DE69737397T2

DE69737397T2 - Verwendung von mif-antagonisten zur krebstherapie

Info

Publication number: DE69737397T2
Application number: DE69737397T
Authority: DE
Inventors: Richard J. Cos Cob BUCALA; Jason A. Chesney
Original assignee: Cytokine Pharmasciences Inc
Current assignee: Cytokine Pharmasciences Inc
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2017-10-25
Also published as: DK0954334T3; US20080317759A1; AU5101498A; ES2283013T3; EP0954334A4; CA2267069C; AU740478B2; EP0954334A1; ATE354372T1; WO1998017314A1; CA2267069A1; PT954334E; US20040156848A1; DE69737397D1; JP2001502698A; JP2009155335A; EP0954334B1; US6774227B1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines MIF (Makrophagen Migrations-inhibierender Faktor) Antagonisten-Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-MIF monoklonalen Antikörpern, MIF Antisense-RNA Molekülen und einer Kombination daraus zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung oder Vorbeugung von Krebs oder für die Behandlung von Tumor-Neovaskularisierung.
Hintergrund der Erfindung
MIF wurde ursprünglich durch seine Fähigkeit identifiziert, die Migration von Meerschweinchen-Makrophagen in vitro zu verhindern (Bloom & Bennett, Science 153: 80–82, 1966; und David, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56: 72–77, 1966). Es ist berichtet worden, dass MIF mit Hypersensitivitätsreaktionen des verzögerten Typs zusammenhängt (Bloom & Bennett, 1966, vorstehend; David, 1966, vorstehend), von Lektin-aktivierten T-Zellen produziert wird (Weiser et al., J. Immunol. 126: 1958–1962, 1981) und die Anhaftung, Phagozytose und tumorizide Aktivität von Makrophagen verstärkt (Nathan et al., J. Exp. Med. 137: 275–288, 1973; Nathan et al., J. Exp. Med. 133: 1356–1376, 1971; und Churchill et al., J. Immunol. 115: 781–785, 1975). Leider verwendeten viele dieser Untersuchungen gemischte Kulturüberstände, von denen man glaubte, dass es sich um reines MIF handelte, von denen aber später gezeigt wurde, dass sie andere Cytokine, wie zum Beispiel IFN-γ und IL-4, enthielten, die auch Migrations-inhibitorische Aktivität aufweisen (McInnes & Rennick, J Exp. Med. 167: 598–611, 1988; Thurman et al., J. Immunol. 134: 305–309, 1985).
Rekombinantes humanes MIF wurde zuerst aus einer humanen T-Zell Bank kloniert (Weiser et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7522–7526, 1989) und es wurde gezeigt, dass rekombinantes humanes MIF aus dem Blut abgeleitete Makrophagen dazu aktiviert, intrazelluläre Parasiten und Tumorzellen in vitro zu töten, die Expression von IL-1β und TNFα stimuliert und die Synthese von Stickoxid induziert (Weiser et al., J. Immunol. 147: 2006–2011, 1991; Pozzi et al., Cellular Immunol. 145: 372–379, 1992; Weiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8049–8052, 1992; und Cunha et al., J. Immunol 150: 1908–1912, 1993). Bis vor sehr kurzem hat jedoch der Mangel an einer verlässlichen Quelle gereinigten MIFs eine Untersuchung des genauen biologischen Profils dieses Moleküls weiterhin verhindert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines MIF (Makrophagen Migrations-inhibierender Faktor) Antagonisten-Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-MIF monoklonalen Antikörpern, MIF Antisense-RNA Molekülen und einer Kombination daraus zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung oder Vorbeugung von Krebs bereit.
In einer Ausführungsform ist der Krebs ein solider Tumor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Krebs ein B-Zell- oder ein T-Zell-Lymphom.
In bestimmten Ausführungsformen wird der Krebs durch Behandlung eines prämalignen Zustandes oder eines gutartigen Tumors verhindert.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Krebs aus der Gruppe bestehend aus Ösophaguskrebs, Magenkrebs, Nierenkarzinom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nasopharyngealkrebs, Osteokarzinom, Ovarialkrebs und Uteruskrebs ausgewählt.
In einer Ausführungsform ist das MIF Antagonisten-Agens ein anti-MIF monoklonaler Antikörper oder ein bindendes Fragment davon, das an humanen MIF bindet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines MIF (Makrophagen Migrations-inhibierender Faktor) Antagonisten-Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-MIF monoklonalen Antikörpern, MIF Antisense-RNA Molekülen und einer Kombination daraus zur Herstellung eines Mediakmentes für die Behandlung von Tumor-Neovaskularisierung bereit.
In einer Ausführungsform ist das Agens ein anti-MIF monoklonaler Antikörper oder ein bindendes Fragment davon, das an humanes MIF bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Agens ein Antikörper, der spezifisch an den Migrations-inhibierenden Faktor (MIF) bindet.
In einer anderen Ausführungsform ist das Agens ein Migrations-inhibierender Faktor (MIF) Antisense-Molekül.
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, dass MIF zur Proliferation von T-Zellen in vitro erforderlich war. Neutralisierende monoklonale Antikörper (mAk) gegen MIF inhibierten die Proliferation von anti-CD3 induzierten primären T-Zellen direkt. Diese in-vitro-Daten sagen voraus, dass MIF Antagonisten gegen prolifererierende Tumorzellpopulationen im Allgemeinen und gegen Lymphome im Besonderen therapeutisch aktiv sind.
Zusätzlich werden in einem voraussagenden Modell von Tumorwachstum in-vivo-Daten vorgelegt, dass ein MIF Antagonist, insbesondere ein neutralisierender MIF Antikörper das Wachstum von Tumorzellen in vivo inhibierte. Diese Beobachtungen zeigen eine unerwartete Beteiligung von MIF beim Regulieren des Zellzyklus und des Zellwachstums in vivo auf der organismischen Ebene an. Ohne von der Theorie festgelegt zu sein, scheint es jedoch, dass die therapeutische Aktivität der MIF Antagonisten durch Inhibieren der Vaskularisierung von solidem Tumorgewebe wirkt und somit eine universelle Behandlung solider Tumoren ist, beruhend auf dem Inhibieren der Ernährung von Tumorgewebe durch Abschneiden oder Inhibieren der Blutversorgung von wachsendem Tumorgewebe.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Hemmung des anfänglichen Lymphom-Auswachsens in vivo durch Behandlung mit neutralisierenden Anti-MIF monoklonalen Antikörpern. 1 zeigt das mittlere geschätzte Tumorgewicht am Tag 7 für anti-MIF behandelte Gruppen und Isotyp-Kontrollgruppen. B-Zell-Lymphomzellen (38C13-Zellen, bereitgestellt von J. D. Kemp, Dept. of Pathology, U. von IA) wurden aus einer Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase (RPMI/10% FBS) gewonnen, 10 min lang bei 300 × g zentrifugiert, zweimal mit PBS gespült und auf eine Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt. Eine Suspension von 38C13 (5 × 10⁴ Zellen) wurde unter Verwendung einer 1-ml Spritze, ausgestattet mit einer 27-Gauge Nadel, i. d. injiziert. Innerhalb von 30 min erhielten die Mäuse eine i. p. Injektion von 0,2 ml (0,3 mg) entweder eines IgG₁ Isotyp-Kontrollantikörpers (Pharmingen; San Diego, CA) oder eines anti-MIF monoklonalen Antikörpers XIV.15.5, XIV.14.3 oder III.D.9 (bereitgestellt von C. Metz, Dept. of Med. Biochemistry, The Picower Institute). Die Antikörperinjektionen wurden 6 Tage lang alle 48 Stunden wiederholt. Das Tumorgewicht wurde gemäß der folgenden Formel: Tumorgewicht (in Gramm) = (Breite, cm)² × (Länge, cm)/2 (gemäß Taetle et al., Cancer Treatment Reports 71: 297–304, 1987) aus Messungen geschätzt, die nach 7 Tagen unter Verwendung von Vernier-Tastzirkeln genommen wurden. Die Mäuse wurden durch CO₂-Asphyxierung euthanasiert und die Tumoren wurden ausgeschnitten und gewogen.
2 zeigt eine Hemmung des anfänglichen Lymphom-Auswachsens in vivo durch Behandlung mit neutralisierenden anti-MIF monoklonalen Antikörpern. 2 zeigt das mittlere Nassgewicht von Tumormassen, die aus anti-MIF (XIV.15.5)-behandelten Gruppen und Kostroll-Gruppen seziert wurden. Die Tumoren wurden, wie in 1 beschrieben, aus den Tieren geerntet.
