ES2283013T3 - Utilizacion de antagonistas de factor de inhibicion de emigracion de macrofagos para terapia anti-cancer. - Google Patents

Utilizacion de antagonistas de factor de inhibicion de emigracion de macrofagos para terapia anti-cancer. Download PDF

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Abstract

SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA TRATAR O EVITAR UNA ENFERMEDAD QUE COMPRENDE LA SUPERPROLIFERACION CELULAR EN UN SUJETO QUE COMPRENDE LA ADMINISTRACION AL SUJETO EN EL CUAL SE DESEA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UN AGENTE ANTAGONISTA DEL MIF (FACTOR INHIBIDOR DE LA MIGRACION DE MACROFAGOS). TAMBIEN SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA TRATAR LA NEOVASCULARIZACION TUMORAL EN UN SUJETO, QUE COMPRENDE LA ADMINISTRACION DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UN AGENTE QUE INHIBA O NEUTRALICE LA ACTIVIDAD DEL FACTOR INHIBIDOR DE LA MIGRACION (MIF).

Description

Utilización de antagonistas de factor de inhibición de emigración de macrófagos para terapia anti-cáncer.
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Sector técnico al que pertenece la invención
La presente invención se refiere a la utilización de un agente antagonista MIF ("factor de inhibición de emigración de macrófagos") seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales anti MIF, moléculas RNA antisentido MIF y una combinación de las mismas para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de cáncer o para el tratamiento de neovascularización de tumores.
Antecedentes de la invención
El factor MIF fue identificado originalmente por su capacidad en prevenir la emigración de macrófagos de cobayas in vitro (Bloom & Bennett, Science 153:80-82, 1966; y David, Proc. Natl. Acad Sci. USA 56:72-77, 1966). El factor MIF se ha indicado que está asociado con reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (Bloom & Bennett, 1966, supra; David, 1966, supra), producidas por células T activadas por lectina (Weiser y otros, J. Immunol.126:1958-1962, 1981), y para incrementar la adherencia de macrófagos, fagocitosis y actividad tumoricida (Nathan y otros, J. Exp. Med. 137:275-288, 1973; Nathan y otros, J. Exp. Med. 133:1356-1376, 1971; y Churchill y otros, J. Immunol. 115:781-785, 1975). Desafortunadamente, muchos de estos estudios utilizaron sobrenadantes de cultivos mixtos que se creían MIF puro, que se demostró más tarde que contenían otras citoquinas tales como IFN-\gamma e IL-4, que tienen también actividad inhibitoria de emigración (Mclnnes&Rennick, J. Exp. Med. 167:598-611, 1988; Thurman y otros, J. Immunol. 134:305-309, 1985).
El MIF humano recombinante fue clonado en primer lugar a partir de una biblioteca de células T humanas (Weiser y otros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7522-7526, 1989) y se ha demostrado que el factor MIF humano recombinante activa los macrófagos derivados de la sangre para exterminar parásitos intracelulares y células tumorales in vitro, estimulando la expresión de IL-1\beta y TNF\alpha, e induciendo síntesis de óxido nítrico (Weiser y otros, J. Immunol. 147:2006-2011, 1991; Pozzi y otros, Cellular Immunol. 145:372-379, 1992; Weiser y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8049-8052, 1992; y Cunha y otros, J. Immunol 150:1908-1912, 1993). No obstante, hasta muy recientemente la falta de una fuente fiable de MIF purificado ha continuado dificultando la investigación del perfil biológico preciso de esta molécula.
Características de la invención
La presente invención da a conocer la utilización de un agente antagonista de MIF (factor inhibitorio de la inmigración de macrófagos) seleccionado entre el grupo que consiste en anticuerpos monoclonales anti-MIF, moléculas RNA anti sentido MIF y una combinación de las mismas para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de cáncer.
Según una realización, el cáncer es un tumor sólido.
En una realización preferente, el cáncer es un célula B o un linfoma de célula T.
En ciertas realizaciones, el cáncer se previene por tratamiento de un estado premaligno o un tumor benigno.
En ciertas realizaciones, el cáncer es seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de esófago, cáncer de estómago, carcinoma renal, cáncer de vejiga, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer nasofaríngeo, osteocarcinoma, cáncer de ovario y cáncer uterino.
En una realización, el agente antagonista de MIF es un anticuerpo monoclonal anti MIF o un fragmento de unión del mismo que se une a MIF humano.
La presente invención da a conocer también la utilización de un agente antagonista de MIF (factor inhibitorio de la inmigración de macrófagos) seleccionado entre el grupo que consiste en anticuerpos monoclonales anti MIF, moléculas RNA antisentido MIF y una combinación de las mismas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de neovascularización de tumores.
En una realización, el agente es un anticuerpo monoclonal anti MIF o un fragmento de unión del mismo que se une a MIF humano.
En una realización preferente, el agente es un anticuerpo que se une específicamente al factor inhibitorio de emigración (MIF).
En otra realización, el agente es una molécula antisentido de factor inhibitorio de emigración (MIF).
La invención se basa en el descubrimiento de que se requiere MIF para la proliferación de células T in vitro. La neutralización de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra MIF inhibe directamente la proliferación de células T primarias inducidas anti-CD3. Estos datos in vitro predicen que los antagonistas de MIF son terapéuticamente activos contra poblaciones celulares de tumores en situación de proliferación de manera general, y contra linfomas en particular. Además, se han presentado datos in vivo en un modelo de crecimiento de tumor predictivo de que un antagonista de MIF, en particular un anticuerpo neutralizante de MIF inhibe el crecimiento de células tumorales in vivo. Estas observaciones indican una involucración inesperada de MIF en la regulación del ciclo celular y el crecimiento celular in vivo a nivel de los organismos. No obstante, sin limitación a ninguna teoría, parece que la actividad terapéutica de antagonistas MIF actúa inhibiendo la vascularización de tejidos de tumores sólidos, y por lo tanto es un tratamiento universal de tumores sólidos basado en la inhibición de la nutrición de los tejidos del tumor suprimiendo cualquier suministro de sangre a los tejidos tumorales en crecimiento.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la inhibición del crecimiento de linfoma inicial in vivo por tratamiento con anticuerpos monoclonales neutralizantes anti MIF. La figura 1 muestra la media en siete días de peso tumoral estimado para grupos tratados anti-MIF y grupos de control isotipo. Se recogieron células de linfoma de célula B (38C13 células, proporcionadas por J.D. Kemp, Dept. of Pathology, U. of AI) de la fase de cultivo de crecimiento exponencial (RPMI/10%FBS) se centrifugaron 10 minutos a 300 xg, como se lavaron dos veces con PBS, y se ajustaron a una densidad de 1 x 10^{5} células/ml. Se inyectó una suspensión de 38C13 (5 x 10^{4} células) por vía intradérmica utilizando una jeringa de 1 ml dotada de una aguja de tipo 27. Dentro de 30 minutos, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 0,2 ml (0,3 mg) de una igG, anticuerpo de control isotipo (Pharmingen; San Diego, CA) o un anticuerpo monoclonal anti MIF XIV.15.5, XIV.14.3 o III.D.9 (facilitado por C Metz, Dept. of Med. Biochemistry, The Picower Institute). Se repitieron inyecciones de anticuerpos cada 48 horas durante 6 días. El peso del tumor fue estimado por mediciones tomadas después de 7 días utilizando galgas Vernier de acuerdo con la fórmula siguiente: peso tumoral (en gramos) = (anchura, cm)^{2} x (longitud, cm)/2 (de acuerdo con Taetle y otros, Cancer Treatment Reports 71:297-304, 1987). Se eutanizaron ratones por asfixia mediante CO_{2} y se separaron tumores por corte y se pesaron.
