BR122024004313A2

BR122024004313A2 - Molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células t

Info

Publication number: BR122024004313A2
Application number: BR122024004313-0A
Authority: BR
Inventors: Oliver Ast; Marina Bacac; Sabine Imhof-Jung; Christiane Jaeger; Christian Klein; Stefan Klostermann; Michael Molhoj; Joerg Thomas Regula; Wolfgang Schaefer; Pablo Umaña
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2014-08-04
Filing date: 2015-08-03
Publication date: 2024-04-02

Abstract

A presente invenção refere-se, de forma geral, a moléculas de ligação de antígenos biespecíficos inovadores para ativação de células T e redirecionamento a células alvo específicas. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam essas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos, vetores e células hospedeiras que compreendem esses polinucleotídeos. A presente invenção refere-se ainda a métodos de produção das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos de acordo com a presente invenção e a métodos de uso dessas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos no tratamento de doenças.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se, de forma geral, a moléculas de ligação de antígenos biespecíficos para ativação de células T. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam essas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos, vetores e células hospedeiras que compreendem esses polinucleotídeos. A presente invenção refere-se ainda a métodos de produção das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos de acordo com a presente invenção e a métodos de uso dessas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos no tratamento de doenças.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A destruição seletiva de células individuais ou de tipos de células específicos é frequentemente desejável em uma série de ambientes clínicos. É, por exemplo, objetivo primário da terapia de câncer a destruição específica de células de tumores, mantendo células e tecidos saudáveis intactos e não danificados.

[003] Uma forma atrativa de atingir isso é induzindo reação imunológica contra o tumor, para fazer com que células efetoras imunes como células matadoras naturais (NK) ou linfócitos T citotóxicos (CTLs) ataquem e destruam células de tumores. CTLs constituem as células efetoras mais potentes do sistema imunológico, mas elas não podem ser ativadas pelo mecanismo efetor mediado pelo domínio Fc de anticorpos terapêuticos convencionais.

[004] Neste particular, anticorpos biespecíficos projetados para ligação com um “braço” a um antígeno da superfície sobre células alvo e com o segundo “braço” a um componente ativador invariável do complexo receptor de células T (TCR) tornaram-se de interesse nos últimos anos. A ligação simultânea desse anticorpo aos seus dois alvos forçará interação temporária entre célula alvo e célula T, causando a ativação de qualquer célula T citotóxica e lise subsequente da célula alvo. A reação imunológica é, portanto, redirecionada para as células alvo e é independente da apresentação de antígenos de peptídeo pela célula alvo ou da especificidade da célula T, como seria relevante para ativação restrita por MHC normal de CTLs. Neste contexto, é crucial que CTLs somente sejam ativados quando uma célula alvo estiver apresentando o anticorpo biespecífico para eles, ou seja, a sinapse imunológica é imitada. São particularmente desejáveis anticorpos biespecíficos que não necessitam de condicionamento prévio de linfócitos nem de coestímulo para permitir a lise eficiente de células alvo.

[005] Diversos formatos de anticorpos biespecíficos foram desenvolvidos e a sua adequação para imunoterapia mediada por células T foi investigada. Destas, as chamadas moléculas BiTE (engajador de células T biespecíficas) foram muito bem caracterizadas e já exibiram alguma promessa na medicina (analisadas em Nagorsen e Bauerle, Exp. Cell Res.317, 1255 1260 (2011)). BiTEs são moléculas scFv em conjunto nas quais duas moléculas de scFv são fundidas por um ligante flexível. Formatos biespecíficos adicionais que são avaliados para engajamento de células T incluem diacorpos (Holliger et al, Prot. Eng. 9, 299-305 (1996)) e seus derivados, tais como diacorpos em conjunto (Kipriyanov et al, J. Mol. Biol. 293, 41-66 (1999)). Um desenvolvimento mais recente são as chamadas moléculas DART (redirecionamento de dupla afinidade), que são baseadas no formato de diacorpos, mas apresentam uma ponte de dissulfeto C-terminal para estabilização adicional (Moore et al, Blood 117, 4542-51 (2011)). Os chamados triomabs, que são moléculas de IgG de rato/camundongo híbridas inteiras e também são atualmente avaliadas em testes clínicos, representam um formato com tamanho maior (analisado em Seimetz et al, Cancer Treat. Rev. 36, 458 467 (2010)).

[006] A variedade de formatos sendo desenvolvidos exibe o grande potencial atribuído ao redirecionamento e à ativação de células T em imunoterapia. A tarefa de geração de anticorpos biespecíficos apropriados, entretanto, não é trivial, mas envolve uma série de desafios que necessitam ser atendidos com relação à eficácia, toxicidade, aplicabilidade e capacidade de produção dos anticorpos.

[007] Construções pequenas, tais como moléculas BiTE (embora sejam capazes de reticular eficientemente células alvo e efetoras) possuem meia vida em soro muito curta, exigindo sua administração a pacientes por meio de infusão contínua. Formatos similares a IgG, por outro lado (embora apresentem o grande benefício de meia vida longa) sofrem toxicidade associada às funções efetoras nativas inerentes a moléculas de IgG. Seu potencial imunogênico constitui outra característica desfavorável de anticorpos biespecíficos similares a IgG, especialmente formatos não humanos, para desenvolvimento terapêutico bem sucedido. Por fim, um desafio importante no desenvolvimento geral de anticorpos biespecíficos foi a produção de construções de anticorpos biespecíficos em quantidade e pureza clinicamente suficientes, devido ao desemparelhamento de cadeias leve e pesada de anticorpos com diferentes especificidades mediante coexpressão, o que reduz o rendimento da construção montada corretamente e resulta em diversos subprodutos não funcionais dos quais pode ser difícil separar o anticorpo biespecífico desejado.

[008] Diferentes abordagens foram realizadas para superar a questão de associação de cadeia em anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Klein et al, mAbs 6, 653-663 (2012)). A estratégia de “botões em orifícios”, por exemplo, destina-se a forçar o emparelhamento de duas cadeias pesadas de anticorpos diferentes introduzindo mutações nos domínios CH3 para modificar a interface de contato. Sobre uma cadeia, aminoácidos volumosos são substituídos por aminoácidos com cadeias laterais curtas para criar um “orifício”. Por outro lado, aminoácidos com cadeias laterais grandes são introduzidos no outro domínio CH3, para criar um “botão”. Coexpressando- se essas duas cadeias pesadas (e duas cadeias leves idênticas, que necessitam ser apropriadas para as duas cadeias pesadas), são observados altos rendimentos de heterodímero ("botão-orifício") em comparação com homodímero ("orifício-orifício"ou "botão-botão") (Ridgway, J. B. et al, Protein Eng. 9 (1996) 617-621; e WO 96/027011). O percentual de heterodímeros poderá ser adicionalmente aumentado por meio de remodelagem das superfícies de interação dos dois domínios CH3 utilizando uma abordagem de exibição de fagos e a introdução de uma ponte de dissulfeto para estabilizar os heterodímeros (Merchant, A. M. et al, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S. et al, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35). Novas abordagens para a tecnologia de botões em orifícios são descritas, por exemplo, em EP 1870459 A1.

[009] A estratégia de “botões em orifícios”, entretanto, não resolve o problema de desemparelhamento de cadeia pesada e cadeia leve, que ocorre em anticorpos biespecíficos que compreendem cadeias leves diferentes para ligação aos diferentes antígenos alvo.

[0010] Uma estratégia para evitar o desemparelhamento de cadeia leve e cadeia pesada é alterar os domínios entre as cadeias leve e pesada de um dos braços de ligação de um anticorpo biespecífico (vide WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 e Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191, que se referem a anticorpos IgG biespecíficos com cruzamento de domínio).

[0011] Substituindo os domínios variáveis de cadeia pesada e leve VH e VL em um dos braços de ligação do anticorpo biespecífico (WO 2009/080252; vide também Schaefer, W. et al, PNAS 108 (2011) 11187-11191) claramente reduz os subprodutos causados pelo desemparelhamento de uma cadeia leve contra um primeiro antígeno com a cadeia pesada errada contra o segundo antígeno (em comparação com abordagens sem essa troca de domínios). Essas preparações de anticorpos não são, entretanto, completamente livres de subprodutos. O principal subproduto é baseado em uma interação do tipo Bence Jones (Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191; na Fig. S1I do Suplemento). É, portanto, desejável redução adicional desses subprodutos, por exemplo, para aumentar o rendimento desses anticorpos biespecíficos.

[0012] Considerando as dificuldades e desvantagens associadas aos anticorpos biespecíficos atualmente disponíveis para imunoterapia mediada por células T, permanece a necessidade de formatos inovadores e aprimorados dessas moléculas. A presente invenção fornece moléculas de ligação de antígenos biespecíficos projetadas para ativação e redirecionamento de células T que combinam boa eficácia e capacidade de produção com baixa toxicidade e propriedades farmacocinéticas favoráveis.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0013] Segundo a presente invenção, a razão de um anticorpo biespecífico desejado em comparação com subprodutos indesejados, particularmente subprodutos do tipo Bence Jones que ocorrem em anticorpos biespecíficos com troca de domínio VH/VL em um dos seus braços de ligação, pode ser aprimorada por meio da introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições de aminoácidos específicas nos domínios CH1 e CL.

[0014] Em primeiro aspecto, portanto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, que compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; em que o primeiro antígeno é um antígeno de células T ativadoras e o segundo antígeno é um antígeno de células alvo ou o primeiro antígeno é um antígeno de células alvo e o segundo antígeno é um antígeno de células T ativadoras; e em que: i. no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii. no domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0015] Segundo a presente invenção, a segunda molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada, em que as regiões variáveis da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídas. Em realizações específicas, a primeira (e a terceira, se houver) molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional. Em uma realização específica adicional, não mais de uma molécula de Fab capaz de ligação específica a um antígeno de células T ativadoras encontra-se presente na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (ou seja, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T fornece ligação monovalente ao antígeno de células T ativadoras).

[0016] Em uma realização específica, o primeiro antígeno é um antígeno de células alvo e o segundo antígeno é um antígeno de células T ativadoras. Em uma realização mais específica, o antígeno de células T ativadoras é CD3, particularmente CD3 epsilon. Em uma realização, o antígeno de células alvo é CD20.

[0017] Em uma realização da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)), e, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0018] Em uma realização adicional, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0019] Em ainda outra realização, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0020] Em uma realização específica, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0021] Em outra realização específica, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0022] Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; em que o primeiro antígeno é um antígeno de células alvo e o segundo antígeno é um antígeno de células T ativadoras; e em que, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização alternativa da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, no domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e, no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0023] Em uma realização adicional, no domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e, no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0024] Em ainda outra realização, no domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0025] Em uma realização, no domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0026] Em outra realização, no domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) e no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0027] Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno.

[0028] Em realizações específicas, a terceira molécula de Fab é idêntica à primeira molécula de Fab. Nessas realizações, a terceira molécula de Fab compreende, portanto, as mesmas substituições de aminoácidos da primeira molécula de Fab. Como a primeira molécula de Fab, a terceira molécula de Fab é particularmente uma molécula de Fab convencional.

[0029] Caso uma terceira molécula de Fab esteja presente, em uma realização específica, a primeira e a terceira molécula de Fab ligam-se especificamente a um antígeno de células alvo e a segunda molécula de Fab liga-se especificamente a um antígeno de células T ativadoras, particularmente CD3, mais especificamente CD3 epsilon.

[0030] Em algumas realizações da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, a primeira molécula de Fab em (a) e a segunda molécula de Fab em (b) são fundidas entre si, opcionalmente por meio de um ligante de peptídeos. Em uma realização específica, a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Em uma realização alternativa, a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Em realizações nas quais (i) a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab ou (ii) a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab, adicionalmente, a cadeia leve de Fab da molécula de Fab e a cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab podem ser fundidas entre si, opcionalmente por meio de um ligante de peptídeos.

[0031] Em realizações específicas, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

[0032] A molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção pode ter diferentes configurações, ou seja, a primeira e a segunda (e, opcionalmente, a terceira) molécula de Fab podem ser fundidas entre si e ao domínio Fc de diferentes formas. Os componentes podem ser fundidos entre si diretamente ou, preferencialmente, por meio de um ou mais ligantes de peptídeos apropriados. Quando a fusão ocorrer ao terminal N de uma subunidade do domínio Fc, ela ocorre tipicamente por meio de uma região de articulação de imunoglobulina.

[0033] Em uma realização, a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Nessa realização, a primeira molécula de Fab pode ser fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab ou ao terminal N da outra subunidade do domínio Fc.

[0034] Em uma realização, cada uma dentre a primeira e a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc. Nesta realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende essencialmente uma molécula de imunoglobulina, em que, em um dos braços de Fab, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve VH e VL são substituídas entre si (vide a Figura 1A, D).

[0035] Em realizações alternativas, a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em uma realização específica, cada uma dentre a segunda e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc e a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Nesta realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende essencialmente uma molécula de imunoglobulina, em que, em um dos braços de Fab, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada VH e VL são substituídas entre si e em que uma molécula de Fab adicional (convencional) é fundida no terminal N ao mencionado braço de Fab (vide a Figura 1B, E). Em outra dessas realizações, cada uma dentre a primeira e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc e a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Nesta realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende essencialmente uma molécula de imunoglobulina com uma molécula de Fab adicional fundida em terminal N a um dos braços de Fab de imunoglobulina, em que, na mencionada molécula de Fab adicional, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve VH e VL são substituídas entre si (vide a Figura 1C, F).

[0036] Em todas as configurações diferentes da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, as substituições de aminoácidos descritas no presente podem encontrar-se nos domínios CH1 e CL da primeira e (quando presente) da terceira molécula de Fab ou nos domínios CH1 e CL da segunda molécula de Fab. Preferencialmente, elas se encontram nos domínios CH1 e CL da primeira e (quando presente) da terceira molécula de Fab. Segundo o conceito da presente invenção, caso substituições de aminoácidos conforme descrito no presente sejam realizadas na primeira (e, quando presente, na terceira) molécula de Fab, nenhuma substituição de aminoácido é realizada na segunda molécula de Fab. Por outro lado, caso substituições de aminoácidos conforme descrito no presente sejam realizadas na segunda molécula de Fab, nenhuma substituição de aminoácido é realizada na primeira (e, quando presente, na terceira) molécula de Fab.

[0037] Em realizações específicas da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, particularmente em que substituições de aminoácidos conforme descrito no presente são realizadas na primeira (e, quando presente, na terceira) molécula de Fab, o domínio constante CL da primeira (e, quando presente, da terceira) molécula de Fab é do isotipo capa. Em outras realizações da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, particularmente em que substituições de aminoácidos conforme descrito no presente são realizadas na segunda molécula de Fab, o domínio constante CL da segunda molécula de Fab é do isotipo capa. Em algumas realizações, o domínio constante CL da primeira (e, quando presente, da terceira) molécula de Fab e o domínio constante CL da segunda molécula de Fab são do isotipo capa.

[0038] Em uma realização específica, a molécula de imunoglobulina compreendida na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção é uma imunoglobulina da classe IgG. Em uma realização ainda mais específica, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG1. Em outra realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG4.

[0039] Em uma realização específica, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, que compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; c. uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; e d. um domínio Fc composto de primeira e segunda subunidades capazes de associação estável; e. que o primeiro antígeno é um antígeno de células alvo e o segundo antígeno é um antígeno de células T ativadoras, particularmente CD3, mais especificamente CD3 epsilon; f. que a terceira molécula de Fab em (c) é idêntica à primeira molécula de Fab em (a); em que, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que: i. a primeira molécula de Fab em (a) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab em (b) e cada uma dentre a segunda molécula de Fab em (b) e a terceira molécula de Fab em (c) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em (d); ou ii. a segunda molécula de Fab em (b) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab em (a) e cada uma dentre a primeira molécula de Fab em (a) e a terceira molécula de Fab em (c) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em (d).

[0040] Em uma realização ainda mais específica, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, que compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; c. uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; e d. um domínio Fc composto de primeira e segunda subunidades capazes de associação estável; em que o primeiro antígeno é um antígeno de células alvo e o segundo antígeno é um antígeno de células T ativadoras, particularmente CD3, mais especificamente CD3 epsilon; em que a terceira molécula de Fab em (c) é idêntica à primeira molécula de Fab em (a); em que, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira molécula de Fab em (a) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab em (b) e cada uma dentre a segunda molécula de Fab em (b) e a terceira molécula de Fab em (c) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em (d).

[0041] Em uma realização adicional, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, que compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; e c. um domínio Fc composto de primeira e segunda subunidades capazes de associação estável; em que: i. o primeiro antígeno é um antígeno de células alvo e o segundo antígeno é um antígeno de células T ativadoras, particularmente CD3, mais especificamente CD3 epsilon; ou ii. o segundo antígeno é um antígeno de células alvo e o primeiro antígeno é um antígeno de células T ativadoras, particularmente CD3, mais especificamente CD3 epsilon; em que, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que cada uma dentre a primeira molécula de Fab em (a) e a segunda molécula de Fab em (b) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[0042] Em realizações específicas da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG. Em uma realização específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em outra realização específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Em uma realização ainda mais específica, o domínio Fc é um domíno Fc de IgG4 que compreende a substituição de aminoácidos S228P (numeração de Kabat). Em realizações específicas, o domínio Fc é um domínio Fc humano.

[0043] Em realizações específicas, o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade de domínio Fc. Em uma realização específica, um resíduo de aminoácidos no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo de aminoácido que possui volume de cadeia lateral maior, de forma a gerar uma protuberância no domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade no domínio CH3 da segunda subunidade e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo de aminoácido que possui volume de cadeia lateral menor, de forma a gerar uma cavidade no domínio CH3 da segunda subunidade na qual a protuberância no domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.

[0044] Em uma realização específica, o domínio Fc exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo. Em certas realizações, o domínio Fc é elaborado para possuir afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não elaborado. Em uma realização, o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora. Em uma realização, uma ou mais substituições de aminoácidos no domínio Fc que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora encontram-se em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste de L234, L235 e P329 (numeração de índice EU de Kabat). Em realizações específicas, cada subunidade do domínio Fc compreende três substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora, em que as mencionadas substituições de aminoácidos são L234A, L235A e P329G (numeração do índice EU de Kabat). Em uma dessas realizações, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humano. Em outras realizações, cada subunidade do domínio Fc compreende duas substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora, em que as mencionadas substituições de aminoácidos são L235E e P329G (numeração do índice EU de Kabat). Em uma dessas realizações, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4, particularmente um domínio Fc de IgG4 humano. Em uma realização, o domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é um domínio Fc de IgG4 e compreende as substituições de aminoácidos L235E e S228P (SPLE) (numeração do índice EU de Kabat).

[0045] Em uma realização, o receptor Fc é um receptor FCY. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em uma realização específica, o receptor Fc é FcYRIIa, FCYRI e/ou FcYRIIIa. Em uma realização, a função efetora é citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[0046] Em uma realização específica da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, a molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células T ativador, particularmente CD3, mais especificamente CD3 epsilon, compreende a região de determinação da complementaridade de cadeia pesada (CDR) 1 de SEQ ID N° 4, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 5, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 6, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 8, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 9 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 10. Em uma realização ainda mais específica, a molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células T ativador, particularmente CD3, mais especificamente CD3 epsilon, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 3 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 7. Em uma realização específica, a segunda molécula de Fab compreendida na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção liga se especificamente a CD3, mais especificamente CD3 epsilon, e compreende a região de determinação da complementaridade de cadeia pesada (CDR) 1 de SEQ ID N° 4, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 5, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 6, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 8, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 9 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 10. Em uma realização ainda mais específica, a mencionada segunda molécula de Fab compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 3 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 7.

[0047] Em uma realização específica adicional da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, a molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células alvo, particularmente CD20, compreende a região de determinação da complementaridade de cadeia pesada (CDR) 1 de SEQ ID N° 46, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 47, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 48, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 49, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 50 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 51. Em uma realização ainda mais específica, a molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células alvo, particularmente CD20, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 30 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31. Em uma realização específica, a primeira (e, quando presente, a terceira) molécula de Fab compreendida na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção liga-se especificamente a CD20 e compreende a região de determinação da complementaridade de cadeia pesada (CDR) 1 de SEQ ID N° 46, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 47, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 48, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 49, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 50 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 51. Em uma realização ainda mais específica, a mencionada primeira (e, quando presente, a mencionada terceira) molécula de Fab compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 30 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31.

[0048] Em um aspecto específico, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, que compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; c. uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; e d. um domínio Fc composto de primeira e segunda subunidades capazes de associação estável; em que: i. o primeiro antígeno é CD20 e o segundo antígeno é CD3, particularmente CD3 epsilon; ii. cada uma dentre a primeira molécula de Fab em (a) e a terceira molécula de Fab em (c) compreende a região de determinação de complementaridade (CDR) de cadeia pesada 1 de SEQ ID N° 46, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 47, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 48, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 49, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 50 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 51 e a segunda molécula de Fab em (b) compreende a CDR 1 de cadeia pesada de SEQ ID N° 4, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 5, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 6, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 8, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 9 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 10; iii. no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R), particularmente por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e iv. a primeira molécula de Fab em (a) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab em (b) e cada uma dentre a segunda molécula de Fab em (b) e a terceira molécula de Fab em (c) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em (d).

[0049] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, que compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; c. uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno; e d. um domínio Fc composto de primeira e segunda subunidades capazes de associação estável; em que: i. o primeiro antígeno é CD20 e o segundo antígeno é CD3, particularmente CD3 epsilon; ii. cada uma dentre a primeira molécula de Fab em (a) e a terceira molécula de Fab em (c) compreende a região de determinação de complementaridade (CDR) de cadeia pesada 1 de SEQ ID N° 46, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 47, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 48, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 49, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 50 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 51 e a segunda molécula de Fab em (b) compreende a CDR 1 de cadeia pesada de SEQ ID N° 4, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 67, a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 6, a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 68, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 9 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 10; iii. no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R), particularmente por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) e da terceira molécula de Fab em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e iv. a primeira molécula de Fab em (a) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab em (b) e cada uma dentre a segunda molécula de Fab em (b) e a terceira molécula de Fab em (c) é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em (d).

[0050] Segundo outro aspecto da presente invenção, são fornecidos um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção. A presente invenção fornece ainda um ou mais vetores de expressão que compreendem o(s) polinucleotídeo(s) isolado(s) de acordo com a presente invenção e uma célula hospedeira que compreende o(s) polinucleotídeo(s) isolado(s) ou o(s) vetor(es) de expressão de acordo com a presente invenção. Em algumas realizações, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente uma célula de mamífero.

[0051] Em outro aspecto, é fornecido um método de produção da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, que compreende as etapas de (a) cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção sob condições apropriadas para a expressão da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T e (b) recuperação da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T. A presente invenção também engloba uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T produzida por meio do método de acordo com a presente invenção.

[0052] A presente invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0053] Também são englobados pela presente invenção métodos de utilização da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T e da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T ou composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para uso como medicamento. Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de doenças em indivíduos dela necessitados. Em uma realização específica, a doença é câncer.

[0054] Também é fornecido o uso de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção para a fabricação de medicamentos para o tratamento de doenças em indivíduos dela necessitados; bem como um método de tratamento de doenças em indivíduos, que compreende a administração ao mencionado indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção em forma farmaceuticamente aceitável. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em qualquer das realizações acima, o indivíduo é preferencialmente mamífero, particularmente ser humano.

[0055] A presente invenção também fornece um método de indução da lise de células alvo, particularmente células de tumores, que compreende o contato de células alvo com uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção na presença de células T, particularmente células T citotóxicas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0056] Figura 1: exemplos de configurações das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (TCBs) de acordo com a presente invenção. (A, D) Ilustração da molécula “1+1 CrossMab”. (B, E) Ilustração da molécula "2+1 IgG Crossfab" com ordem alternativa de componentes Crossfab e Fab ("invertidos"). (C, F) Ilustração da molécula “2+1 IgG Crossfab”. (G, K) Ilustração da molécula "1+1 IgG Crossfab" com ordem alternativa de componentes Crossfab e Fab ("invertidos"). (H, L) Ilustração da molécula “1+1 IgG Crossfab”. (I, M) Ilustração da molécula “2+1 IgG Crossfab” com dois CrossFabs. (J, N) Ilustração da molécula “2+1 IgG Crossfab” com dois CrossFabs e ordem alternativa de componentes Crossfab e Fab (“invertidos”). (O, S) Ilustração da molécula “Fab-Crossfab”. (P, T) Ilustração da molécula “Crossfab-Fab”. (Q, U) Ilustração da molécula “(Fab)2-Crossfab”. (R, V) Ilustração da molécula “Crossfab-(Fab)2”. (W, Y) Ilustração da molécula "Fab- (Crossfab)2". (X, Z) Ilustração da molécula “(Crossfab)2-Fab”. Black dot: modificação opcional do domínio Fc promotor da heterodimerização. ++, --: aminoácidos de cargas opostas introduzidas nos domínios CH e CL.

[0057] Figura 2: ilustração dos TCBs preparados no Exemplo 1. (A) “2+1 IgG CrossFab, invertido” sem modificações de carga (troca de CH1/CL em aglutinante CD3), (B) “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinante de CD3, modificação de carga em aglutinantes CD20, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (C) “2+1 IgG CrossFab” com modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes CD20, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (D) “2+1 IgG CrossFab, invertido” sem modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinante CD3), (E) “2+1 IgG CrossFab, invertido” sem modificações de carga (troca de VH-CH1/VL-CL em aglutinante CD3), (F) “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinantes CD20, modificação de carga em aglutinante CD3, EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K), (G) “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga e mutação de DDKK em região Fc (troca de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes CD20, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (H) “1+1 CrossMab” com modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinante CD20, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (I) “1+1 CrossMab” com modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinante CD20, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K, aglutinante CD20 diferente), (J) “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga 213E, 123R (troca de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinante CD20, E = 213E; R = 123R), (K) “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga (troca de VH/VL e modificação de carga em aglutinante CD3).

[0058] Figura 3: (A-I, N, O) análise CE-SDS dos TCBs preparados no Exemplo 1 (purificações purificadas finais). (A) Eletroferograma da molécula “A”, exibido na Figura 2A, (B) eletroferograma da molécula ”B”, exibido na Figura 2B, (C) eletroferograma da molécula “C”, exibido na Figura 2C, (D) eletroferograma da molécula ”D”, exibido na Figura 2D, (E) eletroferograma da molécula ”E”, exibido na Figura 2E, (F) eletroferograma da molécula ”F”, exibido na Figura 2F, (G) eletroferograma da molécula ”G”, exibido na Figura 2G, (H) eletroferograma da molécula ”H”, exibido na Figura 2H, (I) eletroferograma da molécula ”I”, exibido na Figura 2I, (N) eletroferograma da molécula ”J”, exibido na Figura 2J, (O) eletroferograma da molécula ”K”, exibido na Figura 2K. Linha A = não reduzido, linha B = reduzido. (J-L, P, Q) Análise SDS-PAGE de TCBs preparados no Exemplo 1 após a primeira etapa de purificação (cromatografia de afinidade de Proteína A). (J) 4-12% Bis-Tris SDS- PAGE, não reduzido; linha 1 = marcador (Marca 12, padrão não manchado, Invitrogen); linha 2-11 = frações de cromatografia de afinidade de Proteína A da molécula B, (K) 3-8% Tris-Acetato SDS-PAGE, não reduzido; linha 1 = marcador (HiMark, Invitrogen); linha 2-12 = frações de cromatografia de afinidade de Proteína A da molécula C, (L) 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE, não reduzido; linha 1 = marcador (Marca 12, padrão não manchado, Invitrogen); linha 2-14 = frações de cromatografia de afinidade de Proteína A da molécula D, (P) 4-12% Bis/Tris SDS PAGE, não reduzido; linha 1 = marcador (Marca 12, Invitrogen); linha 2-10 = frações de cromatografia de afinidade de Proteína A da molécula J, (Q) 4-12% Bis/Tris SDS PAGE, não reduzido; linha 1 = marcador (Marca 12, Invitrogen); linha 2-12 = frações de cromatografia de afinidade de Proteína A da molécula K. (M) Cromatografia de exclusão de tamanhos preparativa (SEC; primeira etapa de purificação) de TCBs preparados no Exemplo 1 (molécula A (primeira etapa de SEC), B e D, conforme indicado).

[0059] Figura 4: ligação de CD3 e CD20 de anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-CD20 (“TCB CD20”) com ou sem modificações de carga (“resíduos de carga”) (vide o Exemplo 1).

[0060] Figura 5: lise de células de tumor induzida por anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-CD20 (“TCB CD20”) com ou sem modificações de carga (“resíduos de carga”) mediante incubação por 22 horas com PBMCs humanas (vide o Exemplo 1).

[0061] Figura 6: ativação de células T CD8+ (A) ou células T CD4+ (B) mediante morte mediada por células T de células alvo de tumores que expressam CD20 (Nalm-6) induzidas por anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-CD20 (“TCB CD20”) com ou sem modificações de carga (“resíduos de carga”) (vide o Exemplo 1).

[0062] Figura 7: ativação de células T CD8+ (A) ou células T CD4+ (B) mediante morte mediada por células T de células alvo de tumores que expressam CD20 (Z-138) induzidas por anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-CD20 (“TCB CD20”) com ou sem modificações de carga (“resíduos de carga”) (vide o Exemplo 1).

[0063] Figura 8: esgotamento de células B em sangue integral humano saudável mediante incubação com anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-CD20 (“TCB CD20”) com ou sem modificações de carga (“resíduos de carga”); teste de 22 horas (vide o Exemplo 1).

[0064] Figura 9: ativação de células T CD8+ (A) ou células T CD4+ (B) mediante morte mediada por células T de células B que expressam CD20 em sangue integral saudável humano induzidas por anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-CD20 (“TCB CD20”) com ou sem modificações de carga (“resíduos de carga”) (vide o Exemplo 1).

[0065] Figura 10: ligação de TCB anti-CD20/anti-CD3 (molécula “B” exibida na Figura 2B) a células alvo que expressam CD20 (A) e CD3 (B) humanas.

[0066] Figura 11: ligação de TCB anti-CD20/anti-CD3 (molécula “B” exibida na Figura 2B a células alvo que expressam CD20 e CD3 humanas e de macacos cynomolgus. (A) Células B, (B) células T CD4 e (C) células T CD8.

[0067] Figura 12: lise de células de tumores mediada por diferentes formatos de anticorpos TCB anti-CD20/anti-CD3.

[0068] Figura 13: lise de células de tumores e ativação de células T subsequente mediada por diferentes formatos de anticorpos TCB anti- CD20/anti-CD3. (A-C) Lise de células alvo de tumor Z138 por células efetoras PBMC de três doadores humanos diferentes. (D) Lise de um quadro de linhagens de células de tumores DLBCL conforme indicado.

[0069] Figura 14: esgotamento de células B em sangue integral humano mediado por diferentes formatos de anticorpos TCB anti-CD20/anti- CD3.

[0070] Figura 15: ativação de células T por diferentes formatos de TCB anti-CD20/anti-CD3, testados por meio de quantificação da intensidade de sinalização abaixo no fluxo de CD3 utilizando teste relator de Jurkat-NFAT.

[0071] Figura 16: parâmetros farmacocinéticos de administração de mistura intravenosa de 0,5 mg/kg de anticorpo TCB anti-CD20/anti-CD3 (molécula “B” exibida na Figura 2B) de dados de amostragem esparsos em camundongos NOG.

[0072] Figura 17: representação esquemática do projeto de estudo para determinar a atividade de esgotamento de células B de anticorpo TCB anti-CD20/anti-CD3 (molécula "B" exibida na Figura 2B) em camundongos NOG totalmente humanizados.

