V(根據Kabat EU索引編號)。
  33. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域相較於原生IgG1 Fc域而言，針對Fc受體展現降低之結合親和力及/或降低的效應功能。
  34. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含一或多個胺基酸取代，該取代降低與Fc受體之結合及/或效應功能。
  35. 如請求項34之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該一或多個胺基酸取代位於一或多個選自L234、L235及P329之群組的位置(Kabat EU索引編號)。
  36. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域之各亞單元包含降低與活化Fc受體之結合及/或效應功能的三個胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G(Kabat EU索引編號)。
  37. 如請求項33之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該Fc受體為Fcγ受體。
  38. 如請求項33之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該效應功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  39. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其用作藥物。
  40. 如請求項1至3、11至13及20至23中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其用於治療有需要之個體之疾病。
  41. 如請求項40之T細胞活化雙特異性抗原結合分子，其中該疾病為癌症。
  42. 一或多種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至38中任一項之T細胞活化雙特異性抗原結合分子。
  43. 一或多種包含如請求項42之聚核苷酸的載體。
  44. 如請求項43之載體，其係表現載體。
  45. 一種包含如請求項42之聚核苷酸或如請求項43或44之載體的宿主細胞。
  46. 一種製造能夠特異性結合至CD3及靶細胞抗原之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含以下步驟：a)在適於表現該T細胞活化雙特異性抗原結合分子的條件下培養如請求項45之 宿主細胞及b)回收該T細胞活化雙特異性抗原結合分子。
  47. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至38中任一項或自如請求項46之方法所獲得之T細胞活化雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
  48. 如請求項47之醫藥組合物，其用作藥物。
  49. 如請求項47之醫藥組合物，其用於治療有需要之個體之疾病。
  50. 如請求項49之醫藥組合物，其中該疾病為癌症。
  51. 一種如請求項1至38中任一項或自如請求項46之方法所獲得之T細胞活化雙特異性抗原結合分子的用途，係用於製造治療增生性病症的藥物。
  52. 如請求項51之用途，其中該增生性病症為癌症。
  53. 一種用於誘導靶細胞溶解的活體外方法，該方法包含在T細胞存在下，使靶細胞與如請求項1至38中任一項或自如請求項46之方法所獲得之T細胞活化雙特異性抗原結合分子接觸。
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