La figura 2 muestra la inhibición del crecimiento de linfoma inicial in vivo por tratamiento con anticuerpos monoclonales neutralizantes anti MIF. La figura 2 muestra peso medio en húmedo de masas tumorales diseccionadas de anti-MF (XIV.15.5) y grupos tratados con control. Los tumores fueron recogidos de los animales tal, como se describe en la figura 1.
La figura 3 muestra la inhibición de crecimiento de linfoma establecido in vivo por tratamiento con anticuerpos monoclonales neutralizantes anti MIF. En estos experimentos, el protocolo experimental descrito en la figura 1 fue seguido excepto que los tumores se dejaron crecer durante 96 horas a unas dimensiones medias de 0,01 cm^{3} aproximadamente antes de empezar el tratamiento. Los ratones con tumores fueron distribuidos a continuación en grupos cuyos tumores mostraron un tamaño de tumor medio similar. El tratamiento de los ratones y la medición de los tumores se llevó a cabo de igual manera que en los experimentos de crecimiento de linfoma inicial descritos en la figura 1. Se registraron datos sobre tamaños de los tumores cada 48 horas desde el día 0 (tiempo de inyección del primer anticuerpo (XIV.15,5), 4 días después de la inyección de células 38C13) hasta el día 6.
La figura 4 muestra la inhibición de proliferación de células de endoteliales humanas in vivo con anticuerpos monoclonales neutralizantes anti MIF. Las células endoteliales microvasculares humanas en proliferación (cuarta pasada)/(Clonetics; San Diego, CA) (5000/pocillo en una placa de 96 pocillos) fueron incubadas con 10-200 \mug/ml de Control IgG_{1} (Sigma; St. Louis, MO) o anti cuerpo monoclonal neutralizante anti MIF XIV.15.5 en medio de crecimiento celular endotelial conteniendo 1% de suero bovino fetal (ECG-1) durante 3 horas. La actividad proliferativa de estos cultivos fue medida por la incorporación de [(^{3}H)] timidina (4 \muCi/ml) en DNA medido por un contador de centelleo líquido.
La figura 5 muestra la inhibición de la proliferación de células endoteriales humanas in vivo con olegonucleótidos antisentido MIF. Células endoteriales microvasculares humanas proliferantes (4ª pasada; Clonetics), cultivadas en ECG-1 (5000/pocillo en una placa de 96 pocillos), fueron transfectadas con oligonucleótidos de fosforotionato (10 \mug/ml; Oligo's Etc,; Wilsonville, OR) utilizando reactivo de lipofectina según el protocolo del fabricante (Gibco; Gaithersburg, Md): S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3'(sentido, MIF humano: SEQ ID NO 1); y AS-MIF-5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC- 3'(anti sentido, MIF humano; SEQ ID No 2). Después de 16 horas, la actividad proliferativa de esos cultivos fue medida durante las ocho horas siguientes por la incorporación de [(^{3}H)] timidina (4 \muCi/ml)en DNA con medición por conteo por centelleo líquido.
La figura 6 muestra la inhibición de la proliferación de células de leucemia mielogenosa con oligonucleótidos antisentido de MIF. Se transfectaron cultivos de células de leucemia mielogenosa crómica de la fase de proliferación logarítmica K-562 (5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos;obtenidas de ATCC; Rockville, MD) con los siguientes oligonucleótidos de fosforotionato (10 \mug/ml; Oligo's etc.) utilizando reactivo Lipofectina según el protocolo del fabricante (Gibco); S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3'(sentido, MIF humano: SEQ ID NO 1); y AS-MIF-5-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3'(anti sentido, MIF humano; SEQ ID No 2). Después de 16 horas de incubación en condiciones de cultivo celular estándar (37ºC, 5% CO_{2} en atmósfera de aire humidificado), se midió la actividad proliferativa de estos cultivos durante las ocho horas siguientes por incorporación de [(^{3}H)] timidina (4 \muCi/ml; Dupont) en DNA medido por conteo por centelleo de líquido.
La figura 7 muestra la inhibición de la vascularización de tumor por tratamiento con anticuerpos anti MIF in vivo. Se llevó a cabo una comparación del número medio de perfiles capilares positivos CD31 por secciones con tinción inmunohistoquímica con un campo de alta potencia (400X) de tumores recogidos de animales tratados con mAb anti MIF con respecto a animales de control tratados con Ab. Los resultados demuestran que los tumores que crecen en animales tratados con anticuerpos anti MIF, además de ser más pequeños que los que tienen lugar en animales tratados con anticuerpos de control, se encontraban significativamente menos vascularizados en base a volumen por unidad.
La figura 8 muestra un experimento in vitro que muestra un anticuerpo monoclonal anti MIF inhibiendo la proliferación de células de fibroblasto NIH3T3.
Descripción detallada de la invención
La presente invención da a conocer la utilización de un agente antagonista de MIF (factor inhibitorio de la inmigración de macrófagos) seleccionado entre el grupo que consiste en anticuerpos monoclonales anti MIF, moléculas RNA antisentido MIF y una combinación de las mismas para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de alteraciones relacionadas con tumores. En una realización, el tumor es un tumor sólido, y más preferentemente un linfoma de células B o de células T.
Las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas para tratar estados premalignos, tales como tumores benignos, alteraciones hiperproliferativas y alteraciones disproliferativas benignas. Las alteraciones y enfermedades a tratar por los compuestos de la presente invención incluyen también, sin que ello sirva de limitación, linfomas de células B y T, cáncer de piel, tumores cerebrales, cáncer de huesos, cáncer de esófago, cáncer de estómago, carcinoma renal, cáncer de vejiga, cáncer de senos, cáncer de colon, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer nasofaríngeo, osteocarcinoma, cáncer de ovario y cáncer uterino.
En una realización de la presente invención, el agente antagonista es un anticuerpo monoclonal anti MIF o un fragmento de unión del mismo que se une a MIF humano. En una realización preferente, el anticuerpo contiene un dominio de unión que se une inmunoespecíficamente a MIF.
La neutralización o inhibición de MIF puede ser conseguida en una serie de formas distintas, que puede incluir, sin que ello sirva de alimentación, la utilización de factores que se unen a MIF y neutralizan su actividad biológica; la utilización de antagonistas receptores de MIF; la utilización de factores que inhiben la actividad enzimática de MIF; la utilización de compuestos que inhiben la liberación de MIF de fuentes celulares en el cuerpo; y la utilización de secuencias de nucleótidos derivadas de la codificación de MIF, secuencias no codificantes y/o reguladoras para impedir o reducir la expresión de MIF. Cualquiera de los anteriores puede ser utilizado individualmente o en combinación para inhibir la actividad de MIF en el tratamiento de estados relativos a sobreproliferación celular, y además se puede combinar con cualquier otra terapia antitumoral tal como terapia farmacológica, quirúrgica, de citoquinas, de esteroides o de genes, o cualquier combinación de las mismas.