[0073] Figura 18: cinética de frequência de células B e células T no sangue de camundongos NOG totalmente humanizados tratados com (B) anticorpo TCB anti-CD20/anti-CD3 (molécula “B” exibida na Figura 2B) ou (A) veículo controle. D0, D7: dias de injeção de terapia.

[0074] Figura 19: análise da expressão de diferentes marcadores da superfície sobre células T periféricas três dias (D3) e dez dias (D10) após a injeção de veículo (barras pretas) ou anticorpo TCB anti-CD20/anti-CD3 (molécula “B” exibida na Figura 2B) (barras brancas) em camundongos totalmente humanizados.

[0075] Figura 20: análise da frequência de células B (A), frequência de células T (B) e expressão de marcadores da superfície sobre células T (C) no baço de veículo (barras pretas) ou camundongos totalmente humanizados tratados com anticorpo TCB anti-CD20/anti-CD3 (molécula “B” exibida na Figura 2B) (barras brancas) ao término do estudo (D10 após a primeira injeção terapêutica).

[0076] Figura 21: atividade antitumores de anticorpo TCB anti- CD20/anti-CD3 (molécula “B” exibida na Figura 2B) (0,5 mg/kg, uma vez por semana) no modelo WSU-DLCL2 em camundongos NOG com transferência de huPBMC.

[0077] Figura 22: ilustração das moléculas “2+1 IgG CrossFab, invertido” preparadas no Exemplo 2. (1) Molécula sem modificações de carga, (2) molécula com modificações de carga nos domínios CH1 e CL das moléculas de Fab que se ligam especificamente a BCMA (EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K).

[0078] Figura 23: análise de CE-SDS (linha A = não reduzido, linha B = reduzido, tabela de pico para a linha A) de moléculas “2+1 IgG CrossFab, invertido” utilizadas no Exemplo 2. Diferentes métodos de purificação (cromatografia de afinidade de Proteína A (PA), cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC), cromatografia de intercâmbio de cátions (cIEX) e uma etapa cromatográfica de exclusão de tamanhos final (re-SEC)) foram aplicados para a molécula sem modificações de carga (83A10-TCB) e a molécula com modificações de carga (83A10-TCBcv).

[0079] Figura 24: análise CE-SDS (linha A = não reduzido, linha B = reduzido, tabela de pico para a linha A) de moléculas “2+1, IgG CrossFab, invertido” utilizadas no Exemplo 2, em comparação cabeça a caberça (H2H) após etapas de purificação por cromatografia de afinidade de Proteína A (PA) e cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC).

[0080] Figura 25: análise de citometria de fluxo de ligação de anticorpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 a linhagens de células de mieloma múltiplo positivas para BCMA. (A) 83A10-TCB sobre células H929 e células MKN45, (B) 83A10-TCBcv sobre células H929 e células MKN45, (C) comparação de 83A10-TCB e 83A10-TCBcv sobre células H929.

[0081] Figura 26: morte de células de mieloma H929 positivas para BCMA por anticorpos TCB anti-BCMA/anti-CD3 ((A) 83A10-TCB, (B) 83A10-TCBcv), conforme medido por meio da liberação de LDH.

[0082] Figura 27: ilustração dos TCBs preparados no Exemplo 3. (A) “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes Her2, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (B) “2+1 IgG CrossFab” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes Her3, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K).

[0083] Figura 28: análise CE-SDS dos TCBs preparados no Exemplo 3 (purificação purificada final). (A) Eletroferograma de TCB Her2, exibido na Figura 27A, (B) eletroferograma de TCB Her3, exibido na Figura 27B. Linha A = não reduzido, linha B = reduzido.

[0084] Figura 29: ligação de TCB Her2 (A) e TCB Her3 (B) a células, conforme determinado por meio de FACS. Intensidades de fluorescência média para ligação da molécula de TCB Her2 a CD3 humano sobre células Jurkat (esquerda) ou a Her2 (A) ou Her3 (B) humano sobre células KPL-4 (direita), conforme medido por meio de citometria de fluxo. São ilustrados valores de fluorescência média, com base em triplicatas, incluindo desvio padrão.

[0085] Figura 30: ativação de células T por meio de TCB Her3. Mediante coincubação de células efetoras PBMC humanas, células alvo KPL-4 e concentrações crescentes do TCB Her3, o percentual de células T CD8 positivas CD69 foi medido por meio de FACS após 48 horas. São exibidas triplicatas com desvio padrão.

[0086] Figura 31: ativação de células Jurkat por meio de CD3 após cinco horas, conforme determinado por meio de luminescência. Mediante incubação de células de tumor KPL4 com células relatoras Jurkat-NFAT (E:T 5:1 (A) ou 2,5:1 (B)) e aumento das concentrações de TCB Her2 (A) ou TCB Her3 (B), determinou-se a ativação de Jurkats por sinais luminescentes relativos (RLUS) após cinco horas. Os valores EC50 foram calculados por meio de Graph Pad Prism (34,4 pM (A) e 22 pM (B)). São ilustrados valores médios de triplicatas e as barras de erro indicam desvio padrão.

[0087] Figura 32: (A, B) lise de células de tumores, conforme medido por meio de liberação de LDH, mediante incubação de células alvo KPL4, N87, T47D ou MDA-MB-231 positivas para Her2 com células efetoras PBMC humanas (E:T 10:1) e concentrações crescentes da molécula de TCB Her2 por 25 horas (A) ou 46 horas (B). São ilustrados valores médios de triplicatas e as barras de erro indicam desvio padrão. Os valores de EC50 foram calculados por meio de GraphPadPrism: 7,5 pM (células KPL4), 25,6 pM (células N87), 30,6 pM (células T47D) e 59,9 pM (células MDA-MB-231). (C) Lise de células de tumores, conforme medido por meio de liberação de LDH, mediante incubação de células alvo KPL4 positivas para Her3 com células efetoras PBMC humanas (E:T 10:1) e concentrações crescentes da molécula de TCB Her3 por 24 horas ou 48 horas, conforme indicado. São ilustrados valores médios de triplicatas e as barras de erro indicam desvio padrão. Os valores de EC50 foram calculados por meio de GraphPadPrism: 2,54 pM (24 horas) e 0,53 pM (48 horas).

[0088] Figura 33: lise de células de tumor, induzida por TCB Her3, conforme determinado pela atividade de Caspase 3/7 (luminescência). É exibido o sinal de luminescência relativa, que foi medido em consequência da atividade de Caspase 3/7 em células alvo KPL-4-Caspase-3/7 GloSensor após 6,5 horas de coincubação com PBMCs (E:T = 10:1) e concentrações diferentes de TCB Her3, conforme indicado. São exibidas triplicatas com desvio padrão. O valor de EC50 foi calculado por meio de GraphPadPrism: 0,7 pM.

[0089] Figura 34: ilustração dos TCBs preparados no Exemplo 4. (A) “(Fab)2-CrossFab” com modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes de MCSP, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (B) "(Fab)2-CrossFab" sem modificações de carga (troca de VH/VL em aglutinante CD3).

[0090] Figura 35: análise CE-SDS de TCB com modificações de carga preparadas no Exemplo 4 (purificação purificada final). Eletroferograma de (Fab)2-XFab-LC007cv, exibido na Figura 34A. Linha A = não reduzido, linha B = reduzido.

[0091] Figura 36: intensidades de fluorescência média para ligação das moléculas de TCB a MCSP humano sobre células MV-3 (esquerda) ou CD3 humano sobre células Jurkat (direita), conforme medido por meio de citometria de fluxo. São ilustrados valores de fluorescência média, com base em triplicatas, incluindo desvio padrão.

[0092] Figura 37: lise de células de tumores, conforme medido por meio de liberação de LDH, mediante incubação de células MV-3 positivas para MCSP humanas com células efetoras PBMC humanas (E:T 10:1) e concentrações crescentes das moléculas de TCB por 24 horas (esquerda) ou 48 horas (direita). São ilustrados valores médios de triplicatas e as barras de erro indicam desvio padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0093] Os termos são utilizados no presente da forma geralmente utilizada na técnica, a menos que definido em contrário a seguir.

[0094] Da forma utilizada no presente, a expressão “molécula que se liga a antígeno” designa, no seu sentido mais amplo, uma molécula que liga especificamente um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação de antígenos são imunoglobulinas e seus derivados, tais como fragmentos.

[0095] O termo “biespecífico” indica que a molécula de ligação de antígenos é capaz de ligar-se especificamente a pelo menos dois determinantes antigênicos distintos. Tipicamente, uma molécula de ligação de antígenos biespecífica compreende dois locais de ligação de antígenos, cada um dos quais é específico para um determinante antigênico diferente. Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecífica é capaz de ligar simultaneamente dois determinantes antigênicos, particularmente dois determinantes antigênicos expressos sobre duas células distintas.

[0096] O termo “valente”, da forma utilizada no presente, indica a presença de uma quantidade especificada de locais de ligação de antígenos em uma molécula de ligação de antígenos. Desta forma, a expressão “ligação monovalente a antígeno” indica a presença de um (e não mais de um) local de ligação de antígenos específico para o antígeno na molécula de ligação de antígenos.

[0097] “Local de ligação de antígenos” designa o local, ou seja, um ou mais resíduos de aminoácidos, de uma molécula de ligação de antígenos que fornece interação com o antígeno. O local de ligação de antígenos de um anticorpo compreende, por exemplo, resíduos de aminoácidos das regiões de determinação da complementaridade (CDRs). Uma molécula de imunoglobulina nativa tipicamente possui dois locais de ligação de antígenos e uma molécula de Fab tipicamente possui um único local de ligação de antígeno.

[0098] Da forma utilizada no presente, a expressão “molécula que se liga a antígeno” designa uma molécula de polipeptídeo que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em uma realização, uma porção de ligação de antígeno é capaz de dirigir a entidade à qual é ligada (por exemplo, uma segunda porção de ligação de antígeno) a um local alvo, tal como um tipo específico de célula de tumor ou estroma de tumor que posui o determinante antigênico. Em outra realização, uma porção de ligação de antígenos é capaz de ativar a sinalização por meio do seu antígeno alvo, tal como um antígeno complexo de receptores de células T. Porções de ligação de antígenos incluem anticorpos e seus fragmento conforme definido adicionalmente no presente. Porções de ligação de antígenos específicas incluem um domínio de ligação de antígenos de um anticorpo, que compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma região variável de cadeia leve de anticorpo. Em certas realizações, as porções de ligação de antígenos podem compreender regiões constantes de anticorpos, conforme definido adicionalmente no presente e conhecido na técnica. Regiões constantes de cadeia pesada úteis incluem qualquer um dos cinco isotipos: α, δ, ε, Y ou μ. Regiões constantes de cadeia leve úteis incluem qualquer um dos dois isotipos: K e À.

[0099] Da forma utilizada no presente, a expressão “determinante antigênico” é sinônimo de “antígeno” e “epítopo” e designa um local (tal como um estiramento contíguo de aminoácidos ou uma configuração de conformação composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) sobre uma macromolécula de polipeptídeo à qual se liga uma porção de ligação de antígeno, formando um complexo de antígeno e porção de ligação de antígeno. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, sobre as superfícies de células de tumores, sobre as superfícies de células infectadas por vírus, sobre as superfícies de outras células doentes, sobre a superfície de células imunes, livres em soro sanguíneo e/ou na matriz extracelular (ECM). As proteínas indicadas como antígenos no presente (por exemplo, CD3) podem ser qualquer forma nativa das proteínas de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (tais como ratos e camundongos), a menos que indicado em contrário. Em uma realização específica, o antígeno é uma proteína humana. Ao fazer-se referência a uma proteína específica no presente, o termo engloba a proteína não processada “com comprimento total”, bem como qualquer forma da proteína resultante do processamento na célula. O termo também engloba variantes da proteína de ocorrência natural, tais como variantes divididas ou variantes alélicas. Um exemplo de proteína humana útil como antígeno é CD3, particularmente a subunidade épsilon de CD3 (vide UniProt n° P07766 (versão 130), NCBI RefSeq n° NP_000724.1, SEQ ID N° 1 para a sequência humana; ou UniProt n° Q95LI5 (versão 49), NCBI GenBank n° BAB71849.1, SEQ ID N° 2 para a sequência de cynomolgus (Macaca fascicularis)). Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção liga-se a um epítopo de CD3 ou um antígeno de células alvo que é conservado entre o antígeno de célula alvo ou CD3 de diferentes espécies.

[00100] Por “liga-se especificamente”, indica-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada de interações indesejadas e não específicas. A capacidade de uma porção de ligação de antígeno de ligar- se a um determinante antigênico específico pode ser medida por meio de um teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA) ou outros métodos familiares dos técnicos no assunto, tais como método de ressonância de plasma de superfície (SPR) (analisado em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al, Glyco J. 17, 323-329 (2000)) e testes de ligação tradicionais (Heeley, Endocr. Res. 28, 217-229 (2002)). Em uma realização, a extensão de ligação de uma porção de ligação de antígenos até uma proteína não relacionada é de menos de cerca de 10% da ligação da porção de ligação de antígenos ao antígeno medido, por exemplo, por meio de SPR. Em certas realizações, uma porção de ligação de antígenos que se liga ao antígeno ou uma molécula de ligação de antígenos que compreende aquela porção de ligação de antígenos possui constante de dissociação (KD) de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (tal como 10-8 M ou menos, por exemplo de 10-8 M a 10-13 M, tal como, de 10-9 M a 10-13 M).

[00101] “Afinidade” designa a resistência da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (tal como um receptor) e seu parceiro de ligação (tal como um ligante). A menos que indicado em contrário, da forma utilizada no presente, “afinidade de ligação” designa afinidade de ligação intrínseca que reflete interação 1:1 entre membros de um par de ligação (tal como uma porção de ligação de antígenos e antígeno ou um receptor e seu ligante). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (KD), que é a razão entre constantes de taxa de associação e dissociação (koff e kon, respectivamente). Desta forma, afinidades equivalentes podem compreender diferentes constantes de velocidade, desde que a razão entre as constantes de velocidade permaneça a mesma. A afinidade pode ser medida por meio de métodos bem estabelecidos na técnica, incluindo os descritos no presente. Um método específico de medição da afinidade é ressonância de plasma de superfície (SPR).

[00102] “Ligação reduzida”, tal como ligação reduzida a um receptor Fc, designa redução da afinidade de PAra a interação correspondente, conforme medido, por exemplo, por meio de SPR. Por clareza, o termo também inclui redução da afinidade a zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), ou seja, eliminação completa da interação. Por outro lado, “aumento da ligação” designa aumento da afinidade de ligação para a interação correspondente.

[00103] “Antígeno de células T ativadoras”, da forma utilizada no presente, designa um determinante antigênico expresso sobre a superfície de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, que é capaz de induzir a ativação de células T mediante interação com uma molécula de ligação de antígenos. Especificamente, a interação de uma molécula de ligação de antígenos com um antígeno de células T ativadoras pode induzir a ativação de células T acionando o processo de sinalização do complexo de receptores de células T. Em uma realização específica, o antígeno de células T ativadoras é CD3, particularmente a subunidade épsilon de CD3 (vide UniProt n° P07766 (versão 130), NCBI RefSeq n° NP_000724.1, SEQ ID N° 1 para a sequência humana; ou UniProt n° Q95LI5 (versão 49), NCBI GenBank n° BAB71849.1, SEQ ID N° 2 para a sequência de cynomolgus (Macaca fascicularis)).

[00104] “Ativação de células T”, da forma utilizada no presente, designa uma ou mais reações celulares de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionadas a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citoquinas, liberação de moléculas efetoras citotóxicas, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. As moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção são capazes de induzir a ativação de células T. Testes adequados de medição da ativação de células T são conhecidos na técnica descrita no presente.

[00105] “Antígeno de células alvo”, da forma utilizada no presente, designa um determinante antigênico apresentado sobre a superfície de uma célula alvo, tal como uma célula em um tumor, tal como uma célula de câncer ou célula do estroma de tumor. Em uma realização específica, o antígeno de células alvo é CD20, particularmente CD20 humano (vide UniProt n° P11836).

[00106] Da forma utilizada no presente, os termos “primeiro”, “segundo” ou “terceiro”, com relação a moléculas de Fab etc., são utilizados por conveniência de diferenciação quando existe mais de um de cada tipo de porção. O uso desses termos não se destina a conceder ordem ou orientação específica da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, a menos que seja indicado explicitamente dessa forma.

[00107] “Molécula de Fab” designa uma proteína que consiste do domínio VH e CH1 da cadeia pesada (a “cadeia pesada de Fab”) e o domínio VL e CL da cadeia leve (a “cadeia leve de Fab”) de uma imunoglobulina.

[00108] “Fundido” indica que os componentes (tais como uma molécula de Fab e uma subunidade de domínio Fc) são ligados por ligações de peptídeos, seja diretamente ou por meio de um ou mais ligantes de peptídeos.

[00109] Da forma utilizada no presente, a expressão “fita simples” designa uma molécula que compreende monômeros de aminoácidos ligados linearmente por ligações de peptídeos. Em certas realizações, uma das porções de ligação de antígenos é uma molécula de Fab de fita simples, ou seja, uma molécula de Fab em que a cadeia leve de Fab e a cadeia pesada de Fab são conectadas por um ligante de peptídeos para formar uma única cadeia de peptídeos. Nessa realização específica, o terminal C da cadeia leve de Fab é conectado ao terminal N da cadeia pesada de Fab na molécula de Fab de fita simples.

[00110] Por molécula de Fab “cruzada” (também denominado “Crossfab”), indica-se uma molécula de Fab em que os domínios variáveis da cadeia leve e pesada de Fab são substituídos (ou seja, substituídos entre si), ou seja, a molécula de Fab cruzada compreende uma cadeia de peptídeos composta do domínio variável de cadeia leve VL e do domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 (VL-CH1, na direção terminal N para C) e uma cadeia de peptídeos composta do domínio variável de cadeia pesada VH e do domínio constante de cadeia leve CL (VH-CL, na direção terminal N para C). Para maior clareza, em uma molécula de Fab cruzada na qual os domínios variáveis da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos, em que a cadeia de peptídeos que compreende o domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 é denominada no presente “cadeia pesada” da molécula de Fab cruzada.

[00111] Por outro lado, por molécula de Fab “convencional”, indica-se uma molécula de Fab no seu formato natural, ou seja, que compreende uma cadeia pesada composta dos domínios constante e variável de cadeia pesada (VH-CH1, na direção do terminal N para C) e uma cadeia leve composta dos domínios variável e constante de cadeia leve (VL-CL, em direção do terminal N para C).

[00112] A expressão “molécula de imunoglobulina” designa uma proteína que possui a estrutura de um anticorpo de ocorrência natural. Imunoglobulinas da classe IgG, por exemplo, são glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por dissulfeto. Do terminal N para o C, cada cadeia pesada possui um domínio variável (VH), também denominado domínio pesado variável ou região variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também denominada região constante de cadeia pesada. De forma similar, do terminal N para o C, cada cadeia leve possui um domínio variável (VL), também denominado domínio leve variável ou região variável de cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL), também denominado região constante de cadeia leve. A cadeia pesada de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dentre cinco tipos, denominados α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), Y (IgG) ou μ (IgM), alguns dos quais podem ser adicionalmente divididos em subtipos, tais como yi (IgGi), y2 (IgG2), y3 (IgG3), y4 (IgG4), α1 (IgA1) e α2 (IgA2). A cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dentre dois tipos, denominados capa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante. Uma imunoglobulina consiste essencialmente de duas moléculas de Fab e um domínio Fc, ligados por meio da região de articulação de imunoglobulina.

[00113] O termo anticorpo no presente é utilizado no sentido mais amplo e engloba diversas estruturas de anticorpos, incluindo, mas sem limitações, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígenos desejada.

[00114] “Fragmento de anticorpo” designa uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma parte de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas sem limitações, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de fita simples (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio simples. Para análise de certos fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al, Nat. Med. 9, 129-134 (2003). Para análise de fragmentos de scFv, vide, por exemplo, Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore, eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994); vide também WO 93/16185; e Patentes Norte-Americanas n° 5.571.894 e 5.587.458. Para discusssão de fragmentos de Fab e F(ab')2 que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptores salvos e possuem aumento da meia vida in vivo, vide a Patente Norte-Americana n° 5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação de antígenos que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al, Nat. Med. 9, 129-134 (2003); e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al, Nat. Med. 9, 129-134 (2003). Anticorpos de domínio simples são fragmentos de anticorpos que compreendem, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia pesada ou, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, anticorpo de domíno simples é um anticorpo de domínio simples humano (Domantis, Inc., Waltham MA; vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 6.248.516 B1). Fragmentos de anticorpos podem ser elaborados por meio de diversos métodos, incluindo, mas sem limitações, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente.

[00115] A expressão “domínio de ligação de antígenos” designa a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente a um antígeno e é complementar a ele, no todo ou em parte. Um domínio de ligação de antígenos pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpos (também denominados regiões variáveis de anticorpos). Particularmente, um domínio de ligação de antígenos compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo.

[00116] A expressão “região variável” ou “domínio variável” designa o domínio de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente possuem estruturas similares, em que cada domínio compreende quatro regiões de cadeia principal (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs). Vide, por exemplo, Kindt et al, Kuby Immunology, sexta edição, W. H. Freeman & Co., pág. 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígenos.

[00117] A expressão “região hipervariável” ou “HVR”, da forma utilizada no presente, designa cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que possuem sequência hipervariável e/ou formam circuitos estruturalmente definidos (“circuitos hipervariáveis”). Geralmente, anticorpos com quatro cadeias nativos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2 e H3) e três na VL (L1, L2 e L3). HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos dos circuitos hipervariáveis e/ou das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), em que estas últimas possuem variabilidade de sequências mais alta e/ou estão envolvidas em reconhecimento de antígenos. Com exceção de CDR1 em VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam os circuitos hipervariáveis. Regiões hipervariáveis (HVRs) também são denominadas “regiões de determinação da complementaridade" (CDRs) e essas expressões são utilizadas no presente de forma intercambiável com referência a partes da região variável que formam as regiões de ligação de antígenos. Esta região específica foi descrita por Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991) e por Chothia et al, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos em comparação entre si. A aplicação de qualquer definição para designar CDR de um anticorpo ou suas variantes destina-se, entretanto, a encontrar-se dentro do escopo da expressão conforme definido e utilizado no presente. Os resíduos de aminoácidos apropriados que englobam as CDRs conforme definido por qualquer uma das referências mencionadas acima são descritos abaixo na Tabela 1 como comparação. Os números exatos de resíduos que englobam uma CDR específica variarão, dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Os técnicos no assunto podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR específica, considerando a sequência de aminoácidos de região variável do anticorpo. As sequências de CDR fornecidas no presente são geralmente de acordo com a definição de Kabat. TABELA 1: DEFINIÇÕES DE CDR1 A numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al (vide abaixo). 2 “AbM” com “b” minúsculo conforme utilizado na Tabela 1 designa as CDRs conforme definido pelo software de modelagem de anticorpos “AbM” da Oxford Molecular.

[00118] Kabat et al também definiram um sistema de numeração para sequências de região variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Os técnicos comuns no assunto podem atribuir de forma inequívoca este sistema de “numeração de Kabat” a qualquer sequência de região variável, sem depender de nenhum dado experimental além da própria sequência. Da forma utilizada no presente com relação a sequências de região variáveis, “numeração de Kabat” designa o sistema de numeração descrito por Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991). A menos que especificado em contrário, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em uma região variável de anticorpo são de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[00119] Da forma utilizada no presente, as posições de aminoácidos de todas as regiões constantes e domínios da cadeia leve e pesada são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat descrito em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), denominado no presente “numeração de acordo com Kabat” ou “numeração de Kabat”. Especificamente, o sistema de numeração de Kabat (vide págs. 647-660 de Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)) é utilizado para o domínio constante de cadeia leve CL de isotipo capa e lambda e o sistema de numeração de índice EU de Kabat (vide as págs. 661-723) é utilizado para os domínios constantes de cadeia pesada (CH1, articulação, CH2 e CH3), que é esclarecido adicionalmente no presente por meio de referência a “numeração de acordo com o índice EU de Kabat” neste caso.

[00120] As sequências de polipeptídeos da listagem de sequências não são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Os técnicos comuns no assunto são, entretanto, familiares com a conversão da numeração das sequências da Listagem de Sequências em numeração de Kabat.

[00121] “Estrutura” ou “FR” designa resíduos de domínios variáveis diferentes de resíduos de região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável consiste geralmente de quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de FR e HVR geralmente aparecem na sequência a seguir em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3- H3(L3)-FR4.

[00122] A “classe” de um anticorpo ou imunoglobulina designa o tipo de domínio constante ou região constante de posse da sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados α, δ, ε, Y e μ, respectivamente.

[00123] A expressão “domínio Fc” ou “região Fc” no presente é utilizada para definir uma região terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma parte da região constante. A expressão inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar levemente, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é normalmente definida como estendendo-se a partir de Cys226 ou de Pro230 até o terminal carboxila da cadeia pesada. Anticorpos produzidos por células hospedeiras podem, entretanto, sofrer divisão pós-tradução de um ou mais, particularmente um ou dois aminoácidos do terminal C da cadeia pesada. Um anticorpo produzido por uma célula hospedeira por meio de expressão de uma molécula de ácido nucleico específica que codifica uma cadeia pesada com comprimento total pode incluir, portanto, a cadeia pesada com comprimento total ou pode incluir uma variante dividida da cadeia pesada com comprimento total (também denominada no presente “cadeia pesada variante dividida”). Este pode ser o caso em que os dois aminoácidos com terminal C finais da cadeia pesada são glicina (G446) e lisina (K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). A lisina terminal C (Lys447) ou a glicina terminal C (Gly446) e lisina (K447) da região Fc, portanto, podem ou não estar presentes. As sequências de aminoácidos de cadeias pesadas que incluem domínios Fc (ou uma subunidade de um domínio Fc conforme definido no presente) são indicadas no presente sem dipeptídeo de glicina-lisina terminal C quando não indicado em contrário. Em uma realização da presente invenção, uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado no presente, compreendido em uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, compreende um dipeptídeo de glicina-lisina terminal C adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização da presente invenção, uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado no presente, compreendido em uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, compreende um resíduo de glicina terminal C adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). As composições de acordo com a presente invenção, tais como as composições farmacêuticas descritas no presente, compreendem uma população de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção. A população de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode compreender moléculas que possuem uma cadeia pesada com comprimento total e moléculas que possuem uma cadeia pesada variante dividida. A população de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode consistir de uma mistura de moléculas que contêm uma cadeia pesada com comprimento total e moléculas que contêm uma cadeia pesada variante dividida, em que pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T possuem uma cadeia pesada variante dividida. Em uma realização da presente invenção, uma composição que compreende uma população de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de domínio Fc conforme especificado no presente com um dipeptídeo de glicina-lisina terminal C adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização da presente invenção, uma composição que compreende uma população de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de domínio Fc conforme especificado no presente com um resíduo de glicina terminal C adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização da presente invenção, essa composição compreende uma população de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compostas de moléculas que compreendem uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de domínio Fc conforme especificado no presente; em que as moléculas compreendem uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de domínio Fc conforme especificado no presente com um resíduo de glicina terminal C adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e moléculas que compreendem uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de domínio Fc conforme especificado no presente com um dipeptídeo de glicina-lisina terminal C adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). A menos que especificado em contrário no presente, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD, 1991 (vide também acima). Uma “subunidade” de domínio Fc conforme utilizado no presente designa um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, ou seja, um polipeptídeo que compreende regiões constantes com terminais C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, capazes de autoassociação estável. Uma subunidade de domínio Fc de IgG, por exemplo, compreende IgG CH2 e domínio constante de IgG CH3.

[00124] “Modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc” é uma manipulação da cadeia principal de peptídeos ou das modificações pós-tradução de uma subunidade de domínio Fc que reduz ou evita a associação de um polipeptídeo que compreende a subunidade de domínio Fc com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma associação promotra de modificações, da forma utilizada no presente, inclui particularmente modificações separadas realizadas para cada uma das duas subunidades de domínio Fc cuja associação é desejada (ou seja, a primeira e a segunda subunidade do domínio Fc), em que as modificações são complementares entre si, de forma a promover a associação das duas subunidades de domínio Fc. Uma associação promotora de modificações pode, por exemplo, alterar a estrutura ou carga de uma ou das duas subunidades de domínio Fc, de forma a tornar sua associação estérica ou eletrostaticamente favorável, respectivamente. A (hetero)dimerização ocorre, portanto, entre um polipeptídeo que compreende a primeira subunidade de domínio Fc e um polipeptídeo que compreende a segunda subunidade de domínio Fc, que poderão não ser idênticos no sentido de que os componentes adicionais fundidos a cada uma das subunidades (por exemplo, porções de ligação de antígenos) não são os mesmos. Em algumas realizações, a associação promotora de modificações compreende uma mutação de aminoácidos no domínio Fc, especificamente uma substituição de aminoácidos. Em uma realização específica, a associação promotora de modificações compreende uma mutação de aminoácidos separada, especificamente uma substituição de aminoácidos, em cada uma das duas subunidades do domínio Fc.

[00125] A expressão “funções efetoras” designa as atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptores de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP); secreção de citoquinas, absorção de antígenos mediada por complexo imunológico por células que apresentam antígenos, regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptores de células B); e ativação de células B.

[00126] Da forma utilizada no presente, os termos “elaborar, elaborado, elaboração” são considerados incluindo qualquer manipulação da cadeia principal de peptídeo ou as modificações pós-tradução de um polipeptídeo recombinante ou de ocorrência natuarl ou seu fragmento. Elaboração inclui modificações da sequência de aminoácidos, do padrão de glicosilação ou do grupo de cadeia lateral de aminoácidos individuais, bem como combinações dessas abordagens.

[00127] A expressão “mutação de aminoácido”, da forma utilizada no presente, destina-se a englobar substituições, exclusões, inserções e modificações de aminoácidos. Qualquer combinação de substituição, exclusão, inserção e modificação pode ser realizada para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, tais como redução da ligação a um receptor Fc ou aumento da associação a outro peptídeo. Inserções e exclusões de sequências de aminoácidos incluem exclusões e inserções com terminais amino e/ou carbóxi de aminoácidos. Mutações de aminoácidos específicos são substituições de aminoácidos. Para fins de alterar, por exemplo, as características de ligação de uma região Fc, substituições de aminoácidos não conservadoras, ou seja, que substituem um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades químicas e/ou estruturais diferentes, são particularmente preferidas. Substituições de aminoácidos incluem substituição por aminoácidos não de ocorrência natural ou por derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão (por exemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metil-histidina, ornitina, homosserina e 5-hidroxilisina). Mutações de aminoácidos podem ser geradas utilizando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Métodos genéticos podem incluir mutagênese dirigida a local, PCR, síntese genética e similares. Contempla-se que os métodos de alteração do grupo de cadeia lateral de um aminoácido por meio de métodos diferentes de engenharia genética, tais como modificação química, podem também ser úteis. Diversas designações podem ser utilizadas no presente para indicar a mesma mutação de aminoácido. Substituição de prolina na posição 329 do domínio Fc por glicina, por exemplo, pode ser indiicada como 329G, G329, G329, P329G ou Pro329Gly.