3 zeigt eine Hemmung von etabliertem Lymphomwachstum in vivo durch Behandlung mit neutralisierenden anti-MIF monoklonalen Antikörpern. In diesen Experimenten wurde dem in 1 beschriebenen Versuchsprotokoll gefolgt, außer dass man die Tumoren 96 Stunden lang auf eine mittlere Größe von ungefähr 0,01 cm³ wachsen ließ, bevor die Behandlung begonnen wurde. Die Tumor tragenden Mäuse wurden dann in Gruppen aufgeteilt, deren Tumoren eine ähnliche mittlere Tumorgröße aufzeigten. Die Behandlung der Mäuse und Messung der Tumoren wurde auf eine Weise wie in den in 1 beschriebenen Experimenten zum anfänglichen Lymphom-Auswachsen ausgeführt. Daten zur Tumorgröße werden von Tag 0 (Zeit der ersten Injektion von Antikörper (XIV.15.5), 4 Tage nach der Injektion von 38C13 Zellen) bis Tag 6 alle 48 Stunden aufgetragen.
4 zeigt eine Hemmung der Proliferation humaner Endothelzellen in vivo mit neutralisierenden anti-MIF monoklonalen Antikörpern. Proliferierende humane mikrovaskuläre Endothelzellen (vierte Passage) (Clonetics; San Diego, CA) (5.000/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen) wurden mit 10–200 μg/ml einer IgG₁ Kontrolle (Sigma; St. Louis, MO) oder neutralisierendem anti-MIF monoklonalem Antikörper XIV.15.5 drei Stunden lang in Endothelzellwachstumsmedium, das 1% fötales Rinderserum enthielt (ECG-1) inkubiert. Die proliferative Aktivität dieser Kulturen wurde durch den Einbau von [³H]-Thymidin (4 μCi/ml) in DNA, wie durch Flüssigszintillationszählung gemessen wurde, gemessen.
5 zeigt eine Hemmung der Proliferation humaner Endothelzellen in vivo mit MIF Antisense-Oligonucleotiden. Proliferierende humane mikrovaskuläre Endothelzellen (vierte Passage; Clonetics), die in ECG-1 gezüchtet wurden (5.000/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen), wurden mit Phosphorothionat-Oligonucleotiden (10 μg/ml; Oligo's Etc.; Wilsonville, OR) unter Verwendung des Lipofectin-Reagens nach dem Protokoll des Herstellers (Gibco; Gaithersburg, MD) transfiziert: S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3' (Sense, humanes MIF; SEQ ID No. 1) und AS-MIF: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (Antisense, humanes MIF; SEQ ID No. 2). Nach 16 Stunden wurde die proliferative Aktivität dieser Kulturen über die anschließenden acht Stunden hinweg durch den Einbau von [³H]-Thymidin (4 μCi/ml) in DNA, wie durch Flüssigszintillationszählung gemessen wurde, gemessen.
6 zeigt eine Hemmung der Proliferation myelogener Leukämiezellen mit MIF Antisense-Oligonucleotiden. Kulturen proliferierender K-562 chronischer myelogener Leukämiezellen in der Log-Phase (5.000 Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen, erhalten von ATCC, Rockville, MD) wurden mit den folgenden Phosphorothionat-Oligonucleotiden (10 μg/ml; Oligo's Etc.) unter Verwendung des Lipofectin- Reagens nach dem Protokoll des Herstellers (Gibco) transfiziert: S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3' (Sense, humanes MIF; SEQ ID No. 1) und AS-MIF: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (Antisense, humanes MIF; SEQ ID No. 2). Nach 16 Stunden Inkubation unter Standard-Zellkulturbedingungen (37°C, 5% CO₂ in einer befeuchteten Luftatmosphäre) wurde die proliferative Aktivität dieser Kulturen über die anschließenden acht Stunden hinweg durch den Einbau von [³H]-Thymidin (4 μCi/ml; DuPont) in DNA, wie durch Flüssigszintillationszählung gemessen wurde, gemessen.
7 zeigt eine Hemmung der Tumor-Vaskularisierung durch Behandlung mit anti-MIF Antikörpern in vivo. Ein Vergleich der mittleren Anzahl CD31-positiver Kapillarprofile pro Hochvergrößerungsfeld (400 ×) in immunhistochemisch gefärbten Schnitten von Tumoren, die aus mit anti-MIF mAk behandelten Tieren gegenüber mit Kontroll-Ak behandelten geerntet worden waren, wurde durchgeführt. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die in mit anti-MIF Antikörper behandelten Tieren wachsenden Tumoren zusätzlich dazu, dass sie kleiner als diejenigen waren, die in mit Kontroll-Antikörper behandelten Tieren auftraten, auf einer pro Einheitsvolumen-Basis signifikant weniger vaskularisiert waren.
8 zeigt ein in-vitro-Experiment, das einen anti-MIF monoklonalen Antikörper zeigt, der die Proliferation von NIH3T3 Fibroblastenzellen inhibiert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines MIF (Makrophagen Migrations-inhibierender Faktor) Antagonisten-Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-MIF monoklonalen Antikörpern, MIF Antisense-RNA Molekülen und einer Kombination daraus zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Vorbeugung von Störungen, die mit einem Tumor zusammenhängen, bereit. In einer Ausführungsform ist der Tumor ein solider Tumor und besonders bevorzugt ein B-Zell- oder ein T-Zell-Lymphom.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um prämaligne Zustände, wie zum Beispiel gutartige Tumoren, hyperproliferative Störungen und gutartige Störungen mit abnormaler Proliferation zu behandeln. Störungen und Erkrankungen, die durch die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden sollen, schließen auch B- und T-Zell-Lymphome, Hautkrebs, Hirntumoren, Knochenkrebs, Ösophaguskrebs, Magenkrebs, Nierenkarzinom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nasopharyngealkrebs, Osteokarzinom, Ovarialkrebs und Uteruskrebs ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Antagonisten-Agens ein anti-MIF monoklonaler Antikörper oder ein bindendes Fragment davon, das an humanes MIF bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform enhält der Antikörper eine bindende Domäne, die immunspezifisch an MIF bindet.
Die Neutralisierung oder Hemmung von MIF kann auf etliche Weisen erreicht wer den, welche die Verwendung von Faktoren, die an MIF binden und dessen biologische Aktivität neutralisieren, die Verwendung von MIF-Rezeptor Antagonisten, die Verwendung von Faktoren, welche die enzymatische Aktivität von MIF inhibieren, die Verwendung von Verbindungen, welche die Freisetzung von MIF aus zellulären Quellen im Körper inhibieren, und die Verwendung von Nucleotidsequenzen, die von kodierenden, nicht kodierenden und/oder regulatorischen MIF Sequenzen abgeleitet sind, um die Expression von MIF zu verhindern oder zu verringern, einschließen können, aber nicht darauf beschränkt sind. Jedes der Vorangegangenen kann einzeln oder in Kombination benutzt werden, um die MIF Aktivität bei der Behandlung von Zuständen, die mit zellulärer Überproliferation zusammenhängen, zu inhibieren, und kann ferner mit jeder anderen Antitumortherapie, wie zum Beispiel einer pharmakologischen, chirurgischen, Cytokin-, Steroid- oder Gentherapie, oder jeder Kombination davon kombiniert werden.
Die Erfindung beruht teilweise auf der Hypothese, dass MIF beim Regulieren der Zellproliferation eine Rolle spielt, und dass sich eine Hemmung der Zellproliferation durch spezifisches Neutralisieren der Aktivität von MIF ergeben würde. Dieses Modell wird durch die Beispiele unterstützt. MIF ist für die Proliferation von T-Zellen in vitro erforderlich. Neutralisierende monoklonale Antikörper (mAk) gegen MIF inhibierten die Proliferation von anti-CD3-aktivierten primären T-Zellen direkt, wie durch Einbau von [³H]-Thymidin gemessen wurde. Diese Ergebnisse zeigen an, dass MIF wirkt, um das Immunsystem durch eine Aktivierung von T-Zellen zu regulieren. Eine Verabreichung neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen MIF inhibierte das Wachstum von Tumoren in einem Maus-B-Zell Lymphommodell. Zusätzlich inhibierten anti-MIF Agenzien (monoklonale Antikörper und Antisense-Moleküle) wirtsabhängige Vorgänge, die zur Tumoretablierung erforderlich sind, wie zum Beispiel die Etablierung einer Tumor-Neovaskularisierung. Diese Ergebnisse sagen voraus, dass ein Neutralisieren der Produktion, Freisetzung oder Aktivität von MIF eine signifikante therapeutische Antitumoraktivität hat, insbesondere für solide Tumoren, die eine Vaskularisierung benötigen, um das Wachstum zu unterstützen. Die MIF neutralisierenden Faktoren schließen anti-MIF Antikörper, Antikörperfragmente, MIF Rezeptoren und MIF Rezeptorfragmente ein.
Verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Herstellung von Antikörpern gegen Epitope von rekombinant produziertem oder natürlich gereinigtem MIF verwendet werden. Neutralisierende Antikörper, wie zum Beispiel diejenigen, welche die biologischen Aktivitäten von MIF inhibieren, indem sie um die MIF Epitope, die am Binden zellulärer Rezeptoren beteiligt sind, kompetieren oder sie sterisch behindern, werden für Diagnostika und Therapeutika besonders bevorzugt. Derartige Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, chimäre, einkettige und Fragmente, die durch eine Fab Expressionsbank hergestellt werden, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Zur Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion von MIF und/oder einem Teilstück von MIF immunisiert werden. Derartige Wirtstiere können Kaninchen, Mäuse und Ratten, um nur einige zu nennen, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Verschiedene Adjuvanzien können abhängig von der Wirtsart verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu erhöhen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Freund's (vollständig und unvollständig), Mineralgele wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Stoffe wie zum Beispiel Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, das Hämocyanin der Schlüssellochschnecke, Dinitrophenol und möglicherweise nützliche humane Adjuvanzien wie zum Beispiel BCG (Bazillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Monoklonale Antikörper gegen MIF können durch Verwendung jeder Technik hergestellt werden, die durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur für die Herstellung von Antikörpermolekülen sorgt. Diese schließen die ursprünglich von Kohler und Milstein beschriebene Hybridomtechnik (Nature, 256: 495–497, 1975), die humane B-Zell Hybridomtechnik (Kosbor et al., Immunology Today, 4: 72, 1983; und Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026–2030, 1983) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96, 1985) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich können Techniken, die für die Herstellung „chimärer Antikörper" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851–6855, 1984; Neuberger et al., Nature, 312: 604–608, 1984; und Takeda et al., Nature, 314: 452–454, 1985) durch Spleissen der Gene von einem Maus-Antikörpermolekül der geeigneten Antigen-Spezifität zusammen mit Genen von einem humanen Antikörpermolekül der geeigneten biologischen Aktivität entwickelt worden sind, verwendet werden. Alternativ dazu können Techniken, die für die Herstellung einkettiger Antikörper beschrieben worden sind ( US-Patent 4.946.778 ), angepasst werden, um für MIF spezifische einkettige Antikörper herzustellen.
Die Hybridomtechnik ist benutzt worden, um anti-MIF monoklonale Antikörper zu erzeugen. Hybridome, die monoklonale IgG-Antikörper, die gegen sowohl humane als auch Maus-Formen von MIF gerichtet sind, sezernieren, sind isoliert und auf ihre Fähigkeit hin, die biologische Aktivität von MIF zu neutralisieren, charakterisiert worden. Es wurde gezeigt, dass anti-MIF monoklonale Antikörper die Stimulierung der Makrophagen-Tötung intrazellulärer Parasiten inhibierten. Die anti-MIF monoklonalen Antikörper sind auch benutzt worden, um einen spezifischen und empfindlichen ELISA Durchmusterungsassay für MIF zu entwickeln. Sowohl die anti-MIF monoklonalen Antikörper als auch der ELISA-Assay können bei der Diagnose und/oder Behandlung entzündlicher Reaktionen und Schock verwendet werden.
Antikörperfragmente, die spezifische MIF-Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen derartige Fragmente ein, sind aber nicht beschränkt auf: die F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ dazu können Fab Expressionsbanken konstruiert werden (Huse et al., Science, 246: 1275–1281, 1989), um eine schnelle und leichte Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität für MIF zu ermöglichen.
Hybridome, die monoklonale Antikörper (mAk), die gegen humane und Maus-Formen von MIF gerichtet sind, sezernieren, wurden gemäß auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren hergestellt und isoliert. Kurz gesagt, weibliche BALB/c-Mäuse wurden intraperitoneal (i. p.) mit rekombinantem Maus- oder humanem MIF (10 μg/Maus) in Ribi Adjuvans (Ribi Immunochem.) immunisiert. Während des Immunisierungs- und Auffrischzeitraumes wurde den Mäusen aus dem Schwanz Blut entnommen und der Serumtiter von anti-MIF Antikörper sowie die Isotypverteilung (IgM gegenüber IgG) wurden durch direkte Enzym-verbundene Immunabsorptionsassayverfahren (ELISA), die auf Mikrotiterplatten beruhten, auf Vertiefungen mit immobilisiertem rekombinantem MIF (250 ng/ml; 55 μl/Vertiefung) als Antigen analysiert. Den immunisierten Mäusen wurden Auffrischinjektionen von rekombinantem MIF (10 μg/Maus) in Ribi Adjuvans mindestens viermal gegeben, bevor Milzen zur Fusion entnommen wurden. Drei Tage vor der Milzzellfusion mit Maus-Myelomzellen (P3X63Ag8.653; American Type Culture Collection) unter Verwendung von Polyethylenglycol (Boehringer Mannheim) wurden die Mäuse i. p. mit sowohl Maus- als auch humanem MIF (10 μg in PBS) aufgefrischt. Die Hybridome wurden unter HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin; GIBCO) Selektionsmedium (DMEM, das HAT, 10% Condimed (BoehringerMannheim), 20% FBS (Hyclone) und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin; GIBCO) enthielt) zwei oder drei Wochen lang expandiert. Kulturüberstände von wachsenden Hybridomen wurden durch direkte ELISA Verfahren mit immobilisertem rekombinantem MIF auf anti-MIF Antikörper durchgemustert.
Die Immunreaktivität von Antikörpern aus anti-MIF positiven Klonen wurde ferner durch Western Immunblotting-Techniken analysiert und Hybridome, die hohe Titer produzierten, wurden zum erneuten Klonieren durch limitierende Verdünnung ausgewählt.

Anti-MIF monoklonale Antikörper wurden unter Verwendung von Screentype ELISA (Boehringer Mannheim) isotypisiert. Hybridome, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper (des Typs IgG) sezernierten, wurden als Aszites in BALB/c-Mäusen gezüchtet und mAk wurden unter Verwendung von T-Gelchromatographie (Pierce) gereinigt. Mehrere anti-MIF monoklonale Antikörper des Typs IgM wurden identifiziert, aber nicht weiter charakterisiert. Mehrere IgG sezernierende Hybridome wurden isoliert und charakterisiert (Tabelle 1). Tabelle 1

	Humanes MIF	Maus-MIF	IgG-Subtyp
VIIG3	–	+	IgG2b
IXD11	–	+	IgG2a
XB2	–	+	IgG3
XID5	–	+	IgG2b
XIG2	–	+	IgG3
VD8	–	+	IgG2b
IID9	+	+	IgG1
IIID9	+	+	IgG1
XIF7	+	+	IgG2b
I31	+	+	IgG1
IV2.2	+	+	IgG1
XI7	+	+	n.d.
XII15.6	+	+	IgG1
XIV15.4	+	+	IgG1

Gereinigte anti-MIF monoklonale Antikörper wurden in einem Makrophagen-Tötungsassay auf Neutralisierungsaktivität getestet. Durch Thioglykollat hervorgerufene peritoneale Maus-Makrophagen wurden aus BALB/c-Mäusen erhalten, man ließ sie 4 Stunden lang anhaften und dann wurden sie mit dem intrazellulären Parasiten Leishmania major in einem Verhältnis Parasit:Makrophage von 8:1 infiziert. Nach dem Spülen wurden infizierte Makrophagenkulturen mit rekombinantem humanem MIF behandelt (das die Makrophagen-Tötung intrazelllulärer Parasiten in einer dosisabhängigen Weise im Vergleich zu Kulturmediumkontrollen verstärkt), mit oder ohne zugegebene monoklonale anti-MIF Antikörper VIIG3 oder XID5 (25 μg/ml). Es wurde festgestellt, dass beide Antikörper das MIF-verstärkte Töten von L. major um etwa 50% neutralisierten.