La invención se basa parcialmente en la hipótesis de que el MIF juega un papel importante en la regulación de la proliferación celular, y que al neutralizar específicamente la actividad de MIF, se tendría como resultado la inhibición de la proliferación celular. Este modelo es soportado por los ejemplos. El MIF se requiere para la proliferación de células T in vitro. La neutralización de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra MIF ha inhibido directamente la proliferación de células primarias T activadas anti-CD3, medida por la incorporación de [(^{3}H)] timidina. Estos resultados indican que el MIF funciona regulando el sistema inmune por la activación de células T. La administración de anticuerpos monoclonales neutralizantes contra MIF ha inhibido el crecimiento de tumores en un modelo de linfoma de células B murinas. Además, agentes anti MIF (anticuerpos monoclonales y moléculas antisentido) han inhibido procesos dependientes de huésped requeridos para establecimiento de tumor, tales como el establecimiento de la neovascularización de tumores. Estos resultados predicen que la neutralización de la producción, liberación o actividad de MIF tiene una actividad terapéutica antitumoral significativa, particularmente para tumores sólidos que requieren vascularización para soportar el crecimiento. Los factores neutralizantes de MIF comprenden anticuerpos anti MIF, fragmentos de anticuerpos, receptores de MIF y fragmentos receptores de MIF.
Se pueden utilizar diferentes procedimientos conocidos en esta técnica para la producción de anticuerpos para epítopos de MIF producido de forma recombinante o purificado de fuentes naturales. Anticuerpos neutralizantes, tales como los que inhiben actividades biológicas de MIF por competencia de los epítopos de MIF u obstruyendo estéricamente los mismos, involucrados en la unión de receptores celulares son especialmente preferentes para diagnóstico y terapéutica. Estos anticuerpos incluyen, sin que ello sirva de limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadera única y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab.
Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar varios animales huésped por inyección de MIF y/o una parte de MIF. Estos animales huésped pueden incluir, sin que ello sirva de limitación, conejos, ratones y ratas entre otros. Diferentes coadyuvantes pueden ser utilizados para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, incluyendo, sin que ello sirva de limitación, coadyuvante de Freund's (completo o incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias con tensión artificial tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina keyhole limpet, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos monoclonales para MIF se pueden preparar utilizando cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos por líneas de células continuas en cultivo. Estas incluyen, sin que ello sirva de limitación, la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor y otros, Immunology Today, 4:72, 1983; y Cote y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030, 1983) y la técnica de hibridoma EBV (Cole y otros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96, 1985). Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Neuberger y otros, Nature, 312:604-608,1984; y Takeda y otros, Nature, 314:452-454, 1985) al cortar y unir los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especifidad antigénica apropiada junto con genes procedentes de una molécula de anticuerpo humano de una actividad biológica apropiada. De forma alternativa, se pueden adaptar técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadera única (Patente USA 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena única específicos de MIF.
La técnica de hibridoma ha sido utilizada para generar anticuerpos monoclonales anti MIF. Se han aislado hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales IgG dirigidos contra formas humanas y murinas de MIF y se han caracterizado por su capacidad en neutralizar actividad biológica de MIF. Los anticuerpos monoclonales anti MIF se ha demostrado que inhiben la estimulación de eliminación de macrófagos de parásitos intracelulares. Los anticuerpos monoclonales anti MIF se han utilizado tambibén para desarrollar un ensayo de rastreo ELISA específico y sensible para MIF. Se pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales anti MIF y el ensayo ELISA en el diagnóstico y/o tratamiento de las respuestas inflamatorias y shock.
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos de MIF específicos por técnicas conocidas. Por ejemplo, esos fragmentos incluyen, sin que ello sirva de limitación: los fragmentos F(ab')_{2} que se pueden producir por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpos y los fragmentos Fab que se pueden generar por reducción de los puentes de bisulfuro de los fragmentos de F(ab')_{2}. De manera alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresión Fab (Huse y otros, Science, 246:1275-1281, 1989) para permitir una identificación fácil y rápida de fragmentos monoclonales Fab con la deseada especificidad para MIF.
Se prepararon hibridomas segregando anticuerpos monoclonales (MAbs) dirigidos contra formas humanas y murinas de MIF y se aislaron de acuerdo con métodos conocidos en esta técnica. Brevemente, ratones hembra BALB/c fueron inmunizados intraperitonealmente (i.p) con MIF recombinante murino o humano (10 \mug/ ratón) en coadyuvante de Ribi (Ribi Immunochem). Durante el periodo de inmunización y de desarrollo, los ratones fueron sangrados por la cola y se ensayaron concentraciones de anticuerpos anti MIF en el suero, así como distribución de isotipos (IgM vs.IgG), por métodos de ensayo (ELISA) inmunoabsorbentes ligados a encimas, de tipo directo, basados en placas de microtitulación, en pocillos con MIF recombinante inmovilizado como antígeno (250 ng/ml; 55 \mul/pocillo). Se facilitaron a los ratones inmunizados inyecciones de refuerzo de MIF recombinante (10 \mug/ratón) en coadyuvante de Ribi como mínimo cuatro veces antes de retirar los bazos para fusión. Tres días antes de la fusión del bazo con células de mieloma de ratón (P3X63Ag8.653; American Type Culture Collection) utilizando polietilén glicol (Boerhinger Mannheim) se reforzaron los ratones intraperitonealmente con MIF murino y humano (10 \mug en PBS). Se expandieron hibridomas en medio de selección HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina; GIBCO)(DMEM conteniendo HAT, 10% Condimed (Boerhinger Mannheim), 20% FBS (Hyclone)y antibióticos (penicilina, estreptomicina, GIBCO) durante un periodo de dos a tres semanas. Se rastrearon los sobrenadantes de cultivo de crecimiento de hibridomas para anticuerpos anti MIF por métodos ELISA directos con MIF recombinante inmovilizado.
Se analizó adicionalmente la inmunoreactividad de anticuerpos procedentes de clones positivos anti MIF por técnicos de inmunotransferencia Western, y se escogieron hibridomas productores de altas concentraciones para reclonado por dilución limitadora. Se isotiparon monoclonales anti MIF utilizando el tipo de rastreo ELISA (Boehinger
Mannheim). Se cultivaron hibridomas que segregaban los anticuerpos monoclonales deseados (tipo IgG) como ascitos en ratones BALB/c, y se purificaron MAb's utilizando cromatografía de gel T (Pierce). Se identificaron varios anticuerpos monoclonales de tipo IgM anti MIF pero no se caracterizaron adicionalmente. Se aislaron varios hibridomas que segregaban IgG y se caracterizaron (tabla 1).
TABLA 1
1
Se comprobaron anticuerpos monoclonales anti MIF purificados para la actividad de neutralización en un ensayo de eliminación de macrófagos. Se obtuvieron macrófagos peritoneales de ratón elicitados mediante tioglicolato a partir de ratones BALB/c, se dejaron adherir durante cuatro horas, y luego se infectaron con el parásito intracelular Leishmania major con una proporción de parásito: macrófago de 8:1. Después de lavado, los cultivos de macrófagos infectados fueron tratados con MIF humano recombinante (que favorece la eliminación de macrófagos de parásitos intracelulares en forma dependiente de la dosis en comparación con controles de medio de cultivo) con o sin anticuerpos anti MIF monoclonales añadidos VIIG3 o XID5% (25 \mug/ml). Se observó que ambos anticuerpos neutralizaban la exterminación favorecida por MIF de L.Major aproximadamente en 50%.