[00128] Da forma utilizada no presente, o termo “polipeptídeo” designa uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeos). O termo “polipeptídeo” designa qualquer cadeia de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Desta forma, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteínas”, “cadeias de aminoácidos” ou qualquer outra expressão utilizada para designar uma cadeia de dois ou mais aminoácidos são incluídos na definição de “polipeptídeo” e o termo “polipeptídeo” pode ser utilizado no lugar de qualquer uma dessas expressões ou de forma intercambiável com elas. O termo “polipeptídeo” também se destina a designar os produtos de modificações após a expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitações, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção e bloqueio conhecidos, divisão proteolítica ou modificação por aminoácidos não de ocorrência natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por meio de tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácidos nucleicos designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo por meio de síntese química. Um polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode ter tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1000 ou mais ou 2000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter estrutura tridimensional definida, embora não necessariamente possuam essa estrutura. Polipeptídeos com estrutura tridimensional definida são denominados dobrados e polipeptídeos que não possuem estrutura tridimensional definida, mas podem adotar uma grande quantidade de conformações diferentes, são denominados não dobrados.

[00129] Por polipeptídeo “isolado” ou sua variante ou derivado, designa-se um polipeptídeo que não se encontra no seu meio natural. Nenhum nível de purificação específico é necessário. Um polipeptídeo isolado, por exemplo, pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos produzidos de forma recombinante e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para os propósitos da presente invenção, bem como polipeptídeos nativos ou recombinantes que tenham sido separados, fracionados ou parcial ou substancialmente purificados por meio de qualquer método apropriado.

[00130] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos”, com relação a uma sequência de polipeptídeos de referência, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma possível sequência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados de alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação do usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TUX510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações nas quais ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente expressa como uma dada sequência de aminoácidos A que possui ou compreende certo percentual de identidade de sequências de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculado conforme segue: 100 vezes a fração X/Y em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliados como coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos entre A e B não será igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos entre B e A. A menos que indicado especificamente em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa de computador ALIGN-2.

[00131] O termo “polinucleotídeo” designa uma molécula ou construção de ácido nucleico isolada, tal como RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus ou DNA de plasmídeos (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação de fosfodiésteres convencional ou uma ligação não convencional (tal como uma ligação de amida, tal como encontrado em ácidos nucleicos de peptídeos (PNA)). A expressão “molécula de ácido nucleico” designa qualquer um ou mais segmentos de ácidos nucleicos, tais como fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo.

[00132] Por molécula de ácido nucleico “isolada” ou polinucleotídeo, indica-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que tenha sido removida do seu ambiente nativo. Um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor, por exemplo, é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcial ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula de polinucleotídeo contida em células que normalmente contêm a molécula de polinucleotídeo, mas a molécula de polinucleotídeo está presente de forma extracromossômica ou em um local cromossômico que é diferente do seu local cromossômico natural. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de acordo com a presente invneção, bem como formas de fitas positivas e negativas e formas de fita dupla. Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda essas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser ou incluir um elemento regulador tal como um promotor, local de ligação de ribossomos ou término de transcrição.

[00133] Por ácido nucleico ou polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 95% "idêntica"a uma sequência de nucleotídeos de referência de acordo com a presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto pelo fato de que a sequência de polinucleotídeos pode incluir até cinco mutações pontuais para cada cem nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser excluídos ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos de até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorer nas posições terminais 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer ponto entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. De forma prática, pode-se determinar convencionalmente se qualquer sequência de polinucleotídeos específica é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção utilizando programas de computador conhecidos, tais como os discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).

[00134] A expressão “conjunto de expressão” designa um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácidos nucleicos especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico específico em uma célula alvo. O conjunto de expressão recombinante pode ser incorporado a um plasmídeo, cromossomo, DNA de mitocôndria, DNA de plastídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a parte de conjunto de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácidos nucleicos a ser transcrita e um promotor. Em certas realizações, o conjunto de expressão de acordo com a presente invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação de antígeno biespecíficas de acordo com a presente invenção ou seus fragmentos.

[00135] A expressão “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônima de “construção de expressão” e designa uma molécula de DNA que é utilizada para introduzir e dirigir a expressão de um gene específico ao qual é associada operativamente em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como estrutura de ácido nucleico autorreprodutora, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual tenha sido introduzido. O vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende um conjunto de expressão. Vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Quando o vetor de expressão estiver dentro da célula alvo, a proteína ou molécula de ácido ribonucleico que é codificada pelo gene é produzida pelo sistema de transcrição e/ou tradução celular. Em uma realização, o vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende um conjunto de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação de antígeno biespecíficas de acordo com a presente invenção ou seus fragmentos.

[00136] As expressões “célula hospedeira”, “linhagem de células hospedeiras” e “cultivo de células hospedeiras” são utilizadas de forma intercambiável e designam células nas quais o ácido nucleico exógeno tenha sido introduzido, incluindo a prole dessas células. As células hospedeiras incluem “transformadores” e “células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a prole delas derivada sem considerar o número de passagens. A prole pode não ter teor de ácido nucleico completamente idêntico a uma célula parental, mas pode conter mutações. Inclui-se no presente prole mutante que possui a mesma função ou atividade biológica conforme selecionado na célula transformada originalmente. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizado para gerar as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos de acordo com a presente invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, tais como células cultivadas de mamíferos, como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongos P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de insetos e células de plantas, para indicar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou tecido animal ou vegetal cultivado.

[00137] “Receptor Fc ativador” é um receptor Fc que, após engajamento por um domínio Fc de um anticorpo, permite eventos de sinalização que estimulam a célula portadora de receptores a realizar funções efetoras. Receptores Fc ativadores humanos incluem FcYRIIIa (CD16a), FCYRI (CD64), FcYRIIa (CD32) e FcαRI (CD89).

[00138] Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) é um mecanismo imunológico que leva à lise de células alvo revestidas por anticorpo por células efetoras imunológicas. As células alvo são células às quais os anticorpos ou seus derivados que compreendem uma região Fc ligam-se especificamente, geralmente por meio da parte de proteína que é terminal N para a região Fc. Da forma utilizada no presente, “ADCC reduzida” é definida como redução da quantidade de células alvo que são lisadas em um dado tempo, em uma dada concentração de anticorpo no meio em volta das células alvo, por meio do mecanismo de ADCC definido acima e/ou aumento da concentração de anticorpo no meio em volta das células alvo, necessário para atingir a lise de um dado número de células alvo em um dado tempo, pelo mecanismo de ADCC. A redução de ADCC é relativa à ADCC, mediada pelo mesmo anticorpo, produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, utilizando os mesmos métodos padrão de produção, purificação, formulação e armazenagem (que são conhecidos dos técnicos no assunto), mas que não foram produzidos. A redução de ADCC mediada por um anticorpo que compreende, no seu domínio Fc, uma substituição de aminoácidos que reduz ADCC, por exemplo, é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo sem essa substituição de aminoácidos no domínio Fc. Testes apropriados para medir ADCC são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, a Patente PCT n° WO 2006/082515 ou Patente PCT n° WO 2012/130831).

[00139] “Quantidade eficaz” de um agente designa a quantidade que é necessária para resultar em alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual é administrada.

[00140] “Quantidade terapeuticamente eficaz” de agente, tal como composição farmacêutica, designa uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado. Quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, reduz, retarda, minimiza ou evita efeitos adversos de doenças.

[00141] “Indivíduo” ou “paciente” é mamífero. Os mamíferos incluem, mas sem limitações, animais domesticados (tais como vacas, carneiros, gatos, cães e cavalos), primatas (tais como seres humanos e primatas não humanos como macacos), coelhos e roedores (tais como camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou paciente é ser humano.

[00142] A expressão “composição farmacêutica” designa uma preparação que se encontra em uma forma que permita que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja efetiva e não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para o paciente a quem a formulação seria administrada.

[00143] “Veículo farmaceuticamente aceitável” designa um ingrediente em uma composição farmacêutica, diferente de ingrediente ativo, que não é tóxico para pacientes. Veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas sem limitações, tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[00144] Da forma utilizada no presente, “tratamento” (e suas variações gramaticais tais como “tratar” ou “tratando”) indica intervenção clínica em tentativa de alterar o curso natural de doença no indivíduo sendo tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o transcurso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas sem limitações, a prevenção da ocorrência ou reincidência de doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhoria ou redução do estado doentio e remissão ou melhoria de prognóstico. Em algumas realizações, as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção são utilizadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a velocidade do progresso de uma doença.

[00145] O termo “bula” é utilizado para designar instruções costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou avisos referentes à utilização desses produtos terapêuticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00146] A presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T com propriedades favoráveis para aplicação terapêutica, particularmente com capacidade de produção aprimorada (por exemplo, com relação à pureza e rendimento). As substituições de aminoácidos em moléculas de Fab compreendidas nas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção são particularmente eficientes na redução do desemparelhamento de cadeias leves com cadeias pesadas não coincidentes (subprodutos do tipo Bence-Jones), que podem ocorrer na produção de moléculas de ligação de antígenos bi/multiespecíficos com base em Fab com intercâmbio de VH/VL em um (ou mais, no caso de moléculas que compreendem mais de duas moléculas de Fab de ligação de antígenos) dos seus braços de ligação (vide também o pedido PCT n° PCT/EP2015/057165, particularmente seus exemplos, incorporado integralmente ao presente como referência).

[00147] Em primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, que compreende: a. uma primeira molécula de Fab que se liga especificamente a um primeiro antígeno; b. uma segunda molécula de Fab que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são substituídos entre si; em que o primeiro antígeno é um antígeno de células T ativadoras e o segundo antígeno é um antígeno de células alvo ou o primeiro antígeno é um antígeno de células alvo e o segundo antígeno é um antígeno de células T ativadoras; e em que: i. no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido com carga positiva (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido com carga negativa (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii. no domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido com carga positiva (numeração de acordo com Kabat), em que, no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b) o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido com carga positiva (numeração de acordo com Kabat) e em que, no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b), o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido com carga negativa (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00148] Segundo a presente invenção, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T não compreende as duas modificações mencionadas em (i) e (ii). Os domínios constantes CL e CH1 da segunda molécula de Fab não são substituídos entre si (ou seja, eles permanecem inalterados).

[00149] Em uma realização da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00150] Em uma realização adicional, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e, no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00151] Em uma realização específica, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00152] Em uma realização mais específica, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00153] Em uma realização ainda mais específica, no domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00154] Em realizações específicas, o domínio constante CL da primeira molécula de Fab em (a) é do isotipo capa.

[00155] Alternativamente, as substituições de aminoácidos de acordo com as realizações acima podem ser realizadas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b) e não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab em (a). Nessas realizações específicas, o domínio constante CL da segunda molécula de Fab em (b) é do isotipo capa.

[00156] A molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno. Em realizações específicas, a mencionada terceira molécula de Fab é idêntica à primeira molécula de Fab em (a). Nessas realizações, as substituições de aminoácidos de acordo com as realizações acima serão realizadas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de cada uma dentre a primeira molécula de Fab e a terceira molécula de Fab. Alternativamente, as substituições de aminoácidos de acordo com as realizações acima podem ser realizadas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda molécula de Fab em (b), mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira molécula de Fab e da terceira molécula de Fab.

[00157] Em realizações específicas, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

FORMATOS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS BIESPECÍFICOS ATIVADORES DE CÉLULAS T

[00158] Os componentes da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T podem ser fundidos entre si em uma série de configurações. Exemplos de configurações são ilustrados na Figura 1.

[00159] Em realizações específicas, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

[00160] Em algumas realizações, a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc.

[00161] Em uma dessas realizações, a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira e da segunda molécula de Fab, o domínio Fc composto de primeira e segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab e a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1G e 1K. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab e a cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[00162] Em outra dessas realizações, a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira e da segunda molécula de Fab, o domínio Fc composto de primeira e segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que cada uma dentre a primeira e a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1A e 1D. A primeira e a segunda molécula de Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou por meio de um ligante de peptídeo. Em uma realização específica, cada uma dentre a primeira e a segunda molécula de Fab é fundida ao domínio Fc por meio de uma região de articulação de imunoglobulina. Em uma realização específica, a região de articulação de imunoglobulina é uma região de articulação de IgG1 humana, particularmente em que o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1.

[00163] Em outras realizações, a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc.

[00164] Em uma dessas realizações, a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira e da segunda molécula de Fab, o domínio Fc composto de primeira e segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab e a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1H e 1L. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab e a cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[00165] As moléculas de Fab podem ser fundidas ao domínio Fc ou entre si diretamente ou através de um ligante de peptídeos, que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de dois a vinte aminoácidos. Ligantes de peptídeos são conhecidos na técnica e descritos no presente. Ligantes de peptídeos não imunogênicos apropriados incluem, por exemplo, ligantes de peptídeos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n ou G4(SG4)n. “n” é geralmente um número inteiro de 1 a 10, tipicamente de 2 a 4. Em uma realização, o mencionado ligante de peptídeo possui comprimento de pelo menos cinco aminoácidos, em uma realização comprimento de 5 a 100 e, em realização adicional, 10 a 50 aminoácidos. Em uma realização, o mencionado ligante de peptídeo é (GxS)n ou (GxS)nGm com G = glicina, S = serina e (x = 3, n = 3, 4, 5 ou 6 e m = 0, 1, 2 ou 3) ou (x = 4, n = 2, 3, 4 ou 5 e m = 0, 1, 2 ou 3), em uma realização x = 4 e n = 2 ou 3 e, em realização adicional, x = 4 e n = 2. Em uma realização, o mencionado ligante de peptídeos é (G4S)2. Um ligante de peptídeos particularmente apropriado para fusão das cadeias leves de Fab da primeira e da segunda molécula de Fab entre si é (G4S)2. Um exemplo de ligante de peptídeos apropriado para conexão das cadeias pesadas de Fab dos primeiro e segundo fragmentos de Fab compreende a sequência (D)-(G4S)2 (SEQ ID N° 11 e 12). Além disso, os ligantes podem compreender (uma parte de) uma região de articulação de imunoglobulina. Particularmente quando uma molécula de Fab for fundida ao terminal N de uma subunidade de domínio Fc, ela pode ser fundida por meio de uma região de articulação de imunoglobulina ou uma de suas partes, com ou sem um ligante de peptídeos adicional.

[00166] Uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T com uma única porção de ligação de antígenos (tal como uma molécula de Fab) capaz de ligação específica a um antígeno de células alvo (por exemplo, conforme exibido na Figura 1A, D, G, H, K e L) é útil, particularmente em casos em que a internalização do antígeno de células alvo seja esperada após a ligação de uma porção de ligação de antígenos com alta afinidade. Nesses casos, a presença de mais de uma porção de ligação de antígenos para o antígeno de células alvo pode aumentar a internalização do antígeno de células alvo, de forma a reduzir a sua disponibilidade.

[00167] Em muitos outros casos, entretanto, será vantajoso ter uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreenda duas ou mais porções de ligação de antígenos (tais como moléculas de Fab) específicas para um antígeno de células alvo (vide os exemplos exibidos nas Figuras 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J, 1M ou 1N), por exemplo, para otimizar o direcionamento para o local alvo ou para permitir a retícula de antígenos de células alvo.

[00168] Consequentemente, em realizações específicas, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao primeiro antígeno. O primeiro antígeno é preferencialmente o antígeno de células alvo. Em uma realização, a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional. Em uma realização, a terceira molécula de Fab é idêntica à primeira molécula de Fab (ou seja, a primeira e a terceira molécula de Fab compreendem as mesmas sequências de aminoácidos de cadeia leve e pesada e possuem a mesma disposição de domínios (ou seja, convencional ou cruzada)). Em uma realização específica, a segunda molécula de Fab liga-se especificamente a um antígeno de células T ativador, particularmente CD3, e a primeira e a terceira molécula de Fab ligam-se especificamente a um antígeno de células alvo.

[00169] Em realizações alternativas, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente uma terceira molécula de Fab que se liga especificamente ao segundo antígeno. Nessas realizações, o segundo antígeno é preferencialmente o antígeno de células alvo. Em uma dessas realizações, a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada (uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si). Em uma dessas realizações, a terceira molécula de Fab é idêntica à segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda e a terceira molécula de Fab compreendem as mesmas sequências de aminoácidos de cadeia leve e pesada e possuem a mesma disposição de domínios (ou seja, convencional ou cruzada)). Em uma dessas realizações, a primeira molécula de Fab liga-se especificamente a um antígeno de células T ativador, particularmente CD3, e a segunda e a terceira molécula de Fab ligam- se especificamente a um antígeno de células alvo.

[00170] Em uma realização, a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc.

[00171] Em uma realização específica, cada uma dentre a segunda e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc e a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira, da segunda e da terceira molécula de Fab, o domínio Fc composto de primeira e segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab e a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc, em que a terceira molécula de fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da segunda unidade do domínio Fc. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1B e 1E (realizações específicas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional, preferencialmente idêntica à primeira molécula de Fab) e nas Figuras 1I e 1M (realizações alternativas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada, preferencialmente idêntica à segunda molécula de Fab). A segunda e a terceira molécula de Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou por meio de um ligante de peptídeos. Em uma realização específica, cada uma dentre a segunda e a terceira molécula de Fab é fundida ao domínio Fc por meio de uma região de articulação de imunoglobulina. Em uma realização específica, a região de articulação de imunoglobulina é uma região de articulação de IgG1 humana, particularmente em que o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab e a cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[00172] Em outra realização, cada uma dentre a primeira e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc e a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira, da segunda e da terceira molécula de Fab, o domínio Fc composto de primeira e segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab e a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc, em que a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1C e 1F (realizações específicas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional, preferencialmente idêntica à primeira molécula de Fab) e nas Figuras 1J e 1N (realizações alternativas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada, preferencialmente idêntica à segunda molécula de Fab). A primeira e a terceira molécula de Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou por meio de um ligante de peptídeos. Em uma realização específica, cada uma dentre a primeira e a terceira molécula de Fab é fundida ao domínio Fc por meio de uma região de articulação de imunoglobulina. Em uma realização específica, a região de articulação de imunoglobulina é uma região de articulação de IgG1 humana, particularmente em que o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Opcionalmente, a cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab e a cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[00173] Em configurações da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T em que uma molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N de cada uma das subunidades do domínio Fc por meio de uma região de articulação de imunoglobulina, as duas moléculas de Fab, as regiões de articulação e o domínio Fc formam essencialmente uma molécula de imunoglobulina. Em uma realização específica, a molécula de imunoglobulina é uma imunoglobulina de classe IgG. Em uma realização ainda mais específica, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG1. Em outra realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG4. Em uma realização específica adicional, a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana. Em outras realizações, a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica ou imunoglobulina humanizada.

[00174] Em algumas realizações da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, a cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab e a cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab são fundidas entre si, opcionalmente por meio de um ligante de peptídeos. Dependendo da configuração da primeira e da segunda molécula de Fab, a cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab pode ser fundida no seu terminal C ao terminal N da cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab ou a cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab pode ser fundida no seu terminal C ao terminal N da cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab. A fusão das cadeias leves de Fab da primeira e da segunda molécula de Fab reduz adicionalmente o desemparelhamento de cadeias leve e pesada de Fab não coincidentes e também reduz a quantidade de plasmídeos necessária para expressão de algumas das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção.

[00175] Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com uma subunidade de domínio Fc (VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)) e um polipeptídeo no qual a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com uma subunidade de domínio Fc (VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve da primeira molécula de Fab (VL(1)- CL(1)). Em certas realizações, os polipeptídeos são ligados covalentemente, por exemplo, por uma ligação de dissulfeto.

[00176] Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com uma subunidade de domínio Fc (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)- CH2-CH3(-CH4)). Em outras realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo no qual a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com uma subunidade de domínio Fc (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)).

[00177] Em algumas dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo de cadeia leve de Fab cruzada da segunda molécula de Fab, em que a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab (VL(1)-CL(1)). Em outras dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeo terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com o polipeptídeo de cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab (VL(2)-CH1(2)- VL(1)-CL(1)) ou um polipeptídeo em que o polipeptídeo de cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)), conforme apropriado.

[00178] A molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com estas realizações pode compreender adicionalmente (i) um polipeptídeo de subunidade de domínio Fc (CH2-CH3(- CH4)) ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada de Fab de uma terceira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com uma subunidade de domínio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo de cadeia leve de Fab de uma terceira molécula de Fab (VL(3)- CL(3)). Em certas realizações, os polipeptídeos são covalentemente ligados, por exemplo, por uma ligação de dissulfeto.

[00179] Em algumas realizações, a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Em algumas dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T não compreende um domínio Fc. Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira e da segunda molécula de Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1O e 1S.

[00180] Em outras realizações, a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Em algumas dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T não compreende um domínio Fc. Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira e da segunda molécula de Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1P e 1T.

[00181] Em algumas realizações, a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab e a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente uma terceira molécula de Fab, em que a mencionada terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Nessas realizações específicas, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional. Em outra dessas realizações, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si. Em algumas dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira, da segunda e da terceira molécula de Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1Q e 1U (realizações específicas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional, preferencialmente idêntica à primeira molécula de Fab).

[00182] Em algumas realizações, a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab e a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente uma terceira molécula de Fab, em que a mencionada terceira molécula de Fab é fundida no terminal N da cadeia pesada de Fab ao terminal C da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Nessas realizações específicas, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si. Nessas outras realizações, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional. Em algumas dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira, da segunda e da terceira molécula de Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a primeira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal N da cadeia pesada de Fab ao terminal C da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1W e 1Y (realizações específicas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada, preferencialmente idêntica à segunda molécula de Fab).

[00183] Em algumas realizações, a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab e a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente uma terceira molécula de Fab, em que a mencionada terceira molécula de Fab é fundida no terminal N da cadeia pesada de Fab ao terminal C da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Nessas realizações específicas, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional. Em outra dessas realizações, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si. Em algumas dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira, da segunda e da terceira molécula de Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal N da cadeia pesada de Fab ao terminal C da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1R e 1V (realizações específicas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional, preferencialmente idêntica à primeira molécula de Fab).

[00184] Em algumas realizações, a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab e a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente uma terceira molécula de Fab, em que a mencionada terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Nessas realizações específicas, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si. Nessas outras realizações, a mencionada terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab convencional. Em algumas dessas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste essencialmente da primeira, da segunda e da terceira molécula de Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes de peptídeos, em que a segunda molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab e a terceira molécula de Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada de Fab ao terminal N da cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab. Essa configuração é ilustrada esquematicamente nas Figuras 1X e 1Z (realizações específicas, em que a terceira molécula de Fab é uma molécula de Fab cruzada, preferencialmente idêntica à primeira molécula de Fab).

[00185] Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo no qual a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve da primeira molécula de Fab (VL(1)-CL(1)).

[00186] Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab (VL(1)-CL(1)).

[00187] Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo no qual a cadeia pesada de Fab de uma terceira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab (VL(1)-CL(1)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente o polipeptídeo de cadeia leve de Fab de uma terceira molécula de Fab (VL(3)-CL(3)).

[00188] Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com a cadeia pesada de Fab de uma terceira molécula de Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve da primeira molécula de Fab (VL(1)-CL(1)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente o polipeptídeo de cadeia leve de Fab de uma terceira molécula de Fab (VL(3)-CL(3)).

[00189] Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo no qual a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com a região variável de cadeia leve de Fab de uma terceira molécula de Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab de uma terceira molécula de Fab (ou seja, a terceira molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab (VL(1)-CL(1)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab de uma terceira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab de uma terceira molécula de Fab (VH(3)-CL(3)).

[00190] Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia leve de Fab de uma terceira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab de uma terceira molécula de Fab (ou seja, a terceira molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região variável de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeo com terminal carbóxi com a região constante de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab (ou seja, a segunda molécula de Fab compreende uma cadeia pesada de Fab cruzada, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a cadeia pesada de Fab da primeira molécula de Fab (VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab da segunda molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab da segunda molécula de Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo de cadeia leve de Fab da primeira molécula de Fab (VL(1)-CL(1)). Em algumas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende adicionalmente um polipeptídeo no qual a região variável de cadeia pesada de Fab de uma terceira molécula de Fab compartilha uma ligação de peptídeos com terminal carbóxi com a região constante de cadeia leve de Fab de uma terceira molécula de Fab (VH(3)-CL(3)).

[00191] Segundo qualquer uma das realizações acima, componentes da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (por exemplo, moléculas de Fab, domínio Fc) podem ser fundidos diretamente ou por meio de vários ligantes, particularmente ligantes de peptídeos que compreendem um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2- 20 aminoácidos, que são descritos no presente ou conhecidos na técnica. Ligantes de peptídeos não imunogênicos apropriados incluem, por exemplo, ligantes de peptídeos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n ou G4(SG4)n, em que n é geralmente um número inteiro de 1 a 10, tipicamente de 2 a 4.

DOMÍNIO FC

[00192] O domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T consiste de um par de cadeias de polipeptídeos que compreende domínios de cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. O domínio Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG), por exemplo, é um dímero, em que cada uma de suas subunidades compreende os domínios constantes de cadeia pesada de IgG CH2 e CH3. As duas subunidades do domínio Fc são capazes de associação estável entre si. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende não mais de um domínio Fc.

[00193] Em uma realização da presente invenção, o domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é um domínio Fc de IgG. Em uma realização específica, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em outra realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Em uma realização mais específica, o domínio Fc é um domíno Fc de IgG4 que compreende uma substituição de aminoácidos na posição S228 (numeração de Kabat), particularmente a substituição de aminoácidos S228P. Esta substituição de aminoácidos reduz a troca de braços de Fab in vivo de anticorpos IgG4 (vide Stubenrauch et al, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Em uma realização específica adicional, o domínio Fc é humano. Um exemplo de sequência de uma região Fc de IgG1 humana é fornecido em SEQ ID N° 13.

[00194] Modificações de domínios Fc promotoras da heterodimerização:

[00195] Moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreendem diferentes moléculas de Fab, fundidas a uma ou à outra das duas subunidades do domínio Fc e, portanto, as duas subunidades do domínio Fc são tipicamente compreendidas em duas cadeias de polipeptídeos não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e a dimerização subsequente geram diversas combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para aumentar o rendimento e a pureza de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T em produção recombinante, será conveniente, portanto, introduzir, no domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, uma modificação promotora da associação dos polipeptídeos desejados.

[00196] Consequentemente, em realizações específicas, o domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende uma modificação promotora da associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O local de interação mais extensa entre proteínas entre as duas subunidades de um domínio Fc de IgG humano encontra-se no domínio CH3 do domínio Fc. Em uma realização, portanto, a mencionada modificação encontra-se no domínio CH3 do domínio Fc.

[00197] Existem diversas abordagens para modificações no domínio CH3 do domínio Fc, a fim de executar a heterodimerização, que são bem descritas, por exemplo, em WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 e WO 2013/096291. Tipicamente, em todas essas abordagens, o domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e o domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc são ambos elaborados de forma complementar, de forma que cada domínio CH3 (ou a cadeia pesada que o compreende) não possa mais homodimerizar-se, mas seja forçado a heterodimerizar-se com o outro domínio CH3 elaborado de forma complementar (de forma que o primeiro e o segundo domínio CH3 heterodimerizem-se e nenhum homodímero entre os dois primeiros ou os dois segundos domínios CH3 seja formado). Essas diferentes abordagens de heterodimerização de cadeias pesadas aprimorada são contempladas como diferentes alternativas em combinação com as modificações de cadeia leve e pesada (substituição de VH e VL em um braço de ligação e introdução de substituições de aminoácidos carregados com cargas opostas na interface CH1/CL) na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, que reduzem o desemparelhamento de cadeias leves e subprodutos do tipo Bence Jones.

[00198] Em uma realização específica, a mencionada modificação promotora da associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc é uma chamada modificação de “botão em orifício”, que compreende uma modificação de “botão” em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação de “orifício” na outra das duas subunidades do domínio Fc.

[00199] A tecnologia de botão em orifício é descrita, por exemplo, em US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al, Prot. Eng. 9, 617-621 (1996) e Carter, J. Immunol. Meth. 248, 7-15 (2001). Geralmente, o método envolve a introdução de uma protuberância (“botão”) na superfície intermediária de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente (“orifício”) na interface de um segundo polipeptídeo, de tal forma que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de forma a promover a formação de heterodímeros e a formação de homodímeros ocultos. Protuberâncias são construídas por meio da substituição de cadeias laterais de aminoácidos pequenas da superfície intermediária do primeiro polipeptídeo por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são criadas na superfície intermediária do segundo polipeptídeo por meio da substituição de cadeias laterais de aminoácidos grandes por menores (por exemplo, alanina ou treonina).

[00200] Consequentemente, em uma realização específica, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui volume de cadeia lateral maior, de forma a gerar uma protuberância no domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade no domínio CH3 da segunda subunidade e, no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui volume de cadeia lateral menor, de forma a gerar uma cavidade no domínio CH3 da segunda subunidade na qual a protuberância no domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.

[00201] Preferencialmente, o mencionado resíduo de aminoácido que possui volume de cadeia lateral maior é selecionado a partir do grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).

[00202] Preferencialmente, o mencionado resíduo de aminoácido que possui volume de cadeia lateral menor é selecionado a partir do grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V).

[00203] A protuberância e a cavidade podem ser elaboradas por meio de alteração do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por meio de mutagênese específica de local ou de síntese de peptídeos.

[00204] Em uma realização específica, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc (a subunidade “botões”), o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W) e, no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (a subunidade “orifício”), o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em uma realização, na segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é adicionalmente substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00205] Em ainda outra realização, na primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de serina na posição 354 é adicionalmente substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo de ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo de cisteína (E356C) e, na segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina na posição 349 é adicionalmente substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). A introdução desses dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte de dissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, J. Immunol. Methods 248, 7-15 (2001)).

[00206] Em uma realização específica, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00207] Em uma realização específica, a molécula de Fab que liga especificamente um antígeno de células T ativadoras é fundida (opcionalmente por meio de uma molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células alvo) à primeira subunidade do domínio Fc (que compreende a modificação “botão”). Sem desejar restrições à teoria, a fusão da molécula de Fab que liga especificamente um antígeno de células T ativadoras à subunidade que contém botão do domínio Fc minimizará (adicionalmente) a geração de moléculas de ligação de antígenos que compreendem duas moléculas de Fab que se ligam a um antígeno de células T ativadoras (choque estérico de dois polipeptídeos que contêm botões).

[00208] Outros métodos de modificação de CH3 para executar a heterodimerização são contemplados como alternativas de acordo com a presente invenção e são descritos, por exemplo, em WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 e WO 2013/096291.

[00209] Em uma realização, é alternativamente utilizada a abordagem de heterodimerização descrita em EP 1870459 A1. Esta abordagem baseia-se na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições de aminoácidos específicas na interface de domínio CH3/CH3 entre as duas subunidades do domínio Fc. Uma realização específica da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção são as mutações de aminoácidos R409D; K370E em um dos dois domínios CH3 (do domínio Fc) e mutações de aminoácidos D399K; E357K no outro dos domínios CH3 do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00210] Em outra realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende a mutação de aminoácido T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e, adicionalmente, mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00211] Em outra realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende as mutações de aminoácidos S354C e T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc ou a mencionada molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende as mutações de aminoácidos Y349C e T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos S354C, T366S, L368A e Y407V nos domínios CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e, adicionalmente, as mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; e E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00212] Em uma realização, é alternativamente utilizada a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2013/157953. Em uma realização, primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido T366K e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido L351D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização adicional, o primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido adicional L351K. Em uma realização adicional, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácido selecionada a partir de Y349E, Y349D e L368E (preferencialmente, L368E) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00213] Em uma realização, é alternativamente utilizada a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2012/058768. Em uma realização, primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366A e K409F. Em uma realização adicional, o segundo domínio CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional na posição T411, D399, S400, F405, N390 ou K392, selecionada, por exemplo, a partir de (a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ou T411W, (b) D399R, D399W, D399Y ou D399K, (c) S400E, S400D, S400R ou S400K, (d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ou F405W, (e) N390R, N390K ou N390D, (f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ou K392E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização adicional, primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos L351Y e Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366V e K409F. Em uma realização adicional, primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366A e K409F. Em uma realização adicional, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente as mutações de aminoácidos K392E, T411E, D399R e S400R (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00214] Em uma realização, é alternativamente utilizada a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2011/143545, por exemplo, com a modificação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste de 368 e 409 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00215] Em uma realização, é alternativamente utilizada a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2011/090762, que também utiliza a tecnologia de botões em orifícios descrita acima. Em uma realização, primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido T366W e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A. Em uma realização, primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido T366Y e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407T (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00216] Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T ou seu domínio Fc é da subclasse IgG2 e utiliza-se alternativamente a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2010/129304.

