WO2023043156A1 - 항-vegfr2(kdr) 개량 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-vegfr2(kdr) 개량 항체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023043156A1
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antibody
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light chain
antigen
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남주령
정종근
이원섭
유진산
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주식회사 파멥신
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to anti-VEGFR2 (KDR) improved antibodies or antigen-binding fragments thereof exhibiting improved properties and uses thereof.
  • the present invention substitutes the heavy chain FR (framework regoin) of a human antibody that specifically binds to VEGFR2/KDR from VH1 to VH3 and the light chain FR (framework regoin) from VL1 to VK1, and induces mutation to induce antigenic
  • angiogenesis angiogenesis
  • VEGFR2/KDR is the primary angiogenic receptor, binds to VEGF isoforms A, C, D and E and is important for endothelial cell differentiation as well as mitogenic, angiogenic and invasiveness-enhancing effects of VEGF.
  • Anti-VEGFR2 antibodies are all known VEGF isotypes
  • VEGFR2/KDR VEGFR2/KDR
  • targeting the receptor reduces the probability of completely inhibiting signaling even in the presence of very high levels of VEGF isoforms. increase
  • Angiogenesis means the generation of new blood vessels from existing blood vessels by the growth, division, migration, etc. of endothelial cells. In adults, except for special cases such as wound healing and female reproductive cycle, It doesn't happen. However, it is associated with tumor growth and metastasis, age-related macular degeneration, rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, psoriasis and chronic inflammation. Excessive angiogenesis has been reported in the same disease (Cameliet and Jain, Nature, 407:249, 2000), and for this reason, many efforts have been made to treat diseases, especially tumors, using angiogenesis inhibitors.
  • vascular endothelial growth factor vascular endothelial growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGFb transforming growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • endothelial cell growth factor is an endothelial cell-specific factor directly involved in the growth, differentiation and migration of endothelial cells. is the most abundant isoform (Tisher et al., J Biol Chem, 266: 11947, 1991).
  • Endothelial growth factor regulates the formation of new blood vessels from the differentiation of endothelial precursors (angioblasts) in situ, embryonic tissue (Breier et al., Development (Camb), 114:521, 1992), macrophages , expressed in proliferating epithelial keratinocytes during wound healing (Brown et al., J. Exp. Med., 176:1375, 1992) and may be responsible for tissue edema associated with inflammation (Ferrara et al., Endocr Rev., 13:18, 1992).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF receptor The biological function of VEGF is mediated through the VEGF receptor, which has high affinity for VEGF, and the receptor is endothelial cells during embryogenesis (Millauer et al., Cell, 72: 835, 1993) and during tumorigenesis. is selectively expressed in
  • the VEGF receptor (VEGFR) is a class III receptor-type tyrosine kinase characterized by having several, usually 5 or 7, immunoglobulin-like loops in its aminoterminal extracellular receptor ligand-binding domain (Kaipainen et al ., J. Exp. Med., 178: 2027, 1993).
  • the other two sites include a transmembrane site and a carboxy-terminal intracellular catalytic domain interrupted by the insertion of a hydrophilic interkinase sequence of variable length, termed the kinase insert domain (Terman et al., Oncogene, 6: 1677, 1991 ).
  • VEGFR is the fms-like tyrosine kinase receptor (flt-1), or VEGFR-1 (Shibuya et al., Onco gene, 5: 519, 1990; WO 92/14248; Terman et al., Oncogenes, 6: 1677, 1991) and receptor/fetal kinase containing kinase insert domains (KDR/flk-1), or VEGFR-2 (Matthews et al. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026, 1991).
  • VEGFR-3 flt-4
  • VEGF homologs VEGF-C and VEGF-D plays an important role in the development of lymphatic vessels.
  • Flk-1 High levels of Flk-1 are expressed by endothelial cells infiltrating gliomas. (Plate et al., Nature 359:845, 1992). Flk-1 levels are specifically upregulated by VEGF produced by human glioblastomas (Plate et al., Cancer Res. 53: 5822, 1993).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF activity inhibits the growth of human tumor grafts in nude mice (Kim et al., Nature 362: 841, 1993), suggesting that VEGF in tumor-associated angiogenesis indicates that it plays a direct role.
  • mAb neutralizing anti-VEGF monoclonal antibody
  • VEGF ligands are upregulated in tumor cells and their receptors are upregulated in tumor-infiltrating vascular endothelial cells, the expression of VEGF ligands and their receptors is low in normal cells not associated with angiogenesis. Therefore, these normal cells block the interaction between VEGF and its receptors, so that angiogenesis is inhibited, and thus tumor growth does not occur.
  • VEGFR-2 High levels of VEGFR-2 are expressed by endothelial cells infiltrating gliomas and are specifically upregulated by VEGF produced by human glioblastomas (Plate et al., Nature, 359:845, 1992; Plate et al. al., Cancer Res., 53:5822, 1993). Since VEGFR-2 transcripts are rarely detected in normal brain endothelial cells, high levels of VEGFR-2 expression in glioblastoma-associated endothelial cells (GAEC) indicate that receptor activity is induced during tumorigenesis.
  • GEC glioblastoma-associated endothelial cells
  • VEGF is expressed at high levels in various types of tumors (Plate et al., Nature, 359:8435, 1992; Dvorak et al., J. Exp. Med., 174:1275, 1991), and new capillaries They cluster around VEGF-producing tumor cells (Plate et al., Nature, 359:8435, 1992). VEGF expression is strongly up-regulated under hypoxic conditions, such as those associated with rapidly growing tumors (Shweiki et al., Nature, 359:843, 1992).
  • VEGF neutralization by antibodies such as Avastin is associated with cancer or clinically approved therapies for inhibiting other angiogenic diseases such as AMD.
  • Avastin Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov., 3(5):391, 2004; Avery et al., Ophthalmology, 113(3):363, 2006
  • resistance to VEGF blockade was found even when combined with chemotherapy. This resistance may be associated with remodeled vasculature and increased expression of other angiogenic factors. Accordingly, there is still a need in the art for improved compositions and methods for inhibiting cancer and other diseases associated with angiogenesis.
  • TKIs tyrosine kinase inhibitors
  • anti-KDRP antibodies can inhibit KDR-mediated angiogenesis
  • the antibody approach has advantages over TKIs.
  • anti-KDR antibodies are more specific KDR targets (ie, anti-KDR antibodies do not inhibit other VEGF receptors). Because of this high specificity, anti-KDR antibodies can limit and/or avoid off-target effects and toxicity caused by less specific TKIs (Witte et al., Cancer Metastasis Rev., Jun. ;17(2):155, 1998).
  • anti-KDR antibodies are expected to prevent all known VEGFs from binding to VEGFR2/KDR.
  • Anti-KDR antibodies may have a stronger inhibitory effect on tumor angiogenesis than simply blocking VEGF-A. It is possible that therapy with anti-KDR antibodies may be effective in cases of Avastin resistance.
  • the inventors of the present application have substituted the FR (framework regoin) of the heavy chain variable region from VH1 to VH3 and the light chain FR (framework regoin) to VL1 in order to improve an antibody that specifically binds to the existing VEGFR2 / KDR. was substituted with VK1, and mutations were induced in the CDR3 regions of the heavy and light chains to prepare a novel antibody having increased affinity for an antigen, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide improved antibodies or antigen-binding fragments of antibodies having improved binding ability to VEGFR2/KDR.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a vector containing the nucleic acid, a transformed cell containing the vector, and a method for preparing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing angiogenic diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for co-administration with other therapeutic agents containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a heavy chain CDR1 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 19 and 25;
  • a heavy chain CDR2 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20 and 26, and
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 51, 52 and 53, and
  • a light chain CDR1 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, and 28;
  • a light chain CDR2 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23 and 29, and
  • VEGFR2/KDR binds to VEGFR2/KDR, including a light chain variable region comprising a light chain CDR3 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24 and 30.
  • the present invention also relates to an antibody that binds to VEGFR2/KDR comprising a heavy chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 36, 40, 44, 48, or its An antigen-binding fragment is provided.
  • the present invention also relates to an antibody that binds to VEGFR2/KDR comprising a light chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a selected sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 34, 38, 42, 46, and 50 or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a heavy chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 36, 40, 44, 48 and SEQ ID NOs: 34, 38, 42, 46, 50 Provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGFR2 / KDR comprising a light chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a selected sequence selected from the group consisting of.
  • the present invention also provides nucleic acids encoding the antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the present invention also provides a vector containing the nucleic acid.
  • the present invention also provides a transformed cell comprising the vector.
  • the present invention also provides a method for producing the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following steps: (a) culturing the cells; and (b) recovering the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cells.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating angiogenic diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a composition for diagnosis of angiogenic disease comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating tumor or cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a composition for co-administration with other therapeutic agents containing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Figure 1 is a sequence grafted with the heavy chain CDR sequence of 6A6.
  • Figure 2 is a sequence grafted with the light chain CDR sequence of 6A6.
  • FIG. 3 shows ELISA results of evaluating the binding of transiently expressed and purified anti-Ang2 antibodies to human and mouse Ang2 and Ang1.
  • Figure 4 is a result showing the ability to neutralize human and mouse Ang2 / Tie2 binding of the selected anti-Ang2 antibody.
  • the present invention relates to improved antibodies of fully humanized antibodies that neutralize vascular endothelial growth factor receptors.
  • it relates to improved antibodies of human monoclonal antibodies (registered patent No. 10-0883430) neutralizing vascular endothelial growth factor receptors and their uses.
  • the inventors of the present application were invented from a fully human antibody library and improved a unique antibody that targets VEGFR-2/KDR and at the same time has reactivity to mouse or rat-derived flk-1 (a VEGFR-2 homologue). Although the superiority of the antibody has been proven through clinical trials, the binding ability of the antibody protein to the antigen is rather low and the in vivo half-life is short. By improving this, it is expected to increase efficacy as an immuno-anticancer agent and increase efficacy in diseases related to angiogenesis.