In getrennten Experimenten wurden gereinigte monoklonale anti-MIF Antikörper in einem [³H]-Thymidin-Einbauassay mit primären Maus-T-Zellen, die auf anti-CD3 IgG-beschichteten (Pharmingen) Gewebekulturplatten gezüchtet wurden, auf MIF neutralisierende Aktivität getestet. Kurz gesagt, dieser Assay setzte BALB/c Milzzellen ein, die unter Verwendung von Maus-T-Zell-Anreicherungssäulen (R & D) isoliert und auf anti-CD3 IgG-beschichteten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in RPMI, das 10% FBS, Antibiotika (Penicillin, Streptomycin) und L-Glutamin enthielt, zusammen mit den monoklonalen anti-MIF- oder Kontrollantikörpern aus der Maus gezüchtet wurden. Nach 48 Stunden wurden T-Zellen 16 bis 18 Stunden lang mit [³H]-Thymidin gepulst, geerntet und durch beta-Szintillationszählverfahren gezählt. Als positive Kontrolle wurden anti-IL2 monoklonale Antikörper (Genzyme) zugegeben, um die Proliferation und den damit zusammenhängenden Einbau von [³H]-Thymidin zu inhibieren. Sowohl die VIIG3 als auch die XID5 Antikörper senkten den Einbau von Thymidin um etwa 20%; eine anti-IL2-Behandlung verringerte den Einbau von [³H]-Thymidin um etwa 75%.
Eine MIF-spezifische "Sandwich" ELISA Technik wurde beruhend auf dem Einfangen von MIF durch einen immobiliserten VIIG3 Antikörper, gefolgt von Nachweis mit einem polyklonalen anti-MIF Kaninchenantiserum entwickelt. Dieser Assay wurde folgendermaßen durchgeführt: Vertiefungen von Immulon II (Dynatech) ELISA-Platten wurden mit 10–15 μg/ml mAk (VIIG3) in PBS beschichtet (65 μl/Vertiefung); der mAk war aus Aszites unter Verwendung von T-Gel-Absorptionsmittel (Pierce) gereinigt worden. Die Platten wurden versiegelt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann mit Superblock (Pierce) (140–150 μl/Vertiefung), das 2% Ziegenserum enthielt, 1–2 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden unter Verwendung eines automatisierten ELISA Plattenspülgerätes gespült (zweimal mit TBS, der 0,05% Tween20 enthielt, unter Verwendung von 200 μl/Vertiefung). MIF Proben und Standards wurden in 0,5 ml oder 1,5 ml Eppendorfröhrchen durch Zugabe von Tween20 zu Kulturüberständen auf eine Endkonzentration von 0,2% hergestellt. Die Zelllysate wurden gleichermaßen in TBS-Puffer mit Tween20 bei einer Endkonzentration von 0,2% verdünnt. Standards wurden ähnlich durch Verdünnen von gereinigtem rekom binantem Maus- oder humanem MIF in DMEM/1% FBS/0,2% Tween 20 hergestellt. Proben und Standards wurden auf die Platte aufgetragen (60 μl/Vertiefung) und die Platte wurde versiegelt und über Nacht bei 4°C unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Platte wurde fünfmal mit TBS/0,05% Tween20 gespült, und der zweite Antikörper (z. B. Kaninchen anti-Maus MIF Serum102, 1:220 in TBS/0,2% Tween20/0,2% Ziegenserum) wurde mit 60 μl/Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde versiegelt und 2 Stunden lang unter sanftem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Vertiefungen wurden dann fünfmal mit TBS/0,05%Tween20 gespült und ein tertiäres Antikörper-Enzym-Konjugat (im Handel erhältliche Ziegen-anti-Kaninchen IgG-alkalische Phosphatase, 1:4000 in TBS/0,2% Tween20/2% Ziegenserum verdünnt, wie vom Hersteller, Boehringer Mannheim, empfohlen) wurde mit 60 μl/Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde zugedeckt, 35 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann 5-mal mit TBS/0,05% Tween20 gespült. Der Assay wurde mit p-Nitrophenylphosphatlösung (pNPP) wie vom Hersteller empfohlen entwickelt (5 mg Sigma 104 Tablette in 5 ml AP-Puffer: 10 mM Diethanolamin/0,5 mM MgCl₂, pH-Wert 9,5). Man ließ das Reaktionsprodukt sich im Dunkeln bei Raumtemperatur entwickeln und es wurde innerhalb von 15–30 Minuten bei 405 nm abgelesen. Dieser Assay ergibt einen Empfindlichkeitsbereich von etwa 100 pg/ml–250 ng/ml. Es sollte angemerkt werden, dass für die Durchführung dieser „Sandwich"-Technik verschiedene Kombinationen von zwei oder mehr MIF-spezifischen Antikörpern verwendet werden können, um MIF in einer Probe einzufangen und nachzuweisen. Der immobilisierte Antikörper ist nicht auf den Antikörper VIIG3 beschränkt, und der zweite Antikörper ist nicht auf ein Kaninchen-Antiserum beschränkt.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines anti-MIF monoklonalen Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Vorbeugung von Krebs bereit. Malignitäten, die mit anti-MIF monoklonalen Antikörpern behandelt werden können schließen diejenigen, die in Tabelle 2 aufgezählt sind, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Tabelle 2
MALIGNITÄTEN UND VERWANDTE STÖRUNGEN
Leukämie

Akute Leukämie Akute lymphatische Leukämie Akute myeloische Leukämie Myeloblastenleukämie Promyeloblastenleukämie Myelomonozytenleukämie Monozytenleukämie Erythroleukämie Chronische Leukämie Chronische myeloische Leukämie Chronische lymphatische Leukämie

Lymphom

Hodgkin-Lymphom
Non-Hodgkin-Lymphom
Multiples Myelom

Solide Tumoren

Sarkome und Karzinome Fibrosarkom Myxosarkom Liposarkom Chondrosarkom Osteogenes Sarkom Osteosarkom Chordom Angiosarkom Kaposi-Sarkom Swing-Sarkom Kolonkarzinom kolorektales Karzinom Pankreaskrebs Brustkrebs Ovarialkrebs Prostatakrebs Plattenepithelkarzinom Adenokarzinom Schweißdrüsenkarzinom Talgdrüsenkarzinom Papilläres Karzinom Wilms-Tumor Gebärmutterhalskrebs Lungenkarzinom kleinzelliges Lungenkarzinom Epithelkarzinom Melanom Neuroblastom Angiome Diabetische Retinopathie

Vorzugsweise werden B- und T-Zell-Lymphome behandelt oder verhindert. In anderen spezifischen Ausführungsformen wird eine Malignität oder werden Veränderungen mit abnormaler Proliferation oder hyperproliferative Störungen in Kopf, Hals, Cervix, Niere, Magen, Haut, Eierstock, Blase, Brust, Kolon, Lunge oder Uterus behandelt oder verhindert. In anderen spezifischen Ausführungsformen wird ein Sarkom oder eine Leukämie behandelt oder verhindert. In anderen besonderen Ausführungsformen wird ein Osteosarkom oder Nierenzellkarzinom behandelt oder verhindert.
Die MIF monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch verabreicht werden, um prämaligne Zustände zu behandeln und um das Fortschreiten zu einem neoplastischen oder malignen Zustand zu verhindern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf diejenigen Störungen, die in Tabelle 2 aufgezählt sind. Eine derartige prophylaktische oder therapeutische Verwendung ist bei Zuständen angezeigt, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie einem Fortschreiten zu Neoplasie oder Krebs vorangehen, insbesondere da, wo nicht neoplastisches Zellwachstum, bestehend aus Hyperplasie oder Dysplasie aufgetreten ist. Hyperplasie ist eine Form von kontrollierter Zellproliferation, die eine Erhöhung der Zellzahl in einem Gewebe oder Organ ohne signifikante Veränderung in Struktur oder Funktion mit sich bringt. Dysplasie ist häufig ein Vorläufer von Krebs und wird hauptsächlich in den Epithelien gefunden; sie ist die ungeordnetste Form nicht neoplastischen Zellwachstums, die einen Verlust der Einheitlichkeit einzelner Zellen und der architektonischen Orientierung von Zellen mit sich bringt. Dysplasie tritt charakteristischerweise auf, wo es eine chronische Irritation oder Entzündung gibt, und wird oft in der Cervix, den Atemwegen, der Mundhöhle und der Gallenblase gefunden.