[00217] Em uma realização alternativa, uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação que media efeitos de direcionamento eletrostático, por exemplo, conforme descrito na patente PCT WO 2009/089004. Geralmente, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades de domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados, de forma que a formação de homodímeros torne-se eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização seja eletrostaticamente favorável. Em uma dessas realizações, primeiro domínio CH3 compreende a substituição de aminoácidos de K392 ou N392 por um aminoácido com carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D), preferencialmente K392D ou N392D) e um segundo domínio CH3 compreende a substituição de aminoácidos de D399, E356, D356 ou E357 por um aminoácido com carga positiva (por exemplo, lisina (K) ou arginina (R), preferencialmente D399K, E356K, D356K ou E357K, de maior preferência D399K e E356K). Em uma realização adicional, o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente a substituição de aminoácidos de K409 ou R409 por um aminoácido com carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D), preferencialmente K409D ou R409D). Em uma realização adicional, o primeiro domínio CH3 compreende adicional ou alternativamente a substituição de aminoácidos de K439 e/ou K370 por um aminoácido com carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D)) (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00218] Em ainda outra realização, é alternativamente utilizada a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2007/147901. Em uma realização, primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos K253E, D282K e K322D e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos D239K, E240K e K292D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00219] Em ainda outra realização, pode-se alternativamente utilizar a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2007/110205.

[00220] Em uma realização, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos D356K e D399K (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

MODIFICAÇÕES DE DOMÍNIO FC REDUTORAS DA FUNÇÃO EFETORA E/OU LIGAÇÃO DE RECEPTORES FC

[00221] O domínio Fc confere à molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T propriedades farmacocinéticas favoráveis, incluindo longa meia vida em soro, que contribui para o bom acúmulo no tecido alvo e razão favorável de distribuição de sangue no tecido. Ao mesmo tempo, ele pode, entretanto, gerar direcionamento indesejável da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T a células que expressam receptores de Fc e não às células portadoras de antígenos preferidas. Além disso, a coativação de processos de sinalização de receptores de Fc pode gerar liberação de citoquinas que, em combinação com as propriedades ativadoras de células T e a meia vida longa da molécula de ligação de antígenos, resulta em ativação excessiva de receptores de citoquinas e severos efeitos colaterais mediante administração sistêmica. Ativação de células imunes (portadoras de receptor Fc) diferentes de células T podem até reduzir a eficácia da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T devido à potencial destruição de células T, por exemplo, por células NK.

[00222] Consequentemente, em realizações específicas, o domínio Fc das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo. Em uma dessas realizações, o domínio Fc (ou a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende o mencionado domínio Fc) exibe menos de 50%, preferencialmente menos de 20%, de maior preferência menos de 10% e, de preferência superior, menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo (ou uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende um domínio Fc de IgG1 nativo) e/ou menos de 50%, preferencialmente menos de 20%, de maior preferência menos de 10% e, de preferência superior, menos de 5% da função efetora, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo (ou uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende um domínio Fc de IgG1 nativo). Em uma realização, o domínio Fc (ou a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende o mencionado domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ou induz a função efetora. Em uma realização específica, o receptor Fc é um receptor FCY. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em uma realização, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em uma realização específica, o receptor Fc é um receptor FCYhumano ativador, mais especificamente FcYRIIIa, FCYRI ou FcYRIIa humano, ainda mais especificamente FcyRIIa humano. Em uma realização, a função efetora é uma ou mais selecionadas a partir do grupo de secreção de citoquinas, ADCP, ADCC e CDC. Em uma realização específica, a função efetora é ADCC. Em uma realização, o domínio Fc exibe afinidade de ligação substancialmente similar a receptor Fc neonatal (FcRn), em comparação com domínio Fc de IgG1 nativo. Atinge-se ligação substancialmente similar a FcRn quando o domínio Fc (ou a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende o mencionado domínio Fc) exibe mais de cerca de 70%, particularmente mais de cerca de 80%, mais especificamente mais de cerca de 90% da afinidade de ligação de um domínio Fc de IgG1 nativo (ou a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende um domínio Fc de IgG1 nativo) a FcRn.

[00223] Em certas realizações, o domínio Fc é elaborado para possuir afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não elaborado. Em realizações específicas, o domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou função efetora. Tipicamente, uma ou mais mutações de aminoácidos idênticas estão presentes em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em uma realização, a mutação de aminoácido reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc. Em uma realização, a mutação de aminoácido reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos duas vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos dez vezes. Em realizações nas quais existe mais de uma mutação de aminoácido que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc ao receptor Fc, a combinação dessas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes ou até pelo menos cinquenta vezes. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende um domínio Fc elaborado exibe menos de 20%, particularmente menos de 10%, mais especificamente menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc em comparação com uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende um domínio Fc não elaborado. Em uma realização específica, o receptor Fc é um receptor FCY. Em algumas realizações, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em algumas realizações, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em uma realização específica, o receptor Fc é um receptor FCY humano ativador, mais especificamente FcYRIIIa, FCYRI ou FcYRIIa humano, ainda mais especificamente FcYRIIIa humano. Preferencialmente, a ligação a cada um desses receptores é reduzida. Em algumas realizações, a afinidade de ligação a um componente de complemento, especificamente a afinidade de ligação a C1q, também é reduzida. Em uma realização, a afinidade de ligação a receptor Fc neonatal (FcRn) não é reduzida. Ligação substancialmente similar a FcRn, ou seja, a preservação da afinidade de ligação do domínio Fc ao mencionado receptor, é atingida quando o domínio Fc (ou a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende o mencionado domínio Fc) exibe mais de cerca de 70% da afinidade de ligação de uma forma não elaborada do domínio Fc (ou a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende a mencionada forma não elaborada do domínio Fc) a FcRn. O domínio Fc ou as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção que compreendem o mencionado domínio Fc podem exibir mais de cerca de 80% e até mais de cerca de 90% dessa afinidade. Em certas realizações, o domínio Fc da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é elaborado para ter função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não elaborado. A função efetora reduzida pode incluir, mas sem limitações, um ou mais dos seguintes: citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) reduzida, fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) reduzida, secreção de citoquinas reduzida, absorção de antígenos mediada por complexo imunológico reduzida por células que apresentam antígenos reduzida, ligação reduzida a células NK, ligação reduzida a macrófagos, ligação reduzida a monócitos, ligação reduzida a células polimorfonucleares, apoptose indutora da sinalização direta reduzida, retícula reduzida de anticorpos ligados a alvos, amadurecimento de células dendríticas reduzido ou primer de células T reduzido. Em uma realização, a função efetora reduzida é uma ou mais selecionadas a partir do grupo de CDC reduzido, ADCC reduzido, ADCP reduzido e secreção de citoquinas reduzida. Em uma realização específica, a função efetora reduzida é ADCC reduzida. Em uma realização, a ADCC reduzida é menos de 20% da ADCC induzida por um domínio Fc não elaborado (ou uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende um domínio Fc não elaborado).

[00224] Em uma realização, a mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou a função efetora é uma substituição de aminoácidos. Em uma realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização mais específica, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em algumas realizações, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma dessas realizações, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humano. Em uma realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329. Em uma realização mais específica, a substituição de aminoácidos é P329A ou P329G, particularmente P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e uma substituição de aminoácidos adicional em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297 e P331 (numerações de acordo com o índice UE de Kabat). Em uma realização mais específica, a substituição de aminoácidos adicional é E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em realizações específicas, o domínio Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em realizações mais específicas, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”). Em uma dessas realizações, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humano. A combinação “P329G LALA” de substituições de aminoácidos elimina quase completamente a ligação de receptor FCY(bem como complemento) de um domínio Fc de IgGi humano, conforme descrito na Patente PCT n° WO 2012/130831, incorporada integralmente ao presente como referência. WO 2012/130831 também descreve métodos de preparação desses domínios Fc mutantes e métodos de determinação das suas propriedades, tais como funções efetoras ou ligação de receptores Fc.

[00225] Anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação reduzida a receptores de Fc e funções efetoras reduzidas em comparação com anticorpos IgG1. Em algumas realizações, portanto, o domíno Fc das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção é um domínio Fc de IgG4, particularmente um domínio Fc de IgG4 humano. Em uma realização, o domínio Fc de IgG4 compreende substituições de aminoácidos na posição S228, especialmente a substituição de aminoácidos S228P (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Para reduzir adicionalmente a sua afinidade de ligação para um receptor Fc e/ou sua função efetora, em uma realização, o domínio Fc de IgG4 compreende uma substituição de aminoácidos na posição L235, especialmente a substituição de aminoácidos L235E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outra realização, o domínio Fc de IgG4 compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329, especialmente a substituição de aminoácidos P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma realização específica, o domínio Fc de IgG4 compreende substituições de aminoácidos nas posições S228, L235 e P329, especificamente substituições de aminoácidos S228P, L235E e P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Esses mutantes de domínios Fc de IgG4 e suas propriedades de ligação de receptor FCYsão descritos na Patente PCT n° WO 2012/130831, incorporada integralmente ao presente como referência.

[00226] Em uma realização específica, o domínio Fc que exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo, é um domínio Fc de IgG1 humano que compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e, opcionalmente, P329G ou um domínio Fc de IgG4 humano que compreende as substituições de aminoácidos S228P, L235E e, opcionalmente, P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00227] Em certas realizações, eliminou-se a N-glicosilação do domínio Fc. Em uma dessas realizações, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos na posição N297, particularmente uma substituição de aminoácidos que substitui asparagina por alanina (N297A) ou ácido aspártico (N297D) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[00228] Além dos domínios Fc descritos acima e na Patente PCT n° WO 2012/130831, os domínios Fc com ligação de receptores Fc e/ou função efetora reduzida também incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos de domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente Norte- Americana n° 6.737.056) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Esses mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais das posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo a chamada mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente Norte-Americana n° 7.332.581).

[00229] Domínios Fc mutantes podem ser preparados por meio de exclusão, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos utilizando métodos químicos ou genéticos bem conhecidos na técnica. Métodos genéticos podem incluir mutagênese específica de local da sequência de DNA codificadora, PCR, síntese genética e similares. As alterações de nucleotídeos corretas podem ser verificadas, por exemplo, por meio de sequenciamento.

[00230] A ligação a receptores de Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por meio de ELISA ou de Ressonância de Plasma de Superfície (SPR) utilizando instrumentação padrão tal como instrumento BIAcore (GE Healthcare) e receptores de Fc como os que podem ser obtidos por meio de expressão recombinante. Esse teste de ligação apropriado é descrito no presente. Alternativamente, a afinidade de ligação de domínios Fc ou moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células que compreendem um domínio Fc para receptores de Fc pode ser avaliada utilizando linhagens celulares conhecidas por expressarem receptores de Fc específicas, tais como células NK humanas que expressam receptor FcYlIIa.

[00231] A função efetora de um domínio Fc ou uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende um domínio Fc pode ser medida por meio de métodos conhecidos na técnica. É descrito no presente um teste apropriado para medir ADCC. Outros exemplos de testes in vitro para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente Norte-Americana n° 5.500.362; Hellstrom et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 1499-1502 (1985); Patente Norte-Americana n° 5.821.337; Bruggemann et al, J. Exp. Med. 166, 1351-1361 (1987). Alternativamente, podem ser empregados métodos de teste não radioativos (vide, por exemplo, teste de citotoxicidade não radioativo para citometria de fluxo ACTI® (Cell Technology, Inc., Mountain View, CA); e teste de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modelo animal como o descrito em Clynes et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 652-656 (1998).

[00232] Em algumas realizações, a ligação do domínio Fc a um componente de complemento, especificamente a C1q, é reduzida. Consequentemente, em algumas realizações em que o domínio Fc é elaborado para ter função efetora reduzida, a mencionada função efetora reduzida inclui CDC reduzida. Testes de ligação de C1q podem ser conduzidos para determinar se a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é capaz de ligar C1q e, portanto, possui atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação de C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202, 163 (1996); Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

PORÇÕES DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS

[00233] A molécula de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção é biespecífica, ou seja, ela compreende pelo menos duas porções de ligação de antígenos capazes de ligação específica a dois determinantes antigênicos distintos. Segundo a presente invenção, as porções de ligação de antígenos são moléculas de Fab (ou seja, domínios de ligação de antígenos compostos de uma cadeia leve e uma pesada, cada qual compreendendo um domínio variável e um constante). Em uma realização, as mencionadas moléculas de Fab são humanas. Em outra realização, as mencionadas moléculas de Fab são humanizadas. Em ainda outra realização, as mencionadas moléculas de Fab compreendem domínios constantes de cadeia leve e pesada humanos.

[00234] Pelo menos uma das porções de ligação de antígenos é uma molécula de Fab cruzada. Essa modificação reduz o desemparelhamento de cadeias leve e pesada de diferentes moléculas de Fab, de forma a aumentar o rendimento e a pureza da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção em produção recombinante. Em uma molécula de Fab cruzada específica útil para a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, os domínios variáveis da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab (VL e VH, respectivamente) são substituídos. Mesmo com essa substituição de domínios, entretanto, a preparação da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode compreender certos subprodutos devido à chamada interação do tipo Bence Jones entre cadeias leves e pesadas desemparelhadas (vide Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Para reduzir adicionalmente o desemparelhamento de cadeias leve e pesada de diferentes moléculas de Fab e, portanto, aumentar a pureza e a produção da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T desejada, segundo a presente invenção, aminoácidos carregados com cargas opostas são introduzidos em posições de aminoácidos específicas nos domínios CH1 e CL da(s) molécula(s) de Fab que se liga(m) especificamente a um antígeno de células alvo ou à molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células T ativadoras. Modificações de carga são realizadas na(s) molécula(s) de Fab convencional(is) compreendida(s) na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (conforme exibido, por exemplo, nas Figuras 1A-C, G-J) ou na(s) molécula(s) de Fab cruzada(s) compreendida(s) na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (conforme exibido, por exemplo, nas Figuras 1D-F, K-N) (mas não em ambas). Em realizações específicas, as modificações de carga são realizadas na(s) molécula(s) de Fab convencional(is) compreendida(s) na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (que, em realizações específicas, liga(m)-se ao antígeno de células alvo).

[00235] Em uma realização específica de acordo com a presente invenção, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é capaz de ligar-se simultaneamente a um antígeno de células alvo, particularmente um antígeno de células de tumor e um antígeno de células T ativadoras, particularmente CD3. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é capaz de reticular uma célula T e uma célula alvo por meio de ligação simultânea a um antígeno de células alvo e um antígeno de células T ativadoras. Em uma realização ainda mais específica, essa ligação simultânea resulta em lise da célula alvo, particularmente células de tumor. Em uma realização, essa ligação simultânea resulta na ativação da célula T. Em outras realizações, essa ligação simultânea resulta em reação celular de linfócitos T, particularmente linfócitos T citotóxicos, selecionados a partir do grupo de: proliferação, diferenciação, secreção de citoquinas, liberação de moléculas efetoras citotóxicas, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Em uma realização, a ligação da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T ao antígeno de células T ativadoras, particularmente CD3, sem ligação simultânea ao antígeno de células alvo, não resulta em ativação de células T.

[00236] Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é capaz de redirecionar a atividade citotóxica de células T a uma célula alvo. Em uma realização específica, o mencionado redirecionamento é independente da apresentação de antígenos de peptídeos mediados por MHC pela célula alvo e/ou especificidade da célula T.

[00237] Particularmente, uma célula T de acordo com qualquer das realizações da presente invenção é uma célula T citotóxica. Em algumas realizações, a célula T é uma célula T CD4+ ou CD8+, particularmente uma célula T CD8+.

ATIVAÇÃO DE MOLÉCULA DE FAB DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS DE CÉLULAST:

[00238] A molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende pelo menos uma molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células T ativadoras (também denominada no presente “molécula de Fab de ligação de antígenos de células T ativadoras”). Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende não mais de uma molécula de Fab (ou outra molécula de Fab) capaz de ligação específia a um antígeno de células T ativadoras. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T fornece ligação monovalente ao antígeno de células T ativadoras.

[00239] Em realizações específicas, a molécula de Fab que liga especificamente um antígeno de células T ativador é uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si. Nessas realizações, a(s) molécula(s) de Fab que liga(m) especificamente um antígeno de células alvo é(são) uma molécula de Fab convencional. Em realizações nas quais existe mais de uma molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células alvo compreendido na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, a molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células T ativadoras é preferencialmente uma molécula de Fab cruzada e as moléculas de Fab que se ligam especificamente a um antígeno de células alvo são moléculas de Fab convencionais.

[00240] Em realizações alternativas, a molécula de Fab que liga especificamente um antígeno de células T ativadoras é uma molécula de Fab convencional. Nessas realizações, a(s) molécula(s) de Fab que liga(m) especificamente um antígeno de células alvo é uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si.

[00241] Em uma realização específica, o antígeno de células T ativadoras é CD3, particularmente CD3 humano (SEQ ID N° 1) ou CD3 de cynomolgus (SEQ ID N° 2), mais especificamente CD3 humano. Em uma realização específica, a molécula de Fab de ligação de antígenos de células T ativadores apresenta reação cruzada (ou seja, liga-se especificamente) a CD3 humano e de cynomolgus. Em algumas realizações, o antígeno de células T ativadoras é a subunidade epsilon de CD3 (CD3 epsilon).

[00242] Em algumas realizações, a molécula de Fab de ligação de antígenos de células T ativadores liga-se especificamente a CD3, particularmente CD3 epsilon, e compreende pelo menos uma região de determinação da complementaridade (CDR) de cadeias pesadas selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 e pelo menos uma CDR de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 e SEQ ID N° 10.

[00243] Em uma realização, a molécula de Fab de ligação de CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID N° 4, a CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 5, a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 6 e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID N° 8, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID N° 9 e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID N° 10.

[00244] Em outra realização, a molécula de Fab de ligação de CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID N° 4, a CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 67, a CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 6 e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR1 de cadeia leve de SEQ ID N° 68, a CDR2 de cadeia leve de SEQ ID N° 9 e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID N° 10.

[00245] Em uma realização, a molécula de Fab de ligação de CD3 compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID N° 3 e uma sequência de região variável de cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID N° 7.

[00246] Em uma realização, a molécula de Fab de ligação de CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 3 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 7.

[00247] Em uma realização, a molécula de Fab de ligação de CD3 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID N° 3 e a sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID N° 7.

MOLÉCULA DE FAB DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS DE CÉLULAS ALVO:

[00248] A molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção compreende pelo menos uma molécula de Fab que se liga especificamente a um antígeno de células alvo (também denominada no presente “molécula de Fab de ligação de antígenos de células alvo”). Em certas realizações, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende duas moléculas de Fab que se ligam especificamente a um antígeno de células alvo. Em uma realização específica, cada uma dessas moléculas de Fab liga-se especificamente ao mesmo determinante antigênico. Em uma realização ainda mais específica, todas essas moléculas de Fab são idênticas, ou seja, elas compreendem as mesmas sequências de aminoácidos que incluem as mesmas substituições de aminoácidos no domínio CH1 e CL conforme descrito no presente (se houver). Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno de células alvo. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende não mais de duas moléculas de Fab que se ligam especificamente a um antígeno de células alvo.

[00249] Em realizações específicas, a(s) molécula(s) de Fab que se liga(m) especificamente a um antígeno de células alvo é(são) uma molécula de Fab convencional. Nessas realizações, a(s) molécula(s) de Fab que liga(m) especificamente um antígeno de células T ativador é(são) uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si.

[00250] Em realizações alternativas, a(s) molécula(s) de Fab que se liga(m) especificamente a um antígeno de células alvo é(são) uma molécula de Fab cruzada conforme descrito no presente, ou seja, uma molécula de Fab na qual os domínios variáveis VH e VL das cadeias pesada e leve de Fab são substituídos entre si. Nessas realizações, a(s) molécula(s) de Fab que liga(m) especificamente um antígeno de células T ativadoras é(são) uma molécula de Fab convencional.

[00251] A molécula de Fab de ligação de antígenos de células alvo liga-se a um determinante antigênico específico e é capaz de dirigir a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T a um local alvo, tal como a um tipo específico de célula de tumor que possui o determinante antigênico.

[00252] Em certas realizações, a molécula de Fab de ligação de antígenos de células alvo liga-se especificamente a um antígeno da superfície celular.

[00253] Em certas realizações, a molécula de Fab de ligação de antígenos de células alvo é dirigida a um antígeno associado a uma condição patológica, tal como um antígeno apresentado sobre uma célula de tumor ou sobre uma célula infectada com vírus. Antígenos de células alvo apropriados são antígenos da superfície celular, tais como, mas sem limitações, receptores da superfície celular. Em realizações específicas, o antígeno de células alvo é um antígeno humano. Exemplos de antígenos de células alvo incluem CD20, Her2, Her3, MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina associado a melanoma, também conhecido como proteoglicano de sulfato de condroitina 4) ou BCMA (alvo de maturação de células B humanas, também conhecido como Membro 17 da Superfamília de Receptores de Fator de Necrose Tumorosa (UniProt Q02223)).

[00254] Em realizações específicas, o antígeno de células alvo é CD20, particularmente CD20 humano. Em uma realização, o antígeno de células alvo é CD20 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a região de determinação da complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada de SEQ ID N° 46, a CDR 2 de cadeia pesada de SEQ ID N° 47 e a CDR 3 de cadeia pesada de SEQ ID N° 48 e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDR 1 de cadeia leve de SEQ ID N° 49, a CDR 2 de cadeia leve de SEQ ID N° 50 e a CDR 3 de cadeia leve de SEQ ID N° 51. Em uma realização adicional, o antígeno de células alvo é CD20 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 30 e uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 31. Em ainda outra realização, o antígeno de células alvo é CD20 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID N° 30 e a sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID N° 31. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 18, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 19, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 20 e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 21. Em uma realização específica adicional, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 18, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 19, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 20 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 21. Em outra realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 32, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 19, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 20 e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 21. Em uma realização adicional, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 32, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 19, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 20 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 21. Em ainda outra realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 36, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 37, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 38 e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 39. Em uma realização adicional, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 36, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 37, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 38 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 39. Em uma realização adicional, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 40, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 41, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 20 e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 21. Em uma realização adicional, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 40, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 41, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 20 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 21.

[00255] Em outras realizações, o antígeno alvo é Her2, particularmente Her2 humano. Em uma realização, o antígeno de células alvo é Her2 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 61 e uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 62. Em uma realização adicional, o antígeno de células alvo é Her2 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID N° 61 e a sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID N° 62. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 21, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 52, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 53 e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 54. Em uma realização adicional, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 21, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 52, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 53 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 54.

[00256] Em outras realizações, o antígeno alvo é Her3, particularmente Her3 humano. Em uma realização, o antígeno de células alvo é Her3 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 63 e uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 64. Em uma realização adicional, o antígeno de células alvo é Her3 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID N° 63 e a sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID N° 64. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 21, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 55, um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 56 e um polipeptídeo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico à sequência de SEQ ID N° 57. Em uma realização adicional, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreende uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 21, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 55, uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 56 e uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID N° 57.

[00257] Em outras realizações, o antígeno alvo é proteoglicano sulfato de condroitina associado a melanoma (MCSP), particularmente MCSP humano. Em uma realização, o antígeno de células alvo é MCSP e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 65 e uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID N° 66. Em uma realização adicional, o antígeno de células alvo é Her2 e a molécula de Fab que se liga especificamente ao mencionado antígeno de células alvo compreende a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID N° 65 e a sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID N° 66.

[00258] Em algumas realizações, o antígeno alvo é BCMA. Em outras realizações, o antígeno de células alvo não é BCMA.

POLINUCLEOTÍDEOS

[00259] A presente invenção fornece adicionalmente polinucleotídeos isolados que codificam uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T conforme descrito no presente ou um de seus fragmentos. Em algumas realizações, o mencionado fragmento é um fragmento de ligação de antígenos.

[00260] Os polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção podem ser expressos na forma de um único polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T completa ou na forma de diversos (por exemplo, dois ou mais) polinucleotídeos que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem ser associados, por exemplo, por meio de ligações de dissulfeto ou outros meios para formar uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T funcionais. A parte de cadeia leve de uma molécula de Fab pode ser codificada, por exemplo, por meio de um polinucleotídeo separado da parte da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende a parte de cadeia pesada da molécula de Fab, uma subunidade de domínio Fc e, opcionalmente, (parte de) outra molécula de Fab. Quando coexpressos, os polipeptídeos de cadeia pesada associar-se-ão aos polipeptídeos de cadeia leve para formar a molécula de Fab. Em outro exemplo, a parte da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende uma das duas subunidades de domínios Fc e, opcionalmente, (parte de) uma ou mais moléculas de Fab poderão ser codificadas por um polinucleotídeo separado da parte da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que compreende a outra das duas subunidades de domínio Fc e, opcionalmente, (parte de) uma molécula de Fab. Quando coexpressas, as subunidades de domínio Fc associar-se-ão para formar o domínio Fc.

[00261] Em algumas realizações, o polinucleotídeo isolado codifica toda a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, conforme descrito no presente. Em outras realizações, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido na molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, conforme descrito no presente.

[00262] Em certas realizações, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outras realizações, um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA de acordo com a presente invenção pode ter fita simples ou fita dupla.

MÉTODOS RECOMBINANTES

[00263] Moléculas de ligação de antígenos biespecificos ativadores de células T de acordo com a presente invenção podem ser obtidas, por exemplo, por meio de síntese de peptídeos em estado sólido (tal como síntese de fase sólida Merrifield) ou produção recombinante. Para produção recombinante, um ou mais polinucleotídeos que codificam a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (fragmento), por exemplo, conforme descrito acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou expressão em uma célula hospedeira. Esse polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e/ou sequenciado utilizando procedimentos convencionais. Em uma realização, é fornecido um vetor, preferencialmente um vetor de expressão, que compreende um ou mais dos polinucleotídeos de acordo com a presente invenção. Métodos que são bem conhecidos dos técnicos no assunto podem ser utilizados para construir vetores de expressão que contêm a sequência de codificação de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (fragmento) em conjunto com sinais de controle de transcrição/tradução apropriados. Estes métodos incluem métodos de DNA recombinante in vitro, métodos sintéticos e recombinação genética/recombinação in vivo. Vide, por exemplo, os métodos descritos em Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989) e Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um conjunto de expressão no qual o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (fragmento) (ou seja, a região de codificação) é clonado em associação operativa com um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou tradução. Da forma utilizada no presente, “região de codificação” é uma parte de ácido nucleico que consiste de códons traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de parada” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em aminoácidos, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, quando presente, mas quaisquer sequências laterais, tais como promotores, locais de ligação de ribossomos, términos de transcrição, introns, regiões não traduzidas 5’ e 3’ e similares, não são parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação podem estar presentes em uma construção de polinucleotídeo isolada, tal como sobre um único vetor, ou em construções de polinucleotídeos separadas, por exemplo, sobre vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação; um vetor de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, codificar um ou mais polipeptídeos, que são separados pós ou em cotradução nas proteínas finais por meio de divisão proteolítica. Além disso, o vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T (fragmento) de acordo com a presente invenção, sua variante ou derivado. Regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitações, motivos ou elementos especializados, tais como um peptídeo de sinal de secreção ou domínio funcional heterólogo. Ocorre associação operativa quando uma região de codificação de um produto genético, tal como um polipeptídeo, é associada a uma ou mais sequências reguladoras, de forma a colocar a expressão do produto genético sob a influência ou o controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região de codificação de polipeptídeos e um promotor a ela associado) são “associados operativamente” caso a indução de função promotora resulte na transcrição de mRNA que codifica o produto genético desejado e caso a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfira com a capacidade das sequências reguladoras da expressão de dirigir a expressão do produto genético nem interfira com a capacidade do modelo de DNA de ser transcrito. Desta forma, uma região promotora seria operativamente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo caso o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de células que dirige a transcrição substancial do DNA somente em células previamente determinadas. Outros elementos de controle de transcrição, além do promotor, tais como aprimoradores, operadores, repressores e sinais de término de transcrição, podem ser associados operativamente ao polinucleotídeo para dirigir a transcrição específica de células. Promotores apropriados e outras regiões de controle da transcrição são descritos no presente. Diversas regiões de controle de transcrição são conhecidas dos técnicos no assunto. Estas incluem, sem limitações, regiões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas sem limitações, segmentos promotores e amplificadores de citomegalovírus (tais como o promotor inicial imediato, em conjunto com intron A), vírus dos símios 40 (por exemplo, o promotor inicial) e retrovírus (por exemplo, o vírus sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem as derivadas de genes de vertebrados tais como actina, proteína de choque de calor, hormônio do crescimento bovino e α-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão genética em células eucarióticas. Regiões de controle da transcrição apropriadas adicionais incluem promotores específicos de tecidos e aprimoradores, bem como promotores indutíveis (por exemplo, tetraciclinas indutíveis promotoras). De forma similar, diversos elementos de controle de tradução são conhecidos dos técnicos comuns no assunto. Estes incluem, mas sem limitações, locais de ligação de ribossomos, códons de início e de término de tradução e elementos derivados de sistemas virais (particularmente, um local de entrada de ribossomos interno ou IRES, também denominado sequência de CITE). O conjunto de expressão pode também incluir outras características, tais como uma origem de reprodução e/ou elementos de integração de cromossomos tais como repetições de terminal longo (LTRs) retrovirais ou repetições de terminal invertido (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV).

[00264] Regiões de codificação de ácidos nucleicos e polinucleotídeos de acordo com a presente invenção podem ser associadas a regiões de codificação adicionais que codificam peptídeos de sinal ou secreção, que dirigem a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção. Caso se deseje a secreção da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, por exemplo, DNA que codifica uma sequência de sinal pode ser colocado acima no fluxo do ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção ou um de seus fragmentos. Segundo a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos possuem um peptídeo de sinal ou sequência líder de secreção que é dividida da proteína madura após o início da exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático bruto. Os técnicos comuns no assunto sabem que polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente possuem um peptídeo de sinal fundido ao terminal N do polipeptídeo, que é dividido do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em certas realizações, utiliza-se o peptídeo de sinal nativo, tal como um peptídeo de sinal de cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina, ou um derivado funcional daquela sequência que mantém a capacidade de dirigir a secreção do polipeptídeo associado operativamente a ela. Alternativamente, pode ser utilizado um peptídeo de sinal de mamífero heterólogo ou um de seus derivados funcionais. A sequência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder de ativador de plasminogene de tecido (TPA) humano ou β-glucuronidase de camundongo.

[00265] DNA que codifica uma sequência de proteínas curtas que poderá ser utilizada para facilitar a purificação posterior (por exemplo, uma marca de histidina) ou auxiliar na marcação da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode ser incluído no polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T ou nas suas extremidades.