  • FR frame regoin of the heavy chain variable region
  • light chain FR framework regoin
  • the improved antibody was screened in the following manner. First, the CDR region sequence and framework (FR) sequence of 6A6 were identified, and the heavy chain CDR sequence was grafted to the human germline VH3 sequence and the light chain CDR sequence was grafted to the human germline VK1 using a CDR grafting technique.
  • FR framework
  • CDR grafting is generally a method of isolating DNA encoding the variable region sequence of a mouse monoclonal antibody, securing a CDR sequence through gene cloning, and then transplanting the CDR sequence into a suitable human antibody sequence in silico ( Hou S, et al.Humanization of an anti-CD34 monoclonal antibody by complementarity-determining region grafting based on computer-assisted molecular modeling.J Biochem.2008;144(1):115-20;and Kashmiri SV, De Pascalis R, Gonzales NR, Schlom J. SDR grafting--a new approach to antibody humanization.Methods.2005;36(1):25-34).
  • the framework of 6A6 with human germline VH1/VL1 was replaced with human germline VH3/VK1.
  • a heavy chain CDR1 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 19 and 25,
  • a heavy chain CDR2 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20 and 26, and
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 51, 52 and 53, and
  • a light chain CDR1 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, and 28;
  • a light chain CDR2 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23 and 29, and
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGFR2/KDR comprising a light chain variable region comprising a light chain CDR3 comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24 and 30.
  • antibody refers to an anti-VEGFR2/KDR antibody that specifically binds to VEGFR2/KDR.
  • the scope of the present invention includes not only complete antibody forms that specifically bind to VEGFR2/KDR, but also antigen-binding fragments of the antibody molecules.
  • a complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to the heavy chain by disulfide bonds.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses include gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3). ), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • An antigen-binding fragment of an antibody or antibody fragment refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, and the like.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and a first constant region (CH1) of heavy chains, and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • An F(ab')2 antibody is produced by forming a disulfide bond between cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Double-chain Fv two-chain Fv
  • scFv single-chain Fv
  • scFv single-chain Fv
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of whole antibodies with papain, and F(ab')2 fragments can be obtained by digestion with pepsin), and gene It can also be produced through recombinant technology.
  • proteolytic enzymes for example, Fab can be obtained by restriction digestion of whole antibodies with papain, and F(ab')2 fragments can be obtained by digestion with pepsin
  • gene It can also be produced through recombinant technology.
  • an antibody according to the present invention is in the form of an Fv (eg scFv) or a complete antibody.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3) or gamma 4 (IgG4).
  • Light chain constant regions can be of the kappa or lambda type.
  • the term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence for imparting specificity to an antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3. and fragments thereof.
  • the term “light chain” refers to a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to impart specificity to an antigen. I mean everything.
  • Antibodies of the present invention include monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F(ab') fragments, disulfide-linked Fvs (sdFV) and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of such antibodies; and the like.
  • the monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, the same thing except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts in the individual antibodies comprising the population. Monoclonal antibodies are highly specific, directed against a single antigenic site. In contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • Epitope means a protein determinant to which an antibody can specifically bind.
  • An epitope usually consists of a group of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and usually has specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Conformational and non-stereotypic epitopes are distinguished by loss of binding to the former but not to the latter in the presence of a denaturing solvent.
  • non-human (eg, murine) antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are derived from a non-human species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit, or non-human, which retains the desired specificity, affinity, and capacity for residues from a hypervariable region of the recipient. It is a human immunoglobulin (recipient antibody) in which residues from a primate hypervariable region have been replaced.
  • human antibody is a molecule derived from human immunoglobulin, and means that all amino acid sequences constituting the antibody, including complementarity determining regions and structural regions, are composed of human immunoglobulin.
  • heavy and/or light chains are identical to or homologous to corresponding sequences in antibodies that are derived from a particular species or belong to a particular antibody class or subclass, while the remaining chain(s) are from another species or belong to another antibody class or subclass. Included are “chimeric” antibodies (immunoglobulins) that are identical to or homologous to the corresponding sequence in an antibody belonging to a subclass, as well as fragments of such antibodies that exhibit the desired biological activity.
  • Antibody variable region refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule that include the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs; i.e., CDR1, CDR2, and CDR3), and the framework regions (FR). .
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • VH refers to the variable region of the heavy chain.
  • VL refers to the variable region of the light chain.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Each variable region typically has three CDR regions identified as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • the present invention includes a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 2.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGFR2 / KDR is a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2 and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 3, of SEQ ID NO: 4
  • a light chain variable region comprising light chain CDR1, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 6;
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 9, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 12 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 15, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 17, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 18. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 22, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 23, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 24 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 25, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 26, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 27, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 28, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 29, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 30 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 51, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 17, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 18 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 52, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 17, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 18 a light chain variable region that does, or
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 53, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 17, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 18. It may include a light chain variable region to.
  • a "framework region” is a variable region residue other than a CDR residue.
  • Each variable region typically has four FRs identified as FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • Fv fragment is an antibody fragment that contains the complete antibody recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy chain variable region and one light chain variable region in tight, virtually covalent association, for example, an scFv.
  • the “Fab” fragment contains the variable and constant domains of the light chain and the variable and first constant domains of the heavy chain (CH1).
  • F(ab')2 antibody fragments generally comprise a pair of Fab fragments covalently linked near their carboxy termini by hinge cysteines between them.
  • a “single-chain Fv” or “scFv” antibody fragment comprises the VH and VL domains of an antibody, which domains are present in a single polypeptide chain.
  • the Fv polypeptide may further include a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows the scFv to form a desired structure for antigen binding.
  • the VEGFR2/KDR antibody may include single or double chains. Functionally, the binding affinity of the VEGFR2/KDR antibody is in the range of 10 ⁇ 5 M to 10 ⁇ 12 M.
  • the binding affinity of the VEGFR2 / KDR antibody is 10 -6 M to 10 -12 M, 10 -7 M to 10 -12 M, 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -12 M, 10 -5 M to 10 -11 M, 10 -6 M to 10 -11 M, 10 -7 M to 10 -11 M, 10 -8 M to 10 -11 M, 10 -9 M to 10 -11 M, 10 -10 M to 10 -11 M, 10 -5 M to 10 -10 M, 10 -6 M to 10 -10 M, 10 -7 M to 10 -10 M, 10 -8 M to 10 -10 M, 10 -9 M to 10 -10 M, 10 -5 M to 10 -9 M, 10 -6 M to 10 -9 M, 10 -7 M to 10 -9 M, 10 -8 M to 10 -9 M,
  • the present invention is an antibody that binds to VEGFR2 / KDR comprising a heavy chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 36, 40, 44, 48 or an antigen binding thereof It's about shorts.
  • the present invention also relates to an antibody that binds to VEGFR2/KDR comprising a light chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a selected sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 34, 38, 42, 46, and 50 Or it relates to an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a heavy chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 36, 40, 44, 48 and SEQ ID NOs: 34, 38, 42, 46, 50 It relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGFR2 / KDR comprising a light chain variable region comprising a sequence having 80% or more homology with a selected sequence selected from the group consisting of.
  • the homology is 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% compared to the entire sequence of the claimed SEQ ID NO. %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or greater homology.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGFR2/KDR may include a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 36, 40, 44, and 48.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGFR2/KDR may include a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 34, 38, 42, 46, and 50.
  • It may include the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 48 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 50.
  • “Phage display” is a technique in which a variant polypeptide is displayed as a fusion protein with at least a portion of an envelope protein on the surface of a phage, eg, a filamentous phage particle.
  • the usefulness of phage display lies in the fact that large libraries of randomized protein variants can be targeted and rapidly and efficiently sorted for sequences that bind with high affinity to the target antigen. Displaying peptide and protein libraries on phage has been used to screen millions of polypeptides for those with specific binding properties.
  • Phage display technology has provided a powerful tool for generating and selecting novel proteins that bind specific ligands (eg antigens). Using phage display technology, large libraries of protein variants can be generated and sequences that bind with high affinity to the target antigen can be rapidly sorted.
  • a nucleic acid encoding a variant polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a viral envelope protein, eg, a gene III protein or a gene VIII protein.
  • Monovalent phage display systems have been developed in which a nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a portion of a gene III protein. In monovalent phage display systems, gene fusions are expressed at low levels and the wild-type gene III protein is also expressed to maintain particle infectivity.
  • Phage display technology has several advantages over conventional hybridoma and recombinant methods for producing antibodies with desired characteristics. This technology enables the generation of large antibody libraries with diverse sequences in a short time without using animals. Production of hybridomas or production of humanized antibodies may require several months of production time. In addition, since no immunization is required, the phage antibody library can generate antibodies against toxic or low antigenic antigens. Phage antibody libraries can also be used to generate and identify novel therapeutic antibodies.
  • Techniques for generating human antibodies from immunized, non-immunized human, germline sequences, or naive B cell Ig repertoires can be used using phage display libraries.
  • a variety of lymphoid tissues can be used to prepare na ⁇ ve or non-immune antigen-binding libraries.
  • a technique capable of identifying and isolating high-affinity antibodies from phage display libraries is important for isolating novel antibodies for therapeutic use.
  • Isolation of a high affinity antibody from a library may depend on the size of the library, the efficiency of production in bacterial cells and the diversity of the library.
  • the size of the library is reduced by inefficient production due to improper folding of the antibody or antigen-binding protein and the presence of stop codons.
  • Expression in bacterial cells may be inhibited if the antibody or antigen-binding domain does not fold properly. Expression can be improved by alternating mutations of residues on the surface of the variable/constant interface or selected CDR residues.
  • the sequence of the framework region is one element for providing proper folding when generating an antibody phage library in bacterial cells.
  • CDR3 regions have been found to be those that often participate in antigen binding. Since the CDR3 region on the heavy chain varies considerably in size, sequence, and structural conformation, various libraries can be prepared using it.
  • Diversity can also be generated by randomizing the CDR regions of the variable heavy and light chains using all 20 amino acids at each position.
  • the use of all 20 amino acids may result in a high diversity of variant antibody sequences and increase the chance of identifying novel antibodies.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention may include not only the sequence of the anti-VEGFR2 / KDR antibody of the present invention described herein, but also a biological equivalent thereof to the extent that it can specifically recognize VEGFR2 / KDR.