Alternativ dazu oder zusätzlich zur Anwesenheit von abnormalem Zellwachstum, das als Hyperplasie oder Dysplasie gekennzeichnet ist, kann die Anwesenheit von einem oder mehreren Kennzeichen eines transformierten Phänotyps oder eines malignen Phänotyps, der in vivo aufgezeigt oder in vitro durch eine Zellprobe von einem Patienten aufgezeigt wird, die Erwünschtheit einer prophylaktischen/therapeutischen Verabreichung von anti-MIF monoklonalen Antikörpern anzeigen. Die Kennzeichen eines transformier ten Phänotyps schließen Morphologieänderungen, lockerere Substratanhaftung, Verlust von Kontakthemmung, Verlust von Verankerungsabhängigkeit, Proteasefreisetzung, erhöhten Zuckertransport, verringerten Serumbedarf, Expression fötaler Antigene, Verschwinden des 250.000 Dalton großen Zelloberflächenproteins ein.
In einer spezifischen Ausführungsform sind die Leukoplakie, eine gutartig erscheinende hyperplastische oder dysplastische Läsion von Epithel, oder die Bowen-Krankheit, ein in situ Karzinom, präneoplastische Läsionen, welche die Erwünschtheit einer prophylaktischen Intervention anzeigen.
Pharmazeutische Formulierungen
Eine therapeutische Verbindung, wie zum Beispiel ein therapeutischer monoklonaler Antikörper, kann einem humanen Patienten allein oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, wo sie mit geeigneten Trägern oder Exzipienten in Dosen gemischt wird, um verschiedene Zustände, die eine zelluläre Überproliferation mit sich bringen, zu behandeln oder zu verbessern. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezeichnet ferner diejenige Menge der Verbindung, die ausreichend ist, um Tumorwachstum zu inhibieren. Therapeutisch wirksame Dosen können allein oder als adjunktive Therapie in Kombination mit anderen Behandlungen für Tumorwachstum oder damit zusammenhängende Erkrankungen verabreicht werden. Techniken zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können in der letzten Ausgabe von "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, gefunden werden.
Geeignete Verabreichungswege können zum Beispiel eine orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung, parenterale Abgabe, einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen, sowie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen und wahlweise in einer Depot- oder Retardformulierung einschließen.
Darüberhinaus kann man das Agens der vorliegenden Erfindung in einem gezielten Arzneistoffabgabesystem, zum Beispiel in einem Liposom, das mit einem anti-CD4 Antikörper beschichtet ist, um auf T-Zell-Lymphome abzuzielen, verabreichen. Die Liposomen werden auf Zellen, die CD4 exprimieren, abgezielt und durch sie selektiv aufgenommen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Weise hergestellt werden, die selbst bekannt ist, wie zum Beispiel durch herkömmliche Mischungs-, Auflösungs-, Drageeherstellungs-, Levitations-, Emulgations-, Verkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können auf herkömmliche Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch verträglicher Träger formuliert werden, die Exzipienten und Hilfsmittel umfassen, die das Verarbeiten der wirksamen Verbindungen zu Herstellungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die richtige Formulierung hängt vom gewählten Verabreichungsweg ab.
Zur Injektion können die Agenzien der Erfindung in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie zum Beispiel Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischem Kochsalzpuffer. Zur transmukosalen Verabreichung werden für die zu durchdringende Grenze geeignete Eindringmittel in der Formulierung verwendet. Derartige Eindringmittel sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen leicht durch Kombinieren der wirksamen Verbindungen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern formuliert werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Derartige Träger befähigen die Verbindungen der Erfindung, zur oralen Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschwemmungen, Suspensionen und dergleichen formuliert zu werden. Pharmazeutische Herstellungen zur oralen Verwendung können durch einen soliden Exzipienten, wahlweise durch Mahlen eines so erhaltenen Gemisches und Verarbeiten des Gemisches von Granulatkörnern nach Zugabe geeigneter Hilfsmittel, falls gewünscht, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten, erhalten werden. Geeignete Exzipienten sind insbesondere Füllstoffe wie zum Beispiel Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Celluloseherstellungen wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht können Sprengmittel zugegeben werden, wie zum Beispiel das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar, oder Algininsäure oder ein Salz davon, wie zum Beispiel Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die wahlweise Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Identifizierung oder um unterschiedliche Kombinationen von Dosen der aktiven Verbindung zu kennzeichnen, zugegeben werden.
Pharmazeutische Herstellungen, die oral verwendet werden können, schließen aus Gelatine hergestellte Steckkapseln sowie weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie zum Beispiel Glycerin oder Sorbitol, hergestellt werden, ein. Die Steckkapseln können die wirksamen Bestandteile im Gemisch mit Füllstoffen, wie zum Beispiel Lactose, Bindemitteln, wie zum Beispiel Stärken, und/oder Schmiermitteln, wie zum Beispiel Talkum oder Magnesiumstearat, und wahlweise Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die wirksamen Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen, aufgelöst oder suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen zur oralen Verabreichung sollten in für eine derartige Verabreichung geeigneten Dosierungen vorliegen.
Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Lutschtabletten, die auf herkömmliche Weise formuliert werden, annehmen.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung günstigerweise in Form einer Aerosolspray-Präsentierung aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Zer stäuber unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, wie zum Beispiel Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder eines anderen geeigneten Gases, abgegeben. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zum Abgeben einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Kapseln und Kartuschen aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalations- oder Insufflationsapparat können formuliert werden, indem sie ein Pulvergemisch der Verbindung und einen geeigneten Pulvergrundstoff, wie zum Beispiel Lactose oder Stärke, enthalten.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, wie zum Beispiel durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Form von Dosierungseinheiten, in Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern mit einem zugegebenen Konservierungsmittel vorgelegt werden. Die Zusammensetzungen können derartige Formen als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln annehmen und können Formulierungsagenzien wie zum Beispiel suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Agenzien enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässrige Lösungen der wirksamen Verbindungen in wasserlöslicher Form ein. Zusätzlich können Suspensionen der wirksamen Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen Fettöle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyzeride, oder Liposomen, ein. Wässrige Injektionssuspensionen können Stoffe enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Wahlweise kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Agenzien enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung hoch konzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Zäpfchen oder Bleibeklistiere, die herkömmliche Zäpfchengrundstoffe wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
Die Verbindungen können auch als Depotherstellungen formuliert werden. Derartige lang wirkende Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Somit können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel als Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwer lösliche Derivate, zum Beispiel als schwer lösliches Salz, formuliert werden.
Liposomen und Emulsionen sind bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder Träger für hydrophobe Arzneistoffe. Bestimmte organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid, können auch eingesetzt werden, obwohl normalerweise auf Kosten höherer Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen unter Verwendung eines Retardsystems, wie zum Beispiel semipermabler Matrizen solider hydrophober Polymere, die das therapeutische Agens enthalten, abgegeben werden. Verschiedene Retardmaterialien sind etabliert worden und sind Fachleuten wohlbekannt. Retardkapseln können, je nach ihrer chemischen Beschaffenheit, die Verbindungen über wenige Wochen bis zu über 100 Tage hinweg freisetzen. Je nach der chemischen Beschaffenheit und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagens können zusätzliche Strategien zur Proteinstabilisierung eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Festphasen- oder Gelphasenträger oder -exzipienten umfassen. Beispiele für derartige Träger oder Exzipienten schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglycole, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Viele der Verbindungen der Erfindung, die als Neutralisatoren der MIF Aktivität identifiziert worden sind, können als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Salz-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Bernsteinsäure usw., oder Basen gebildet werden. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln, die die entsprechenden freien Base-Formen sind, löslicher zu sein. Beispiele für pharmazeutisch kompatible Salze, Träger oder Exzipienten sind Fachleuten wohlbekannt und können zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A. R. Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Esston, PA, 1990, gefunden werden. Derartige Salze schließen Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Acetat-, Citrat-, Tartrat- und Malatsalze und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Dosis
Eine therapeutisch wirksame Menge bedeutet eine Menge, die darin wirksam ist, die Entwicklung oder das Fortschreiten von Krebs oder einer hyperproliferativen Erkrankung bei der behandelten Versuchsperson zu verhindern oder zu inhibieren. Eine Bestimmung der wirksamen Mengen liegt wohl innerhalb der Fähigkeit von Fachleuten, besonders angesichts der detaillierten Offenbarung, die hierin bereitgestellt wird. Für jede im Verfahren der Erfindung verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich aus Zellkulturassays geschätzt werden. Eine derartige Information kann verwendet werden, um die bei Menschen nützlichen Dosen genauer zu bestimmen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezeichnet diejenige Menge der Verbindung, die zu einer Verringerung der Entwicklung von Krebs, eines Tumors oder einer hyperproliferativen Erkrankung oder von Symptomen davon führt oder die das Überleben bei einem Patienten verlängerte. Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit derartiger Verbindungen kann durch pharmazeutische, pharmakologische und toxikologische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren zum Bestimmen der LD₅₀ (der Dosis, die für 50% der Population letal ist) und der ED₅₀ (der Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und er kann als das Verhältnis zwischen LD₅₀ und ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes aufzeigen, werden bevorzugt. Die aus Zellkulturassays oder Tieruntersuchungen erhaltenen Daten können beim Formulieren eines Dosierungsbereiches zur Verwendung bei Menschen verwendet werden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereiches zirkulierender Konzentrationen, welche die ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches je nach der eingesetzten Dosierungsform und des benutzten Verabreichungsweges variieren. Die genaue Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können durch den einzelnen Arzt angesichts des Zustands des Patienten gewählt werden.