[00266] Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos de acordo com a presente invenção. Em certas realizações, é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores de acordo com a presente invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas no presente com relação a polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em uma dessas realizações, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica (parte de) uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção. Da forma utilizada no presente, a expressão “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser elaborado para gerar as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção ou seus fragmentos. Células hospedeiras apropriadas para reprodução e sustentação da expressão de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T são bem conhecidas na técnica. Essas células podem sofrer transfecção ou transdução, conforme apropriado, com o vetor de expressão específico e grandes quantidades de células que contêm vetores podem ser cultivadas para semear fermentadores em larga escala para obter quantidades suficientes da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para aplicações clínicas. Células hospedeiras apropriadas incluem micro-organismos procarióticos, tais como E. coli, ou várias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de insetos ou similares. Polipeptídeos podem ser produzidos, por exemplo, em bactérias, particularmente quando não for necessário glicosilação. Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado. Além de procariontes, micróbios eucarióticos tais como leveduras ou fungos filamentosos são hospedeiros de expressão ou clonagem apropriados para vetores codificadores de polipeptídeos, incluindo linhagens de fungos e leveduras cujos processos de glicosilação tenham sido “humanizados”, o que resulta na produção de um polipeptídeo com padrão de glicosilação total ou parcialmente humano. Vide Gerngross, Nat. Biotech. 22, 1409-1414 (2004) e Li et al, Nat. Biotech. 24, 210-215 (2006). As células hospedeiras apropriadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) também são derivadas de organismos multicelulares (vertebrados e invertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram identificadas numerosas linhagens bacilovirais que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Cultivos de células vegetais podem também ser utilizados como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descrevem tecnologia PLANTIBODIES® de produção de anticorpos em plantas transgênicas). Células de vertebrados podem também ser utilizadas como hospedeiros. Podem ser úteis, por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescimento em suspensão. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293T conforme descrito, por exemplo, em Graham et al, J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)), células de rim de filhote de hamster (BHK), células Sertoli de camundongos (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma de colo do útero humano (HELA), células de rim canino (MDCK), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A), células de pulmão humano (W138), células de fígado humano (Hep G2), células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562), células TRI (conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4216 (1980)); e linhagens de células de mieloma tais como YO, NS0, P3X63 e Sp2/0. Para análise de certas linhagens de células de hospedeiros mamíferos apropriadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa NJ), págs. 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células cultivadas, tais como células cultivadas de mamíferos, células de levedura, células de insetos, células bacterianas e células de plantas, para indicar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou tecido animal ou vegetal cultivado. Em uma realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de mamífero, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula de rim embriônico humano (HEK) ou uma célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0 ou Sp20).

[00267] Tecnologias padrão são conhecidas na técnica para expressar genes exógenos nestes sistemas. Células que expressam um polipeptídeo que compreende a cadeia leve ou pesada de um domínio de ligação de antígenos tal como um anticorpo podem ser elaboradas de forma a também expressar a outra cadeia de anticorpo, de tal forma que o produto expresso seja um anticorpo que possua uma cadeia leve e uma pesada.

[00268] Em uma realização, é fornecido um método de produção de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, conforme fornecido no presente, sob condições apropriadas para expressão da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T e recuperação da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T da célula hospedeira (ou meio de cultivo de células hospedeiras).

[00269] Os componentes da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T são fundidos geneticamente entre si. A molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode ser projetada de tal forma que seus componentes sejam fundidos diretamente entre si ou indiretamente por meio de uma sequência ligante. A composição e o comprimento do ligante podem ser determinados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e sua eficácia pode ser testada. Exemplos de sequências ligantes entre diferentes componentes de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T são encontrados nas sequências fornecidas no presente. Sequências adicionais podem também ser incluídas para incorporar um local de divisão para separar os componentes individuais da fusão, se desejado, tais como uma sequência de reconhecimento de endopeptidase.

[00270] Em certas realizações, uma ou mais porções de ligação de antígenos das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T compreendem pelo menos uma região variável de anticorpo capaz de ligar um determinante antigênico. Regiões variáveis podem fazer parte e ser derivadas de anticorpos de ocorrência natural ou não natural e seus fragmentos. Métodos de produção de anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Anticorpos não de ocorrência natural podem ser construídos utilizando síntese de peptídeos de fase sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 4.186.567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por meio de seleção de bibliotecas combinatórias que compreendem cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.969.108 de McCafferty).

[00271] Qualquer espécie animal de anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação de antígenos ou região variável pode ser utilizada nas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção. Anticorpos não limitadores, fragmentos de anticorpos, domínios de ligação de antígenos ou regiões variáveis úteis na presente invenção podem ser de origem humana, em primatas ou murinos. Caso a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T destine-se a uso humano, pode ser utilizada uma forma quimérica de anticorpo em que as regiões constantes do anticorpo são de seres humanos. Uma forma humanizada ou totalmente humana do anticorpo pode também ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.565.332 de Winter). Pode-se atingir humanização por meio de diversos métodos, incluindo, sem limitações, (a) enxerto das CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) sobre estrutura humana (por exemplo, anticorpo receptor) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos de cadeia principal críticos (por exemplo, os que são importantes para reter boa afinidade de ligação de antígenos ou funções de anticorpos); (b) enxerto apenas das regiões de determinação da especificidade não humanas (SDRs ou a-CDRs; os resíduos críticos para a interação entre anticorpo e antígeno) sobre regiões constantes e de estrutura humana; ou (c) transplante dos domínios variáveis não humanos completos, mas “disfarçando-os” com uma seção similar à humana por meio da substituição de resíduos da superfície. Anticorpos humanizados e métodos de sua elaboração são analisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front Biosci. 13, 1619-1633 (2008) e são adicionalmente descritos, por exemplo, por Riechmann et al, Nature, 332: 323-329 (1988); Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 10029-10033 (1989); Patentes Norte-Americanas n° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Jones et al, Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol. 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31 (3), 169-217 (1994); Kashmiri et al, Methods 36, 25-34 (2005) (que descreve enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 489-498 (1991) (que descreve a “nova formação de superfície”); Dall’Acqua et al, Methods 36, 43-60 (2005) (que descreve “comutação de FR”); e Osbourn et al, Methods 36, 61-68 (2005) e Klimka et al, Br. J. Cancer 83, 252-260 (2000) (que descreve a abordagem de “seleção orientada” para comutação de FR). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas podem ser produzidos utilizando vários métodos conhecidos na técnica. Os anticorpos humanos são geralmente descritos em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 450-459 (2008). Regiões variáveis humanas podem fazer parte e ser derivadas de anticorpos monoclonais humanos elaborados por meio do método de hibridoma (vide, por exemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas podem também ser preparados por meio da administração de imunogenes a um animal transgênico que tenha sido modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico (vide, por exemplo, Lonberg, Nat. Biotech. 23, 1117-1125 (2005)). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas podem também ser gerados por meio do isolamento de sequências de região variável de clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fagos derivadas de seres humanos (vide, por exemplo, Hoogenboom et al em Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al, Ed., Human Press, Totowa NJ, 2001); e McCafferty et al, Nature 348, 552-554; Clackson et al, Nature 352, 624-628 (1991)). O fago exibe tipicamente fragmentos de anticorpos, seja como fragmentos de Fv de fita simples (scFv) ou como fragmentos de Fab.

[00272] Em certas realizações, as porções de ligação de antígenos úteis na presente invenção são elaboradas para ter afinidade de ligação aprimorada de acordo, por exemplo, com os métodos descritos no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2004/0132066, cujo teor completo é incorporado ao presente como referência. A capacidade da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção de ligar-se a um determinante antigênico específico pode ser medida por meio de um teste imunossorvente ligado por enzima (ELISA) ou outros métodos familiares para os técnicos no assunto, tais como método de ressonância do plasma de superfície (analisado em um sistema BIACORE T100) (Liljeblad et al, Glyco J. 17, 323-329 (2000)) e testes de ligação tradicionais (Heeley, Endocr. Res. 28, 217-229 (2002)). Testes de competição podem ser utilizados para identificar um anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação de antígeno ou domínio variável que concorre com um anticorpo de referência pela ligação a um antígeno específico, tal como um anticorpo que concorre com o anticorpo V9 para ligação a CD3. Em algumas realizações, esse anticorpo concorrente liga-se ao mesmo epítopo (por exemplo, epítopo linear ou de conformação) que é ligado pelo anticorpo de referência. Exemplos detalhados de métodos de mapeamento de epítopos aos quais se liga um anticorpo são fornecidos em Morris (1996), Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa NJ). Em um exemplo de teste de competição, antígeno imobilizado (por exemplo, CD3) é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga ao antígeno (por exemplo, anticorpo V9, descrito em US 6.054.297) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado para determinar a sua capacidade de concorrer com o primeiro anticorpo pela ligação ao antígeno. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, antígeno imobilizado é incubado em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições que permitam a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido e é medida a quantidade de marca associada ao antígeno imobilizado. Caso a quantidade de marca associada a antígeno imobilizado seja substancialmente reduzida na amostra de tese com relação à amostra controle, isso indica que o segundo anticorpo concorre com o primeiro anticorpo pela ligação ao antígeno. Vide Harlow e Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY).

[00273] Moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T preparadas conforme descrito no presente podem ser purificadas por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como cromatografia de líquidos de alto desempenho, cromatografia de troca de íons, eletroforese de gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanhos e similares. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína específica dependerão, em parte, de fatores tais como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade etc. e serão evidentes para os técnicos no assunto. Para purificação por cromatografia por afinidade, pode-se utilizar um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno ao qual se liga a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T. Para purificação por cromatografia de afinidade de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção, por exemplo, pode ser utilizada uma matriz com proteína A ou proteína G. Cromatografia por afinidade de proteína A ou G sequencial e cromatografia de exclusão de tamanhos podem ser utilizadas para isolar uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T essencialmente conforme descrito nos Exemplos. A pureza da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode ser determinada por meio de qualquer um dentre uma série de métodos analíticos bem conhecidos, incluindo eletroforese de gel, cromatografia de líquidos sob alta pressão e similares. Demonstrou-se, por exemplo, que as proteínas de fusão de cadeia pesada expressas conforme descrito nos Exemplos encontram-se intactas e são adequadamente montadas conforme demonstrado por meio de SDS-PAGE redutor (vide, por exemplo, a Figura 3). Três faixas foram resolvidas a cerca de Mr 25.000, Mr 50.000 e Mr 75.000, correspondentes aos pesos moleculares previstos da proteína de fusão de cadeia leve, cadeia pesada e cadeia leve/cadeia pesada de molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T.

TESTES

[00274] Moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadoras de células T fornecidas no presente podem ser identificadas, selecionadas ou caracterizadas pelas suas propriedades físico-químicas e/ou atividades biológicas por meio de diversos testes conhecidos na técnica.

TESTES DE AFINIDADE

[00275] A afinidade da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para um receptor Fc ou antígeno alvo pode ser determinada de acordo com os métodos descritos nos Exemplos por meio de ressonância de plasma de superície (SPR), utilizando instrumentação padrão tal como instrumento BIAcore (GE Healthcare) e receptores ou proteínas alvo como as que podem ser obtidas por meio de expressão recombinante. Alternativamente, a ligação de moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para diferentes receptores ou antígenos alvo pode ser avaliada utilizando linhagens celulares que expressam o antígeno alvo ou receptor específico, por exemplo, por meio de citometria de fluxo (FACS). Um exemplo de realização ilustrativo específico para medir a afinidade de ligação é descrito a seguir e nos Exemplos abaixo.

[00276] Segundo uma realização, KD é medido por meio de ressonância de plasma de superfície utilizando uma máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

[00277] Para analisar a interação entre a parte Fc e os receptores Fc, receptor Fc recombinante marcado com His é capturado por um anticorpo His anti-Penta (Qiagen) imobilizado sobre chips CM5 e as construções biespecíficas são utilizadas como analisados. Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilados (CM5, GE Healthcare) são ativados com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Anticorpo anti-Penta-His é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 5,0, até 40 μg/ml antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/min para atingir cerca de 6500 unidades de reação (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do ligante, injeta-se 1 M de etanolamina para bloquear grupos não reagidos. Em seguida, o receptor Fc é capturado por sessenta segundos a 4 ou 10 nM. Para medições cinéticas, diluições em série em quatro vezes da construção biespecífica (faixa de 500 nM a 4000 nM) são injetadas em HBS-EP (GE Healthcare, 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% Tensoativo P20, pH 7,4) a 25 °C em velocidade de fluxo de 30 μl/min por 120 s.

[00278] Para determinar a capacidade do antígeno alvo, construções biespecíficas são capturadas por um anticorpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que é imobilizado sobre uma superfície de chip sensor CM5 ativada conforme descrito para o anticorpo anti-Penta-His. A quantidade final de proteína acoplada é de cerca de 12000 RU. As construções biespecíficas são capturadas por noventa segundos a 300 nM. Os antígenos alvo são passados através das células de fluxo por 180 segundos em faixa de concentração de 250 a 1000 nM com velocidade de fluxo de 30 μl/min. A dissociação é monitorada por 180 s.

[00279] Diferenças do índice de refração geral são corrigidas por meio de subtração da reação obtida sobre a célula de fluxo de referência. A reação em estado estável foi utilizada para derivar a constante de dissociação KD por meio de encaixe de curva não linear do isoterma de ligação de Langmuir. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação de Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIACORE® T100 versão 1.1.1) por meio de adequação simultânea dos sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) é calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293, 865-881 (1999).

TESTES DE ATIVIDADE

[00280] A atividade biológica das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção pode ser medida por meio de diversos testes conforme descrito nos Exemplos. Atividades biológicas podem incluir, por exemplo, a indução da proliferação de células T, a indução da sinalização em células T, a indução da expressão de marcadores de ativação em células T, a indução da secreção de citoquinas por células T, a indução da lise de células alvo tais como células de tumores e a indução de regressão de tumores e/ou o aumento da sobrevivência.

COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

[00281] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T fornecidas no presente, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos abaixo. Em uma realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T fornecidas no presente e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer uma das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T fornecidas no presente e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.

[00282] É adicionalmente fornecido um método de produção de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção em forma apropriada para administração in vivo, em que o método compreende (a) obtenção de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção e (b) formulação da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, em que é formulada uma preparação de molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para administração in vivo.

[00283] Composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T dissolvidas ou dispersas em um veículo farmaceuticamente aceitável. A expressão “farmacêutica ou farmacologicamente aceitável” designa composições e entidades moleculares que são geralmente atóxicas para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas, ou seja, não produzem reação adversa, alérgica ou outra indesejável quando administradas a animais, tais como seres humanos, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será conhecida dos técnicos no assunto à luz da presente invenção, conforme exemplificado por Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18aEd., Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente como referência. Além disso, para administração a animais (tais como seres humanos), compreender-se-á que as preparações deverão atender os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza estabelecidos pelo Escritório de Padrões Biológicos do FDA ou autoridades correspondentes em outros países. As composições preferidas são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Da forma utilizada no presente, “veículo farmaceuticamente aceitável” incui todo e qualquer solvente, tampão, meio de dispersão, revestimento, tensoativo, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos e agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes retardantes da absorção, sais, conservantes, antioxidantes, proteínas, drogas, estabilizantes de drogas, polímeros, géis, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, tinturas, materiais similares e suas combinações, como será conhecido dos técnicos comuns no assunto (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329, incorporado ao presente como referência). Exceto quando algum veículo convencional for incompatível com o ingrediente ativo, contempla-se o seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas.

[00284] A composição pode compreender diferentes tipos de veículos, dependendo se destinar-se à administração em forma sólida, líquida ou de aerossol e se ela necessita ser estéril para vias de administração tais como injeção. Moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) podem ser administradas por via intravenosa, intradérmica, intra- arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intraesplênica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, subconjuntiva, intravesicular, via mucosa, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, inalatória (por exemplo, inalação por aerossol), por meio de injeção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada por meio de banho das células alvo diretamente, por meio de um cateter, lavagem, em cremes, em composições de lipídios (por exemplo, lipossomos) ou por outro método ou qualquer combinação dos acima, como seria do conhecimento dos técnicos comuns no assunto (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences,18aEd., Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente como referência). Administração parenteral, particularmente injeção intravenosa, é mais comumente utilizada para administração de moléculas de polipeptídeos tais como as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção.

[00285] As composições parenterais incluem as projetadas para administração por meio de injeção, por exemplo injeção subcutânea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão de solução salina fisiológica. A solução pode conter agentes formuladores tais como agentes formadores de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T podem apresentar-se em forma de pó para constituição com um veiculo apropriado, tal como água livre de pirogênio estéril, antes do uso. Soluções injetáveis estéreis são preparadas por meio de incorporação das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção na quantidade necessária e no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes indicados abaixo, conforme o necessário. A esterilidade pode ser facilmente conseguida, por exemplo, por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas por meio de incorporação dos diversos ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou os demais ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções, suspensões ou emulsões injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são métodos de secagem a vácuo ou secagem por congelamento, que geram um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de um meio líquido previamente filtrado estéril. O meio líquido deverá ser adequadamente tamponado, se necessário, e o diluente líquido torna-se, em primeiro lugar, isotônico antes da injeção com glicose ou solução salina suficiente. A composição deve ser estável sob condições de fabricação e armazenagem e preservada contra a ação de contaminação de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. Apreciar-se-á que a contaminação com endotoxina deverá ser mantida em nível mínimo seguro, tal como menos de 0,5 ng/mg de proteína. Veículos farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem, mas sem limitações: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabens tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos com baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de proteína e Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como polietileno glicol (PEG). Suspensões de injeção aquosa podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol, dextrano ou similares. Opcionalmente, a suspensão pode também conter agentes ou estabilizantes apropriados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Além disso, podem ser preparadas suspensões dos compostos ativos na forma de suspensões de injeção oleosas apropriadas. Veículos ou solventes lipofílicos apropriados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como triglicérides ou ganchos de etila, ou lipossomos.

[00286] Ingredientes ativos podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de métodos de coacervação ou polimerização interfacial, tais como microcápsulas de gelatina ou hidroximetilcelulose e microcápsulas de metacrilato de (póli)metila, respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Esses métodos são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences (18a edição, Mack Printing Company, 1990). Podem ser elaboradas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o polipeptídeo, em que essas matrizes encontram-se na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Em realizações específicas, absorção prolongada de uma composição injetável pode ser causada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio, gelatina ou suas combinações.

[00287] Além das composições descritas anteriormente, as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T podem também ser formuladas como preparação de depósito. Essas formulações de ação prolongada podem ser administradas por meio de implante (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular) ou por meio de injeção intramuscular. Portanto, por exemplo, as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos apropriados (por exemplo, na forma de emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca de íons, ou como derivados escassamente solúveis, tais como um sal escassamente solúvel.

[00288] Composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção podem ser fabricadas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsificação, encapsulação, captura ou liofilização. Composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional, utilizando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser farmaceuticamente utilizadas. A formulação apropriada depende da via de administração selecionada.

[00289] As moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T podem ser formuladas em uma composição em forma de base ou ácido livre, neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica da base ou ácido livre. Estes incluem os sais de adição de ácidos, tais como os formados com os grupos amino livres de uma composição proteinácea, ou que são formados com ácidos inorgânicos, tais como ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, ou bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros próticos que as formas de base livre correspondentes.

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS

[00290] Qualquer uma das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T fornecidas no presente pode ser utilizada em métodos terapêuticos. Moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas como agentes imunoterapêuticos, por exemplo, no tratamento de cânceres.

[00291] Para uso em métodos terapêuticos, moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção seriam formuladas, dosadas e administradas de forma consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de fornecimento do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes da medicina.

[00292] Em um aspecto, são fornecidas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção para uso como medicamento. Em aspectos adicionais, são fornecidas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de doenças. Em certas realizações, são fornecidas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento. Em uma realização, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T conforme descrito no presente para uso no tratamento de doenças em indivíduos dela necessitados. Em certas realizações, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para uso em um método de tratamento de indivíduos portadores de doença que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T. Em certas realizações, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como um agente anticâncer caso a doença a ser tratada seja câncer. Em realizações adicionais, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T conforme descrito no presente para uso na indução de lise de uma célula alvo, particularmente uma célula de tumor. Em certas realizações, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para uso em um método de indução da lise de uma célula alvo, particularmente uma célula de tumor, em indivíduos que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para induzir a lise de uma célula alvo. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima é mamífero, preferencialmente um ser humano.

[00293] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento destina-se ao tratamento de doenças em indivíduos dele necessitados. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se a uso em um método de tratamento de doença que compreende a administração a um indivíduo portador da doença de uma quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento. Em certas realizações, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em uma realização, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como um agente anticâncer caso a doença a ser tratada seja câncer. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se à indução de lise de uma célula alvo, particularmente uma célula de tumor. Em ainda outra realização, o medicamento destina-se a uso em um método de indução da lise de uma célula alvo, particularmente uma célula de tumor, em indivíduos que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do medicamento para induzir a lise de uma célula alvo. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima pode ser mamífero, preferencialmente um ser humano.

[00294] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de tratamento de doenças. Em uma realização, o método compreende a administração a um indivíduo portador dessa doença de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção. Em uma realização, é administrada uma composição ao mencionado indivíduo, que compreende a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção em forma farmaceuticamente aceitável. Em certas realizações, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em uma realização específica, a doença é câncer. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como um agente anticâncer caso a doença a ser tratada seja câncer. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima pode ser mamífero, preferencialmente um ser humano.

[00295] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de indução da lise de células alvo, particularmente células de tumores. Em uma realização, o método compreende o contato de células alvo com uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção na presença de células T, particularmente células T citotóxicas. Em um aspecto adicional, é fornecido um método de indução da lise de células alvo, particularmente células de tumores, em indivíduos. Em uma dessas realizações, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T para induzir a lise de uma célula alvo. Em uma realização, “indivíduo” é ser humano.

[00296] Em certas realizações, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo, particularmente câncer. Exemplos não limitadores de cânceres incluem câncer da bexiga, câncer do cérebro, câncer da cabeça e do pescoço, câncer pancreático, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer do ovário, câncer do útero, câncer do colo do útero, câncer do endométrio, câncer do esôfago, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer da próstata, câncer do sangue, câncer da pele, carcinoma das células escamosas, câncer dos ossos e câncer renal. Outros distúrbios da proliferação celular que podem ser tratados utilizando uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, neoplasmas localizados no: abdômen, ossos, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritôneo, glândulas endócrinas (adrenal, paratireoide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireoide), olhos, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvico, pele, tecido mole, baço, região torácica e sistema urogenital. Também são incluídas lesões ou condições pré-cancerosas e metástases de câncer. Em certas realizações, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer das células renais, câncer da pele, câncer do pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer do cérebro e câncer da cabeça e do pescoço. Os técnicos no assunto reconhecem facilmente que, em muitos casos, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode não fornecer cura, mas somente benefício parcial. Em algumas realizações, alteração fisiológica que possui algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Desta forma, em algumas realizações, uma quantidade de molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que fornece alteração fisiológica é considerada “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz”. O objeto, paciente ou indivíduo necessitado de tratamento é tipicamente mamífero, mais especificamente ser humano.

[00297] Em algumas realizações, uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção é administrada a uma célula. Em outras realizações, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção é administrada a um indivíduo para o tratamento de doença.

[00298] Para a prevenção ou o tratamento de doenças, a dosagem apropriada de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção (quando utilizada isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, da via de administração, do peso do corpo do paciente, do tipo de molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T, da severidade e do curso da doença, se a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, intervenções terapêuticas anteriores ou concorrentes, histórico clínico do paciente, reação à molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T e do critério do médico atendente. O praticante da medicina responsável pela administração, em qualquer eventualidade, determinará a concentração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e dose(s) apropriada(s) para o paciente individual. Diversos cronogramas de dosagem, incluindo, mas sem limitações, administrações isoladas ou múltiplas ao longo de vários momentos, administração de mistura e infusão de pulso, são contemplados no presente.

[00299] A molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T é administrada adequadamente ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode ser uma dosagem inicial possível para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou de infusão contínua. Dose diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até a ocorrência de supressão desejada de sintomas da doença. Um exemplo de dosagem da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T estaria na faixa de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em outros exemplos não limitadores, a dose pode também compreender cerca de 1 micrograma/kg de peso do corpo, cerca de 5 microgramas/kg de peso do corpo, cerca de 10 microgramas/kg de peso do corpo, cerca de 50 microgramas/kg de peso do corpo, cerca de 100 microgramas/kg de peso do corpo, cerca de 200 microgramas/kg de peso do corpo, cerca de 350 microgramas/kg de peso do corpo, cerca de 500 microgramas/kg de peso do corpo, cerca de 1 miligrama/kg de peso do corpo, cerca de 5 miligramas/kg de peso do corpo, cerca de 10 miligramas/kg de peso do corpo, cerca de 50 miligramas/kg de peso do corpo, cerca de 100 miligramas/kg de peso do corpo, cerca de 200 miligramas/kg de peso do corpo, cerca de 350 miligramas/kg de peso do corpo, cerca de 500 miligramas/kg de peso do corpo, cerca de 1000 mg/kg de peso do corpo ou mais por administração e qualquer faixa que possa ser delas derivada. Em exemplos não limitadores de uma faixa que pode ser derivada dos números relacionados no presente, pode ser administrada uma faixa de cerca de 5 mg/kg de peso do corpo a cerca de 100 mg/kg de peso do corpo, cerca de 5 microgramas/kg de peso do corpo a cerca de 500 miligramas/kg de peso do corpo etc., com base nos números descritos acima. Pode-se administrar ao paciente, portanto, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações). Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T). Pode-se administrar dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Outros regimes de dosagem podem, entretanto, ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de testes e métodos convencionais.

[00300] As moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção serão geralmente utilizadas em quantidade eficaz para atingir o propósito pretendido. Para uso no tratamento ou prevenção de condição de doença, as moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção ou suas composições farmacêuticas são administradas ou aplicadas em quantidade terapeuticamente eficaz. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz encontra-se bem dentro das capacidades dos técnicos no assunto, especialmente à luz da descrição detalhada fornecida no presente.

[00301] Para administração sistêmica, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de testes in vitro, tais como testes de cultivo celular. A dose pode ser formulada em seguida em modelos animais para atingir faixa de concentração circulante que inclui IC50 conforme determinado em cultivo celular. Estas informações podem ser utilizaas para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos.

[00302] As doses iniciais podem também ser estimadas a partir de dados in vivo, tais como modelos animais, utilizando métodos que são bem conhecidos na técnica. Os técnicos comuns no assunto poderão otimizar facilmente a administração a seres humanos com base em dados de animais.

[00303] A quantidade e o intervalo da dosagem podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis de plasma das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que sejam suficientes para manter o efeito terapêutico. Dosagens habituais de pacientes para administração por meio de injeção variam de cerca de 0,1 a 50 mg/kg/dia, tipicamente cerca de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Níveis de plasma terapeuticamente eficazes podem ser atingidos por meio da administração de diversas doses diárias. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por meio de HPLC.

[00304] Em casos de administração local ou absorção seletiva, a concentração local eficaz das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T pode não estar relacionada com a concentração em plasma. Os técnicos no assunto serão capazes de otimizar doses locais terapeuticamente eficazes sem experimentação indevida.

[00305] Dose terapeuticamente eficaz das moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T descritas no presente geralmente fornecerá benefício terapêutico em causar toxicidade substancial. A toxicidade e a eficácia terapêutica de uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T podem ser determinadas por meio de procedimentos farmacêuticos padrão em cultivo celular ou animais experimentais. Testes de cultivo celular e estudos com animais podem ser utilizados para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dosagem entre efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a razão LD50/ED50. São preferidas moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T que exibem grandes índices terapêuticos. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção exibe alto índice terapêutico. Os dados obtidos de testes de cultivo celular e estudos com animais podem ser utilizados na formulação de uma série de dosagens apropriadas para uso em seres humanos. A dosagem repousa preferencialmente dentro de uma série de concentrações em circulação que incluem ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo de uma série de fatores, tais como a forma de dosagem empregada, a via de administração utilizada, a condição do paciente e similares. A formulação exata, a via de administração e a dosagem podem ser selecionadas pelo médico individual em vista das condições do paciente (vide, por exemplo, Fingl et al, 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, pág. 1, incorporado integralmente ao presente como referência).

[00306] O médico que atende pacientes tratados com moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção saberiam como e quando encerrar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade, distúrbios dos órgãos e similares. Por outro lado, o médico atendente também saberia ajustar o tratamento em níveis mais altos caso a reação clínica não fosse adequada (excluindo a toxicidade). A magnitude de uma dose fornecida na administração do distúrbio de interesse variará com a severidade da condição a ser tratada, com a via de administração e similares. A severidade da condição pode ser parcialmente avaliada, por exemplo, por meio de métodos de avaliação de prognóstico padrão. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose também variem de acordo com a idade, o peso do corpo e a reação do paciente individual.

OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS

[00307] As moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção podem ser administradas em combinação com um ou mais agentes diferentes em terapia. Uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção pode ser coadministrada com pelo menos um agente terapêutico adicional. A expressão “agente terapêutico” engloba qualquer agente administrado para o tratamento de sintomas ou doenças em indivíduos necessitados desse tratamento. Esse agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos apropriados para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudicam entre si. Em certas realizações, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, agente citoestático, inibidor da adesão celular, agente citotóxico, ativador da apoptose celular ou agente que aumenta a sensibilidade das células a indutores apoptóticos. Em uma realização específica, o agente terapêutico adicional é um agente anticâncer, tal como um interruptor de microtubos, antimetabólito, inibidor da topoisomerase, intercalador de DNA, agente alquilante, terapia hormonal, inibidor de quinase, antagonista receptor, ativador da apoptose de células de tumores ou agente antiangiogênico.

[00308] Esses outros agentes encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T utilizada, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. As moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T são geralmente utilizadas nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer meio que seja determinado empírica ou clinicamente como apropriado.

[00309] Essas terapias de combinação indicadas acima englobam administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma composição ou em composições separadas) e administração separada, caso em que a administração da molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou depois da administração do agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. As moléculas de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção podem também ser utilizadas em combinação com terapia de radiação.

ARTIGOS INDUSTRIALIZADOS

[00310] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e uma marca ou bula sobre o recipiente ou a ele associada. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas, sacos de solução intravenosa etc. Os recipientes podem ser formados com uma série de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que, por si própria ou em combinação com outra composição, é eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou ampola que possui uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção. A marca ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição selecionada. Além disso, o artigo industrializado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no seu interior, em que a composição compreende uma molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células T de acordo com a presente invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no seu interior, em que a composição compreende um agente citotóxico ou outro terapêutico adicional. O artigo industrializado nesta realização da presente invenção pode compreender adicionalmente uma bula que indica que as composições podem ser utilizadas para o tratamento de uma condição específica. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

EXEMPLOS

[00311] A seguir encontram-se exemplos de métodos e composições de acordo com a presente invenção. Compreende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, considerando a descrição geral fornecida acima.

MÉTODOS GERAIS MÉTODOS DE DNA RECOMBINANTE

[00312] Foram utilizados métodos padrão de manipulação de DNA, conforme descrito em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes. Informações gerais sobre as sequências de nucleotídeos de cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E. A. et al (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Publicação NIH n° 91-3242.

SEQUENCIAMENTO DE DNA

[00313] As sequências de DNA foram determinadas por meio de sequenciamento de fitas duplas.

SÍNTESE GENÉTICA

[00314] Os segmentos genéticos desejados, quando necessários, foram gerados por meio de PCR utilizando modelos apropriados ou foram sintetizados pela Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR por meio de síntese genética automática. Em casos em que nenhuma sequência genética exata estava disponível, foram projetados primers de oligonucleotídeos com base em sequências de homólogos mais próximos e os genes foram isolados por meio de PCR RT a partir de RNA originário do tecido apropriado. Os segmentos genéticos ladeados por locais de divisão de endonuclease de restrição isolados foram clonados em vetores de sequenciamento/clonagem padrão. O DNA de plasmídeo foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração foi determinada por meio de espectroscopia de UV. A sequência de DNA dos fragmentos de genes subclonados foi confirmada por meio de sequenciamento de DNA. Foram projetados segmentos genéticos com locais de restrição apropriados para permitir a subclonagem nos vetores de expressão correspondentes. Todas as construções foram projetadas com uma sequência de DNA com extremidade 5’ para um peptídeo líder, que dirige as proteínas para secreção em células eucarióticas.

