PT954334E - Utilização de antagonistas do factor inibitório da migração de macrófago para a terapia de anti-cancro. - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE ANTAGONISTAS DO PACTOR INIBITÓRIO DA MIGRAÇÃO DE MACRÕFAGO PARA A TERAPIA DE ΑΝΤΙ-CANCRO"

Campo Técnico da Invenção A presente invenção refere-se à utilização de um agente antagonista de MIF (factor inibitório da migração de macrófago) seleccionado a partir do grupo que consiste de anticorpos monoclonais anti-MIF, moléculas de ARN de anti-sentido de MIF, e uma sua combinação para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção do cancro ou para o tratamento da neovascularização do tumor.

Antecedentes da Invenção 0 MIF foi originalmente identificado pela sua capacidade de prevenir a migração dos macrófagos do porco da Guiné in vitro (Bloom & Bennett, Science 153: 80-82, 1966; e David, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 56: 72-77, 1966). O MIF tem sido relatado como estando associado com as reacções de hipersensibilidade de tipo retardado (Bloom & Bennett, 1966, supra; David, 1966, supra), para ser produzido por células T activadas por lectina (Weiser et al., J Immunol. 126: 1958-1962, 1981), e para aumentar a aderência do macrófago, a fagocitose e a actividade tumoricidal (Nathan et al., J. Exp. Med. 137: 275-288, 1973; Nathan et al., J. Exp. Med. 133: 1356-1376, 1971; e Churchill et al., J Immunol. 115: 781-785, 1975). Infelizmente, muitos destes estudos utilizaram sobrenadantes de cultura misturados que foram pensados serem o MIF puro, mas que mostraram mais tarde conter outras citoquinas, tais como o IFN-γ e 2 o IL-4, que também têm actividade inibitória de migração (Mclnnes e Rennick, J Exp. Med. 167; 598-611, 1988; Thurman et al., J.

Immunol. 134: 305-309, 1985). O MIF humano recombinante foi primeiramente clonado a partir de um banco de células T humanas (Weiser et al.r 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86: 7522-7526, 1989), e o MIF humano recombinante mostrou activar os macrófagos derivados do sangue para matar os parasitas intracelulares e as células de tumor in vitro, para estimular a expressão de IL-Ιβ e de TNFa, e para induzir a síntese do óxido nítrico (Weiser et al., J. Immunol. 147: 2006-2011, 1991; Pozzi et al., Cellular Immunol, 145: 372-379, 1992; Weiser et al., Proc.

Natl. Acad. Scí. USA 89: 8049-8052, 1992; e Cunha et al. , J.

Immunol. 150: 1908-1912, 1993). Até muito recentemente, no entanto, a falta de uma fonte fiável de MIF purificado continuou a impedir a investigação do perfil biológico exacto desta molécula.

Sumário da Invenção A presente invenção fornece a utilização de um agente antagonista de MIF (factor inibitório da migração de macrófago) seleccionado a partir do grupo que consiste de anticorpos monoclonais anti-MIF, moléculas de ARN de anti-sentido de MIF, e uma sua combinação para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção do cancro.

Numa forma de realização, o cancro é um tumor sólido.

Numa forma de realização preferida, o cancro é um linfoma de células B ou de células T.

Em certas formas de realização, o cancro é prevenido pelo tratamento de uma condição pré-maligna ou de um tumor benigno. 3

Em certas formas de realização, o cancro é seleccionado a partir do grupo que consiste do cancro do esófago, cancro do estômago, carcinoma renal, cancro da mama, cancro do cólon, cancro do pulmão, melanoma, cancro nasofaríngico, osteocarcinoma, cancro do ovário e cancro uterino.

Numa forma de realização, o agente antagonista de MIF é um anticorpo monoclonal anti-MIF ou um seu fragmento de ligação que se liga a um MIF humano. A presente invenção também fornece a utilização de um agente antagonista de MIF (factor inibitório da migração de macrófago) seleccionado a partir do grupo que consiste de anticorpos monoclonais anti-MIF, moléculas de ARN de anti-sentido de MIF, e uma sua combinação para a preparação de um medicamento para o tratamento da neovascularização de tumor.

Numa forma de realização, o agente é um anticorpo monoclonal anti-MIF ou um seu fragmento de ligação que se liga ao MIF humano.

Numa forma de realização preferida, o agente é um anticorpo que se liga especificamente ao factor inibitório da migração (MIF).