En experimentos separados, se comprobaron anticuerpos anti MIF monoclonales purificados en cuanto a actividad neutralizante de MIF en un ensayo de incorporación de [(^{3}H)] - timidina con células T murinas primarias cultivadas en placas de cultivo de tejido anti CD3 con recubrimiento IgG (Pharmingen). Brevemente, este ensayo utilizó células de bazo BALB/c que fueron aisladas utilizando columnas de enriquecimiento de células T murinas (R&D) y cultivadas en placas de microtitulación de 96 pocillos anti CD3 con recubrimiento IgG en RPMI conteniendo 10% de FBS, antibióticos (penicilina, estreptomicina) y L-glutamina junto con anticuerpos monoclonales de ratón anti-MIF o de control. Después de 48 horas, se pulsaron células T con [^{3}H]-timidina durante 16 a 18 horas, se recogieron y se contaron mediante métodos de conteo por centelleo beta. Como control positivo, se añadieron anticuerpos monoclonales anti-IL-2 (Genzime) para inhibir la proliferación e incorporación de [^{3}H]-timidina asociada. Tanto los anticuerpos VIIG3 como XID5 disminuyeron la incorporación de timidina en 20% aproximadamente; el tratamiento anti-IL-2 redujo la incorporación de [^{3}H]-timidina en 75% aproximadamente.
Se desarrolló una técnica ELISA "sándwich" específica de MIF, basada en la retención de MIF por anticuerpos VIIG3 inmovilizados seguido de detección con un antisuero anti-MIF policlonal de conejo. Este ensayo fue llevado a cabo de la forma siguiente: se recubrieron pocillos de una placa Immulon II (Dynatech) ELISA con 10-15 \mug/ml Mab (VIIG3) en PBS (65 \mul/pocillo); el MAb había sido purificado a partir de ascitos utilizando absorbente gel-T (Pierce). Se estanqueizaron placas y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente. A continuación, se bloquearon los pocillos con Superblock (Pierce) conteniendo 2% de suero de cabra (140-150 \mul/pocillo) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas utilizando un lavador de placas automatizado ELISA (dos veces con TBS conteniendo 0,05% Tween20 utilizando 200 \mul/pocillo). Se prepararon muestras de MIF y estándares en tubos eppendorf de 0,5 ml o de 1,5 ml añadiendo Tween20 a sobrenadantes de cultivo hasta una concentración final de 0,2%. De manera similar, se diluyeron lisados de células en tampón TBS con Tween20 a una concentración final de 0,2%. Se prepararon estándares de manera similar diluyendo MIF murino o humano recombinante purificado en DMEM/1% FBS/0,2% Tween20. Se aplicaron muestras y estándares a la placa (60 \mul/pocillo) y la placa fue estanqueizada e incubada durante una noche a 4ºC con agitación suave. La placa fue lavada cinco veces con TBS/0,05% Tween20 y se añadió un segundo anticuerpo (por ejemplo, suero MIF anti-murino 102 de conejo, 1:220 en TBS/0,2% Tween20/2% de suero de cabra) añadido a 60 \mul/pocillo. La placa fue estanqueizada e incubada 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Todos los pocillos fueron lavados 5 veces con TBS/0,05% Tween20 y se añadió a 60 \mul/pocillo un conjugado terciario anticuerpo-enzima (IgG anticonejo-fosfatasa alcalina de cabra disponible comercialmente con dilución 1:4000 en TBS/0,2% Tween20/2% suero de cabra, tal como se recomienda por el fabricante, Boehringer Mannheim). La placa fue recubierta, incubada durante 35 minutos a temperatura ambiente, y lavada a continuación 5 veces con TBS/0,05% Tween20. El ensayo fue desarrollado con solución de p-nitrofenil fosfato (pNPP), tal como se recomienda por el fabricante (tableta 5 mg Sigma 104 en 5 ml tampón AP: 10 mM dietanolamina/0,5 mM MgCl_{2}, pH 9.5). El producto de reacción se dejó revelar en la oscuridad a temperatura ambiente, y se leyó a 405 nm dentro de un periodo de 15-30 minutos. El ensayo proporciona una gama de sensibilidad aproximada de 100 pg/ml-250 ng/ml. Se debe observar que para la práctica de esta técnica de "sándwich" se pueden utilizar varias combinaciones de dos o más anticuerpos específicos MIF para captar y detectar MIF en una muestra. El anticuerpo inmovilizado no queda restringido a anticuerpo VIIG3, y el segundo cuerpo no está limitado a antisuero de conejo.
La presente invención da a conocer la utilización de anticuerpos monoclonales anti-MIF para la preparación de un medicamento para el tratamiento o para la prevención de cáncer.
Los estados malignos que se puede tratar por anticuerpos monoclonales anti-MIF incluyen, sin que ello sirva de limitación, los indicados en la Tabla 2.
TABLA 2 Enfermedades de cáncer y alteraciones relacionadas
2
TABLA 2 (continuación)
3 
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Retinopatía Diabética
Preferentemente, se tratan o previenen los linfomas de células B y T. En otras realizaciones específicas, se tratan o se previenen estados malignos o cambios disproliferativos o hiperproliferativos en la cabeza, cuello, cervix, riñón, estómago, piel, ovarios, vejiga, senos, colon, pulmón o útero. En otras realizaciones específicas, se trata o se previene sarcoma o leucemia. En otras realizaciones específicas, se trata o se previene osteosarcoma o carcinoma de células renales.
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Los anticuerpos monoclonales MIF de la presente invención pueden ser administrados también para tratar estados premalignos y para evitar el avance a estado neoplástico o maligno, incluyendo, sin que ello sirva de limitación, las enfermedades indicadas en la Tabla 2. Esta utilización profiláctica o terapéutica está indicada en estados conocidos o sospechosos de preceder el avance hacia neoplasia o cáncer, en particular, en los casos en que ha tenido lugar crecimiento celular no neoplásico consistente en hiperplasia o displasia. La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada que comporta un incremento del número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. La displasia es frecuentemente un antecedente de cáncer y se observa principalmente en el epitelio; es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, comportando la pérdida de uniformidad celular individual y la orientación de la arquitectura de las células. La displasia tiene lugar de forma característica cuando existe irritación crónica o inflamación crónica y se encuentra frecuentemente en el cervix, conductos respiratorios, cavidad bucal y vejiga.
De manera alternativa o adicionalmente a la presencia de crecimiento anormal de células, caracterizado como hiperplasia o displasia, la presencia de una o varias características o un fenotipo transformado o de un fenotipo maligno, que se muestra in vitro o in vivo por una muestra celular de un paciente, puede indicar que es deseable de administración profiláctica/terapéutica de anticuerpos monoclonales anti-MIF. Las características de un fenotipo transformado incluyen cambios morfológicos, fijación más libre del sustrato, pérdida de inhibición de contacto, pérdida de dependencia de anclaje, liberación de proteasa, transporte incrementado de azúcar, exigencia de suero reducida, expresión de antígenos fetales, desaparición de la proteína de la superficie celular de 250.000 daltons.
En una realización específica, la leucoplakia, una lesión de aspecto benigno del epitelio hiperplásica o displásica, o la enfermedad de Bowen, carcinoma in situ, son lesiones preneoplásticas que indican que es deseable una intervención profiláctica.