  • additional changes may be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of residues in the amino acid sequence of the antibody.
  • Such amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Accordingly, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the antibodies of the present invention or the nucleic acid molecules encoding them are construed to include sequences showing substantial identity with the sequences described in SEQ ID NOs.
  • the above substantial identity is at least 90% when the sequence of the present invention and any other sequence described above are aligned so as to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It refers to sequences exhibiting homology, most preferably at least 95% homology, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool is accessible from NCBI, etc., and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastp, blasm, blastx, tblastn, and tblastx on the Internet.
  • the BLAST is accessible at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • a sequence homology comparison method using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may have 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% of the specified sequence described herein or as a whole. , 99%, or greater homology.
  • homology can be determined by sequence comparison and/or alignment by methods known in the art. For example, a sequence comparison algorithm (ie, BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection can be used to determine the percent sequence homology of a nucleic acid or protein of the invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the nucleic acid may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31, 35, 39, 43, and 47 encoding heavy chain variable regions.
  • the nucleic acid may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33, 37, 41, 45, and 49 encoding light chain variable regions.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof can be recombinantly produced by isolating a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention. Nucleic acids are isolated and inserted into replicable vectors for further cloning (amplification of DNA) or further expression. Based on this, the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid in another aspect.
  • Nucleic acid has the meaning of comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic building blocks of nucleic acids, include not only natural nucleotides, but also analogs in which sugar or base sites are modified. .
  • the sequences of nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • DNA encoding the antibody is readily isolated or synthesized using conventional procedures (eg, by using oligonucleotide probes capable of specifically binding to DNA encoding the heavy and light chains of the antibody).
  • Vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.
  • the term "vector” refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; cosmid vector; and viral vectors such as bacteriophage vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors, and adeno-associated viral vectors.
  • the nucleic acid encoding the antibody is operably linked to a promoter.
  • “Operably linked” means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is linked to the other nucleic acid. It will regulate the transcription and/or translation of the sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, metallotionine promoter, ⁇ -actin promoter, human hemoglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian Promoters derived from animal viruses such as adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter from HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter from HIV , the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein Barr virus (EBV) and the promoter of Rouss sarcoma virus (RSV) can be used, and usually has a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • a mammalian Cell eg, metallotionine promoter, ⁇ -actin promoter, human hemoglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian Promoters derived from animal viruses such as
  • vectors may be fused with other sequences to facilitate purification of antibodies expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • the vector contains an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selectable marker, for example, for ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a cell transformed with the above-mentioned vector.
  • Cells used to generate the antibodies of the present invention may be, but are not limited to, prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cells.
  • Escherichia coli strains of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida), Proteus Prokaryotic host cells such as Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • Bacillus such as Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis
  • Streptomyces Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida)
  • Proteus Prokaryotic host cells such as Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines are COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • the cells can be cultured in various media. Among commercially available media, it can be used as a culture medium without limitation. All other necessary supplements known to those skilled in the art may also be included in suitable concentrations. Culture conditions such as temperature, pH, etc. are already in use with host cells selected for expression and will be apparent to those skilled in the art.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be recovered by, for example, centrifugation or ultrafiltration to remove impurities, and the resultant may be purified using, for example, affinity chromatography. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, and the like.
  • the antibody may be an IgG or a fragment including a variable region, that is, ScFv or Fab.
  • the variable region of the heavy chain may be IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating angiogenic diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Angiogenesis refers to the formation or growth of new blood vessels from previously existing blood vessels, and "angiogenesis-related disease” refers to a disease related to the occurrence or progression of angiogenesis. If it can be treated with the antibody, the disease can be included in the scope of angiogenesis-related diseases without limitation.
  • diseases associated with angiogenesis include cancer, metastasis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal graft rejection, macular degeneration, angiogenesis Neovascular glaucoma, erythrosis, proliferative retinopathy, psoriasis, hemophilic arthritis, capillary formation of atherosclerotic plaques, keloid , wound granulation, vascular adhesion, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, autoimmune diseases, Crohn's disease, restenosis , atherosclerosis, intestinal adhesions, cat scratch disease, ulcer, liver cirrhosis, nephritis, diabetic nephropathy, diabetic Diabetic Foot Ulcers, chronic kidney failure, diabetes mellitus, inflammatory diseases, idiopathic pulmonary fibrosis, sepsis, acute respiratory distress syndrome respiratory distress syndrome) and neurodegenerative diseases, but are not limited thereto.
  • the cancer includes esophageal cancer, stomach cancer, large intestine cancer, rectal cancer, oral cancer, pharynx cancer, larynx cancer, Lung cancer, colon cancer, breast cancer, uterine cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer ( testis cancer), bladder cancer, renal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, connective tissue cancer, skin cancer, It is selected from the group consisting of brain cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's lymphoma, lymphoma and multiple myeloid blood cancer, but is limited thereto It is not.
  • prevention or prophylaxis refers to any measure that inhibits or delays the onset of a disease of interest by administering an antibody or composition of the invention.
  • treatment or therapy refers to any action that results in improvement of symptoms or improvement of symptoms of a disease of interest by administration of an antibody or composition of the present invention.
  • the present invention for example, (a) a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof to VEGFR2 / KDR according to the present invention; And (b) it may be a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tumor or cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention may also be a method for preventing or treating tumor or cancer comprising administering the antibody or antigen-binding fragment thereof to a tumor or cancer patient.
  • the present invention may be a use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for inhibiting the mechanism of VEGFR2 / KDR, and a use for preventing or treating tumor or cancer through it.
  • a tumor or cancer that is a disease to which the composition is applied includes a tumor or cancer that typically overexpresses VEGF or VEGFR2/KDR, and a tumor or cancer that does not overexpress VEGF or VEGFR2/KDR.
  • tumors or cancers preferred for treatment include melanoma (eg, metastatic malignant melanoma), renal cancer (eg, clear cell carcinoma), prostate cancer (eg, hormone refractory prostate adenocarcinoma).
  • pancreatic adenocarcinoma breast cancer, colon cancer
  • lung cancer eg, non-small cell lung cancer
  • esophageal cancer head and neck squamous cell carcinoma
  • liver cancer ovarian cancer
  • cervical cancer thyroid cancer
  • glioblastoma glioma
  • leukemia lymphoma
  • the present invention includes refractory or recurrent cancers that can be treated using the antibodies of the present invention.
  • the present invention provides, for example, a method for treating angiogenic disease, comprising administering a therapeutically effective amount of the anti-VEGFR2/KDR antibody or antigen-binding fragment thereof to a patient in need of angiogenesis inhibition.
  • the treatment of the angiogenic disease may further include identifying a patient in need of angiogenesis inhibition prior to the administering step.
  • VEGFR2 / KDR related diseases comprising administering a therapeutically effective amount of the anti-VEGFR2 / KDR antibody or antigen-binding fragment thereof to a patient in need of prevention and / or treatment of VEGFR2 / KDR related diseases
  • a method for preventing and/or treating is provided.
  • the prevention and/or treatment method may further include identifying a patient in need of prevention and/or treatment of a VEGFR2/KDR-related disease prior to the administration step.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, which is commonly used in drug formulations, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, and calcium phosphate. , alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include at least one selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, and preservatives commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • an effective amount of the pharmaceutical composition or the antibody or antigen-binding fragment thereof may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intradermal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. may be administered.
  • the oral composition may be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device capable of transporting an active substance to a target cell.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount of a pharmaceutical composition for treating a disease sufficient for a reasonable benefit/risk ratio applicable to all medical treatments. The effective amount depends on the severity of the disease to be treated, the age and sex of the patient, the type of disease, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration, the rate of secretion, the duration of treatment, co-administration of the drug and other drugs known in the art. It depends on a variety of factors, including parameters. Compositions of the present invention may be administered alone or in combination with other therapies. In such cases, it may be administered sequentially or concurrently with conventional therapies.
  • the composition may be administered in a single dose or divided into multiple doses. Taking these factors into full consideration, it is important to administer the smallest amount sufficient to obtain the maximum effect without side effects, and this dosage can be readily determined by a person skilled in the art.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but is changed according to various factors including the patient's health condition and weight, the severity of the disease, the type of drug, the route of administration and the time of administration.
  • the composition is administered by typically accepted routes, eg, orally, rectally, intravenously, subcutaneously, in mammals, including rats, rats, livestock, humans, etc., in single or multiple doses per day. , intrauterinely or intracerebrovascularly.
  • the content of the anti-VEGFR2 / KDR antibody or antigen-binding fragment thereof in the pharmaceutical composition is a formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, administration interval, administration route, excretion rate and reaction sensitivity It can be prescribed in various ways by factors such as
  • the daily dose of the anti-VEGFR2 / KDR antibody or antigen-binding fragment thereof is 0.001 to 1000 mg / kg, specifically 0.01 to 100 mg / kg, more specifically 0.1 to 50 mg / kg, more specifically 0.1 to 1000 mg / kg. It may range, but is not limited to, 20 mg/kg.
  • the daily dose may be formulated as one formulation in unit dose form, formulated in appropriate portions, or prepared by placing it in a multi-dose container.
  • the pharmaceutical composition may be co-administered with other drugs such as other angiogenesis inhibitor-related disease treatments, and the dosage, administration method, and type of other drugs may be appropriately prescribed according to the patient's condition.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules. Additional topics may be included.
  • the pharmaceutical composition containing the anti-VEGFR2 / KDR antibody or antigen-binding fragment thereof contains the antibody or antigen-binding fragment, it can be formulated as an immunoliposome.
  • Liposomes containing antibodies can be prepared according to methods well known in the art.
  • the immune liposome is a lipid composition containing phosphatidylcholine, cholesterol and polyethylene glycol-derivatized phosphatidylethanolamine and can be prepared by reverse phase evaporation. (Patent Publication 10-2015-0089329)
  • the Fab' fragment of an antibody can be conjugated to a liposome through a disulfide-replacement reaction.