Numa outra forma de realização, o agente é uma molécula de anti-sentido (MIF) de factor inibitório da migração. A invenção é baseada na descoberta de que o MIF foi necessário para a proliferação de células T in vitro. A neutralização de anticorpos monoclonais (mAbs) contra o MIF inibiu directamente a proliferação de células T primárias induzidas por anti-CD3. Estes dados in vitro predizem que os antagonistas de MIF são terapeuticamente activos contra as populações de células de tumor que proliferam em geral e 4 contra os linfornas em particular. Além do mais, são apresentados dados in vivo num modelo vaticinador do crescimento do tumor que um antagonista de MIF, em particular um anticorpo de neutralização de MIF inibiu o crescimento da célula de tumor in vivo. Estas observações indicam um envolvimento inesperado de MIF no regulamento do ciclo da célula e no crescimento da célula in vivo a um nível referente ao organismo. Sem ser ligado pela teoria, no entanto, parece que a actividade terapêutica dos antagonistas de MIF actua por inibir a vascularização do tecido do tumor sólido, e é assim um tratamento universal de tumores sólidos baseados em inibir a nutrição ao tecido do tumor através do corte da inibição do fornecimento de sangue ao tecido de tumor em crescimento.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra a inibição do crescimento do linfoma inicial in vivo pelo tratamento com anticorpos monoclonais de neutralização Anti-MIF. A figura 1 mostra o peso médio do tumor estimado no dia 7 para grupos de controlo de isotipo e de anti-MIF tratado. As células de linfoma de célula B (células 38C13, fornecidas por J.D. Kemp, Dept. of Pathology, U. de IA) foram reunidas a partir da cultura de fase de crescimento exponencial (RPMI/10 % de FBS) , centrifugadas durante 10 minutos a 300 x g, lavadas duas vezes com PBS, e ajustadas a uma densidade de 1 x 105 células/mL. Um suspensão de 38C13 (5 x 104 células) foi injectada i.d. utilizando uma seringa de 1 mL adaptada com uma agulha de medida 27. Ao fim de 30 minutos, os ratos receberam 0,2 mL de uma injecção (0,3 mg) i.p. quer de um IgG, anticorpo de controlo de isotipo (Pharmingen; San Diego, CALIFÓRNIA) ou um anticorpo monoclonal de anti-MIF XIV. 15.5, XIV. 14.3 ou III. D. 9 (fornecido por C. Metz, Dept. Of Med. Biochemistry, The Picower Institute). As injecções de anticorpo foram repetidas a cada 48 horas durante 6 dias. O peso de tumor foi 5 estimado a partir de medições tomadas depois de 7 dias usando compassos de calibre de Vernier de acordo com a fórmula seguinte: peso de tumor (em gramas) = (largura, cm)2 x (comprimento, cm)/2 (de acordo com Taetle et al., Câncer Treatment Reports 71: 297-304, 1987). Os ratos foram eutanizados por asfixia com C02 e os tumores foram excisados e pesados. A figura 2 mostra a inibição do crescimento do linfoma inicial in vivo pelo tratamento com anticorpos monoclonais de neutralização de Anti-MIF. A figura mostra o peso húmido médio de massas de tumor dissecadas a parir dos grupos tratados de controlo e de anti-MIF (XIV.15.5). Os tumores foram colhidos dos animais, como descrito na Figura 1. A figura 3 mostra a inibição do crescimento do linfoma estabilizado in vivo pelo tratamento com anticorpos monoclonais de neutralização de Anti-MIF. Nestas experiências, o protocolo experimental descrito na Figura 1 foi seguido excepto o facto dos tumores terem sido deixados a crescer durante 96 horas a um tamanho médio de aproximadamente 0,01 cm3 antes do tratamento ter sido começado. Os ratos que carregam o tumor foram depois distribuídos em grupos cujos tumores apresentaram um tamanho de tumor médio semelhante. O tratamento dos ratos e a medição dos tumores foi conduzido de uma maneira como nas experiências de crescimento do linfoma inicial descrito na Figura 1. Os dados no tamanho de tumor são traçados a cada 48 horas desde o dia 0 (período da primeira injecção de anticorpo (XIV.15.5), 4 dias depois da injecção da célula 38C13) até ao dia 6. A figura 4 mostra a inibição da proliferação de células endoteliais humanas in vivo com anticorpos monoclonais de neutralização de anti-MIF. As células endoteliais microvasculares humanas de 6 proliferação (quarta passagem) (Clonetícs; San Diego, CALIFÓRNIA) (5 000/cavidade num prato de 96 cavidades) foram incubadas com 10-200 pg/mL de Controlo de IgGi (Sigma; St. Louis, MO) ou anticorpo monoclonal de neutralização de anti-MIF XIV.15.5 em Meio de Crescimento de Célula Endotelial que contém 1 % de soro fetal de bovino (ECG-1) durante três horas. A actividade proliferativa destas culturas foi medida pela incorporação de [3H]timidina (4, pCi/mL) no ADN como medido pela contagem de cintilação líquida. A figura 5 mostra a inibição da proliferação de células endoteliais humanas in vivo com os oligonucleótidos de anti-sentido de MIF. As células endoteliais microvasculares humanas de proliferação (quarta passagem; Clonetícs), culturadas em ECG-1 (5 000/cavidade num prato de 96 cavidades), foram transfectadas com oligonucleótidos de fosforotionato (10 pg/mL; Oligo's etc.; Wilsonville, OR) usando o reagente Lipofectin através do protocolo de fabricação (Gibco; Gaithersburg, MD); S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3 1 (MIF humano, de sentido; SEQ ID NO: 1); e AS-MIF: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (MIF humano de anti-sentido; SEQ ID NO: 2). Depois de 16 horas, a actividade proliferativa destas culturas foi medida ao longo das oito horas subsequentes pela incorporação de [3H]timidina (4 pCi/mL) no ADN como medido pela contagem de cintilação líquida. A figura 6 mostra a inibição da proliferação das células da leucemia mielógena com os oligonucleótidos de antisentido de MIF. As culturas da célula da leucemia mielógena crónica de fase de proliferação de log K-562 (5 000 células/cavidade em pratos de 96 cavidades; obtidas a partir de ATCC; Rockvílle, MD) foram transfectadas com os oligonucleótidos de fosforotionato seguinte (10 pg/mL; Oligo's etc.) usando o reagente Lipofectin pelo protocolo de fabricação (Gibco): S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3' (MIF humano, de sentido; SEQ ID NO: 1); e AS-MIF: 5'-ATG-AAC- 7 ATC-GGC-ATG-ATG-GC-31 (MIF humano, de anti-sentido; SEQ. ID NO: 2). Depois de 16 horas de incubação em condições de cultura de célula padrão (37 °C, 5 % de C02 em atmosfera de ar humedecida) a actividade proliferativa destas culturas foi medida ao longo das oito horas subsequentes pela incorporação de [3H]timidina (4 pCi/mL; DuPont) em ADN como medido por contagem de cintilação líquida. A figura 7 mostra a inibição da vascularização do tumor por tratamento com anticorpos de anti-MIF in vivo. Uma comparação do número médio de perfis capilares positivos de CD3 por campo de poder elevado (4Q0X) em secções de tumores imuno-histoquimicamente manchadas colhidas a partir de animais tratados com mAb de anti-MIF contra os tratados com Ab de controlo foi feita. Os resultados demonstram que os tumores que cresceram em animais tratados com anticorpos de anti-MIF, além de ser mais pequenos do que os que ocorrem em animais tratados com anticorpos de controlo, foram significativamente menos vascularizados numa base de volume por unidade. A figura 8 mostra uma experiência in vitro que mostra um anticorpo monoclonal de anti-MIF que inibe a proliferação das células dos fibroblastos NIH3T3.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção fornece a utilização de um agente antagonista de MIF (factor inibitório de migração de macrófago) seleccionado a partir do grupo que consiste de anticorpos monoclonais de anti-MIF, moléculas de ARN de anti-sentido de MIF e uma sua combinação para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de perturbações relacionadas com o tumor. Numa forma de realização, o 8 tumor é um tumor sólido, e de um modo mais preferido, um linfoma de célula B ou de célula T.

As composições da presente invenção podem ser utilizadas para tratar condições pré-malignas, tais como tumores no início, perturbações hiperproliferativas e o início de perturbações disproliferativas. As perturbações e as doenças a serem tratadas pelas composições da presente invenção também incluem mas não são limitadas a, linfomas de células B e T, cancro da pele, tumores cerebrais, cancro dos ossos, cancro do esófago, cancro do estômago, carcinoma renal, cancro da bexiga, cancro da mama, cancro do cólon, cancro do pulmão, melanoma, cancro nasofaríngico, osteocarcinoma, cancro do ovário e cancro uterino.

Numa forma de realização da presente invenção, o agente antagonista é um anticorpo monoclonal de anti-MIF ou um seu fragmento de ligação que se liga a um MIF humano. Numa forma de realização preferida, o anticorpo contém um domínio de ligação que se liga imunospecificamente ao MIF. A neutralização ou a inibição de MIF de acordo com a invenção podem ser acompanhadas de um número de formas, as quais podem incluir, mas não são limitadas à utilização de factores que se ligam ao MIF e neutralizam a sua actividade biológica; a utilização de antagonistas de receptor de MIF; a utilização de factores que inibem a actividade enzimãtica de MIF; a utilização de compostos que inibem a libertação de MIF de fontes celulares no corpo; e a utilização de sequências de nucleótidos derivadas da codificação de MIF, não codificação, e/ou sequências reguladoras para prevenir ou reduzir a expressão de MIF. Algum dos precedentes pode ser utilizado individualmente ou em combinação para inibir a actividade de MIF no tratamento de condições relacionadas com a 9 sobreproliferação celular, e além disso podem ser combinados com qualquer outra terapia de anti-tumor, tal como a terapia farmacológica, cirúrgica, de citoquina, de esteróides ou de gene, ou qualquer uma sua combinação. A invenção é baseada, em parte, na hipótese de que o MIF desempenha um papel no regulamento da proliferação celular, e que por especificamente neutralizar a actividade de MIF, a inibição da proliferação celular resultaria. Este modelo é apoiado pelos exemplos. 0 MIF é necessário para a proliferação das células T in vitro. Os anticorpos monoclonais de neutralização (mAbs) contra o MIF inibiram directamente a proliferação das células T primárias activadas pelo anti-CD3, como medido pela incorporação de [3H]timidina. Estes resultados indicam que o MIF funciona para regular o sistema imune através de uma activação das células T. A administração de anticorpos monoclonais de neutralização contra o MIF inibiu o crescimento de tumores num modelo de murino com linfoma de célula B. Além do mais, os agentes de anti-MIF (anticorpos monoclonais e moléculas de anti-sentido) inibiram os processos dependentes do hospedeiro necessários para o estabelecimento do tumor, tal como, o estabelecimento da neovascularização do tumor. Estes resultados predizem que a neutralização da produção, libertação ou actividade de MIF tem actividade terapêutica anti-tumor significativa, em particular para os tumores sólidos que necessitam de vascularização para apoiar o crescimento. Os factores de neutralização de MIF incluem anticorpos de anti-MIF, fragmentos de anticorpo, receptores de MIF, e fragmentos de receptor de MIF. Vários procedimentos conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos a epítopos de MIF recombinantemente produzido ou naturalmente purificado. Os anticorpos de 10 neutralização, tais como aqueles que inibem as actividades biológicas de MIF que competem para ou estericamente obstruem os epítopos de MIF envolvidos na ligação de receptores celulares é especialmente preferida para o diagnóstico e a terapêutica. Tais anticorpos incluem mas não são limitados a uma cadeia singular, policlonal, monoclonal, quimérica, e fragmentos produzidos por um banco de expressão de Fab.

Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injecção de MIF e/ou uma porção de MIF. Tais animais hospedeiros podem incluir mas não são limitados a coelhos, ratos, e murganhos, para nomear apenas alguns. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo mas não estando limitado a Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias de superfície activa tais como a lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões de óleo, hemocianina retirada às lapas, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como o BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Os anticorpos monoclonais para o MIF podem ser preparados por se utilizar qualquer técnica que provê a produção de moléculas de anticorpo por linhas de células contínuas em cultura. Estes incluem mas não são limitados à técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein, (Nature, 256: 495-497, 1975), a técnica do hibridoma da célula B humana (Kosbor et al., Immunology Today, 4: 72, 1983; e Cote et al., Proc. Nail. Acad. Sei. USA, 80: 2026-2030, 1983) e a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96, 1985) . Além do mais, as técnicas de desenvolvimento para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 11 USA, 81: 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature, 312: 604-608, 1984; e Takeda et al., Nature, 314: 452-454, 1985) por se entrançarem os genes de uma molécula de anticorpo de rato de especificidade de antigénio apropriada em conjunto com os genes de uma molécula de anticorpo humana de actividade biológica apropriada podem ser utilizadas. Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia singular (patente norte americana No. 4 946 778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia singular específicos para o MIF. A técnica do hibridoma tem sido utilizada para gerar anticorpos monoclonais anti-MIF. Os hibridomas que segregam os anticorpos monoclonais de IgG dirigidos tanto contra as formas humanas como de murinos de MIF foram isolados e caracterizados pela sua capacidade para neutralizar a actividade biológica de MIF. Os anticorpos monoclonais anti-MIF foram mostrados como inibindo a estimulação da morte de macrófagos de parasitas intracelulares. Os anticorpos monoclonais anti-MIF também foram utilizados para desenvolver um ensaio de filtração de ELISA sensível e específico de MIF. Tanto os anticorpos monoclonais anti-MIF como o ensaio de ELISA podem ser usados no diagnóstico e/ou no tratamento de respostas e choques inflamatórios.

Os fragmentos de anticorpo que reconhecem os epítopos de MIF específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem mas não são limitados a : os fragmentos de F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão de pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos de Fab que podem ser gerados por se reduzirem as pontes de dissulfeto dos fragmentos de F(ab')2. Alternativamente, os bancos de expressão de Fab podem ser construídos (Huse et al., Science, 246: 1275-1281, 1989) para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada de MIF.

Os anticorpos monoclonais que segregam os hibridomas de (MAbs) dirigidos contra as formas humanas e de murino de MIF foram feitos e isolados de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Resumidamente, os ratos fêmea BALB/c foram imunizados intraperitonealmente (i.p). com MIF humano ou de murino recombinante (10 pg/rato) em Ribi Adjuvante (Ribi Immunochem.). Durante o período de imunização e de auxílio, os ratos foram sangrados pela cauda e a titulação com anticorpo anti-MIF de soro, bem como a distribuição isotipo (igM contra IgG), foram ensaiados através de métodos de ensaio de imunoabsorvência ligados por enzima directamente baseada em pratos de microtitulação (ELISA) em cavidades com MIF recombinante imobilizado (250 ng/mL; 55 pL/cavidade) como antigénio. Aos ratos imunizados foram dadas injecções de intensificador de MIF recombinante (10 pg/rato) em Ribi Adjuvante pelo menos quatro vezes antes dos baços terem sido retirados para a fusão. Três dias antes de fusão das células do baço com células de mieloma de rato (P3X63Ag8.653; American Type Culture Collection) utilizando polietileno glicol (Boerhinger Mannheim), os ratos foram ajudados por i.p. tanto com MIF humano como de murino (10 pg em PBS). Os hibridomas foram expandidos sob meio de selecção de HAT (hipoxantina, aminopterina, e timidina; GIBCO) (DMEM que contém HAT, 10 % de Condimed (Boerhinger

Mannheim), 20 % de FBS (Hyclone), e antibióticos (penicilina, estreptomicina; GIBCO) durante duas a três semanas. Os sobrenadantes de cultura para hibridomas de crescimento foram filtrados para anticorpos anti-MIF através de métodos de ELISA directos com MIF recombinante imobilizado. A imunoreactividade de anticorpos de clones positivos anti-MIF foram além disso analisados por técnicas de imuno-mancheamento de 13

Western, e a titulação elevada que produz hibridomas foi escolhida para a reclonagem pela diluição restritiva. Os monoclonais anti-MIF foram isotipados por se utilizar ELISA Screentype (Boehinger Mannheim). Os anticorpos monoclonais desejados para segregar os hibridomas (tipo IgG) foram cultivados como ascites em ratos BALB/c, e os MAb's foram purificados usando cromatografia de gel T (Pierce). Vários anticorpos monoclonais anti-MIF de tipo IgM foram identificados mas não caracterizados adicionalmente. Vários hibridomas que segregam o IgG foram isolados e caracterizados (Tabela 1).

Tabela 1

MIF humano MIF de murino Subtipo de IgG VIIG3 - + IgG2b IXD11 - + IgG2a XB2 - + IgG3 XID5 - + IgG2b XIG2 - 4· IgG3 VD8 - + IgG2b IID9 + IgGl IIID9 + IgGl XIF7 + + IgG2b 131 + + IgGl IV2.2 + + IgGl XI7 + + n.d. XII15.6 + + IgGl XIV15.4 + + IgGl Os anticorpos monoclonais anti-MIF purificados foram testados para a actividade de neutralização num ensaio de morte de macrófago. Os macrófagos peritoneais de rato eliciados por tioglicolato foram obtidos a partir de ratos BALB/c , deixados a aderir durante 4 horas, e depois infectados com o parasita intracelular de Leishmania maior a uma proporção de parasita : macrófago de 8:1. Depois da lavagem, as culturas de macrófago infectadas foram 14 tratadas com MIF humano recombinante (o qual aumenta a morte de macrófagos de parasitas intracelulares numa forma dependente da dose quando comparados com controlos de meio de cultura) com ou sem anticorpos de anti-MIF monoclonais VIIG3 ou XID5 adicionados (25 pg/ml), Ambos os anticorpos foram verificados como neutralizando a morte aumentada de MIF por L. maior até 50 %.