Doseriungsmenge und -intervall können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der wirksamen Einheit, die ausreichend sind, um die gewünschten modulierenden Wirkungen aufrechtzuerhalten, oder die minimale wirksame Konzentration (MEC) bereitzustellen. Die MEC wird für jede Verbindung variieren, kann aber aus in-vitro-Daten geschätzt werden; die zum Erreichen einer Hemmung von 50–90% des Zell- oder Tumorwachstums unter Verwendung der hierin beschriebenen Assays notwendige Konzentration. Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erreichen, werden von individuellen Kennzeichen und dem Verabreichungsweg abhängen. HPLC-Assays, Bioassays oder Immunassays können jedoch verwendet werden, um Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Dosierungsintervalle können auch unter Verwendung des MEC-Wertes bestimmt werden. Verbindungen sollten unter Verwendung eines Regimes verabreicht werden, das 10–90% der Zeit Plasmaspiegel oberhalb der MEC aufrechterhält, vorzugsweise zwischen 30–90% und am meisten bevorzugt zwischen 50–90%. In Fällen von lokaler Verabreichung, zum Beispiel der direkten Einführung in einen Tumor, oder bei selektiver Aufnahme hängt die wirksame lokale Konzentration des Arzneistoffes vielleicht nicht mit der Plasmakonzentration zusammen. Die Menge der Zusammensetzung, die verabreicht wird, hängt von der Versuchsperson, die behandelt wird, vom Gewicht der Versuchsperson, dem Schweregrad der Beschwerden, der Verabreichungsweise und der Beurteilung des verschreibenden Arztes ab.
Beispiel 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Behandlung Tumor-tragender Mäuse mit anti-MIF monoklonalen Antikörpern. Für diese Experimente wurde eine Behandlung von C3H-HeN Mäusen mit verschiedenen anti-MIF mAk am selben Tag wie die Tumorimplantation begonnen. Dieses Verfahren untersucht das Potenziel von anti-MIF mAk, anfängliches Tumorwachstum zu inhibieren, und wird als voraussagendes Modell für Metastase und therapeutische Agenzien zum Behandeln von metastasierendem Krebs betrachtet. Verschiedene anti-MIF mAk können in diesem Modell auf Antitumorwirksamkeit hin untersucht werden. Das 38C13 B-Zell Lymphommodell ist ein gut etabliertes Modell eines soliden Tumors, das seit seiner anfänglichen Beschreibung 1977 (Kemp et al., Cancer Research 55: 3817–3824, 1995) verwendet worden ist, um neue Therapeutika gegen Krebs abzuschätzen. Das Modell wurde durch Injizieren von Maus B-Lymphomzellen intradermal (i. d.) in den Mausstamm, von dem sie ursprünglich abgeleitet wurden (C3H-HeN), erreicht. Innerhalb von 10 Tagen entwickelten diese Mäuse ein solides Lymphom, das leicht messbar ist.
Unter Verwendung von [³H]-Thymidin Einbauassays testeten wir die Wirkungen einer anti-MIF Behandlung auf 38C13 Zellen in vitro. Weder eine anti-MIF Antikörperbehandlung (mit den mAk III.D.9 oder XIV.15.5) noch eine anti-MIF Antisense-Oligonucleotidbehandlung (unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Antisense-Oligonucleotide) unterdrückten die 38C13 Zellproliferation in vitro signifikant. Diese Daten sagen voraus, dass derartige anti-MIF therapeutische Verfahren und Agenzien für diesen Tumorzelltyp nicht direkt antiproliferativ waren.
C3H-HeN Mäuse wurden anästhesiert und dann auf der oberen Flanke kurz geschoren. 50.000 38C13 Zellen in der Log-Phase (in 0,05 ml PBS) wurden i. d. mit einer 1-ml Spritze und einer 27-G Nadel injiziert. Innerhalb von 30 Minuten erhielten die Tiere eine Behandlung durch IP-Injektion von 500 μg anti-MIF mAk oder mAk des Kontrollisotyps. Injektionen von mAb wurden 4 Tage lang alle 48 Stunden wiederholt. Die Tiere wurden täglich unter Verwendung von Vernier-Tastzirkeln auf Tumorwachstum überwacht. Die Tiere wurden unter Verwendung von CO₂-Erstickung euthanasiert, Tumoren werden isoliert, gewogen und histologisch analysiert.
Aufgrund der Variabilität des Tumorwachstums innerhalb von Gruppen (abhängig von der genauen Injektionsstelle, dem Volumen der Injektion) und um für das Erhalten einer statistischen Auswertung der Ergebnisse zu sorgen, umfasste jede Gruppe fünf Tiere und das Experiment wurde dreimal ausgeführt. Zusätzlich zu den Versuchsgruppen (d. h. den mit anti-MIF Ak behandelten) wurden Kontrollgruppen untersucht, zum Beispiel eine Gruppe, die mit einem Isotyp-Kontrollantikörper gegen ein irrelevantes Antigen behandelt wurde und eine Gruppe, die nur mit Vehikel behandelt wurde. Die Ergebnisse werden in den 1 und 2 gezeigt, die demonstrieren, dass eine Störung der biologischen Aktivität von MIF, in diesem Fall durch Behandeln mit einem monoklonalen Antikörper, die Entwicklung eines soliden Tumors, in diesem Falle eines B-Zell Lymphoms, in ansonsten normalen Tieren inhibierte.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass eine MIF Antagonisten-Therapie gegen etablierte Tumoren in einem voraussagenden in-vivo-Modell wirksam ist. Mit Tumorzellen beimpfte Mäuse wurden behandelt, nachdem man den Tumoren einen Zeitraum ließ, um sich zu etablieren. In diesen Experimenten wurde die gleiche Anzahl Tumorzellen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben injiziert, außer dass man die soliden Tumoren 6 Tage lang bis zu einem mittleren Durchmesser von etwa 6 mm sich entwickeln und wachsen ließ. Nach 6 Tagen folgte eine Behandlung der Tiere und eine Messung der Tumoren dann dem gleichen Schema wie oben. Dieses Verfahren betont eine therapeutische Aktivität von anti-MIF mAk auf etablierte Tumoren.
C3H-HeN Mäuse wurden anästhesiert und dann auf der oberen Flanke kurz geschoren. 50.000 38C13 Zellen in der Log-Phase (in 0,05 ml PBS) wurden i. d. mit einer 1 ml Spritze und einer 27-G Nadel injiziert. Die Tiere wurden täglich durch Messungen, die mit Vernier-Tastzirkeln genommen wurden, auf Tumorwachstum hin überwacht. Am 6. Tag des Experiments erhielten Gruppen von Tieren eine Behandlung durch IP-Injektion von 500 μg Isotyp-mAk, anti-MIF mAk oder nur PBS. Die Injektionen wurden 4 Tage lang alle 48 Stunden wiederholt. Die Tiere wurden täglich überwacht und das Tumorwachstum wurde durch Messungen, die mit Vernier-Tastzirkeln genommen wurden, abgeschätzt. Die Tiere wurden unter Verwendung von CO₂-Erstickung euthanasiert, die Tumoren wurden isoliert, gewogen und histologisch analysiert.