  • another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for diagnosing a VEGFR2/KDR inhibitor-related disease comprising the anti-VEGFR2/KDR antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • processing the anti-VEGFR2 / KDR antibody or antigen-binding fragment thereof to the biological sample obtained from the patient Checking the antigen-antibody reaction; And when an antigen-antibody reaction is detected, determining that the patient has symptoms of VEGFR2/KDR activation and/or overproduction, or a disease associated with activation and/or overproduction of VEGFR2/KDR. Or provide a way to inform the diagnosis.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of cells, tissues, and body fluids obtained from a patient.
  • the step of determining whether the antigen-antibody reaction may be performed through various methods known in the art. For example, it can be measured through conventional enzymatic reaction, fluorescence, luminescence and / or radiation detection, specifically, immunochromatography, reverse histochemical staining (Immunohistochemistry), enzyme-linked immunosorbent assay (enzymeliked immunosorbent assay) : ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA), Western blotting, etc. It may be measured by a method selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • Cancer can be diagnosed by analyzing the final signal intensity by the immunoassay process. That is, when the protein of the marker of the present invention is highly expressed in a biological sample and the signal is stronger than that of a normal biological sample (eg, normal gastric tissue, blood, plasma or serum), cancer is diagnosed.
  • a normal biological sample eg, normal gastric tissue, blood, plasma or serum
  • the present invention relates to a kit for diagnosing cancer comprising the composition for diagnosing cancer.
  • the kit according to the present invention can diagnose cancer by analyzing the signal indicated by the reaction between the sample and the antibody.
  • the signal may include, but is not limited to, enzymes linked to the antibody, such as alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase, luciferase, or cytochrome P450.
  • the substrate for the enzyme is bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol -AS-B1-phosphate) and ECF (enhanced chemifluorescence) are used, and when horseradish peroxidase is used, chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorufin benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol) , TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline), ABTS (2
  • the kit according to the present invention may include a label that generates a detectable signal
  • the label may include a chemical (eg, biotin), an enzyme (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horseradish peroxidase and cytochrome P450), radioactive materials (eg C14, I125, P32 and S35), fluorescent materials (eg fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent materials and fluorescence resonance energy transfer (FRET) It may include, but is not limited thereto.
  • Measurement of the activity or signal of an enzyme used for the diagnosis of angiogenesis can be performed according to various methods known in the art.
  • Patients to be administered or diagnosed with the pharmaceutical composition may be mammals including primates including humans and monkeys, rodents including mice and rats, and the like.
  • the VEGFR2/KDR related diseases include cancer; cancer metastasis; eye diseases such as retinopathy of prematurity, macular degeneration (eg, age-related macular degeneration), diabetic retinopathy, and neovascular glaucoma; asthma; rheumatoid arthritis; psoriasis; inflammatory diseases such as pneumonia and chronic inflammation; It may be a cardiovascular disease such as hypertension or arteriosclerosis or sepsis.
  • the cancer may be overexpressing VEGFR2 / KDR, and may be solid cancer or hematological cancer, but is not limited thereto, squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin cancer , skin or intraocular melanoma, rectal cancer, perianal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, hepatocellular cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, Glioboma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, liver tumor, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer
  • the antibodies of the present invention can be used in combination with other antibodies or biologically active agents or substances for various purposes. From this point of view, the present invention relates to a composition for concomitant administration with other angiogenic disease therapeutics comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the other angiogenic disease treatment agents include anti-angiogenic drugs, anti-inflammatory drugs and/or anti-cancer drugs. Through this, it is possible to overcome each other's resistance and improve efficacy.
  • the anti-VEGFR2/KDR antibody or antigen-binding fragment thereof and other angiogenic disease therapeutics may be administered sequentially or simultaneously.
  • a composition comprising an anti-VEGFR2 / KDR antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient is administered to the subject, or the composition
  • an anti-angiogenic drug, anti-inflammatory drug and/or anti-cancer drug is administered to the subject.
  • the composition may be administered to a subject simultaneously with an anti-angiogenic drug, an anti-inflammatory drug, and/or an anti-cancer drug.
  • the CDR sequence of 6A6 was identified through Kabat numbering and IMGT programs, and cloning was performed by transplanting it into the Hunam germline VH3/VK1.
  • the heavy chain CDR transplant sequence was indicated in [ Figure 1]
  • the light chain CDR transplant sequence was indicated in [ Figure 2].
  • Biopanning was performed using each variant scFv phage library.
  • Antigens KDR1-3 domian-Fc
  • PBST PBST
  • BSA blocking buffer 200 ml
  • the supernatant was discarded, and the precipitate was spread on a large square plate (CM 34 ⁇ g/ml + 1% Glucose) and incubated overnight at 37° C.
  • the remaining 100ml of the output titer was diluted 1/10, 1/100, and 1/1000, spread on a CM plate, and overnighted at 37°C.
  • the colonies grown on the square plate were added with 50ml of 2x YT medium, scraped using a loop, and centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes, discarding the supernatant, and using the primary panning stock for the precipitate.
  • helper phage M13KO7 mutant was added to the cells in an amount of 20 times. A helper phage was added and infected at 37° C. for 30 minutes, followed by centrifugation at 6000 rpm for 10 min.
  • the supernatant was discarded, and the cells were replaced with 100 ml of 2xYT medium (CM 34 ⁇ g/ml + Kan. 70 ⁇ g/ml + 1 mM IPTG + 5 mM MgCl2), followed by overnight at 200 rpm and 30° C. The next day, the grown cells were centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes and centrifuged again in the same manner. The collected supernatant was precipitated on ice for 1 hour with 1/5 (v/v) 20% PEG/2.5m NaCl of the supernatant. After precipitating, centrifugation was performed at 9000 rpm for 1 hour.
  • 2xYT medium CM 34 ⁇ g/ml + Kan. 70 ⁇ g/ml + 1 mM IPTG + 5 mM MgCl2
  • the dissociation rate constant K dis of scFv was measured as a quantitative evaluation index of the ability to maintain binding.
  • the binding ability of the selected antibody to the antigen was measured using Octet (Fortebio). To this end, the KDR1-3 domains were immobilized on a biosensor, and then a candidate antibody expressed in scFv form was added and bound, and then the dissociation rate constant was measured. Amino acid sequences (Tables 2 and 3) and dissociation rate constant measurement results (Table 1) for the selected five optimized clones are shown. The indicated CDR sequences are sequences analyzed through the IMGT database.
  • Conversion of the selected scFv phage into an IgG form was performed using molecular biology techniques. Phagemid was extracted from the selected E. Coli clone, and the variable region was amplified using PCR technique. The amplified heavy chain variable region was inserted into an expression vector (Invivogen, pfusess-hchg1) containing the heavy chain constant region, and the amplified light chain variable region was inserted into an expression vector (Invivogen, pfuse2ss-hclk) containing the light chain constant region, DNA cloning in IgG form was completed.
  • Phagemid was extracted from the selected E. Coli clone, and the variable region was amplified using PCR technique.
  • the amplified heavy chain variable region was inserted into an expression vector (Invivogen, pfusess-hchg1) containing the heavy chain constant region, and the amplified light chain variable region was inserted into an expression vector (Invivogen, pfuse2ss-hclk
  • Expi293F expression system kit (Thermo Fisher Scientific, US) was used. Expi293 cells included in the kit were cultured in suspension on a 125 rpm orbital shaker in a 37°C, 5% CO 2 environment using a dedicated medium. It was subcultured to 3 X 10 5 cells/ml every 3 days, and used after adjusting the number of cells to 3 X 10 6 cells/ml when introducing an expression vector.
  • Expifectamine a dedicated reagent, was used for gene introduction, and a Lipid-DNA complex containing 1 mg of expression vector DNA and 2.7 ⁇ l of Expifectamine per 1 ml of cell suspension was prepared, added to the cell suspension, and 16-18 hours after introduction, the enhancer ( Enhancer) 1/2 was added to induce expression. After culturing for 3-4 days under the same conditions, the supernatant containing IgG was collected by centrifugation.
  • the obtained supernatant was injected into a Protein A column (GE Healthcare) to purify IgG through affinity chromatography. After equilibrating the column with 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 7.0), supernatant was injected, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% polysorbate 20 (pH 7.0) solution. After washing with 50 mM NaCl, eluted with 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5) and neutralized with 1 M Tris.
  • the eluted protein was subjected to dialysis using a MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane (Spectrum Labs, US) to replace the solvent with PBS. Thereafter, the mixture was concentrated to the required concentration using Vivaspin (Satorius, DE) and stored at -80 ° C after dispensing.
  • the binding ability of the selected antibodies to the KDR1-3 domains was measured using the Octet system (Fortebio Inc. US). To this end, the anti-VEGFR2 / KDR antibody was immobilized on a biosensor, and the binding kinetics of each concentration of human KDR1-3 were measured to calculate the association rate constant (ka), dissociation rate constant (k dis ) and association constant (KD). (Table 4).
  • HUVEC cells purchased from Lonza (cat# C2519A) were used, and VascuLife VEGF-Mv medium complete kit (Lifeline cell technology, cat# LCT-LL-0005) medium was used on a plate coated with 2% gelatin.
  • culture Culture is performed in a 37 °C, 5% Co2 incubator. Cells within passage 10 were used for the assay, and 1X10 4 cells were used per well in a 96-well plate with M199 medium (Gibco, cat# 11043-023) containing 0.5% heat inactivated FBS.
  • VEGF165 R&D, cat#293-VE
  • VEGF165 was treated at a concentration of 30 ng/mL per well.
  • viability was measured. Viability was quantified by ATP in living cells using promega's CellTier Glo-Luminescent Cell viability Assay Kit (cat no. G7571) (FIG. 3).
  • the selected antibody inhibited the efficacy by VEGF165 by concentration.
  • HUVEC cells were used, and HUVEC cells purchased from Lonza (cat# C2519A) were used. After culturing cells using VascuLife VEGF-Mv medium complete kit (Lifeline cell technology, cat# LCT-LL-0005) medium, put 8x10 5 per well in a 6-well plate and grow overnight in an incubator supplied with carbon dioxide at 37°C. After treating the above cells with antibody at a concentration of 10ug/mL for 20 minutes, VEGF165 (R&D, cat#293-VE) was treated for 10 minutes. At this time, wells without antibody and containing only VEGF165 protein were included and used as a reference value for analysis of the signal suppression effect.