Em experiências separados, os anticorpos de anti-MIF monoclonais purificados foram testados para a actividade de neutralização de MIF num ensaio de incorporação de [3H] -timidina com células T de murino primárias culturadas em pratos de cultura de tecido revestido por IgG de anti-CD3 (Pharmingen). Resumidamente, este ensaio empregou células de baço BALB/c que foram isoladas usando colunas de enriquecimento de células T de murino (R e D) e cultivadas em pratos de micro titulação de 96 cavidades revestidos com IgG de anti-CD3 em RPMI que contêm 10 % de FBS, antibióticos (penicilina, estreptomicina) e L-glutamina em conjunto com o anti-MIF ou os anticorpos monoclonais de rato de controlo. Depois de 48 horas, as células T foram pulsadas com [3H]-timidina durante 16 a 18 horas, colhidas e contadas por métodos de contagem de beta cintilação. Como um controlo positivo, os anticorpos monoclonais de anti-IL-2 (Genzyme) foram adicionados para inibir a proliferação e a incorporação associada à [3H]-timidina. Tanto os anticorpos VIIG3 como os XID5 reduziram a incorporação de timidina em cerca de 20 %; o tratamento com anti-IL-2 reduziu a incorporação de [3H]-timidina em cerca de 75 %.

Uma técnica de ELISA "sanduíche" específica de MIF foi desenvolvida, baseada na ancoragem de MIF pelo anticorpo VIIG3 imobilizado seguida pela detecção com um antisoro anti-MIF policlonal de coelho. Este ensaio foi executado como se segue: cavidades de prato de ELISA de Immulon II (Dynatech) foi revestidos 15 com 10-15 pg/mL de MAb (VIIG3) em PBS (65 pL/cavidade); o MAb tinha sido purificado a partir de ascites utilizando um absorvente de gel T (Pierce). Os pratos foram selados e incubados durante a noite à temperatura ambiente. As cavidades foram depois bloqueadas com Superblock (Pierce) que contém 2 % de soro de cabra (140150 pL/cavidade) durante 1-2 horas à temperatura ambiente. Os pratos foram lavados usando um lavador de prato de ELISA automatizado (duas vezes com TBS que contém 0,05 % de Tween 20 utilizando 200 pL/cavidade). As amostras de MIF e os padrões foram preparados em tubos de micro-centrifugação de 0,5 mL ou de 1,5 mL por se adicionar Tween 20 aos sobrenadantes de cultura a uma concentração final de 0,2 %. Os lisados de célula foram da mesma forma diluídos em tampão de TBS com Tween 20 a uma concentração final de 0,2 %. Os padrões foram preparados da mesma forma por se diluir o MIF humano ou de murino recombinante purificado em DMEM/1 % de FBS/0,2 % de Tween 20. As amostras e os padrões foram aplicados ao prato (60 pL/cavidade) e o prato selado e incubado durante a noite a 4 °C com agitação suave. O prato foi lavado cinco vezes com o TBS/0,05 % de Tween 20, e o segundo anticorpo (por exemplo, o soro de MIF anti-murino de Coelho 102, 1:220 em TBS/0,2 % de Tween 20/2 % de soro de cabra) adicionado a 60 pL/cavidade. O prato foi selado e incubado 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. Todas as cavidades foram depois lavadas cinco vezes com o TBS/0,05 % de Tween 20 e a enzima de anticorpo terciária conjugada (fosfatase alcalina de IgG de anti-coelho de cabra comercialmente disponível, diluída 1:4000 em TBS/0,2 % Tween 20/2 % de soro de cabra como recomendado pelo fabricante, Boehringer Mannheim) foi adicionada em 60 pL/cavidade. O prato foi revestido, incubado durante 35 minutos à temperatura ambiente, e depois lavado 5 vezes com o o TBS/0,05 % de Tween 20. 0 ensaio foi desenvolvido com solução de fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) como recomendado pelo fabricante (5 mg de comprimido 104 de Sigma em 5 mL de tampão AP: 10 mM de 16 dietanolamina/O,5 mM de MgCl2/ pH 9,5). 0 produto de reacção foi deixado a desenvolver-se às escuras à temperatura ambiente, e lido a 405 nm no prazo de 15-30 minutos. Este ensaio dá a variação de sensibilidade de cerca de 100 pg/mL - 250 ng/mL. Deve ser observado que para a prática desta técnica de "sanduíche", várias combinações de dois ou mais anticorpos específicos de MIF podem ser usadas para capturar e detectar o MIF numa amostra. 0 anticorpo imobilizado não é restringido ao anticorpo VIIG3, e o segundo anticorpo não é limitado a um antisoro de coelho. A presente invenção fornece a utilização de um anticorpo monoclonal de anti-MIF para a preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção do cancro.

As malignidades que podem ser tratadas por anticorpos monoclonais de anti-MIF incluem mas não são limitadas às enumeradas na Tabela 2.

Tabela 2

MALIGNIDADES E PERTURBAÇÕES RELACIONADAS

Leucemia

Leucemia aguda

Leucemia Linfocítica Aguda Leucemia Mielocítica Aguda Mieloblástica Promieloblástica Mielomonocítica Monocítíca Eritroleucemia Leucemia Crónica

Leucemia Mielocítica Crónica Leucemia Linfocítica Crónica 17

Linfoma

Doença de Hodgkíns Doença de Não Hodgkíns Mieloraa Múltiplo Tumores sólidos

Sarcomas e Carcinomas Fibrosarcoma Mxicosarcoma Liposarcoma Condrosarcoma Sarcoma Osteogénico Osteosarcoma Cordoma Angiosarcoma Endoteliosarcoma Tumor de Ewing Carcinoma do Cólon Carcinoma Colorectal Cancro Pancreãtico Cancro da Mama Cancro do Ovário Cancro da Próstata Carcinoma de Células Escamosas Adenocarcínoma

Carcinoma da Glândula Sudorípara

Carcinoma da Glândula Sebácea

Carcinoma Papílar

Tumor de Wilm

Cancro Cervical

Carcinoma do pulmão

Carcinoma do pulmão de célula pequena 18

Carcinoma Epitelial Melanoma Neuroblastoma Angiomas

Retinopatia Diabética

De um modo preferido, os linfornas de célula B e T são tratados ou prevenidos. Em outras formas de realização específicas, a malignidade ou as modificações disproliferativas ou as perturbações hiperproliferativas são tratadas ou prevenidas na cabeça, pescoço, cervical, rim, estômago, pele, ovário, bexiga, peito, cólon, pulmão ou útero. Em outras formas de realização específicas, o sarcoma, ou a leucemia são tratados ou prevenidos. Em outras formas de realização particulares, o osteosarcoma ou o carcinoma de célula renal é tratado ou prevenido.

Os anticorpos monoclonais de MIF da presente invenção também podem ser administrados para tratar condições pré-malignas e para prevenir a progressão a um estado maligno ou neoplásico, incluindo mas não limitados às perturbações enumeradas na Tabela 2. Tal utilização profilática ou terapêutica é indicada em condições conhecidas ou suspeitas de precederem progressão da neoplasia ou do cancro, em particular, onde o crescimento de células não neoplásicas que consiste de hiperplasia, ou displasia tenha ocorrido. A hiperplasia é uma forma de proliferação de células controlada que envolve um aumento no número de células num tecido ou órgão, sem alteração significativa em estrutura ou função. A displasia é frequentemente um precursor do cancro, e é encontrado principalmente nos epitélios; ê a forma mais desordenada de crescimento de células não neoplásicas, que envolve uma perda na 19 uniformidade da célula individual e na orientação arquitetónica de células. A displasia caracteristicamente ocorre onde existe irritação crónica ou inflamação e muitas vezes é encontrada na cervical, nas passagens respiratórias, na cavidade oral, e na vesícula biliar.