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T (TCB) COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA (ANTI-CD20/ANTI-CD3)

[00315] As moléculas a seguir foram preparadas neste exemplo e suas ilustrações esquemáticas são exibidas na Figura 2: A. “2+1 IgG CrossFab, invertido” sem modificações de carga (intercâmbio de CH1/CL em aglutinante CD3) (Figura 2A, SEQ ID N° 14-17); B. “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes CD20) (Figura 2B, SEQ ID N° 18-21); C. “2+1 IgG CrossFab” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes CD20) (Figura 2C, SEQ ID N° 32, 19-21); D. “2+1 IgG CrossFab, invertido” sem modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3) (Figura 2D, SEQ ID N° 33, 15, 17, 21); E. “2+1 IgG CrossFab, invertido” sem modificações de carga (intercâmbio de VH-CH1/VL-CL em aglutinante CD3) (Figura 2E, SEQ ID N° 34, 15, 17 e 35); F. “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinantes CD20, modificação de carga em aglutinante CD3) (Figura 2F, SEQ ID N° 36-39); G. “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga e mutação de DDKK na região Fc (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinantes CD20) (Figura 2G, SEQ ID N° 40, 41,20, 21); H. “1+1 CrossMab” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinante CD20) (Figura 2H, SEQ ID N° 42, 43, 20, 21); I. “1+1 CrossMab” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinante CD20, aglutinante CD20 diferente) (Figura 2I, SEQ ID N° 43-45, 21); J. “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga 213E, 123R (intercâmbio de VH/VL em aglutinante CD3, modificação de carga em aglutinante CD20) (Figura 2J, SEQ ID N° 69-71,21); e K. “2+1 IgG CrossFab, invertido” com modificações de carga (intercâmbio de VH/VL e modificação de carga em aglutinante CD3) (Figura 2K, SEQ ID N° 15, 17, 72, 73).

[00316] A região variável de sequências de DNA de cadeia leve e pesada foi subclonada em quadro com a cadeia pesada constante ou a cadeia leve constante previamente inserida no vetor de expressão de mamíferos receptores correspondente. A expressão de proteínas é dirigida por um promotor de MPSV e uma sequência de sinal póliA sintética está presente na extremidade 3' do CDS. Além disso, cada vetor contém uma sequência OriP EBV.

[00317] As moléculas foram produzidas por meio de cotransfecção de células HEK293-EBNA que crescem em suspensão com os vetores de expressão de mamíferos utilizando polietilenoimina (PEI). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em razão 1:2:1:1 (A: “cadeia pesada de vetor (VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VL-CL)": “cadeia pesada de vetor (VH-CH1-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VL-CH1)”: B, D, G, J, K: “cadeia pesada de vetor (VH-CH1-VL-CH1- CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VL-CL)": “cadeia pesada de vetor (VH-CH1- CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VH-CL)"; C: “cadeia pesada de vetor (VL- CH1-VH-CH1-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VL-CL)": “cadeia pesada de vetor (VH-CH1-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VH-CL)"; E: “cadeia pesada de vetor (VH-CH1-VL-CL-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VL-CL)": “cadeia pesada de vetor (VH-CH1-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VH-CH1)”; F: “cadeia pesada de vetor (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VH-CL)”: “cadeia pesada de vetor (VL-CH1-CH2-CH3)”: “cadeia leve de vetor (VH-CH1)”) ou razão 1:1:1:1 (H, I: “cadeia pesada de vetor (VL-CH1-CH2- CH3)”: “cadeia leve de vetor (VL-CL)”: “cadeia pesada de vetor (VH-CH1-CH2- CH3)”: “cadeia leve de vetor (VH-CL)”).

[00318] Para transfecção, células EBNA HEK293 foram cultivadas em soro em suspensão livre em meio de cultivo Excell contendo 6 mM de L- glutamina e 250 mg/l de G418. Para produção em frascos de agitação de 600 ml (volume máximo de trabalho de 400 ml), 600 milhões de células EBNA HEK293 foram semeados 24 horas antes de transfecção. Para transfecção, as células foram centrifugadas por cinco minutos a 210 x g e o sobrenadante foi substituído por 20 ml de meio CHO CD pré-aquecido. Vetores de expressão são misturados em 20 ml de meio CHO CD até quantidade final de 400 μg de DNA. Após adição de 1080 μl de solução de PEI (2,7 μg/ml), a mistura foi turbilhonada por quinze segundos e incubada em seguida por dez minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram misturadas com a solução de DNA/PEI, transferidas para um frasco de agitação de 600 ml e incubadas por três horas a 37 °C em um incubador com atmosfera de CO2 a 5%. Após incubação, adicionou-se 360 ml de Excell + 6 mM de L-glutamina + 5 g/l de Pepsoy + 1,0 mM de meio VPA e as células foram cultivadas por 24 horas. Um dia após a transfecção, adicionou-se 7% de alimentação 1 (Lonza). Após sete dias, o sobrenadante de cultivo foi recolhido para purificação por meio de centrifugação por vinte a trinta minutos a 3600 x g (centrifugado Sigma 8K), a solução foi filtrada estéril (filtro de 0,22 mm) e adiciona-se azida de sódio em concentração final de 0,01 % p/v. A solução foi mantida a 4 °C.

[00319] A concentração das construções no meio de cultivo foi determinada por meio de HPLC Proteína A. A base de separação foi a ligação de moléculas que contêm Fc sobre Proteína A sob pH 8,0 e eluição em etapas a partir de pH 2,5. Havia duas fases móveis. Estas foram tampões de Tris (10 mM) - glicina (50 mM) - NaCl (100 mM), idênticos exceto pelo ajuste a diferentes pHs (8 e 2,5). O corpo de coluna foi uma coluna prévia Upchurch de 2x20 mm com volume interno de cerca de 63 μl preenchido com POROS 20A. 100 μl de cada amostra foram injetados sobre material equilibrado com velocidade de fluxo de 0,5 ml/min. Após 0,67 minutos, a amostra foi eluída com etapas de pH até pH 2,5. A quantificação foi realizada por meio de determinação de 280 nm de absorção e cálculo utilizando uma curva padrão com faixa de concentração de IgG1 humana de 16 a 166 mg/l.

[00320] A proteína secretada foi purificada a partir de sobrenadantes de cultivo celular por meio de cromatografia de afinidade utilizando cromatografia de afinidade de Proteína A, seguida por uma etapa cromatográfica de exclusão de tamanhos.

[00321] Para cromatografia de afinidade, o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna HiTrap Proteína A HP (CV = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada com 25 ml de 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 7,5. Proteína não ligada foi removida por meio de lavagem com pelo menos dez volumes de coluna de 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 0,5 M de cloreto de sódio, pH 7,5, seguidos por uma etapa de lavagem adicional utilizando seis volumes de coluna de 10 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio e 0,5 M de cloreto de sódio, pH 5,45. A coluna foi lavada em seguida com 20 ml de 10 mM MES, 100 mM cloreto de sódio, pH 5,0 e a proteína alvo foi eluída em seis volumes de coluna de 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio e 100 mM de glicina, pH 3,0. A solução de proteína foi neutralizada por meio da adição de 1/10 de 0,5 M fosfato de sódio, pH 8,0. A proteína alvo foi concentrada e filtrada antes da carga sobre uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de cloreto de sódio, solução de Tween-20 a 0,01%, pH 6,0. A molécula A necessitou ser purificada por meio de uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC) preparativa adicional para atingir teor final de monômero de 100%. Frações com alto teor de monômero da primeira etapa de exclusão de tamanhos foram, portanto, reunidas, concentradas e novamente carregadas sobre uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare). Esta etapa de purificação adicional não foi necessária para as outras moléculas (dependendo do perfil de subproduto, entretanto, a reunião de frações e, portanto, a recuperação após a primeira cromatografia de exclusão de tamanhos foram diferentes para essas moléculas).

[00322] A pureza e o peso molecular das moléculas foram analisados após a primeira etapa de purificação (cromatografia de afinidade de Proteína A) por meio de SDS-PAGE na ausência de agente redutor e manchas com Coomassie (SimpleBlue® SafeStain, Invitrogen). O sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, Estados Unidos) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante (géis de Tris-Acetato a 4-12% ou Bis-Tris 4-12%).

[00323] Determinou-se a concentração de proteína em amostras de proteína purificadas por meio de medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos.

[00324] A pureza e o peso molecular de moléculas após a etapa de purificação final foram analisados por meio de análise CE-SDS na presença e na ausência de um agente redutor. O sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Foram utilizados 2 μg de amostra para análise.

[00325] O teor agregado de amostras de anticorpos foi analisado utilizando uma coluna de exclusão de tamanhos analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em 25 mM de K2HPO4, 125 mM de NaCl, 200 mM de monocloridrato de L-arginina, 0,02% (p/v) de NaN3, tampão de condução sob pH 6,7 a 25 °C.

[00326] Todas as moléculas foram produzidas e purificadas seguindo o mesmo método (exceto pela molécula A, que foi submetida a uma etapa de SEC adicional, conforme indicado acima).

[00327] A molécula A exibiu alto teor agregado após a primeira cromatografia de exclusão de tamanhos preparativa. O teor de agregados após esta etapa de purificação não pôde ser determinado, pois não havia separação inicial de impurezas com alto peso molecular e da fração monomérica. Para obter material 100% monomérico, foi necessária uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanhos preparativa adicional. A molécula B foi 100% monomérica após uma cromatografia de exclusão de tamanhos preparativa.

[00328] A concentração no sobrenadante foi mais alta para a molécula A, mas o rendimento final (devido ao alto teor agregado) foi 2,3 vezes menor que para a molécula B (Tabela 2).

[00329] A pureza final exibida por análises CE-SDS foi mais alta para a molécula B que para a molécula A (Tabela 3, Figuras 3A e B). As Figuras 3M e 3N exibem cromatogramas da etapa de purificação SEC (SEC preparativa), em que a molécula A possui um pico amplo em comparação com a molécula B, o que indica que a preparação de molécula A carregada sobre o SEC não é homogênea, enquanto a preparação de molécula B é, em grande parte, monomérica.

[00330] A molécula C pôde ser produzida com alto título, mas, em comparação com a molécula B, a recuperação final foi mais baixa, devido ao alto teor de subprodutos que não puderam ser completamente removidos pelos métodos de cromatografia aplicada (Tabela 2, Tabela 3, Figura 3B e J e Figura 3C e K). Conforme exibido nas Figuras 3B e 3K, a análise de SDS-PAGE após a etapa de purificação de Proteína A não exibiu subproduto para a molécula B, enquanto a preparação de molécula C contém alguns subprodutos que surgem em peso molecular aparente de 100 kDa.

[00331] A molécula D difere da molécula B somente na ausência dos resíduos carregados nos Fabs anti-CD20. Esta molécula poderá também ser produzida transitoriamente com alto título, mas, conforme já descrito para a molécula C, a qualidade final exibida sobre SEC analítico (98% de monômero para a molécula D x 100% de monômero para a molécula B) e a recuperação foram mais baixas que para a molécula B devido ao alto teor de subprodutos (Tabela 2, Tabela 3, Figura 3B e J e Figura 3D e L). Conforme exibido nas Figuras 3J e 3L, a análise de SDS- PAGE após a etapa de purificação de Proteína A não exibiu subproduto para a molécula B, enquanto a preparação de molécula D contém alguns subprodutos que surgem em peso molecular aparente de 66 kDa e 40 kDa. As Figuras 3N e 3O exibem cromatogramas da etapa de purificação SEC (SEC preparativa), em que a molécula D possui pico amplo em comparação com a molécula B, o que indica que a preparação de molécula D carregada sobre o SEC não é homogênea, enquanto a preparação de molécula B é, em grande parte, monomérica.

[00332] O título da produção de molécula E também foi alto, mas o produto final continha ainda impurezas com baixo peso molecular conforme exibido por meio de eletroforese capilar e SEC analítica (Tabela 2, Tabela 3, Figura 3E).

[00333] Ao contrário da molécula B, a molécula F possui o intercâmbio VH-VL sobre o Fab da porção de ligação de alvo de tumor, enquanto as modificações de carga foram introduzidas no Fab anti-CD3. Esta molécula pôde também ser produzida com altos títulos, mas a recuperação final foi lenta devido aos subprodutos. Para TCB anti- CD20/anti-CD3, o formato com modificações de carga no Fab anti-CD20 é preferível com relação à produção e purificação.

[00334] A molécula G é uma molécula com modificações de carga na região Fc (“DD” = K392D; K409D em uma das subunidades do domínio Fc, “KK” = D356K; D399K na outra das subunidades do domínio Fc (numeração de EU), substituindo a mutação de “botão em orifício”. A geração de moléculas biespecíficas é fomentada pela introdução de dois resíduos de ácido aspártico sobre uma cadeia pesada e dois resíduos de lisina na segunda cadeia pesada (Figura 2G). Esta molécula pôde ser produzida com alto título, mas o produto final ainda continha algumas impurezas com alto e baixo peso molecular exibidas por meio de SEC analítica e eletroforese capilar (Tabela 2; Tabela 3), enquanto os subprodutos puderam ser completamente removidos para a mesma molécula que conduz a mutação de “botão em orifício" (molécula B).

[00335] A molécula I, que difere da molécula H no seu aglutinante CD20, exibiu teor agregado mais alto após a cromatografia de exclusão de tamanhos preparativa final em comparação com a molécula H. A pureza final exibida por análises CE-SDS foi mais alta para a molécula H que para a molécula I (Tabela 3, Figuras 3H e I). A recuperação para a molécula H também foi 40% mais alta que para a molécula I (Tabela 2). Este resultado demonstra que a qualidade da molécula também depende do anticorpo utilizado no formato biespecífico de células T.

[00336] A produção de molécula J e molécula K apresentou bom título inicial, o que gerou bom rendimento. A recuperação final de cerca de 20% para as duas moléculas, entretanto, ficou bem abaixo dos 48% atingidos com a molécula B (Tabela 2). As duas moléculas possuem qualidade final similar, com teor de monômero de mais de 99% (Tabela 2). A pureza em CE-SDS não reduzido é melhor para a molécula J (que não possui as modificações de carga na posição 124 do domínio CL e na posição 147 do domínio CH1) com cerca de 99% em comparação com a molécula K (que possui modificações de carga e substituição de VL-VH no aglutinante de CD3) com 90% (Tabela 3, Figuras 3N e 3O). A molécula J exibiu alguma precipitação durante a etapa de concentração após cromatografia de afinidade. A molécula K possui modificações de carga no CrossFab de ligação de CD3 e não nos Fabs de ligação de CD20. Isso possui impacto sobre a qualidade final conforme exibido por meio de CE- SDS (Tabela 3, Figura 3O). A diferença de qualidade é principalmente visível após a primeira etapa de purificação sobre SDS-Page (Figuras 3P e 3Q). A molécula K contém mais subprodutos a 150 kDa e 70 kDa (meias moléculas e construções provavelmente com cadeias leves faltantes) que a molécula J. As duas moléculas possuem a mesma estabilidade térmica que é similar à molécula B (Tabela 4).

[00337] Para TCB anti-CD20/anti-CD3, a versão “invertida” com modificações de carga sobre o Fab anti-CD20 (molécula B) é o formato que poderá ser produzido com a mais alta recuperação e qualidade final. TABELA 2: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS TCB ANTI- CD20/ANTI-CD3 COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA * produto final, após duas etapas de SEC. TABELA 3: ANÁLISES DE CE-SDS (NÃO REDUZIDAS) DE MOLÉCULAS TCB ANTI- CD20/ANTI-CD3 COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA

CONFIRMAÇÃO DO PESO MOLECULAR POR MEIO DE ANÁLISES DE LC-MS DESGLICOSILAÇÃO

[00338] Para confirmar a preparação homogênea das moléculas, a solução de proteínas final foi analisada por meio de análises de LC-MS. Para remover a heterogeneidade introduzida por carboidratos, as construções foram tratadas com PNGaseF. Com este propósito, o pH da solução de proteína foi ajustado em pH 7,0 por meio da adição de 2 μl de 2 M Tris a 20 μg de proteína com concentração de 0,5 mg/ml. 0,8 μg de PNGaseF foram adicionados e incubados por doze horas a 37 °C.

ANÁLISE DE LC-MS - DETECÇÃO ONLINE

[00339] O método LC-MS foi realizado sobre um HPLC Agilent 1200 acoplado a um espectrômetro de massa TOF 6441 (Agilent). A separação cromatográfica foi realizada sobre uma coluna de poliestireno Macherey Nagel; RP1000-8 (tamanho de partículas de 8 μm), 4,6 x 250 mm; cat. n° 719510). O eluente A foi 5% de acetonitrila e 0,05% (v/v) de ácido fórmico em água e o eluente B foi de 95% de acetonitrila, 5% de água e 0,05% de ácido fórmico. A velocidade de fluxo foi de 1 ml/min, a separação foi realizada a 40 °C e 6 μg (15 μl) de uma amostra de proteína foram obtidos com o tratamento descrito acima.

[00340] Durante os primeiros quatro minutos, o eluído foi dirigido para o lixo, a fim de evitar contaminação de sal do espectrômetro de massa. A fonte de ESI estava funcionando com fluxo de gás de secagem de 12 l/min, temperatura de 350 °C e pressão de nebulizador de 60 psi. Os espectros de MS foram obtidos utilizando tensão de fragmentador de 380 V e faixa de massa de 700 a 3200 m/z em modo de íons positivos. Dados de MS são obtidos pelo software do instrumento de quatro a dezessete minutos.

[00341] A preparação de molécula A continha cerca de 10 a 15% de moléculas com cadeias leves desemparelhadas e traços de cadeias leves livres ou ligadas. A preparação de molécula B continha traços de moléculas que compreendem duas cadeias leves CD3. Impurezas tais como cadeia leve livre ou cadeia leve ligada não puderam ser detectadas (Tabela 2).

ESTABILIDADE TÉRMICA POR MEIO DE DIFUSÃO DE LUZ ESTÁTICA

[00342] A estabilidade térmica foi monitorada por meio de difusão de luz estática (SLS) e medição da fluorescência de proteína intrínseca em resposta à tensão de temperatura aplicada.

[00343] 30 μg de amostra de proteína filtrada com concentração de proteínas de 1 mg/ml foram aplicados em duplicata a Optim 2 (Avacta Analytical Ltd., Grã-Bretanha). A temperatura foi elevada de 25 para 85 °C a 0,1 °C/min, coletando se o raio e a intensidade de difusão total. Para determinação da fluorescência de proteína intrínseca, a amostra foi excitada a 295 nm e a emissão foi coletada a 266 até 473 nm.

[00344] Determinou-se a estabilidade térmica para todas as moléculas e os resultados são exibidos na Tabela 4. A temperatura de agregação (TAgg) determinada por meio de difusão de luz dinâmica e a temperatura de fusão (TM) medida por meio de fluorescência de proteína após a aplicação de um gradiente de temperatura foram comparáveis para todas as moléculas com TAgg variando de 54 a 58°C e TM variando de 56 a 60°C (Tabela 4). TABELA 4: ESTABILIDADE TÉRMICA DE MOLÉCULAS TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3 COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA

LIGAÇÃO A CD3 E CD20 DE ANTICORPOS TCB ANTI-CD3/ANTI-CD20

[00345] A ligação a CD3 de anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-CD20 com ou sem modificações de carga (moléculas “A” e “B” acima) foi medida utilizando células Jurkat que expressam CD3 humano. A ligação a CD20 foi determinada utilizando células Z-138 que expressam CD20 humanas. Células de suspensão foram colhidas, lavadas uma vez com PBS e a viabilidade e densidade celular foram determinadas utilizando Vicell. As células de suspensão foram novamente suspensas a 2 x 106 células/ml em tampão FACS. 100 μl da suspensão celular foram semeados em uma placa de 96 cavidades com fundo abaulado. Cada etapa foi realizada a 4 °C. As placas foram centrifugadas a 360 x g por cinco minutos e o sobrenadante foi removido. Diluições de anticorpos foram preparadas em PBS/0,1% BSA. 30 μl dos anticorpos TCB anti-CD3/anti-CD20 ou tampão FACS foram adicionados às cavidades e as células foram incubadas por trinta minutos a 4 °C. Após a incubação, 120 μl de tampão FACS foram adicionados por cavidade, a placa foi centrifugada por cinco minutos a 350 x g e o sobrenadante foi removido. A etapa de lavagem foi repetida uma vez. 30 μl de anticorpo secundário previamente diluído foram adicionados por cavidade, conforme indicado na disposição de placas. As placas foram incubadas por trinta minutos adicionais a 4 °C. Após a incubação, 120 μl de tampão FACS foram adicionados por cavidade, as placas foram centrifugadas por cinco minutos a 350 x g e o sobrenadante foi removido. A etapa de lavagem foi repetida uma vez para todas as placas exceto a placa com células Jurkat, que foram fixadas diretamente após esta etapa de lavagem. As células foram fixadas utilizando 100 μl de tampão de fixação BD por cavidade (BD Biosciences, n° 554655) a 4 °C por 20-30 minutos. As células foram novamente suspensas em 80 μl/cavidade de tampão FACS para a medição de FACS utilizando BD FACS CantoII.

[00346] O resultado deste experimento é exibido na Figura 4.

LISE DE CÉLULAS DE TUMORES E ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T CD4+ E CD8+ MEDIANTE MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS ALVO DE TUMOR QUE EXPRESSAM CD20 INDUZIDAS POR ANTICORPOS TCB ANTI-CD3/ANTI-CD20

[00347] A morte mediada por células T de células alvo e a ativação de células T induzidas por anticorpos TCB anti-CD3/anti-CD20 com ou sem modificações de carga (moléculas “A” e “B” acima) foi determinada sobre células de tumor Z-138 e Nalm-6. PBMCs humanas foram utilizadas como efetores e a morte bem como a ativação de células T foram detectadas 22 horas após a incubação com o anticorpo biespecífico. Resumidamente, as células alvo foram colhidas, lavadas e colocadas em placas sob densidade de 30.000 células/cavidade utilizando placas com 96 cavidades com fundo abaulado. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por meio de centrifugação de densidade Histopaque de sangue fresco de doadores humanos saudáveis. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e colocado em camadas sobre gradiente Histopaque (Sigma, n° H8889). Após a centrifugação (450 x g, trinta minutos, temperatura ambiente), o plasma acima da interfase contendo PBMCs foi descartado e as PBMCs foram transferidas para um novo tubo Falcon cheio em seguida com 50 ml de PBS. A mistura foi centrifugada (400 x g, dez minutos, temperatura ambiente), o sobrenadante foi descartado e a pelota de PBMC foi lavada duas vezes com PBS estéril (etapas de centrifugação de 350 x g, dez minutos). A população de PBMCs resultante foi contada automaticamente (ViCell) e mantida em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) em um incubador celular (37 °C, 5% CO2) até uso adicional (não mais de 24 horas). Para o teste de mortalidade, os anticorpos foram adicionados nas concentrações indicadas (faixa de 1000 pM - 0,1 pM em triplicata). PBMCs foram adicionadas a células alvo na razão E:T final de 6:1. Após a incubação, as placas foram centrifugadas a 420 x g por quatro minutos e 50 μl/cavidade foram transferidos para placas com 96 cavidades e fundo plano novas para detecção de LDH. Realizou-se detecção de LDH utilizando um Kit de Detecção de Citotoxicidade (Roche n° 11644793001) de acordo com as instruções do fabricante. As células remanescentes foram lavadas com PBS contendo 0,1% BSA. Manchas de superfície para CD8 (anti-CD8 humano APCCy7, Biolegend n° 301016), CD4 (anti-CD4 humano FITC, Biolegend n° 300506), CD69 (BV421 anti-CD69 humano, Biolegend n° 310930) e CD25 (PECy7 anti-CD25 humano, Biolegend n° 302612) foram realizadas de acordo com as indicações dos fornecedores. Após trinta minutos a 4 °C, as células foram lavadas duas vezes com 150 μl/cavidade de PBS contendo 0,1% de BSA e fixadas utilizando 100 μl/cavidade de PFA a 2%. A medição foi realizada utilizando BD FACS CantolI.

[00348] O resultado deste experimento é exibido nas Figuras 5, 6 e 7. As duas moléculas exibem atividade comparável em termos de lise de células de tumores e ativação de células T.

ESGOTAMENTO DE CÉLULAS B E ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T CD4+ E CD8+ MEDIANTE MORTE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS B HUMANAS SAUDÁVEIS INDUZIDA POR ANTICORPOS TCB ANTI-CD3/ANTI-CD20 EM SANGUE INTEGRAL HUMANO

[00349] Sangue integral humano de doador saudável foi incubado com anticorpos TCB anti-CD3/anti-CD20 com ou sem modificações de carga (moléculas “A” e “B” acima) em concentrações indicadas (faixa de 50000 pM - 1 pM em triplicatas). Após 22 horas, o sangue foi misturado e 35 μl foram coletados para manchas com 20 μl de mistura de anticorpos FACS contendo CD8 (APCCy7 anti-CD8 humano, Biolegend n° 301016), CD4 (FITC, anti-CD4 humano, Biolegend n° 300506), CD69 (BV421, anti-CD69 humano, Biolegend n° 310930) e CD25 (PECy7, anti-CD25 humano, Biolegend n° 302612), CD22 (APC anti-CD22 humano, Biolegend n° 302510) e CD45 (PerCPCy5.5 anti- CD45 humano, Biolegend n° 304028). Após quinze minutos de incubação à temperatura ambiente, o sangue foi fixado com solução de lise FACS (BD, n° 349202) e analisado por meio de citometria de fluxo. O esgotamento de células B foi calculado com base na razão entre números de células B e números de células T CD4+, definindo as amostras não tratadas em esgotamento de células B a 0%.

[00350] O resultado deste experimento é exibido nas Figuras 8 e 9. As duas moléculas exibem atividade comparável em termos de esgotamento de células B em sangue integral e ativação de células T.

LIGAÇÃO DE ANTICORPO TCB ANTI-CD3/ANTI-CD20 A CÉLULAS ALVO QUE EXPRESSAM CD20 E CD3 HUMANO

[00351] A ligação do anticorpo TCB anti-CD3/anti-CD20 exibido como molécula “B” acima foi testada sobre linhagem celular de linfoma de células B de células grandes difusas (DLBCL) que expressa CD20 humano (WSU DLCL2, 0,5-1 x 106 locais de ligação de CD20) e linhagem de linfócitos T imortalizados que expressam CD3 (Jurkat). Resumidamente, as células foram colhidas, contadas, tiveram sua viabilidade verificada e foram novamente suspensas a 1,5 x 106 células/ml em tampão FACS (PBS 0,1% BSA). 100 μl de suspensão celular (contendo 0,15 x 106 células) foram incubados em placas com 96 cavidades com fundo abaulado por trinta minutos a 4 °C com concentrações crescentes de TCB CD20 (50 pM - 200 nM), lavados duas vezes com PBS 0,1% BSA frio, novamente incubados por trinta minutos adicionais a 4 °C com anticorpo secundário específico de fragmento de Fcg anti-IgG humano de cabra e fragmento de F(ab’)2 AffiniPure conjugado a PE diluído (Jackson Immuno Research Lab PE n° 109-116-170), lavados duas vezes com PBS 0,1% BSA frio, fixados por meio de adição de 2% de PFA e analisados por meio de FACS utilizando FACS CantoII (Software FACS Diva) excluindo células mortas da análise por meio de portal de FSC/SSC.

[00352] Os resultados são exibidos na Figura 10A (ligação a células WSU DLCL2) e Figura 10B (ligação a células Jurkat). Curvas de ligação e os valores EC50 relativos à ligação foram calculados utilizando GraphPadPrism5. Os valores EC50 foram de 0,98 nM (ligação bivalente a células WSU DLCL2 que expressam CD20) e cerca de 12,5 nM (ligação monovalente a células Jurkat que expressam CD3).

[00353] Ligação de anticorpo TCB anti-CD3/anti-CD20 a células alvo que expressam CD20 e CD3 humanos e de macacos cynomolgus:

[00354] A reatividade cruzada do anticorpo TCB anti-CD3/anti- CD20 exibido como molécula “B” acima foi avaliada por meio de determinação da ligação a células B que expressam CD20 humano e de macacos cynomolgus e células T CD4 e CD8 que expressam CD3. Resumidamente, sangue humano e de macacos cynomolgus heparinizado de doadores saudáveis foi utilizado para isolar PBMCs por meio de centrifugação de densidade. PBMCs isoladas foram contadas, tiveram sua viabilidade verificada e foram novamente suspensas a 4 x 106 células/ml em tampão FACS (100 μl de PBS 0,1% BSA). 100 μl de suspensão celular (contendo 0,4 x 106 células) foram colocados em placas com fundo em U e 96 cavidades e centrifugados (420 x g, 4 min). Após a remoção dos sobrenadantes, PBMCs foram incubadas por trinta minutos a 4 °C com concentrações crescentes de CD20 TCB- AlexaFlour488 (200 pM - 200 nM), lavadas por duas vezes com PBS frio 0,1% BSA e novamente incubadas por trinta minutos adicionais a 4 °C com anticorpos com reação cruzada humanos/de cynomolgus: anti-CD19 (doméstico, clone 8B8)-AlexaFluor647, anti-CD4 (BD, n° 552838, clone L200)- PerCPCy5.5 e anti-CD8 (BD, n° 555367, clone RPA-T8)-PE. Após trinta minutos, PBMCs foram lavadas duas vezes com PBS 0,1% BSA frio e tratadas com solução de lise FACS (BD, n° 349202), seguida por análise de FACS utilizando FACS CantoII (Software FACS Diva). Curvas de ligação foram obtidas utilizando GraphPadPrism5.

[00355] Os resultados são exibidos na Figura 11A (ligação a células B humanas e de macacos cynomolgus), Figura 11B (ligação a células T CD4 humanas e de macacos cynomolgus) e Figura 11C (ligação a células T CD8 humanas e de macacos cynomolgus). Os valores EC50 relativos à ligação a células B que expressam CD20, calculados utilizando GraphPadPrism5, foram de 4,8 nM (células B humanas) e 3,3 nM (células B de cynomolgus).

LISE DE CÉLULAS DE TUMORES MEDIADA POR DIFERENTES FORMATOS DE ANTICORPOS TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3

[00356] Lise de células de tumores mediada por formatos de anticorpos TCB anti-CD20/anti-CD3 diferentes (moléculas “B”, “A”, “C” e “H” exibidas acima) foi determinada sobre células Z138 (linfoma de células do manto, 0,06-0,23 x 106 locais de ligação CD20). PBMCs humanas foram utilizadas como efetores e a lise de tumores foi detectada após 21-24 horas de incubação com os diferentes formatos de anticorpos biespecíficos. Resumidamente, as células alvo foram colhidas, lavadas e colocadas em placas sob densidade de 50.000 células/cavidade utilizando placas com 96 cavidades com fundo em U. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por meio de centrifugação de densidade Histopaque de sangue humano saudável. Sangue novo foi diluído com PBS estéril e colocado em camadas sobre gradiente Histopaque (Sigma, H8889). Após a centrifugação (450 x g, trinta minutos, temperatura ambiente, sem freio), o plasma acima da interfase contendo PBMCs foi descartado e as PBMCs foram transferidas para um novo tubo Falcon cheio em seguida com 50 ml de PBS. A mistura foi centrifugada (350 x g, dez minutos, temperatura ambiente), o sobrenadante foi descartado e a pelota de PBMC foi lavada com PBS estéril (300 x g, dez minutos). A população de PBMCs resultante foi contada automaticamente (ViCell) e armazenada em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e 1% de L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) a 37°C e 5% de CO2 em um incubador celular até uso adicional (não mais de 24 horas). Para o teste de lise de tumores, os anticorpos foram adicionados nas concentrações indicadas (faixa de 0,1 pM - 1 nM em triplicata). PBMCs foram adicionadas a células alvo em razão E:T final de 6:1. A lise de células de tumores foi testada após 21-24 horas de incubação a 37 °C, 5% de CO2 por meio de quantificação de LDH liberado em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). Atingiu-se lise máxima das células alvo (= 100%) por meio de incubação de células alvo com 1% Triton X-100. Lise mínima (= 0%) designa células alvo coincubadas com células efetoras sem construção biespecífica.