Formulaciones Farmacéuticas
Se puede administrar a un paciente humano un compuesto terapéutico, tal como un anticuerpo monoclonal terapéutico, por sí mismo o en compuestos farmacéuticos, en los que se mezcla con portadores adecuados o excipientes a dosis para tratar o mejorar diferentes estados que comportan sobreproliferación celular. Una dosis efectiva terapéuticamente se refiere adicionalmente a la cantidad de compuesto suficiente para inhibir el crecimiento tumoral. Se pueden administrar dósis terapéuticamente efectivas solas o como terapia adicional en combinación con otros tratamientos para crecimiento tumoral o enfermedades asociadas. Se pueden encontrar técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la presente solicitud, por ejemplo, en la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA.
Pueden ser rutas apropiadas de administración, por ejemplo, la ruta oral, rectal, transmucosal, o administración intestinal; suministro parenteral incluyendo inyecciones intravasculares, subcutáneas, intremedulares y también intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, o intraoculares, y opcionalmente en una formulación de depósito o de liberación continuada.
Además, se puede administrar el agente de la presente invención en un sistema de suministro de medicamento direccionado, por ejemplo, en un liposoma con un recubrimiento de anticuerpo, anti-CD4 para direccionado a linfomas de células T. Los liposomas serán una diana específica y se tomarán selectivamente por células que expresan CD4.
Los compuestos farmacéuticos de la presente invención pueden ser fabricados de manera que es conocida en sí misma, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla convencional, disolución, preparación de pastillas, levitación, emulsión, encapsulado, retención o liofilización. Se pueden formular compuestos farmacéuticos a utilizar, de acuerdo con la presente invención, de manera convencional utilizando uno o varios portadores fisiológicamente aceptables, comprendiendo excipientes y auxiliares que facilitan el proceso de los compuestos activos en preparados que pueden ser utilizados farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración escogida.
A efectos de inyección, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o una solución fisiológica salina tampón. Para administración transmucosal, se utilizan en la formulación en penetrantes apropiados de la barrera para su paso por permeación. Estos penetrantes son conocidos en esta técnica. Para administración oral, los compuestos se pudieron formular fácilmente combinando los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Estos portadores posibilitan que los compuestos de la invención puedan ser formulados en forma de tabletas pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, emulsiones, suspensiones y similares, para ingestión oral por el paciente a tratar. Los preparados faracéuticos para utilización oral se pueden obtener mediante excipientes sólidos, moturando opcionalmente la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir productos auxiliares adecuados, en caso deseado, para obtener núcleos de tabletas o de grageas. Son excipientes adecuados, de modo específico, cargas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa, tales como, por ejemplo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). En caso deseado, se pueden introducir agentes desintegrantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato sódico.
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Los núcleos para grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Con este objetivo, se pueden utilizar soluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietilén glicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a recubrimientos de tabletas o de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dósis de compuestos activos.
Se incluyen entre los preparados farmacéuticos que se pueden utilizar oralmente cápsulas de gelatina contenidas en un panel de expulsión por empuje y también en forma de cápsulas estancas, blandas, realizadas a base de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas que se pueden administrar por expulsión por empuje pueden contener los ingredientes activos en mezcla con cargas, tales como lactosa, aglomerantes, tales como almidones, y/o lubricantes, tales como talco o estearato magnésico, y opcionalmente estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilén glicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones por administración oral deben encontrarse en dósis adecuadas para dicha administración.
Para administración bucal, los compuestos pueden adoptar forma de tabletas o pastillas formuladas en forma convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos a utilizar, de acuerdo con la presente invención, se suministran convenientemente en forma de un aerosol en recipientes a presión o un pulverizador con utilización de un propulsor adecuado, tal como dicloro difluoro metano, tricloro fluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de clasificación se puede determinar disponiendo una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de gelatina a utilizar en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y un material en polvo adecuado como base, tal como lactosa o almidón.
Los compuestos se pueden formular para administración parenteral por inyección, tal como, por ejemplo, inyección "bolus" o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en formas de dósis unitarias, en ampollas o en multidósis con un conservante añadido. Los compuestos pueden adoptar formas, tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos o en aceite, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones para inyección en aceite apropiadas. Se incluyen entre los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como etiloleato o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección de tipo acuoso pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes adecuados o agentes que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
Los compuestos pueden ser también formulados en compuestos rectales tales como supositorios o enemas de retención, conteniendo bases convencionales para supositorios tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Los compuestos pueden ser también formulados como preparación de depósito. Estas formulaciones de actuación prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales polímeros o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, en forma de emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o derivados poco solubles, por ejemplo, una sal poco soluble.
Los liposomas y las emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos de suministro o portadores para medicamentos hidrofóbicos. También se pueden utilizar ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, si bien habitualmente a costa de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden ser suministrados utilizando un sistema de liberación a largo plazo, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos conteniendo el agente terapéutico. Se han determinado diferentes materiales de liberación continuada y son bien conocidos por los técnicos en la materia. Las cápsulas de liberación prolongada pueden liberar los compuestos, dependiendo de su naturaleza química, durante unas pocas semanas hasta llegar a unos 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del agente terapéutico, se pueden utilizar estrategias adicionales para estabilización de proteínas.
Los compuestos farmacéuticos comprenden también soportes sólidos o geles o excipientes adecuados. Se incluyen entre los ejemplos de dichos soportes o excipientes, sin que ello sirva de limitación, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diferentes azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilén glicoles.
Muchos de los compuestos de la invención identificados como neutralizantes de la actividad de MIF pueden ser dispuestos como sales con contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles pueden estar formadas con muchos ácidos, incluyendo, sin que ello sea limitativo, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc.; o sus bases. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que las correspondientes formas de bases libres. Son bien conocidos en la técnica ejemplos de sales, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, por parte de los técnicos en la materia, pudiéndose encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Estas sales comprenden, sin que ello sea limitativo, sales de: sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cloruros ácidos, bromuros ácidos, yoduros ácidos, acetato, citrato, tartrato y malatos, y similares.
Dosis
Una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad efectiva para impedir o para inhibir el desarrollo o el avance de cáncer o enfermedades hiperproliferativas en el sujeto sometido a tratamiento. La determinación de las cantidades efectivas se encuentra sobradamente dentro de la capacidad de los técnicos en la materia, especialmente en base a la materia que se ha dado a conocer en esta descripción. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. Esta información puede ser utilizada para determinar de manera más precisa las dosis útiles en humanos.
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del compuesto que tiene como resultado una reducción en el desarrollo del cáncer, tumor o enfermedad hiperproliferativa, o síntomas de la misma, o que prolonga la supervivencia de un paciente. La toxicidad y eficacia terapéutica de estos compuestos se pueden determinar por procesos farmacéuticos, farmacológicos, y toxicológicos estándar en cultivos de células o animales experimentales, para determinar el LD_{50} (dosis letal para el 50% de la población) y el ED_{50} (dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como proporción entre LD_{50} y ED_{50}. Son preferibles los compuestos que muestran elevados índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular o estudios con animales pueden ser utilizados en la formulación de un rango de dosificación para su utilización en humanos. La dosificación de estos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen el ED_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación utilizada y de la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, la ruta de administración y dosificación se pueden escoger por el médico del individuo teniendo en cuenta el estado del paciente.