Alternativamente ou em adição à presença de crescimento de células anormais caracterizadas como hiperplasia ou displasia, a presença de uma ou várias características ou de um fenotipo transformado, ou de um fenotipo maligno, apresentado in vivo ou apresentado in vitro por uma amostra de célula de um paciente, pode indicar o desejo de administração profilática/terapêutica de anticorpos monoclonais de anti-MIF. As características de um fenotipo transformado incluem modificações de morfologia, anexação de substrato mais livre, perda de inibição de contacto, perda de dependência de ancoragem, libertação de protease, transporte de açúcar aumentado, necessidade de soro reduzida, expressão de antigénios fetais, desaparecimento da proteína de superfície de célula de 250 000 dalton.

Numa forma de realização específica, a leucoplasia, uma lesão displásica ou hiperplásica que parece benigna de epitélio, ou a doença de Bowen, um carcinoma in situ, são lesões pré-neoplásicas indicativas do desejo de intervenção profilática.

Formulações Farmacêuticas

Um composto terapêutico, tal como um anticorpo monoclonal terapêutico, pode ser administrado a um paciente humano por si mesmo ou em composições farmacêuticas onde é misturado com portadores ou excipientes convenientes em doses para tratar ou melhorar várias condições que envolvem o excesso de proliferação celular. Uma dose terapeutieamente eficaz adicional refere-se 20 àquela quantidade do composto suficiente para inibir o crescimento do tumor. As doses terapeuticamente eficazes podem ser administradas sozinhas ou como terapia secundária em combinação com outros tratamentos para o crescimento de tumores ou de doenças associadas. As técnicas da formulação e a administração dos compostos de aplicação imediata podem ser encontradas em Ciências Farmacêuticas de "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, última adição.

As vias de administração convenientes, por exemplo, podem incluir a administração oral, rectal, transmucosal, ou intestinal; libertação parentérica, incluindo injecções intramusculares, subcutâneas, intramedulares, bem como injecções intratecais, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneais, intranasais, ou intraoculares, e opcionalmente numa formulação de acção retardada ou de libertação prolongada.

Além disso, cada um pode administrar o agente da presente invenção num sistema de libertação de fármaco alvo, por exemplo num lipossoma revestido com um anticorpo de anti-CD4 para atingir os linfornas de célula T. Os lipossomas serão atingidos e tomados selectivamente por células que expressam CD4.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas de uma maneira tal que é ela própria conhecida, tal como, por meio de processos de mistura convencional, dissolução, fabricação de drageias, levitação, emulsificação, encapsulação, captura, ou liofilização. As composições farmacêuticas para utilização de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de maneira convencional por se utilizar um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis que compreendem excipientes e auxiliares os quais facilitam o processamento dos compostos activos em preparações as quais podem ser utilizadas farmaceuticamente. A 21 formulação adequada está dependente da via de administração escolhida.

Para a injecção, os agentes da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, de um modo preferido em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como a solução de Hank, a solução de Ringer, ou o tampão de soro fisiológico . Para a administração transmucosal, os penetrantes apropriados à barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são conhecidos na técnica. Para a administração oral, os compostos podem ser formulados rapidamente através da combinação dos compostos activos com portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tais portadores permitem aos compostos da invenção serem formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e semelhantes, para a ingestão oral por um paciente a ser tratado. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas de excipiente sólido, opcionalmente moendo uma mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, depois de se adicionarem auxiliares convenientes, se desejado, para se obterem comprimidos ou núcleos de drageias. Os excipientes convenientes são, em particular, enchedores tais como açúcares, incluindo a lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; as preparações de celulose tais como, por exemplo, o amido de milho, o amido de trigo, o amido de arroz, o amido de batata, gelatina, a goma tragacante, a celulose de metilo, a hidroxipropilmetilcelulose, a carboximetilcelulose de sódio, e/ou a polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, os agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como a pirrolidona de polivinilo ligada transversalmente, ágar, ou o ácido algínico ou um seu sal tal como o alginato de sódio.

Os núcleos de drageias são fornecidos com revestimentos 22 convenientes. Para esta finalidade, as soluções de açúcar concentradas podem ser usadas, as quais podem opcionalmente conter goma arábica, talco, pirrolidona de polivinilo, gel de carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos convenientes ou misturas de solventes. Os corantes ou os pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drageias para identificação ou para caracterizar combinações diferentes de doses de composto activo.

As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de pressão feitas de gelatina, bem como cápsulas suaves, seladas feitas da gelatina e de um plasticizante, tal como o glicerol ou o sorbitol. As cápsulas de pressão podem conter os ingredientes activos em mistura com o enchedor tal como a lactose, ligantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspendidos em líquidos convenientes, tais como óleos gordos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além do mais, podem ser adicionados estabilizadores. Todas as formulações para a administração oral devem estar em dosagens convenientes para tal administração.

Para a administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou losangos formulados de maneira convencional.

Para a administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com a presente invenção são convenientemente libertados na forma de uma apresentação de pulverização de aerossol de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com a utilização de um propulsor conveniente, tal como, o diclorodifluorometano, o triclorofluorometano, o diclorotetrafluoroetano, o dióxido de 23 carbono ou outros gases convenientes. Em caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para libertar uma quantidade medida. As cápsulas e os cartuchos da gelatina para utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó conveniente tal como a lactose ou o amido.

Os compostos podem ser formulados para administração parentérica por injecção, tal como, por injecção de bolo ou infusão contínua. As formulações para injecção podem ser apresentadas na forma de dosagem única, em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas, com um conservante adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

As formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos na forma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas como suspensões de injecção oleosa apropriada. Os solventes ou os veículos lipofílicos convenientes incluem óleos gordos tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácido gordo sintético, tais como oleato de etilo ou triglicêridos, ou lipossomas. As suspensões de injecção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como celulose de carboximetilo de sódio, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes convenientes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Os compostos também podem ser formulados em composições rectais tais como supositórios ou irrigadores de retenção, que contêm bases 24 para supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de acção prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos convenientes (por exemplo como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de troca de iões, ou como derivados solúveis de forma reduzida, por exemplo, como um sal solúvel de forma reduzida.

Os lipossomas e as emulsões são exemplos conhecidos de veículos ou portadores de libertação de fármacos hidrofóbicos. Certos solventes orgânicos tais como o dimetilsulfóxido também podem ser empregues, embora normalmente à custa de maior toxicidade. Adicionalmente, os compostos podem ser libertados por se utilizar um sistema de libertação sustentada, tais como matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o agente terapêutico. Vários dos materiais de libertação sustentada foram estabelecidos e são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. As cápsulas de libertação sustentada, dependendo da sua natureza química, podem libertar os compostos durante algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, as estratégias adicionais para a estabilização da proteína podem ser empregues.

As composições farmacêuticas também podem compreender portadores ou excipientes de fase sólida ou de gel convenientes. Os exemplos de tais portadores ou excipientes incluem mas não são limitados a carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, 25 derivados de celulose, gelatina, e polímeros tais como o polietileno glicol.

Muitos dos compostos da invenção identificados como neutralizadores da actividade de MIF podem ser fornecidos como sais com contraiões farmaceuticamente compatíveis. Os sais farmaceutícamente compatíveis podem ser formados com muitos ácidos, incluindo mas não limitados ao clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc.; ou bases. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros protónicos que são as formas de base livre correspondentes. Os exemplos de sais, portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, são bem conhecidos dos especialistas na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, A.R. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990. Tais sais incluem, mas não são limitados a, sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cloridrato, hidroiodeto, bromidrato, acetato, citrato, tartarato e malato, e os semelhantes.