[00357] A Figura 12 demonstra que diferentes formatos de anticorpos TCB CD20 induziram lise forte e específica de alvo de células alvo CD20+. O quadro A demonstra que “CD20 TCB_2+1_com cargas, invertido” (molécula “B” exibida acima) exibe atividade comparável a “CD20 TCB_2+1_sem cargas, invertido” (molécula “A” exibida acima) e ambas são mais potentes que o formato “CD20 TCB_1+1_com cargas” (molécula “H” exibida acima). O quadro B demonstra que “CD20 TCB_2+1_com cargas, invertido” (molécula “B” exibida acima) é mais potente que o formato “CD20 TCB_2+1_com cargas, clássico" (molécula "C" exibida acima). Os valores EC50 relativos a testes de mortalidade, calculados utilizando GraphPadPrism5, são fornecidos na Tabela 5. TABELA 5: VALORES EC50 (PM) DE LISE DE CÉLULAS DE TUMOR MEDIADA POR DIFERENTES FORMATOS DE ANTICORPOS TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3 AVALIADOS UTILIZANDO CÉLULAS ALVO DE TUMOR Z138 QUE COEXPRESSA CD20

[00358] Lise de células de tumores e ativação de células T subsequente mediada por diferentes formatos de anticorpos TCB anti- CD20/anti-CD3:

[00359] A lise de células de tumores mediada por diferentes formatos de anticorpos TCB anti-CD20/anti-CD3 (moléculas "B" e "H" exibidas acima) foi adicionalmente determinada sobre células Z138 (linfoma de células do manto) utilizando PBMCs humanas derivadas de três doadores saudáveis diferentes, bem como sobre um quadro mais amplo de linhagens de DLBCL que inclui as linhagens celulares OCI Ly-18 (0,06-0,2 x 106 locais de ligação CD20), Ramos (0,1-0,4 x 106 locais de ligação CD20), SU-DHL-5 (0,13-0,21 x 106 locais de ligação CD20), SU- DHL-8 (locais de ligação CD20 abaixo do limite de detecção do teste), Toledo (0,02 x 106 locais de ligação CD20) e U2932 (0,09-0,4 x 106 locais de ligação CD20). A colheita de células de tumores, o isolamento de PBMCs e as condições de teste foram idênticos aos descritos no exemplo anterior. A razão E:T para os testes exibidos nas Figuras 13A-C foi de 6:1 e, para o teste exibido na Figura 13D, foi de 3:1. A lise de células de tumores foi testada após 21 horas de incubação a 37 °C, 5% de CO2 por meio de quantificação de LDH liberado em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). Para determinação da ativação de células T que ocorre mediante lise de células de tumores, PBMCs foram transferidas para uma placa com 96 cavidades e fundo abaulado, centrifugadas a 400 x g por cinco minutos e lavadas por duas vezes com PBS contendo 0,1% de BSA. Manchas de superfície para CD8 (anti-CD8 humano APCCy7, Biolegend n° 301016), CD4 (anti-CD4 humano FITC, Biolegend n° 300506) e CD25 (PECy7 anti-CD25 humano, Biolegend n° 302612) foram realizadas de acordo com as indicações dos fornecedores. As células foram lavadas duas vezes com 150 μl/cavidade de PBS contendo 0,1% de BSA e fixadas utilizando 2% PFA ou solução de lise de FACS (BD, n° 349202). As amostras foram analisadas em BD FACS CantoII.

[00360] A Figura 13 demonstra que o formato de anticorpo “CD20 TCB_2+1_com cargas, invertido” (molécula “B” exibida acima) é mais potente que o formato de anticorpo “CD20 TCB_1+1” (molécula “H” exibida acima) conforme determinado por meio de detecção de lise de células de tumores (Quadros A e D) e ativação de células T (Quadros B e C) utilizando PBMCs de diferentes doadores. Os valores EC50 relativos à lise de tumores e ativação de células T de células Z138 são fornecidos na Tabela 6a. Os valores EC50 relativos a testes de lise de tumores de um quadro de linhagens celulares de DLBCL são fornecidos na Tabela 6b. Os valores EC50 foram calculados utilizando GraphPadPrism5. TABELA 6a: VALORES EC50 (PM) DE LISE DE CÉLULAS DE TUMORES E ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTICORPOS TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3 UTILIZANDO CÉLULAS DE TUMORES Z138 QUE EXPRESSAM CD20 TABELA 6B: VALORES EC50 (PM) DE LISE DE TUMORES DE UM QUADRO DE LINHAGENS DE CÉLULAS DE TUMORES DLBCL MEDIADA POR ANTICORPOS TCB ANTI- CD20/ANTI-CD3

ESGOTAMENTO DE CÉLULAS B EM SANGUE INTEGRAL HUMANO MEDIADO POR DIFERENTES FORMATOS DE ANTICORPOS TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3

[00361] Determinou-se adicionalmente o esgotamento de células B normais por diferentes formatos de anticorpos TCB anti-CD20/anti-CD3 (moléculas “B” e “H” exibidas acima) e por obinutuzumab utilizando sangue humano fresco de voluntários saudáveis. Resumidamente, sangue fresco foi coletado em seringas contendo heparina. Parcelas de sangue (180 μl/cavidade) foram colocadas em placas com 96 cavidades profundas, suplementadas com TCB ou diluições de anticorpos (10 μl/cavidade + 10 μl/cavidade de PBS) e incubadas por 24 horas a 37 °C em CO2 a 5% em um incubador celular umidificado. Após a incubação, sangue foi misturado por meio de pipetagem para cima e para baixo antes da transferência de parcelas de 35 μl de sangue para placas com fundo em U de 96 cavidades e incubação com anti-CD45 fluorescente (APC, Biolegend, n° 304037), anti-CD4 (PerCPCy5.5, BD, n° 552838), anti-CD8 (APCCy7, Biolegend, n° 301016), anti- CD19 (PE, Biolegend, n° 302208), anti-CD25 (PECy7, Biolegend, n° 302612) e anti- CD69 (BV421, Biolegend, n° 310930) em volume total de 55 μl para citometria de fluxo. Após quinze minutos de incubação à temperatura ambiente (no escuro), foram adicionados 180 μl/cavidade de solução de lise FACS (BD Biosciences) para esgotar eritrócitos e fixar células antes da citometria de fluxo.

[00362] A Figura 14 demonstra que “CD20 TCB_2+1_com cargas, invertido” (molécula “B” acima) é mais potente no esgotamento de células B normais que obinutuzumab (Gazyva) e “CD20 TCB_1+1” com cargas (molécula “H” acima). TABELA7: VALORESEC50 (PM) DE ESGOTAMENTO DE CÉLULASB EM SANGUE INTEGRAL HUMANO NORMAL MEDIADO POR DIFERENTES ANTICORPOS DIRECIONADORES DE CD20

ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T DETERMINADA POR MEIO DE QUANTIFICAÇÃO DA INTENSIDADE DE SINALIZAÇÃO ABAIXO NO FLUXO DE CD3 UTILIZANDO TESTE RELATOR DE JURKAT-NFAT

[00363] A capacidade de diferentes formatos de anticorpos TCB anti-CD20/anti-CD3 de induzir a retícula de células T e subsequente ativação de células T foi determinada utilizando cocultivos de células alvo de tumores que expressam CD20 e células relatoras de Jurkat-NFAT (linhagem de células relatoras de leucemia linfática aguda humana que expressa CD3 com um promotor de NFAT, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega n° CS176501). Mediante ligação simultânea de TCB anti-CD20/anti-CD3 a antígeno CD20 (expresso sobre células de tumores) e antígeno CD3 (expresso sobre células relatoras de Jurkat-NFAT), o promotor de NFAT é ativado e gera expressão de luciferase de vaga-lume ativa. A intensidade do sinal de luminescência (obtido por meio da adição de substrato de luciferase) é proporcional à intensidade da ativação e sinalização de CD3. Células relatoras de Jurkat-NFAT crescem em suspensão e foram cultivadas em RPMI1640, 2 g/l de glicose, 2 g/l de NaHCO3, 10% FCS, 25 mM de HEPES, 2 mM de L- glutamina, 1 x NEAA, 1 x piruvato de sódio a 0,1-0,5 milhão de células por ml e 200 μg por ml de higromicina. Para o teste, células alvo de tumores (Z138) foram colhidas e a viabilidade foi determinada utilizando ViCell. 50 μl/cavidade de anticorpos diluídos ou meio (para controles) foram adicionados a células alvo. 20.000 células/cavidade foram colocadas em placas com 96 cavidades com fundo plano e paredes brancas (n° 655098, Greiner Bio-One). Em seguida, células relatoras de Jurkat-NFAT foram colhidas e a viabilidade foi determinada utilizando ViCell. As células foram novamente suspensas a dois milhões de células/ml em meio de cultivo celular sem higromicina B e adicionadas a células de tumores a 0,1 x 106 células/cavidade (50 μl/cavidade) para obter E:T final de 5:1 e volume final de 100 μl por cavidade. As células foram incubadas por seis horas a 37 °C em um incubador umidificado. Ao final do tempo de incubação, 100 μl/cavidade de solução ONE-Glo (1:1 ONE-Glo e volume de meio de teste por cavidade) foram adicionados a cavidades e incubados por dez minutos à temperatura ambiente no escuro. Detectou-se a luminescência utilizando leitor ELISA WALLAC Victor3 (PerkinElmer2030), 5 seg/cavidade como tempo de detecção.

[00364] A Figura 15 demonstra que “CD20 TCB_2+1_com cargas, invertido” (molécula “B” acima) gera ativação de células T e sinalização abaixo no fluxo de CD3 mais forte que “CD20 TCB_1+1” (molécula “H” acima). TABELA 8: VALORES EC50 (PM) DE ATIVAÇÃO DECD3 DETECTADOS UTILIZANDO CÉLULAS RELATORAS DE JURKAT-NFAT

PK DE DOSE ÚNICA DE TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3 EM CAMUNDONGOS NOG SAUDÁVEIS

[00365] Realizou-se estudo farmacocinético de dose única (SDPK) para avaliar a exposição de TCB anti-CD20/anti-CD3 molécula “B” (denominada a seguir “TCB CD20”) durante estudos de eficácia (Figura 16). Realizou-se administração de mistura intravenosa de 0,5 mg/kg a camundongos NOG e amostras de sangue foram retiradas em momentos selecionados para avaliação farmacocinética. Utilizou-se um imunoteste genérico para medir as concentrações totais de TCB CD20. A faixa de calibragem da curva padrão para TCB CD20 foi de 0,78 a 50 ng/ml, em que 15 ng/ml é o limite inferior de quantificação (LLOQ).

[00366] Observou-se declínio bifásico com meia vida beta de dez dias (análise não compartimental) e liberação de 8 ml/d/kg (modelo de dois compartimentos). A meia vida e a liberação foram conforme esperado em comparação com IgG não dirigido normal (Tabela 9).

[00367] Utilizou-se Phoenix v6.2 da Pharsight Ltd. para análise, modelagem e simulação de PK. TABELA9: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE ADMINISTRAÇÃO DE MISTURA INTRAVENOSA DE 0,5 MG/KG DE TCB CD20 EM CAMUNDONGOS NOG

ATIVIDADE DE ESGOTAMENTO DE CÉLULAS B IN VIVO DE TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3

[00368] A atividade de esgotamento de células B periféricas de TCB CD20 foi testada em camundongos NOD/Shi-scid/IL-2RYnulo (NOG) totalmente humanizados.

[00369] Camundongos NOG totalmente humanizados com 14 semanas de idade, portadores de níveis fisiológicos de células B e T humanas em circulação (Hayakawa, J. et al (2009), Stem Cells 27 (1), 175-182) foram tratados com veículo (n = 7) ou com TCB CD20 (n = 6) à dose de 0,5 mg/kg administrada por via intravenosa (iv) uma vez por semana. Conforme exibido no projeto de estudo da Figura 17, camundongos foram sangrados para análise de células B e células T, um e três dias após a primeira injeção terapêutica (D1, D3) e três dias após a segunda (D10) e, nesse momento, o estudo foi encerrado. Neste último momento, os baços também foram colhidos para análise de células B e células T. Os camundongos foram selecionados quatro dias antes da injeção terapêutica (D-4) como referência inicial para contagens de células B e T em circulação. A Figura 18 exibe as contagens de células B e T analisadas por meio de citometria de fluxo ex vivo em sangue de veículo (quadro esquerdo) e camundongos tratados com TCB CD20 (quadro direito) nos diferentes momentos. Os resultados demonstram que células B em circulação esgotaram-se com muita eficiência já um dia após a injeção de TCB CD20 e o seu número permaneceu indetectável por toda a duração do estudo. Por outro lado, a contagem de células T em circulação caiu apenas transitoriamente em D1 após a injeção terapêutica, retornou aos níveis iniciais em D3 e permaneceu estável por toda a duração do estudo. A situação de ativação de células T também foi analisada no sangue de camundongos tratados em D3 e D10 após a primeira injeção terapêutica, por meio de citometria de fluxo ex vivo, utilizando diferentes marcadores da superfície de células T e o marcador de proliferação Ki67 (Figura 19). Células T de camundongos tratados com TCB CD20 demonstraram fenótipo ativado em D3 após injeção terapêutica (quadro superior) com regulagem superior dos marcadores de ativação CD25, 4-1BB, PD-1 e granzima B (GZB) nos compartimentos de células T CD4 e CD8, em comparação com células T de controle veículo. Células T de camundongos tratados também expressaram níveis mais altos do marcador de proliferação Ki67. Em D10 após a primeira injeção terapêutica, a maior parte dos marcadores da ativação de células T havia retornado aos níveis iniciais, com exceção de GZB e PD-1, que ainda eram expressos em níveis mais altos em comparação com controle veículo.

[00370] A Figura 20 exibe os resultados de análises de células B e células T realizadas sobre baços de camundongos tratados com TCB CD20 e veículo ao término do estudo (D10). Tratamento com TCB CD20 também mediou esgotamento de células B muito eficiente nesse órgão linfoide secundário (Figura 20A), enquanto as contagens de células T exibiram níveis comparáveis a controle veículo (Figura 20B). A situação de ativação de células T (Figura 20C) foi similar à observada em sangue, com expressão mais alta de GZB e PD-1 em células T esplênicas de camundongos tratados em comparação com controle veículo.

[00371] Juntos, esses resultados demonstram que tratamento com TCB CD20 pode mediar esgotamento muito eficiente de células B periféricas já um dia após a injeção de terapia, com células B permanecendo indetectáveis até o término do estudo (três dias após a segunda injeção terapêutica). Células B também são eficientemente esgotadas no baço de camundongos tratados. A atividade de esgotamento de células B é realizada em paralelo com a ativação de células T transitória no sangue de animais tratados, que retorna aos níveis iniciais três dias após a injeção terapêutica, com exceção de marcadores de ativação de GZB e PD-1, que permanecem expressos em nível mais alto em comparação com controles não tratados.

ATIVIDADE ANTITUMORES DE TCB ANTI-CD20/ANTI-CD3 EM MODELO WSU-DLCL2

[00372] A atividade antitumores de TCB CD20 foi testada em camundongos NOG portadores da linhagem de células de linfoma de células B grandes difusas humanas WSU-DLCL2 e transferida com células mononucleares periféricas humanas (PBMC). Resumidamente, fêmeas de camundongos NOG receberam injeção subcutânea (sc) de 1,5 x 106 células WSU-DLCL2 (originalmente obtidas da Coleção Europeia de Cultivos Celulares). Quando o volume médio do tumor atingiu 200 mm3, os camundongos receberam injeção intraperitoneal de PBMCs humanas (10 x 106 células por camundongo) como células T humanas fonte. Dois dias mais tarde, os camundongos receberam terapia com TCB CD20 por via intravenosa em dose de 0,5 mg/kg administrada uma vez por semana. Conforme ilustrado na Figura 21, TCB CD20 exibe potente atividade antitumores, com regressão de tumor quase completa observada ao término do estudo (dia 34).

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T “2+1 IGG CROSSFAB, INVERTIDO” COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA (ANTI-BCMA/ANTI- CD3)

[00373] Ilustrações esquemáticas das moléculas preparadas neste exemplo são exibidas na Figura 22. A molécula “2+1 IgG CrossFab, invertido” anti-BCMA/anti-CD3 sem modificações de carga (denominada neste exemplo “83A10-TCB”) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 22-25 e a molécula “2+1 IgG CrossFab, invertido” anti-BCMA/anti-CD3 com modificações de carga (denominada neste exemplo “83A10-TCBcv”) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 26-29.

[00374] Para geração de vetores de anticorpos biespecíficos BCMAxCD3, as moléculas biespecíficas derivadas de IgG1 consistem de pelo menos duas porções de ligação de antígenos capazes de ligar-se especificamente a dois determinantes antigênicos distintos CD3 e BCMA. As porções de ligação de antígenos são fragmentos de Fab compostos de uma cadeia pesada e uma leve, cada qual compreendendo uma região variável e uma constante. Pelo menos um dos fragmentos de Fab foi um fragmento “Crossfab”, em que VH e VL foram substituídos. A substituição de VH e VL no fragmento de Fab garante que fragmentos de Fab com especificidade diferente não possuam disposições de domínio idênticas. O projeto de molécula biespecífica foi monovalente para CD3 e bivalente para BCMA, em que um fragmento de Fab foi fundido ao terminal N do CrossFab interno (2+1). A molécula biespecífica continha uma parte de Fc para que a molécula tenha meia vida mais longa. As moléculas foram produzidas por meio de cotransfecção de células EBNA HEK293 que crescem em suspensão com os vetores de expressão de mamíferos utilizando polietilenoimina (PEI). Para preparação de construções 2+1 CrossFab-IgG, células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em razão 1:2:1:1 (“vetor Fc (botão)": “cadeia leve de vetor”: “cadeia leve de vetor CrossFab”: “cadeia pesada de vetor-CrossFab”).

[00375] Para anticorpos biespecíficos, a introdução de substituição/alteração em um braço de ligação “Crossfab” reduz claramente os subprodutos, mas a preparação não é totalmente livre de subprodutos (descritos em detalhes em WO 2009/080252 e Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Para reduzir adicionalmente os subprodutos causados pela falta de coincidência de uma cadeia leve contra um primeiro antígeno com a cadeia pesada errada contra o segundo antígeno e para aumentar o rendimento do anticorpo biespecífico, aplica-se uma abordagem adicional à molécula por meio da introdução de substituições de aminoácidos carregados com a carga oposta em posições de aminoácidos específicas nos domínios CH1 e CL no domínio constante CL da primeira cadeia leve sob (a) o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) e arginina (R)), em que, no domínio constante CH1 da primeira cadeia pesada em (a), o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com Kabat); ou (ii) no domínio constante CL da segunda cadeia leve em (b) o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em uma realização preferida, independentemente por lisina (K) e arginina (R)), em que, no domínio constante CH1 da segunda cadeia pesada em (b) o aminoácido nas posições 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com Kabat).

[00376] Para produção dos anticorpos biespecíficos, anticorpos biespecíficos foram expressos por meio de cotransfecção transitória dos vetores de expressão de mamíferos correspondentes em células HEK293- EBNA, que foram cultivadas em suspensão, utilizando polietilenoimina (PEI). Um dia antes da transfecção, as células HEK293-EBNA foram semeadas em 1,5 milhão de células viáveis/ml em meio Ex-Cell suplementado com 6 mM de L-glutamina. Para cada mililitro de volume final de produção, 2,0 milhões de células viáveis foram centrifugados (cinco minutos a 210 x g). O sobrenadante foi aspirado e as células foram novamente suspensas em 100 μl de meio CHO de CD. O DNA para cada mililitro de volume final de produção foi preparado por meio da mistura de 1 μg de DNA (razão cadeia pesada: cadeia pesada modificada: cadeia leve: cadeia leve modificada = 1:1:2:1) em 100 μl de meio CHO CD. Após adição de 0,27 μl de solução de PEI (1 mg/ml), a mistura foi turbilhonada por quinze segundos e mantida à temperatura ambiente por dez minutos. Após dez minutos, as células novamente suspensas e a mistura de DNA e PEI foram reunidas e transferidas em seguida para um recipiente apropriado que foi colocado em um dispositivo de agitação (37 °C, 5% CO2). Após tempo de incubação de três horas, 800 μl de meio Ex-Cell, suplementado com 6 mM de L-glutamina, 1,25 mM de ácido valproico e 12,5% de Pepsoy (50 g/l), foram adicionados para cada ml de volume de produção final. Após 24 horas, foram adicionados 70 μl de alimentação (SF40, Lonza) para cada mililitro de volume de produção final. Após sete dias ou quando a viabilidade celular era menor ou igual a 70%, as células foram separadas do sobrenadante por meio de centrifugação e filtragem estéril. Os anticorpos foram purificados por meio de uma etapa de afinidade e uma ou duas etapas de polimento, que são a cromatografia de troca de cátions e a cromatografia de exclusão de tamanhos. Quando necessário, utilizou-se uma etapa de polimento adicional.

[00377] Para a etapa de afinidade, o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de proteína A (HiTrap Proteína A FF, 5 ml, GE Healthcare) equilibrada com 6 CV 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 7,5. Após uma etapa de lavagem com o mesmo tampão, o anticorpo foi eluído da coluna por meio de eluição em etapas com 20 mM de fosfato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio e 100 mM de glicina, pH 3.0. As frações com o anticorpo desejado foram imediatamente neutralizadas por 0,5 M de fosfato de sódio, pH 8,0 (1:10), reunidas e concentradas por meio de centrifugação. O concentrado foi filtrado estéril e adicionalmente processado por meio de cromatografia de troca de cátions e/ou cromatografia de exclusão de tamanhos.

[00378] Para a etapa de cromatografia de troca de cátions, a proteína concentrada foi diluída 1:10 com o tampão de eluição utilizado para a etapa de afinidade e carregada sobre uma coluna de troca de cátions (Poros 50 HS, Applied Biosystems). Após duas etapas de lavagem com o tampão de equilíbrio e tampão de lavagem, respectivamente, 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 20 mM de TRIS, pH 5,0 e 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 20 mM de TRIS, 100 mM de cloreto de sódio, pH 5,0, a proteína foi eluída com gradiente utilizando 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, 20 mM de TRIS e 100 mM de cloreto de sódio, pH 8,5. As frações que contêm o anticorpo desejado foram reunidas, concentradas por meio de centrifugação, filtradas estéreis e processadas adicionalmente em uma etapa de exclusão de tamanhos.

[00379] Para a etapa de exclusão de tamanhos, a proteína concentrada foi injetada em uma coluna XK 16/60 HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) e 20 mM de histidina, 140 mM de cloreto de sódio, pH 6,0, com ou sem Tween 20 como tampão de formulação. As frações que contêm os monômeros foram reunidas, concentradas por meio de centrifugação e filtradas estéreis em uma ampola estéril.

[00380] Realizou-se determinação da concentração de anticorpo por meio de medição da absorção a 280 nm, utilizando o valor teórico da absorção de uma solução do anticorpo a 0,1%. Este valor foi baseado na sequência de aminoácidos e calculado por meio de software GPMAW (dados Lighthouse).

[00381] A pureza e o teor de monômero da preparação de proteína final foram determinados por meio de CE-SDS (sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Life Sciences)), resp. HPLC (coluna de exclusão de tamanhos analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh)) em tampão de 25 mM de fosfato de potássio, 125 mM de cloreto de sódio, 200 mM de monocloridrato de L-arginina e 0,02% (p/v) azida de sódio, pH 6,7.

[00382] Para verificar o peso molecular das preparações finais de proteína e confirmar a preparação homogênea da solução final de proteína das moléculas, utilizou-se cromatografia de líquidos-espectrometria de massa (LC- MS). Realizou-se em primeiro lugar uma etapa de desglicosilação. Para remover a heterogeneidade introduzida por carboidratos, as construções foram tratadas com PNGaseF (ProZyme). O pH da solução de proteína, portanto, foi ajustado em pH 7,0 por meio da adição de 2 μl de 2 M Tris a 20 μg de proteína com concentração de 0,5 mg/ml. 0,8 μg de PNGaseF foram adicionados e incubados por doze horas a 37 °C. Realizou-se em seguida detecção online de LC-MS. O método LC-MS foi realizado sobre um HPLC Agilent 1200 acoplado a um espectrômetro de massa TOF 6441 (Agilent). A separação cromatográfica foi realizada sobre uma coluna de poliestireno Macherey Nagel; RP1000-8 (tamanho de partículas de 8 μm), 4,6 x 250 mm; cat. n° 719510). O eluente A foi 5% de acetonitrila e 0,05% (v/v) de ácido fórmico em água e o eluente B foi de 95% de acetonitrila, 5% de água e 0,05% de ácido fórmico. A velocidade de fluxo foi de 1 ml/min, a separação foi realizada a 40 °C e 6 μg (15 μl) de uma amostra de proteína foram obtidos com o tratamento descrito acima.

[00383] Durante os primeiros quatro minutos, o eluído é dirigido para o lixo, a fim de proteger o espectrômetro de massa contra contaminação de sal. A fonte de ESI estava funcionando com fluxo de gás de secagem de 12 l/min, temperatura de 350 °C e pressão de nebulizador de 60 psi. Os espectros de MS foram obtidos utilizando tensão de fragmentador de 380 V e faixa de massa de 700 a 3200 m/z em modo de íons positivos. Dados de MS foram obtidos pelo software do instrumento de quatro a dezessete minutos.

[00384] A Figura 23 ilustra os gráficos de CE-SDS (não reduzidos) das preparações de proteína finais após diferentes métodos de purificação para anticorpos 83A10-TCB e 83A10-TCBcv. Cromatografia de afinidade de proteína A (PA) e etapas de purificação cromatográficas de exclusão de tamanhos (SEC) aplicadas a anticorpo 83A10-TCB resultaram em pureza de menos de 30% e 82,8% de teor de monômero (A). Ao aplicar-se etapas de purificação adicionais que incluem cromatografia de troca de cátions (cIEX) e etapas cromatográficas de exclusão de tamanhos final (re-SEC) às preparações de proteína finais em (A), a pureza aumentou para 93,4%, mas o teor de monômeros permaneceu inalterado e o rendimento foi significativamente reduzido para 0,42 mg/l. Ao aplicar-se modificações de carga específicas a CL- CH1 Fab anti-BCMA 83A10, nomeadamente anticorpo 83A10-TCBcv, um perfil de produção/purificação superior da molécula de TCB, conforme demonstrado por pureza de 95,3%, teor de monômero de 100% e rendimento de até 3,3 mg/l, já poderá ser observado mesmo quando as etapas de purificação de PA + cIEX + SEC foram aplicadas (C) em comparação com (B) com perfil de produção/purificação que exibe rendimento 7,9 vezes mais baixo e teor de monômeros 17,2% menor, apesar da inclusão de uma etapa de purificação re-SEC adicional.

[00385] Conduziu-se em seguida uma etapa de produção cabeça a cabeça para comparar o perfil de produção/purificação de anticorpos 83A10- TCB x 83A10-TCBcv, a fim de avaliar adicionalmente as vantagens das modificações de carga de CL-CH1 aplicadas aos anticorpos. Conforme ilustrado na Figura 24, as propriedades de anticorpos 83A10-TCB e 83A10- TCBcv foram medidas lado a lado e comparadas após cada etapa de purificação (1) somente cromatografia de afinidade de PA (A, B), (2) cromatografia de afinidade de PA e, em seguida, SEC (C, D) e (3) cromatografia de afinidade de PA, depois SEC, em seguida cIEX e re-SEC (E, F). Os gráficos de CE-SDS (não reduzidos) das soluções de proteína finais após os métodos de purificação correspondentes para anticorpos 83A10-TCB e 83A10-TCBcv são demonstrados na Figura 24. Conforme exibido nas Figuras 24A e 24B, já foram observados aprimoramentos com a aplicação das variantes de carga ao anticorpo TCB após purificação somente por meio de cromatografia de afinidade de PA. Neste estudo cabeça a cabeça, etapa de purificação de cromatografia de afinidade de PA aplicada a anticorpo 83A10-TCB resultou em pureza de 61,3%, rendimento de 26,2 mg/l e teor de monômero de 63,7% (24A). Comparativamente, ao purificar-se anticorpo 83A10-TCBcv por meio de cromatografia de afinidade de PA, todas as propriedades foram aprimoradas com melhor pureza de 81,0%, melhor rendimento de 51,5 mg/l e teor de monômeros de 68,2% (24B). Ao aplicar-se uma etapa de purificação de SEC adicional às preparações de proteína finais observadas nas Figuras 24A e 24B, 83A10-TCB obteve pureza de 69,5%, rendimento de 14,1 mg/l e teor de monômeros de 74,7% em comparação com 83A10- TCBcv com pureza e teor de monômeros aprimorados de até 91,0 e 83,9%, respectivamente, e rendimento de 10,3 mg/l. Embora o rendimento fosse levemente menor (ou seja, 27% menos) para 83A10-TCBcv que para 83A10-TCB neste experimento específico, o percentual de moléculas corretas foi muito melhor para 83A10-TCBcv que para 83A10-TCB, respectivamente 90% x 40-60%, conforme medido por meio de LC-MS. Na terceira comparação cabeça a cabeça, preparações de proteína finais 83A10-TCB e 83A10-TCBcv das Figuras 24C e 24D foram reunidas com cerca de um litro (equivolume) de preparações de proteína finais correspondentes de outro lote de purificação (mesma produção) somente após etapa de purificação por cromatografia de afinidade de PA. As preparações de proteínas reunidas foram adicionalmente purificadas em seguida por meio de métodos de purificação cIEX e SEC. Conforme ilustrado nas Figuras 24E e 24F, observou- se consistentemente aprimoramento do perfil de produção/purificação do anticorpo TCB com as variantes de carga em comparação com anticorpo TCB sem variante de carga. Após o uso de diversas etapas de métodos de purificação (ou seja, PA +/- SEC + cIEX + SEC) para purificar anticorpo 83A10- TCB, atingiu-se apenas 43,1% de pureza e pôde-se atingir teor de monômeros de 98,3%, mas às custas do rendimento, que foi reduzido para 0,43 mg/l. O percentual de moléculas corretas conforme medido por meio de LC-MS ainda foi baixo, de 60-70%. Ao final, a qualidade da preparação de proteína final não foi aceitável para uso in vitro. Em profundo contraste, quando as mesmas diversas etapas de purificação com a mesma cronologia foram aplicadas a anticorpo 83A10-TCBcv, atingiu-se 96,2% de pureza e teor de monômeros de 98,9%, bem como 95% da molécula correta, conforme medido por meio de LC- MS. O rendimento também sofreu grandes reduções, entretanto, para 0,64 mg/l após a etapa de purificação de cIEX. Os resultados demonstram que melhor pureza, teor de monômeros mais alto, maior percentual de moléculas corretas e melhor rendimento podem ser atingidos com anticorpo 83A10-TCBcv após apenas duas etapas de purificação padrão, ou seja, cromatografia de afinidade de PA e SEC (Figura 24D), embora essas propriedades não pudessem ser atingidas com 83A10-TCB, mesmo ao aplicar-se etapas de purificação adicionais (Figura 24E).