  • VascuLife VEGF-Mv medium complete kit Lifeline cell technology, cat# LCT-LL-0005
  • VEGF165 R&D, cat#293-VE
  • HUVEC cells are washed twice with PBS, and then reacted on ice for 20 minutes with lysis buffer (Thermo Scientific, RIPA buffer & phosphatase inhibitors) added to obtain cell extract. Then, after centrifugation at 13000 rpm and 4°C, only the supernatant is obtained. After quantification using the BCA protein quantification method, the lysate is loaded on a 10% SDS-PAGE gel and electrophoresed. After transfer using a nitrocellulose membrane (Bio-Rad), dilute 5% skim milk in 0.1% Tween20 TBST buffer and proceed with blocking for 1 hour at room temperature.
  • lysis buffer Thermo Scientific, RIPA buffer & phosphatase inhibitors
  • the anti-VEGFR2/KDR antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention exhibits improved binding ability to VEGFR2/KDR, and can be usefully used for preventing or treating cancer/tumor or angiogenesis inhibitor-related diseases.

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Abstract

본 발명은 향상된 특성을 나타내는 항-VEGFR2(KDR) 개량 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 중쇄 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가시킨 항-VEGFR2(KDR) 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 신생혈관형성(angiogenesis)과 관련된 질환의 진단 또는 치료용 조성물, 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 항체 이외의 치료제와 병용 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

항-VEGFR2(KDR) 개량 항체 및 이의 용도
본 발명은 향상된 특성을 나타내는 항-VEGFR2(KDR) 개량 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 중쇄 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가시킨 항-VEGFR2(KDR) 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 신생혈관형성(angiogenesis)과 관련된 질환의 진단 또는 치료용 조성물, 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 항체 이외의 치료제와 병용 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.
VEGFR2/KDR는 일차적인 혈관신생 수용체이며, VEGF 이소형인 A, C, D 및 E와 결합하고, 내피 세포 분화뿐만 아니라 VEGF의 미토겐성, 혈관신생성 및 침투성-강화 효과에 중요하다. 항- VEGFR2 항체는 공지된 모든 VEGF 이소형이
VEGFR2/KDR에 결합하여 시그널링을 시작하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 종양은 더 많은 수의 VEGF를 분비하는 반면, 수용체의 수는 상대적으로 일정하게 유지되기 때문에, 수용체를 표적하는 것은 아주 높은 수준의 VEGF 이소형의 존재하에서 조차 완전하게 시그널링을 억제하는 확률을 증가시킨다.
신생혈관형성 (angiogenesis)이라 함은 내피세포의 성장, 분열, 이동 등에 의하여 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 것을 의미하며, 성인에서는 상처의 치료, 여성의 생식사이클 등의 특별한 경우를 제외하고는 발생하지 않는다. 그러나 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성 (age-related macular de유전자ration), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 건선 (psoriasis) 및 만성 염증(chronic inflammation)등과 같은 질병에서 과도한 신생혈관의 형성이 보고 되어 있으며 (Cameliet andJain, Nature, 407:249, 2000), 이러한 이유로 신생혈관 억제제를 이용하여 질병치료 특히 종양의 치료를 하고자 하는 노력이 많이 기울어지고 있다.
신생혈관형성에 관여하는 인자로는 혈관내피세포 성장인자 (VEGF), 상피 성장인자 (EGF), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 전환 성장인자 (TGFb), 섬유아세포 성장인자 (FGF) 등이 있으며 이중 내피세포 성장인자는 내피세포의 성장, 분화 이동에 직접적으로 관여하는 내피세포 특이적 인자로 4종의 상이한 이소형(VEGF165, VEGF121, VEGF189,VEGF206)이 존재하며 태반을 제외한 모든 인간조직에서 VEGF165가 가장 풍부한 이소형이다(Tisher et al., J Biol Chem, 266: 11947, 1991).
내피세포 성장인자 (VEGF)는 in situ에서 내피 전구체 (혈관 모세포)의 분화로부터의 새로운 혈관 형성을 조절하며, 배아조직(Breier et al., Development (Camb), 114:521, 1992), 대식세포, 상처치유 동안의 증식 상피 각질 세포(Brown et al., J. Exp. Med., 176:1375, 1992) 에서 발현되고, 염증과 결부된 조직부종의 원인일 수 있다(Ferrara et al., Endocr. Rev., 13:18, 1992). In situ 하이브리다이제이션 연구에 의하면, 다형성 아교모세포종, 혈관모세포종, 중추신경계 신생물 및 에이즈-결부 카포시 육종 (Plate et al., nature 359:845,1992; Plate et al., Cancer Res. 53: 5822, 1993; Berkman et al., J. Clin. Invest. 91: 153, 1993; Nakamura et al., AIDS Weekly. 13(1), 1992)을 포함하여 다수의 인간 종양주에서 VEGF가 고도로 발현된다는 것이 증명되었다. 고수준의 VEGF는 저산소증 유도혈관 신생에서도 관찰되었다(Shweiki et al., Nature 359:843, 1992).
VEGF의 생물학적 기능은 VEGF에 대하여 고친화성을 가지는 VEGF 수용체를 통하여 매게되는데, 상기 수용체는 배아형성(embryo유전자sis) 동안 (Millauer et al., Cell, 72: 835, 1993) 및 종양 형성 동안 내피세포에서 선택적으로 발현된다. 일반적으로 VEGF 수용체 (VEGFR)는 그의 아미노말단 세포외 수용체 리간드-결합 도메인에 여러 개, 일반적으로 5개 또는 7개의 면역글로불린 유사 루프를 가지는 것을 특징으로 하는 클래스 III 수용체형 타이로신키나제이다 (Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2027, 1993). 다른 두 부위는 키나제 인서트 도메인이라 칭해지는 가변성 길이의 친수성 인터키나제 서열의 삽입에 의해 중단되는 카르복시-말단 세포내 촉매 도메인 및 막통과 부위를 포함한다 (Terman et al., Oncogene, 6: 1677, 1991). VEGFR은 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2와 같은 다른 수용체도 VEGF에 결합할 수 있기는 하지만, fms-유사 타이로신 키나제 수용체 (flt-1), 또는 VEGFR-1(Shibuya et al., Onco유전자, 5: 519, 1990; WO 92/14248; Terman et al., Onco유전자, 6:1677, 1991) 및 키나제 인서트 도메인 포함 수용체/태아간 키나제(KDR/flk-1), 또는 VEGFR-2(Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026,1991)를 포함한다. 다른 타이로신 키나제 수용체인 VEGFR-3 (flt-4)는 VEGF 호몰로그인 VEGF-C 및 VEGF-D에 결합하며 림프관의 발달에서 중요한 역할을 한다.
고수준의 Flk-1은 신경아교종을 침윤하는 내피세포에 의해 발현된다. (Plate et al., Nature 359:845, 1992). Flk-1 수준은 인간 아교모세포종에 의해 생성되는 VEGF에 의해 특이적으로 상향조절된다 (Plate et al., Cancer Res. 53: 5822, 1993). 아교모세포종 결부 내피세포 (GAEC) 에서 Flk-1이 고수준으로 발현된다는 사실은, Flk-1 전사체가 정상 뇌 내피 세포에서는 거의 검출되지 않기 때문에 수용체 활성이 아마도 종양 형성동안 유도된다는 것을 나타낸다. 이러한 상향조절은 종양에 매우 근접한 혈관내피세포에서만 발생한다. 중화 항-VEGF 모노클노날 항체(mAb)로 VEGF 활성을 차단하면 누드 생쥐에서 인간 종양이식편의 성장이 억제되는데(Kim et al., Nature 362: 841, 1993), 이는 종양 관련 혈관 신생에 있어서의 VEGF가 직접적인 역할을 한다는 것을 나타내는 것이다.
VEGF 리간드가 종양세포에서 상향조절되고, 그의 수용체가 종양 침윤 혈관내피세포에서 상향 조절되기는 하지만, 혈관 신생과 결부되지 않은 정상세포에서는 VEGF 리간드 및 그의 수용체의 발현은 낮다. 따라서 이러한 정상 세포는 VEGF와 그의 수용체 사이의 상호 작용을 차단하여 혈관 신생이 억제되게 되고, 따라서 종양성장이 일어나지 않는다.
고수준의 VEGFR-2는 신경교종에 침윤하는 내피세포에 의해 발현되며, 인간 아교모세포종에 의해 생성된 VEGF에의해 특이적으로 상향조절된다 (Plate et al., Nature, 359:845, 1992; Plate et al., Cancer Res., 53:5822, 1993). VEGFR-2 전사체는 정상 뇌 내피세포에서는 거의 검출되지 않기 때문에, 아교모세포종 관련 내피세포(GAEC)에서 고수준의 VEGFR-2 발현되는 것은 종양 형성 동안 수용체 활성이 유도된다는 것을 나타낸다.
VEGF는 다양한 유형의 종양에서 높은 수준으로 발현되고(Plate et al., Nature, 359:8435, 1992; Dvorak et al., J. Exp. Med., 174:1275, 1991), 새롭게 생긴 모세혈관은 VEGF-생산성 종양 세 포 주위에 모여든다(Plate et al., Nature, 359:8435, 1992). VEGF 발현은 빠르게 성장하는 종양과 연계된 것들처럼, 저산소증 조건하에서 강하게 상향-조절된다(Shweiki et al., Nature, 359:843, 1992). 아바스틴(Avastin)과 같은 항체에 의한 VEGF 중화는(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov., 3(5):391, 2004; Avery et al., Ophthalmology, 113(3):363, 2006) 암 또는 AMD와 같은 다른 혈관 신생 질환을 억제하기 위해 임상적으로 승인된 요법이다. 그러나, VEGF 차단에 대한 내성이 화학요법과 병용되는 경우에서조차 발견되었다. 이 내성은 리모델링된 맥관구조 및 다른 혈관신생 인자의 증가된 발현과 관련될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야에는 암 및 혈관신생과 관련된 다른 질환을 억제하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
티로신 키나제 억제제(TKI) 및 항-KDRP 항체 둘 모두가 KDR-매개된 혈관신생을 억제할 수 있다 하더라도, 항체 접근은 TKI에 비해 장점을 갖는다. TKI와 대조적으로, 항-KDR 항체는 더 특이적인 KDR 표적제이다(즉, 항-KDR 항체는 다른 VEGF 수용체를 억제하지 않는다). 이러한 높은 특이성 때문에, 항-KDR 항체는 표적 이탈 효과(off-target effect) 및 덜 특이적인 TKI에 의해 야기된 독성을 제한하고/하거나 회피할 수 있다(Witte et al., Cancer Metastasis Rev., Jun;17(2):155, 1998).