Dose

Uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade eficaz para prevenir ou inibir o desenvolvimento ou a progressão de cancro ou de doença hiperproliferativa no sujeito a ser tratado. A determinação das quantidades eficazes está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui fornecida. Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de célula. Tal informação pode ser usada para determinar mais exactamente as doses úteis em seres humanos. 26

Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade do composto que resulta em uma redução do desenvolvimento do cancro, de um tumor, ou de uma doença hiperproliferativa, ou dos seus sintomas ou que possa prolongar a sobrevivência a um paciente. A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos, farmacológicos, e toxicológicos padrão em culturas de célula ou em animais experimentais, para determinar o LDSo (a dose letal a 50 % da população) e o ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população). A proporção da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a proporção entre ED50 e ED50. Os compostos que apresentam elevados índices terapêuticos são preferidos. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de célula ou estudos dos animais podem ser usados na formulação de uma variedade da dosagem para utilização em seres humanos. A dosagem de tais compostos está de um modo preferido dentro de uma variedade de concentrações de circulação que incluem o ED50 com muito pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta variedade dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada, A formulação exacta, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico do indivíduo em vista da condição do paciente. A quantidade de dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis de plasma da fracção activa que são suficientes para manter os efeitos de modulação desejados, ou de concentração eficaz mínima (MEC). O MEC vai variar para cada composto mas pode ser estimado a partir de dados in vitro; a concentração necessária para se conseguir uma inibição de célula de 50-90 %, ou o crescimento de tumor utilizando os ensaios aqui descritos. As dosagens necessárias para se conseguir o MEC vão depender das características individuais e da via da administração. 27

No entanto, os ensaios de HPLC, os bioensaios ou os imunoensaios podem ser usados para determinar as concentrações de plasma.

Os intervalos de dosagem também podem ser determinados usando o valor de MEC. Os compostos devem ser administrados usando um regime que mantém os níveis de plasma acima do MEC de 10-90 % do tempo, de um modo preferido entre 30-90 % e de um modo mais preferido entre 50-90 %. Em casos de administração local, por exemplo, a introdução directa num tumor, ou o consumo selectivo, a concentração local eficaz do fármaco não pode estar relacionada à concentração de plasma. A quantidade de composição administrada vai ser dependente do sujeito a ser tratado, do peso do sujeito, da gravidade da aflição, da forma de administração e do julgamento do médico que prescreve.

Exemplo 1

Este exemplo ilustra o tratamento de ratos que carregam tumor com anticorpos monoclonais de anti-MIF. Para estas experiências, o tratamento de ratos C3H-HeN com vários mAbs de anti-MIF foi começado no mesmo dia da implantação do tumor. Este procedimento examina o potencial dos mAbs de anti-MIF para inibir o crescimento do tumor inicial e é considerado como sendo um modelo preditivo para as metástases e os agentes terapêuticos para tratar o cancro metastático. Vários mAbs de anti-MIF podem ser examinados para a eficácia de anti-tumor neste modelo. 0 modelo de linfoma de célula 38C13B é um modelo de tumor sólido bem estabelecido que foi usado para avaliar novas terapêuticas contra o cancro desde a sua descrição inicial em 1977 (Kemp et ai., Câncer Research 55: 3817-3824, 1995). O modelo foi realizado por se injectarem células de linfoma B de murino intra-dermicamente (i.d). na estirpe de ratos dos quais eles foram inicialmente derivados (C3H-HeN). Ao fim de 10 28 dias, estes ratos desenvolveram um linfoma sólido o qual é facilmente mensurável.

Usando ensaios de incorporação de 3H-timidina, testámos os efeitos do tratamento de anti-MIF em células 38C13 in vitro. Nem o tratamento de anticorpo de anti-MIF (com III.D.9 ou XIV.15.5 de mAb) nem o tratamento com o oligonucleótido de antisentido anti-MIF (usando os oligonucleótidos de antisentido descritos infra) suprimiram significativamente a proliferação de célula 38C13 in vitro. Estes dados predizem que tais métodos terapêuticos de anti-MIF e os agentes não foram directamente anti-proliferativos para este tipo de célula de tumor.

Os ratos C3H-HeN foram anestesiados e depois estreitamente cortados no flanco superior. 50 000 células 38C13 de fase de log (em 0,05 mL de PBS) foram injectadas i.d. com uma seringa de 1 mL e uma agulha de 27 g. Ao fim de 30 minutos, os animais receberam o tratamento através de injecção IP de 500 pg de mAbs de anti-MIF ou de mAbs de isotipo de controlo. As injecções de mAb foram repetidas a cada 48 horas durante 4 dias. Os animais foram controlamos diariamente para o crescimento de tumor utilizando o compasso de calibre de Vernier. Os animais foram eutanizados utilizando asfixia por C02, os tumores são isolados, pesados, e analisados por histologia.

Devido à variabilidade do crescimento do tumor dentro de grupos (dependente do local exacto da injecção, do volume da injecção) e prover para se obter a avaliação estatística de resultados, cada grupo experimental compreendeu cinco animais e a experiência foi conduzida três vezes. Em adição aos grupos experimentais: (isto é, anti-MIF-Ab tratados) os grupos de controlo foram estudados, por exemplo um grupo tratado com um anticorpo de controlo de isótopo de anticorpo dirigido contra um antígénio irrelevante, e um grupo 29 tratado cora o veículo sozinho. Os resultados são mostrados nas Figuras 1 e 2, demonstrando que a interferência com a actívidade biológica de MIF, neste caso por tratamento com um anticorpo monoclonal inibiu o desenvolvimento do tumor sólido, neste caso um linfoma de célula B em animais normais de outra forma.

Exemplo 2

Este exemplo ilustra que a terapia antagonista de MIF é eficaz contra tumores estabelecidos num modelo in vivo preditivo. Os ratos inoculados com células de tumor foram tratados depois de se deixar um período de tempo para que os tumores se tornassem estabelecidos. Nestas experiências, o mesmo número de células de tumor foi injectado da mesma maneira como a descrita no exemplo 1, excepto o facto dos tumores sólidos terem sido deixados a desenvolver-se e a crescer durante 6 dias para um diâmetro médio de cerca de 6 mm. Depois de 6 dias, o tratamento dos animais e as medições dos tumores seguiram então o mesmo esquema como o de cima. Este procedimento acentua a actívidade terapêutica de mAbs de anti-MIF em tumores estabelecidos.

Os ratos C3H-HeN foram anestesiados e depois estreitamente cortados no flanco superior. 50 000 células 38C13 de fase de log (em 0,05 mL de PBS) foram injectadas i.d. com uma seringa de 1 mL e uma agulha de 27 g. Os animais foram controlados diariamente para o crescimento do tumor por medições tomadas com os compassos de calibre de Vernier. No 6o dia da experiência, os grupos de animais receberam o tratamento por injecção de IP de 500 pg de mAbs de isotipo, mAbs de anti-MIF, ou PBS sozinho. As injecções foram repetidas a cada 48 horas durante 4 dias. Os animais foram controlados diariamente e o crescimento do tumor foi estimado a partir de medições tomadas com o compasso de calibre Vernier. Os 30 animais são eutanizados por se utilizar asfixia com C02, os tumores foram isolados, pesados, e analisados por histologia.