La cantidad de dosificación y el intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma de la fracción activa, que son suficientes para mantener los efectos moduladores deseados, o concentración efectiva mínima (MEC). El MEC variará para cada compuesto pero se puede estimar a partir de datos in vitro; la concentración necesaria para conseguir una inhibición 50-90% de las células, o crecimiento tumoral utilizando los ensayos que se describen. Las dosis necesarias para conseguir el MEC dependerán de las características individuales y de la ruta de administración. No obstante, se pueden utilizar ensayos HPLC, bioensayos o inmunoensayos para determinar las concentraciones en plasma.
También se pueden determinar los intervalos de dosificación utilizando el valor MEC. Los compuestos deben ser administrados utilizando un régimen que mantenga unos niveles en plasma por encima del MEC durante 10-90% del tiempo, preferentemente entre 30-90% y más preferentemente entre 50-90%. En caso de administración local, por ejemplo, en la introducción directa en un tumor, o en absorción selectiva, la concentración local efectiva del medicamento puede no estar relacionada con la concentración en el plasma. La cantidad de compuesto administrado dependerá del sujeto a tratar, de su peso, de la gravedad de la enfermedad, de la forma de administración y de la evaluación del médico que efectúa la prescripción.
Ejemplo 1
Este ejemplo muestra el tratamiento de ratones con tumor mediante anticuerpos monoclonales anti-MIF. Para estos experimentos, se empezó el tratamiento de ratones C3H-HeN con varios mAbs anti-MIF el mismo día de la implantación del tumor. Este procedimiento examina el potencial de mAbs anti-MIF en la inhibición del crecimiento inicial del tumor y se considera que es un modelo predictivo de metástasis y agentes terapéuticos para tratar cáncer metastásico. Se pueden examinar varios mAbs anti-MIF en cuanto a la eficacia anti-tumoral en este modelo. El modelo de linfoma celular 38C13B es un modelo de tumor sólido bien establecido, que ha sido utilizado para evaluar nuevas terapéuticas contra el cáncer desde su descripción inicial en 1977 (Kemp y otros, Cancer Research 55:3817-3824, 1995). El modelo fue conseguido inyectando intradérmicamente células de linfoma B murino (i.d.) en la cepa de ratones de la que se derivaron inicialmente (C3H-HeN). Dentro de 10 días, estos ratones desarrollaron linfomas sólidos que fueron fácilmente medibles.
Utilizando ensayos de incorporación de ^{3}H-timidina, los inventores comprobaron los efectos del tratamiento anti-MIF en células 38C13 in vitro. Ninguno de dichos tratamiento de anticuerpos anti-MIF (con mAbs's IIID.9 o XIV.15.5) ni tratamiento de oligonucleótidos anti-sentido anti-MIF (utilizando los oligonucleótidos anti-sentido que se describen más adelante) suprimieron significativamente la proliferación de células 38C13 in vitro. Estos datos son indicativos de que dichos métodos y agentes terapéuticos anti-MIF no eran directamente anti-proliferativos para este tipo de célula tumoral.
Se anestesiaron ratones C3H-HeN y a continuación fueron fijados íntimamente en el flanco superior. Se inyectaron i.d. células 38C13 en fase 50.000 log (en 0,05 ml PBS) con una jeringa de 1 ml y una aguja 27 g. Al cabo de 30 minutos, los animales recibieron tratamiento por inyección IP de 500 \mug de mAbs anti-MIF o de mAbs de un isotipo de control. Las inyecciones de mAb fueron repetidas cada 48 horas durante 4 días. Se controlaron los animales diariamente en cuanto a crecimiento tumoral utilizando galgas Vernier. Los animales fueron eutanizados utilizando asfixia por CO_{2}, los tumores fueron aislados, pesados, y analizados por histología.
Debido a la variabilidad de crecimiento tumoral dentro de los grupos (dependiendo del lugar preciso de la inyección, volumen de la inyección) y para preveer la obtención de la evaluación estadística de los resultados, cada grupo experimental comprendía cinco animales y el experimento fue llevado a cabo tres veces. Adicionalmente a los grupos experimentales: grupos de control (es decir, tratados con Ab anti-MIF)fueron estudiados por ejemplo, un grupo tratado con anticuerpo de control de isótopo de anticuerpo, dirigido contra un antígeno irrelevante, y un grupo tratado con vehículo solamente. Se muestran los resultados en las figuras 1 y 2, demostrando que la interferencia con la actividad biológica de MIF, en este caso por tratamiento con un anticuerpo monoclonal, inhibía el desarrollo de tumores sólidos, en este caso linfoma de células B en animales que, por lo demás, eran normales.
Ejemplo 2
Este ejemplo muestra que la terapia de antagonistas de MIF es eficaz contra tumores establecidos en un modelo predictivo in vivo. Se trataron ratones con inoculación de células tumorales después de dejar un periodo de tiempo para que los tumores se establecieran. En estos experimentos, se inyectó el mismo número de células tumorales de la misma manera que se describe en el ejemplo 1, excepto que los tumores sólidos se dejaron desarrollar y crecer durante 6 días hasta un diámetro medio de unos 6 mm. Después de 6 días, el tratamiento de los animales y la medición de los tumores siguió el mismo esquema anterior. Este procedimiento destaca la actividad terapéutica de mAbs anti-MIF en tumores establecidos.
Se anestesiaron ratones C3H-HeN y a continuación fueron fijados íntimamente en el flanco superior. Se inyectaron células 38C13 en fase 50.000 log (en 0,05 ml PBS) i.d. con una jeringa de 1 ml y aguja 27 g. Los animales fueron controlados diariamente en cuanto al crecimiento tumoral por mediciones tomadas con galgas Vernier. Al 6º día del experimento, grupos de animales recibieron tratamiento por inyección IP de 500 \mug de mAbs isotipo, mAbs anti-MIF, o PBS solamente. Las inyecciones se repitieron cada 48 horas durante 4 días. Los animales fueron controlados diariamente y se estimó el crecimiento tumoral por mediciones tomadas con galgas Vernier. Los animales fueron eutanizados utilizando asfixia por CO_{2}, los tumores fueron aislados, pesados y analizados por histología.
Debido a la variabilidad en tamaño inicial de los tumores (dependiendo del lugar preciso de la inyección, volumen de la inyección y otros factores) y para conseguir datos para evaluación estadística, cada grupo experimental y de control era de 5 animales. Tal como se ha mostrado en la figura 3, los tumores establecidos crecieron más lentamente en animales tratados anti-MIF que en animales tratados con anticuerpos de control.
El procedimiento anteriormente indicado para valorar los efectos de anti-tumorales de terapias dirigidas contra MIF se repitió siguiendo un programa de dosificación distinto, de manera que los animales que tenían tumor fueron tratados con 0,5 mg de anticuerpos anti-MIF o anticuerpos de control dos veces al día, en vez de hacerlo un día sí y un día no, empezando en el día 6 después del injerto de las células tumorales. El peso tumoral estimado promedio no era distinto entre los grupos en el día 6, por medición justamente antes de la primera inyección de anticuerpo (45,6 \pm 4,6 mg para el grupo de control isotipo con respecto a 46,1 \pm 3,4 mg para el grupo programado para recibir mAb XIV anti-MIF (15,5; media \pm sd). No obstante, en el día 7, los tumores en el grupo tratado de control habían crecido significativamente más que los tumores en el grupo tratado con anticuerpos anti-MIF (246,7\pm 41,4 con respecto a 97,2\pm 12,2, respectivamente). Estos datos soportan la conclusión de que los métodos y agentes dirigidos a la inhibición de MIF, y más particularmente al tratamiento con anticuerpos anti-MIF, son eficaces en la inhibición del crecimiento de tumores establecidos in vivo.