[00386] A Tabela 10 resume as propriedades de 83A10-TCB em comparação com 83A10-TCVcv após etapa de purificação de PA. A Tabela 11 resume as propriedades de 83A10-TCB em comparação com 83A10-TCVcv após etapas de purificação de PA e SEC. A Tabela 12 resume as propriedades de 83A10-TCB em comparação com 83A10-TCVcv após PA e SEC mais PA isoladamente e, em seguida, etapas de purificação de cIEX e re-SEC. Para as Tabelas 10 a 12, os valores em negrito destacam a propriedade superior comparando 83A10-TCB e 83A10-TCVcv. Com uma exceção que pode não ser representativa, todos os parâmetros de produção/purificação e valores resultantes dos três experimentos de comparação cabeça a cabeça foram superiores para 83A10-TCBcv em comparação com 83A10-TCB. Os resultados gerais demonstram claramente que poderão ser atingidas vantagens em características de produção/purificação com a aplicação de modificações de carga de CL-CH1 a anticorpos TCB e apenas duas etapas de purificação (ou seja, cromatografia de afinidade de PA e SEC) foram necessárias para atingir preparações de proteína com alta qualidade e propriedades de capacidade de desenvolvimento muito boas. TABELA 10: PERFIL DE PRODUÇÃO/PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T ANTI-BCDMA/ANTI-CD3 APÓS ETAPA DE PURIFICAÇÃO DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE PROTEÍNA A TABELA 11: PERFIL DE PRODUÇÃO/PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T ANTI-BCMA/ANTI-CD3 APÓS ETAPAS DE PURIFICAÇÃO DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE PROTEÍNA A E CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHOS TABELA 12: PERFIL DE PRODUÇÃO/PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T ANTI-BCMA/ANTI-CD3 APÓS ETAPAS DE PURIFICAÇÃO DE (1.A) CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE PROTEÍNA A E CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHOS E (1.B) CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE PROTEÍNA A, APENAS REUNIDOS; EM SEGUIDA, ETAPAS DE (2) CROMATOGRAFIA DE TROCA DE CÁTIONS E (3) CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHOS FINAL LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T ANTI-BCMA/ANTI-CD3 PARA LINHAGENS DE CÉLULAS DE MIELOMA MÚLTIPLO POSITIVAS PARA BCMA (CITOMETRIA DE FLUXO) TCBcv)

[00387] Anticorpos TCB anti-BCMA/anti-CD3 (83A10-TCB, 13A4- TCBcv) foram analisados por meio de citometria de fluxo para determinar a ligação a BCMA humano sobre células NCI-H929 que expressam BCMA (ATCC® CRL-9068®). Utilizou-se MKN45 (linhagem de células de adenocarcinoma gástrico humano que não expressa BCMA) como controle negativo. Resumidamente, células cultivadas foram colhidas, contadas e a viabilidade celular foi avaliada utilizando ViCell. Células viáveis foram ajustadas em seguida a 2 x 106células por mililitro em tampão de manchas FACS contendo BSA (BD Biosciences). 100 μl dessa suspensão celular foram adicionalmente parcelados por cavidade em uma placa com 96 cavidades com fundo abaulado e incubados com 30 μl dos anticorpos anti-BCMA ou controle IgG correspondente por trinta minutos a 4 °C. Todos os anticorpos TCB anti- BCMA/anti-CD3 (e controles TCB) foram titulados e analisados em faixa de concentração final de 1 a 300 nM. As células foram centrifugadas em seguida (5 min, 350 x g), lavadas com 120 μl/cavidade de tampão de manchas FACS (BD Biosciences), novamente suspensas e incubadas por trinta minutos adicionais a 4 °C com fragmento Fc específico anti-IgG humano de cabra e fragmento de F(ab’)2 AffiniPure conjugado a PE e conjugado a fluorocromo (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). As células foram lavadas em seguida duas vezes com tampão de manchas (BD Biosciences), fixadas utilizando 100 μl de tampão de fixação BD por cavidade (BD Biosciences, n° 554655) a 4 °C por vinte minutos, novamente suspensas em 120 μl de tampão FACS e analisadas utilizando BD FACS CantoII. Conforme ilustrado na Figura 25, a intensidade de fluorescência média de anticorpos TCB anti-BCMA/anti- CD3 foi plotada em função das concentrações de anticorpos; (A) 83A10-TCB sobre células H929 e células MKN45, (B) 83A10-TCBcv sobre células H929 e células MKN45. Quando aplicável, EC50 foi calculado utilizando Prism GraphPad (La Jolla CA, Estados Unidos) e os valores EC50 que indicam a concentração de anticorpos necessária para atingir 50% da ligação máxima para ligação de 83A10-TCB e 83A10-TCBcv a células H929 encontram-se resumidos na Tabela 13. A Figura 25C demonstra que 83A10-TCB e 83A10- TCBcv ligam-se a células H929 de forma dependente da concentração e com potência similar. Esses resultados são esperados, pois as moléculas 83A10- TCB e 83A10-TCBcv compartilham sequências de CDR idênticas sobre os domínios variáveis VL e VH correspondentes. Anticorpo controle DP47-TCB não se ligou a células de mieloma H929 positivas para BCMA conforme medido pela falta de aumento da intensidade de fluorescência média. Em segundo experimento de comparação cabeça a cabeça, 83A10-TCB e 83A10-TCBcv foram avaliados para determinar a ligação a células H929 positivas para BCMA e a falta de ligação a células MKN45 negativas para BCMA/CD3. Conforme ilustrado na Figura 25D, 83A10-TCB e 83A10-TCBcv ligam-se a células H929 positivas para BCMA de forma dependente da concentração e com potência similar. Valores EC50 para ligação de 83A10-TCB e 83A10-TCBcv a células H929 para este segundo experimento encontram-se resumidos na Tabela 14. TABELA 13: VALORES EC50 PARA LIGAÇÃO DE ANTICORPOS TCB ANTI-BCMA/ANTI- CD3 A CÉLULAS H929 (EXPERIMENTO 1) TABELA 14: VALORES EC50 PARA LIGAÇÃO DE ANTICORPOS TCB ANTI-BCMA/ANTI- CD3 A CÉLULAS H929 (EXPERIMENTO 2) CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS T REDIRECIONADA DE CÉLULAS DE MIELOMA H929 COM ALTA EXPRESSÃO DE BCMA INDUZIDA POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T ANTI-BCMA/ANTI-CD3 (TESTE DE LIBERAÇÃO DE LDH)

[00388] Anticorpos TCB anti-BCMA/anti-CD3 também foram analisados para determinar seu potencial de indução da apoptose mediada por células T em células de mieloma com alta expressão de BCMA mediante retícula da construção por meio de ligação das porções de ligação de antígenos a BCMA sobre as células. Resumidamente, células alvo de mieloma múltiplo H929 que expressam BCMA humano foram colhidas com tampão de dissociação celular, lavadas e novamente suspensas em RPMI suplementado com soro de feto bovino a 10% (Invitrogen). Cerca de 30.000 células por cavidade foram colocadas em placas com 96 cavidades com fundo abaulado e a diluição correspondente da construção de anticorpo foi adicionada para concentração final desejada (em triplicata); em que as concentrações finais variam de 0,1 pM a 10 nM. Para comparação apropriada, todas as construções de TCB e controles foram ajustados à mesma molaridade. Células T totais humanas (efetoras) foram adicionadas às cavidades para obter razão final de efetor:alvo (E:T) de 5:1. Ao utilizar-se PBMCs humanas como células efetoras, utilizou-se razão E:T final de 10:1. Grupos controle negativos foram representados apenas por células alvo ou efetoras. Como controle positivo para ativação de todas as células T humanas, utilizou-se 1 μg/ml de PHA-M (Sigma n° L8902). Para normalização, determinou-se a lise máxima das células alvo H929 MM (= 100%) por meio de incubação das células alvo com concentração final de 1% Triton X-100, incluindo a morte celular. Lise mínima (= 0%) foi representada por células alvo coincubadas apenas com células efetoras, ou seja, sem nenhum anticorpo biespecífico de células T. Após incubação por 20-24 horas a 37 °C, 5% de CO2, a liberação de LDH das células alvo de mieloma necrótico/apoptótico no sobrenadante foi medida com o kit de detecção de LDH (Roche Applied Science), seguindo as instruções do fabricante. O percentual de liberação de LDH foi plotado contra as concentrações de anticorpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 em curvas de reação à concentração. Quando aplicável, os valores EC50 foram medidos utilizando software Prism (GraphPad) e determinados como a concentração de anticorpo TCB que resulta em 50% de liberação máxima de LDH. Conforme exibido na Figura 26, anticorpos TCB anti-BCMA/anti-CD3 ((A, B) 83A10-TCB, (C, D) 83A10-TCBcv) induziram morte dependente da concentração de células de mieloma H929 positivas para BCMA, conforme medido por meio de liberação de LDH. A morte de células H929 foi específica, pois anticorpo controle DP47-TCB que não se liga a células alvo positivas para BCMA não induziu a liberação de LDH, mesmo sob a concentração mais alta de 1 nM (A). Embora os valores EC50 não fossem mensuráveis com o uso de software estatístico Prism (GraphPad) para 83A10-TCB (A, B) e 83A10-TCBcv (C, Experimento 1), a magnitude de valores EC50 pôde ser aproximadamente estimada em baixa potência de faixa picomolar para moléculas de TCB não carregadas e carregadas. Em segundo experimento, o efeito de 83A10-TCBcv foi avaliado no teste de morte de células T redirecionado e valor EC50 pôde ser medido a 1,5 pM. Os autores não puderam descartar que o valor EC50 levemente mais baixo (potência levemente melhor) podia dever-se à variabilidade do doador de sangue. A magnitude de potência para matar células H929 encontrava-se definitivamente, entretanto, na faixa picomolar baixa. Os resultados gerais sugerem que 83A10-TCB (sem variante de carga) x 83A10-TCBcv (com variante de carga) exibe propriedades biológicas similares em testes com base em células. TABELA 15: VALORES EC50 E ESTIMATIVAS PARA MORTE DE CÉLULAS T REDIRECIONADA DE CÉLULAS H929 INDUZIDAS POR ANTICORPOS TCB ANTI- BCMA/ANTI-CD3

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T "2+1 IGG CROSSFAB, INVERTIDO"COM MODIFICAÇÕES DE CARGA (ANTI-HER2/ANTI-CD3) E ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T "2+1 IGG CROSSFAB"COM MODIFICAÇÕES DE CARGA (ANTI-HER2/ANTI-CD3)

[00389] Uma ilustração esquemática das moléculas preparadas neste exemplo é exibida na Figura 27. A molécula “2+1 IgG CrossFab, invertido” anti-Her2/anti-CD3 com modificações de carga (denominada neste exemplo “TCB Her2”) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 21, 52, 53 e 54. A molécula “2+1 IgG CrossFab” anti-Her3/anti-CD3 com modificações de carga (denominada neste exemplo “TCB Her3”) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 21,55, 56 e 57.

[00390] As moléculas foram preparadas, purificadas e analisadas conforme descrito no Exemplo 1 acima (com uma única etapa de SEC preparativa).

[00391] As duas moléculas poderão ser purificadas com alta qualidade final exibida por meio de cromatografia de exclusão de tamanhos analítica e CE-SDS (Tabelas 16 e 17). Embora a recuperação do TCB Her2 nesta preparação fosse mais baixa em comparação com TCB Her3, a proteína era quase pura após as duas etapas de purificação (Proteína A e SEC). Análise de CE-SDS exibe apenas 1,18% de impurezas com baixo peso molecular a cerca de 164 kDa (Tabela 17). A espécie detectada a 187,28 kDa corresponde à molécula alvo sem glicosilação com ligação N sobre o domínio Fc (esta espécie é comumente detectada por meio de CE-SDS para IgG1 humana após a produção em células eucarióticas).

[00392] TCB Her3 poderá ser purificado com boa recuperação. A qualidade final foi superior ao TCB Her2 comparando o teor de monômero final. Além disso, CE-SDS exibe 100% de proteína alvo, considerando que o pico detectado a 192,05 kDa corresponde à espécie de Fc não glicosilada.

[00393] Para as duas preparações, nenhuma impureza com baixo peso molecular relativa ao produto tal como cadeias leves livres (peso molecular esperado a 25 kDa), cadeias leves dimerizadas como pode ocorrer por meio da introdução de apenas uma troca de CH1-CL sobre uma cadeia leve (peso molecular esperado a 50 kDa) nem moléculas com cadeias leves ligadas de forma não covalente ou faltantes (peso molecular esperado a 125 kDa, 150 kDa ou 175 kDa) foram detectadas por meio de CE-SDS ou cromatografia de exclusão de tamanhos analítica. TABELA 16: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS TCB ANTI- HER2/ANTI-CD3 E ANTI-HER3/ANTI-CD3 COM MODIFICAÇÕES DE CARGA TABELA 17: ANÁLISES DE CE-SDS (NÃO REDUZIDAS) DE MOLÉCULAS TCB ANTI- HER2/ANTI-CD3 E ANTI-HER3/ANTI-CD3 COM MODIFICAÇÕES DE CARGA

LIGAÇÃO DE TCB HER2 E TCB HER3 A CÉLULAS

[00394] Células de suspensão de Jurkat foram colhidas, lavadas com tampão FACS (PBS + 0,1% BSA) uma vez e a viabilidade foi determinada por meio de ViCell.

[00395] Células de tumores KPL-4 aderentes (gentilmente fornecidas por J. Kurebayashi, Escola Médica de Kawasaki, Japão) foram colhidas com tampão de dissociação celular (Gibco Invitrogen) e lavadas com tampão FACS uma vez, antes da determinação da viabilidade por meio de ViCell.

[00396] 0,2 milhão de células forakm colocadas em placas por cavidade de uma placa com 96 cavidades e fundo abaulado e as placas foram centrifugadas por quatro minutos a 400 g. Em seguida, foram adicionados 25 μl por cavidade das diluições de TCB em tampão FACS às células. As células foram incubadas por trinta minutos no refrigerador. As células foram lavadas duas vezes em seguida com 150 μl de tampão FACS por cavidade.

[00397] 25 μl de anticorpo secundário adequadamente diluído (fragmento de F(ab’)2 AffiniPure conjugado a FITC, anti-IgG humano de cabra, específico de fragmento F(ab’)2, Jackson ImmunoResearch) foram adicionados por cavidade e as placas foram manchadas por trinta minutos adicionais a 4 °C no escuro.

[00398] As placas foram lavadas duas vezes com 150 μl de tampão FACS por cavidade e novamente suspensas em 150 μl de tampão FACS. Realizou-se análise utilizando BD FACS Canto II, equipado com software FACS Diva. Valores de fluorescência média (MFI) foram plotados contra a concentração das moléculas TCB.

[00399] Conforme exibido na Figura 29, as duas TCBs exibem boa ligação dependente de concentração aos seus antígenos alvo correspondentes sobre células.

ATIVAÇÃO DE CÉLULAS EFETORAS T CD8+ HUMANAS, APÓS LISE MEDIADA POR CÉLULAS T DE CÉLULAS DE TUMORES HUMANOS, INDUZIDA PELO TCB HER3

[00400] Células efetoras T CD8+ de um experimento clássico de lise de células de tumor (conforme descrito abaixo) com TCB Her3 utilizando razão entre efetor e alvo (E:T) de 10:1 e tempo de incubação de 48 horas foram avaliadas para determinar o percentual de células positivas para CD69.

[00401] Resumidamente, após a incubação, PBMCs foram transferidas para uma placa com 96 cavidades e fundo abaulado, centrifugadas a 350 x g por cinco minutos e lavadas por duas vezes com PBS contendo 0,1% BSA. Manchas de superfície para CD8 (Biolegend n° 300908) e CD69 (BioLegend n° 310904) foram realizadas de acordo com as indicações dos fornecedores. As células foram lavadas duas vezes com 150 μl/cavidade de PBS contendo 0,1% de BSA e fixadas por vinte minutos a 4° C utilizando 100 μl/cavidade de PFA a 1%. Após centrifugação, as amostras foram novamente suspensas em 200 μl/cavidade de PBS 0,1% BSA e analisadas em FACS CantoII (Software FACS Diva).

[00402] Conforme exibido na Figura 30, o TCB Her3 induz a retícula de células T e células de tumor (KPL-4) por meio das suas porções de direcionamento correspondentes e induz a ativação de células T de forma dependente da concentração.

TESTE DE ATIVAÇÃO DE JURKAT-NFAT

[00403] A capacidade do TCB Her2 e do TCB Her3 de induzir a retícula de células T e subsequente ativação de células T foi determinada utilizando cocultivos de células alvo positivas para antígenos de tumores (KPL- 4) e células relatoras de Jurkat-NFAT (linhagem de células relatoras de leucemia linfática aguda humana que expressa CD3 com um promotor de NFAT, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega n° CS176501). Mediante ligação simultânea da molécula de TCB a antígeno Her2 humano, respectivamente Her3 humano (expresso sobre células de tumores) e antígeno CD3 (expresso sobre células relatoras de Jurkat-NFAT), o promotor de NFAT é ativado e gera expressão de luciferase de vaga-lume ativa. A intensidade do sinal de luminescência (obtido por meio da adição de substrato de luciferase) é proporcional à intensidade da ativação e sinalização de CD3.

[00404] Para o teste, células de tumores humanos KPL-4 foram colhidas com tampão de dissociação celular (Gibco Invitrogen) e a viabilidade foi determinada utilizando ViCell. 20.000 células/cavidade foram colocadas em placas com 96 cavidades com paredes brancas e fundo plano (Greiner Bio-One) e foram adicionados TCBs diluídos ou meio (para controles). Em seguida, células relatoras de Jurkat-NFAT foram colhidas e a viabilidade foi determinada utilizando ViCell. As células foram novamente suspensas em meio de cultivo celular e adicionadas a células de tumores para obter E:T final de 2,5:1 (para TCB Her2) ou 5:1 (para TCB Her3) conforme indicado e volume final de 100 μl por cavidade. As células foram incubadas por cinco horas a 37 °C em um incubador umidificado. Ao final do tempo de incubação, 100 μl/cavidade de solução ONE-Glo (Promega, n° E6120) (1:1 ONE-Glo e volume de meio de teste por cavidade) foram adicionados a cavidades e incubados por dez minutos à temperatura ambiente no escuro. Detectou-se a luminescência utilizando leitor ELISA WALLAC Victor3 (PerkinElmer2030), 5 seg/cavidade como tempo de detecção.

[00405] Conforme ilustrado na Figura 31, as duas moléculas de TCB induzem a retícula de células T por meio de CD3 e subsequente ativação de células T. O TCB Her3 é levemente mais potente sobre células KPL-4, o que poderá ser explicado por nível mais alto de Her3 sobre Her2 nessas células alvo.

LISE DE CÉLULAS DE TUMOR INDUZIDA PORTCB HER2 E TCB HER3

[00406] A lise de células de tumor de células alvo de tumores que expressam Her2 ou Her3 induzida pelas moléculas de TCB correspondentes foi determinada, utilizando células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) como efetores, em E:T de 10:1. A lise de células de tumores foi determinada por meio de medição de LDH liberado nos sobrenadantes após 24 horas e 48 horas mediante incubação com os TCBs, conforme indicado.

[00407] PBMCs humanas foram isoladas a partir de sangue fresco ou de uma camada plaquetária. Resumidamente, sangue foi diluído a 2:1 (sangue fresco) ou 3:1 (camada plaquetária) com PBS. Cerca de 30 ml da mistura de sangue e PBS foram colocados sobre 15 ml de Histopaque (Sigma) e centrifugados por trinta minutos a 450 x g sem freio à temperatura ambiente. Os linfócitos foram coletados com uma pipeta de 10 ml em tubos de 50 ml contendo PBS. Os tubos foram cheios até 50 ml com PBS e centrifugados por dez minutos a 350 g. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em 50 ml de PBS e centrifugada por dez minutos a 300 x g. A etapa de lavagem foi repetida uma vez. As células foram novamente suspensas em RPMI contendo 10% FCS e 1% GlutaMax (Life Technologies) e armazenadas a 37 °C, 5% CO2 no incubador até o início do teste (não mais de 24 horas).

[00408] Células alvo foram colhidas com Tripsina/EDTA, lavadas e colocadas em placas sob densidade de 30.000 células/cavidade utilizando placas com 96 cavidades com fundo plano. As células foram mantidas em adesão por uma noite em um incubador umidificado. No dia do teste, as placas de teste foram centrifugadas a 350 x g por cinco minutos e o meio foi aspirado. Foram adicionados 100 μl por cavidade de meio de teste.

[00409] Os TCBs foram adicionados nas concentrações indicadas (faixa de 0,001 pM a 1 nM para o TCB Her3 e 0,01 pM a 100 nM para o TCB Her2, em triplicatas). PBMCs foram adicionadas a células alvo na razão E:T final de 10:1. A morte de células alvo foi determinada após 24 e 48 horas de incubação por meio de quantificação de LDH (lactato desidrogenase) liberada em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). Atingiu-se lise máxima das células alvo (= 100%) por meio de incubação de células alvo com 1% Triton X-100. Lise mínima (= 0%) designa células alvo coincubadas com células efetoras sem anticorpo biespecífico. Os valores EC50 foram calculados utilizando GraphPadPrism5.

[00410] Em outro experimento, determinou-se a lise de células de tumores por meio de atividade de Caspase 3/7 após 6,5 horas medindo-se a luminescência em um leitor de microplatas (tempo de leitura de cinco segundos por cavidade).

[00411] Para determinação da atividade de Caspase 3/7, células alvo KPL-4-Caspase-3/7 GloSensor (células KPL-4 transfectadas de forma estável com plasmídeo GloSensor) foram colhidas conforme descrito acima. Após uma lavagem com PBS, a concentração foi ajustada em 0,3 x 106células/ml no meio de teste (RPMI1640, 2% FCS, 1% Glutamax) e misturada com 2% v/v reagente cAMP GloSensor (Promega). 100 μl (= 30.000 células) dessa suspensão de células alvo foram transferidos para cada cavidade de uma placa com fundo plano e 96 cavidades com paredes brancas.

[00412] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por meio de centrifugação de densidade Histopaque de preparações de linfócitos enriquecidas (camadas plaquetárias) obtidas de doadores humanos saudáveis, conforme descrito acima. O teste de lise de células de tumor foi realizado essencialmente conforme descrito acima.

[00413] Os resultados ilustrados na Figura 32C e na Figura 33 ilustram que a molécula de TCB Her3 induz apoptose potente e dependente de concentração e lise de células de tumores KPL-4.

[00414] O mesmo é válido para TCB Her2 ilustrado nas Figuras 32A e B e exibe lise dependente de concentração significativa de células de tumores ao longo do tempo. EC50 da morte parece, portanto, depender do nível de expressão de Her2 sobre a célula alvo correspondente. Quanto mais alto o nível de expressão, melhor a morte de células de tumor por TCB Her2.

EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T “(FAB)2- CROSSFAB” COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA (ANTI-MCSP/ANTI-CD3)

[00415] Uma ilustração esquemática das moléculas preparadas neste exemplo é exibida na Figura 34. A molécula “(Fab)2-CrossFab” anti- MCSP/anti-CD3 com modificações de carga nos aglutinantes de MCSP (denominada “(Fab)2-XFab-LC007cv” neste exemplo) compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 58, 59 e 60. A molécula “(Fab)2- CrossFab” anti-MCSP/anti-CD3 sem modificações de carga (denominada “(Fab)2-XFab" neste exemplo) compreende as sequências de aminoácidos correspondentes sem as modificações de carga.

[00416] As moléculas foram preparadas, purificadas e analisadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 acima, com as adaptações a seguir.

[00417] Para a produção dessas moléculas, as células HEK293- EBNA foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em razão 1:2:1 (“cadeia pesada de vetor”: “Fab anti-MSCP de cadeia leve de vetor”: “Fab anti-CD3 de cadeia leve de vetor”).

[00418] A concentração das construções no meio de cultivo foi determinada por meio de HPLC-Proteína A, com base na ligação de partes do domínio CH1 à Proteína A sob pH 8,0 e eluição em etapas a partir de pH 2,5, conforme descrito no Exemplo 1.

[00419] As proteínas secretadas foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultivo celular por meio de cromatografia de afinidade utilizando cromatografia de afinidade de ligação a CH1, seguida por uma etapa cromatográfica de exclusão de tamanhos.

[00420] Para cromatografia de afinidade, o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna HiTrap KappaSelect (CV = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada com 5 ml de 50 mM de Tris, 100 mM de glicina, 150 mM de NaCl, pH 8,0. Proteína não ligada foi removida por meio de lavagem com pelo menos dez volumes de coluna de 50 mM de Tris, 100 mM de glicina e 150 mM de NaCl, pH 8,0. A proteína alvo foi eluída em gradiente de 10 volumes de coluna a 50 mM de Tris, 100 mM de glicina e 150 mM de NaCl, pH 2,0. A solução de proteína foi neutralizada por meio da adição de 1/40 de 2 M Tris, pH 8,0. A proteína alvo é concentrada e filtrada antes da carga sobre uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de cloreto de sódio e 0,01% Tween-20, pH 6,0.

[00421] As duas moléculas foram produzidas e purificadas seguindo o mesmo método. Em comparação com a molécula sem modificações de carga ("(Fab)2-XFab"), o título da molécula com cargas foi dez vezes mais baixo. A recuperação final foi, entretanto, cerca de duas vezes mais alta para a molécula com as modificações de carga nos dois Fabs anti-MCSP (“(Fab)2-XFab-LC007cv”) (Tabela 18). A molécula (Fab)2-XFab-LC007cv pôde ser purificada até teor de monômeros final de 95,8% exibido por meio de cromatografia de exclusão de tamanhos e pureza final comprovada por meio de análises de CE-SDS de 94,33%. TABELA 18: RESUMO DA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS TCB ANTI- MCSP/ANTI-CD3 COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA TABELA 19: ANÁLISES DE CE-SDS (NÃO REDUZIDAS) DE MOLÉCULAS TCB ANTI- MCSP/ANTI-CD3 COM MODIFICAÇÕES DE CARGA

LIGAÇÃO CELULAR DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T “(FAB)2- CROSSFAB” COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA (ANTI-MCSP/ANTI-CD3)

[00422] Células de suspensão de Jurkat-NFAT foram colhidas, lavadas com tampão FACS (PBS + 0,1% BSA) uma vez e a viabilidade foi determinada por meio de ViCell.

[00423] Células de tumores MV-3 aderentes foram colhidas com tampão de dissociação celular (Gibco Invitrogen) e lavadas com tampão FACS uma vez, antes da determinação da viabilidade por meio de ViCell.

[00424] 0,2 milhão de células foram colocadas em placas por cavidade de uma placa com 96 cavidades e fundo abaulado e as placas foram centrifugadas por quatro minutos a 400 x g. Em seguida, foram adicionados 25 μl por cavidade das diluições de anticorpo primário em tampão FACS às células. As células foram incubadas por trinta minutos no refrigerador. As células foram lavadas duas vezes em seguida com 150 μl de tampão FACS por cavidade.

[00425] 25 μl do anticorpo secundário diluído (fragmento de F(ab’)2 AffiniPure conjugado a FITC, anti-IgG humano de cabra, específico de fragmento F(ab’)2, Jackson ImmunoResearch) foram adicionados por cavidade e as placas foram manchadas por trinta minutos adicionais a 4 °C no escuro.

[00426] As placas foram lavadas duas vezes com 150 μl de tampão FACS por cavidade e novamente suspensas em 150 μl de tampão FACS. Realizou-se análise utilizando BD FACS Canto II, equipado com software FACS Diva. Valores de fluorescência média (MFI) foram plotados contra a concentração das moléculas TCB MCSP.

[00427] Conforme exibido na Figura 36, a molécula (Fab)2-XFab- LC007cv exibe ligação dependente de concentração a MCSP humano sobre MV-3 e a CD3 humano sobre células Jurkat. A molécula (Fab)2-XFab sem modificações de carga exibe ligação comparável a MCSP humano como (Fab)2-XFab-LC007cv (ligação de EC50 de 2,3 nM para o (Fab)2-XFab- LC007cv contra EC50 1,5 nM para o (Fab)2-XFab).

LISE DE CÉLULAS DE TUMORES MEDIADA POR ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T “(FAB)2-CROSSFAB” COM E SEM MODIFICAÇÕES DE CARGA (ANTI- MCSP/ANTI-CD3)

[00428] A lise de células de tumor de células alvo de tumor MV-3 que expressam MCSP induzida pelas moléculas TCB MCSP foi realizada utilizando PBMCs humanas como efetores em E:T de 10:1. A lise de células de tumores foi determinada por meio de medição de LDH liberado nos sobrenadantes após 24 horas e 48 horas mediante incubação com os TCBs.

[00429] Resumidamente, células alvo foram colhidas com Tripsina/EDTA, lavadas e colocadas em placas sob densidade de 25.000 células/cavidade utilizando placas com 96 cavidades com fundo plano. As células foram mantidas em adesão por uma noite em um incubador umidificado. No dia do teste, as placas de teste foram centrifugadas a 350 x g por cinco minutos e o meio foi aspirado. Foram adicionados 100 μl por cavidade de meio de teste.

[00430] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de sangue fresco. Resumidamente, o sangue foi diluído a 2:1 com PBS. Cerca de 30 ml da mistura de sangue e PBS foram colocados sobre 15 ml de Histopaque (Sigma) e centrifugados por trinta minutos a 450 x g sem freio. Os linfócitos foram coletados com uma pipeta de 10 ml em tubos de 50 ml contendo PBS. Os tubos foram cheios até 50 ml com PBS e centrifugados por dez minutos a 350 x g. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em 50 ml de PBS e centrifugada por dez minutos a 300 x g. A etapa de lavagem foi repetida uma vez. As células foram novamente suspensas em RPMI contendo 10% FCS e 1% GlutaMax (Life Technologies) e armazenadas a 37 °C, 5% CO2 no incubador até o início do teste (não mais de 24 horas).

[00431] Para o teste de mortalidade, as moléculas de TCB foram adicionadas nas concentrações indicadas (faixa de 0,04 pM - 10 nM em triplicata). PBMCs foram adicionadas a células alvo na razão E:T final de 10:1. A morte de células alvo foi determinada após 24 e 48 horas de incubação por meio de quantificação de LDH (lactato desidrogenase) liberada em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, n° 11 644 793 001). Atingiu-se lise máxima das células alvo (= 100%) por meio de incubação de células alvo com 1% Triton X-100. Lise mínima (= 0%) designa células alvo coincubadas com células efetoras sem anticorpo biespecífico. Os valores EC50 foram calculados utilizando GraphPadPrism5.

[00432] Conforme ilustrado na Figura 37, as duas moléculas exibem lise dependente de concentração de células alvo que expressam hMCSP. A potência da molécula (Fab)2-XFab-LC007cv (EC50 2,8 pM após 24 horas e 8,6 pM após 48 horas) é comparável à potência da molécula (Fab)2- XFab sem modificações de carga (EC50 5,9 pM após 24 horas e 4,8 pM após 48 horas).

[00433] Embora a presente invenção tenha sido descrita com alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e os exemplos não deverão ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção. As descrições de todas as literaturas científicas e patentes mencionadas no presente são expressamente incorporadas integralmente como referência. 1/1

Claims

1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS BIESPECÍFICOS ATIVADORES DE CÉLULAS T, caracterizada por compreender uma cadeia pesada de SEQ ID N° 18, uma cadeia pesada de SEQ ID N° 19, uma cadeia leve de SEQ ID N° 20 e uma cadeia leve de SEQ ID N° 21.