Devido à variabilidade no tamanho de tumor inicial (dependente do local exacto da injecção, do volume da injecção e de outros factores) e para fornecer dados para avaliação estatística, cada grupo experimental e de controlo numerou 5 animais. Como mostrado na Figura 3 os tumores estabelecidos cresceram mais lentamente em animais tratados com anti-MIF do que em animais tratados com o anticorpo de controlo. 0 procedimento acima mencionado para avaliar os efeitos de anti-tumor da terapia visada contra o MIF foi repetido sob um esquema de dosagem diferente, pelo qual os animais que carregam tumores sujeitos foram tratados com 0,5 mg de anticorpos de anti-MIF ou anticorpos de controlo duas vezes por dia e não um dia sim um dia não, começando no Dia 6 depois do enxerto da célula de tumor. O peso de tumor médio estimado não se diferenciou entre os grupos no Dia 6, como medido justamente antes da primeira injecção de anticorpo (45,6 ± 4,6 mg para o grupo de controlo de isotipo contra 46,1 + 3,4 mg para o grupo agendado para receber o mAb XIV. 15.5 anti-MIF; médio ± desvio padrão). No Dia 7, no entanto, os tumores no grupo tratado por controlo tinham crescido significativamente mais do que os tumores do grupo tratado por anticorpo de anti-MIF (246,7 + 41,4 contra 97,2 ± 12,2, respectivamente). Estes dados apoiam a conclusão de que os métodos e os agentes dirigidos â inibição de MIF, e mais em particular o tratamento com anticorpos de anti-MIF, são eficazes para inibir o crescimento de tumores estabelecidos in vivo.

Exemplo 3

Este exemplo ilustra que os antagonistas de MIF inibem o 31 crescimento de tumor através da inibição da vascularização do tumor. As células endoteliais microvasculares humanas de proliferação (quarta passagem) (Clonetics; San Diego, CA) 5 000/cavidade num prato de 96 cavidades) foram incubadas com 10-200 pg/mL de controlo de IgGi, (Sigma; St. Louis, MO) ou anticorpo monoclonal XIV.15.5 de neutralização de anti-MIF (cortesia do Dr. C. Metz, Departamento de Bioquímica Médica, The Picower Institute For Medicai Research; Manhasset, NY) em Meio de Crescimento de Célula Endotelial que contêm 1 % de soro fetal de bovino (ECG-1; Clonetics) durante três horas. A actividade proliferativa destas culturas foi medida ao longo das 16 horas subsequentes pela incorporação de [3H] timidina (4 pCi/mL) (DuPont; Boston, MA) em ADN como medido por contagem de cintilação líquida (Figura 3) . As células endoteliais microvasculares humanas de proliferação (quarta passagem; Clonetics), culturadas em ECG-1 (5 000/cavidade em pratos de 96 cavidades), foram transfectadas com os oligonucleótidos de fosforotionato seguintes (10 pg/mL; Oligo etc.; Wilsonville, OR) usando o reagente de Lipofectin pelo protocolo de fabricação (Gibco; Gaithersburg, MD): S-MIF: 5'-GCC--ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3' (MIF humano, sentido; SEQ ID NO: 1) AS-MIF: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-31 (MIF humano, antí-sentido, SEQ ID NO: 2) . Depois de 16 horas, a actividade prolif erativa destas culturas foi medida ao longo das oito horas subsequentes pela incorporação de [3H] timidina (4 pCi/mL; DuPont) em ADN como medido por contagem de cintilação líquida (Figura 5). Os anticorpos de Anti-MIF foram mostrados como sendo anti-proliferativos para as células endoteliais microvasculares humanas (Figura 4) , indicando que os anticorpos de anti-MIF exercem a actividade anti-angiogénica in vivo. O ARNm de MIF anti-sentido inibiu a proliferação de célula endotelial humana in vitro em aproximadamente 50 % (Figura 5) relativamente aos constructos de sentido. Assim o ARNm de MIF anti- 32 sentido foi mostrado como sendo anti-proliferativo para as células endoteliais humanas, indicando que o ARNm de MIF anti-sentido exerce a actividade anti-angiogénica. Estes resultados demonstram que a terapia de anti-MIF contra o cancro pode beneficiar de (1) efeitos anti-proliferativos directos da terapia de anti-MIF em células de tumor; e/ou (2) inibição de processos dependentes do hospedeiro, tais como a angiogenese, necessária para a iniciação, desenvolvimento ou progressão do tumor.

Exemplo 5

Este exemplo ilustra a inibição da proliferação de células da leucemia ín vitro. Estes estudos foram levados a cabo para examinar se os métodos terapêuticos de anti-MIF e os agentes podem ter efeitos anti-proliferativos directos em células de tumor. Neste exemplo as células K562 (células de leucemia mielogenosas humanas crónicas) foram expostas aos constructos de MIF de anti-sentido. As culturas de células K562 de leucemia mielogenosa crónica de fase de log que proliferam (5 000 células/cavidade em pratos de 96 cavidades; obtidas a partir de ATCC; Rockville, MD) foram transfectadas com os oligonucleótidos de fosforotionato seguintes (10 pg/mL; Oligo etc.) usando o reagente de Lipofectin pelo protocolo de fabricação (Gibco): S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-31 (MIF humano, sentido; SEQ ID NO: 1); AS-MIF: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (MIF humano, anti-sentido; SEQ ID NO: 2). Depois de 16 horas de incubação em condições de cultura de célula padrão (37 °C, 5 % de CO em atmosfera de ar húmido) a actividade proliferativa destas culturas foi medida ao longo das oito horas subsequentes pela incorporação de [3H]timidina (4, μΟί/mL; DuPont) em ADN como medido por contagem de cintilação liquida.

Relativamente aos constructos de MIF de sentido, o ARNm de MIF de 33 anti-sentido inibiu a proliferação de célula K562 até 50 % (Figura 6) . Os resultados demonstrara que o efeito anti-proliferativo directo do tratamento de anti-MIF em células de tumor, e mais especificamente a actividade do tratamento de MIF específico de anti-sentido contra a proliferação de célula de leucemia.

Exemplo 6

Este exemplo ilustra a inibição da vascularização do linfoma in vivo pelo tratamento com um anticorpo de neutralização de anti-MIF. A neovascularização do tumor foi avaliada por mancheamento imunohistoquímico para um marcador de superfície de célula endotelial constitutivamente expresso (CD31, também conhecido como molécula de adesão de célula de plaqueta endotelial ou PECAM-1). O crescimento do tumor foi iniciado em ratos normais pela transplantação de células de linfoma singeneicas. Os ratos inoculados com células de tumor foram tratados a partir do tempo em que a célula de tumor transfere quer com anticorpos de anti-MIF ou de controlo e a vascularização do tumor, como visualizado em espécimes histológicas de tumores colhidos por específico mancheamento imuno-histoquímico para CD31, foi comparado entre secções de anti-MIF contra os ratos que carregam o tumor tratado com o anticorpo de controlo.

As células de linfoma de célula B (linha de célula 38C13; fornecidas por J. D. Kemp, Dept. of Pathology, U. of IA) foram reunidas da cultura de fase de crescimento exponencial (RPMI/10 % de FBS) , centrifugadas 10 minutos a 30 x g, lavadas duas vezes com PBS, e ajustadas a 1 x IO6 células/mL (em PBS). Depois dos métodos de Kemp et al. (infra)., grupos de cinco ratos fêmea C3H/HeN (20-25 g; Harlan Labs, NY) foram barbeados no flanco superior e 0,05 mL da suspensão de células 38C13 1 x 106/mL (5 x 104 células) foi 34 injectada i.d. com uma seringa de 1 mL e uma agulha de 27 guage. Ao fim de 30 minutos, os ratos receberam uma injecção de 0,2 mL (0,3 mg) i.p. quer em anticorpo de controlo de isotipo de IgGx (Pharmingen; San Diego, CA) ou de anticorpo monoclonal de anti-MIF (XIV,15.5, mAb de subclasse de IgGlf fornecido por C. Metz, Dept. of Med. Biochemistry, The Picower Institute para Medicai Research). As injecções de anticorpo foram repetidas a cada 48 horas durante 6 dias. Os ratos foram eutanizados por asfixia com C02 e os tumores foram excisados, fixados em 10 % de formalina neutra tamponada, seccionados, e processados para análise imuno-histoquímica. Depois de se extinguirem as peroxidases endógenas com H202 (3 %) , as secções desparafinadas foram incubadas sequencialmente com um mAb anti CD31 (diluição de 1:50; clone MEC 13.3; Pharmingen; San Diego, CA) ou um anticorpo de controlo de isotopo de IgG2 (Pharmingen) , com um anticorpo secundário de IgG de anti-rato ligado a fosfatase alcalina, e desenvolvido com nova fucsina (DAKO) como substrato. As secções de controlo manchadas com um controlo de isotipo ou sem anticorpo primário não mostraram nenhuma imunoreactividade.