Ejemplo 3
El ejemplo muestra que los antagonistas de MIF inhiben el crecimiento tumoral al inhibir la vascularización del tumor. Se incubaron células endoteliales microvasculares humanas proliferantes (cuarto paso) (Clonetics; San Diego, CA) 5.000/pocillo en una placa de 96 pocillos) con 10-200 \mug/ml de IgG_{1} control (Sigma; St. Louis, MO) o anticuerpo monoclonal neutralizante anti-MIF XIV.15.5 (cortesía del Dr. C. Metz, Department of Medical Biochemistry, The Picower Institute for Medical Research; Manhasset, NY) en medio de crecimiento de células endoteliales conteniendo 1% de suero bovino fetal (ECG-1; Clonetics) durante 3 horas. La actividad proliferativa de estos cultivos fue medida a lo largo de las 16 horas siguientes por la incorporación de [(^{3}H)] timidina (4 \muCi/ml) (DuPont; Boston, MA) en DNA medido por conteo de centelleo líquido (Figura 3). Se transfectaron células endotel3iales micro vasculares humanas proliferantes (cuarto paso; Clonetics), cultivadas en ECG-1 (5000/pocillo en una placa de 96 pocillos), con los siguientes oligonucleótidos de fosforotionato (10 \mug/ml; Oligo's, etc.; Wilsonville, OR) utilizando radiactivo Lipofectin para el protocolo de fabricación (Gibco; Gaithersburg, MD): S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3'(sentido, humano MIF; SEQ ID Nº 1) AS-MIF:5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (antisentido, MIF humano ID SEQ Nº 2). Después de 16 horas, la actividad proliferativa de estos cultivos fue medida a lo largo de las ocho horas siguientes por incorporación de [(^{3}H)] timidina (4 \muCi/ml; DuPont) en DNA medido por conteo de centelleo líquido (figura 5). Los anticuerpos anti-MIF se mostraron anti-proliferantes para las células endoteliales microvasculares humanas (figura 4), indicando que los anticuerpos anti MIF ejercen actividad anti-angiogénica in vivo.
\newpage
El mRNA de MIF anti-sentido inhibió la proliferación de células endoteriales humanas in vitro aproximadamente el 50% (figura 5) con respecto a constructos de sentido. De este modo el mRNA de MIF anti-sentido se demostró que era anti-proliferativo para células endoteliales humanas, indicando que el mRNA de MIF anti-sentido ejerce actividad anti-angiogénica. Estos resultados demuestran que la terapia anti-MIF contra el cáncer se puede beneficiar de (1) efectos anti-proliferativos directos de la terapia anti-MIF en células tumorales; y/o (2) inhibición de procesos dependientes de huésped tales como angiogénesis, necesarios para el inicio del tumor, su desarrollo o avance.
Ejemplo 5
Este ejemplo muestra la inhibición de la proliferación de células de leucemia in vitro. Estos estudios fueron llevados a cabo para examinar si métodos y agentes terapéuticos anti-MIF pueden tener efectos anti-proliferativos directos en las células tumorales. En este ejemplo células K562 (células de leucemia mialogenosa humana crónica) fueron expuestas a contructos MIF antisentido. Cultivos de células de leucemia mialogenosa crónica K562 en proliferación en fase logarítmica (5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos; obtenidas de ATCC; Rockville, MD) fueron transfectadas con los siguientes oligonucleótidos de fosforotionato (10 \mug/ml; Oligo's, etc) utilizando reactivo de Lipofectina según el protocolo del fabricante (Gibco): S-MIF: 5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3'(sentido, humano MIF; SEQ ID Nº 1); AS-MIF:5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3' (antisentido, MIF humano; ID SEQ Nº 2). Después de 16 horas de incubación en condiciones estándar de cultivo celular (37ºC, 5% CO en atmósfera de aire humidificado)la actividad proliferativa de estos cultivos fue medida a lo largo de las ocho horas subsiguientes por la incorporación de (^{3}H)timidina (4 \muCi/ml; DuPont) en DNA como medición por conteo por centelleo.
Con respecto a constructos de MIF sentido, el mRNA de MIF antisentido inhibió la proliferación de células K562 aproximadamente en 50% (figura 6). Estos resultados demuestran el efecto anti-proliferativo directo de tratamiento anti MIF sobre células tumorales, y más específicamente la actividad de tratamiento anti-sentido específico de tratamiento anti-sentido específico de MIF contra la proliferación de las células de leucemia.
Ejemplo 6
Este ejemplo muestra la inhibición de vascularización de linfoma in vivo por tratamiento con un anticuerpo neutralizante anti-MIF. La neovascularización del tumor fue evaluada por tinción inmunohistoquímica para un marcador de superficie de células endoteliales expresado constitutivamente (CD31, también conocido como molécula de de adhesión de plaquetas de célula endotelial o PECAM-1). El crecimiento del tumor fue iniciado en ratones normales por transplante de células de linforma singeneico. Se trataron ratones inoculados con células de tumor desde el momento de transferencia de las células de tumor con anti-MIF o anticuerpos de control y vascularización del tumor, visualizado en muestras histológicas de tumores recogidos por tinción inmunohistoquímica específica para CD31, efectuando comparación entre secciones de anti-MIF con respecto a ratones de control portadores de tumor, tratados con anticuerpos.
Se recogieron células de linfoma de célula B (línea celular 38C13; facilitadas por J.D. Kemp, Dept. of Pathology, U. de IA) del cultivo en fase de crecimiento exponencial (RPMI/10%FBS), se centrifugaron 10 minutos a 30 x g., se lavaron dos veces con PBS, y se ajustaron a 1 x 10^{6} células/ml (en PBS). Siguiendo los métodos de Kemp y otros (más adelante), grupos de cinco ratones hembra C3H/HeN (20-25 g; Harlan Labs. NY) fueron afeitados en el flanco superior y se inyectaron i.d. 0,05 ml de 1 x 10^{6}/ml de suspensión de células 38C13 (5 x 10^{4}células) con una jeringa de 1 ml y una aguja de medida 27. Dentro de 30 minutos los ratones recibieron una inyección i.p. de 0,2 ml (0,3 mg) de anticuerpo de control isotipo IgG_{1} (Pharmingen; San Diego, CA) o bien anticuerpo monoclonal anti-MIF (XIV. 15.5, mAb subclase IgG_{1} facilitado por C. Metz, Dept. of Med. Biochemistry, Instituto Picower para Investigación Médica). Se repitieron las inyecciones de anticuerpo cada 48 horas durante 6 días. Se eutanizaron ratones por asfixia por CO_{2} y se separaron por corte los tumores, se fijaron en formalina al 10% neutra, tamponada, se seccionaron y se procesaron para análisis inmunohistoquímico. Después de anular las peroxidasas endógenas con H_{2}O_{2}(3%), las secciones desparafinizadas fueron incubadas secuencialmente con mAb anti CD31 (dilución 1:50; clon MEC 13.3; Pharmingen; San Diego; CA) o un anticuerpo de control isotipo IgG_{2} (Pharmingen), con anticuerpo secundario IgG anti-ratón ligado a fosfatasa alcalina, y se reveló con nueva fucsina (DAKO) como sustrato. Secciones de control con tinción con control isotipo o sin anticuerpo primario no mostraron inmunorreactividad.