단지 하나의 리간드(VEGF-A)와만 결합하는 아바스틴과는 달리, 항-KDR 항체는 모든 공지의 VEGF가 VEGFR2/KDR에 결합하는 것을 방지하는 것으로 예상된다. 항-KDR 항체는 단순히 VEGF-A를 차단하는 것 보다는 종양 혈관신생에 대해 더욱 강력한 억제 효과를 가질 수 있다. 항-KDR 항체를 이용한 요법이 아바스틴 내성의 경우에 효과적일 수 있다는 가능성이 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체를 개량하기 위하여, 중쇄 가변영역의 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 중쇄와 경쇄의 CDR3 영역에 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가한 신규한 항체를 제조하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 VEGFR2/KDR에 대한 향상된 결합력을 갖는 항체의 개량 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하는 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암의 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하는 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다른 치료제와 병용 투여하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 7, 13, 19 및 25로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열번호 2, 8, 14, 20 및 26으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 3, 9, 15, 21, 27, 51, 52 및 53로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 4, 10, 16, 22, 및 28로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열번호 5, 11, 17, 23 및 29으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 6, 12, 18, 24 및 30로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다른 치료제와 병용투여하기 위한 조성물을 제공한다.
도 1은 6A6의 중쇄 CDR 서열을 이식한 서열이다.
도 2는 6A6의 경쇄 CDR 서열을 이식한 서열이다.
도 3은 일시발현 및 정제한 항-Ang2 항체의 인간 및 마우스 Ang2 와 Ang1에 대한 결합을 평가한 ELISA 결과이다.
도 4는 선별된 항 Ang2 항체의 인간 및 마우스 Ang2/Tie2 결합을 중화할수 있는 능력을 보여주는 결과이다.
[규칙 제91조에 의한 정정 06.10.2022]　
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발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은, 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 완전인간화 항체의 개량 항체에 관한 것이다. 특히, 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 (등록특허 10-0883430)의 개량 항체 및 그 용도에 관한 것이다.
본 출원의 발명자들은 완전인간항체 라이브러리로부터 발명되었으며, VEGFR-2/KDR을 표적으로 하면서 동시에 마우스나 렛트 유래의 flk-1(VEGFR-2 상동체)에 대해서도 반응성을 가지는 유일한 항체를 개량하였다. 해당 항체는 임상시험을 통하여 그 우수성이 입증되었으나, 항체 단백질의 항원에 대한 결합력이 다소 낮은편이며, 생체내 반감기가 짧다. 이를 개량하여 면역항암제로써의 효능 증대, 혈관신생과 관련된 질환들에서의 효능 증대가 예상된다.
기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체를 개량하기 위하여, 중쇄 가변영역의 FR(framework regoin)을 VH1에서 VH3로 치환 및 경쇄 FR(framework regoin)을 VL1에서 VK1으로 치환하고, 중쇄와 경쇄의 CDR3 영역에 돌연변이를 유도시켜 항원에 대한 친화도를 증가한 신규한 항체를 제조하였다. 그 결과, 본 발명자들은 기존 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항체보다 높은 결합력을 가지며, 세포내 효능이 더 좋은 항체를 개발하여, 항체가 목적하는 면역항암제 또는 혈관신생과 관련된 질병의 치료제로써의 역할을 할 수 있음을 확인하였다.
상기 개량 항체는 다음과 같은 방법으로 스크리닝하였다. 먼저 6A6의 CDR 영역 서열과 프레임워크(frame work: FR) 서열을 확인하고, CDR grafting 기법을 사용하여, 중쇄 CDR 서열을 human germline VH3 서열에 이식하고, 경쇄 CDR 서열을 human germline VK1에 이식하였다.
CDR grafting(이식)이란 일반적으로 마우스 단클론 항체의 가변부위 서열을 암호화 하는 DNA를 분리하고 유전자 클로닝을 통하여 CDR 서열을 확보한 다음 in silico 상으로 적합한 인간항체 서열 안으로 CDR 서열을 이식하여 만드는 방법이다(Hou S, et al. Humanization of an anti-CD34 monoclonal antibody by complementarity-determining region grafting based on computer-assisted molecular modelling. J Biochem. 2008;144(1):115-20; 및 Kashmiri SV, De Pascalis R, Gonzales NR, Schlom J. SDR grafting--a new approach to antibody humanization. Methods. 2005;36(1):25-34). 위의 방법을 활용하여 human germline VH1/VL1을 갖는 6A6의 프레임워크를 human germline VH3/VK1으로 치환하였다.
상기 치환된 항체의 친화도를 향상시키기 위하여, 경쇄와 중쇄의 CDR3 염기서열에 돌연별이를 유도하는 라이브러리를 구축하고, 재조합 KDR D1~D3-Fc 융합 단백질을 이용하여, 항체를 스크리닝하였다. 항체 스크리닝은 파아지 디스플레이를 사용하여 스크리닝 하였다.
이를 바탕으로, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1, 7, 13, 19 및 25로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열번호 2, 8, 14, 20 및 26으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 3, 9, 15, 21, 27, 51, 52 및 53로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 4, 10, 16, 22, 및 28로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열번호 5, 11, 17, 23 및 29으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 6, 12, 18, 24 및 30로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 항-VEGFR2/KDR 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 VEGFR2/KDR에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 영역은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 본 발명은 서열번호 1의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명에 있어, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 및 서열번호 15의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2 및 서열번호 21의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2 및 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 및 서열번호 51의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 및 서열번호 52의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는
서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 및 서열번호 53의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다. 각 가변 영역은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 영역과 1개의 경쇄 가변 영역이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
VEGFR2/KDR 항체는 단쇄 또는 이중 쇄를 포함할 수 있다. 기능적으로, VEGFR2/KDR 항체의 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, VEGFR2/KDR 항체의 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
본 발명은 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
상기 상동성은 청구된 서열번호의 서열 전체와 비교하여 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 서열번호 32의 중쇄 가변영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변영역;
서열번호 36의 중쇄 가변영역 및 서열번호 38의 경쇄 가변영역;
서열번호 40의 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 경쇄 가변영역;
서열번호 44의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 48의 중쇄 가변영역 및 서열번호 50의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 VEGFR2/KDR를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-VEGFR2/KDR 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NCBI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
상기 핵산은 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 31, 35, 39, 43, 47로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 핵산은 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 33, 37, 41, 45, 49로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
상기 항체는 IgG 또는 가변영역을 포함한 단편 즉 ScFv, Fab일 수 있다. 또한 중쇄의 가변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 혈관신생은 이전에 존재한 혈관으로부터 새로운 혈관의 형성 또는 성장을 의미하며, "혈관신생 관련 질환(angiogenesis-related disease)"은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 항체로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정 없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 관련 질환의 예로는 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 당뇨병성 족부궤양(diabetic Foot Ulcers), 만성 신부전 (chronic kidney failure), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases), 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis), 패혈증(sepsis), 급성 호흡곤란 증후군(Acute respiratory distress syndrome) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에 사용된 용어 "예방(prevention or prophylaxis)"은 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 시작을 억제 또는 지연하게 하는 모든 조치를 가리킨다. 용어 "치료(treatment or therapy)"는 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 증상이 개선되거나 증상이 호전되게 하는 모든 조치를 가리킨다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 VEGFR2/KDR에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 또는 암환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VEGFR2/KDR의 기작 방해 용도 및 이를 통한 종양 또는 암의 예방 또는 치료 용도일 수 있다.
상기 조성물에 적용되는 질환인 종양 또는 암은 전형적으로 VEGF 또는 VEGFR2/KDR를 과발현하는 종양 또는 암, 및 VEGF 또는 VEGFR2/KDR를 과발현하지 않은 종양 또는 암을 포함한다. 치료용으로 바람직한 종양 또는 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 치료할 수 있는 불응 또는 재발암을 포함한다.
본 발명은 예를 들어, 상기 항-VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 질환의 치료방법이 제공된다. 상기 혈관신생 질환의 치료는 상기 투여 단계 이전에 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 VEGFR2/KDR 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGFR2/KDR 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 VEGFR2/KDR 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 여기에 사용된 용어 "약학적으로 유효한 양(pharmaceutically effective amount)"은 모든 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익과 위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분한 질환 치료용 약학적 조성물의 양을 가리킨다. 유효량은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 경우에, 종래의 치료법과 함께 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 랫, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg, 더욱 구체적으로 0.1 내지 20 ㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다른 혈관신생 저해제 관련된 질병의 치료제와 같은 다른 약물과 병용 투여 가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
특히, 상기 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. (공개특허 10-2015-0089329) 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.
한편, 상기 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VEGFR2/KDR 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 VEGFR2/KDR의 활성화 및/또는 과생성 여부를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 VEGFR2/KDR 저해제 관련된 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계; 및 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 환자를 VEGFR2/KDR 활성화 및/또는 과생성 증상이 존재하거나, VEGFR2/KDR의 활성화 및/또는 과생성 관련 질병을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 진단 방법 또는 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 생물 시료는 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzymeliked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzymeimmunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western bloting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 고발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널을 분석하여, 암을 진단할 수 있다. 이 때, 상기 시그널은 항체에 결합된 효소 예를 들어 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 사이토크롬 P450을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있으며, 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈관신생의 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 또는 진단 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
상기 VEGFR2/KDR 관련된 질병은 암; 암전이; 미숙아 망막병증, 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증, 혈관신생성녹내장 등의 안질환; 천식; 류마티스성 관절염; 건선; 폐렴, 만성 염증 등의 염증성 질환; 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관질환 또는 패혈증 등일 수 있다. 상기 암은 VEGFR2/KDR 를 과발현하는 것일 수 있고, 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 다른 항체 또는 생물학적 활성제 또는 다양한 목적을 위한 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 이러한 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 다른 혈관신생 질환 치료제와의 병용투여용 조성물에 관한 것이다.