Como revelado por mancheamento imuno-histoquímico para o marcador de célula endotelial, CD31, as secções do tecido de tumor colhido de ratos tratados com o anticorpo de controlo mostram uma cama uniformemente densa de neo-vascularização. As secções do tecido de tumor de ratos tratados com um anticorpo monoclonal de anti MIF de rato, no entanto, mostram evidência imuno-histoquímica só escassa de vascularização da massa de tumor. Os tumores que se desenvolveram em animais tratados com os mAbs de anti-MIF foram significativamente mais pequenos do que os tumores que se desenvolveram nas massas de ratos tratadas com Ab de controlo do que os tumores nos ratos tratados por anticorpo de controlo.

Uma comparação do número médio de perfis capilares positivos CD31 35 por campo de alta potência (400X) em secções imuno-histoquimicamente manchadas de tumores colhidos de mAb tratados com anti-MIF contra os animais tratados com Ab de controlo foram feitas. 0 número de perfis capilares CD31+ foi tabulado para cinco campos de elevado poder de secções de histologia de amostras de tumor tomadas de dois animais de cada grupo (anti-MIF contra o anticorpo de controlo tratado). Estes tumores foram os colhidos como descrito nas experiências de protuberância de tumores iniciais mostrados nas Figuras 1 e 2. Os resultados desta comparação do grau de vascularização são mostrados na Figura 7, que demonstra que os tumores que crescem em animais tratados por anticorpo de anti-MIF, além de serem mais pequenos do que os que ocorrem nos animais tratados por anticorpo de controlo, são significativamente menos vascularizados numa base por unidade de volume. Assim os benefícios de anti-tumor de agentes terapêuticos e dos métodos dirigidos contra o MIF são mostrados como ocorrendo, pelo menos em parte, através de um efeito evidente em processos dependentes do hospedeiro, tal como a angiogenese, que contribui poderosamente para a determinação do curso do desenvolvimento do tumor.

Exemplo 7

Este exemplo ilustra a depleção do MIF segregado por se utilizar um anticorpo monoclonal de anti-MIF. Os anticorpos monoclonais foram feitos depois de um protocolo estabelecido. 0 MIF recombinante de murino purificado com o adjuvante de RIBI (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) foi usado para imunizar os ratos fêmea BALB/c. 10 pg de MIF recombinante de murino expressaram em E. coli um plasmídeo induzível pETl 11b IPTG (Novagen, Madison, WI) , purificado por FPLC e C8 Sep Pak (Waters Co, Milford, MA) , misturado com 100 pL de adjuvante de RIBI e injectado i.p. Os titulados de anticorpo foram ensaiados por ELISA directa. Logo que 36 os titulados foram > 5 vezes as células de baço de soros não imunes foram fundidas com células P3-X63 Ag8 por se utilizar 50 % de polietileno glicol. Os clones singulares foram filtrados por ELISA e o mancheamento de Western e os positivos foram depois injectados i.p. em ratos BALB/c, preparados com prístino e IgG que contém ascites reunidas. 0 anti-MIF e o IgG não imune foram purificados a partir de ascites por cromatografia de afinidade da proteína G seguindo as instruções dos fabricantes (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Para a maior parte das experiências 10 pg/mL de IgG não imune ou anti-MIF foram adicionados a células NIH3T3 (5 X 105 células/mL) e deixados a proliferar durante a noite na presença de [3H]timidina (5,0 μΟί por mililitro; 1 Ci = 3 Gbq) (DuPont NEN, Boston, MA). Células NIH3T3 culturadas em DMEM/10 % de FBS/2,0 mM de glutamina; 37 °C em 95 % de ar/5 % de C02. As células foram colhidas em filtros de 96 cavidades (Packard Cell Harvester); o fluido de cintilação adicionado e as cavidades contadas para o 3H incorporado. Os dados fornecidos na Figura 8 mostram uma relação de resposta de dose para a proliferação como uma função da dose de anticorpo de anti-MIF. O anticorpo de controlo não inibiu a proliferação, mas o anticorpo de anti-MIF inibiu realmente a proliferação a uma proporção de concentração de 600 ng/mL para 6 pg/mL.

Depósito

As estirpes de hibridomas de murino III.D.9 e XIV.15.5 foram depositadas no dia 24 de Outubro de 1996, com a American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os Objectívos de Procedimentos de Patentes, e o número de acesso designado 37 ATCC HB-12220. LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTES: Bucala, Richard J. e Chesney, Jason A.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: UTILIZAÇÃO DE ANTAGONISTAS DO FACTOR INIBITÓRIO DA MIGRAÇÃO DE MACRÓFAGO PARA A TERAPIA DE ΑΝΤΙ-CANCRO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: THE PICOWER INSTITUTE FOR MEDICAL

RESEARCH

(B) RUA: 350 COMMUNITY DRIVE

(C) CIDADE: MANHASSET

(D) ESTADO: NOVA IORQUE (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 11030 (v) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: DISCO FLEXÍVEL (B) COMPUTADOR: PC compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: Windows 95

(D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: WORD (vi) DADOS DE APLICAÇÃO CORRENTE: (A) NÚMERO DE APLICAÇÃO: a ser designado (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (Viii) PROCURADOR/AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NOME: Oster, Jeffrey B. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32 585

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO ABSTRACTO: 0205WO (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 516 562 9404 (B) TELEFAX: 516 365 7919 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 (B) TIPO: ácido nucleíco (C) CARACTERÍSTICA DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: hMIF de sentido (XI) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3' (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) CARACTERÍSTICA DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: hMIF de anti-sentido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: 5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' 20

Lisboa, 4 de Maio de 2007

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agente antagonista de MIF (factor inibitório da migração de macrófago) seleccionado a partir do grupo que consiste de anticorpos monoclonais de anti-MIF, moléculas de ARN de MIF de antí-sentido, e uma sua combinação para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção do cancro.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é um tumor sólido.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o cancro é um linfoma de célula B ou de célula T.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é prevenido pelo tratamento de uma condição pré-maligna ou de tumor benigno.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é seleccionado a partir do grupo que consiste de cancro do esófago, cancro do estômago, carcinoma renal, cancro da bexiga, cancro da mama, cancro do cólon, cancro do pulmão, melanoma, cancro nasofaríngico, osteocarcínoma, cancro do ovário e cancro uterino.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o agente antagonista de MIF é um anticorpo monoclonal de anti-MIF ou um seu fragmento de ligação que se liga a um MIF humano. 2

7. Utilização de um agente antagonista de MIF (factor inibitório da migração de macrófago) seleccionado a partir do grupo que consiste de anticorpos monoclonais de anti-MIF, moléculas de ARN de MIF de anti-sentido, e uma sua combinação para a preparação de um medicamento para o tratamento da neovascularização de tumor.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o agente é um anticorpo monoclonal de anti-MIF ou um seu fragmento de ligação que se liga ao MIF humano.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o agente é um anticorpo que liga especialmente o factor inibitório da migração de macrófago (MIF).

10. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o agente é uma molécula de anti-sentido do factor inibitório da migração de macrófago (MIF). Lisboa, 4 de Maio de 2007