Tal como se revela por tinción inmunohistoquímica para el marcador de células endoteliales CD31, secciones de tejidos de tumor recogidos de ratones tratados con anticuerpo de control muestran un lecho uniformemente denso de neovascularización. Secciones de tejidos de tumor de ratones tratados con anticuerpo monoclonal de ratón anti-MIF, no obstante, muestran pruebas inmunohistoquímicas de solamente una vascularización escasa de la masa del tumor. Los tumores desarrollados en animales tratados con m-Abs anti MIF fueron significativamente más pequeños que los tumores desarrollados en los ratones tratados con Ab de control con respecto a los tumores de ratones tratados con anticuerpos de control.
Se llevó a cabo una comparación del número medio de perfiles capilares positivos de CD31 mediante microscopio de alta potencia (400X) en secciones con tinción inmunohistoquímica de tumores recogidos de animales dotados con mAb anti MIF con respecto a animales tratados con Ab de control. El número de perfiles capilares de CD31+ fue tabulado para cinco campos de alta potencia de secciones histológicas de muestras de tumores tomadas de dos animales de cada grupo (tratados con anti-MIF con respecto tratados con anticuerpos de control). Estos tumores fueron los recogidos tal como se ha descrito en los experimentos iniciales de crecimiento de tumores, mostrados en las figuras 1 y 2. Los resultados de esta comparación del grado de vascularización se muestra en la figura 7, que muestra que los tumores que crecen en animales tratados con anticuerpos anti MIF, además de ser más pequeños que los que tienen lugar en animales tratados con anticuerpos de control, son significativamente menos vascularizados en base a unidad de volumen. Por lo tanto, las ventajas anti-tumorales de los agentes terapéuticos y métodos dirigidos contra MIF se demuestran que tienen lugar, por lo menos en parte, por un efecto aparente en procesos dependientes del huésped, tales como angiogénesis, contribuyendo poderosamente a determinar el curso del desarrollo del tumor.
Ejemplo 7
Este ejemplo muestra el agotamiento de MIF segregado utilizando un anti-cuerpo monoclonal anti-MIF. Se prepararon anti-cuerpos monoclonales siguiendo un protocolo establecido. Se utilizó, para inmunizar ratones hembra de BALB/c, MIF recombinante murino purificado con coadyuvante RIBI (RIBI ImmunoChem Research Inc. Hamilton, MT). 10 \mug de MIF recombinante murino expresado en E. Coli a partir de plásmido inducible IPTG pET 11b (Novagen, Madison, WI), purificado por FPLC y C8 Sep PAk (Waters Co., Milford, MA), mezclados con 100 \mul de coadyuvante RIBI e inyectados i.p. Se ensayaron titulaciones de anticuerpo por ensayo ELISA directo. Cuando las titulaciones fueron >5 veces, las células no inmunes de suero de bazo fueron fusionadas con células P3-X63 Ag8 utilizando 50% de polietilen glicol. Se rastrearon clones individuales por medio de ELISA y transferencia western y los positivos fueron inyectados i.p. en ratones BALB/c, recogiendo ascitos cebados en fase primitiva y conteniendo IgG. Se purificaron anti-MIF e IgG no inmune procedente de ascistos por cromatografía de afinidad a proteína G según instrucciones del fabricante (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Para la mayor parte de experimentos, se añadieron 10 \mug/ml de IgG no inmune o IgG anti-MIF a células NIH3T3 (5 x 10^{5} células/ml) y se dejó proliferar durante una noche en presencia de (3H) timidina (5,0 uCi por milílitro, 1 Ci=3Gbq) (DuPont NEN, Boston, MA).
Se cultivaron células NIH3T3 en DMEM/10%FBS/2,0 mM glutamina; 37º en 95% aire/5%CO_{2}. Las células fueron recogidas en filtros de 96 pocillos (Packard Cell Harvester); se añadió un fluido para centelleo y se contaron los pocillos para ^{3}H incorporada. Los datos que se muestran en la figura 8 indican una relación de respuesta a la dosis para proliferación como función de la dosis de anticuerpo anti-MIF. El anticuerpo de control no inhibió la proliferación, pero el anticuerpo anti-MIF inhibió la proliferación en el rango de concentración de 600 ng/ml a 6 \mug/ml.
Depósito
Se depositaron cepas de hibridomas murinos III.D.9 y XIV.15.5 el 24 de Octubre de 1996, en la American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, según las disposiciones del tratado de Budapest sobre reconocimiento internacional de depósito de microorganismos con objetivo de procedimiento de Patentes y les fue asignado el número de acceso ATCC HB-12220.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTES: Bucala, Richard J. y Chesney, Jason A.
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UTILIZACIÓN DE ANTAGONISTAS DE FACTOR DE INHIBICIÓN DE MIGRACIÓN DE MACRÓFAGOS PARA TERAPIA ANTI-CÁNCER.
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: THE PICOWER INSTITUTE FOR MEDICAL RESEARCH
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 350 Community Drive
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(C)
CIUDAD: Manhasset
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(D)
ESTADO: New York
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(E)
PAÍS: U.S.A
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 11030
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(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Diskette
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(B)
ORDENADOR: PC Compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: Windows95
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Word
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
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(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD: falta asignar
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(B)
FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Oster, Jeffrey B.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32.585
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/Nº EXPEDIENTE: 0205WO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 516 562 9404
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 516 365 7919
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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1
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(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
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(C)
HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Desconocida
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(ii)
TIPO MOLECULAR: hMIF sentido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:5'-GCC-ATC-ATG-CCG-ATG-TTC-AT-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
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(C)
HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Desconocida
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(ii)
TIPO MOLECULAR: hMIF antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:5'-ATG-AAC-ATC-GGC-ATG-ATG-GC-3'20.

Claims (10)

1. Utilización de un agente antagonista de MIF (factor de inhibición de migración de macrófagos), seleccionado entre el grupo que consiste en anticuerpos monoclonales anti MIF, moléculas de RNA anti-sentido de MIF y una combinación de los mismos para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de cáncer.
2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el cáncer es un tumor sólido.
3. Utilización, según la reivindicación 2, en la que el cáncer es un linfoma de células B o de células T.
4. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el cáncer es impedido por tratamiento de una condición precancerosa o tumor benigno.
5. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el cáncer es seleccionado del grupo que consiste en cáncer de esófago, cáncer de estómago, carcinoma renal, cáncer de vejiga, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer nasofaríngeo, osteocarcinoma, cáncer de ovario y cáncer de útero.
6. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el agente antagonista de MIF es un anticuerpo monoclonal anti-MIF o un fragmento de unión del mismo que se une a MIF humano.
7. Utilización de un agente antagonista de MIF (factor de inhibición de migración de macrófagos), seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales anti MIF, moléculas de RNA antisentido de MIF y una combinación de los mismos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la neovascularización de un tumor.
8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que el agente es un anticuerpo monoclonal anti-MIF o un fragmento de unión del mismo que se une a MIF humano.
9. Utilización, según la reivindicación 8, en la que el agente es un anticuerpo que se une específicamente al factor inhibitorio de migración de macrófagos (MIF).
10. Utilización, según la reivindicación 7, en la que el agente es una molécula antisentido (MIF) de factor de inhibición de factor de migración de macrófagos.
ES97913963T 1996-10-24 1997-10-24 Utilizacion de antagonistas de factor de inhibicion de emigracion de macrofagos para terapia anti-cancer. Expired - Lifetime ES2283013T3 (es)

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