상기 다른 혈관신생 질환 치료제는 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 들 수 있다. 이를 통해 서로의 저항성을 극복시키고 효능을 증진시킬 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 다른 혈관신생 질환 치료제와 병용 투여되는 경우 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 다른 혈관신생 질환 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 예를 들면, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 대상체에게 투여한 후, 활성 성분으로서 항 VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하거나, 상기 조성물을 대상체에게 투여한 후, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 상기 대상체에게 투여한다. 경우에 따라서, 상기 조성물을 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물과 동시에 대상체에게 투여할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. CDR grafting(이식)
6A6의 CDR 서열을 Kabat 넘버링, IMGT 프로그램을 통하여 확인하고, 이를 Hunam germline VH3/VK1에 이식하는 클로닝을 수행하였다. [도 1]에 중쇄 CDR 이식 서열을 표기하였으며, [도 2]에 경쇄 CDR 이식 서열을 표기하였다.
실시예 2. 친화도 증진을 위한 변이체 제작 및 선별
CDR grafting된 항체의 친화도 증진을 위한 최적화를 수행하였다. 경쇄와 중쇄의 CDR3의 원래 DNA 서열을 70% 보존하며 랜덤화(randomize)시키는 소프트-랜덤화(soft-randomization)법을 활용하여, 경쇄 CDR3와 중쇄 CDR3에 무작위 변이를 도입한 프라이머를 제작하였다. 이를 사용한 PCR을 통해 변이가 도입된 경쇄 가변영역, 중쇄 가변영역 코딩 DNA 단편을 확보하였다. 이 DNA 단편을 각각 scFv 파지 파지미드의 경쇄 가변영역 및 scFv 파지 파지미드의 중쇄 가변영역과 치환하여, 경쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리와 중쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 각각 제작하였다.
변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 페놀-클로로포름 정제 후 전기천공법을 사용하여 대장균주 XL-1 Blue에 형질전환 하였다. 형질전환 효율 분석 및, DNA 서열 분석을 통해 다양성이 확보된 것을 확인한 후, 500 ml 규모로 배양하여 파지 발현을 유도하고, PEG-침전법을 이용하여 경쇄와 중쇄의 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리 제작하였다.
각 변이체 scFv 파지 라이브러리를 사용하여 바이오패닝을 실시하였다. 96-웰 면역 플레이트에 항원 (KDR1~3 domian-Fc)을 2 mg/㎖로 100 ml씩 웰에 넣고 4℃ 오버나이트 (overnight) 시켰다. 다음날 항원 코팅 플레이트 (coating plate)는 PBST(0.1% tween20)로 3번 워싱한 후 2% BSA 차단 버퍼 (blocking buffer) 200 ml를 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 2x YT-TET(tetracycline 10㎍/㎖) 성장 배지 (growth medium) 2ml에 XL1-Blue 스톡 (stock) 50 ml를 넣고 37 ℃, 200 rpm에서 2시간 정도 키운 후 13 ml를 더 첨가하여 OD600이 0.5가 될 때까지 키워주었다. 차단 (blocking) 2시간이 지나면 1X PBST(0.1% tween20)로 3번 워싱하였다. 워싱한 각 웰에 변이체 라이브러리를 와 4% BSA를 동일한 양으로 섞은 후 200 ml씩 첨가하여 실온에서 30분간 로킹(rocking)한 후 2시간을 반응시켰다. 파지 라이브러리 반응이 끝나면 상층액은 버리고 0.1% PBST로 5번 워싱하고 PBS로 5번 워싱하였다. 각 웰에 100 mM TEA(trimethylamine) 100ml를 넣은 후 실온에서 10분간 흔들어 주었다. 10분 지나면 각 웰에 1M Tris(pH 7.5) 50 ml를 넣고 섞어주었다. 상등액 (supernatant)은 OD600 0.5가 된 XL1-blue 10ml에 넣어 37℃에서 30분간 감염 (infection)시켰다. 감염이 끝나면 100 ml는 아웃풋 타이터 (output titer)로 사용하고 나머지는 6,000 rpm, 10분간 원심분리 하였다. 상층액은 버리고 침전물은 라지 스퀘어 플레이트 (large square plate: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose)에 스프레딩 (spreading)하여 37℃에서 오버나이트 인큐베이션 (overningt incubation) 하였다. 아웃풋 타이터로 남겨둔 100ml는 1/10, 1/100, 1/1000으로 희석 (dilution)하여 CM 플레이트에 스프레딩하여 37℃에서 오버나이트하였다. 다음날 스퀘어 플레이트에 자란 콜로니 (colony)는 2x YT 배지 50ml을 넣은 후 룹 (loop)을 사용하여 긁어 모은 후 6000 rpm, 10분 원심분리하여 상층액은 버리고 침전액 (precipitate)에 대하여 1차 패닝 스톡 (panning stock)을 만들고 2x YT 배양 배지 (growth media: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose) 100 ml을 500 ml 삼각플라스크에 넣은 후 OD600 0.2 되게 세포를 넣고 200 rpm, 37℃에서 OD 0.5가 될 때까지 키워주었다. OD600 값이 0.5가 될 때까지 세포를 배양한 후에 헬퍼 파지 (helper phage: M13KO7 mutant)을 세포의 20배가 되게 넣어주었다. 헬퍼 파지를 넣고 37℃, 30분 감염 (infection)시킨 후 6000 rpm, 10 min 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 세포는 2xYT 배지 (CM 34㎍/㎖ + Kan. 70㎍/㎖ + 1mM IPTG + 5mM MgCl2) 100ml로 교체하여 넣어준 후 200 rpm, 30℃, 오버나이트하였다. 다음날 자란 세포는 7000 rpm, 10분, 원심분리하고 같은 방법으로 한번 더 원심분리하였다. 모은 상층액은 상층액의 1/5 (v/v) 20% PEG/2.5m NaCl 를 넣고 아이스 (ice)에서 1시간 침전시켰다. 침전시킨 후 9000 rpm, 1시간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 PBS 5ml로 침전액 (precipitate)을 풀어준 후 0.45 mm 필터 (filter)에 여과한 후 4℃에 보관하여 이를 다음 번 패닝 (panning) 과정에서 사용하였다. 이 과정을 3~4번 반복하여 항원에 결합하는 항체를 ELISA를 수행하여 확인하였다.
그 후 선별과정에서는 결합을 유지하는 능력의 정량적 평가지표로서 scFv의 해리 속도 상수 Kdis를 측정하였다.
실시예 3. 항원에 대한 고친화력을 가진 항체선별 (Off-rate screening)
선별된 항체의 항원에 대한 결합력을 Octet (Fortebio)을 이용하여 측정하였다. 이를 위하여 KDR1~3 domain을 바이오센서 (biosensor)에 고정 (immobilize)한 후 scFv 형태로 발현된 후보항체를 넣고 결합시킨 후, 해리 속도 상수를 측정하였다. 선별된 최적화 클론 5종에 대한 아미노산 서열(표 2, 3)과 해리 속도 상수 측정 결과(표 1)를 도시하였다. 표기된 CDR 서열은 IMGT database를 통하여 분석한 서열이다.
Figure PCTKR2022013664-appb-img-000001
Figure PCTKR2022013664-appb-img-000002
Figure PCTKR2022013664-appb-img-000003
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Figure PCTKR2022013664-appb-img-000007
실시예 4. 항체 발현
선별한 scFv 파지의 IgG형태로의 전환은 분자생물학적 기법을 사용하여 수행하였다. 선별한 E. Coli 클론에서 파지미드 (Phagemid)를 추출, PCR기법을 사용하여 가변영역을 증폭하였다. 증폭한 중쇄 가변영역을 중쇄 불변영역을 포함하는 발현벡터 (Invivogen, pfusess-hchg1)에 삽입하고, 증폭한 경쇄 가변영역은 경쇄 불변영역을 포함하는 발현벡터 (Invivogen, pfuse2ss-hclk)에 삽입하여, IgG 형태의 DNA 클로닝을 완료하였다.
IgG의 일시 발현은 Expi293F 발현 시스템 키트 (Expi293F expression system kit: Thermo Fisher Scientific, US)을 사용하였다. Kit에 포함된 Expi293 세포를 전용 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경 하에서 125 rpm 오비탈 쉐이커 상 부유배양 하였다. 3일마다 3 X 105 cells/ml 되도록 계대배양 하였으며, 발현 벡터 도입시에는 3 X 106 cells/ml 되도록 세포수를 조정 한 후 사용하였다. 유전자 도입은 전용 시약인 Expifectamine을 사용하였으며, 세포현탁액 1 ml 당 발현 벡터 DNA 1 mg과 Expifectamine 2.7 μl을 함유하는 Lipid-DNA 복합체를 제작, 세포현탁액에 첨가하였으며, 도입 16-18시간 후 인헨서 (Enhancer) 1/2를 첨가하여 발현을 유도하였다. 이후 동일 조건에서 3-4일간 배양 후 원심분리하여 IgG 함유 상등액을 취하였다.
실시예 5. 항체의 정제
취득한 상등액을 Protein A 컬럼(GE Healthcare)에 주입하여 친화력 크로마토그래피를 통해 IgG를 정제하였다. 컬럼을 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 7.0)으로 평형화 시킨 후 상등액을 주입, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% polysorbate 20 (pH 7.0) 용액으로 세정한 후, 50 mM NaCl, 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5)로 용출 후 1 M Tris로 중화하였다. 용출된 단백질은 MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane (Spectrum Labs, US)를 사용한 투석 과정을 통해 PBS로 용매를 교체하였다. 이후 Vivaspin (Satorius, DE)을 사용하여 필요 농도로 농축하여 분주 후 -80℃에서 보관하였다.