Aufgrund der Variabilität der anfänglichen Tumorgröße (abhängig von der genauen Injektionsstelle, dem Volumen der Injektion und anderen Faktoren) und um Daten für eine statistische Auswertung bereitzustellen, zählte jede Versuchs- und Kontrollgruppe fünf Tiere. Wie in 3 gezeigt, wuchsen etablierte Tumoren in mit anti-MIF behandelten Tieren langsamer als in mit Kontrollantikörper behandelten Tieren.
Das vorstehende Verfahren zum Abschätzen der Antitumorwirkungen einer gegen MIF gezielten Therapie wurde unter einem anderen Dosierungsplan wiederholt, wobei Tumor-tragende Versuchstiere mit 0,5 mg anti-MIF Antikörpern oder Kontrollantikörpern zweimal täglich statt jeden zweiten Tag behandelt wurden, beginnend am Tag 6 nach der Tumorzelleinpflanzung. Das mittlere geschätzte Tumorgewicht unterschied sich zwischen den Gruppen am Tag 6, wie gerade vor der ersten Antikörperinjektion gemessen wurde, nicht (45,6 ± 4,6 mg für die Isotyp-Kontrollgruppe gegenüber 46,1 ± 3,4 mg für die Gruppe, von der geplant war, dass sie anti-MIF mAk XIV.15.5 erhalten sollte; Mittelwert ± SD). Bis zum Tag 7 waren die Tumoren in der behandelten Kontrollgruppe jedoch signifikant mehr gewachsen als die Tumoren in der mit anti-MIF Antikörper behandelten Gruppe (246,7 ± 41,4 gegenüber 97,2 ± 12,2). Diese Daten unterstützen den Schluss, dass Verfahren und Agenzien, die auf eine Hemmung von MIF gerichtet sind, und ganz besonders eine Behandlung mit anti-MIF Antikörpern, wirksam sind, um das Wachstum etablierter Tumoren in vivo zu inhibieren.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass MIF Antagonisten Tumorwachstum inhibieren, indem sie die Tumorvaskularisierung inhibieren. Proliferierende humane mikrovas kuläre Endothelzellen (vierte Passage) (Clonetics; San Diego, CA) 5.000/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen) wurden mit 10–200 μg/ml IgG₁ Kontrollantikörper (Sigma; St. Louis, MO) oder neutralisierendem anti-MIF monoklonalem Antikörper XIV.15.5 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. C. Metz, Department of Medical Biochemistry, The Picower Institute For Medical Research; Manhasset, NY) in Endothelial Cell Growth Medium, das 1% fötales Rinderserum enthielt (ECG-1; Clonetics) drei Stunden lang inkubiert. Die proliferative Aktivität dieser Kulturen wurde über die anschließenden 16 Stunden hin durch Einbau von [³H]-Thymidin (4 μCi/ml) (DuPont; Boston, MA) in DNA, wie durch Flüssigszintillationszählung gemessen wurde (3), gemessen. Proliferierende humane mikrovaskuläre Endothelzellen (vierte Passage; Clonetics), in ECG-1 gezüchtet (5.000/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen), wurden mit den folgenden Phosphorothionat-Oligonucleotiden (10 μg/ml; Oligo's Etc.; Wilsonville, OR) unter Verwendung von Lipofectin-Reagens nach dem Protokoll des Herstellers (Gibco; Gaithersburg, MD) transfiziert: S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3' (Sense, humanes MIF; SEQ ID No. 1) und AS-MIF: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (Antisense, humanes MIF; SEQ ID No. 2). Nach 16 Stunden wurde die proliferative Aktivität dieser Kulturen über die anschließenden acht Stunden hinweg durch Einbau von [³H]-Thymidin (4 μCi/ml; DuPont) in DNA, wie durch Flüssigszintillationszählung gemessen wurde, gemessen (5). Es wurde gezeigt, dass anti-MIF Antikörper für humane mikrovaskuläre Endothelzellen antiproliferativ waren (4), was anzeigt, dass anti-MIF Antikörper eine antiangiogene Aktivität in vitro ausüben.
Antisense MIF mRNA inhibierte die Proliferation humaner Endothelzellen in vitro um ungefähr 50% (5) relativ zu Sense-Konstrukten. Somit wurde gezeigt, das Antisense MIF mRNA für humane Endothelzellen antiproliferativ war, was anzeigt, dass Antisense MIF mRNA eine antiangiogene Aktivität ausübt. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine anti-MIF Therapie gegen Krebs aus (1) direkten antiproliferativen Wirkungen der anti-MIF Therapie auf Tumorzellen und/oder (2) einer Hemmung wirtsabhängiger Vorgänge, wie zum Beispiel Angiogenese, die für Initiation, Entwicklung oder Fortschreiten eines Tumors erforderlich sind, Nutzen ziehen kann.
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht eine Hemmung der Proliferation von Leukämiezellen in vitro. Diese Untersuchungen wurden ausgeführt, um zu untersuchen, ob anti-MIF therapeutische Verfahren und Agenzien direkte antiproliferative Wirkungen auf Tumorzellen haben können. In diesem Beispiel wurden K562 Zellen (Zellen von einer chronischen humanen myelogenen Leukämie) Antisense MIF-Konstrukten ausgesetzt. Zellkulturen proliferierender K562 chronischer myelogener Leukämiezellen in der Log-Phase (5.000 Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen, erhalten von ATCC, Rockville, MD) wurden mit den folgenden Phosphorothionat-Oligonucleotiden (10 μg/ml, Oligo's Etc.) unter Verwendung von Lipofectin-Reagens nach dem Protokoll des Herstellers (Gibco) transfiziert: S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3' (Sense, humanes MIF; SEQ ID No. 1); AS-MIF: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (Antisense, humanes MIF; SEQ ID No. 2). Nach 16 Stunden Inkubation unter Standard-Zellkulturbedingungen (37°C, 5% CO₂ in einer befeuchteten Luftatmosphäre) wurde die proliferative Aktivität dieser Kulturen über die anschließenden acht Stunden hinweg durch Einbau von [³H]-Thymidin (4 μCi/ml; DuPont) in DNA, wie durch Flüssigszintillationszählung gemessen wurde, gemessen.
Relativ zu Sense MIF Konstrukten inhibierte Antisense MIF mRNA die Proliferation von K562 Zellen um etwa 50% (6). Die Ergebnisse demonstrieren die direkte antiproliferative Wirkung einer anti-MIF Behandlung auf Tumorzellen und genauer gesagt die Aktivität einer für MIF spezifischen Antisense Behandlung gegen eine Proliferation von Leukämiezellen.
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht eine Hemmung der Lymphom-Vaskularisierung in vivo durch Behandlung mit einem neutralisierenden anti-MIF Antikörper. Die Tumor-Neovaskularisierung wurde durch immunhistochemisches Färben auf eine konstitutiv exprimierte Endothelzell-Oberflächenmarkierung hin (CD31, auch als Blutplättchen-Endothelzellen-Adhäsionsmolekül oder PECAM-1 bekannt) abgeschätzt. Tumorwachstum wurde in normalen Mäusen durch Transplantation syngener Lymphomzellen initiiert. Mit Tumorzellen beimpfte Mäuse wurden vom Zeitpunkt des Tumorzelltransfers an entweder mit anti-MIF oder Kontrollantikörpern behandelt und die Tumor-Vaskularisierung, wie in histologischen Proben von geernteten Tumoren durch für CD31 spezifisches immunhistochemisches Farben sichtbar gemacht, wurde zwischen Schnitten Tumortragender Mäuse, die mit anti-MIF gegenüber Kontrollantikörper behandelt wurden, verglichen.