실시예 6. 항체의 결합 특이성 분석
선별된 항체의 KDR1~3 domain에 대한 결합력을 Octet system (Fortebio Inc. US)를 사용하여 측정하였다. 이를 위하여 항-VEGFR2/KDR 항체를 바이오센서에 고정화 하고, 인간 KDR1~3의 농도 별 결합 동역학을 측정하여 결합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kdis) 및 결합 상수 (KD)를 산출하였다 (표 4).
Figure PCTKR2022013664-appb-img-000008
실시예 7. 항체의 중화능력 확인 (HUVEC viability assay)
항체의 생물학적 활성을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. HUVEC은 Lonza (cat# C2519A)사에서 구매한 세포를 사용하였으며, VascuLife VEGF-Mv medium complete kit (Lifeline cell technology, cat# LCT-LL-0005) 배지를 사용하여, 2% gelatin 이 coating된 plate에서 culture한다. Culture는 37 ℃, 5% Co2 incubator 에서 수행한다. assay에는 passage 10 이내의 세포를 사용하며, 0.5% heat inactivated FBS가 포함된 M199 medium(Gibco, cat#11043-023)으로 96well plate에서 well 당 1X104 cells 을 이용하여 수행하였다. Assay는 여러 농도로 희석된 항체를 assay plate 에 먼저 처리한 후에 세포를 well 마다 1X104 cells을 넣어 준 후, 30분간 incubator에서 배양한다. 30분간의 배양 후, VEGF165(R&D, cat#293-VE)를 well 마다 30 ng/mL의 농도로 처리하였다. 3일간 37℃ CO2 incubator에서 배양한 후 viability를 측정하였다. Viability는 promega사의 CellTier Glo-Luminescent Cell viability Assay Kit (cat no. G7571)를 사용하여 살아 있는 세포내의 ATP를 정량하였다(도 3). 도3에서 보여지듯이 선별된 항체는 VEGF165에의한 효능을 농도별로 저해 하였다.
실시예 8. 항체의 VEGF165/VEGFR2 신호 억제 효과 분석(p-KDR assay)
VEGF/VEGFR2 신호 억제 효과 분석을 위하여 HUVEC 세포를 사용하였으며, HUVEC은 Lonza (cat# C2519A)사에서 구매한 세포를 사용하였다. VascuLife VEGF-Mv medium complete kit (Lifeline cell technology, cat# LCT-LL-0005) 배지를 사용하여, 세포배양 한 후, 6well 플레이트에 well별로 8x105 넣어, 37℃ 이산화탄소가 공급되는 인큐베이터에서 하룻밤 키운다. 위의 세포에 항체를 10ug/mL의 농도로 20분간 처리한 후, VEGF165(R&D, cat#293-VE)를 10분간 처리 한다. 이때 항체가 없고, VEGF165단백질만 들어있는 웰을 포함시켜 신호 억제 효과 분석의 기준값으로 삼는다. 각 약물 반응이 끝난 HUVEC 세포는 PBS로 2번 세척 후, cell extract를 얻기 위해 lysis buffer (Thermo Scientific, RIPA buffer & phosphatase inhibitors)를 넣고 아이스에서 20분 반응 시킨다. 이 후, 13000 rpm, 4℃에서 원심분리 후, 상등액만 얻는다. BCA 단백질 정량법을 이용하여 정량 후, 10% SDS-PAGE gel에 lysate를 로딩 후, 전기영동 한다. Nitrocellulose membrane (Bio-Rad)을 이용하여 transfer 진행 후, 0.1% Tween20 TBST buffer에 5% skim milk를 희석하여 상온 1시간 blocking 진행한다. 이 후, 1차 antibody (p-VEGFR2(Y1175) ; Cell signaling)들을 1:1000으로 희석하여 4℃에서 shaking overnight 진행하고, Peroxidase-conjugate 2차 antibody (Santa cruz)를 1:5000으로 희석하여, 상온 1시간 반응시킨다. ECL solution (Pierce) 반응을 거쳐 목적하는 단백질의 밴드를 관찰하였다. 그 결과, D4, D3, A4에서 VEGF165에 의한 인산화를 6A6보다 효과적으로 저해함을 확인하였다(도 4).
본 발명을 통해 기존의 VEGFR2/KDR를 표적으로 하는 항체보다 친화도가 향상된 항체를 개발함으로써, 종양을 치료하는데 있어서 기존의 치료제보다 더 효능이 좋은 병용 치료 및 단독 치료법을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 항-VEGFR2/KDR 항체 또는 이의 항원 결합단편은 VEGFR2/KDR에의 향상된 결합력을 나타내어, 목적하는 암/종양 또는 혈관신생 저해제 관련된 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (15)

  1. 서열번호 1, 7, 13, 19 및 25로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 2, 8, 14, 20 및 26으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 3, 9, 15, 21 및 27로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 4, 10, 16, 22, 및 28로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 5, 11, 17, 23 및 29으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 6, 12, 18, 24 및 30로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 및 서열번호 15의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2 및 서열번호 21의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는
    서열번호 25의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2 및 서열번호 27의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 32, 36, 40, 44, 48로 구성된 군에서 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 34, 38, 42, 46, 50으로 구성된 군에서 선택되는 선택되는 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  9. 제8항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  10. 제9항의 발현벡터를 포함하는, 형질전환 세포.
  11. 다음 단계를 포함하는 VEGFR2/KDR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제10항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 진단용 조성물.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다른 치료제와의 병용투여용 조성물.
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992014248A1 (de) 1991-02-09 1992-08-20 Deutsche Thomson-Brandt Gmbh Verfahren zur verkürzung der zugriffszeit
KR100883430B1 (ko) 2007-06-13 2009-02-12 한국생명공학연구원 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 및그 용도
KR20150089329A (ko) 2014-01-27 2015-08-05 삼성전자주식회사 Ang-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2015134242A1 (en) * 2014-03-04 2015-09-11 Eli Lilly And Company Anti-met in combination with anti-vegfr2 antibodies therapy for cancer
WO2015133882A1 (ko) * 2014-03-07 2015-09-11 사회복지법인 삼성생명공익재단 ScFv 항체 라이브러리, 이의 제조방법 및 이를 이용한 ScFv 항체 스크리닝 방법
US20180127504A1 (en) * 2015-04-14 2018-05-10 Academia Sinica Anti-vegfr2 human antibody for anti-angiogenic and targeted cancer therapy
KR20180132401A (ko) * 2017-06-02 2018-12-12 주식회사 파멥신 암 치료 또는 예방용 조성물

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992014248A1 (de) 1991-02-09 1992-08-20 Deutsche Thomson-Brandt Gmbh Verfahren zur verkürzung der zugriffszeit
KR100883430B1 (ko) 2007-06-13 2009-02-12 한국생명공학연구원 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 및그 용도
KR20150089329A (ko) 2014-01-27 2015-08-05 삼성전자주식회사 Ang-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2015134242A1 (en) * 2014-03-04 2015-09-11 Eli Lilly And Company Anti-met in combination with anti-vegfr2 antibodies therapy for cancer
WO2015133882A1 (ko) * 2014-03-07 2015-09-11 사회복지법인 삼성생명공익재단 ScFv 항체 라이브러리, 이의 제조방법 및 이를 이용한 ScFv 항체 스크리닝 방법
US20180127504A1 (en) * 2015-04-14 2018-05-10 Academia Sinica Anti-vegfr2 human antibody for anti-angiogenic and targeted cancer therapy
KR20180132401A (ko) * 2017-06-02 2018-12-12 주식회사 파멥신 암 치료 또는 예방용 조성물

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AVERY ET AL., OPHTHALMOLOGY, vol. 113, no. 3, 2006, pages 363
BERKMAN ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 91, 1993, pages 153
BREIER ET AL., DEVELOPMENT (CAMB, vol. 114, 1992, pages 521
BROWN ET AL., J. EXP. MED., vol. 176, 1992, pages 1375
CAMELIETJAIN, NATURE, vol. 407, 2000, pages 249
DVORAK ET AL., J. EXP. MED., vol. 174, 1991, pages 1275
FERRARA ET AL., ENDOCR. REV., vol. 13, 1992, pages 18
FERRARA ET AL., NAT REV DRUG DISCOV., vol. 3, no. 5, 2004, pages 391
HOU S ET AL.: "Humanization of an anti-CD34 monoclonal antibody by complementarity-determining region grafting based on computer-assisted molecular modelling", J BIOCHEM, vol. 144, no. 1, 2008, pages 115 - 20, XP002605633
KAIPAINEN ET AL., J. EXP. MED., vol. 178, 1993, pages 2027
KASHMIRI SVDE PASCALIS RGONZALES NRSCHLOM J: "SDR grafting--a new approach to antibody humanization", METHODS, vol. 36, no. 1, 2005, pages 25 - 34, XP004852550, DOI: 10.1016/j.ymeth.2005.01.003
KIM ET AL., NATURE, vol. 362, 1993, pages 841
MATTHEWS ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 88, 1991, pages 9026
MILLAUER ET AL., CELL, vol. 72, 1993, pages 835
NAKAMURA ET AL., AIDS WEEKLY, vol. 13, no. 1, 1992
PLATE ET AL., CANCER RES, vol. 53, 1993, pages 5822
PLATE ET AL., CANCER RES., vol. 53, 1993, pages 5822
PLATE ET AL., NATURE, vol. 359, 1992, pages 845
SHIBUYA ET AL., ONCOGENE, vol. 5, 1990, pages 519
SHWEIKI ET AL., NATURE, vol. 359, 1992, pages 8435
TERMAN ET AL., ONCOGENE, vol. 6, 1991, pages 1677
TISHER ET AL., J BIOL CHEM, vol. 266, 1991, pages 11947
WITTE ET AL., CANCER METASTASIS REV., vol. 17, no. 2, June 1998 (1998-06-01), pages 155

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