B-Zell-Lymphomzellen (38C13-Zelllinie, bereitgestellt von J. D. Kemp, Dept. of Pathology, U. von IA) wurden aus Kulturen in der exponentiellen Wachstumsphase (RPMI/10% FBS) gewonnen, 10 min lang bei 30 × g zentrifugiert, zweimal mit PBS gespült und auf 1 × 10⁶ Zellen/ml (in PBS) eingestellt. Den Verfahren von Kemp et al. (nachstehend) folgend, wurden Gruppen von fünf weiblichen C3H/HeN Mäusen (20–25 g; Harlan Labs, NY) auf der oberen Flanke rasiert und 0,05 ml der 38C13 Zellsuspension mit 1 × 10⁶/ml (5 × 10⁴ Zellen) wurden i. d. mit einer 1 ml Spritze und einer 27-Gauge Nadel injiziert. Innerhalb von 30 min erhielten Mäuse eine 0,2 ml (0,3 mg) i. p. Injektion von entweder einem IgG₁ Isotyp-Kontrollantikörper (Pharmingen; San Diego, CA) oder einem anti-MIF monoklonalen Antikörper (XIV.15.5, mAk der Unterklasse IgG₁, bereitgestellt von C. Metz, Dept. of Med. Biochemistry, The Picower Institute for Medical Research). Die Antikörper-Injektionen wurden 6 Tage lang alle 48 Stunden wiederholt. Die Mäuse wurden durch CO₂-Asphyxierung euthanasiert und die Tumoren wurden ausgeschnitten, in gepuffertem neutralem 10% Formalin fixiert, geschnitten und für eine immunhistochemische Analyse verarbeitet. Nach dem Quenchen endogener Peroxidasen mit H₂O₂ (3%) wurden die entparaffinierten Schnitte nacheinander mit einem anti-CD31 mAk (Verdünnung 1:50; Klon MEC 13.3; Pharmingen, San Diego, CA) oder einem Kontrollantikörper des Isotyps IgG₂ (Pharmingen), mit einem an alkalische Phosphatase gebundenen anti-Maus sekundären IgG-Antikörper inkubiert und mit neuem Fuchsin (DAKO) als Substrat entwickelt. Kontrollschnitte, die mit einer Isotypkontrolle oder ohne primären Antikörper gefärbt wurden, zeigten keine Immunreaktivität.
Wie durch immunhistochemische Färbung auf die Endothelzellmarkierung CD31 hin aufgedeckt wurde, zeigen Schnitte von Tumorgewebe, das aus mit Kontrollantikörper behandelten Mäusen geerntet wurde, ein gleichmäßig dichtes Bett von Neovaskularisierung. Schnitte von Tumorgewebe aus mit einem anti-MIF monoklonalen Mausantikörper behandelten Mäusen zeigen jedoch immunhistochemische Evidenz von nur geringer Vaskularisierung der Tumormasse. Die Tumoren, die sich in mit anti-MIF mAk behandelten Tieren entwickelten, waren signifikant kleiner als die Tumoren, die sich in den mit Kontroll-Ak behandelten Mäusen entwickelten.
Ein Vergleich der mittleren Anzahl CD3-positiver Kapillarprofile pro Hochvergrößerungsfeld (400 ×) in immunhistochemisch gefärbten Schnitten von Tumoren, die aus anti-MIF mAk behandelten gegenüber mit Kontroll-Ak behandelten Tieren geerntet wurden, wurde durchgeführt. Die Anzahl an CD31+-Kapillarprofilen wurde für fünf Hochvergrößerungsfelder von Histologieschnitten von Tumorproben tabellarisch aufgeführt, die von zwei Tieren jeder Gruppe genommen wurden (mit anti-MIF gegenüber mit Kontrollantikörper behandelt). Diese Tumoren waren diejenigen, die wie in den Experimenten zum anfänglichen Tumorauswachsen, die in den 1 und 2 gezeigt wurden, beschrieben, geerntet wurden. Die Ergebnisse dieses Vergleichs des Vaskularisierungsgrades werden in 7 gezeigt, die demonstriert, dass die in mit anti-MIF Antikörper behandelten Tieren wachsenden Tumoren zusätzlich dazu, dass sie kleiner sind als diejenigen, die in mit Kontrollantikörper behandelten Tieren auftreten, auf einer pro Einheitsvolumen-Basis signifikant weniger vaskularisiert sind. Somit wird gezeigt, dass die Antitumorvorteile therapeutischer Agenzien und Verfahren, die gegen MIF gerichtet sind, mindestens teilweise durch eine anscheinende Wirkung auf wirtsabhängige Vorgänge, wie zum Beispiel Angiogenese, auftreten, die stark zum Bestimmen des Ablaufs der Tumorentwicklung beitragen.
Beispiel 7
Dieses Beispiel veranschaulicht eine Verarmung von sezerniertem MIF unter Verwendung eines anti-MIF monoklonalen Antikörpers. Monoklonale Antikörper wurden einem etablierten Protokoll folgend hergestellt. Gereinigtes rekombinantes Maus-MIF mit einem RIBI Adjuvans (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) wurde verwendet, um weibliche BALB/c Mäuse zu immunisieren. 10 μg rekombinantes Maus-MIF wurde in E. coli von einem IPTG-induzierbaren Plasmid, pET 11b (Novagen, Madison, WI), exprimiert, durch FPLC und C8 Sep Pak (Waters Co., Milford, MA) gereinigt, mit 100 μl RIBI Adjuvans gemischt und i. p. injiziert. Antikörpertiter wurden direkt durch ELISA analysiert. Sobald die Titer > 5-mal die der Nicht-Immunseren betrugen, wurden Milzzellen unter Verwendung von 50% Polyethylenglycol mit P3-X63 Ag8 Zellen fusioniert. Einzelne Klone wurden durch ELISA und Western-Blot durchmustert und Positive wurden dann i. p. in BALB/c-Mäuse injiziert, mit Pristan vorbehandelt und Ascites, die IgG enthielten, wurden gewonnen. Anti-MIF und nicht immunes IgG wurden aus Ascites durch Protein-G Affinitätschromatographie den Anleitungen der Hersteller (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) folgend gereinigt. Für die meisten Experimente wurden 10 μg nicht immunes oder anti-MIF IgG zu NIH3T3 Zellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) gegeben und man ließ sie über Nacht in Anwesenheit von [³H]-Thymidin (5,0 μCi pro Milliliter; 1 Ci = 3 Gbq) (DuPont NEN, Boston, MA) proliferieren.
NIH3T3 Zellen wurden in DMEM/10% FBS/2,0 mM Glutamin; 37°C in 95% Luft/5% CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden auf Filter mit 96 Vertiefungen geerntet (Packard Cell Harvester), Szintillationsflüssigkeit wurde zugegeben und die Vertiefungen auf eingebautes ³H gezählt. Die in 8 bereitgestellten Daten zeigen eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für die Proliferation als Funktion der anti-MIF Antikörperdosis. Ein Kontrollantikörper inhibierte die Proliferation nicht, aber ein anti-MIF Antikörper inhibierte die Proliferation im Konzentrationsbereich von 600 ng/ml bis 6 μg/ml.
Hinterlegung
Die Maus Hybridomstämme III.D.9 und XIV.15.5 wurden am 24. Oktober 1996 bei der American Type Culture Collection, 1201 Parklaven Drive, Rockville, Maryland 20852, unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt, und ihnen wurden die Hinterlegungsnummer ATCC HB-12220 zugeteilt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines MIF (Makrophagen Migrations-inhibierender Faktor) Antagonisten-Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-MIF monoklonalen Antikörpern, MIF Antisense-RNA Molekülen und einer Kombination daraus zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung oder Vorbeugung von Krebs.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der Krebs ein solider Tumor ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 2, worin der Krebs ein B-Zell- oder ein T-Zell-Lymphom ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der Krebs durch die Behandlung eines prämalignen Zustandes oder eines gutartigen Tumors verhindert wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ösophaguskrebs, Magenkrebs, Nierenkarzinom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nasopharyngealkrebs, Osteokarzinom, Ovarialkrebs und Uteruskrebs.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das MIF Antagonisten-Agens ein anti-MIF monoklonaler Antikörper ist oder ein bindendes Fragment davon, das an humanen MIF bindet.
Verwendung eines MIF (Makrophagen Migrations-inhibierender Faktor) Antagonisten-Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anti-MIF monoklonalen Antikörpern, MIF Antisense-RNA Molekülen und einer Kombination daraus zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Tumor-Neovaskularisierung.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, worin das Agens ein anti-MIF monoklonaler Antikörper ist oder ein bindendes Fragment davon, das an humanen MIF bindet.
Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin das Agens ein Antikörper ist, der spezifisch an den Makrophagen Migrations-inhibierenden Faktor (MIF) bindet.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, worin das Agens ein Makrophagen-Migrationsinhibierender Faktor (MIF) Antisense-Molekül ist.